KR102665626B1 - 변형된 박테리아 포자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항생제 내성 유전자의 도입이 없는, 변형된 박테리아 포자, 배타적이지 않으면서도 특히 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 변형된 박테리아 포자에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 변형된 박테리아 포자를 생성하는 방법, 포자에 이종성 유전자를 도입하기 위한 벡터 및 키트까지 확장된다.

Description

변형된 박테리아 포자
본 발명은 항생제 내성 유전자의 도입이 없는, 변형된 박테리아 포자, 배타적이지 않으면서도 특히 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 변형된 박테리아 포자에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 변형된 박테리아 포자를 생성하는 방법, 포자-형성 박테리아에서 이종성 유전자를 도입하기 위한 벡터 및 키트까지 확장된다.
바실러스(Bacillus) 내생포자, 또는 포자는 열 안정성, 유해 화학물질에의 노출 및 건조(desiccation)를 포함한 잘 알려진 내성 특성을 갖는 휴면기 독립체(dormant entity)이다(1). 이와 같이, 포자는 여러 가지 응용을 제공한다. 가장 중요한 것은 코트 단백질 앵커(coat protein anchor)에 융합하여 포자 표면 상에 항원을 표시(display)할 수 있는 점막 백신(mucosal vaccine)으로서의 포자의 사용이다(2). 점막 경로(경구, 설하 또는 비내)에 의한 재조합 포자의 면역화는 유망한 결과를 보여주었고, 일부 경우 인간 또는 동물에 효과적일 수 있는 보호 수준을 보여주었다(3-5). 후자의 경우, 공급물에 백신을 혼입하는 능력이 특히 매력적이고, 일부 동물에 대해서는 주장컨대 백신화하는 유일한 방법이다. 예를 들어, 백신화는 새우를 바이러스 병원체, 예를 들어, 흰반점 증후군 바이러스(WSSV; White Spot Syndrome Virus)에 대해 양식하였으며, 여기서, WSSV VP26 및 VP28 외피 단백질을 발현하는 재조합 포자는 새우에서 보호를 부여하는 것으로 나타났다(6-9).
다수의 바실러스 종은 '식용 등급(food grade)', 즉, 인간이 섭취하기에 안전한 것으로 간주되며, QPS(EFSA, 유럽 식품 안전청에서 정의한 예단적 고안전성(Qualified Presumption of Safety))로 지정된다(10). 미국에서, 일부 균주는 GRAS(미국 식품의약국에서 정의한 일반적으로 안전한 것으로 인정됨) 상태를 가지고 있다. QPS 및 GRAS 상태는 인간과 동물 사료 모두에서 비. 서브틸리스(B. subtilis)를 포함한 다수의 바실러스 균주를 프로파이오틱스로 사용할 수 있도록 지원했다(11). 재조합 프로바이오틱스(12)의 개념은 개념적으로, 바실러스(13)의 유익한 특성을 이용하기 위한 논리적인 다음 단계이다.
백신 외에 포자는 포자 표면 상에서 효소, 예를 들어 동물 사료 효소 피타제(phytase)(14)의 발현을 용이하게 하는 것으로 나타났다. 효소를 운반하는 프로바이오틱 박테리아를 사용하는 능력은 효소를 정제할 필요가 없고, 산업에 유의한 이점을 제공할 수 있을 것이다. 마지막으로, 스트렙타비딘은 비. 서브틸리스 포자 상에서 발현되어 모노클로날 항체가 포자 표면 상에 컨쥬게이션되고 항암 약물이 로딩된 포자를 암세포(15)로 표적화하는 것을 가능하게 하였다.
산업적 응용에 대한 바실러스 포자의 잠재적인 효용에도 불구하고, 유전적으로 변형된 바실러스의 고의적인 방출과 관련하여 많은 장애물이 남아 있다. 첫째는 안정한 재조합 균주의 유전자 공학에 사용되는 항생제 내성(AbR) 유전자의 사용이다. AbR에 관하여, 비. 서브틸리스 내로의 이종성 DNA의 삽입을 필요로 하는 대부분의 절차는 양성 선별(positive selection)(16)을 위해 AbR 유전자를 사용하는 이소성(ectopic) 삽입을 필요로 한다. 클로람페니콜 또는 에리트로마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드 벡터는 전형적으로, 세포 성장에 불필요한(redundant) 유전자좌(genetic locus), 전형적으로 알파 아밀라제(amyE) 또는 트레오닌 C(thrC) 유전자(17)에서 이소성 삽입에 사용된다. 방출 후 AbR 유전자 전달의 잠재적인 위험은 인지되고, AbR 유전자(18, 19)의 도입 없이 이종성 유전자의 삽입을 가능하게 하는 비. 서브틸리스에서 적어도 2개의 시스템이 현재 알려져있다.
둘째의 가장 어려운 장애물은, 재조합 포자가 일단 방출되면 수백만년 동안 생존 가능한 독립체(20)로서 생존하는 것으로 나타났기 때문에 상기 포자의 궁극적인 운명이다. 토양은 보통 휴면 포자(21)로 농축되어 있고, 이들 포자의 본질적인 견고성(intrinsic robustness)은 이들의 고의적인 방출 후 지속되지 않을 것이라고 주장하기 어렵게 한다. 하나의 접근법은 발아 결핍 포자를 구축하는 것이겠지만, 기껏해야 발아율은 0.0015%(22)까지 감소될 수 있으며, 이는 규제 당국을 만족시키는 것 같지 않다.
따라서, 항생제 내성 유전자의 도입 없이 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내로 도입하는 향상된 방법에 대한 필요성이 존재한다.
발명자들은 소위 '티민-결여 사멸'(23-25)을 초래하는 티민 기아(starvation)의 접근법을 채택하였다. 대부분의 원핵생물은 thyA 유전자에 의해 인코딩되는 단일 티미딜레이트(thymidylate) 신타제(synthase) 효소를 갖는 것으로 알려져 있고, 돌연변이화된 티미딜레이트 신타제 유전자를 갖는 원핵생물은 저농도의 티미딘 또는 티민에서 성장할 수 없어서 세포 사멸을 초래한다. 따라서, 티민 기아는 다른 영양소의 부족에서 흔히 발견되는 생물정역(biostatic) 효과와 상이하다. 티민-결여 사멸은 비. 서브틸리스(26)에 대해 문서화되었고, 박테리아는 이것이 thyA 및 thyB 유전자(27)에 의해 인코딩되는 2개의 티미딜레이트 신타제 효소를 갖는다는 점에서 독특하다.
그러나, 티민-결여 사멸의 개념은 1954년부터 알려져 있음에도 불구하고, 항생제 내성 유전자의 도입 없이 이종성 유전자를 도입하기 위해서는 포자-형성 박테리아에 성공적으로 적용된 적이 결코 없었다.
발명자들은 항생제 내성 유전자의 도입 없이 이종성 유전자의 도입을 위해 포자-형성 박테리아, 예컨대 바실러스를 활용하기 위해 '티민-결여 사멸'의 원리를 성공적으로 채택하였다. 재조합 포자로서 이들이 발아해야 하기 때문에, 이들은 티민 또는 티미딘의 결여(또는 단지 저농도)로 인해 환경에서 즉시 사멸할 것이고 생존하거나 증식(즉, 성장)하는 데 실패할 것이다. 개발되는 접근법은 특히, 이러한 접근법이 임의의 항생제 내성 유전자의 도입 없이 성공적으로 더 높은 수준의 트리메토프림(trimethoprim) 상에서 양성 선별을 가능하게 하는 2-단계 유전자 통합 과정이기 때문에 특히 신규하다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 적어도 하나의 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내로 도입하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 상기 박테리아가 증식할 수 없게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내의 티미딜레이트 신타제 유전자 내로 도입하는 단계; 및
(ii) 트리메토프림의 존재 하에 상기 포자-형성 박테리아를 성장시키는 단계.
바람직한 예에서 그리고 유리하게는, 상기 방법은 항생제 내성 유전자의 도입 없이 작동하고, 따라서, 상기 고찰된 문제점을 극복한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은: (iii) 상기 포자-형성 박테리아로부터 박테리아 포자를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
박테리아 포자는 발아할 수 있거나 발아할 수 없지만, 상기 포자가 발아한다면, 해당 발아된 포자 밖으로 성장하고 증식하는 것은 불가능한 것으로 이해될 것이다.
유리하게는, 본 발명자들은 예를 들어, 박테리아가 2개 이상의 thy 유전자를 갖거나, 박테리아가 thyA 및 thyB 유전자를 갖거나(예를 들어, 바실러스 종(Bacillus spp.)), 또는 thyA의 불활성화가 정상적인 생리학적 조건 하에 박테리아의 성장에 영향을 줄 수 없는 실시 형태들에서, 박테리아 내의 모든 티미딜레이트 신타제를 불활성화시키는 간결한 방식을 고안하였다.
따라서, 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 이종성 유전자는 박테리아 내에 존재하는 각각의 티미딜레이트 신타제 유전자 내로 도입된다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 포자-형성 박테리아는 바실러스 종일 수 있다(2개의 티미딜레이트 신타제 유전자, thyA 및 thyB를 갖는 것으로 알려져 있다는 점에서 독특함). 바람직하게는, 이종성 유전자는 바실러스 종의 2개의 티미딜레이트 신타제 유전자, 예를 들어 thyA 및 thyB 각각 내로 도입된다. 바실러스 종 박테리아는 비. 서브틸리스, 비. 세레우스(B. cereus), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 아밀로리쿼파세안스(B. amyloliquefaeceans), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) 또는 비. 메가테리움(B. megaterium)일 수 있다. 그러나, 가장 바람직하게는, 바실러스 종 박테리아는 비. 서브틸리스이다.
바실러스에서 thyA 단독의 불활성화는 티민-결여 사멸을 유도하지 않을 것이고, 정상적인 생리학적 조건 하에 성장을 손상시키거나 예방하지 않을 것으로 이해되어야 한다.
또 다른 실시 형태에서, 포자-형성 박테리아는 클로스트리디움(Clostridium) 종(1개의 티미딜레이트 신타제 유전자를 갖는 것으로 알려져 있음)일 수 있다. 바람직하게는, 이 실시 형태에서, 이종성 유전자는 티미딜레이트 신타제 유전자 내로 도입된다. 클로스트리디움 종 박테리아는 씨. 디피실레(C. difficile), 씨. 페르프린겐스(C. perfringens), 씨. 테타니(C. tetani), 씨. 보툴리눔(C. botulinum), 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 씨. 셀룰로리티쿰(C. cellulolyticum), 씨. 노비이(C. novyi) 또는 씨. 테르모셀룸(C. thermocellum)일 수 있다. 가장 바람직하게는, 클로스트리디움 종 박테리아는 클로스트리디움 디피실레이다.
본 방법의 바람직한 실시 형태에서, 포자-형성 박테리아는 박테리아 배양물에 존재한다.
상기 방법의 단계 (ii)는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 성장 배지를 함유하는 임의의 적합한 용기, 예컨대 페트리 디쉬 또는 유리 배양 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. 성장 배지는 0.001 μg/ml 내지 20 μg/ml, 0.01 μg/ml 내지 15 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 1 μg/ml 내지 5 μg/ml, 2 μg/ml 내지 4 μg/ml, 또는 바람직하게는 대략 3 μg/ml의 농도에서 트리메토프림을 포함할 수 있다.
추가의 실시 형태에서, 단계 (ii) 동안, 박테리아는 2 mg/ml 미만의 농도 또는 본원에 개시된 임의의 농도에서 효모 추출물(YE)을 포함하는 배지에서 성장될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 배지는 YE를 함유하지 않는다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 동안, 박테리아는 본원에 개시된 임의의 농도, 예를 들어 대략 50 μg/ml에서 티민 또는 티미딘을 포함하는 배지에서 성장될 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 동안, 박테리아는 본원에 개시된 임의의 농도, 예를 들어 대략 3 μg/ml에서 트리메토프림을 포함하는 배지에서 성장될 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 동안, 박테리아는 본원에 개시된 임의의 농도, 예를 들어 대략 0.2%(w/v)에서 카사미노산(CAA; casamino acid)을 포함하는 배지에서 성장될 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 동안, 박테리아는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 또는 임의의 아미노산 혼합물이 보충된 배지에서 성장될 수 있다.
일 실시 형태에서, 유전자 삽입을 갖는 세포는 티민 또는 티미딘이 보충되지 않는 한 성장 불능으로 확인될 수 있다. 추가의 또는 대안적인 확인은 형질전환체로부터 키메라 유전자의 존재를 PCR에 의해 증폭시키는 것이다.
가장 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 유전적으로 변형된 바실러스 종, 예컨대 비. 서브틸리스의 생물학적 봉쇄(containment)에 적합한 클로닝 시스템을 제공한다.
따라서, 본 발명의 이러한 실시 형태에 따르면, 적어도 하나의 이종성 유전자를 바실러스 종 내에 도입하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 상기 박테리아가 증식할 수 없게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계; 및
(ii) 트리메토프림의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계.
바람직한 실시 형태에서, 이종성 유전자는 thy 유전자 중 하나 내로 도입된 다음, 후속하여 다른 thy 유전자 내로 도입된다. 따라서, 바람직하게는, 적어도 하나의 이종성 유전자를 바실러스 종 내에 도입하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 상기 박테리아가 증식할 수 없게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계;
(ii) 트리메토프림의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계;
(iii) 이종성 유전자를 상기 바실러스 종 내의 thyA 유전자 또는 thyB 유전자 중 다른 것 내로 도입하는 단계; 및
(iv) 트리메토프림의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계.
바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은: (v) 상기 바실러스 종으로부터 박테리아 포자를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
박테리아 포자는 발아할 수 있거나 발아할 수 없지만, 상기 포자가 발아한다면, 해당 발아된 포자 밖으로 성장하고 증식하는 것은 불가능한 것으로 이해될 것이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 항생제 내성 유전자의 도입 없이 작동한다. 바람직한 실시 형태에서, 단계 (i)은 바실러스 종 내의 thyA 유전자 내로의 이종성 유전자의 도입이고, 단계 (iii)은 바실러스 종 내의 thyB 유전자 내로의 이종성 유전자의 도입이다.
바람직한 실시 형태에서, 바실러스 종은 비. 서브틸리스이다. 바람직한 실시 형태에서, 바실러스 종 또는 비. 서브틸리스는 박테리아 배양물에 존재한다.
일 실시 형태에서, thyA의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 하기와 같이 SEQ ID NO: 1로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
ATGACGCAATTCGATAAACAATACAATTCAATTATAAAGGATATTATCAATAATGGAATCTCAGACGAAGAGTTTGATGTAAGAACCAAGTGGGACTCAGATGGAACACCGGCACATACTCTAAGTGTAATCAGTAAGCAAATGAGATTCGACAACTCAGAGGTTCCGATTTTAACGACAAAAAAGGTTGCCTGGAAAACAGCCATTAAAGAGTTGCTCTGGATTTGGCAGCTGAAATCTAATGATGTTAATGATTTAAACATGATGGGCGTCCATATTTGGGATCAGTGGAAACAAGAAGACGGAACCATCGGACATGCATATGGATTTCAGCTGGGGAAGAAAAACAGAAGTCTAAATGGAGAAAAAGTGGATCAGGTAGACTATCTTCTTCATCAATTGAAGAACAATCCATCTTCACGCAGACACATTACAATGCTGTGGAATCCTGATGAATTAGACGCAATGGCCTTAACGCCATGTGTATACGAGACACAATGGTACGTTAAACATGGGAAACTCCACCTTGAGGTAAGAGCACGGAGCAATGATATGGCATTGGGAAATCCATTCAATGTATTCCAGTATAATGTGTTGCAGCGCATGATTGCTCAAGTGACTGGTTATGAGCTTGGTGAATATATCTTTAACATTGGGGATTGCCATGTGTACACACGTCATATAGACAATTTGAAAATTCAAATGGAAAGAGAACAGTTTGAAGCACCTGAACTATGGATCAATCCTGAAGTGAAAGATTTTTATGACTTTACCATTGATGATTTCAAGTTAATCAACTATAAACATGGGGACAAGCTTTTATTTGAGGTAGCGGTTTAA
[SEQ ID NO: 1]
따라서, 바람직하게는, 본 방법은 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 SEQ ID NO: 1으로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체 내로 도입하는 단계를 포함한다. 대안적인 실시 형태에서, 상기 방법은 이종성 유전자를 SEQ ID NO: 1 또는 이의 단편 또는 변이체 내로 도입하는 것이 아닌 바실러스 종 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있되, SEQ ID NO: 1의 발현이 교란되거나 감소되도록 한다.
일 실시 형태에서, thyA의 오픈 리딩 프레임은 하기와 같이 SEQ ID NO: 18로서 본원에 제공된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
MTQFDKQYNSIIKDIINNGISDEEFDVRTKWDSDGTPAHTLSVISKQMRFDNSEVPILTTKKVAWKTAIKELLWIWQLKSNDVNDLNMMGVHIWDQWKQEDGTIGHAYGFQLGKKNRSLNGEKVDQVDYLLHQLKNNPSSRRHITMLWNPDELDAMALTPCVYETQWYVKHGKLHLEVRARSNDMALGNPFNVFQYNVLQRMIAQVTGYELGEYIFNIGDCHVYTRHIDNLKIQMEREQFEAPELWINPEVKDFYDFTIDDFKLINYKHGDKLLFEVAV
[SEQ ID NO: 18
SEQ ID NO: 1 및 18은 비. 서브틸리스로부터의 예이므로, 이들 서열의 변이체는 모든 바실러스 종으로부터의 관련(relevant) thyA 유전자를 포함한다. 본 발명은 바실러스 종의 임의의 thyA에 적용 가능하고, SEQ ID NO: 1 및 18은 예시적이며 제한하려는 것이 아님을 주지하는 것이 중요하다.
일 실시 형태에서, thyB의 오픈 리딩 프레임은 하기와 같이 SEQ ID NO: 2로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
ATGAAACAGTATAAGGATTTCTGCAGACATGTTTTAGAGCATGGTGAGAAAAAGGGAGACCGGACTGGGACCGGAACAATCAGCACTTTCGGATATCAAATGAGATTTAATTTACGGGAAGGCTTTCCGATGCTCACCACTAAAAAACTCCACTTTAAATCAATTGCGCATGAACTGCTGTGGTTCTTAAAAGGAGATACGAATGTACGCTATCTGCAGGAAAACGGAGTGCGAATCTGGAATGAGTGGGCTGATGAAAACGGTGAACTTGGACCTGTATATGGCTCCCAATGGCGTTCTTGGCGGGGAGCTGATGGAGAAACCATTGATCAAATTTCCCGTCTTATTGAAGATATTAAAACAAATCCGAACTCCAGACGCTTAATCGTCAGCGCCTGGAATGTTGGTGAAATTGATAAAATGGCGTTGCCGCCGTGCCATTGCCTGTTCCAATTCTATGTGTCTGACGGCAAGCTGTCCTGTCAGCTGTATCAGCGCTCTGCCGATGTTTTCTTAGGTGTGCCGTTTAATATTGCATCTTATGCCCTCCTAACCATGATCATTGCTCATGTGACTGGGCTTGAACCGGGCGAGTTCATCCATACGTTTGGTGATGTTCATATTTACCAAAATCATATTGAACAAGTCAATTTGCAGCTGGAAAGAGATGTTAGACCGCTTCCGCAGCTTCGTTTCGCCAGAAAGGTTGATTCTATTTTTAACTTTGCATTTGAGGACTTTATCATCGAGGATTATGATCCGCATCCTCATATAAAAGGGGCGGTCAGCGTATGA
[SEQ ID NO: 2]
따라서, 바람직하게는, 본 방법은 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 SEQ ID NO: 2로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체 내로 도입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 이종성 유전자를 SEQ ID NO: 2 또는 이의 단편 또는 변이체 내로 도입하는 것이 아닌 바실러스 종 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있되, SEQ ID NO: 2의 발현이 교란되거나 감소되도록 한다.
일 실시 형태에서, thyB의 오픈 리딩 프레임은 하기와 같이 SEQ ID NO: 19로서 본원에 제공된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
MKQYKDFCRHVLEHGEKKGDRTGTGTISTFGYQMRFNLREGFPMLTTKKLHFKSIAHELLWFLKGDTNVRYLQENGVRIWNEWADENGELGPVYGSQWRSWRGADGETIDQISRLIEDIKTNPNSRRLIVSAWNVGEIDKMALPPCHCLFQFYVSDGKLSCQLYQRSADVFLGVPFNIASYALLTMIIAHVTGLEPGEFIHTFGDVHIYQNHIEQVNLQLERDVRPLPQLRFARKVDSIFNFAFEDFIIEDYDPHPHIKGAVSV
[SEQ ID NO: 19]
SEQ ID NO: 2 및 19는 비. 서브틸리스로부터의 예이므로, 이들 서열의 변이체는 모든 바실러스 종으로부터의 관련 thyB 유전자를 포함한다. 본 발명은 바실러스 종의 임의의 thyB에 적용 가능하고, SEQ ID NO: 2 및 19는 예시적이며 제한하려는 것이 아님을 주지하는 것이 중요하다.
일 실시 형태에서, 단계 (i)은 바실러스 종을 플라스미드로 형질전환시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 플라스미드는 선형화될 수 있으며, 바실러스 종 thyA 유전자의 좌측 아암(arm)의 적어도 일부, 이종성 유전자, 및 바실러스 종 thyA 유전자의 우측 아암의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 단계 (i)은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 벡터로 수행될 수 있다. 형질전환은 전기천공을 사용하여 수행될 수 있다.
단계 (ii) 및/또는 단계 (iv)는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 성장 배지를 함유하는 임의의 적합한 용기, 예컨대 페트리 디쉬 또는 세포 배양 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, 단계 (ii) 및/또는 단계 (iv) 동안, 바실러스 종은 2 mg/ml 미만의 농도에서 효모 추출물(YE)을 포함하는 배지에서 성장될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 배지는 1.5 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.0001 mg/ml 또는 0 mg/ml 미만의 농도에서 YE를 가진다. 일 실시 형태에서, 바실러스 종이 성장하는 배지는 YE를 함유하지 않는다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 및/또는 단계 (iv) 동안, 바실러스 종은 티민 또는 티미딘을 포함하는 배지에서 성장할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 티민 또는 티미딘은 0.1 μg/ml 내지 1000 μg/ml, 1 μg/ml 내지 500 μg/ml, 300 μg/ml 이하, 10 μg/ml 내지 200 μg/ml, 20 μg/ml 내지 100 μg/ml 사이, 30 μg/ml 내지 80 μg/ml, 35 μg/ml 내지 65 μg/ml, 45 μg/ml 내지 55 μg/ml, 또는 바람직하게는 대략 50 μg/ml로 존재할 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 및/또는 단계 (iv) 동안, 성장 배지는 임의의 적합한 성장 배지, 예를 들어 Spizizen's 최소 배지(SMM)이다.
일 실시 형태에서, 단계 (iv)에 존재하는 트리메토프림의 양은 단계 (ii)에 존재하는 트리메토프림의 양보다 높다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii) 동안, 배지는 0.001 μg/ml 내지 20 μg/ml, 0.01 μg/ml 내지 15 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 1 μg/ml 내지 5 μg/ml, 2 μg/ml 내지 4 μg/ml, 또는 바람직하게는 대략 3 μg/ml의 농도에서 트리메토프림을 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 트리메토프림의 농도는 단계 (iv)에서 트리메토프림의 농도보다 낮다.
일 실시 형태에서, 단계 (ii)는 12시간 내지 168시간, 24시간 내지 144시간, 48시간 내지 120시간, 60시간 내지 108시간, 또는 72시간 내지 96시간의 성장을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
일 실시 형태에서, thyA 좌에 삽입을 갖는 세포는, 티민 또는 티미딘과 함께 또는 없이 37℃에서의 성장능과, 티민 또는 티미딘이 보충되지 않는 한 46℃에서의 성장 불능에 의해 확인될 수 있다. 추가의 또는 대안적인 확인은 thyA 서열에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 형질전환체로부터 키메라 유전자의 존재를 PCR에 의해 증폭시키는 것이다. 일부 실시 형태에서, 콜로니는 스크리닝되고 2 가지 유형으로 분리될 수 있다: i) 큰, 불투명한 콜로니(72시간 내지 96시간의 성장 후 2 내지 3 mm), ii) 반투명한, 더 작은 콜로니(72시간 내지 96시간의 성장 후 1 mm). 일부 실시 형태에서, 유형 (i) 콜로니는 선별될 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (iii)은 바실러스 종을 플라스미드로 형질전환시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 플라스미드는 선형화될 수 있으며, 바실러스 종 thyB 유전자의 좌측 아암의 적어도 일부, 이종성 유전자, 및 바실러스 종 thyB 유전자의 우측 아암의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 단계 (iii)은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 벡터로 수행될 수 있다. 형질전환은 전기천공을 사용하여 수행될 수 있다.
일 실시 형태에서, 바실러스 종은 2 mg/ml 미만의 농도에서 효모 추출물(YE)을 함유하는 배지에서 바실러스 종을 배양하는 단계를 수반하는 방법을 사용하여 제조되거나 전기천공-적격(electro-competent)으로 만들어질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 배지는 1.5 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.0001 mg/ml, 또는 0 mg/ml 미만의 농도에서 YE를 가진다. 일 실시 형태에서, 바실러스 종이 성장하는 배지는 YE를 함유하지 않는다. 가장 바람직한 실시 형태에서, 바실러스 종은 단계 (i) 및 (ii)에 의해 발생된 바와 같은 thyA 삽입을 갖는 균주이다.
일 실시 형태에서, YE는 본 방법의 임의의 단계에서 사용되는 배지에서 2 mg/ml 미만의 농도, 본원에 개시된 임의의 농도에서 존재하거나, 바람직하게는 존재하지 않는다.
일 실시 형태에서, 단계 (iv)는 80 μg/ml 이하, 40 μg/ml 이하, 30 μg/ml 이하, 0.01 μg/ml 내지 30 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 20 μg/ml, 1 μg/ml 내지 15 μg/ml, 2 μg/ml 내지 10 μg/ml, 5 μg/ml 내지 7 μg/ml, 또는 바람직하게는 대략 6 μg/ml의 농도에서 트리메토프림을 포함할 수 있는 배지를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 트리메토프림의 농도는 단계 (ii)에서 트리메토프림의 농도보다 높다.
카사미노산(CAA)은 카제인의 산 가수분해에 의해 생성된다. 전형적인 조성은 하기와 같지만, 이들 숫자는 근사치이고, 조성 내에서의 변동은 본 발명에 사용하기에 허용 가능하다: Ala 2.8%, Arg 3.6%, Asp 6.3%, 시스틴 0.3%, Glu 21.1%, Gly 2.2%, His 2.7%, Ile 5.6%, Leu 8.4%, Lys 7.5%, Met 2.7%, Phe 4.6%, Pro 9.9%, Ser 5.6%, Thr 4.2%, Trp 1.1%, Tyr 6.1%, Val 5.0%. CAA는 트립토판을 함유하지 않을 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (iv) 동안, 바실러스 종은 카사미노산(CAA)을 포함하는 배지에서 성장할 수 있다. 상기 배지는 0.0001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.01% 내지 1%, 0.05% 내지 0.5%, 0.1% 내지 0.3%, 또는 바람직하게는 대략 0.2%(w/v)에서 CAA를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (iv) 동안, 바실러스 종은 적어도 하나의 아미노산이 보충된 배지에서 성장될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 배지는 임의의 천연 발생 아미노산 또는 아미노산들, 및 선택적으로 모든 천연 발생 아미노산 또는 트립토판을 제외한 모든 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 배지는 세린, 글리신, 시스테인, 메티오닌, 이들의 임의의 조합, 또는 모든 4개 아미노산을 포함할 수 있다. 배지는 0.0001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.01% 내지 1%, 0.05% 내지 0.5%, 0.1% 내지 0.3%, 또는 바람직하게는 대략 0.2%(w/v)에서 CAA를 함유하는 배지와 동등한 농도에서 임의의 개별 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시 형태에서, 배지는 대략 0.2%(w/v)에서 CAA를 함유하는 배지와 동등한 농도에서 세린, 글리신, 시스테인, 및/또는 메티오닌을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 배지는 대략 0.2%(w/v)에서 CAA를 함유하는 배지와 동일한 아미노산을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 단계 (iv)는 6시간 내지 144시간, 12시간 내지 120시간, 24시간 내지 96시간, 36시간 내지 72시간, 또는 대략 48시간의 성장을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
일 실시 형태에서, 2개의 삽입을 갖는 세포는 37℃ 또는 46℃에서 티민 또는 티미딘이 보충되지 않는 한 성장 불능으로 확인될 수 있다. 추가의 또는 대안적인 확인은 thyA 및 thyB 서열에 어닐링하는 프라이머를 사용하여 형질전환체로부터 키메라 유전자의 존재를 PCR에 의해 증폭시키는 것이다.
임의의 이종성 유전자는 해당 또는 각각의 티미딜레이트 신타제 유전자 내로의 유전자 삽입에 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 이종성 유전자는 포자 코트 단백질, 예를 들어 비. 서브틸리스의 CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF 또는 CotG를 인코딩하는 유전자에 융합된다. 사용되는 포자 단백질은 변형되는 특정 박테리아 및 사용되는 적절한 유전자에 따라 선택될 수 있다. 클로스트리디움 종과 함께 사용되기에 적절한 포자 코트 단백질은 CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CdeC, BclA1, BclA2 또는 BclA3(53, 54, 55)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이종성 유전자는 thyA 유전자 내로 삽입될 수 있고, 동일한 이종성 유전자는 thyB 유전자 내로 삽입될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상이한 이종성 유전자는 thyB 유전자 내로 삽입된 것으로부터 thyA 유전자 내로 삽입될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 방법에 의해 제조된 생성된 포자는 백신화에 사용하기 위한 이종성 단백질을 가질 수 있다. 생성된 포자는 활성 효소로서 표시되는 이종성 단백질을 갖는다. 생성된 포자는 포자 표면으로의 단백질의 컨쥬게이션을 가능하게 하는 이종성 단백질을 가질 수 있다.
티민 또는 티미딘의 부재 하에 증식할 수 없는 이종성 유전자를 포함하는 균주의 발생 및 선별 후, 본 방법은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 배양은 티민 또는 티미딘, 2 mg/ml 미만의 농도에서의 YE 또는 부재하는 YE 및 적어도 하나의 아미노산 또는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 혼합물을 포함하는 임의의 배지 상에서 있을 수 있다. 농도는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 농도일 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 적어도 하나의 이종성 유전자를 비. 서브틸리스 내에 도입하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 상기 비. 서브틸리스가 증식할 수 없게 하는 방법이 제공되며, 바람직하게는 상기 방법은 항생제 내성 유전자의 도입을 수반하지 않으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이종성 유전자를 비. 서브틸리스 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계;
(ii) 트리메토프림 및 티민 또는 티미딘, 및 2 mg/ml 미만의 농도에서 YE의 존재 하에 상기 비. 서브틸리스를 성장시키는 단계로서, 선택적으로 YE가 존재하지 않는 단계;
(iii) 이종성 유전자를 상기 비. 서브틸리스 내의 thyA 유전자 또는 thyB 유전자 중 다른 것 내로 도입하는 단계; 및
(iv) 트리메토프림 및 티민 또는 티미딘, 및 2 mg/ml 미만의 농도에서 YE의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계로서, 선택적으로 YE가 존재하지 않는 단계.
바람직한 실시 형태에서, YE는 단계 (i) 후의 모든 단계 동안 2 mg/ml 미만의 농도, 바람직하게는 0 mg/ml의 농도에서 존재한다. 바람직한 실시 형태에서, 티민 또는 티미딘은 단계 (i) 후의 모든 배양물에 대해 존재한다. 바람직한 실시 형태에서, 이종성 유전자는 단계 (i) 동안 thyA 유전자 내로 도입되고, 이종성 유전자는 단계 (iii) 동안 thyB 유전자 내로 도입된다.
따라서, 본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 적어도 하나의 이종성 유전자를 비. 서브틸리스 내에 도입하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 상기 비. 서브틸리스가 증식할 수 없게 하는 방법이 제공되며, 바람직하게는 상기 방법은 항생제 내성 유전자의 도입을 수반하지 않으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이종성 유전자를 비. 서브틸리스 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계;
(ii) 트리메토프림의 존재 하에 그리고 티민 또는 티미딘의 존재 하에 상기 비. 서브틸리스를 성장시키는 단계;
(iii) 이종성 유전자를 상기 비. 서브틸리스 내의 thyA 유전자 또는 thyB 유전자 중 다른 것 내로 도입하는 단계; 및
(iv) 트리메토프림 및 티민 또는 티미딘, 및 적어도 하나의 아미노산의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계로서, 선택적으로 CAA가 존재하는 단계.
바람직한 실시 형태에서, 티민 또는 티미딘은 단계 (i) 후의 모든 배양물에 대해 존재한다. 바람직한 실시 형태에서, 이종성 유전자는 단계 (i) 동안 thyA 유전자 내로 도입되고, 이종성 유전자는 단계 (iii) 동안 thyB 유전자 내로 도입된다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 제1 양태의 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 박테리아 포자가 제공된다.
바람직하게는, 박테리아 포자는 바실러스 종이고, 바람직하게는 그 안에서 이종성 유전자의 도입으로 인해 비-기능적 thyA 및 thyB 유전자를 포함한다.
제3 양태에서, 적어도 하나의 이종성 유전자를 포함하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 증식할 수 없는 박테리아 포자가 제공되며, 상기 박테리아 포자는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:
(i) 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내의 티미딜레이트 신타제 유전자 내로 도입하는 단계;
(ii) 트리메토프림의 존재 하에 상기 포자-형성 박테리아를 성장시키는 단계; 및
(iii) 상기 포자-형성 박테리아로부터 박테리아 포자를 형성하는 단계.
바람직한 실시 형태에서, 박테리아 포자는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다.
바람직한 실시 형태에서, 박테리아 포자는 바실러스 종일 수 있다. 바실러스 종 박테리아는 비. 서브틸리스, 비. 세레우스, 비. 푸밀루스, 비. 아밀로리쿼파세안스, 비. 코아굴란스, 비. 클라우시이, 비. 리케니포르미스 또는 비. 메가테리움일 수 있다. 가장 바람직하게는, 바실러스 종 박테리아는 비. 서브틸리스이다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 박테리아 포자는 클로스트리디움 종일 수 있다. 클로스트리디움 종 박테리아는 씨. 디피실레, 씨. 페르프린겐스, 씨. 테타니, 씨. 보툴리눔, 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 셀룰로리티쿰, 씨. 노비이 또는 씨. 테르모셀룸일 수 있다. 가장 바람직하게는, 클로스트리디움 종 박테리아는 클로스트리디움 디피실레이다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종성 유전자를 포함하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 증식할 수 없는 박테리아 포자가 제공되며, 상기 박테리아 포자는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 방법에 의해 또는 개시된 바와 같은 임의의 배양 또는 조건을 사용하여 생성된다.
본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 적어도 하나의 이종성 유전자를 포함하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 증식할 수 없는 바실러스 종 포자가 제공되며, 상기 바실러스 종 포자는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:
(i) 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계;
(ii) 트리메토프림의 존재 하에 그리고 티민 또는 티미딘의 존재 하에, 선택적으로 2 mg/ml 미만의 농도에서 YE의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계로서, 바람직하게는 YE가 존재하지 않는 단계;
(iii) 이종성 유전자를 상기 바실러스 종 내의 thyA 유전자 또는 thyB 유전자 중 다른 것 내로 도입하는 단계; 및
(iv) 선택적으로 단계 (ii)에서보다 높은 농도에서 트리메토프림의 존재 하에, 그리고 티민 또는 티미딘의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계로서,
선택적으로 2 mg/ml 미만의 농도에서 YE의 존재 하에 성장시키며, 바람직하게는 YE가 존재하지 않고,
선택적으로 적어도 하나의 아미노산의 존재 하에 성장시키며, 선택적으로 CAA가 존재하는 단계; 및
(v) 상기 바실러스 종으로부터 박테리아 포자를 형성하는 단계.
바람직한 실시 형태에서, 이종성 유전자는 단계 (i) 동안 thyA 유전자 내로 도입되고, 이종성 유전자는 단계 (iii) 동안 thyB 유전자 내로 도입된다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내의 thyA 유전자 내로 도입하는 데 사용하기 위한 벡터가 제공된다.
일 실시 형태에서, 벡터는 바실러스 종 thyA 유전자의 5' 부분 중 적어도 일부, 이종성 유전자, 및 바실러스 종 thyA 유전자의 3' 부분 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 벡터는 바실러스 종 thyA 유전자의 좌측 아암 및 우측 아암을 포함할 수 있다. 상기 아암은 다중 클로닝 부위의 측면에 있을 수 있다. 예를 들어, 벡터는 비. 서브틸리스 thyA 유전자의 좌측(예를 들어 900 bp) 아암 및 우측(예를 들어 950 bp) 아암을 포함할 수 있다.
측면 아암의 길이는 삽입되는 이종성 서열의 길이에 대해 조정될 수 있다. 더 긴 측면 아암(예를 들어 약 1500 bp)은 큰 삽입물에 필요할 수 있다.
벡터는 다중 클로닝 부위에 삽입되는 이종성 유전자를 포함할 수 있다. 상기 이종성 유전자는 이종성 유전자에 융합된 포자 코트 단백질을 포함하는 키메라 유전자일 수 있다. 예를 들어, 포자 코트 단백질은 비. 서브틸리스의 CotB 또는 CotC일 수 있다. 벡터는: 바실러스 종 thyA 유전자의 좌측 아암, 포자 코트 단백질, 이종성 유전자가 포자 코트 단백질에 융합되도록 상기 이종성 유전자의 삽입을 가능하게 하는 다중 클로닝 부위, 및 바실러스 종 thyA 유전자의 우측 아암을 포함할 수 있다.
하나의 순수하게 예시적인 실시 형태에서, thyA의 좌측 아암은 하기와 같이 SEQ ID NO: 3으로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
CAGATCATATAAGGAATGAACCGCTGCCAAATATCATAAAAAAGTTGTTAATGATCAAATGAATGAAATTAGAGAGAATTTATTTTAAAGAAAGCCCAATTGCACATGGACAAATGACAATTGATATTGAGGTAAAATACAATGCATTAAATCAGAAAAAGCTATTGGAGGATTTAATGTGTTTAGACAATTTCCAATTTGGTATACACAAACACCTGACTATTTGAATTTTTATGTACCGCAATATCAAACCATTTCGTATAATCCTCAACAATGTTATCAACGGTGTATGTACCAAACTGGCGGTAACTATGAGCTATGTGACAGACTATGTTATGGAGAAATACAGGTGTAAAAGAGGGGGATTAACTCCTCTTTAAACACACAGTGAGTGGAATAAGATCCTCACTTTATCTGCAAGTGCTTAGTATTTGCGATAATATTGCATTCGTAATAAATTATGCTTAGCAACTGAAAATGAAAGAAGGATATGAATAGTCATGACGCAATTCGATAAACAATACAATTCAATTATAAAGGATATTATCAATAATGGAATCTCAGACGAAGAGTTTGATGTAAGAACCAAGTGGGACTCAGATGGAACACCGGCACATACTCTAAGTGTAATCAGTAAGCAAATGAGATTCGACAACTCAGAGGTTCCGATTTTAACGACAAAAAAGGTTGCCTGGAAAACAGCCATTAAAGAGTTGCTCTGGATTTGGCAGCTGAAATCTAATGATGTTAATGATTTAAACATGATGGGCGTCCATATTTGGGATCAGTGGAAACAAGAAGACGGAACCATCGGACATGCATATGGATTTCAGCTGGGGAAGAAAAACAGAAGTCTAAATGGAGAAAAAGTGGATCAGGTAGACTATCTTCTTCATCAAT
[SEQ ID NO: 3]
볼드체 서열은 thyA 코딩 서열을 나타내고, 비-볼드체 서열은 업스트림 영역을 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 3으로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
하나의 순수하게 예시적인 실시 형태에서, thyA의 우측 아암은 하기와 같이 SEQ ID NO: 4로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
TGAAGAACAATCCATCTTCACGCAGACACATTACAATGCTGTGGAATCCTGATGAATTAGACGCAATGGCCTTAACGCCATGTGTATACGAGACACAATGGTACGTTAAACATGGGAAACTCCACCTTGAGGTAAGAGCACGGAGCAATGATATGGCATTGGGAAATCCATTCAATGTATTCCAGTATAATGTGTTGCAGCGCATGATTGCTCAAGTGACTGGTTATGAGCTTGGTGAATATATCTTTAACATTGGGGATTGCCATGTGTACACACGTCATATAGACAATTTGAAAATTCAAATGGAAAGAGAACAGTTTGAAGCACCTGAACTATGGATCAATCCTGAAGTGAAAGATTTTTATGACTTTACCATTGATGATTTCAAGTTAATCAACTATAAACATGGGGACAAGCTTTTATTTGAGGTAGCGGTTTAATGCTGCCTTTTTATTGTGCAGTGAATAGATAGCAGGTATCCTAATTTCATTAAGCAATCTGGAAGATGAATAAAAATTGAAGGACAAACACGTATAATACATAAAAAAGATTAACTCTACAGTTAATCTTTTTTATTCAGAAGAAAATATCCTAACTTTGAAACTAAATACAAAGTAAAAGCAATCATTACAGTTCTAGATATTACAATTCCATGAATAGCTAGATCATATCCAGCAGGTATCAACGCATTTGTATTACACATAAAATATATAGATATTAGAAGTGCTACAATAACTAAAATCATTCCAAAAAGACTTGTTTTTTCATATTTCATACCAATTTCCACCCTTATTAAAGTTAGGTTTAAACAAAAGAGCTGAAGAAACGAACTATGACCAGTATGCTCCAAGGAAAACCGCCAGACAATGCTGGCGGCTTTTTGCTGCTTCGTTTATTTATTAACAGAGATCGTAACGTTATTTCCTGCAACTGAAACCTTTGCGAAATCC
[SEQ ID NO: 4]
볼드체 서열은 thyA 코딩 서열을 나타내고, 비-볼드체 서열은 다운스트림 영역을 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 4로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
임의의 적합한 다중 클로닝 부위는 본 발명의 벡터에 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 다중 클로닝 부위는 하기와 같이 SEQ ID NO: 5로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGGGTACCGAGCTCGAATTC
[SEQ ID NO: 5]
따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 5로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
하나의 순수하게 예시적인 실시 형태에서, thyA 벡터는 하기와 같이 SEQ ID NO: 6으로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다:
CAGATCATATAAGGAATGAACCGCTGCCAAATATCATAAAAAAGTTGTTAATGATCAAATGAATGAAATTAGAGAGAATTTATTTTAAAGAAAGCCCAATTGCACATGGACAAATGACAATTGATATTGAGGTAAAATACAATGCATTAAATCAGAAAAAGCTATTGGAGGATTTAATGTGTTTAGACAATTTCCAATTTGGTATACACAAACACCTGACTATTTGAATTTTTATGTACCGCAATATCAAACCATTTCGTATAATCCTCAACAATGTTATCAACGGTGTATGTACCAAACTGGCGGTAACTATGAGCTATGTGACAGACTATGTTATGGAGAAATACAGGTGTAAAAGAGGGGGATTAACTCCTCTTTAAACACACAGTGAGTGGAATAAGATCCTCACTTTATCTGCAAGTGCTTAGTATTTGCGATAATATTGCATTCGTAATAAATTATGCTTAGCAACTGAAAATGAAAGAAGGATATGAATAGTCATGACGCAATTCGATAAACAATACAATTCAATTATAAAGGATATTATCAATAATGGAATCTCAGACGAAGAGTTTGATGTAAGAACCAAGTGGGACTCAGATGGAACACCGGCACATACTCTAAGTGTAATCAGTAAGCAAATGAGATTCGACAACTCAGAGGTTCCGATTTTAACGACAAAAAAGGTTGCCTGGAAAACAGCCATTAAAGAGTTGCTCTGGATTTGGCAGCTGAAATCTAATGATGTTAATGATTTAAACATGATGGGCGTCCATATTTGGGATCAGTGGAAACAAGAAGACGGAACCATCGGACATGCATATGGATTTCAGCTGGGGAAGAAAAACAGAA GTCTAAATGGAGAAAAAGTGGATC AGGTAGACTATCTTCTTCATCAATAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGGGTACCGAGCTCGAATTCTGAAGAACAATCCATCTTCACGCAGACACATTACAATGCTGTGGAATCCTGAT GAATTAGACGCAATGGCCTTAAC GCCATGTGTATACGAGACACAATGGTACGTTAAACATGGGAAACTCCACCTTGAGGTAAGAGCACGGAGCAATGATATGGCATTGGGAAATCCATTCAATGTATTCCAGTATAATGTGTTGCAGCGCATGATTGCTCAAGTGACTGGTTATGAGCTTGGTGAATATATCTTTAACATTGGGGATTGCCATGTGTACACACGTCATATAGACAATTTGAAAATTCAAATGGAAAGAGAACAGTTTGAAGCACCTGAACTATGGATCAATCCTGAAGTGAAAGATTTTTATGACTTTACCATTGATGATTTCAAGTTAATCAACTATAAACATGGGGACAAGCTTTTATTTGAGGTAGCGGTTTAATGCTGCCTTTTTATTGTGCAGTGAATAGATAGCAGGTATCCTAATTTCATTAAGCAATCTGGAAGATGAATAAAAATTGAAGGACAAACACGTATAATACATAAAAAAGATTAACTCTACAGTTAATCTTTTTTATTCAGAAGAAAATATCCTAACTTTGAAACTAAATACAAAGTAAAAGCAATCATTACAGTTCTAGATATTACAATTCCATGAATAGCTAGATCATATCCAGCAGGTATCAACGCATTTGTATTACACATAAAATATATAGATATTAGAAGTGCTACAATAACTAAAATCATTCCAAAAAGACTTGTTTTTTCATATTTCATACCAATTTCCACCCTTATTAAAGTTAGGTTTAAACAAAAGAGCTGAAGAAACGAACTATGACCAGTATGCTCCAAGGAAAACCGCCAGACAATGCTGGCGGCTTTTTGCTGCTTCGTTTATTTATTAACAGAGATCGTAACGTTATTTCCTGCAACTGAAACCTTTGCGAAATCC
[SEQ ID NO: 6]
따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 6으로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 이종성 유전자의 삽입을 확인하는 데 사용될 수 있을 예시적인 프라이머 어닐링 부위는 볼드체와 밑줄로 제시된다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내의 thyB 유전자 내로 도입하는 데 사용하기 위한 벡터가 제공된다.
일 실시 형태에서, 벡터는 바실러스 종 thyB 유전자의 5' 부분 중 적어도 일부, 이종성 유전자, 및 바실러스 종 thyB 유전자의 3' 부분 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 벡터는 바실러스 종 thyB 유전자의 좌측 아암 및 우측 아암을 포함할 수 있다. 상기 아암은 다중 클로닝 부위의 측면에 있을 수 있다. 예를 들어, 벡터의 비. 서브틸리스 thyB 유전자의 좌측 아암(900 bp) 및 우측 아암(1.1 kb)을 포함할 수 있다.
측면 아암의 길이는 삽입되는 이종성 서열의 길이에 대해 조정될 수 있다. 더 긴 측면 아암(예를 들어 약 1500 bp)은 큰 삽입물에 필요할 수 있다.
벡터는 다중 클로닝 부위에서 삽입되는 이종성 유전자를 포함할 수 있다. 상기 이종성 유전자는 이종성 유전자에 융합된 포자 코트 단백질을 포함하는 키메라 유전자일 수 있다. 예를 들어, 포자 코트 단백질은 비. 서브틸리스의 CotB 또는 CotC일 수 있다. 벡터는: 바실러스 종 thyB 유전자의 좌측 아암, 포자 코트 단백질, 이종성 유전자가 포자 코트 단백질에 융합되도록 상기 이종성 유전자의 삽입을 가능하게 하는 다중 클로닝 부위, 및 바실러스 종 thyB 유전자의 우측 아암을 포함할 수 있다.
순수하게 예시적인 실시 형태에서, thyB의 좌측 아암은 하기와 같이 SEQ ID NO: 7로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
CCAAATCTGCCGCTCAGTGTTTGCATGGAGAATGTAGAAAAAGTCCTGAACAAACGTGAAATTATTCATGCTGTTTTGACAGGCCTTGCACTCGATCAGCTTGCAGAACAGAAACTTCTCCCCGAACCGCTGCAGCACCTTGTTGAAACGGATGAACCGCTTTACGGCATAGATGAAATTATCCCGCTTTCAATCGTTAATGTGTACGGGTCGATCGGTTTGACCAATTTCGGTTATTTGGATAAAGAGAAGATTGGAATTATTAAGGAACTTGATGAAAGTCCAGACGGTATTCACACCTTTTTGGATGATATTGTGGCAGCTCTTGCTGCAGCAGCGGCGAGCAGAATTGCACATACGCATCAGGATCTGCAAGATGAAGAAAAAGAACAGGATGAAAAGCCTGTCGTCAGCTGACTATAAAAAAATCATTTCTGGGTTCAGAAATGATTTTTTATTGTGTTACACTACTAGAAGACTACTTTTAAAGGATGAAAAAAATGAAACAGTATAAGGATTTCTGCAGACATGTTTTAGAGCATGGTGAGAAAAAGGGAGACCGGACTGGGACCGGAACAATCAGCACTTTCGGATATCAAATGAGATTTAATTTACGGGAAGGCTTTCCGATGCTCACCACTAAAAAACTCCACTTTAAATCAATTGCGCATGAACTGCTGTGGTTCTTAAAAGGAGATACGAATGTACGCTATCTGCAGGAAAACGGAGTGCGAATCTGGAATGAGTGGGCTGATGAAAACGGTGAACTTGGACCTGTATATGGCTCCCAATGGCGTTCTTGGCGGGGAGCTGATGGAGAAACCATTGATCAAATTTCCCGTCTTATTGAAGATATTAAAACAAATCCGAACTCCAGACGCTTAATCGTCAGCGCCTGGA
[SEQ ID NO: 7]
볼드체 서열은 thyB 코딩 서열을 나타내고, 비-볼드체 서열은 업스트림 영역을 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 7로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
하나의 순수하게 예시적인 실시 형태에서, thyB의 우측 아암은 하기와 같이 SEQ ID NO: 8로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
ATGTTGGTGAAATTGATAAAATGGCGTTGCCGCCGTGCCATTGCCTGTTCCAATTCTATGTGTCTGACGGCAAGCTGTCCTGTCAGCTGTATCAGCGCTCTGCCGATGTTTTCTTAGGTGTGCCGTTTAATATTGCATCTTATGCCCTCCTAACCATGATCATTGCTCATGTGACTGGGCTTGAACCGGGCGAGTTCATCCATACGTTTGGTGATGTTCATATTTACCAAAATCATATTGAACAAGTCAATTTGCAGCTGGAAAGAGATGTTAGACCGCTTCCGCAGCTTCGTTTCGCCAGAAAGGTTGATTCTATTTTTAACTTTGCATTTGAGGACTTTATCATCGAGGATTATGATCCGCATCCTCATATAAAAGGGGCGGTCAGCGTATGATTTCATTCATTTTTGCGATGGATGCCAACAGGCTTATCGGCAAAGACAATGATTTGCCGTGGCATTTGCCCAATGATCTTGCATACTTTAAGAAAATAACATCGGGCCATTCAATCATTATGGGCCGGAAAACATTTGAATCGATCGGACGTCCGCTTCCAAATCGGAAAAATATTGTCGTTACCTCAGCGCCGGATTCAGAATTTCAGGGATGCACGGTTGTCAGTTCATTAAAGGATGTACTGGACATTTGTTCAGGCCCTGAAGAATGCTTTGTGATCGGAGGGGCTCAGCTCTATACGGACCTGTTCCCTTATGCGGACAGACTGTATATGACGAAAATTCATCACGAGTTTGAGGGTGACCGTCACTTTCCTGAATTTGATGAATCCAATTGGAAGCTGGTTTCTTCTGAGCAGGGGACCAAAGACGAAAAAAACCCGTATGATTACGAATTTCTAATGTATGAAAAAAAGAAATCTTCTAAAGCGGGAGGATTTTAATTGGTTCGCTACAGCCTTCTAGTGGTTTATATTGTGTATATGCTGTTAAAAAATATGAAACAATTATTTAATCAAACAATGCTCGATCCCCGTCTGTCATACAAAAAACAGATGGCTCTTGTGTACGAACAGCCAAAGGCGTTTTTAGAAGGCTGTATCGGCATCTCCGGTTCAGTTGTGACGATCCATCAGCCAGA
[SEQ ID NO: 8]
볼드체 서열은 thyB 코딩 서열을 나타내고, 비-볼드체 서열은 다운스트림 영역을 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 8로실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
thyA 서열과 thyB 서열 둘 모두의 상기 예시적인 실시 형태는 예를 의도한다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 서열은 종들 사이에 다양할 것이고, 특히 업스트림 서열과 다운스트림 서열 사이에 상당한 변동성이 존재한다.
임의의 적합한 다중 클로닝 부위는 본 발명의 벡터에 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 다중 클로닝 부위는 하기와 같이 SEQ ID NO: 9로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGGGTACCGAGCTCGAATTCTG
[SEQ ID NO: 9]
따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 9로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
일 실시 형태에서, thyB 벡터는 하기와 같이 SEQ ID NO: 10으로서 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다:
CCAAATCTGCCGCTCAGTGTTTGCATGGAGAATGTAGAAAAAGTCCTGAACAAACGTGAAATTATTCATGCTGTTTTGACAGGCCTTGCACTCGATCAGCTTGCAGAACAGAAACTTCTCCCCGAACCGCTGCAGCACCTTGTTGAAACGGATGAACCGCTTTACGGCATAGATGAAATTATCCCGCTTTCAATCGTTAATGTGTACGGGTCGATCGGTTTGACCAATTTCGGTTATTTGGATAAAGAGAAGATTGGAATTATTAAGGAACTTGATGAAAGTCCAGACGGTATTCACACCTTTTTGGATGATATTGTGGCAGCTCTTGCTGCAGCAGCGGCGAGCAGAATTGCACATACGCATCAGGATCTGCAAGATGAAGAAAAAGAACAGGATGAAAAGCCTGTCGTCAGCTGACTATAAAAAAATCATTTCTGGGTTCAGAAATGATTTTTTATTGTGTTACACTACTAGAAGACTACTTTTAAAGGATGAAAAAAATGAAACAGTATAAGGATTTCTGCAGACATGTTTTAGAGCATGGTGAGAAAAAGGGAGACCGGACTGGGACCGGAACAATCAGCACTTTCGGATATCAAATGAGATTTAATTTACGGGAAGGCTTTCCGATGCTCACCACTAAAAAACTCCACTTTAAATCAATTGCGCATGAACTGCTGTGGTTCTTAAAAGGAGATACGAATGTACGCTATCTGCAGGAAAACGGAGTGCGAATCTGGAATGAGTGGGCTGATGAAAACGGTGAACTTGGACCTGTATATGGCTCCCAATGGCGTTCTTGGCGGGGAGCTGATGGAGAAACCATTGATCAAATTTCCCGTCTTATTGAA GATATTAAAACAAATCCGAACTC CAGACGCTTAATCGTCAGCGCCTGGAAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGGGTACCGAGCTCGAATTCTGATGTTGGTGAAATTGATAAAATGGCGTTGCCGCCGTGCCATTGCCTGTTC CAATTCTATGTGTCTGAC GGCAAGCTGTCCTGTCAGCTGTATCAGCGCTCTGCCGATGTTTTCTTAGGTGTGCCGTTTAATATTGCATCTTATGCCCTCCTAACCATGATCATTGCTCATGTGACTGGGCTTGAACCGGGCGAGTTCATCCATACGTTTGGTGATGTTCATATTTACCAAAATCATATTGAACAAGTCAATTTGCAGCTGGAAAGAGATGTTAGACCGCTTCCGCAGCTTCGTTTCGCCAGAAAGGTTGATTCTATTTTTAACTTTGCATTTGAGGACTTTATCATCGAGGATTATGATCCGCATCCTCATATAAAAGGGGCGGTCAGCGTATGATTTCATTCATTTTTGCGATGGATGCCAACAGGCTTATCGGCAAAGACAATGATTTGCCGTGGCATTTGCCCAATGATCTTGCATACTTTAAGAAAATAACATCGGGCCATTCAATCATTATGGGCCGGAAAACATTTGAATCGATCGGACGTCCGCTTCCAAATCGGAAAAATATTGTCGTTACCTCAGCGCCGGATTCAGAATTTCAGGGATGCACGGTTGTCAGTTCATTAAAGGATGTACTGGACATTTGTTCAGGCCCTGAAGAATGCTTTGTGATCGGAGGGGCTCAGCTCTATACGGACCTGTTCCCTTATGCGGACAGACTGTATATGACGAAAATTCATCACGAGTTTGAGGGTGACCGTCACTTTCCTGAATTTGATGAATCCAATTGGAAGCTGGTTTCTTCTGAGCAGGGGACCAAAGACGAAAAAAACCCGTATGATTACGAATTTCTAATGTATGAAAAAAAGAAATCTTCTAAAGCGGGAGGATTTTAATTGGTTCGCTACAGCCTTCTAGTGGTTTATATTGTGTATATGCTGTTAAAAAATATGAAACAATTATTTAATCAAACAATGCTCGATCCCCGTCTGTCATACAAAAAACAGATGGCTCTTGTGTACGAACAGCCAAAGGCGTTTTTAGAAGGCTGTATCGGCATCTCCGGTTCAGTTGTGACGATCCATCAGCCAGA
[SEQ ID NO: 10]
따라서, 바람직하게는, 벡터는 SEQ ID NO: 10으로 실질적으로 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 이종성 유전자의 삽입을 확인하는 데 사용될 수 있을 예시적인 프라이머 어닐링 부위는 볼드체와 밑줄로 제시된다.
본 발명의 제6 양태에 따르면, 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위한 시약을 포함하는 키트가 제공된다.
일 실시 형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 배지를 포함할 수 있으며, 상기 배지는 예를 들어 2 mg/ml 미만의 농도에서 YE를 포함하거나 YE를 포함하지 않을 수 있다. 상기 키트는 트리메토프림을 포함할 수 있다. 상기 키트는 트리메토프림을 포함하는 배지를 포함할 수 있으며, 선택적으로 2개의 배지 중 하나의 배지는 나머지 다른 배지보다 높은 수준의 트림메토프림을 갖는다. 상기 키트는 CAA를 포함할 수 있다. 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 아미노산, 또는 임의의 조합 또는 농축물을 포함할 수 있다. 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 키트의 용도를 설명하거나 임의의 방법을 설명하는 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 적어도 하나의 용기, 예를 들어 페트리 디쉬를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 상기 키트는 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 상기 키트는 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내의 thyA 유전자 내로 도입하는 데 사용하기 위한 벡터 및/또는 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내의 thyB 유전자 내로 도입하는 데 사용하기 위한 벡터를 포함할 수 있다. 상기 키트는 이종성 유전자, 예컨대 백신, 컨쥬게이션 단백질 또는 효소에 대한 유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 키트는 포자 코트 단백질을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 포자 코트 단백질은 이종성 유전자에 쉽게 부착 가능하도록 예를 들어 다중 클로닝 부위에 근접하에 배치될 수 있다.
본 발명은 임의의 핵산 또는 펩타이드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체까지 확장되며, 이는 이의 기능적 변이체 또는 기능적 단편을 포함하여 본원에서 지칭되는 실질적으로 임의의 서열의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "실질적으로 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열", "기능적 변이체" 및 "기능적 단편"은, 본원에서 지칭되는 서열 중 임의의 하나의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열과 적어도 40% 서열 동일성, 예를 들어 SEQ ID No: 1 ~ 19로 나타내는 서열과 40% 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
본원에서 지칭되는 임의의 서열과 50% 초과, 보다 바람직하게는 65%, 70%, 75% 초과, 보다 더 바람직하게는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열도 또한, 예상된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열은 본원에서 지칭되는 임의의 서열과 적어도 85% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 본원에서 지칭되는 임의의 서열과 적어도 99% 동일성을 가진다.
당업자는, 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 사이에서 동일성 퍼센트를 어떻게 계산하는지 이해할 것이다. 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 사이에서 동일성 퍼센트를 계산하기 위해, 2개의 서열의 정렬이 우선 준비되어야 하고, 뒤이어 서열 동일성 값의 계산이 이루어져야 한다. 2개의 서열의 동일성 퍼센트는 하기에 따라 상이한 값을 취할 수 있다: (i) 서열을 정렬하는 데 사용되는 방법, 예를 들어, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램으로 실시됨), 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; 및 (ii) 정렬 방법에 의해 사용되는 매개변수, 예를 들어, 로컬 대 글로벌 정렬, 사용되는 짝-점수 매트릭스(pair-score matrix)(예를 들어 BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등), 및 갭-페널티, 예를 들어 기능적 형태 및 상수.
정렬을 한 후, 2개 서열 사이에서 동일성 퍼센트를 계산하는 상이한 방식이 많이 존재한다. 예를 들어, 당업자는 동일성의 수를 하기의 것으로 나눌 수 있다: (i) 최단 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 비-갭(non-gap) 위치의 수; 또는 (iv) 오버행을 배제한 등가(equivalenced) 위치의 수. 더욱이, 동일성 퍼센트는 또한, 강하게 길이 의존적인 것으로 이해될 것이다. 따라서, 서열 짝이 짧을수록, 당업자가 우연히 발생할 것으로 예상할 수 있는 서열 동일성은 더 높다.
그러므로, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬은 복잡한 과정인 것으로 인식해야 할 것이다. 일반적인 다중 정렬 프로그램 ClustalW(문헌[Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882])는 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성하기 위한 바람직한 방식이다. ClustalW에 적합한 매개변수는 하기와 같을 수 있다: DNA 정렬의 경우: 갭 오픈 페널티 = 15.0, 갭 익스텐션 페널티 = 6.66, 및 매트릭스 = 동일성. 단백질 정렬의 경우: 갭 오픈 페널티 = 10.0, 갭 익스텐션 페널티 = 0.2, 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬의 경우: ENDGAP = -1, 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위해 이들 매개변수 및 기타 매개변수를 변경해야 할 필요성이 있음을 알 것이다.
그 후에 바람직하게는, 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 사이에서 동일성 퍼센트의 계산은 이러한 정렬 (N/T)*100로부터 계산될 수 있으며, 여기서, N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이고, T는 갭을 포함하고 오버행을 포함하거나 배제하는 것과 비교된 위치의 총 수이다. 바람직하게는, 오버행은 계산에 포함된다. 그러므로, 2개의 서열 사이에서 동일성 퍼센트를 계산하는 가장 바람직한 방법은 (i) 예를 들어 상기 제시된 바와 같은 적합한 매개변수 세트를 사용하는 ClustalW 프로그램을 사용하여 서열 정렬을 준비하는 단계; 및 (ii) N 및 T 값을 하기 식: 서열 동일성 = (N/T)*100에 삽입하는 단계를 포함한다.
유사한 서열을 식별하는 대안적인 방법은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열은 엄격한 조건 하에, 제시된 서열 또는 이들의 보체와 혼성화하는 서열에 의해 인코딩될 것이다. 엄격한 조건이란, 본 발명자들은 뉴클레오타이드가 대략 45℃에서 3x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)에서 필터-결합된 DNA 또는 RNA에 혼성화하고, 뒤이어 대략 20℃ 내지 65℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서 적어도 1회 세척되는 것을 의미한다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩타이드는 제시된 서열과 적어도 1개, 그러나 5, 10, 20, 50 또는 100개 미만의 아미노산이 상이할 수 있다.
유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 본원에 기재된 임의의 핵산 서열은 이에 의해 인코딩되는 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 다양해지거나 변화되어 이의 기능적 변이체를 제공할 수 있음이 분명하다. 적합한 뉴클레오타이드 변이체는, 서열 내의 동일한 아미노산을 인코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 가져서 침묵 변화(silent change)를 생성하는 변이체들이다. 다른 적합한 변이체는, 상동성 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 치환하는 아미노산과 유사한 생물물리학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 인코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되는 서열 모두 또는 일부를 포함하여 보존적 변화를 생성하는 변이체들이다. 예를 들어, 작은 비-극성, 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 큰 비-극성, 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 따라서, 어떤 아미노산이 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있는지 이해될 것이고, 당업자는 이들 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 알 것이다.
본원(임의의 첨부된 청구항, 요약서 및 도면을 포함함)에 기재된 모든 특징, 및/또는 이렇게 개시된 임의의 방법 또는 과정의 모든 단계는, 이러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호배타적인 경우의 조합을 제외하고는 임의의 조합으로 임의의 상기 양태와 조합될 수 있다.
본 발명의 보다 양호한 이해를 위해, 그리고 본 발명의 실시 형태가 어떻게 효과적으로 수행될 수 있는지 보여주기 위해, 이제 예를 들어 첨부된 개략적인 도면을 참조로 할 것이며, 도면에서:
도 1은 균주 구축을 그래프로 나타낸 것이다. 비. 서브틸리스의 thyA 및 thyB 좌에 이소성 삽입을 구축하기 위해 2개의 단계가 필요하다. 단계 1에서, 키메라 유전자를 갖는 pThyA 플라스미드가 선형화되고(ApaII 분해), DNA-매개 형질전환에 의해 야생형 비. 서브틸리스 균주(이 경우 균주 PY79)의 세포 내로 도입된다. TmR 형질전환체는 트리메토프림(3 μg/ml) 및 티민(50 μg/ml)을 함유하는 SMM 한천 상에서 선별되고, 제시된 바와 같이 마커 대체에 의해 키메라 유전자와 함께 상동성 thyA DNA의 삽입을 갖는다. 제2 단계에서, 동일하거나 상이한 키메라 유전자를 갖는 pThyB 벡터의 선형화된 플라스미드 DNA는 제1 단계에서 생성된 thyA 삽입 균주의 세포 내로 도입된다. TmR에 대한 선별은 트리메토프림(6 μg/ml 초과) 및 티민(50 μg/ml)을 함유하는 SMM + CAA 한천 상에서 이루어진다;
도 2는 최소 배지에서의 균주의 성장을 그래프로 나타낸 것이다. 야생형 PY79(패널 A), SH13 thyA::cotB-tcdA 26-39 (패널 B) 및 SH14 thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 (패널 C)는 티민 보충(50 μg/ml)과 함께(채워진 부호) 또는 티민 보충 없이(채워지지 않은 부호) SMM 배지에서 37℃에서 성장시켰다;
도 3은 포자 코트 발현을 보여준다. thyA 및 thyB 좌에 삽입을 갖는 비. 서브틸리스 균주는 순수(pure) 포자의 조제물로부터 추출된 포자 코트 단백질의 웨스턴 블로팅으로 검사하였다. 각각의 패널은 야생형 포자(PY79), thyA 및 thyB 삽입을 갖는 포자(AB), 또는 패널 D 외에도 thyA 삽입만 갖는 포자(A)의 추출물에서 수득된 밴드를 보여준다. 패널 A 및 B는 항-VP28(패널 A) 및 항-VP26(패널 B) 항체를 이용한 SH12 thyA::cotB-vp26 thyB::cotC-vp28의 분석을 보여준다. 패널 C는 SH14 thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 의 분석을 보여준다. 패널 D는 SH16 thyA::cotB-SA thyB::cotB-SA의 분석을 보여준다. 키메라 단백질에 상응하는 밴드는 관련 코트 단백질 앵커(CotB 또는 CotC)와 함께 (*)로 표시되어 있다. 1개 웰 당 로딩된 단백질은 2 X 108개 포자로부터의 추출에 해당한다(방법 참조);
도 4는 "완전(whole) 포자 ELISA"로 확인된 표면 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 패널 A; 마이크로타이터 플레이트는 PY79 (spo + ), PP108(amyE::cotC-tcdA 26-39 thrC::cotB-tcdA 26-39 ), SH13(thyA::cotB-tcdA 26-39 ) 및 SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 )의 포자(2 X 108/웰)로 코팅된 다음, 항-포자(1:1,000) 또는 항-TcdA26-39(1:500) 토끼 PAb로 프로브화(probe)하였다. 2차 PAb는 1:5,000이었고, 미접촉(naive) 혈청은 비교를 위해 사용하였으며, 기저 수준은 차감하였다.
패널 B; 패널 A에서와 같으나, 항-포자(1:1,000) 또는 항-VP28(1:300) 토끼 PAb로 프로브화된 PY79, AC01(thyA::cotB-vp28) 및 AC02(thyA::cotB-vp28 thyB::cotB-vp28)의 포자를 사용한다;
도 5는 풍부한 배지에서의 균주의 성장을 그래프로 나타낸 것이다. 37℃에서 PY79(■), SH13(●) 및 SH14(▲)의 성장은 하기로 이루어졌다: 패널 A, LB + 티민(50 μg/ml); 패널 B, LB; 패널 C, DSM + 티민(50 μg/ml) 및 패널 D, DSM;
도 6은 뮤린 GI-관(tract)에서의 생존율을 그래프로 나타낸 것이다. thyA 및 thyB 좌에 삽입을 갖는 SH14, 또는 클로람페니콜 내성 마커로 태깅된 본질적으로 야생형의 균주인 SH250의 단일 경구 용량의 포자(2 X 109)를 마우스(n= 5/gp)에 주입하였다. 배설물에서의 열 내성 포자의 수는 투약-후 12일 동안 확인하였다. SH14 수는 트리메토프림 및 티민이 보충된 한천 상에서 확인하였다(■). 티민 없이는 어떠한 CFU도 검출할 수 없었다(▲). SH250 CFU는 클로람페니콜이 보충된 한천 상에서 확인하였다(●);
도 7은 씨. 디피실레 TcdA26-39 항원을 발현하는 SH14 포자의 면역원성을 나타내는 그래프이다. SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 ), PP108(amyE::cotC-tcdA 26-39 thrC::cotB-tcdA 26-39 ) 및 PY79(spo + )의 포자(5 X 1010)는 제1일, 제14일, 제35일 및 제57일에 경구 위관영양법에 의해 마우스(n=4)에 투여하였다. TcdA26-39에 특이적인 혈청 IgG(패널 A) 및 배설물 IgA(패널 B)는 ELISA로 확인하였고, 종점 역가를 나타냈다. **, p < 0.005; *** p < 0.0002;
도 8은 포자-표시 스트렙타비딘 및 효소 표시에의 항체의 컨쥬게이션을 나타낸다. 패널 A는 면역형광을 사용한, SH16 포자에의 항-TcdA26-39 항체의 컨쥬게이션을 시각화한 것이다. 대조군으로서, SA가 결여된 PY79 포자는 컨쥬게이션에 실패하였다. 위상차 영상(phase contrast image)은 PY79 포자의 존재를 확인한다. 패널 B는 포자 표면 상에 표시된 서브틸리신(subtilisin) E의 활성을 보여준다. 프로테아제 활성을 시각화하기 위해 카제인 한천이 사용되었다. 20 μl의 SH20 현탁액(thyA::aprE thyB::MCS) 또는 PY79 포자로 플레이트에 스팟팅하였다(spot). 각각의 경우 접종물에는 5 X 108개 포자가 존재한다. 양성 대조군으로서, 0.02 단위(unit)의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제(Sigma P5147)를 사용하였다. 37℃에서 24시간 인큐베이션 후, 플레이트를 브로모크레졸 그린으로 염색하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션하여, 분해 구역을 확인하였다. 패널 C는 Lugol 용액으로 염색된 전분 플레이트를 나타낸다. SH18(109 및 1010 cfu) 또는 PY79(1010 cfu)의 순수 포자 현탁액을 플레이트 상에 스팟팅하고, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에는 박테리아 성장을 예방하기 위해 3개의 항생제가 포함되어 있다. 활성 아밀라제를 표시하는 포자는 소거(clearing) 구역을 생성하였다;
도 9는 SH12에서 thy 삽입(thyA::cotC-vp26 thyB::cotB-vp28)에 대한 개략적인 표현을 보여준다. 키메라 유전자 삽입의 측면에 있는 thyA 및 thyB 의 근위부(P) 및 원위부(D) 분절(segment)이 나타나 있다. 나타낸 ORFS는: hypo, 가상의 코딩 ORF, dhfr, 디하이드로폴레이트 리덕타제, ltrC(저온 요건 C 단백질)이다;
도 10은 SH14에서 thy 삽입(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 )을 개략적으로 나타낸 것이다. 키메라 유전자 삽입의 측면에 있는 thyA 및 thyB 의 근위부(P) 및 원위부(D) 분절이 나타나 있다. 나타낸 ORFS는: hypo, 가상의 코딩 ORF, dhfr, 디하이드로폴레이트 리덕타제, ltrC(저온 요건 C 단백질)이다;
도 11은 SH16에서 thy 삽입(thyA::cotB-SA thyB::cotB-SA)을 개략적으로 나타낸 것이다. 키메라 유전자 삽입의 측면에 있는 thyA 및 thyB 의 근위부(P) 및 원위부(D) 분절이 나타나 있다. 나타낸 ORFS는: hypo, 가상의 코딩 ORF, dhfr, 디하이드로폴레이트 리덕타제, ltrC(저온 요건 C 단백질)이다;
도 12는 SH20에서 thy 삽입(thyA::cotB-aprE thyB::MCS)을 개략적으로 나타낸 것이다. 키메라 유전자 삽입의 측면에 있는 thyA 및 thyB 의 근위부(P) 및 원위부(D) 분절이 나타나 있다. 나타낸 ORFS는: hypo, 가상의 코딩 ORF, dhfr, 디하이드로폴레이트 리덕타제, ltrC(저온 요건 C 단백질)이다;
도 13은 SH18에서 thy 삽입(thyA::cotB-amyE thyB::MCS)을 개략적으로 나타낸 것이다. 키메라 유전자 삽입의 측면에 있는 thyA 및 thyB 의 근위부(P) 및 원위부(D) 분절이 나타나 있다. 나타낸 ORFS는: hypo, 가상의 코딩 ORF, dhfr, 디하이드로폴레이트 리덕타제, ltrC(저온 요건 C 단백질)이다;
도 14는 폴레이트 경로에서 트리메토프림의 작용을 개략적으로 나타낸 것이다. 트리메토프림은 디하이드로프테레이트(DHP; dihydropterate)로부터 디하이드로폴레이트(DHF)의 생성뿐만 아니라 테트라하이드로엽산(THF)의 합성에 필요한 효소 디하이드로엽산(DHFR)을 저해한다. 이는 메틸렌테라하이드로엽산(MTHF)의 합성 및 퓨린과 피리미딘 둘 모두의 합성을 예방한다. 비. 서브틸리스에서, 2 가지 티미딜레이트 신서타제(synthetase)(TS), TSase A 및 TSase B는 MTHF를 사용하여 피리미딘 티미딘 및 티민을 생성한다. 두 TS 효소 모두의 불활성화는 외인성 티민(또는 티미딘)이 공급되지 않는 한 치명적이다. 또한, 엽산 및 SHMT(세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제)의 구성성분인 para-아미노벤조산(PABA)이 나타나 있다;
도 15는 티민 또는 티미딘을 함유하는 배지에서 SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 ; thyB::cotC-tcdA 26-39 )의 성장을 개략적으로 나타낸 것이다. SH14는 상이한 농도의 티민 또는 티미딘과 함께 0.2% CAA를 함유하는 SMM에서 성장하였다. 배양물을 37℃에서 18시간 인큐베이션하고, 그 후에 OD를 확인하였다;
도 16은 티민 제거 후 생존 가능성 상실을 개략적으로 나타낸 것이다. SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 )를 트리메토프림(6 μg/ml) 및 티민(50 μg/ml)을 함유하는 SOC 배지에서 밤새 성장(37℃)시킨 후, 티민(50 μg/ml)이 보충된 신선한 SOC 내로 계대배양(subculture)하였다. 0.5 내지 0.6의 OD600에서 세포를 원심분리로 수합하고, PBS로 3회 세척하였으며, 20 ml의 가온(warm) SOC 배지로 현탁하였다. 세포 현탁액 10 ml를 2개의 플라스크 각각에 첨가하고, 여기에 티민 한 개를 첨가하여 최종 농도가 50 μg/ml가 되도록 하였다. 배양물은 37℃에 수조(water bath)에서 진탕(shaking) 인큐베이션하고, 생존 가능한 cfu/ml은 간격을 두고 단계(serial) 희석 및 평판배양으로 결정하였다;
도 17은 풍부한 배지에서 균주의 성장을 개략적으로 나타낸 것이다. 37℃에서 PY79(패널 A) 및 SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 )(패널 B)의 성장은 상이한 농도의 효모 추출물(mg/ml)과 함께 LB + 티민에서 이루어졌다;
도 18은 제1 유전자 교차 후 콜로니 유형을 보여준다. 형질전환 후, 2 가지 유형의 콜로니가 나타난다: 큰-불투명한 유형(유형 1) 및 작은-반투명한 유형(유형 2). 불투명한 콜로니만 이중 삽입 균주의 구축을 위해 전기천공에 사용될 수 있었다; 그리고
도 19는 SMM 배지에서 thyA thyB 삽입 균주의 성장을 개략적으로 나타낸 것이다. 37℃에서 지시된 바와 같은 상이한 보충제(티민 50 μg/ml, CAA(0.2% w/v) 아데닌(20 μg/ml))를 사용한 SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyB::cotC-tcdA 26-39 ) SMM 배지에서의 성장이다. 배지는 패널 A에서는 트리메토프림(3 μg/ml)을 보충하였고 패널 B에서는 트리메토프림을 보충하지 않았다. 대조군으로서, 비. 서브틸리스 균주 PY79가 또한, 보충제가 없는 SMM에서의 성장에 대해 평가되었다.
실시예
바실러스 속의 박테리아 포자의 유전자 조작은 백신화 및 약물 또는 효소의 운반에 대한 잠재성을 보여주었다. 두드러지게도, 포자 표면 상에 표시된 단백질은 활성을 보유하고, 일반적으로 분해되지 않는다. 포자의 건조 내성과 더불어 이들 포자의 열 안정성은 이들 포자가 경구 경로에 의해 인간 또는 동물에게 운반되기에 적합하도록 한다. 이러한 속성에도 불구하고, 하나의 규제적인 장애는 환경 내로 배출된(shed) 생존 가능한 포자로서의 재조합 포자의 운명에 관하여 남아 있었다. 본 발명자들은, 60년 전에 처음으로 보고되었으나 이종성 유전자를 포자-형성 박테리아 내로 도입하는 데 성공적으로 실행된 적이 결코 없는 현상인 '티민-결여 사멸'의 개념을 이용함으로써 포자 GMO의 생물학적 봉쇄를 해결하였다. 비. 서브틸리스를 사용하여, 본 발명자들은 2-단계 과정을 사용하여 키메라 유전자를 2개의 티미딜레이트 신타제 유전자, thyA 및 thyB에 삽입하였다. 처음 thyA, 뒤이어 thyB에서의 삽입은 재조합의 선별을 가능하게 하며, 여기서 상기 삽입은 트리메토프림에 대한 내성을 발생시킨다. 중요하게는, 이 방법은 새로운 항생제 내성 유전자의 도입을 필요로 하지 않는다. 재조합 박테리아 또는 생장(vegetative) 세포는 티민 또는 티미딘에 대해 엄격한 의존도를 가지며, 이들의 부재 시 세포는 용해되고 사멸한다. 삽입은 안정하고, 억제 또는 복귀(reversion)에 대한 어떠한 증거도 명백하지 않았다. 이 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 활성 효소를 표시하는 포자뿐만 아니라 많은 포자 백신을 성공적으로 생성하였다.
재료 및 방법
균주, 배지 및 일반적인 방법
PY79는 균주 168 유형(28)으로부터 유래된 비. 서브틸리스의 독립영양(prototrophic) 균주이다. PP108(amyE::cotC-tcdA 26-39 thrC::cotB-tcdA 26-39 )은 어디에나 기재되어 있다(4). SH250은 amyE 좌에 삽입된 cat 유전자(클로람페니콜에 대한 내성을 인코딩함)를 갖는 PY79의 독립영양 유도체이다. '2-단계 형질전환 절차'를 포함하는 비. 서브틸리스를 이용한 작업에 대한 일반적인 방법은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(29). DSM(Difco 포자형성 배지)은 비. 서브틸리스의 성장 및 포자형성을 위한 표준 배지이다(30). 웨스턴 블로팅을 위해, 정제된 포자를 제조하고, 2 X 108개를 40 μl Bolt LDS 완충제(Life Tech.)에 현탁시키고, 95℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 포자 현탁액을 원심분리(10 분, 18,000 g)하고, 20 μl의 현탁액을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 진행시켰다.
pThy 벡터
pThyA(4,274 bp)는 pMA-RQ(2,556 bp; Genscript, USA) 내로 클로닝된 다중 클로닝 부위(MCS)를 둘러싼 비. 서브틸리스 thyA 유전자의 좌측 아암(900 bp) 및 우측 아암(950 bp)을 포함하는 1,910 bp 분절을 갖는다. 두 아암 모두는 thyA에 인접한 부가적인 근위부 및 원위부 DNA 서열을 갖는다. 유사하게는, pThyB1(4,973 bp)은 pBluescript SK(+)(2,958 bp) 내로 클로닝된 MCS를 둘러싼 비. 서브틸리스 thyB 유전자의 좌측 아암(900 bp) 및 우측 아암(1.1 kb)을 포함하는 2,057 bp 분절을 갖는다. 플라스미드는 bla 유전자를 갖고, thyA 및 thyB 분절의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 10(각각)으로 주어지고, 도 1에서 도식적으로 제시된다. 각각의 벡터의 MCS 부위에 삽입된 키메라 유전자를 갖는 pThyA 및 pThyB 플라스미드를 구축하였다. vp26, vp28, tcdA 26-39 또는 SA 코딩 ORF로의 비. 서브틸리스 cotB 또는 cotC의 5' 분절 사이의 인-프레임(in-frame) 융합을 함유하는 키메라 유전자(코돈 사용법에 대해 최적화되지 않음)는 먼저, pThyA 및 pThyB 벡터의 MCS에서 서브-클로닝에 적합한 5' 말단 및 3' 말단과 함께 합성되었다. 2개 유전자, aprE 및 amyE에 대해, 본 발명자들은 염색체 DNA 주형으로부터 증폭시킨 다음, cotB에 융합시켰다. aprE 유전자(서브틸리신 E를 인코딩함)를 본 발명자들의 컬렉션에서 비. 서브틸리스 균주(SG115)로부터 PCR 증폭시키고, 증폭된 코딩 분절은 단백질 분비(pre) 및 활성화(pro)에 관여하는 N-말단 영역이 결여되었다(31). amyE 유전자(알파 아밀라제를 인코딩함)를 바실러스 아밀로리퀘패세안스의 실험실 균주로부터 증폭시켰고, 분비 신호 서열 없이 클로닝하였다. 이 작업에 사용되는 유전자 융합은 도 9 내지 13에 제시되어 있다.
thyA 및 thyB 삽입을 갖는 비. 서브틸리스 균주의 구축
본원에서 개발된 절차는 2개 단계로 구성되었다. 제1 단계에서, 야생형 수혜자(recipient) 균주(본원에 기재된 작업에서는 독립영양 균주 PY79가 사용되었음)의 세포를, Dubnau 및 Davidoff-Abelson(33)에 의해 기재되고 바실러스 실험실에서 보편적으로 사용되는 '2-단계 형질전환' 절차를 사용하여 적격으로 만들었다(33, 34). 키메라 유전자를 갖는 pThyA 플라스미드를 ApaLI 또는 ScaI 분해를 이용하여 선형화시키고, 세포를 티민(50 μg/ml) 및 트리메토프림(3 μg/ml)이 보충된 SMM(Spizizen's 최소 배지 SMM)(29) 한천 상에 평판배양하였다. 72시간 내지 96시간의 성장 후, 단일 콜로니를 콜로니 정제하고, SMM 한천 ± 티민(50 μg/ml) + 트리메토프림(3 μg/ml) 상에서 37℃ 및 46℃에서 성장에 대해 평가하였다. thyA 좌에 삽입을 갖는 세포는 티민과 함께 또는 티민 없이 37℃에서 성장할 것이지만, 티민이 보충되지 않는 한 46℃에서는 성장할 수 없었다. 추가의 확인은 thyA 서열에 어닐링하는 프라이머를 사용하여 형질전환체로부터 키메라 유전자의 존재를 PCR에 의해 증폭시키는 것이었다. 전형적으로 형질전환 빈도는 약 2 X 103/μg의 적격 세포였고, 이때, 약 15% 내지 20%의 콜로니는 올바른 삽입을 갖는다(설명에 대해서는 이후의 것을 참조). 제2 단계에서, 키메라 유전자를 갖는 선형화된(ApaL1 또는 Sca1) pThyB 플라스미드를 전기천공에 의해 thyA 삽입 균주의 세포 내로 도입하였다. 전기천공된 세포를 티민(50 μg/ml) 및 트리메토프림(6 μg/ml)을 함유하는 SMM+CAA(0.2%(w/v) 카사미노산(CAA)을 함유하는 SMM) 상에 평판배양하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. thyA와 thyB 삽입 둘 모두의 존재를 확인하기 위해, 콜로니를 SMM+CAA 한천 ± 티민(50 μg/ml) 상에서 스트리크(streak)하였고, 37℃에서 성장시켰다. 2개의 삽입을 갖는 세포는 티민이 보충되지 않는 한 37℃와 46℃ 둘 모두에서 성장할 수 없었다. 최종 확인은 2개의 삽입을 증폭시킨 PCR 프라이머를 사용하여 이루어졌다. 전기천공을 사용하여, 통합 빈도는 2개의 삽입(thyA 및 thyB)을 갖는 약 20%의 트리메토프림 내성 콜로니와 함께 약 1 X 103/μg의 선형 DNA였다.
전기천공
본원에 사용되는 절차를, 효모 추출물을 함유하지 않는 SOC2 배지를 주로 사용하여 바실러스에서의 전기천공을 위한 확립된 방법(35)으로부터 변형시켰다. SOC2는 트립톤(2% w/v), NaCl(10 mM), KCl(2.5 mM), MgCl2(5 mM), MgSO4.7H2O(5 mM) 및 글루코스(20 mM)였다. thyA 삽입을 갖는 균주의 밤새 배양물을 25 ml의 SOC2 배지(0.5 M 소르비톨이 보충됨)에서 계대배양하여, 0.2의 출발 OD600을 제공하였다. 배양물을 37℃에서 1.4의 OD600까지 성장시키고, 얼음 상에서 10분 동안 냉각시킨 다음, 4℃에서 원심분리(5,000 x g, 5분)로 수합하였다. 세포를 얼음-냉각된 전기천공 용액(0.5 M 소르비톨, 0.5 M 만니톨, 10%(v/v) 글리세롤)에서 4회 세척하고, 1.6 ml의 동일한 얼음-냉각된 용액에 현탁시켰다. 세포는 이제 전기천공-적격이 되었고, 즉시 사용될 준비가 되었다. 세포를 얼음 상에 유지시키고, 30분 이내에 사용하였지만, 분취액은 -80℃에서 저장될 수 있었다. 1 μl(약 50 ng)의 선형화된 플라스미드 DNA를 60 μl의 전기천공-적격 세포에 첨가하고, 혼합물을 사전-냉각된 큐벳(1 mm 갭 폭)에 전달하고, 얼음 상에서 1.5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 큐벳을 전기천공기(BioRad GenePulser Xcell) 내부에 놓고, 하기 매개변수를 전기천공에 사용하였다: 전압 2, 100 V, 저항 200 W, 시간, 5 밀리초(millisecond) 및 펄스 수, 1. 전기천공 후, 1 ml의 회수 배지(0.5 M 소르비톨 및 0.38 M 만니톨을 함유하는 SOC2 배지)를 큐벳에 첨가하고, 혼합물을 2 ml Eppendor에 전달하고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 단계 희석시키고, 적절한 선별 배지 상에 평판배양하였다.
완전-포자 ELISA
ELISA 방법을 사용하여, 이전에 기재된 바와 같이 표면 노출된 단백질을 검출하였다(36). 마이크로플레이트 웰을 50 μl의 순수 포자 현탁액(2 X 108개 포자/웰)으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 놔두었다. 플레이트를 2%(w/v) BSA로 37℃에서 1시간 동안 블라킹(block)시켰다. 포자 표면 또는 완전 비. 서브틸리스 포자 상에서 발현되는 이종성 항원을 인지하는 토끼 폴리클로날 항체를 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하면서 1차(primary)로 사용하였다. 항-토끼 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이트(1:5,000 in PBS plus 0.05% Tween-20)를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하면서 2차(secondary)로서 사용하였다. TMB(3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘)를 기질로서 사용하였다.
항체
VP28 및 TcdA26-39에 대한 폴리클로날 항체를 4회의 피하 주사(1 mg/용량, 14일마다)를 사용하여 토끼에서 형성(raise)시켰다. 재조합 단백질을 프로인트(Freund) 보조제와 복합체화하고, 혈청을 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. VP26 폴리클로날을 마우스에서 정제된 rVP26 단백질(14일 간격에서 4회의 복강내 용량, 10 μg/용량, 프로인트 보조제가 있음)을 사용하여 형성시켰다.
동물 연구
면역원성 연구를 위해 마우스(C57 Black 6, 암컷, 7주령)에게 PY79 또는 SH14의 순수 포자의 조제물을 투약하였다. 혈청 및 배설물 시료에서 TcdA26-39에 대한 면역 반응은 이전에 기재된 바와 같이 이루어졌다(4). 수명 연구를 위해, Balb/c 마우스(암컷, 7 내지 8주령)를 사용하였다. 마우스(n=5)에게 단일 용량의 SH14 또는 SH250의 순수 포자(2 X 109)를 경구 위관영양법에 의해 투여하였다. 이후 이따금, 새로 무효화된(freshly voided) 배설물을 수합하고(3 내지 4개 펠렛), 균질화하였으며, SH14에 대해 배설물 단계 희석물을 (i) DSM 및 (iii) DSM + 트리메토프림(6 μg/ml) + 티민(50 μg/ml) 한천 플레이트 상에 평판배양하였다. SH250 배설물 희석물을 클로람페니콜(5 μg/ml)을 함유하는 DSM 플레이트 상에 평판배양하였다. 개별 SH14 콜로니를, thy 삽입의 존재에 대해 PCR을 사용하여 무작위로 체크하였다.
스트렙타비딘에의 컨쥬게이션
rTcdA26-39 단백질에 대해 형성된 폴리클로날 항체(토끼; 100 μg)를 Lightning-Link Rapid 비오틴 컨쥬게이션 키트 유형 A(Innova Biosciences)를 사용하여 비오틴화하였다. 200 μl의 PBS에서 균주 PY79의 정제된 포자(1 X 109) 또는 CotB-SA를 발현하는 포자(SH16)를 1 μg의 비오틴화된 항체와 혼합하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후에, 포자를 PBS로 4회 세척하고, 1 ml의 PBS에 현탁시켰다. 약 3 X 108개의 컨쥬게이션된 포자를 사용하여, 마이크로플레이트 웰을 코팅한 다음, 이를 항-토끼 IgG-호스래디쉬 컨쥬게이트(PBS + 0.05% Tween-20 중 1:5,000)로 RT에서 1시간 인큐베이션하면서 프로브화하고, 3회 세척한 후 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 발색시켰다. 대조군으로서, PY79 포자를 동일한 절차를 통해 취하였다. 면역형광을 위해, 5 X 106개의 SH16 또는 PY79의 처리된 포자를 현미경 슬라이드에 첨가하고, 공기 건조하였다. PBS로 3회 세척한 후, 슬라이드를 2%(w/v) BSA + 0.05%(v/v) Tween-20을 함유하는 PBS로 37℃에서 45분 동안 블라킹시켰다. 비오틴화된 항-TcdA26-39 항체(1:300 희석; 200 μl)를 슬라이드에 첨가하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, PBS + 0.05%(v/v) Tween-20으로 3회 세척하였다. 토끼 FITC 혈청(1:200 희석에서 Sigma F0382)을 첨가하고, 슬라이드를 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이미지 분석을 EVOS fl LED 현미경을 이용하여 수행하였다.
독소 차감 검정법(Toxin subtraction assay)
씨. 디피실레 균주 RT176(tcdA + tcdB + )을 TY 브로쓰(broth)(3%(w/v) 트립토스, 2%(w/v) 효모 추출물 및 0.1%(w/v) 소듐 티오들릴콜레이트(thiodlycolate))에서 37℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포-무함유 상층액을 필터-멸균하고, 검정할 때까지 4℃에서 유지시켰다. HT29 세포에서 100% 독성을 야기하는 데 필요한 상층액의 최소 치명적 농도(MLC)를, 2-배 희석 및 HT29 세포에의 희석된 용해물의 첨가, 뒤이은 세포 라운딩 검정법(rounding assay)(4)을 사용한 독성 평가를 사용하여 결정하였다. 상기 검정법을 위해, TcdA26-39 폴리클로날 항체(상기 참조)에 컨쥬게이션된 109개의 SH16의 순수한 포자를 MLC의 독소(전형적으로 1/4000 희석)를 함유하는 200 μl의 2% McCoy's 배지에 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 세포독성을 HT29 세포 및 24시간 동안의 인큐베이션을 사용하여 평가하였다. 대조군으로서, TcdA26-39 항체(상기 참조)와 혼합되었던 PY79 포자를 병행하여 사용하였다.
효소 활성
Sigma Aldrich에 의해 이들의 웹 사이트 상에 기재된 유니버셜 프로테아제 검정법을 사용하고 카제인을 기질로서 사용하여 프로테아제 활성을 결정하였다. 카제인 한천은 1%(w/v) 카제인, 1%(w/v) 스킴드 밀크(skimmed milk), 1%(w/v) 및 1.2%(w/v) 한천 테크니컬 번호 2, 옥소이드(Oxoid)이었다. 액체 중 아밀라제 활성을 기재된 바와 같이 측정하였다(37). 포자 현탁액(20 μl의 부피)을 가용성 전분(1% w/v) 및 소고기(beef) 추출물(0.3% w/v) 및 3 가지 항생제(트리메토프림 10 μg/ml, 클로람페니콜 30 μg/ml 및 에리트로마이신 30 μg/ml)만 갖는 한천 플레이트에 적용함으로써 활성 아밀라제의 생성을 시험하였다. 항생제를 사용하여 플레이트 상에서 임의의 박테리아 성장을 예방하여, 활성이 휴면 포자로부터만 발생되도록 보장하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 그 후에 상기 플레이트를 Lugol 용액(Sigma)으로 2분 동안 침지시켜 전분 분해 구역을 드러내었다.
실시예 1
근거
비. 서브틸리스에서 티민에 대한 절대 요건은 연결되지 않은 thyA(TSaseA) 및 thyB(TSaseB) 유전자(27)에 의해 인코딩되는 2개의 티미딜레이트 신타제(TSase)를 필요로 한다. 이들 유전자는 폴레이트 경로에 연결되고, 세포 성장을 위해 피리미딘을 제공한다(도 14). TSaseB는 열-민감성이고, 46℃의 제한 온도(restrictive temperature)에서 약 5% 내지 8%의 활성만 보유한다. 따라서, thyA 좌의 불활성화는 46℃에서 성장을 위해 티민(또는 티미딘)의 보충을 필요로 한다. TSaseA는 열-민감성이 아니어서, thyB의 불활성화는 세포가 승온에서 성장할 수 있게 한다. 그러나, thyA와 thyB 둘 모두의 불활성화는 37℃와 46℃ 둘 모두에서 성장을 위해 티민에 대한 절대 요건을 생성한다. Neuhard 등에 의해 제시된 바와 같이(27), thy 유전자의 불활성화는, 트리메토프림에 대한 표적인 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)에 대한 필요성이 없어지기 때문에 항-폴레이트 약물 트리메토프림(또는 아미노프테린)에 대한 내성을 생성한다. 그러나, 내성의 수준은 상이하며, 이때, thyA에서의 삽입은 thyA thyB 돌연변이체에서 발견되는 것보다 낮은 수준의 내성을 생성한다(27). 트리메토프림에 대한 차별적인 내성의 이러한 속성은 신규, 2-단계, 이소성 클로닝 시스템이 디자인될 수 있게 한다(도 1). 제1 단계에서 유잔자를 thyA 좌에 도입하고, 제2 단계에서 양성 선별을 위해 증가하는 농도의 트리메토프림에 대한 내성을 사용하여 thyB의 삽입이 이어진다.
thy 좌에서 이소성 클로닝에 대한 개념의 증거를 실증하기 위해, 본 발명자들은 이종성 유전자의 생성물이 이전에 포자 표면 상에서 발현되었던 많은 상기 이종성 유전자를 선택하였다. 각각의 경우, 발현은 표면 발현되는 포자 코트 단백질(CotB 또는 CotC)을 인코딩하는 비. 서브틸리스 유전자에의 융합에 의해 달성되었었다. 선택된 단백질은 VP26 및 VP28이었고, 둘 모두는 새우 바이러스 WSSV(흰반점 증후군 바이러스)의 외피 단백질이다. 비. 서브틸리스 포자 상에서 표시되고 사료에 혼입되는 경우, 이들 재조합 포자는 WSSV의 문제가 있는 새우에 대해 보호를 부여하는 것으로 제시되었다(7, 8, 9). (ii) 포자 표면 상에서 발현되는 클로스트리디움 디피실레 독소 A(TcdA)의 C-말단 도메인을 인코딩하는 TcdA26-39는 이들 재조합 포자가 경구 투약된 햄스터(4, 38)에서 씨. 디피실레 감염(CDI)에 대한 보호를 부여하는 것으로 제시되었다. (iii) 스트렙타비딘(SA)은 포자 상에서 발현된 경우, 결장암 세포로의 표적화를 가능하게 하는 모노클로날 항체 세툭시맙(Cetuximab)에 컨쥬게이션될 수 있다(15). (iv) 마지막으로, 2 가지 효소, 서브틸리신 E(AprE), 알칼리 프로테아제 및 알파 아밀라제(AmyE) 둘 모두는 산업적으로 중요하고 동물 사료에 보편적으로 혼입되는 두 효소이다(32, 39).
이소성 유전자 삽입을 위한 2-단계 방법
이종성 DNA의 삽입을 위해 다중 클로닝 부위(MCS)로 중간점에서 방해된 완전 thyA 또는 thyB 유전자를 갖는 2개의 플라스미드, pThyA 및 pThyB를 디자인하고, 합성하였다(도 1, SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 10). 이중 교차 재조합 사건(event)을 가능하게 할 정도로 충분한 DNA 상동성을 보장하기 위해, 좌측 아암 및 우측 아암은 각각 측면의 업스트림 또는 다운스트림 DNA(총 약 900 bp 근위부 및 원위부)뿐만 아니라 관련 thy 분절을 갖는다. 그 후에, vp26, vp28, tcdA 26-39 , SA, aprE 또는 amyE ORF(도 9 내지 도 13)에의 cotB 및 cotC 유전자(이종성 단백질의 표시에 필요한 포자 코트 앵커를 인코딩함)의 인-프레임 융합을 적절한 pThyA 또는 pThyB 벡터 내로 클로닝하였다. 다음, pThyA 플라스미드를 선형화하고, 37℃에서 트리메토프림(3 μg/ml) 및 티민이 보충된 플레이트 상에서 트리메토프림 내성에 대한 선별로 야생형 균주 PY79의 적격 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. thyA 삽입을 갖는 형질전환체는 티민이 없는 경우 46℃에서 이들의 성장 실패에 의해 인지될 수 있었다. 제2 단계에서, thyB 좌에서 삽입의 도입을 위해, pThyB 플라스미드와 함께 적격 세포의 전형적인 DNA-매개 형질전환은 낮은 통합 빈도와 함께 불충분한 것으로 입증되었다. 대신데, 본 발명자들은 더 높은 농도의 트리메토프림(6 μg/ml)을 이용한 선별을 사용하여 thyA - 균주(방법 참조)에서 thyB 좌에서 pThyB 플라스미드의 도입을 신뢰할 만하게 그리고 재현 가능하게 하는 전기천공 방법을 개발하였다. thyA 및 thyB에 삽입을 갖는 균주는 티민의 부재 시 37℃와 46℃ 둘 모두에서 이들의 성장 실패로 확인되었다. 이러한 2-단계 과정을 사용하여, 본 발명자들은 thyA 및 thyB 좌에 삽입(vp26, vp28, tcdA 26-39 및 SA)을 갖는 많은 균주를 성공적으로 구축하였다(표 1). 이외에도, 본 발명자들은 또한, thyA 좌에서 aprE 및 amyE 유전자의 단일 삽입을 갖는 균주를 만들었다. 절대 티민 의존도를 생성하기 위해, 본 발명자들은 단순히 '빈(empty)' pThyB 플라스미드를 선형화하고, 이 DNA를 6 μg/ml에서 트리메토프림을 선별하는 thyA 돌연변이체 내로 도입하였다. 본 발명자들이 성공적으로 구축한 균주는 1 또는 2개의 상이한 포자 코트 앵커(CotB 및 CotC)에의 융합에 의해 1가(monovalent)(VP28, TcdA26-39, 스트렙타비딘, 서브틸리신 E 및 아밀라제)뿐만 아니라 2가(하나의 포자 상에서 VP26 및 VP28의 발현) 발현이었다. 표 1에서 구축된 각각의 균주에 대해, 본 발명자들은 뉴클레오타이드 서열 분석에 의해 thyA 또는 thyB 삽입의 온전성(integrity)을 확인하였다.
본 발명자들은 37℃에서 최소 SMM 배지에서 삽입의 성장을 검사하였고, 도 2는 thyA 및 thyB 좌에서 cotB-tcdA 26-39 및 cotC-tcdA 26-39 삽입을 갖는 균주(SH14)의 예를 보여준다. 예상된 바와 같이, thyA 삽입 균주는 티민과 함께 또는 티민 없이 정상적으로 성장하였고(도 2b), 야생형 PY79로부터 구분될 수 없었다(도 2a). thyA와는 대조적으로, thyB 삽입 균주는 티민 의존적이었지만, 티민의 존재 하에 더 낮은 최대 OD로부터 제시된 바와 같이 감소된 적합도(fitness)를 가졌다(도 2c).
또한, 완전 게놈 시퀀싱을 사용하여, 본 발명자들은 균주 SH12(thyA::cotC-vp26 thyB::cotB-vp28) 및 SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyA::cotC-tcdA 26-39 )가 임의의 염색체 이상(abberation)(제시되지 않음) 없이 thy 좌에서 특이적인 삽입을 가짐을 확인하였다. 키메라 단백질의 발현은 정제된 포자(도 3은 SH12, SH14 및 SH16에서 VP26, VP28, TcdA26-39 및 SA 키메라의 검출을 위한 블롯을 보여줌)로부터 추출된 단백질의 웨스턴 블로팅으로 확인하였으며, 올바른 mwt의 밴드를 실증하였다. 제2 방법은 상응하는 이종성 항원에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 완전 포자의 ELISA 검출이었고, 도 4는 완전-포자 ELISA에 의한 TcdA26-39(도 4a) 및 VP28(도 4b) 항원의 표면 검출을 보여준다. 예상된 바와 같이, thyA 및 thyB 좌 둘 모두(도 4a에서 SH14)에서 갖는 TcdA26-39 단백질의 수준은 하나의 좌(즉, thyA, SH13)에서의 발현보다 컸다. 병행하여, 본 발명자들은 또한, CotB 및 CotC에 융합된 동일한 항원을 갖지만 각각 hrC 및 amyE 좌에서 삽입된 PP108의 포자에서 TcdA26-39의 존재비(abundance)를 측정하였다(4). 발현 수준은 다소 더 낮았으나, 포자 코트 단백질의 수준을 측정하기 위해 항-포자 PAb를 사용하여 발현 수준은 상응하게 감소되었음을 주지해야 한다.
티민과 티미딘 둘 모두는 thyA 및 thyB 좌에 삽입을 갖는 균주의 성장에 사용될 수 있었다. SH14를 사용하여, 본 발명자들은 최적의 성장을 위해 15 μg/ml의 티민 또는 20 μg/ml의 티미딘이 충분하였음을 보여주었다(도 15). 이는 전에 보고된 50 μg/ml(27)보다 유의하게 더 작았고, 가장 대체로 사용되는 균주 백그라운드에서 차이를 반영한다. thyA 및 thyB 좌에 삽입을 갖는 세포는 티민이 보충된 배지에서 성장할 수 있긴 하였지만, 티민이 제거되었을 때 '티민-결여 사멸'의 특징인 세포 생존능에서의 대량 소실(5시간 이내에 약 5 log)을 겪었다(도 16).
마지막으로, 이 클로닝 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 근위부 thy 코딩 서열로부터의 통독(read through) 증거를 보여주지 않는 각각의 thy 유전자(도 9 내지 도 13)에 대한 동일한 또는 반대되는 전사 극성(transcriptional polarity)인 삽입을 도입할 수 있었다.
실시예 2
thy 좌에서 이소성 삽입의 사용을 위한 실험적 고려사항
a) 풍부한 배지에서의 성장
풍부한 배지, 예컨대 LB 및 DSM에서, 단일 thyA 삽입 균주는 티민 보충 없이 37℃에서 성장할 수 있었던 한편, thyA thyB 이중 삽입은 성장을 보여주지 않았다(도 5b 및 도 5d). 흥미롭게도, LB 또는 DSM을 티민으로 보충하는 것은 정상 수준의 성장을 복구하지 않았다. LB에서, 이중 삽입은 성장하는 데 실패한 한편(도 5a), DSM + 티민에서 제한된 성장이 관찰되었다(도 5c). 그러나, DSM에서 24시간 성장 후, 포자형성은 발생한 것으로 제시되었고, 내열성 포자의 수는 PY79와 본질적으로 동등하였다(표 1).
thyA thyB 삽입 균주가 티민이 보충된 최소 배지(도 2c 참조)에서 감소된 적합도이긴 하지만 성장할 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 풍부한 배지의 하나 이상의 구성성분이 폴레이트 경로를 방해함으로써 성장을 잠재적으로 저해할 것으로 판단하였다. 후보물질은 LB 및 DSM 배지에서 각각 5 mg/ml 및 2 mg/ml로 존재하고 SMM 배지에는 부재하는 효모 추출물(YE)이었다. YE는, 활성 살균 성분이 아데노신으로서 식별되었던 이. 콜라이 균주의 티민 돌연변이체를 저해하는 것으로 제시되었다(40). 제2 가능성은, YE의 구성성분이고 폴레이트 경로(도 14)에 직접적으로 관여할 뿐만 아니라 이. 콜라이에 대해 살균인(42) p-아미노벤조산(41)이었다.
본 발명자들은 다양한 수준의 YE와 함께 LB + 티민에서 균주(thy + 및 thyA thyB)를 성장시켰고, 2 mg/ml 이상의 YE 농도가 2개의 thy(thyA + thyB) 삽입을 갖는 균주의 성장을 저해하였음을 밝혀내었다(도 17). 따라서, YE의 저해 활성은 LB 배지에서 thyA thyB 이중 삽입 균주가 티민의 존재 하에 성장하는 데 실패한 이유를 설명한다(도 5a). 유사하게는, YE가 더 낮은 농도로 존재하는 DSM에서, 감소된 성장이 관찰되었다(도 5c). 마지막으로, YE의 저해 작용은 균주 구축(방법 참조)에 사용된 전기천공 단계에 대한 세포의 제조를 위해 YE가 결여된 변형된 성장 배지(SOC2)에 대한 필요성을 요구하였다. 놀랍게도, YE가 명확하게 저해하더라도, 본 발명자들은 이를 아데노신 또는 p-아미노벤조산으로 명확하게 기인할 수 없었다(데이터는 제시되지 않음).
b) 유전자 전달
이전에 언급된 바와 같이, 적격 세포의 DNA-매개 형질전환은 플라스미드 DNA를 비. 서브틸리스 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있었다. 그러나, 제2 단계에서 DNA를 thyA 세포 내로 도입하기 위해, YE가 결여된 변형된 배지를 사용하는 전기천공은 더 높은 통합 빈도를 산출하였다.
본 발명자들은, 제1 유전자 교차 후 동일한 비율의 2개의 콜로니 유형이 티민 및 트리메토프림(3 μg/ml)이 보충된 SMM 한천 상에서 분명하였음을 밝혀내었다(도 18). 유형 1은 크고 불투명한 콜로니였고(2 내지 3 mm), 유형 2 콜로니는 반투명하며 더 작았고(1 mm) 서서히 성장하였다. 모든 콜로니는 티민의 존재 하에 46℃에서 성장할 수 있었으며, 이는 언뜻보기에(prima facie) thyA 삽입을 나타내었다. 그러나, 유형 1 콜로니 중 약 1/3만 PCR을 사용하여 안정한 thyA 삽입을 갖는 것으로 밝혀진 한편, 어떠한 유형 2 콜로니도 삽입을 갖지는 않았다. 본 발명자들은, 트리메토프림 플레이트 상에서 성장할 수 있는 이들 콜로니가 항생제의 존재 하에 성장을 가능하게 하는 일부 형태의 보상적인 그러나 불안정한 돌연변이/들을 가져야 함을 추정한다.
제2의 중요한 발견은, 제2 유전자 전달 재조합이 티민, 트리메토프림(6 μg/ml) 및 CAA가 보충된 SMM 최소 배지 상에서만 선별될 수 있다는 것이었다. CAA가 결여된 한천 상으로 직접적으로 평판배양된다면, 작은(1 mm 미만), 서서히 성장하는 콜로니가 생성될 것이지만, 재배양 후 이들 콜로니는 콜로니 PCR에 의해 결정된 바와 같이 thyB 삽입을 소실한 것으로 밝혀졌다. CAA의 존재 하에서도, 모든 콜로니는 작았고, 트리메토프림(6 μg/ml) 상에서 성장하는 콜로니 중 약 20%만 안정한 thyB 삽입을 갖는다. 비. 서브틸리스뿐만 아니라 이. 콜라이에서의 작업은, 폴레이트 경로의 교란이 퓨린 및 피리미딘뿐만 아니라 주요 아미노산의 결핍을 유발할 수 있음을 보여주었다(43, 44). DHFR의 트리메토프림-매개 불활성화는 DHF뿐만 아니라 THF, MTHF의 세포내 수준을 결핍시킬 것이다. 다시 말해, 이는, 퓨린의 합성에서 중대한 반응이고 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제(SHMT 또는 GlyA, (45, 46))에 의해 촉매화되는 테트라하이드로엽산(THF)을 이용한 세린 및 글리신의 가역적인 상호전환에 영향을 줄 것이다. MTHF는 또한, 시스테인 및 메티오닌(47)의 생합성 경로의 최종 단계에서 이용되고, thyA thyB 대립유전자에 의한 경로의 교란은 메티오닌에 대한 요건을 도입할 수 있었다.
본 발명자들은 CAA, 아데닌 및 티민이 보충된 SMM에서 thyA thyB 삽입 균주 SH14의 성장을 측정하였다(도 19). 트리메토프림(6 μg/ml)의 존재 하에 성장은 최적이어서 CAA를 함유하는 SMM에서만 약 2의 최대 OD600에 도달한 한편, CAA를 함유하지 않거나 아데닌 및/또는 티민만 포함하는 배지에서 성장은 두드러지게 감소되었다. 트리메토프림의 부재 하에 SH14의 성장은 야생형 균주 PY79와 비교하여 약하게 남아 있었지만, i) 항생제의 존재 하에서의 성장보다는 우수하였고, ii) 성장은 CAA의 존재 하에서만 정상적인 적합도로 복구되었다. 따라서, 트리메토프림은 폴레이트 경로를 교란시켜 균주 적합도를 유의하게 감소시키고, 이는 퓨린 또는 피리미딘을 이용하지만 CAA만 이용한 보충에 의해서는 복구될 수 없었다.
따라서, 제2 유전자 전달 단계를 위해(즉, 이중 thyA thyB 삽입의 구축을 위해), 선별 배지는 바람직하게는 모든 아미노산을 제공할 수 있다. 그러나, 일단 구축되면, 트리메토프림의 사용은 더 이상 필요하지 않고, 균주는 3 가지 기준, 첫째, 배지가 티민 또는 티미딘을 함유하며, 둘째, YE가 부재하거나 2 mg/ml 미만의 농도로 존재하고, 셋째, 아미노산이 성장 배지에 제공되는 기준이 충족되는 한 임의의 배지 상에서 배양될 수 있다.
c) 하나의 코트 단백질 앵커의 선택
포자 표면 상에서 이종성 단백질의 발현을 위해, 코트 단백질 CotB 및 CotC는 1가 또는 2가 발현 둘 모두에 사용될 수 있다. 예상된 바와 같이, 2개의 상이한 포자 코트 앵커를 사용하는 경우, 단백질의 발현은 단지 하나로부터 발현을 사용하는 것보다 높았다. 따라서, 도 4a에서 제시된 바와 같이, TcdA26-39 수준은 thyA::cotB-tcdA 26-39 삽입만 갖는 SH13 포자에서보다 thyA::cotB-tcdA 26-39 및 thyB::cotC-tcdA 26-39 삽입을 갖는 SH14 포자에서 더 높았다. 흥미롭게는, CotB에의 VP28의 융합 및 thyA 좌 단독(균주 AC01) 또는 thyA 좌와 thyB 좌 둘 모두(균주 AC02)에서 이러한 키메라의 삽입을 사용하는 것은 후자에서 더 높은 수준의 발현을 유발한다. 이러한 발견은, 각각의 포자가 정의된 수의 CotB 단량체를 가질 것이며 이러한 단량체는 포자 표면 상으로 조립될 수 있고 단순히 상기 수를 증가시키는 것이 코트에서 더 높은 수준의 혼입을 유발해서는 안된다는 것이 추정되어야 하기 때문에 일부 고려사항을 필요로 한다. 그러나, 이들 균주는 온전한(intact) cotB 유전자(이의 정상적인 염색체 좌에 존재함)를 가질 것이므로, thyA::cotB-VP28 삽입을 갖는 세포(즉, AC01)에서 50%의 표시된 CotB 단백질은 야생형 CotB를 제시해야 하고 50% CotB-VP28을 제시해야 한다. 이중 thyA thyB 삽입 균주(AC02)에서, 본 발명자들은 약 66%의 표시된 CotB 단백질이 VP28을 제시하고 약 33%가 야생형 CotB를 제시할 것임을 예측할 것이다. CotB-VP28 및 CotB의 이러한 화학양론비는 도 4b에 제시된 바와 같이 VP28의 ELISA 검출과 일치할 것이다.
실시예 3
복귀
이중-교차 재조합 사건에 의해 발생되는 삽입은 내재적으로 안정해야 하지만, 보상(compensatory) 억제자 또는 우회(bypass) 돌연변이의 획득 가능성이 존재한다. 이를 해결하기 위해, 본 발명자들은 임의의 선별 압력의 부재 하에 반복된 배양 시 티민 의존도가 소실될 수 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 표 2에 제시된 바와 같이, SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyA::cotC-tcdA 26-39 )의 반복된 배양 및 재배양은 티민 의존도의 어떠한 소실도 산출하지 않았으며, 이는 삽입이 안정하였음을 보여주고, 보상 돌연변이의 획득은 이들 보상 돌연변이가 발생한다면 매우 드문 사건이어야 함을 실증하였다.
실시예 4
GI-관에서 thyA - thyB - 포자의 생체내 운명
이. 콜라이가 콜로니화하기 위해서는 퓨린 및 피리미딘의 뮤린 GI-관 합성이 필요한 것으로 실증되었다(48). 이는, 소화된 음식물로부터 또는 체류하는 장내 미생물총(gut microbiota)의 비논리적인(spurious) 용해로부터 비롯될 퓨린 및 피리미딘의 낮은 수준은 비. 서브틸리스 thyA thyB 돌연변이체의 성장을 가능하게 하기에 충분하지 않을 것임을 내포한다. 인간에서, 티미딘의 장내(intestinal) 농도는 0.075 μM로서 추정되고, 돼지에서는 약 1.0 μM로서 추정된다(49). 본 발명자들은, 위장관영양법에 의한 2 X 109개의 SH250(thyA + thyB + CmR) 포자 또는 SH14(thyA::cotB-tcdA 26-39 thyA::cotC-tcdA 26-39 ) 포자의 단일 경구 용량을 마우스에게 주었다. 새로 무효화된(voided) 배설물에서 내열성 포자의 후속적인 배출(shedding)이 결정되었다. SH250의 경우, 균주는 cat 유전자(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제)의 침묵 삽입(silent insertion)을 가지므로, 단계 희석 후 내열성 CFU를 클로람페니콜 플레이트 상에서 결정하였다. SH14 포자는 배설물에 배출되었고, 티민이 보충된 한천 플레이트 상에서만 검출될 수 있었으나 티민이 결여된 플레이트 상에 평판배양된 경우 어떠한 CFU도 검출될 수 없었다(도 6). 10일 후, 배설물에 배출되는 SH14 포자의 수는 검출 역치 수준(<103/g 배설물)에 있었다. 이러한 생체내 데이터는, thyA - thyB - 포자의 포자 배출의 동역학(kinetics)이 야생형 균주의 포자의 배출과 구분될 수 없음을 보여준다, 본 발명자들은, SH14 포자가 효율적으로 발아하고 야생형 포자와 동등함을 확인하였다(데이터는 제시되지 않음). SH14 포자가 GI-관에서 증식할 수 있는지 명확하게 결정하는 것이 가능하지 않긴 하지만, GI-관을 통과한 thyA thyB 포자가 티민의 부재 하에서는 생존할 수 없었음을 보여주는 것은 가능하였다. 또한, 발아된 포자가 생존할 수 있게 할 마커의 복귀 또는 획득의 어떠한 증거도 없었다.
실시예 5
포자 표시의 유용성
본 발명자들은 3 가지 실시예를 사용하여, thyA 및 thyB 좌에 삽입을 갖는 포자가 적용된 목적을 위해, 백신 운반 비히클로서, 포자 표면으로의 단백질의 컨쥬게이션을 위해, 그리고 마지막으로 활성 효소의 표시를 위해 적합하였음을 실증하였다. 본 발명자들은 2개의 포자 코트 단백질 앵커, CotB 및 CotC에 융합된 씨. 디피실레의 TcdA26-39 항원을 발현하는 SH14 포자를 백신으로서 사용하였다. SH14는 뮤린 및 햄스터 감염 모델(4, 38)에서 씨. 디피실레 감염(CDI)에 대한 보호를 부여하는 것으로 이전에 제시되었던 균주 PP108과 동등하다. 본 발명자들은 경구 투여를 사용하여 SH14 및 PP108의 포자로 마우스를 면역화하고, 총 4회의 투약 후 혈청 및 배설물 각각에서 TcdA26-39-특이적 IgG(도 7a) 및 IgA(도 7b)를 측정하였다. 어떠한 반응도 나타내지 않은 대조군(미접촉 및 네이키드(naked) PY79 포자가 투약된 마우스)과 비교하여, PP108 및 SH14 포자는 높은 역가의 IgG 및 IgA를 발생하였고, 이전의 작업을 기반으로 본 발명자들은 이들 항체 수준이 보호적일 것임을 예측할 것이다.
포자 표면 상에 표시된 스트렙타비딘으로의 단백질의 컨쥬게이션을 위해, 본 발명자들은 우선, 토끼 폴리클로날 TcdA26-39-특이적 항체를 비오틴화시켰고, 항체가 SH16 포자에 컨쥬게이션되었음을 면역형광 검출(도 8a)을 사용하여 실증하였고, 또한 완전 포자 ELISA(제시되지 않음)를 사용하여 확인하였다. 이들 컨쥬게이션된 포자를 사용하여, 본 발명자들은 TcdA26-39 IgG를 표시하는 SH16 포자가 조(crude) 세포-무함유 용해물로부터 씨. 디피실레 독소를 차감시킬 수 있을 것인지 질문하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, 컨쥬게이션된 포자와 독소-함유 용해물과의 단지 5분 동안의 인큐베이션은 독성을 90%만큼 감소시켰다. 흥미롭게도, PY79 포자는 또한, TcdA26-39 항체에 결합하는 능력을 어느 정도 가졌으며, 독소 활성에서 온건한(modest) 감소(10% 내지 20%)를 제공할 수 있었다. 실시예로서 사용되는 이 실험은, 포자가 예를 들어 항체의 경구 투여에서 치료 목적을 위한 잠재성을 가질 것임을 실증한다.
효소는, 이들 효소가 소화 및 영양을 향상시키는 동물 사료에 보편적으로 포함된다. 프로테아제 및 아밀라제는, 활성을 보유하는 효소를 포자 표면 상에 표시하는 것이 가능함을 보여주기 위해 본원에서 사용되는 적절한 예이다. 아밀라제를 발현하는 SH18 포자는 이들의 표면 상에서 활성 아밀라제를 발현할 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 8b). 본 발명자들은 카제인 한천을 사용하여, 알칼리 프로테아제, 서브틸리신 E를 발현하는 SH20 포자가 효소적 활성을 가짐을 보여주었다(도 8b). 액체 현탁액에서, 본 발명자들은 1010개의 SH20 포자가 약 0.127 단위의 프로테아제 활성을 가졌음을 밝혀내었다.
실시예 1 내지 5의 요약
본 발명자들은 유전적으로 변형된 박테리아 포자를 함유하기 위한 간단한 방법을 기재하였다. 이들의 접근법은 확장되지만, '티민-결여 사멸'로 인한 고유의(indigenous) 자살에 의존하는 락토바실러스 악시도필루스(Lactobacillus acidophilus)(51) 및 락토콕커스 락티스(Lactococcus lactis)(Steidler 등, 2003)에 대해 기재된 것들과는 상이하다. 1954년(23)에 처음 기재된 티민 의존도는, 티민의 부재가 살균적이어서 티미딜레이트 신타제 유전자에서 결함을 갖는 박테리아가 환경에서 축적될 수 없다는 점에서 다른 영양요구체와 상이하다. 바실러스 종은 2개의 티미딜레이트 신타제 유전자(thyA 및 thyB)를 가지므로, 티민에 대한 완전한 의존도를 달성하기 위해서는 두 유전자 좌 모두의 불활성화를 필요로 한다. 본 발명자들은 본원에서 이것이 가능함을 보여주었고, 처음에는 thyA 좌, 그 후에 thyB 좌의 삽입적 불활성화를 필요로 하는 2-단계 클로닝 절차를 식별하였다. 이들의 접근법은 선별을 위해 항생제 내성 마커의 도입을 필요로 하지 않지만, 그보다는 폴레이트 경로의 성공적인 교란으로 인한 트리메토프림에 대한 증가하는 수준의 내성의 발달을 필요로 한다. thyA 및 thyB 좌에서의 삽입의 온도 민감성 표현형과 더불어, 이는 기술적으로 고려되어야 하는 많은 제약이 있긴 하지만 삽입의 선별과 스크리닝 둘 모두를 위한 유용한 방법을 제공한다. 본 발명자들은 티민의 부재가 살균적임을 보여주고, 이들 균주의 반복된 계대배양(passage)에도 불구하고 복귀 또는 억제의 어떠한 증거도 관찰하지 않는다. 당연하게도, 클로닝 시스템의 목적은 적용된 목적을 위해, 예를 들어 이종성 항원 또는 효소의 발현을 위해 단백질을 발현시킬 수 있는 균주를 구축하는 것이다. 본 발명자들은 본원에서 실시예를 사용하여, 포자 코트 단백질에 융합된 외래 단백질로 이루어진 키메라 단백질이 포자 표면 상에 표시될 수 있음을 보여주었다. 이는 2 가지 효소(서브틸리신 E 및 α-아밀라제)의 운반, 추정상(putative) 백신 보호 항원, 뿐만 아니라 폴리클로날 항체에 컨쥬게이션하는 데 사용된 스트렙타비딘을 포함하였다. 그렇지만, 이 시스템이 생육 세포에서 단백질의 발현 또는 상기 세포로부터의 분비에 동일하게 사용될 수 있는 것이 분명하다.
참조문헌
1. Nicholson WJ, Munakata N, Horneck G, Melosh HJ, Setlow P. 2000. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestial and extraterrestrial environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64:548-572.
2. Pan JG, Kim EJ, Yun CH. 2012. Bacillus spore display. Trends Biotechnol 30:610-612.
3. Duc LH, Hong HA, Fairweather N, Ricca E, Cutting SM. 2003. Bacterial spores as vaccine vehicles. Infection and Immunity 71:2810-2818.
4. Permpoonpattana P, Hong HA, Phetcharaburanin J, Huang JM, Cook J, Fairweather NF, Cutting SM. 2011. Immunization with Bacillus spores expressing toxin A peptide repeats protects against infection with Clostridium difficile strains producing toxins A and B. Infection and immunity 79:2295-2302.
5. Lee S, Belitsky BR, Brinker JP, Kerstein KO, Brown DW, Clements JD, Keusch GT, Tzipori S, Sonenshein AL, Herrmann JE. 2010. Development of a Bacillus subtilis-based rotavirus vaccine. Clin Vaccine Immunol 17:1647-1655.
6. Fu LL, Li WF, Du HH, Dai W, Xu ZR. 2008. Oral vaccination with envelope protein VP28 against white spot syndrome virus in Procambarus clarkii using Bacillus subtilis as delivery vehicles. Lett Appl Microbiol 46:581-586.
7. Nguyen AT, Pham CK, Pham HT, Pham HL, Nguyen AH, Dang LT, Huynh HA, Cutting SM, Phan TN. 2014. Bacillus subtilis spores expressing the VP28 antigen: a potential oral treatment to protect Litopenaeus vannamei against white spot syndrome. FEMS Microbiol Lett 358:202-208.
8. Ning D, Leng X, Li Q, Xu W. 2011. Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration. Journal of applied microbiology 111:1327-1336.
9. Valdez A, Yepiz-Plascencia G, Ricca E, Olmos J. 2014. First Litopenaeus vannamei WSSV 100% oral vaccination protection using CotC::Vp26 fusion protein displayed on Bacillus subtilis spores surface. J Appl Microbiol doi:10.1111/jam.12550.
10. EFSA. 2008. The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed. EFSA Journal 923:1-48.
11. Hong HA, Duc le H, Cutting SM. 2005. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev 29:813-835.
12. Amalaradjou MA, Bhunia AK. 2013. Bioengineered probiotics, a strategic approach to control enteric infections. Bioengineered 4:379-387.
13. Sorokulova IB, Beliavskaia VA, Masycheva VA, Smirnov VV. 1997. Recombinant probiotics: problems and prospects of their use for medicine and veterinary practice. Vestn Ross Akad Med Nauk:46-49.
14. Potot S, Serra CR, Henriques AO, Schyns G. 2010. Display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores, using a coat-associated enzyme as the carrier. Appl Environ Microbiol 76:5926-5933.
15. Nguyen VA, Huynh HA, Hoang TV, Ninh NT, Pham AT, Nguyen HA, Phan TN, Cutting SM. 2013. Killed Bacillus subtilis spores expressing streptavidin: a novel carrier of drugs to target cancer cells. J Drug Target 21:528-541.
16. Shimotsu H, Henner DJ. 1986. Construction of a single copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene 43:85-94.
17. Guerout-Fleury AM, Frandsen N, Stragier P. 1996. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene 180:57-61.
18. Bloor AE, Cranenburgh RM. 2006. An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes. Appl Environ Microbiol 72:2520-2525.
19. Iwanicki A, Piatek I, Stasilojc M, Grela A, Lega T, Obuchowski M, Hinc K. 2014. A system of vectors for Bacillus subtilis spore surface display. Microb Cell Fact 13:30.
20. Cano RJ, Borucki M. 1995. Revival and identification of bacterial spores in 25- to 40-million-year-old Dominican amber. Science 268:1060-1064.
21. Nicholson WL. 2002. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cellular and Molecular Life Sciences 59:410-416.
22. Mauriello EM, Cangiano G, Maurano F, Saggese V, De Felice M, Rossi M, Ricca E. 2007. Germination-independent induction of cellular immune response by Bacillus subtilis spores displaying the C fragment of the tetanus toxin. Vaccine 25:788-793.
23. Cohen SS, Barner HD. 1954. Studies on Unbalanced Growth in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 40:885-893.
24. Goulian M, Bleile BM, Dickey LM, Grafstrom RH, Ingraham HA, Neynaber SA, Peterson MS, Tseng BY. 1986. Mechanism of thymineless death. Adv Exp Med Biol 195 Pt B:89-95.
25. Ahmad SI, Kirk SH, Eisenstark A. 1998. Thymine metabolism and thymineless death in prokaryotes and eukaryotes. Annu Rev Microbiol 52:591-625.
26. Rolfe R. 1967. On the mechanism of thymineless death in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A 57:114-121.
27. Neuhard J, Price AR, Schack L, Thomassen E. 1978. Two thymidylate synthetases in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A 75:1194-1198.
28. Zeigler DR, Pragai Z, Rodriguez S, Chevreux B, Muffler A, Albert T, Bai R, Wyss M, Perkins JB. 2008. The Origins of 168, W23, and Other Bacillus subtilis Legacy Strains. Journal of Bacteriology 190:6983-6995.
29. Harwood CR, Cutting SM. 1990. Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England.
30. Nicholson WL, Setlow P. 1990. Sporulation, germination and outgrowth., p 391-450. In Harwood. CR, Cutting. SM (ed), Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, UK.
31. Ikemura H, Takagi H, Inouye M. 1987. Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. J Biol Chem 262:7859-7864.
32. Tran TT, Mamo G, Mattiasson B, Hatti-Kaul R. 2010. A thermostable phytase from Bacillus sp. MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli. J Ind Microbiol Biotechnol 37:279-287.
33. Dubnau D, Davidoff-Abelson R. 1971. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. I. Formation and properties of the donor-recipient complex. Journal of Molecular Biology 56:209-221.
34. Cutting SM, Vander-Horn PB. 1990. Genetic Analysis, p 27-74. In Harwood CR, Cutting SM (ed), Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England.
35. Sun QY, Ding LW, He LL, Sun YB, Shao JL, Luo M, Xu ZF. 2009. Culture of Escherichia coli in SOC medium improves the cloning efficiency of toxic protein genes. Anal Biochem 394:144-146.
36. Permpoonpattana P, Phetcharaburanin J, Mikelsone A, Dembek M, Tan S, Brisson MC, La Ragione R, Brisson AR, Fairweather N, Hong HA, Cutting SM. 2013. Functional Characterization of Clostridium difficile Spore Coat Proteins. J Bacteriol 195:1492-1503.
37. Harwood CR, Coxon RD, Hancock IC. 1990. The Bacillus cell envelope and secretion, p 327-390. In Harwood CR, Cutting SM (ed), Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons, Chichester.
38. Hong HA, Hitri K, Hosseini S, Kotowicz N, Bryan D, Mawas F, Wilkinson AJ, van Broekhoven A, Kearsey J, Cutting SM. 2017. Mucosal Antibodies to the C-terminus of Toxin A Prevent Colonization of Clostridium difficile Infection and Immunity 85.
39. Walsh GA, Power RF, Headon DR. 1993. Enzymes in the animal-feed industry. Trends Biotechnol 11:424-430.
40. Kinoshita N, Akiyoshi H, Endo H. 1969. Isolation and characterization of substance in yeast extract which inhibits growth of thymine-less strains of Escherichia coli. J Gen Microbiol 59:393-400.
41. Blanchard KC. 1941. The isolation of p-aminobenzoic acid from yeast. The Journal of Biological Chemistry 140:919-926.
42. Davis BD. 1951. Inhibition of Escherichia coli by p-aminobenzoic acid and its reversal by p-hydroxybenzoic acid. J Exp Med 94:243-254.
43. Amyes SG, Smith JT. 1974. Trimethoprim action and its analogy with thymine starvation. Antimicrob Agents Chemother 5:169-178.
44. Stepanek JJ, Schakermann S, Wenzel M, Prochnow P, Bandow JE. 2016. Purine biosynthesis is the bottleneck in trimethoprim-treated Bacillus subtilis. Proteomics Clin Appl 10:1036-1048.
45. Schirch L. 1982. Serine hydroxymethyltransferase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 53:83-112.
46. Ponce-de-Leon MM, Pizer LI. 1972. Serine biosynthesis and its regulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol 110:895-904.
47. Ferla MP, Patrick WM. 2014. Bacterial methionine biosynthesis. Microbiology 160:1571-1584.
48. Vogel-Scheel J, Alpert C, Engst W, Loh G, Blaut M. 2010. Requirement of purine and pyrimidine synthesis for colonization of the mouse intestine by Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 76:5181-5187.
49. Steidler L, Neirynck S, Huyghebaert N, Snoeck V, Vermeire A, Goddeeris B, Cox E, Remon JP, Remaut E. 2003. Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10. Nat Biotechnol 21:785-789.
50. Yan S, Wu G. 2017. Bottleneck in secretion of alpha-amylase in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact 16:124.
51. Fu X, Xu JG. 2000. Development of a chromosome-plasmid balanced lethal system for Lactobacillus acidophilus with thyA gene as selective marker. Microbiol Immunol 44:551-556.
52. CLSI. 2010. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline - Second Ed M45-A2. Institute CaLS, USA.
53. Barra-Carrasco, J., V. Olguin-Araneda, A. Plaza-Garrido, C. Miranda-Cardenas, G. Cofre-Araneda, M. Pizarro-Guajardo, M.R. Sarker & D. Paredes-Sabja, (2013) The Clostridium difficile exosporium cysteine (CdeC)-rich protein is required for exosporium morphogenesis and coat assembly. J Bacteriol 195: 3863-3875.
54. Permpoonpattana, P., E.H. Tolls, R. Nadem, S. Tan, A. Brisson & S.M. Cutting, (2011b) Surface layers of Clostridium difficile endospores. J Bacteriol 193: 6461-6470.
55. Phetcharaburanin, J., H.A. Hong, C. Colenutt, I. Bianconi, L. Sempere, P. Permpoonpattana, K. Smith, M. Dembek, S. Tan, M.C. Brisson, A.R. Brisson, N.F. Fairweather & S.M. Cutting, (2014) The spore-associated protein BclA1 affects the susceptibility of animals to colonization and infection by Clostridium difficile. Mol Microbiol 92: 1025-1038.
<110> Sporegen Limited <120> Modified Bacterial Spores <130> 2020-FPA-9969 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgacgcaat tcgataaaca atacaattca attataaagg atattatcaa taatggaatc 60 tcagacgaag agtttgatgt aagaaccaag tgggactcag atggaacacc ggcacatact 120 ctaagtgtaa tcagtaagca aatgagattc gacaactcag aggttccgat tttaacgaca 180 aaaaaggttg cctggaaaac agccattaaa gagttgctct ggatttggca gctgaaatct 240 aatgatgtta atgatttaaa catgatgggc gtccatattt gggatcagtg gaaacaagaa 300 gacggaacca tcggacatgc atatggattt cagctgggga agaaaaacag aagtctaaat 360 ggagaaaaag tggatcaggt agactatctt cttcatcaat tgaagaacaa tccatcttca 420 cgcagacaca ttacaatgct gtggaatcct gatgaattag acgcaatggc cttaacgcca 480 tgtgtatacg agacacaatg gtacgttaaa catgggaaac tccaccttga ggtaagagca 540 cggagcaatg atatggcatt gggaaatcca ttcaatgtat tccagtataa tgtgttgcag 600 cgcatgattg ctcaagtgac tggttatgag cttggtgaat atatctttaa cattggggat 660 tgccatgtgt acacacgtca tatagacaat ttgaaaattc aaatggaaag 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gtacgttaaa catgggaaac 1080 tccaccttga ggtaagagca cggagcaatg atatggcatt gggaaatcca ttcaatgtat 1140 tccagtataa tgtgttgcag cgcatgattg ctcaagtgac tggttatgag cttggtgaat 1200 atatctttaa cattggggat tgccatgtgt acacacgtca tatagacaat ttgaaaattc 1260 aaatggaaag agaacagttt gaagcacctg aactatggat caatcctgaa gtgaaagatt 1320 tttatgactt taccattgat gatttcaagt taatcaacta taaacatggg gacaagcttt 1380 tatttgaggt agcggtttaa tgctgccttt ttattgtgca gtgaatagat agcaggtatc 1440 ctaatttcat taagcaatct ggaagatgaa taaaaattga aggacaaaca cgtataatac 1500 ataaaaaaga ttaactctac agttaatctt ttttattcag aagaaaatat cctaactttg 1560 aaactaaata caaagtaaaa gcaatcatta cagttctaga tattacaatt ccatgaatag 1620 ctagatcata tccagcaggt atcaacgcat ttgtattaca cataaaatat atagatatta 1680 gaagtgctac aataactaaa atcattccaa aaagacttgt tttttcatat ttcataccaa 1740 tttccaccct tattaaagtt aggtttaaac aaaagagctg aagaaacgaa ctatgaccag 1800 tatgctccaa ggaaaaccgc cagacaatgc tggcggcttt ttgctgcttc gtttatttat 1860 taacagagat cgtaacgtta tttcctgcaa ctgaaacctt 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agatgaaatt 180 atcccgcttt caatcgttaa tgtgtacggg tcgatcggtt tgaccaattt cggttatttg 240 gataaagaga agattggaat tattaaggaa cttgatgaaa gtccagacgg tattcacacc 300 tttttggatg atattgtggc agctcttgct gcagcagcgg cgagcagaat tgcacatacg 360 catcaggatc tgcaagatga agaaaaagaa caggatgaaa agcctgtcgt cagctgacta 420 taaaaaaatc atttctgggt tcagaaatga ttttttattg tgttacacta ctagaagact 480 acttttaaag gatgaaaaaa atgaaacagt ataaggattt ctgcagacat gttttagagc 540 atggtgagaa aaagggagac cggactggga ccggaacaat cagcactttc ggatatcaaa 600 tgagatttaa tttacgggaa ggctttccga tgctcaccac taaaaaactc cactttaaat 660 caattgcgca tgaactgctg tggttcttaa aaggagatac gaatgtacgc tatctgcagg 720 aaaacggagt gcgaatctgg aatgagtggg ctgatgaaaa cggtgaactt ggacctgtat 780 atggctccca atggcgttct tggcggggag ctgatggaga aaccattgat caaatttccc 840 gtcttattga agatattaaa acaaatccga actccagacg cttaatcgtc agcgcctgga 900 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatcccccg ggggtaccga gctcgaattc 960 tgatgttggt gaaattgata aaatggcgtt gccgccgtgc cattgcctgt tccaattcta 1020 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Gly 180 185 190 Ile Leu Val Asp Asn Ala Asp Gly His Tyr Thr Ile Val Lys Asn Gln 195 200 205 Glu Val Leu Arg Ile Tyr Pro Phe His Ile Lys Ser Ile Ser Leu Gly 210 215 220 Pro Lys Gly Ser Tyr Lys Lys Glu Asp Gln Lys Asn Glu Gln Asn Gln 225 230 235 240 Glu Asp Asn Asn Asp Lys Asp Ser Asn Ser Phe Ile Ser Ser Lys Ser 245 250 255 Tyr Ser Ser Ser Lys Ser Ser Lys Arg Ser Leu Lys Ser Ser Asp Asp 260 265 270 Gln Ser Ser Lys Leu Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile 275 280 285 Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys 290 295 300 Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn 305 310 315 320 Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln 325 330 335 Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu 340 345 350 Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr 355 360 365 Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile 370 375 380 Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 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Lys Gly Lys Leu Thr Ala Val Lys Ser Asp 35 40 45 Tyr Ile Ala Leu Gln Ala Glu Lys Lys Ile Ile Tyr Tyr Gln Leu Glu 50 55 60 His Val Lys Ser Ile Thr Glu Asp Thr Asn Asn Ser Thr Thr Thr Ile 65 70 75 80 Glu Thr Glu Glu Met Leu Asp Ala Asp Asp Phe His Ser Leu Ile Gly 85 90 95 His Leu Ile Asn Gln Ser Val Gln Phe Asn Gln Gly Gly Pro Glu Ser 100 105 110 Lys Lys Gly Arg Leu Val Trp Leu Gly Asp Asp Tyr Ala Ala Leu Asn 115 120 125 Thr Asn Glu Asp Gly Val Val Tyr Phe Asn Ile His His Ile Lys Ser 130 135 140 Ile Ser Lys His Glu Pro Asp Leu Lys Ile Glu Glu Gln Thr Pro Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Glu Ala Asp Asp Leu Ser Glu Val Phe Lys Ser Leu Thr 165 170 175 His Lys Trp Val Ser Ile Asn Arg Gly Gly Pro Glu Ala Ile Glu Gly 180 185 190 Ile Leu Val Asp Asn Ala Asp Gly His Tyr Thr Ile Val Lys Asn Gln 195 200 205 Glu Val Leu Arg Ile Tyr Pro Phe His Ile Lys Ser Ile Ser Leu Gly 210 215 220 Pro Lys Gly Ser Tyr Lys Lys Glu Asp Gln Lys Asn Glu Gln Asn Gln 225 230 235 240 Glu Asp Asn Asn Asp Lys Asp Ser Asn Ser Phe Ile Ser Ser Lys Ser 245 250 255 Tyr Ser Ser Ser Lys Ser Ser Lys Arg Ser Leu Lys Ser Ser Asp Asp 260 265 270 Gln Ser Ser Lys Leu Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Val Ala Ala 275 280 285 Ser Ser Val Lys Asn Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe 290 295 300 Asn Thr Leu Thr Gln Asn Met Lys Glu Ile Arg Asp Ala Gly Tyr Ala 305 310 315 320 Ala Ile Gln Thr Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly 325 330 335 Asp Lys Ser Met Arg Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro Thr Ser Tyr 340 345 350 Gln Ile Gly Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Asp Met 355 360 365 Cys Ala Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Val 370 375 380 Ile Asn His Thr Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asp Glu Ile Lys 385 390 395 400 Arg Ile Pro Asn Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser 405 410 415 Asp Arg Trp Asp Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp 420 425 430 Asn Thr Gln Asn Thr Glu Val Gln Thr Tyr Leu Lys Gly Phe Leu Glu 435 440 445 Arg Ala Leu Asn Asp Gly Ala Asp Gly Phe 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Val Pro Gly Gln Asn 865 870 875 880 Gln Pro Gly Phe Asp Tyr Val Gln Asn Gly Leu Tyr Asn Asn Ser Gly 885 890 895 Leu Asn Gly Tyr Leu Pro His 900 <210> 18 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> open reading frame of thyA <400> 18 Met Thr Gln Phe Asp Lys Gln Tyr Asn Ser Ile Ile Lys Asp Ile Ile 1 5 10 15 Asn Asn Gly Ile Ser Asp Glu Glu Phe Asp Val Arg Thr Lys Trp Asp 20 25 30 Ser Asp Gly Thr Pro Ala His Thr Leu Ser Val Ile Ser Lys Gln Met 35 40 45 Arg Phe Asp Asn Ser Glu Val Pro Ile Leu Thr Thr Lys Lys Val Ala 50 55 60 Trp Lys Thr Ala Ile Lys Glu Leu Leu Trp Ile Trp Gln Leu Lys Ser 65 70 75 80 Asn Asp Val Asn Asp Leu Asn Met Met Gly Val His Ile Trp Asp Gln 85 90 95 Trp Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ile Gly His Ala Tyr Gly Phe Gln Leu 100 105 110 Gly Lys Lys Asn Arg Ser Leu Asn Gly Glu Lys Val Asp Gln Val Asp 115 120 125 Tyr Leu Leu His Gln Leu Lys Asn Asn Pro Ser Ser Arg Arg His Ile 130 135 140 Thr Met Leu Trp Asn Pro Asp Glu Leu Asp Ala Met Ala Leu Thr Pro 145 150 155 160 Cys Val Tyr Glu Thr Gln Trp Tyr Val Lys His Gly Lys Leu His Leu 165 170 175 Glu Val Arg Ala Arg Ser Asn Asp Met Ala Leu Gly Asn Pro Phe Asn 180 185 190 Val Phe Gln Tyr Asn Val Leu Gln Arg Met Ile Ala Gln Val Thr Gly 195 200 205 Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Ile Phe Asn Ile Gly Asp Cys His Val Tyr 210 215 220 Thr Arg His Ile Asp Asn Leu Lys Ile Gln Met Glu Arg Glu Gln Phe 225 230 235 240 Glu Ala Pro Glu Leu Trp Ile Asn Pro Glu Val Lys Asp Phe Tyr Asp 245 250 255 Phe Thr Ile Asp Asp Phe Lys Leu Ile Asn Tyr Lys His Gly Asp Lys 260 265 270 Leu Leu Phe Glu Val Ala Val 275 <210> 19 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> open reading frame of thyB <400> 19 Met Lys Gln Tyr Lys Asp Phe Cys Arg His Val Leu Glu His Gly Glu 1 5 10 15 Lys Lys Gly Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Ile Ser Thr Phe Gly Tyr 20 25 30 Gln Met Arg Phe Asn Leu Arg Glu Gly Phe Pro Met Leu Thr Thr Lys 35 40 45 Lys Leu His Phe Lys Ser Ile Ala His Glu Leu Leu Trp Phe Leu Lys 50 55 60 Gly Asp Thr Asn Val Arg Tyr Leu Gln Glu 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Claims (25)

  1. 적어도 하나의 이종성 유전자를 바실러스 종(Bacillus Spp.) 내로 도입하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 상기 바실러스 종이 증식할 수 없게 하는 방법으로서,
    상기 방법은
    (a)
    (ⅰ) 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계; 및
    (ⅱ) 트리메토프림(trimethoprim)의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계; 또는
    (b)
    (ⅰ) 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 thyA 유전자 또는 thyB 유전자 내로 도입하는 단계;
    (ⅱ) 트리메토프림의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계;
    (ⅲ) 이종성 유전자를 상기 바실러스 종 내의 thyA 유전자 또는 thyB 유전자 중 다른 것 내로 도입하는 단계; 및
    (ⅳ) 트리메토프림의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계;를 포함하고,
    상기 방법은 항생제 내성 유전자의 도입 없이 작동하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 바실러스 종은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 (b)의 단계 (ⅰ)은 바실러스 종 내의 thyA 유전자 내로의 이종성 유전자의 도입이고; 및
    단계 (ⅲ)은 바실러스 종 내의 thyB 유전자 내로의 이종성 유전자의 도입인 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ⅱ) 동안, 상기 바실러스 종은 2 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.0001 mg/ml, 또는 0 mg/ml 미만의 농도로 효모 추출물(YE)을 포함하는 배지에서 성장되는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바실러스 종이 성장되는 배지는 YE를 함유하지 않는 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ⅳ) 동안, 상기 바실러스 종은 2 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.0001 mg/ml, 또는 0 mg/ml 미만의 농도로 효모 추출물(YE)을 포함하는 배지에서 성장되는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ⅳ) 동안, 상기 바실러스 종이 성장되는 배지는 YE를 함유하지 않는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    단계 (ⅱ) 동안, 상기 바실러스 종은 티민 또는 티미딘을 포함하는 배지에서 성장되고; 및/또는
    YE는 상기 방법의 임의의 단계에 사용되는 배지 내에서 2 mg/ml 미만의 농도로 존재하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    YE는 상기 방법의 임의의 단계에 사용되는 배지 내에서 존재하지 않는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    단계 (ⅳ) 동안, 상기 바실러스 종은 티민 또는 티미딘을 포함하는 배지에서 성장되는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    단계 (ⅳ)에 존재하는 트리메토프림의 양은 단계 (ⅱ)에 존재하는 트리메토프림의 양보다 많은 방법.
  12. 청구항 3에 있어서,
    thyA 좌(locus)에 삽입을 갖는 세포는 티민 또는 티미딘의 존재 또는 부재 시에 37℃에서 성장능이 있지만, 티민 또는 티미딘이 보충되지 않는 한 46℃에서는 성장능이 없는 것에 의해 확인되는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    단계 (ⅳ) 동안, 상기 바실러스 종은 적어도 하나의 아미노산이 보충된 배지에서 성장되는 방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    단계 (ⅳ) 동안, 상기 바실러스 종은 카사미노산(CAA)을 포함하는 배지에서 성장되는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    (ⅰ) 2 개의 삽입을 갖는 세포는 티민 또는 티미딘이 보충되지 않는 한 37℃ 또는 46℃에서 성장능이 없는 것에 의해 확인되고;
    (ⅱ) 상기 방법은 항생제 내성 유전자의 도입 없이 작동하고; 및/또는
    (ⅲ) 상기 바실러스 종으로부터 박테리아 포자를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 청구항 1의 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 박테리아 포자.
  17. 적어도 하나의 이종성 유전자를 포함하고 티민 또는 티미딘의 부재 하에 증식할 수 없는 박테리아 포자로서,
    상기 박테리아 포자는
    (ⅰ) 이종성 유전자를 바실러스 종 내의 thyA 유전자 및 thyB 유전자 내로 도입하는 단계;
    (ⅱ) 트리메토프림의 존재 하에 상기 바실러스 종을 성장시키는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 바실러스 종으로부터 박테리아 포자를 형성하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 생성되고,
    상기 박테리아 포자는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 박테리아 포자.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 박테리아 포자는 청구항 1에 따른 방법에 의해 생성되는 박테리아 포자.
  19. 청구항 1의 방법에 사용하기 위한 벡터로서,
    (ⅰ) 상기 벡터는 바실러스 종 thyA 유전자의 5' 부분 중 적어도 일부, (ⅱ) 이종성 유전자, 및 (ⅲ) 바실러스 종 thyA 유전자의 3' 부분 중 적어도 일부를 포함하고, 추가로 (ⅳ) 바실러스 종 thyB 유전자의 5' 부분 중 적어도 일부, (ⅴ) 이종성 유전자, 및 (ⅵ) 바실러스 종 thyB 유전자의 3' 부분 중 적어도 일부를 포함하는 벡터.
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EP3181682B1 (en) * 2008-09-29 2021-04-21 Intrexon Actobiotics NV Reduced colonization of microbes at the mucosa

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applied and environmental microbiology. vol. 61, no.12, 4244-4250(1995)
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