KR102654220B1 - Cmip 억제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
Cmip 억제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CMIP (C-Maf Inducing Protein) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법; 및 CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 지방간 질환 치료제의 스크리닝용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 비알콜성 지방간의 유도 및 진행에 영향을 미치는 Ppar-gamma 및 Ppar-gamma의 표적 유전자로 지방수송과 관련된 CD36의 발현을 감소시키고, 비알콜성 지방간증 억제에 관여하는 Ccnd1 발현을 증가시키며, 지방산 흡수를 감소시키는 효과를 나타내었다. 또한, 마우스 모델에서 CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 제제가 독성 없이 PPAR-gamma 및 CD36의 발현을 감소시키고, 간 조직 내 지방 축적을 감소시키며, 혈중 AST 및 중성지방 수치를 감소시키는 효과를 나타낸바, CMIP 발현 또는 활성 억제제는 지방간 질환의 예방 또는 치료용, 간 보호 또는 간 기능 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 비알콜성 지방간의 유도 및 진행에 영향을 미치는 Ppar-gamma 및 Ppar-gamma의 표적 유전자로 지방수송과 관련된 CD36의 발현을 감소시키고, 비알콜성 지방간증 억제에 관여하는 Ccnd1 발현을 증가시키며, 지방산 흡수를 감소시키는 효과를 나타내었다. 또한, 마우스 모델에서 CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 제제가 독성 없이 PPAR-gamma 및 CD36의 발현을 감소시키고, 간 조직 내 지방 축적을 감소시키며, 혈중 AST 및 중성지방 수치를 감소시키는 효과를 나타낸바, CMIP 발현 또는 활성 억제제는 지방간 질환의 예방 또는 치료용, 간 보호 또는 간 기능 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CMIP (C-Maf Inducing Protein) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법; 및 지방간 질환 치료제의 스크리닝용 키트에 관한 것이다.
간은 우리 몸에서 각종 대사 작용, 해독, 분해, 합성 및 분비를 담당하는 중요한 장기로, (i) 에너지 대사 관리 기능, (ii) 효소, 알부민, 인지질 등의 합성, 저장 및 분배 기능, (iii) 각종 대사산물을 담관을 통해 십이지장으로 배설하는 기능 및 (iv) 해독 및 분해 기능 등을 갖는다. 이러한 역할을 하는 간의 기능에 이상이 발생하면 생체의 영양소 대사에 문제를 유발하게 되며, 간 기능 이상을 일으키는 간 질환에는 지방간, 간염, 간경변증, 간암 등이 있다.
그 중, 지방간은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5%)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 증상을 의미한다. 지방간은 크게 과음으로 인한 알콜성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알콜성 지방간으로 나눌 수 있는데, 알콜성 지방간은 알콜을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하고, 비알콜성 지방간은 알콜 이외의 원인으로 인하여 발생한다. 상기 비알콜성 지방간은 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있으며, 특히 비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 가장 흔한 간질환의 하나로서 간에 지방이 축적되어 발생하며, 이 질환은 염증에 더 민감하게 반응하게 하여 간의 기능을 저하시키게 된다.
구체적으로, 비알콜성 지방간 질환은 과량의 알콜을 섭취하지 않은 환자에서 염증 반응을 동반하지 않는 비알콜성 단순 지방간, 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 및 이에 의해 진전되어 간세포의 염증반응, 간섬유화 및 간경화를 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다. 비알콜성 지방간 질환은 원인에 따라 원발성과 속발성으로 나뉜다. 원발성은 대사증후군의 특징인 고지혈증, 당뇨, 또는 비만 등에 의해 발생되며, 속발성은 급격한 체중 감소, 기아 등과 같은 영양적 원인, 다양한 약물, 대사성 원인 및 기타 요인에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.
알콜성 지방간의 경우에는, 알콜의 섭취를 억제함으로써, 증상의 완화 또는 호전을 기대할 수 있는 반면, 비알콜성 지방간의 경우에는 뚜렷한 발병원인이 밝혀져 있지 않아, 상대적으로 치료에 어려움을 겪고 있다. 비알콜성 지방간 질환의 치료와 관련하여, 몇 가지 당뇨 또는 비만 치료 약제 투여의 지방간 질환에 대한 효과가 보고된 바 있다. 경구용 비만치료제로 사용되고 있는 올리스탓(Orlistat)의 경우 지방간염 환자에서 간의 조직학적 향상을 유도했다는 보고(Hussein et al., 2007)가 있으며, PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)의 작용물질(agonist)인 티아졸리딘디온(Thiazolidinedione, TZD) 계열의 약물은 간과 근육에서의 지방 축척을 억제하고, 비알콜성 지방간 질환의 동물 모델에서 간에 대해 직접적인 항 섬유화 작용을 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Galli A et al., 2002). 현재 운동이나 금주, 식이요법 등과 약물 치료를 병행해서 간 질환을 치료하고는 있지만, 근본적으로 완전히 치유가 되기는 어렵기 때문에 효과적이고 개선된 간 질환 치료제 또는 간 보호제의 개발이 계속적으로 필요하다.
한편, 유전자 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 간섭 RNA(RNA interference, 이하 'RNAi')는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). 세포 내에서는 RNA 이중가닥이 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의해 프로세싱되어 21 내지 23개의 이중가닥(base pair,bp)의 siRNA로 변환되며, siRNA 는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514). 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)이 특정한 단백질 표적에 최적화되기까지 오랜 동안의 개발 기간 및 개발 비용이 소요되는 것에 비하여, 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있고, 개발 기간이 단축되면서, 의약화가 불가능한 표적 물질을 포함한 모든 단백질 표적에 대하여 최적화된 리드 화합물을 개발할 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 지방간 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, CMIP 발현을 억제할 경우 지방간 질환을 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 CMIP (C-Maf Inducing Protein) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 지방간 질환 치료제의 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 CMIP(C-Maf Inducing Protein) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "CMIP(C-Maf Inducing Protein)"는 T-세포 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 알려져있다. 상기 CMIP를 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예를 들어, NM_001163262). 그러나, 상기 공지된 서열뿐만 아니라, 이의 상동 단백질 또는 변이 단백질 역시 본 발명에서 제공하는 CMIP의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제"란, 유전자에서 발현되어 생산되는 전사체 또는 단백질의 생성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 제제로는 유전자에 결합하여 전사수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 합성된 전사체에 결합하여 전사체를 분해하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 간섭 RNA; 상기 CMIP의 발현을 억제하거나 활성을 억제하는 화합물, 그 예로 저분자 화합물질; 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 안타고니스트 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "간섭 RNA"는 유전자의 활성을 억제하는 RNAi를 유발시킬 수 있는 이중가닥 RNA를 의미한다. 본 발명에 있어서 상기 CMIP의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 CMIP 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능하고, 구체적으로 CMIP mRNA에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), 또는 miRNA (microRNA)일 수 있다. 예를 들어, CMIP의 발현을 억제하는 siRNA일 수 있고, 상기 siRNA는 바람직하게는 센스 서열 및 안티센스 서열로 구성되고, 각각의 서열은 8 내지 20 뉴클레오티드 길이를 가지며, 안티센스 서열의 일부가 CMIP mRNA의 일부에 상보적이고 안티센스 서열 일부는 센스 서열의 일부에 상보적인 듀플렉스 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 센스(sense) 서열 및 서열번호 2의 안티센스(antisense) 서열로 구성된 siRNA, 서열번호 3의 센스 서열 및 서열번호 4의 안티센스 서열로 구성된 siRNA, 서열번호 5의 센스 서열 및 서열번호 6의 안티센스 서열로 구성된 siRNA, 서열번호 7의 센스 서열 및 서열번호 8의 안티센스 서열로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 9의 센스 서열 및 서열번호 10의 안티센스 서열로 구성된 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "저분자 화합물질"은 상기 CMIP의 발현을 억제하거나 활성을 억제할 수 있는 한, 제한되지 않고 본 발명에 포함될 수 있으며, 천연 유래의 물질 또는 합성된 물질일 수 있다. 구체적으로, 유기합성물질, 또는 천연물질 일 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 CMIP 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 앱타머는 CMIP 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "안타고니스트(antagonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 안타고니스트는 CMIP 단백질의 활성을 억제하는 분자라면 제한 없이 포함하며, 구체적인 예로 상기 안타고니스트는 CMIP 단백질에 결합하여 활성을 억제하는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "지방간 질환 (Fatty liver disease)"은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5%)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 증상을 의미한다. 상기 지방간은 과음으로 인한 알콜성 지방간; 또는 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알콜성 지방간을 포함할 수 있다. 알콜성 지방간은 알콜을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하고, 비알콜성 지방간은 알콜 이외의 원인으로 인하여 발생하며, 상기 비알콜성 지방간은 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 상기 지방간 질환은 비알콜성 지방간 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "비알콜성 지방간 질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)"은 알콜이 아닌 다른 발생 원인에 기인하여 간에 지방이 축적되는 질환을 의미한다. 비알콜성 지방간 질환은 원발성과 속발성에 따른 비알콜성 지방간 질환을 모두 포함하나, 바람직하게는 원발성 고지혈증, 당뇨 또는 비만으로부터 발생되는 비알콜성 지방간 질환을 의미한다. 예를 들어, 비알콜성 지방간 질환은 비알콜성 단순 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 및 이러한 질환의 전진에 의해 발생되는 간섬유화 (Liver fibrosis)와 간경화 (Liver cirrhosis)를 포함한다.
본 발명의 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 통해 지방간 질환의 발명을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 용어 "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써 지방간 질환이 호전 또는 완화되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 지방간 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 구체적인 투여량은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있으며, 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 (a) 지방간 질환 치료제 후보 물질을 CMIP 유전자가 발현되는 세포에 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 지방간 질환 치료제 후보 물질을 처리한 세포에서 CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현량 또는 활성이 지방간 질환 치료제 후보 물질을 처리하지 않은 대조군 세포보다 감소하는 경우, 해당 지방간 질환 치료제 후보 물질을 지방간 질환 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "CMIP", "지방간 질환" 및 "치료"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "지방간 질환 치료제 후보 물질"은 지방간 질환 치료제가 될 수 있는 가능성이 있는 물질의 의미하는 것으로, 통상적인 선정방식에 따라 지방간 질환 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있고, 구체적으로, 저분자 화합물, 유기합성물질, 천연물질, microRNA, siRNA, shRNA, 항체, 앱타머 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량 또는 활성의 측정은 CMIP 단백질 또는 상기 유전자의 mRNA의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 CMIP 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 것은 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 또는 이들의 조합을 이용할 수 있고, 이는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 마이크로어레이 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 CMIP 단백질의 발현수준을 측정하는 것은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 안타고니스트 또는 이들의 조합을 이용할 수 있고, 이는 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "대조군"이란 지방간 질환 치료제 후보 물질을 처리하지 않은 CMIP를 발현하는 세포 또는 조직으로 상기 후보 물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 세포 또는 조직을 의미한다.
본 발명의 용어 “지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법”은, 비만 또는 지방간 질환과 CMIP의 발현이 관련됨을 확인함으로써, CMIP의 활성 및 발현을 치료제 후보 물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다. 지방간 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 지방간 질환의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 지방간 질환 치료제의 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 "CMIP", "지방간 질환" 및 "치료"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 지방간 질환 치료제의 스크리닝용 키트를 이용하여, 지방간 질환 치료제 후보 물질로부터 비만 치료제를 선정할 수 있다.
본 발명에서 CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제, 및 키트는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 비알콜성 지방간의 유도 및 진행에 영향을 미치는 Ppar-gamma 및 Ppar-gamma의 표적 유전자로 지방수송과 관련된 CD36의 발현을 감소시키고, 비알콜성 지방간증 억제에 관여하는 Ccnd1 발현을 증가시키며, 지방산 흡수를 감소시키는 효과를 나타내었다. 또한, 마우스 모델에서 CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 제제가 독성 없이 PPAR-gamma 및 CD36의 발현을 감소시키고, 간 조직 내 지방 축적을 감소시키며, 혈중 AST 및 중성지방 수치를 감소시키는 효과를 나타낸바, CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 지방간 질환의 예방 또는 치료용, 간 보호 또는 간 기능 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 고지방 고수크로스 식이 섭취군에서 정상 식이 섭취군 대비 CMIP 유전자의 메틸화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 1b는 고지방 고수크로스 식이 섭취군에서 정상 식이 섭취군 대비 CMIP 유전자 발현 정도의 변화를 확인한 그래프이다.
도 1c는 고지방 고수크로스 식이 섭취군에서 정상 식이 섭취군 대비 CMIP 단백질 발현 정도의 변화를 확인한 그래프이다.
도 2a는 비만 마우스 모델에서 정상 마우스 대비 CMIP 유전자의 메틸화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 비만 마우스 모델에서 정상 마우스 대비 CMIP 유전자 발현 정도의 변화를 확인한 그래프이다.
도 2c는 비만 마우스 모델에서 정상 마우스 대비 CMIP 단백질 발현 정도의 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 정상 간 조직과 비알콜성 지방간증 소견을 보이는 간 조직에서의 CMIP 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 정상 마우스군과 비알콜성 지방간염 마우스군에서 적출된 간 조직의 CMIP 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 5는 다섯 종류의 CMIP siRNA(siCMIP #1 내지 #5)를 AML-12 세포주에 트랜스펙션한 후, quantitative real-time PCR(도 5 상단) 및 wetern blotting(도 5 하단)을 실시한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 AML-12 세포주에서 CMIP 발현 억제제가 PPAR-gamma 및 Ccnd1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 AML-12 세포주에서 CMIP 발현 억제제가 CD36의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6c는 AML-12 세포주에서 CMIP 발현 억제제가 세포 내 지방산 흡수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 CMIP, PPAR-gamma 및 CD36의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 CMIP 발현 억제가 간 조직 내 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 7c는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 혈중 AST, 중성지방(TG) 및 콜레스테롤 수치에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7d는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 식이 섭취량, ALP 및 ALT 수치에 영향을 미치지 않음을 확인한 그래프이다.
도 1b는 고지방 고수크로스 식이 섭취군에서 정상 식이 섭취군 대비 CMIP 유전자 발현 정도의 변화를 확인한 그래프이다.
도 1c는 고지방 고수크로스 식이 섭취군에서 정상 식이 섭취군 대비 CMIP 단백질 발현 정도의 변화를 확인한 그래프이다.
도 2a는 비만 마우스 모델에서 정상 마우스 대비 CMIP 유전자의 메틸화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 비만 마우스 모델에서 정상 마우스 대비 CMIP 유전자 발현 정도의 변화를 확인한 그래프이다.
도 2c는 비만 마우스 모델에서 정상 마우스 대비 CMIP 단백질 발현 정도의 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 정상 간 조직과 비알콜성 지방간증 소견을 보이는 간 조직에서의 CMIP 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 정상 마우스군과 비알콜성 지방간염 마우스군에서 적출된 간 조직의 CMIP 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 5는 다섯 종류의 CMIP siRNA(siCMIP #1 내지 #5)를 AML-12 세포주에 트랜스펙션한 후, quantitative real-time PCR(도 5 상단) 및 wetern blotting(도 5 하단)을 실시한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 AML-12 세포주에서 CMIP 발현 억제제가 PPAR-gamma 및 Ccnd1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 AML-12 세포주에서 CMIP 발현 억제제가 CD36의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6c는 AML-12 세포주에서 CMIP 발현 억제제가 세포 내 지방산 흡수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 CMIP, PPAR-gamma 및 CD36의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 CMIP 발현 억제가 간 조직 내 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 7c는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 혈중 AST, 중성지방(TG) 및 콜레스테롤 수치에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7d는 비만 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제제의 투여가 식이 섭취량, ALP 및 ALT 수치에 영향을 미치지 않음을 확인한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CMIP 유전자의 메틸화와 CMIP 발현 사이의 상관관계 확인 (1)
1. 고지방 고수크로스 식이에 따른 CMIP 유전자의 메틸화 수준 변화
7주령 C57BL/6N 수컷 마우스 20마리를 두 그룹으로 나누어 1주일간 12시간의 light-dark cycle로 순화(acclimation)시킨 후, 대조군(n=10)은 정상 식이(ND, 98052602, Research Diets), HFHS 식이 그룹(n=10)은 고지방 고수크로스 식이(High-Fat High Sucrose, D12079B, Research Diets)를 12주간 섭취시킨 후 실험을 진행하였다. 12주 후 마우스는 희생되었으며, 간 조직을 채취하여 실험을 진행하였다.
Bissulfite amplicon sequencing (BSAS) 분석을 통하여 CMIP 유전자의 intron 1 부위의 10개의 CpG island의 메틸화를 분석한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 10개중 9개 부위에서 HFHS 섭취 시 CMIP 유전자의 메틸화가 통계적으로 유의하게 감소하였다. CMIP 유전자 메틸화 수준의 평균은 ND 대조군 마우스의 경우 약 60%, HFHS 식이 그룹 마우스의 경우 약 40%의 수준으로, ND 섭취 마우스의 CMIP 유전자 메틸화 수준을 100% 기준으로 하여 상대적으로 평가하였을시 약 66.7%에 해당하는 수준으로 확인되었다.
2. CMIP 유전자의 메틸화와 유전자 발현의 상관관계 확인
CMIP 유전자의 메틸화 감소가 유전자 발현의 증가로 이어지는지 확인하기 위하여 quantitative real-time PCR을 수행한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, CMIP 유전자 메틸화의 감소를 보였던 HFHS 섭취군에서 CMIP mRNA 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 즉, CMIP 유전자의 메틸화는 해당 유전자의 발현과 음의 상관관계를 가짐을 확인하였다.
3. CMIP 단백질의 발현 확인
CMIP 유전자 발현의 증가가 단백질 발현의 증가로 이어지는지 확인하기 위하여 마우스 간조직을 대상으로 western blotting assay를 수행한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 상기 mRNA 발현과 마찬가지로 HFHS 섭취군의 간조직에서 CMIP 단백질 발현이 ND 섭취군에 비해 현저하게 높게 나타남을 확인하였다.
실시예 2: CMIP 유전자의 메틸화와 CMIP 발현 사이의 상관관계 확인 (2)
1. 비만 모델 마우스에서 CMIP 유전자의 메틸화 수준 변화
정상 마우스인 7주령 C57BL/6J-wt (wt) 그리고 비만 모델 마우스인 C57BL/6J-ob/ob (ob/ob) 마우스를 각 그룹당 4마리씩 1주간 12시간의 light-dark cycle로 순화(acclimation)시킨 후 바로 희생시켰으며, 간 조직을 채취하여 실험을 진행하였다.
적출된 마우스의 간을 대상으로 Bissulfite amplicon sequencing (BSAS) 분석을 통하여 CMIP 유전자 intron 1 부위 10개의 CpG island의 메틸화를 분석한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 비만 모델인 ob/ob 마우스 10개의 모든 CpG island 부위에서 메틸화가 통계적으로 유의하게 낮아짐을 관찰하였다. 평균 메틸화 수준은 정상 마우스 간조직의 경우 약 60%, ob/ob 마우스 간조직의 경우 약 30%의 수준으로 나타났으며, 이는 정상 마우스 군의 메틸화 수준을 100% 기준으로 하여 상대적으로 평가하였을시 약 50%에 해당하는 수준으로 확인하였다.
2. CMIP 유전자의 메틸화와 유전자 발현의 상관관계 확인
CMIP 유전자의 메틸화 감소가 유전자 발현의 증가로 이어지는지 확인하기 위하여 quantitative real-time PCR을 수행한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 정상군 대비 CMIP 유전자의 메틸화가 상대적으로 낮았던 ob/ob 마우스의 간조직에서 CMIP mRNA 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 즉, CMIP 유전자의 메틸화는 해당 유전자의 발현과 음의 상관관계를 가짐을 확인하였다.
3. CMIP 단백질의 발현 확인
CMIP 유전자 발현의 증가가 단백질 발현의 증가로 이어지는지 확인하기 위하여 마우스 간조직을 대상으로 western blotting assay를 실시한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 상기 mRNA 발현과 마찬가지로 ob/ob 마우스에서 CMIP 단백질 발현 역시 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 3: 비알콜성 지방간증(NAFLD) 소견을 보이는 인체 간 조직에서의 CMIP 발현 수준 확인
실제 비알콜성 지방간(NAFLD) 소견을 보이는 인체 간조직에서의 CMIP 발현 수준이 정상조직 대비 높은지 여부를 확인하기 위하여 정상을 포함한 다양한 병리적 상태의 간 조직을 지니고 있는 tissue microarray(TMA)를 구입(US Biomax, Inc.)하고, 면역조직염색화학법(immunohistochemistry)을 이용하여 CMIP 발현 수준을 확인하였다.
구체적으로, TMA 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 시트르산염(citrate) 버퍼에 담아 고온 고압에서 항원단백을(CMIP)을 노출시켰다. CMIP 항체를 1:100으로 희석하여 항원이 노출된 TMA 조직에 반응시킨 후, 비오틴이 부착된 2차 항체와 반응시켰다. CMIP 단백의 검출을 위하여 2차 항체와 반응할 수 있는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 부착된 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 반응을 실시하고, 3-3'-디아미노-벤지딘(DAB)를 통하여 반응한 단백질을 검출하였다. 즉, 조직에서 갈색이 강하게 발색될수록 검측하고자 하는 CMIP 단백질의 발현 수준이 높음을 의미한다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상 조직 대비 NAFLD 소견을 보이는 간세포에서 CMIP 발현 수준이 높은 것으로 확나타났다. 이러한 결과는 실제 NAFLD 소견을 보이는 인체 간 조직에서 CMIP의 발현 수준이 높게 나타남을 의미하며, 이는 CMIP를 통한 NAFLD의 진단 및 치료가 가능함을 시사한다.
실시예 4:
비알콜성 지방간염(NASH) 소견을 보이는 마우스 간 조직에서의 CMIP 발현 수준 확인
비알콜성 지방간증뿐만 아니라 비알콜성 지방간염(Non-alcoholic steatohepatitis; NASH) 치료를 위하여 CMIP가 주요 표적이 될 수 있는지 확인하고자, NASH 소견을 보이는 마우스 간 조직을 사용하여 CMIP 발현 수준을 측정하였다.
기존 선행 연구의 방법을 참고하여, 5주령 C57BL/6N 수컷 마우스에 choline-deficient L-amino acid-defined high-fat diet with 0.1% methionine (CDAHFD, Research Diets#A06071302)를 14주간 섭식시켜 NASH 모델로 활용하였다. 14주 후 마우스를 희생시켜 간조직을 적출한 후 단백질을 추출하고, 웨스턴 블랏팅을 통하여 CMIP 단백질 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스군(n=5) 대비 NASH 마우스군(n=5)에서 유의미하게 CMIP의 발현이 증가하는 것으로 나타났다.
CMIP 발현 수준을 정량화하기 위해 각 마우스 개체의 GAPDH (internal control)의 발현으로 CMIP 발현을 보정한 후, 발현 값 총합의 평균을 산출하여 그래프로 표시한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 정상군 대비 NASH 마우스군에서 CMIP의 발현이 1.5배 이상 통계적으로 유의하게 높음을 확인하였다.
이와 같은 결과는 CMIP가 비알콜성 지방간증(NAFLD)뿐만 아니라 비알콜성 지방간염(NASH) 치료를 위한 표적이 될 수 있음을 시사한다.
실시예 5: CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 CMIP siRNA 합성 및 발현 억제능 확인
1. CMIP 발현 또는 활성을 억제하는 CMIP siRNA 합성
CMIP 억제 효과를 확인하기 위해, CMIP mRNA(NCBI Reference Sequence: NM_001163262.1)를 레퍼런스로 사용하여 siRNA를 제작하였다. CMIP siRNA는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 그리고 서열번호 9 및 10으로 구성된 siRNA를 사용하였고, 대조군(Negative control, NC)으로 서열번호 11 및 12로 구성된 서열을 사용하였다(표 1).
| siRNA name | Duplex sequence (5'→ 3') | 서열번호 | |
| siCmip #1 | Sense | GCUUCAACCCAUUCCAUUCUU | 1 |
| Antisense | GAAUGGAAUGGGUUGAAGCUU | 2 | |
| siCmip #2 | Sense | CAAAGGAACUGAAGUACGUUU | 3 |
| Antisense | ACGUACUUCAGUUCCUUUGUU | 4 | |
| siCmip #3 | Sense | ACAUCAUCGACAACAACGAUU | 5 |
| Antisense | UCGUUGUUGUCGAUGAUGUUU | 6 | |
| siCmip #4 | Sense | CCAAGCUUCCUAACCUAAAUU | 7 |
| Antisense | UUUAGGUUAGGAAGCUUGGUU | 8 | |
| siCmip #5 | Sense | CCUAAAGGAGGUUGAUGUUUU | 9 |
| Antisense | AACAUCAACCUCCUUUAGGUU | 10 | |
| Negative control | Sense | CCUCGUGCCGUUCCAUCAGGUAGUU | 11 |
| Antisense | CUACCUGAUGGAACGGCACGAGGUU | 12 |
2. CMIP siRNA의 세포 내 CMIP 발현 억제능 확인
제조한 CMIP siRNA의 CMIP 발현 억제능을 확인하기 위하여, siCmip #1 내지 #5를 각 60pmol의 농도로 AML-12 간세포주에 트랜스펙션(transfection)한 후 이들 각각의 세포 내 CMIP 발현 저해능을 quantitative real-time PCR 및 western blotting을 통하여 확인하였다.
그 결과, quantitative real-time PCR(도 5 상단) 및 western blotting(도 5 하단) 결과에 나타난 바와 같이, siCmip #1 내지 #5가 대조군 대비 CMIP 발현을 유의미하게 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 6: CMIP 발현 억제가 비알콜성 지방간증 관련 인자에 미치는 영향 확인
CMIP 발현 억제가 비알콜성 지방간증 관련 인자에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, AML-12 세포주에 siCmip #1 및 siCmip #2를 각각 트렌스펙션한 후 비알콜성 지방간증 관련 유전자들의 발현 변화를 quantitative real-time PCR을 통하여 관찰하였다. 이때 in vitro 비알콜성 지방간증 유도를 위하여 400 uM의 올레산과 100 uM의 팔미트산을 혼합하여 처리하였으며(OPA), 대조군(-)은 동일한 농도의 BSA(Bovine serum albumin)를 처리하였다.
siCmip #1 및 siCmip #2를 AML-12 세포주에 트렌스펙션하고 12시간 후, OPA 처리를 통하여 비알콜성 지방간증을 유도하였다. 그 후 12시간 뒤 세포들을 수거하고, RNA를 추출한 후 cDAN를 합성하여 이를 기초로 quantitative real-time PCR을 통해 비알콜성 지방간증 관련 유전자들의 발현 변화를 확인하였다.
1. CMIP 발현 억제에 의한 PPAR-gamma 발현 감소 및 Ccnd1 발현 증가
그 결과, CMIP의 siRNA를 이용하여 CMIP의 발현을 억제시켰을 때, 도 6a에 나타낸 바와 같이 비알콜성 지방간의 유도 및 진행에 영향을 미친다고 알려진 Ppar-gamma의 mRNA 발현이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.
또한, CMIP의 siRNA를 이용하여 CMIP의 발현을 억제시켰을 때, 도 6a에 나타낸 바와 같이 비알콜성 지방간증 억제에 관여한다고 알려진 Ccnd1의 mRNA 발현은 증가하는 것으로 나타났다.
2. CMIP 발현 억제에 의한 CD36 발현 감소
Ppar-gamma의 표적 유전자로 지방수송에 관련된 CD36의 유전자 발현을 관찰하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, CMIP의 siRNA를 이용하여 CMIP의 발현을 억제시킨 세포에서 CD36의 mRNA 발현이 현저하게 낮게 관찰되었다.
3. CMIP 발현 억제에 의한 지방산 흡수 감소
세포내 지방산 흡수(fatty acid uptake)를 측정한 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 CMIP의 siRNA를 이용하여 CMIP의 발현을 억제시킨 경우 세포내 지방산 흡수가 상대적으로 감소함을 확인하였다.
실시예 7: 마우스 모델에서 CMIP 발현 억제가 비알콜성 지방간증에 미치는 영향 확인
CMIP 발현 억제를 통하여 비알콜성 지방간증을 완화할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 마우스 비만 모델인 ob/ob 마우스를 사용하였다. 7주령 C57BL/6J-ob/ob (ob/ob) 마우스를 각 그룹당 6마리씩 1주간 12시간의 light-dark cycle로 순화시킨 후, siCmip #1 내지 siCmip #2를 jetPEG와 함께 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 2일 간격으로 2회 투여하고, 두번째 투여 후 3일 뒤에 희생시켜 간을 적출한뒤 다음의 실험들을 진행하였다.
1. CMIP 발현 억제에 의한 PPAR-gamma 및 CD36 발현 감소
적출된 마우스 간 조직을 대상으로 quantitative real-time PCR을 통하여 CMIP 발현이 감소했는지 여부를 확인한 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, siCmip 투여에 의하여 마우스 간 조직 내 CMIP의 mRNA 발현이 저하됨을 확인하였다. 또한 Ppar-gamma 및 CD36의 유전자 발현 역시 CMIP 발현 억제에 의하여 현저하게 감소함을 확인하였다.
2. CMIP 발현 억제에 의한 간 조직 내 지방 축적 감소
적출된 마우스의 간 조직을 대상으로 hematoxylin and Eosin staining을 실시하여 간 조직 내 축적된 지방을 관찰한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, siCmip가 투여된 마우스 그룹에서 간 조직 내 축적된 지방이 감소하는 것으로 관찰되었다.
3. CMIP 발현 억제에 의한 AST 및 TG 감소
마우스 혈액을 통하여 간독성 AST를 측정한 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, siRNA 투여로는 간독성이 관찰되지 않았으며, 오히려 siCmip가 투여된 경우 AST 수치의 감소로 비만 모델 마우스에서 보이는 간독성이 완화되는 것으로 관찰되었다.
마우스 혈액 내 중성지방 수치(TG)를 측정한 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, siCmip #1 및 siCmip #2가 투여된 그룹에서 대조군 대비 혈액 내 비만과 비알콜성 지방간증의 주요 병리지표인 TG 수치가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.
혈중 콜레스테롤 수치도 측정한 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 총콜레스테롤 수치는 siCmip가 투여된 두 그룹에서 현저하게 증가하였는데, 이는 LDL-콜레스테롤의 변화 없이 HDL-콜레스테롤이 증가한 결과가 반영된 것으로 보인다.
4. CMIP 발현 억제제 섭취에 따른 신체 독성 수치의 변화 여부 확인
도 7d에 나타낸 바와 같이, 1주일간 대조군 및 실험군 마우스들이 섭취한 식이의 양은 각 그룹간 차이를 보이지 않았으며, 신체 독성 지표인 ALP 및 ALT 역시 대조군 대비 차이를 나타내지 않아 CMIP 발현 억제제의 독성은 확인되지 않았다.
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<223> CMIP siRNA
<400> 8
uuuagguuag gaagcuuggu u 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMIP siRNA
<400> 9
ccuaaaggag guugauguuu u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMIP siRNA
<400> 10
aacaucaacc uccuuuaggu u 21
<210> 11
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMIP siRNA negative control
<400> 11
ccucgugccg uuccaucagg uaguu 25
<210> 12
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMIP siRNA negative control
<400> 12
cuaccugaug gaacggcacg agguu 25
Claims (7)
- CMIP (C-Maf Inducing Protein) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
상기 제제는 서열번호 1의 센스(sense) 서열 및 서열번호 2의 안티센스(antisense) 서열로 구성된 siRNA; 서열번호 3의 센스 서열 및 서열번호 4의 안티센스 서열로 구성된 siRNA; 서열번호 5의 센스 서열 및 서열번호 6의 안티센스 서열로 구성된 siRNA; 서열번호 7의 센스 서열 및 서열번호 8의 안티센스 서열로 구성된 siRNA; 및 서열번호 9의 센스 서열 및 서열번호 10의 안티센스 서열로 구성된 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 지방간 질환은 비알콜성 지방간 질환인, 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 비알콜성 지방간 질환은 비알콜성 단순 지방간, 영양성 지방간, 기아성 지방간, 비만성 지방간, 당뇨병성 지방간, 비알콜성 지방간염, 간섬유화 및 간경화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - (a) 지방간 질환 치료제 후보 물질을 CMIP 유전자가 발현되는 세포에 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 지방간 질환 치료제 후보 물질을 처리한 세포에서 CMIP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현량 또는 활성이 지방간 질환 치료제 후보 물질을 처리하지 않은 대조군 세포보다 감소하는 경우, 해당 지방간 질환 치료제 후보 물질을 지방간 질환 치료제로 판단하는 단계
를 포함하는 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법. - CMIP 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 지방간 질환 치료제의 스크리닝용 키트로,
상기 CMIP 유전자의 발현 수준은 CMIP 유전자의 발현 억제여부인 것인, 키트.
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2021
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
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| Gene. 2015. Vol.566, pp.74-83. |
| International Journal of Clinical & Experimental Pathology. 2018. Vol.11, No.10, pp.5008-5023.* |
Also Published As
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