KR102643609B1 - B-raf 키나아제 억제제의 말레에이트 염, 결정질 형태, 제조방법, 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온(화합물 1) 말레에이트 염, 특히 세스퀴-말레에이트(sesqui-maleate) 염, 및 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태, 및 제조방법, 약제학적 조성물, 및 BRAF 또는 다른 키나아제에 의해 매개되는 질병 또는 장애의 치료를 위한 치료학적 용도에 관한 것이다.

Description

B-RAF 키나아제 억제제의 말레에이트 염, 결정질 형태, 제조방법, 및 이의 용도
본 발명은 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 (이하, 화합물 1이라 한다), 특히 화합물 1의 세스퀴-말레에이트(sesqui-maleate), 및 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태(다형성 (polymorphs)), 및 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
B-RAF는 세포 증식과 생존을 위한 RAF-MEK-ERK MAPK 경로 수단의 부분인 키나아제(kinase)이다. B-RAF 돌연변이는 흑색종(melanoma) (43%)(H. Davies, et al., Nature, 417 (2002), 949-54; D.R. English, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17 (2008), 1774-80; G.V. Long, et al., Lancet Oncol., 13 (2012), 1087-95), 갑상선(thyroid) (27%) (Y. Cohen, J Natl Cancer Inst, 95 (2003), 625-7; E.T.Kimura, et al., Cancer Res, 63 (2003), 1454-7), 대장(colorectal) (14%) (H. Davies, et al., Nature, 417 (2002), 949-54; D.R. English, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17 (2008), 1774-80; S. Ogino, et al., Gut, 58 (2009), 90-6; C.P.Vaughn, Genes Chromosomes Cancer, 50 (2011), 307-12), 난소(ovarian) (15%) (H. Davies, et al., Nature, 417 (2002), 949-54; S.E.Russell, J Pathol, 203 (2004), 617-9), 및 폐(lung) (2%) (M.S.Brose, et al., Cancer Res, 62(2002), 6997-7000)암을 포함하는, 인간 암의 7% 이상에서 발견되었다. 흑색종에서 발견되는 B-RAF 돌연변이의 90% 이상은 B-RAF의 단백질 사슬(V600E)의 600th 아미노산에서 발린(valine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환되어, 구조적인 활성화를 일으킨다.
흑색종 환자에 대한 베무라페닙(vemurafenib)과 다브라페닙(dabrafenib)과 같은 B-RAF 억제제의 임상 실험은 유효한 것으로 증명되었고, B-RAF 및 MAPK 신호(signaling)에 의존하는 종양을 표적화(target)하는 개념을 입증하였다. 종양에 B-RAF V600E 돌연변이를 지닌 흑색종 환자에서의 선택적인 억제는 인상적인 객관적 반응 속도 및 무-진행 생존의 연장을 가져왔다. 그러나, 베무라페닙(vemurafenib)과 다브라페닙(dabrafenib)을 포함하는, B-RAF 억제제의 제 1세대는 예를 들어, 1) 변이되거나 활성화된 RAS와 관련하여 B-RAF/C-RAF 헤테로다이머(heterodimer)의 유도를 통한 MAPK 신호의 기이한 증가로 인한 각질극세포종(keratoacanthomas) 또는 피부 편평 세포암(cutaneous squamous cell carcinoma)의 발생; 및 2) B-RAF V600E 돌연변이 (예를 들어, 결장과 직장의)를 지닌 흑색종 외부의 제한된 임상적 활성과 같은, 많은 제한을 갖고 있다. 그러므로, 이러한 영역에서 개선될 수 있는 제 2세대 억제제가 매우 바람직하다.
5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 (유리 염기(free base), 화합물 1)은 세린(serine)/트레오닌(threonine) 키나아제의 RAF 패밀리(family)에 대한 강력한 억제 활성을 입증한, 제 2세대 B-RAF 억제제로서 개시되었다.
Figure 112017113587030-pct00001
[화합물 1]
화합물 1은 단일요법(monotherapy) 또는 다른 암 치료와 병행하여, B-RAF 돌연변이 및 K-RAS/N-RAS 돌연변이를 포함하는, RAF-MEK-ERK 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 경로에서의 변형을 가진 암의 치료를 위하여 분자적으로 표적화된 치료제이다. 그러나, 화합물 1의 유리 염기의 상대적으로 낮은 경구 흡수는 약물 제품 개발에 부적합하다.
화합물 1의 유리 염기는 일반적으로 도 1의 XRPD 결과에 기초하여 비정질(amorphous)의 고체로서 수득되고, 화합물 1의 유기 염기는 0.001 mg/mL에서의 LOQ를 갖는 물에서 실질적으로 불용성이며, 0 내지 80%의 RH에서 2.2%의 물 증가(water gain)를 갖는 약간의 흡습성인 것으로 밝혀졌다.
게다가, 화합물 1의 합성은 비효율적이었다. 예를 들어 광학적으로 순수한 이성질체(isomer)를 제조하기 위한 카이랄 HPLC 칼럼(chiral HPLC column) 및 공정으로부터 불순물의 배출을 방해하는 비정질 형태의 화합물 1의 유리 염기 경향과 같은, 다양한 요소들은 화합물 1의 대규모 제조 및 정제를 시도하도록 한다.
실제적으로, 특정 화합물의 염이 안정하고 약제학적 공정에 적합할 것이라고 확신을 갖고 예측하기는 어렵다. 특정 화합물이 다양한 결정질의 고체-상태 형태를 형성하는지 여부 및 이들 결정질의 고체-상태 형태의 물리적인 성질을 예측하는 것은 보다 더 어렵다.
그러므로, 좋은 품질과 재현 가능성을 갖는 화합물 1의 대규모 제조에 적합한 공정 뿐만 아니라 훨씬 우수한 생체이용률(bioavailability)을 가지며 이 약물의 제제 및 저장 동안에 화학적 및 물리적인 안정성을 갖는 화합물 1의 일부 형태가 매우 필요하다.
본 발명의 목적은 좋은 품질과 재현 가능성을 갖는 화합물 1의 대규모 제조에 적합한 공정 뿐만 아니라 훨씬 우수한 생체이용률(bioavailability)을 가지며 이 약물의 제제 및 저장 동안에 화학적 및 물리적인 안정성을 갖는 화합물 1의 일부 형태를 제공하는데에 있다
본 발명의 다른 목적은 화합물 1의 일부 형태에 대한 제조방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 화합물 1의 일부 형태에 대한 약제학적 용도를 제공하는데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온의 염으로서, 상기 염은 하이드로클로라이드 (hydrochloride), 메탄설포네이트(methanesulfonate), 2-하이드록시에테인설포네이트(2-hydroxyethanesulfonate), 말레에이트(maleate) 및 옥살레이트(oxalate)로 구성된 군에서 선택되는 염을 제공한다.
본 발명은 또한, 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온의 말레에이트 염이며, n은 약 0.3 내지 약 1.5의 수인 것을 특징으로 하는 화학식 (Ⅰ)의 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 (Ⅰ)의 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 말레에이트 염의 결정질 형태 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화합물의 치료 유효량과 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화합물 또는 상기 약제학적 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자의 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 결정질의 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 세스퀴-말레에이트 제조방법을 지공한다.
본 발명에 따르면, 화합물 1의 안정한 염 및 그의 결정질 형태는 키나아제의 RAF 패밀리(family)에 대한 강력한 억제 활성을 가지고 화학적으로 매우 안정하며 우수한 생체이용률을 가지므로, 대규모 약제학적 제조에 적합하여 BRAF 또는 다른 키나아제에 의해 매개되는 질병의 치료 및 예방에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
도 1은 비정질 형태에서 화합물 1의 X-선 회절 패턴(X-ray diffraction pattern)을 나타낸다.
도 2는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 X-선 회절 패턴을 나타낸다(아이소프로판올(isopropanol)/물로부터 결정화).
도 3은 화합물 1 하이드로클로라이드(hydrochloride) 염 (1:1)의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 4는 화합물 1 메테인설포네이트(methanesulfonate) 염 (1:1)의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 5는 화합물 1 2-하이드록시에테인설포네이트(2-hydroxyethanesulfonate) 염 (1:1)의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 6은 화합물 1 L-타르트레이트(L-tartrate) 염 (1:1)의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 7은 화합물 1 옥살레이트(oxalate) (1:1)의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 8은 화합물 1과 인산(phosphoric acid) (1:1), 톨루엔술폰산(toluenesulfonic acid) (1:1), 에테인다이술폰산(ethanedisulfonic acid) (1:1), 황산(sulfuric acid) (1:1), API 슬러리 대조군(slurry control) 및 API로부터 수득된 고체의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 9는 화합물 1과 L-젖산(L-lactic acid) (1:1), L-말레산(L-maleic acid) (1:1), 말론산(malonic acid) (1:1), 니코틴아마이드(nicotinamide) (1:1), 사카린(saccharin) (1:1), 숙신산(succinic acid) (1:1), API 슬러리 대조군(slurry control) 및 API로부터 수득된 고체의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 10은 화합물 1과 벤조산(benzoic acid) (1:1), 시트르산(citric acid) (1:1), 푸마르산(fumaric acid) (1:1), 겐티스산(gentisic acid) (1:1), 글리콜산(glycolic acid) (1:1), API 슬러리 대조군(slurry control) 및 API로부터 수득된 고체의 X-선 회절 패턴의 오버레이(overlay)를 나타난다.
도 11은 화합물 1과 니코틴산(nicotinic acid) (1:1), 니코틴산 슬러리 대조군(nicotinic acid slurry control), API 슬러리 대조군(slurry control) 및 API로부터 수득된 고체의 X-선 회절 패턴의 오버레이(overlay)를 나타난다.
도 12는 화합물 1과 아디프산(adipic acid) (1:1), 아디프산 슬러리 대조군(adipic acid slurry control), API 슬러리 대조군(slurry control) 및 API로부터 수득된 고체의 X-선 회절 패턴의 오버레이(overlay)를 나타난다.
도 13은 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정질 형태 A**의 절대 구조(absolute structure)를 나타낸다(아세톤으로부터 결정화에 의해 수득된 단일 결정).
도 14는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정질 형태 A**의 수소 결합을 도시한다.
도 15는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정질 형태 A**의 결정 패킹(Crystal Packing)을 나타낸다.
도 16은 MERCURY 소프트웨어를 사용하여 계산된 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정질 형태 A**의 이론적인 XRPD 패턴을 나타낸다.
도 17은 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 X-선 회절 패턴을 나타낸다(아이소프로판올/물로부터 결정화에 의해 수득된).
도 18은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 B의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 19는 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 C의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 20은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 D의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 21은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 F의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 22는 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 G의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 23은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 H의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 24는 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 I의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 25는 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 J의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 26은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 K의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 27은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 L의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 28은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 M의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 29는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 1H-NMR 스펙트럼(spectrum)을 나타낸다.
도 30은 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 l3C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 31은 DVS에 의한 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 흡습성(즉, 수분 흡착)을 나타낸다.
도 32는 화합물 1 말레에이트 염 (1:1)의 결정질 형태 N의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 33은 화합물 1 말레에이트 (1:1)의 결정질 형태 N의 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 34는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 35는 화합물 1 말레에이트 (1:1.2)의 결정질 형태 B의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 36은 화합물 1 말레에이트 (1:1.3)의 결정질 형태 C의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 37은 화합물 1 말레에이트 (1:1)의 결정질 형태 D의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 38은 화합물 1 말레에이트 (1:0.5)의 결정질 형태 F의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 39는 화합물 1 말레에이트 (1:0.5)의 결정질 형태 G의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 40은 화합물 1 말레에이트 (1:1)의 결정질 형태 H의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 41은 화합물 1 말레에이트 (1:0.5)의 결정질 형태 I의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 42는 화합물 1 말레에이트 (1:1)의 결정질 형태 J의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 43은 화합물 1 말레에이트 (1:1)의 결정질 형태 K의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 44는 화합물 1 말레에이트 (1:0.3)의 결정질 형태 L의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 45는 화합물 1 말레에이트 (1:1.3)의 결정질 형태 M의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명의 염 제조 과정에 있어서, 제약 업계에서 일반적으로 사용되는 많은 염-형성제를 연구하였다. 특히, 본 발명에서 연구된 염-형성제는 염산(hydrochloric acid), 황산(sulfuric acid), 인산(phosphoric acid), 메테인술폰산(methanesulfonic acid), 2-하이드록시에테인술폰산(2-hydroxyethanesulfonic acid), 벤젠술폰산(benzenesulfonic acid), 글리콜산(glycolic acid), l-젖산(l-lactic acid), 푸마르산(fumaric acid), l-타타르산(l-tartaric acid), 시트르산(citric acid), l-말레산(l-maleic acid), 숙신산(succinic acid), 히푸르산(hippuric acid), 말레산(maleic acid), 아디프산(adipic acid), 벤조산(benzoic acid), 겐티스산(gentisic acid), 말론산(malonic acid), 에테인다이술폰산(ethanedisulfonic acid), 톨루엔술폰산(toluenesulfonic acid), 옥살산(oxalic acid), 니코틴산(nicotinic acid), 니코틴아마이드(nicotinamide), 및 사카린(saccharin)으로 구성된 군에서 선택되는 25종의 산 또는 염-형성제를 포함한다.
그러나, 화합물 1과 단지 6개 염의 반응이 염의 형성을 나타냈다. 특히, 염산(도 3), 메테인술폰산(도 4), 2-하이드록시에테인술폰산(도 5), L-타타르산(도 6), 말레산(도 2, 도 17 등) 및 옥살산(도 7)을 포함하는 6개 산과 화합물 1의 염의 고체 형태는 유기 염기, API 조절(control) 및 고체 산 조절로부터 상이한 결정질 형태를 나타냈다. 본 발명의 상기 6개의 결정질 염과 대조적으로, 다른 염은 결정질화 되지 않았다.
본 발명에 따른 하나의 실시예에 있어서, 화합물 1은 대량으로 개시된 공정에 의해 제조되는, 세스퀴-말레에이트 염이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염은 결정질 형태이고(본 에서 결정질 형태 A*로 언급됨) 그것의 X-선 분말 회절 스펙트럼(X-ray powder diffraction spectra)은 전형적으로 하기의 피크(peak) 회절 각을 갖는다(도 2에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00002
화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*는 다소 안정한 결정질 형태이다. 미분화 후 약 1-10 미크론(micron)의 평균적인 입자 크기를 갖는 잘 분포된 미립자(fine particle)가 되기 때문에, 임상 용도를 위한 약물 제품으로 쉽게 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정 형태 A**가 제공된다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A**의 구조는 아세톤에서 서서히 냉각시킴으로써 성장된 단일 결정으로부터 수집된 회절 데이터 세트를 사용하여 결정되었다. 결정 데이터 및 구조 정제(refinement)는 표 2에 나열되어 있다.
Figure 112017113587030-pct00003
도 13에 나타난, 화합물 1 말레에이트의 단일 결정 구조는 유기 염기 분자의 이미다졸 질소 원자가 양성자화 된 세스퀴-말레에이트 염임을 확인한다. C1(S), C2(R) 및 C3(R)의 절대 구성은 0.1(5)의 절대 구조 파라미터에 의해 표시되는 높은 확률로 결정되었다. 수소 결합 상호작용은 도 14에 도시되어 있다. 구조는 bc 평면(plane)에서 2차원 구조를 보여준다. 화합물 1의 유리 염기 분자와 말레에이트 음이온은 b축(axis)을 따라서 분자간-상호작용(N3…N3 2.797Å) 및 수소 결합(N2-H2…O4 2.760Å)에 의해 결합되어 있다. 그리고 나서 테이프 구조(tape structure)는 2차원 구조를 형성하기 위하여 c축을 따라서 분자간 상호작용(N3…O7 3.008Å 및 N4…O7 2.715Å) 및 수소결합(N1-H1…O8 2.659Å)을 통하여 말레레이트 음이온에 결합되어 있다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염의 결정 패킹은 도 15에 도시되어 있다. MERCURY 소프트웨어를 사용하여 계산된 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정질 형태 A**의 이론적인 PXRD 패턴은 도 16에 도시되어 있다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정 형태 A가 제공된다. 도 17에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 A의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 17에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00004
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 B가 제공된다. 도 18에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 B의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 18에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00005
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 C가 제공된다. 도 19에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 C의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 19에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00006
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 D가 제공된다. 도 20에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 D의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 20에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00007
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 F가 제공된다. 도 21에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 F의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 21에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00008
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 G가 제공된다. 도 22에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 G의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 22에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00009
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 H가 제공된다. 도 23에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 H의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 23에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00010
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 I가 제공된다. 도 24에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 I의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 24에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00011
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 J가 제공된다. 도 25에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 J의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 25에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00012
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 K가 제공된다. 도 26에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 K의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 26에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00013
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 L이 제공된다. 도 27에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 L의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 27에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00014
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 M이 제공된다. 도 28에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 M의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 28에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00015
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화합물 1 말레에이트(1:1)의 결정질 형태 N이 제공된다. 도 33에 나타난 바와 같이, 결정질 형태 N의 X-선 분말 회절 스펙트럼은 전형적으로 하기의 피크 분절 각을 갖는다(도 33에서 “간격(spacing)”은 “d-value”로 표시된다):
Figure 112017113587030-pct00016
상기 기재된 결정질 형태 A*, A**, A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, M 및 N에 대하여, 주요 피크(즉, 가장 특징적인, 중요한, 고유한 및/또는 재생 가능한 피크)만 요약된다; 추가적인 피크는 종래의 방법에 의해 분절 스펙트럼으로부터 수득될 수 있다. 상기 기재된 주요 피크는 오차 범위(마지막 주어진 소수점 자리에서 + 또는 - 2, 또는 명시된 값에서 + 또는 - 0.2) 내에서 재현될 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 화학식 ( Ⅰ ) 또는 화학식 ( Ⅱ )의 화합물 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 하나의 실시예에서, 반응식 1에 서술된 과정에 따라 제조 또는 정제된 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*가 제공된다. 본 발명에 개시된 새로운 합성 방법 및 결정화/재결정화 공정은 99%를 초과하는 주요 카이랄 중간체(chiral intermediate)의 제조와 같은, 이전에 보고된 공정과 관련된 많은 문제점을 극복하고 기존 공정에 비해 많은 이점을 제공한다. 특히, 본 발명에 개시된 방법은 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염의 재현성 있는, 상업적인-규모의 제조에 고 품질 및 좋은 수율로 특히 적합하다.
반응식 1
Figure 112017113587030-pct00017
화합물 1 세스퀴-말레에이트 염의 결정질 형태는 하기의 일반적인 방법에 의해 제조될 수 있다: 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염의 결정질 형태 A*는 완전히 용해될 때까지 용매와 함께 가열된다. 여과, 냉각, 결정화, 여과 및 건조 후에, 상응하는 상이한 결정질 형태가 수득된다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염의 결정질 형태 A를 제조하기 위한 결정질 공정의 예는 실시예 3(하기)에 기재되어 있다. 상기에 기재된 결정화는 단일 용매, 유기 용매의 혼합물, 또는 물과 유기 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 결정화를 위한 적합한 유기 용매는 저급 알킬 알코올(lower alkyl alcohols), 케톤(ketones), 에터(ethers), 에스터(esters), 할로젠화 탄화수소(halogenated hydrocarbons), 알케인(alkanes), 할로젠화 벤젠(halogenated benzene), 지방족 나이트릴(aliphatic nitrile), 및 기타 방향족(aromatic) 용매로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 용매는 예를 들어, 아이소프로판올(isopropanol), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 물, N,N-다이메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 아세톤(acetone), 아세토나이트릴(acetonitrile) 및 이들의 혼합물을 포함한다.
화합물 1의 유리 염기는 본래 0 내지 80% RH에서 2.2%의 물 증가로 약간 흡습성인 비정질의 고체로 수득되었다. 동적 기상 수착(dynamic vapor sorption, DVS) 이후에 형태 변형은 관찰되지 않았다. 그것은 편광 현미경으로부터 불규칙한 모양으로 비-복굴절 현상을 나타냈다.
본 발명은 말레에이트 염, 특히 세스퀴-말레에이트 염이 놀랍게도 약물 후보의 원하는 성질을 갖는 것으로 밝혀진 화합물 1의 하이드로클로라이트, 메테인설포네이트, 2-하이드록시에테인설포네이트, L-타르트레이트, 말레에이트 및 옥살레이트 염을 개시한다. 예를 들어, 화합물 1은 결정질의 타르트레이트을 형성하지 않는 것으로 보이며, 옥살레이트 염은 낮은 결정성을 갖는다. 2-하이드록시에테인설포네이트, 메실레이트(mesylate), 및 염산(HCl)은 상대적으로 물에서 좋은 용해성을 나타냈으나, 염산 염은 60°C 및 40°C/75% RH에서 일주일 후에 현저한 분해(degradation)로 화학적으로 불안정하며, 2-하이드록시에테인설포네이트 및 메실레이트 염은 둘 다 0 내지 80% RH로부터 약 4%의 물 증가로 흡습성이다. 2-하이드록시에테인설포네이트 및 메실레이트 염은 또한 60°C 및 40°C/75% RH에서 일주일 후에 현저한 분해(degradation)를 나타냈으며, 따라서 원하는 장기간 화학적인 안정이 결여될 것으로 예상된다. 반면에, 본 발명에서 개시된 세스퀴-말레에이트 염(1:1.5 유리 염기/말레산)은 XRPD 패턴에 의해 입증된 바와 같이, 우수한 결정성을 가지며, 물에서 약간 용해되고, 60°C 및 40°C/75% RH에서 일주일 후에 분해를 나타내지 않아서, 장기간 안정성이 가능함을 보여준다; 따라서, 세스퀴-말레에이트 염이 추가적인 개발을 위해 선택되었다.
바람직하거나 필요하다면, 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염의 순도는 메탄올-슬러리(slurry) 공정을 통해서 세스퀴-말레에이트 염을 말레에이트 염(유리 염기/산의 1:1 비율)으로 전환시킴으로써 추가적으로 개선될 수 있다. 1:1 말레에이트 결정질 염의 형성은 불순물의 효과적인 배출을 초래하였다. 유리 염기의 무정형 형태는 1:1 말레에이트를 염기로 처리한 후에 용매를 추출하여 고순도로 제조될 수 있다. 보다 높은 순도를 갖는 세스퀴-말레에이트 결정질 염은 유리 염기를 말레산으로 처리함으로써 제조되었다(반응식 2).
반응식 2
Figure 112017113587030-pct00018
본 발명에서 용어 “저급 알킬 알코올”는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8, 바람직하게는 C1-C6, 보다 바람직하게는 C1-C4 알킬 알코올을 포함한다. 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 아이소프로판올, 및 부탄올을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 “약”은 다른 언급이 없는 한, 수(예를 들어, 온도, pH, 부피, 등)가 ± 10%, 바람직하게는 ± 5% 이내로 변할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 결정질 형태의 결정화는 또한 용매 시스템에서 과포화를 달성하기 위해 용매의증발, 냉각 및/또는 안티-용매(본 발명에 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 화합물 1 세스퀴-말레에이트를 덜 용해 시킬수 있는 용매)의 첨가에 의해 적어도 하나의 용매를 포함하는 적합한 용매 시스템에서 수행될 수 있다.
결정화는 본 발명에서 기재된 씨결정(seed crystals)을 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서 개별적인 결정질 형태는 결정화 공정의 특정 열역학 및 평형 특성에 의존하는 구체적인 조건 하에서 발생한다. 그러므로, 당업자는 형성된 결정이 결정화 공정의 운동(kinetic) 및 열역학적 특성의 결과임을 알 것이다. 특정 조건(예를 들어, 용매, 온도, 압력, 및 화합물의 농도) 하에서, 특정 결정질 형태는 또 다른 결정질 형태 보다 안정할 수 있다(또는 실제로 임의의 결정질 형태 보다 더 안정하다). 그러나, 특정 결정의 상대적으로 낮은 열역학적 안정성은 유리한 운동 안정성을 가질 수 있다. 시간, 불순물 분포, 교반(stirring), 및 씨결정의 존재 또는 부재, 등과 같은 운동 이외의 추가적인 요소가 결정질 형태에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 상기 기재된 결정질 형태 A*, A**, A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, M 및 N 특히 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*인 화합물 1 말레에이트의 유효량과 및 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 각각 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 활성 화합물은 조성물의 1-99% (중량으로), 바람직하게는 1-70% (중량으로), 또는 보다 바람직하게는 1-50% (중량으로), 또는 가장 바람직하게는, 5-40% (중량으로)일 수 있다.
약제학적 조성물은 정제(tablet), 캡슐(capsule), 알약(pill), 분말(powder), 소독 용액, 현탁액(suspension), 에멀전(emulsion)과 같은 형태의 서방형(sustained release) 주사 형태로 경구로; 페이스트(paste), 크림(cream), 또는 연고(ointment)와 같은 국소 치료 형태를 통하여; 또는 좌약과 같은 직장 투여 형태를 통하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 정확한 투약 용도에 적합한 단위 투약 형태일 수 있다. 게다가, 약제학적 조성물은 다른 활성 성분을 포함할 수 있다.
적합한 약제학적 담체는 물, 다양한 유기 용매 및 다양한 불활성 희석제 또는 충전제를 포함한다. 필요하다면, 약제학적 조성물은 향신료, 접착제(adhesive) 및 부형제(excipient)와 같은 다양한 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 투여의 경우, 정제 및 캡슐은 시트르산, 전분, 알긴산(alginic acids), 및 몇몇 규산염(silicate)와 같은 다양한 붕해제(disintegrating agent), 및 수크로오즈(sucrose), 젤라틴 및 아라비아검(Arabic gum)과 같은 다양한 접착제와 같은 다양한 부형제를 함유할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아르산염(stearate)과 탈크(talc) 충전제를 포함하는 윤활제가 일반적으로 정제의 제조에 사용된다. 동일한 유형의 고체 성분이 또한 연질 및 경질의 젤라틴 캡슐을 조제하는데 사용될 수 있다. 수성 현탁액이 경구 투여에 사용되는 경우, 활성 화합물은 다양한 감미료(sweetener) 또는 향미료(flavoring agents), 색소(pigment) 또는 염색제 조합물과 혼합 될 수 있다. 필요하다면, 다양한 유화제가 사용되거나 현탁액이 생성될 수 있다; 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세린(glycerin) 또는 그들의 조합물과 같은 희석제가 사용될 수 있다.
상기 기재된 약제학적 조성물은 바람직하게는 경구 투여된다.
상기 기재된 약제학적 조성물은 바람직하게는 캡슐 또는 정제 형태이다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, Braf 키나아제(kinase) 또는 EGFR, VEGFR, EPHA, EPHB, 등과 같은 다른 키나아제의 억제에 반응하는 암의 치료에 유용한 약제의 제조에서의 본 발명의 화합물(즉, 화합물 1 말레에이트 및 임의의 상기 기재된 결정질 형태 A*, A**, A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, M 및 N)의 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 하나의 실시예에 있어서, 포유류 췌장염(pancreatitis), 신장 질환, 암, 혈관신생(angiogenesis), 또는 혈관신생과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 유용한 약제의 제조에서의 본 발명의 화합물(즉, 화합물 1 말레에이트 및 임의의 상기 기재된 결정질 형태 A*, A**, A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, M 및 N)의 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 화합물 1 말레에이트 및 임의의 결정질 형태 A*, A**, A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, M 및 N 또는 화합물 1 말레에이트 (1:1) 결정질 형태 N은 종양 혈관신생(tumor angiogenesis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 만성적인 염증성 질환, 건선(psoriasis) 및 피부경화증(scleroderma)과 같은 피부병, 당뇨병 유발성 피부 질환, 당뇨 망막변증(diabetic retinopathy), 조기 망막변증(premature retinopathy), 노화 관련 변성 반점(age-related degeneration stains), 혈관종(hemangioma), 신경교종(glioma), 카포시 내부 종양(Kaposi internal tumor), 난소암, 유방암, 폐암, 췌장암, 림프종(lymphoma), 전립선(prostate), 대장(colon) 및 피부 종양, 및 그들의 합병증으로부터 선택되는, 하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 질병의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
상기 기재된 치료 방법에 대한 타겟 질병은 바람직하게는 B-RAF 또는 NRAS 또는 K-RAS 돌연변이 비-소세포 폐암, 대장암, 자궁내막암(endometrial cancer), 신장암, 골암, 간암, 방광암, 흉부암(chest cancer), 목암, 식도암, 위암, 결장암, 직장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 피부암, 부신암, 자궁 경부암, 림프종, 또는 갑상선 종양, 및 그들의 합병증과 같은 B-RAF, NRAS 및 K-RAS 돌연변이 종양으로부터 선택된다.
상기 기재된 방법은 임의의 화학적 치료(예를 들어, MEK 억제제), 생물학적 치료, 또는 방사선 치료와 조합하여 적용될 수 있다.
투여된 활성 성분 또는 화합물의 복용량은 치료할 환자의 개별적인 요구, 투여 경로, 질병 또는 질환의 중증도, 복용 스케줄 뿐만 아니라 지정된 의사의 평가 및 판단에 의해 결정될 것이다. 그러나, 활성 화합물에 기초하여, 유효 복용량의 바람직한 범위는 체중 1kg 당 약 0.01-120 mg; 또는 보다 바람직하게는 일회 또는 개별적인 투여에서 체중의 kg 당 0.1-10 mg 일 수 있다. 경우에 따라, 상기 기재된 복용량 범위의 하한을 적용하는 것이 보다 적합하고, 다른 경우에서는 보다 높은 복용량이 유해한 부작용을 일으키지 않고 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에 있어서, 임상 실험을 위해 화합물 1 세스퀴-말레에이트가 제공된다. 특히, 본 발명은 암 환자에 대한 하기의 치료 옵션을 갖는 화합물 1 말레에이트의 임상 치료에 관한 것이다: 화합물 1 말레에이트 및/또는 결정질 형태 A*, A**, A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, M 및 N의 복용량은 하루에 1-3회 투여 빈도로 1-100 mg/일 일 수 있다; 바람직한 복용량은 하루에 1-3회 투여 빈도로 5-50 mg/일 이며; 보다 바람직한 복용량은 하루에 1회 투여 빈도로 10-50 mg/일 이다.
하기의 합성 방법, 특정 실시예, 및 효능 시험은 본 발명의 몇몇 실시예에서 추가로 기재되어 있다. 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하거나 제한하지 않는다.
하기의 실시예는 예시적인 것으로 의도되며 사용된 수(예를 들어, 양, 온도, 등)에 관한 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였으나, 일부 실험적인 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 온도는 섭씨 온도이다. 다른 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich, Alfa Aesar, 또는 TCI와 같은 시중에서 구입한 시약은 추가적인 정제 없이 사용하였다.
다른 언급이 없는 한, 하기의 진술된 반응은 무수 용매 중에서 질소 또는 아르곤의 양압(positive pressure) 하에서 또는 건조 튜브(tube)를 사용하여 수행하였다; 반응 플라스크(flask)는 주사기를 통해 기질 및 시약의 도입을 위해 고무 셉타(septa)가 장착되어 있다; 및 유리제품은 오븐 건조 및/또는 가열 건조 되었다.
다른 언급이 없는 한, 칼럼 크로마토그래피(column chromatography) 정제는 실리카 겔 칼럼을 갖는 Biotage system (Manufacturer: Dyax Corporation) 또는 실리카 SepPak 카트리지 (Waters) 상에서 수행되거나, 가포장된(prepacked) 실리카 겔 카트리지를 사용하는 Teledyne Isco Combiflash 정제 시스템에서 수행되었다.
1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 용매로서 DMSO-d6을 사용하여 400 MHz에서 작동하는 Varian 기구 상에서 기록되었다.
무색 판상 결정으로부터의 X-선 강도 데이터는 aBruker APEX-II CCD 회절계(diffractometer) (Cu Kα radiation, λ= 1.54178 Å)를 사용하여 173(2) K에서 측정되었다. 편광 광학 현미경 사진은 실온에서 촬영되었다.
하기의 실시예에서, 다음과 같은 약어가 사용될 수 있다:
AcOH 아세트산(Acetic acid)
ACN 아세토나이트릴(Acetonitrile)
API 활성 약제학적 성분(Active pharmaceutical ingredient), 본 발명에서는 종종 화합물 1로 언급됨
Aq 수용액의
Brine 포화 염화 나트륨 수용액(Saturated aqueous sodium chloride solution)
Bn 벤질(Benzy)l
BnBr 벤질 브로마이드(Benzyl Bromide)
CH2Cl2 다이클로로메테인(Dichloromethane)
DMF N,N-다이에틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide)
Dppf 1,1"-bis(diphenylphosphino)ferrocene
DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene
DIEA or DIPEA N,N-다이아이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine)
DMAP 4-N,N-다이메틸아미노피리딘(4-N,N-dimethylaminopyridine)
DMF N,N-다이에틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide)
DMSO 다이메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide)
EtOAc 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)
EtOH 에탄올(Ethanol)
Et2O or ether 다이에틸 에터(Diethyl ether)
g 그람(grams)
h or hr 시간(hour)
HATU O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HCl 염산(Hydrochloric acid)
HPLC 고속 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography)
IPA 2-프로판올(2-propanol)
i-PrOH 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)
Mg 밀리그람(milligrams)
mL 밀리리터(milliliters)
mmol 밀리몰(millimole)
MeCN 아세토나이트릴(Acetonitrile)
MeOH 메탄올(Methanol)
min 분(minutes)
ms or MS 질량 스펙트럼(Mass spectrum)
Na2SO4 황산 나트륨(Sodium sulfate)
PE 석유 에테르(petroleum ether)
PPA 폴리인산(Polyphosphoric acid)
Rt 정체 시간(Retention time)
Rt or rt 실온(Room temperature)
TBAF 테트라-부틸 암모늄 플로라이드(Tetra-butyl ammonium fluoride)
TBSCl 테트라-부틸다이메틸실릴 클로라이드(tert-Butyldimethylsilyl chloride)
TFA 트리플루오르아세트산(Trifluoroacetic acid)
THF 테트라하아드로퓨란(tetrahydrofuran)
TLC 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)
TMSCl 트리메틸실릴 클로라이드(Trimethylsilyl chloride)
μL 마이크로리터(microliters)
다양한 염-형성제를 이용한 화합물 1의 염의 형성
실시예1A:화합물 1의 유기 염기 및 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 제조
단계 1:중간체 1의 합성
Figure 112017113587030-pct00019
[중간체 1]
DMF (989 kg)에 EtONa (154 kg)가 교반된 용액에 질소 보호 하에서 내부 온도 35℃ 이하에서 EtSH (68.6 kg)을 첨가하였다. 혼합물을 내부 온도 35℃ 이하에서 60~90분 동안 교반하였다. DMF (55.0 kg)에 5-메톡시벤조퓨란(5-Methoxybenzofuran) (58.75 kg)을 첨가하였다. 혼합물을 110-130℃까지 가열하고, 45시간 동안 교반한 후에, 90℃ 이하의 진공상태에서 농축시켰다. 혼합물을 10~20℃까지 냉각한 후에, 2N HCl (1326 kg)을 드롭방식(dropwise)으로 첨가한 후에, 내부 온도 35℃ 이하에서 EtOAc (531 kg) 및 H2O2 (129 kg)를 첨가하였다. 혼합물을 30~60분 동안 교반하였다. 유기층을 분리한 후에, 수층(aqueous phase)을 EtOAc와 추출하였다. 합쳐진 유기층을 포화 염수로 2회 세척한 후에, 용매를 건조하여 증발시켰다. MeOH 및 물 (185 kg) 중 NaOH (44.5 kg)의 용액을 40℃ 이하의 잔여물에 드롭방식(dropwise)으로 첨가하였다. 혼합물을 30~40℃에서 4-6시간 동안 교반하고 여과하였다; 그리고 필터케이크(filter cake)를 MeOH와 물로 세척하였다. DCM을 여과액에 채우고 40℃ 이하의 35% HCl 수용액으로 pH를 1로 조정하였다. 수층을 DCM으로 추출하고, 유기층을 25% NaCl로 세척하고 40℃ 이하에서 농축시켰다. 잔여물은 다음 단계에서 직접 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.14 (s, 1H), 7.86 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.79 (dd, J = 2.0, 0.9 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) ppm. MS: M/e 135 (M+1)+.
단계 2:중간체 2의 합성
Figure 112017113587030-pct00020
[중간체 2]
DMF (989 kg)에 벤조퓨란-5-올(benzofuran-5-ol) (중간체 1, 33.1 kg) 및 Et3N (50.8 kg)이 교반된 용액에 -5 내지 0℃에서 DMF (50 kg) 중 TMSCl (30.4 kg)의 용액을 드롭방식으로 첨가하였다. 혼합물은 0~10℃까지 데우고, 2시간 동안 이 온도에서 교반하였다(IPC check INT-1/INT-2 = 37.4%). 혼합물을 -5 내지 0℃로 냉각시키고, DMF (8 kg) 중 TMSCl (10.6 kg)의 용액을 드롭방식으로 첨가한 후에, 혼합물을 0~10℃까지 데우고, 1시간 동안 이 온도에서 교반하였다. 혼합물은 40℃ 이하에서 농축하고, 혼합물에 n-헵테인(n-heptane)을 첨가하였다. 혼합물을 20-30분 동안 교반하고, 여과하고, 케이크를 n-헵테인으로 세척하였다. 여과액으로부터 용매를 증류하여 제거하고 미가공의 중간체 2(INT-2%: 62.7%, KF: 0.01%)를 수득하였다. DMF (149 kg)에 상기 미가공의 중간체 2 및 Et3N (8.6 kg)이 교반된 용액에 -5 내지 0℃에서 DMF (10 kg) 중 TMSCl (9.0 kg)의 용액을 드롭방식으로 첨가하였다. 혼합물은 0~10℃까지 데우고, 1시간 동안 이 온도에서 교반하였다(TLC는 반응이 완료되었음을 나타낸다). 반응 혼합물을 40℃ 이하에서 농축하고, 혼합물에 n-헵테인을 첨가하였다. 혼합물을 20-30분 동안 교반한 후에 여과하고, 케이크를 n-헵테인으로 세척하였다. 여과액으로부터 용매를 증류하여 제거하고 중간체 2 (41.5 kg, INT-2%: 98.1%)를 무색의 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.56 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 0.00 (s, 9H) ppm.
단계 3:중간체 3의 합성
Figure 112017113587030-pct00021
[중간체 3]
Copper (I) triflate (톨루엔(toluene)과 2:1 복합체(complex), 0.41 kg) 및 (S, S)-Evans Ligand (0.552 kg)을 DCM (160 kg)에 1-2시간 동안 상온에서 N2 대기 하에서 교반하였다. 중간체 2 (37.0 kg)을 첨가하고, 20~30℃에서 DCM (450 kg)에 에틸 다이조에타노에이트(ethyl diazoethanoate) (58 kg)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 20~30℃에 0.5~1시간 동안 교반하였다(IPC: INT-2/INT-3≤0.2%, 잔여물 N2CHCO2Et: 0.05%≤1.0%). 반응 혼합물에 EDTA disodium (0.05 mol/L, 150 kg) 용액을 20~30℃에서 40~50분 동안 3회 첨가하였다. 유기층을 20~30℃에서 25% NaCl 수용액으로 2회 세척하고 30℃ 이하에서 농축하였다. 잔여물을 감압 증류하고 미가공의 중간체 3 (36.26 kg, 84.5%)을 120~144℃에서 수집하였다. 미가공의 화합물은 다음 단계에서 제거될 수 있는 엔도-거울상 이성질체를 포함한다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.79 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 5.4, 1.0 Hz, 1H), 3.08 (dd, J = 5.4, 3.2 Hz, 1H), 1.02 (dd, J = 3.1, 1.2 Hz, 1H), 0.00 (s, 9H) ppm.
단계 4 및 5:중간체 5 및 중간체 6의 합성
Figure 112017113587030-pct00022
Figure 112017113587030-pct00023
[중간체 5] [중간체 6]
MeOH (108 kg) 중 중간체 4 (36.3 kg)의 용액에 20~30℃에서 HCl/MeOH(5M, 0.11 kg) 용액을 첨가하고, 혼합물을 2-3시간 동안 교반하였다(IPC: L/M: 0.5%, 카이랄 순도 90.0%). Et3N (0.22 kg)을 20~30℃에서 드롭방식으로 첨가하였다. 혼합물을 농축하고 잔여물을 n-헵테인/EtOAc (4:1)로 희석한 후에 농축하였다. 온도를 10~20℃로 조정하고 10~20℃에서 2~4시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 젖은 생성물을 얻기 위해 여과하였다(중간체 5: 94.0%, 카이랄 순도: 90.5%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.05 (s, 1H), 6.89 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 5.11 (dd, J = 5.4, 1.0 Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 5.4, 3.0 Hz, 1H), 1.19 - 1.17 (m, 1H) ppm. 미가공의 생성물은 n-헵테인/EtOAc (20:1)로 3회 슬러리화(slurried) 하여 밝은 황색(light yellow) 고체를 얻고, 이를 40~50℃에서 12~16시간 동안 건조하여 16.55 kg의 생성물을 얻었다(중간체 6 98.6%; 카이랄 순도: 99.3%).
단계 6 및 7:중간체 7 및 중간체 8의 합성
Figure 112017113587030-pct00024
Figure 112017113587030-pct00025
[중간체 7] [중간체 8]
DMF (66kg) 중 중간체 6 (14 kg) 및 5-플루오르-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 (SM2, 11.2kg)의 용액에 40~60℃에서 Cs2CO3 (26kg)을 첨가하고, 혼합물을 110~120℃까지 데우고, 3시간 동안 110~120℃에서 교반하였다. 반응물 pH는 25~35℃에서 아세트산 (12.0 kg)으로 6으로 조정하였다. 물 (520 kg)을 첨가하고 혼합물을 1~2시간 동안 교반하였다. 여과 후에, 젖은 생성물을 얻기 위해 EA (78kg)로 고체를 슬러리화 하였다(순도: (중간체 7 + 중간체 8) %: 98%). 젖은 생성물을 THF (240kg)에 교반시킨 용액에 수산화 나트륨 수용액 (125kg, 2M)을 첨가하고 20~30℃에서 2~3시간 동안 교반하였다(IPC: INT-7/INT-8: 0.9%). 혼합물을 20~30℃에서 4N HCl (37kg)로 pH 4~5로 조정한 후에 0.5~1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 50℃ 이하에서 농축하고 고체를 용액으로부터 침전하였다. 여과 후에, 젖은 생성물을 THF 안에서 1~2시간 동안 35~45℃에서 재-슬러리화 한 후에, 여과하였다. 생성된 젖은 생성물을 45~65℃에서 40분 동안 건조하여 표제 화합물 중간체 8(18.95kg: 화학적인 순도 99%, 카이랄 순도 100%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.59 (s, 1H), 10.43 (s, 1H), 7.92 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 5.21 (dd, J = 5.4, 1.0 Hz, 1H), 3.27 - 3.25 (m, 1H), 2.89 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 1.19 (dd, J = 3.0, 1.0 Hz, 1H) ppm. MS: M/e 339 (M+1)+.
단계 8:중간체 9의 합성
Figure 112017113587030-pct00026
[중간체 9]
DMF (167kg) 중 중간체 8 (13.3kg), DIPEA (16kg) 및 HATU (18.1kg)의 용액을 0~15℃에서 DMF (74 kg) 중 4-(트리플루오르메틸)벤젠-1,2-다이아민 (SM3, 7.6 kg)의 혼합물에 드롭방식으로 첨가하였다. 혼합물을 20~25℃에서 4~6 시간 동안 교반하였다 (IPC: INT-9/INT-9: 검출되지 않음). DMF(7.5 kg) 중 활성 탄소(5.3kg)을 반응 혼합물에 첨가하고, 40~45℃에서 2~4시간 동안 교반한후에, 여과하였다. 물 (846 kg)을 15~30℃에서 여과액으로 드롭방식으로 첨가하고, 1~2시간 동안 교반한 경우에 고체가 침전되었다. 침전물을 20~30℃에서 2~4시간 동안 EtOH로 슬러리화 하였다. 여과 후에, 젖은 생성물을 45~60℃에서 37시간 동안 건조하여 표제 화합물 중간체 9 (17.60 kg: 95.5%)를 수득하였다
단계 9:화합물 1의 유기 염기의 합성
Figure 112017113587030-pct00027
[화합물 1의 유기 염기]
AcOH(360 kg)에 중간체 9 (17 kg) 및 물 (1.5 kg)의 용액을 65~70℃에서 20시간 동안 교반하였다(IPC: R/S≤≤1.0%). 혼합물을 55℃ 이하에서 건조하여 농축하고, MeOH(32 kg)로 활성 탄소 (17 kg)를 잔여물에 첨가하였다. 혼합물을 약 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 여과 후에, 여과는 45℃ 이하에서 용매를 제거하기 위하여 농축하였다. EA(160kg) 및 물(330 kg)를 잔여물에 첨가하고, 20~30℃에서 pH 8-9까지 NaOH 수용액을(2mol/L) 첨가하였다. 유기층을 분리하고, EA로 수층을 추출하였다. 합쳐진 유기층을 물로 2회 세척하고 유리 염기 형태의 화합물 1을 수득하기 위해 건조하여 농축하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.84 (s, 1H), 10.47 (s, 1H), 7.98 (d, J 5.8 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.69 (m, 1H), 7.48 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 (dd, J = 5.4, 1.2 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 5.3, 3.3 Hz, 1H), 2.95 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.97 (d, J = 1.3 Hz, 1H) ppm.
단계 10:화합물 1 세스퀴-말레에이트의 합성
Figure 112017113587030-pct00028
[화합물 1 세스퀴-말레에이트]
단계 9의 잔여물에 IPA (83 kg)를 첨가하였다. 물 (29 kg) 중 말레산 (5 kg)을 혼합물에 첨가하고 약 50℃에서 4시간 동안 교반한 후에, 35℃까지 냉각하고 그 온도에서 12시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고 40~60℃에서 건조시키고, D90=4.1μm, D10=1.5μm, D50=2.4μm 의 입자 크기를 갖는 백색 분말(화합물 1 세스퀴-말레에이트 염, 8.36 kg)을 얻기 위해 초미분쇄기(micronizer)에서 미분화하였다. 분말 X-선 회절 패턴 방법이 결정질 형태 A*의 구조를 특성화하기 위해 사용되었다, 도 2 참조. 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*에 대한 1H NMR 스펙트럼을 도 29에 나타냈다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*에 대한 13C-NMR 스펙트럼을 도 30에 나타냈다.
용해도 실험은 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 수용해도(0.020 mg/mL)가 화합물 1의 유리 염기의 수용해도(<LOQ at 0.001 mg/mL) 보다 훨씬 우수하다는 것을 나타냈다.
화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*는 도 31에 도시된 바와 같이 95% RH에 노출되어도 단지 0.1801%의 수분 흡수로 비-흡습성인 것으로 밝혀졌다.
실시예1B:다른 염-형성제와 화합물 1의 염의 제조
화합물 1의 유리 염기 약 160 mg을 각각 2 mL의 IPA를 갖는 40 mL 유리 바이알(vial)에 용해하였다. 분자 비율에 따라서 표 16에 나열된 IPA에 적합한 염-형성제의 용액(슬레이트(slat)-형성제는 IPA에 미리 용해되었고, 용해될 수 없는 염 형성제의 경우에는 현탁액을 가열하여 용해하였다)은 자성을 띤(magnetic) 교반기 상에서 각각 유리 염기 용액으로 천천히 적정한 후에, 24시간 동안 상온에서 교반하여 고체를 침전시켰다. 고체가 수득되지 않는다면, 안티-용매(예를 들어, 헵테인)을 용액에 천천히 첨가하여 침전물을 얻었다. 원심 분리 된 고체를 새로운 결정질 형태가 수득되었는지를 결정하기 위하여 XRPD로 결정한 후에, 추가적인 특성화를 위해 밤새 40℃에서 진공상태로 건조시켰다. IPA에 현탁된 API 및 순수 고체 산을 API 대조군 및 염/공(co)-결정 형성 및 API 또는 고체 염-형성제의 다형성을 구분하기 위한 순수한 고체 염-형성제 대조군으로 사용하였다.
말레산과의 결정질 염 형성 이외에도 유기 염기, API 대조군 및 고체 산 대조군으로부터 상이한 결정 형태를 나타내는, 염산(도 3), 메탄술폰산(도 4), 2-하이드록시에테인술폰산(도 5), L-타타르산(도 6, 진정한 타르트레이트 염은 형성되지 않을 수 있고 타르트레이트로 화학적인 이동이 검출되지 않을 수 있기 때문에 단지 유리 염기의 다형성임), 및 옥살산(도 7)을 포함하는 다섯 개의 산으로부터 결정질 형태의 고체 또한 발견되었다. 형성된 결정질 염 중에서, 2-하이드록시에테인설포네이트 및 말레에이트는 다른 네 개의 산(염산, 메탄술폰산, L-타타르산, 옥살산) 보다 우수한 결정성을 갖는다.
다른 염-형성제로부터 수득된 고체는 모두 무정형 형태(도 8, 도 9, 도 10) 또는 순수한 고체 염-형성제와 동일한 형태(도 11 및 도 12)이며, 유리 형태 또는 비정질의 염 또는 유리 형태를 갖는 염-형성제의 혼합물이 수득됨을 제시하였다.
Figure 112017113587030-pct00029
화합물 1 세스퀴-말레에이트의 단일 결정질 형태 A**의 제조
단일 결정 성장 스크리닝은 용매, 온도, 및 재결정화 방법을 변화시킴으로써 94개의 상이한 조건 하에서 수행되었으며, 이로부터 구조 결정에 적합한 단일 결정이 아세톤 내에서 천천히 냉각됨으로써 수득되었다.
화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 제조
화합물 1의 유기 염기 (145 g)은 1750 mL 의 i-PrOH/H2O (V:V = 4:1) 중 말레산 63.5 g과 혼합하였다. 혼합물은 모든 고체가 용해될 때까지 환류하였다. 맑은 용액을 실온으로 냉각하고, 일부 씨결정을 첨가한 후에, 24시간 동안 방치하였다. 백색 고체가 침전되고 여과되었다. 여과 케이크를 약 500 mL의 i-PrOH/H2O (V:V = 4:1)로 세척하고 48시간 동안 50℃에서 높은 진공 하에서 건조하여 표제 생성물 (112 g)을 결정질 결정으로서 수득하였다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 A의 구조를 특성화하기 위해 사용되었다; 도 17 참조. TGA 결과는 120℃까지 0.3 wt%의 중량 손실을 나타냈다. DSC 결과는 194.2℃에서(개시(onset) 온도) 용융된 흡열(melting endotherm)을 나타냈다. 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 1/1.5의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 34 참조).
실시예 1A는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태(즉, 형태 A*로 지정됨)의 대량 생산에 관한 것이고 실시예 3은 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태(즉, 형태 A로 지정됨)의 실험적인 제조에 관한 것이다. 분말 X-선 회절 패턴, 1H-NMR 스펙트럼 및 다른 기술은 결정질 형태 A* 및 결정질 형태 A의 두 결정질 형태 사이의 일관성을 나타낸다.
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 B의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 B가 결정화를 위해 0.1 ℃/min의 속도로 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 1,4-다이옥세인(1,4-dioxane) 용액을 60℃에서 5℃까지 냉각시켜서 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 20.0 mg을 3 mL 유리 바이알에 넣고, 바이알에 1,4-다이옥세인 1 mL를 첨가한다; 혼합물을 800 RPM의 속도로 50℃에서 자기적으로(magnetically) 저어준다; 0.45 μm의 나일론 막(Nylon membrane)을 사용하여 2시간 동안 60℃에서 평형을 유지한 후에 시료를 여과한다; 및 여과액을 60℃에서 5℃까지 0.1 ℃/min의 속도로 냉각한다. 시료는 분리하기 전에 5℃에서 저장된다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 B의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 18 참조. TGA 결과는 150℃까지 15.1 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 1,4-다이옥세인 용매화합물/수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 다중 중첩된 흡열을 나타냈다(181.4 및 189.6℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 1/1.2의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 35 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 C의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 C는 결정화를 위해 0.1 ℃/min의 속도로 화합물 1의 에탄올 용액을 60℃에서 5℃까지 냉각시켜서 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 21.3 mg을 3 mL 유리 바이알에 넣고, 바이알에 에탄올 1 mL를 첨가한다; 혼합물을 800 RPM의 속도로 50℃에서 자기적으로(magnetically) 저어준다; 0.45 μm의 나일론 막(Nylon membrane)을 사용하여 2시간 동안 60℃에서 평형을 유지한 후에 시료를 여과한다; 및 여과액을 60℃에서 5℃까지 0.1 ℃/min의 속도로 냉각한다. 시료는 분리하기 전에 5℃에서 저장된다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 C의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 19 참조. TGA 결과는 180℃까지 7.0 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 4개의 흡열을 나타냈다(107.5, 162.7, 179.3 및 196.0℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 1/1.3의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 36 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 D의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 D는 RT에서 [dmin]CF3COO 이온성 액체의 존재 하에 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 MeOH 용액의 느린 증발을 통해 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 150.2 mg을 20 mL 유리 바이알에 넣고, 바이알에 MeOH 10.2 mL를 첨가한다; 0.45 μm의 나일론 막(Nylon membrane)을 사용하여 포화된 스토크(stoke) 용액을 얻기 위해 혼합물을 여과한다; 1 mL MeOH 스토크 용액에 [dmin]CF3COO 이온성 액체 2.8 mg를 첨가한다; 및 RT에서 침전을 유도하기 위해 저어준다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 D의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 20 참조. TGA 결과는 120℃까지 6.3 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 2개의 흡열을 나타냈다(75.8 및 161.4 ℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/1의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 37 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 F의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 F는 ACN/물 (1:1, v/v) 용액으로부터 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 결정화를 통해서 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 18.9 mg을 3 mL 유리 바이알에 넣고, ACN/물 (1:1, v/v)의 1.5 mL를 첨가한다; 및 고분자(polymer) 화합물(polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylchloride (PVC), polyvinyl acetate (PVAC), hypromellose (HPMC), 및 methyl cellulose (MC)를 1:1:1:1:1:1의 질량비로)의 약 2 mg을 현탁액에 첨가하고 RT에서 침전을 유도하기 위해 저어준다.
분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 F의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 21 참조. TGA 결과는 130℃까지 3.2 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 ACN 용매화합물/수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 3개의 흡열을 나타냈다(62.4, 156.9 및 169.3℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/0.5의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 38 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 G의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 G는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 아세트산 용액에 물을 첨가하여 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 20.2 mg을 20 mL 유리 바이알에 넣는다; 바이알에 아세트산 1.0 mL를 첨가하고 RT에서 맑은 용액을 얻기 위해 저어준다; 및 침전을 유도하기 위해 단계적으로 용액에 물 5 mL를 첨가한다.
분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 G의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 22 참조. TGA 결과는 120℃까지 11.0 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 4개의 흡열을 나타냈다(84.3, 126.9, 139.4 및 187.3 ℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/0.5의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 39 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 H의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 H는 RT에서 THF에 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A를 슬러리화 하여 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 17.7 mg을 1.5 mL 바이알에 넣고, 현탁액을 얻기 위해 바이알에 THF 0.3 mL을 첨가한다; 및 혼합물을 RT에서 800 RPM의 속도로 3일 동안 자기적으로(magnetically) 저어준다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 H의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 23 참조. TGA 결과는 150℃까지 13.0 wt%의 두 단계의 중량 손실을 나타냈다(결정 THF 용매화합물/수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 2개의 흡열을 나타냈다(124.5 및 178.0℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/1의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 40 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 I의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 I는 RT에서 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A의 IPA/물 (3:1, v/v) 용액을 실온에서 서서히 증발하여 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 13.8 mg을 1.5 mL 바이알에 넣고, 맑은 용액을 수득하기 위해 바이알에 IPA/물 (3:1, v/v) 1.5 mL을 첨가한다; 및 RT에서 침전을 유도하기 위해 용액으로부터 용매를 증발시킨다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 I의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 24 참조. TGA 결과는 180℃까지 20.7 wt%의 두 단계의 중량 손실을 나타냈다(결정 IPA 용매화합물/수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 4개의 중첩된 흡열을 나타냈다(85.8, 115.1 및 138.2 ℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/0.5의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 41 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 J의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 J는 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 A와 말레산 증기 사이의 상호작용을 통해서 제조되었다. 과정: 형태 A 고체의 14.2 mg을 3 mL 바이알에 넣고, 아세트산 2 mL를 포함하는 유리 바이알 20 mL에 3 mL 바이알을 넣고 밀봉한다; 및 RT에서 8일 동안 시스템을 유지하여, 증기가 고체와 상호작용하도록 한다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 J의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 25 참조. TGA 결과는 130℃까지 19.3 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 아세트산 용매화합물/수화물의 분자 포함). DSC 결과는 분해 전에 3개의 흡열을 나타냈다(102.9, 155.7 및 187.7℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/1의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 42 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 K의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 K는 2주 동안 상온에서 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 D를 저장한 후에 수득하였다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 K의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 26 참조. TGA 결과는 150℃까지 4.2 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 수화물의 분자 포함). DSC 결과는 186.6℃(피크 온도)에서 녹기 전에 2개의 흡열을 나타냈다(59.6 및 186.6℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/1의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 43 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 L의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 L은 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 G를 140℃까지 가열하고 RT까지 냉각하여 수득하였다. X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 L의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 27 참조. TGA 결과는 120℃까지 3.9 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 수화물의 분자 포함). DSC 결과는 183.9℃(피크 온도)에서 녹기 전에 1개의 흡열을 나타냈다(141.1℃, 개시 온도). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/0.3의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 44 참조).
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 M의 제조
화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 M은 2주 동안 상온에서 화합물 1 말레에이트의 결정질 형태 J를 저장한 후에 수득하였다. 분말 X-선 회절 패턴 방법은 결정질 형태 L의 구조를 특성화하기 위해 사용된다; 도 28 참조. TGA 결과는 140℃까지 1.4 wt%의 중량 손실을 나타냈다(결정 아세트산 수화물/수화물의 분자 포함). DSC 결과는 다중의 흡열을 나타냈다(123.0, 156.5, 171.9, 176.1 및 195.3℃). 1H-NMR 스펙트럼은 유리 염기/말레산의 약 1/1.3의 화학량적인(stoichiometrical) 비율을 나타냈다(도 45 참조).
화합물 1 말레에이트 및 세스퀴-말레에이트의 형성을 위한 조건의 스크리닝
Figure 112017113587030-pct00030
조건 1:화합물 1은 EtOAc 중 말레산과 반응하였다.
EtOAc (5 mL)에 화합물 1 (47.8 mg)이 교반된 용액에 상온에서 EtOAc (0.2 mol/L, v mL) 중 말레산 용액을 첨가하였다. 혼합물을 30분동안 교반하였다. 고체를 표제 염을 얻기 위해 높은 진공 하에서 여과되고 건조하였다. 놀랍게도, 0.5, 0.9, 1.8, 또는 3.0 eq.의 말레산을 사용하는 경우에, 결정질의 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (1:1.5) 염을 모든 조건 하에서 수득하였다.
조건 2:화합물 1은 EtOH 중 말레산과 반응하였다.
과정: 화합물 1과 EtOH 중 말레산의 혼합물을 모든 고체가 용해될 때까지 20분 동안 환류하였다. 용액을 상온까지 냉각하고 3시간 동안 방치하였다. 백색 고체가 침전 되고, 여과하고 높은 진공 하에서 건조하여 표제 화합물을 얻었다. 놀랍게도 1당량의 말레산을 사용하는 경우에, 결정질의 화합물 1 말레에이트 (1:1) 염이 수득됨을 발견하였다; 그러나 말레산의 양이 1.3, 1.5, 또는 3.5 eq.까지 증가하는 경우에, 모든 조건에서 생성물로서 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (1:1.5) 염을 얻었다.
조건 3:화합물 1은 MeOH 중 말레산과 반응하였다.
과정: 화합물 1과 MeOH 중 말레산의 혼합물을 모든 고체가 용해될 때까지 20분 동안 환류하였다. 용액을 상온까지 냉각하고 3시간 동안 방치하였다. 백색 고체가 침전 되고, 여과하고 높은 진공 하에서 건조하여 화합물 1 말레에이트 (1:1) 염을 얻었다. 놀랍게도 용매로서 MeOH를 사용하면, 1.3, 1.5, 또는 3.5 eq.의 말레산이 사용되는 경우에, 생성물은 일관되게 분발 화합물 1 말레에이트 (1:1) 염이었다.
조건 4:화합물 1은 i-PrOH/물 중 말레산과 반응하였다.
과정: 혼합된 용액 (부피 비는 i-PrOH:H2O = 4:1, 1.7L) 중 화합물 1 (145 g, 0.3 mol)과 말레산 (63 g, 0.54mol)의 혼합물을 모든 고체가 용해될 때까지 20분 동안 환류하였다. 혼합물을 상온까지 냉각하고, 일부 씨결정을 용액에 첨가하였고, 혼합물을 24시간 동안 방치하였다. 백색 결정이 침전되고 여과하였다. 필터 케이크는 혼합된 용액 500 mL로 세척하고 50℃에서 48시간 동안 높은 진공 하에서 건조하여 결정질 바늘(needle)로서 화합물 1 세스퀴-말레에이트 염 (112 g, 56.7%)을 얻었다. 흥미롭게도, 40 vol% i-PrOH를 용매로서 사용하는 경우에, 결정질의 화합물 1 헤미(hemi)-말레에이트 (1:0.5) 염을 수득하였다; 반면에 60 vol% i-PrOH, 90 vol% i-PrOH, 또는 100 vol% i-PrOH을 용매로서 사용하는 경우에, 모든 조건에서 결정질의 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (1:1.5) 염을 얻었다.
조건 5:화합물 1은 다른 용매 중 말레산과 반응하였다.
상기 기재된 유사한 과정에 따라서, 다른 용매(THF, Acetone, DME, 1,4-다이옥세인)를 사용하는 경우에, 수득된 생성물은 일관되게 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (1:1.5) 염이었다.
조건 6:화합물 1 세스퀴-말레에이트 염(1:1.5)의 말레에이트 염(1:1)으로의 전환.
Figure 112017113587030-pct00031
화합물 1 세스퀴-말레에이트 염 (1.0 g, 1.53 mmol)의 결정을 MeOH (20 mL)에서 현탁하고, 혼합물을 실온에서 하루 동안 교반하였다. 백색 고체를 여과하였다. 필터 케이크는 MeOH (10 mL)로 세척하고, 50℃에서 16시간 동안 적외선 램프 하에서 건조하여 화합물 1 말레에이트 염(1:1) (820 mg, 90%)을 백색 결정질 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, dmso) δ 10.50 (s, 1H), 7.97 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.31 - 6.24 (m, 3H), 5.43 (dd, J = 5.2, 1.2 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 5.2, 3.2 Hz, 1H), 2.94 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.97 (dd, J = 3.2, 1.2 Hz, 1H) (상세한 스펙트럼은 도 32 참조).
분말 X-선 회절 패턴 분석은 조건 6 하에서 형성된 백색 결정질의 고체 구조를 결정하고 화합물 1 말레에이트 (1:1) 결정질 형태 N으로 명명하였다(도 33).
조건 7:화합물 1 말레에이트 염(1:1)의 세스퀴-말레에이트 염으로의 전환.
Figure 112017113587030-pct00032
i-PrOH/H2O(4:1, v/v, 50 mL)의 혼합물 중 화합물 1 말레에이트 염 (1:1) (4.3 g)과 말레산 (0.67 g, 말레산 0.8 eq)의 혼합물을 1시간 동안 환류하였다. 소량의 고체가 남아있었다. 또 다른 5 mL 혼합 용매를 첨가하고 형성된 혼합물을 30분 동안 환류하였고, 모든 고체를 용해시켰다. 환합물은 상온까지 냉각한 후에 16시간 동안 방치하였다. 백색 결정이 침전되고 여과하엿다. 필터 케이크는 20 mL의 혼합 용액으로 세척하고, 24시간 동안 적외선 램프 하에서 건조하여 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (3.2 g, 68%) 염을 결정질의 바늘(needle)로서 얻었다.
화합물 1 API 불순물의 배출: 제1 결정화된 28.5 Kg의 세스퀴-말레에이트(화학적인 순도=98.82%)를 메탄올과 45-50℃에서 4-5시간 동안 교반하였다. 그리고나서 슬러리 혼합물을 3-4시간 동안 20-30℃에서 냉각하고, 여과하여 젖은 케이크(30.3 Kg; 화학적인 순도= 99.76%)를 얻었다. 젖은 케이크는 에틸 아세테이트 및 물과 혼합되고, 탄산 나트륨 수용액으로 pH = 7-8로 처리된 후에 물로 세척하였다. 에틸 아세테이트 중 화합물 1의 유리 염기(16.2 Kg; 화학적인 순도= 99.81%)를 수득하였다. 에틸 아세테이트는 증류를 통해 i-propanol로 대체하였다. i-PrOH 중의 유리 염기는 말레산 수용액 및 세스퀴-말레에이트의 씨결정과 교반하였다. 혼합물을 40-50℃에서 몇시간 동안 및 20-30℃에서 몇시간 동안 교반하였다. 형성된 고체는 여과하여 제2 결정화된 세스퀴-말레에이트 염 (19.6 Kg; 화학적인 순도 = 99.82%; 광학적인 순도 = 100%)을 얻었다.
화합물 1의 염 또는 결정질 형태의 안정성 실험
실시예 17A:단기간 안정성 실험
단기간 안정성 실험은 염산 염, 메실레이트 염, 2-하이드록시에테인설포네이트 염 및 말레에이트 염을 평가하기 위해 수행하였다.
상기 염 각각의 약 2 mg(XRPD의 경우: 10 mg)을 40 mL 유리 바이알에서 각각 측량하였다. 유리 염기 형태는 대조군으로 사용하였다. 닫힌 시료를 파라필름(parafilm)으로 덮고 밀봉하고, 열린 시료는 핀홀(pinhole)이 있는 알루미늄 호일로 덮었다. 모든 시료는 해당 조건(60°C 및 40°C/75% RH)에서 1주일 동안 안정성 챔버 또는 건조 오븐에 보관하였다.
염산 염은 일주일 후에 두 조건에서 밝은 황색인 것처럼 보이고, 2-하이드록시에테인설포네이트 메실레이트 및 말레에이트의 외관은 육안 관찰로는 변화가 없었다. XRPD 결과는 결정 형태 변환이 모든 염 시료에서 검출되지 않았음을 나타낸다.
화학적인 안정성 결과는 표 17에 요약하였다. TRS의 증가와 함께 다양한 분해가 검출되었다 (HCl 염 > 2-하이드록시에테인설포네이트 > 메실레이트 > 말레에이트 > 유리 염기). 대조적으로, 화합물 1의 염 형성에 대한 온도 스트레스 조건은 60℃에서 염 시료의 투과 라만 분광법(transmission Raman spectroscopy)이 보다 증가하기 때문에, 습도 스트레스 조건 보다 큰 영향이 있다.
Figure 112017113587030-pct00033
실시예 17B:장기간 안정성 실험
화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*의 장기간 안정성 실험은 25°C/60%RH에서 18개월(Assay w/w: T0 = 99.1% 및 T18 = 98.8%) 및 40℃ / 75%RH 조건에서 6개월(Assay w/w: T0 = 99.1% 및 T6 = 98.9%)까지 보관된 경우에 현저한 화학적인 순도의 변화가 발생하지 않음을 나타냈다. 결과는 심지어 화합물 1 세스퀴-밀레에이트 결정질 형태 A*는 25℃/75% RH에서 24개월 안정성 실험 후에 98.5%의 순도를 여전히 유지하고 있음을 나타냈다. 게다가, 25℃/60% RH에서 18개월 및 40℃/75%RH 조건에서 6개월까지 보관된 경우에 결정 형태 및 광학적인 순도의 변화가 관찰되지 않았다.
효능 시험(Efficacy Tests)
시험 1: 화합물 1 세스퀴-말레에이트에 의한 키나아제의 억제 및 선택성(결정질 형태 A* 시험)
방법:
Raf 키나이제 효소 분석법(Raf kinase enzymatic assays)
homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF) 방법론(methodology) (Cisbio Bioassays)에 기초하여 키나아제 활성 분석에서 Life Technologies의 재조합 B-Raf (V600E) (PV3849), C-Raf (Y340D/Y341D) (PV3805) 및 야생형 Braf (PV3848)에 대한 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*를 시험하였다. 분석은 RAF 키나아제, KM 농도의 ATP, GST-tagged MEK1 (K97R) 및 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A* 또는 25 mM Tris pH 7.4, 10 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 0.5 mM Na3VO4, 5 mM beta-glycerophosphate, 0.01% Triton X-100, 2.5 mM DTT 및 0.1% BSA를 함유하는 완충액(buffer) 중 DMSO를 함유하는 반응 혼합물에서 수행하였다. 키나아제는 1시간 동안 상온에서 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*와 배양하고, 반응은 ATP 및 GST-MEK1(K97R 돌연변이를 갖는 전장(Full-length) 단백질, 박테리아 발현 시스템으로부터 정제된 재조합 단백질) 첨가에 의해 시작하였다. 1시간 동안 상온에서 반응 후에, 정지/검출 용액을 제조업체(Cisbio Bioassays)의 지시에 따라 첨가하였다. 정지/검출 용액은 25 mM Tris pH7.4, 400 mM KF, 50 mM EDTA, 0.1% BSA 및 0.01% Triton X-100을 함유하는 완충액에 Eu3+ cryptate-conjugated anti-phospho MEK1/2 (Ser217/221) 토끼 다중클론 항체 및 d2-conjugated anti-GST 쥐 단일클론 항체를 포함한다. TR-FRET 신호(337 nm 파장에서의 자극을 갖는 620 ㎚에서의 방출에 대한 665 ㎚에서의 형광 방출의 비율)는 1.5시간 배양 후에 PHERAstar FS 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 측정하였다. MEK1의 인산화는 GST-MEK1 단백질에 대한 anti-phospho-MEK1/2 항체의 결합을 유도하여, anti-GST 항체의 수용체 d2에 근접하게 형광성 공여체 (Eu3+ crypate)를 배치하여, 공여체 형광단(fluorophore) (620㎚)에서 수용체 형광단(665㎚)으로의 높은 정도의 형광 공명 에너지의 전달을 일으킨다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*에 대한 IC50은 Graphpad Prism software에 의해 복용량-반응 % 억제 데이터를 4개의 파라미터 로지스틱 모델에 맞추어 파생되었다.
EGFR, EPHA2, PDGFR-beta, TXK, FLT3, VEGFR2, RET, BTK, ITK, TEC 및 SRC에 대한 키나아제 분석
화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*를 재조합 EGFR / EPHA2 / BTK (Carna Biosciences), ITK / TEC / SRC / PDGFR- 베타 / TXK / FLT3 / VEGFR2 / RET (Life Technologies) 및 HER2 (aa676-1255, 곤충 발현 시스템으로부터 정제된 재조합 단백질)에 대하여 제조업체의 지시에 따라 Cisbio Bioassays로부터 HTRF KinEASE-TK 분석법으로 시험하였다. 분석은 키나아제, KM 농도의 ATP, 바이오티닐화된(biotinylated) 펩타이드 기질 (61TK0BLC, Cisbio Bioassys) 및 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*를 함유하는 반응 혼합물에서 수행하였다. 키나아제는 1시간 또는 2시간 동안 상온에서 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*와 배양하고 (EGFR의 경우), 반응은 ATP 및 기질의 첨가에 의해 시작하였다. 반응 후에, 정지/검출 용액을 제조업체의 지시에 따라 첨가하였다. 정지/검출 용액은 25 mM Tris pH7.4, 400 mM KF, 50 mM EDTA, 0.01% BSA, 0.01% Triton X-100을 함유하는 완충액에 Eu+ cryptate conjugated antiphosphotyrosine 항체(61T66kLB, CisBio Bioassys) 및 Streptavidin-XL665 (610SAXLB , CisBio Bioassys)를 포함한다. TR-FRET 신호(337 nm 파장에서의 자극을 갖는 620 ㎚에서의 방출에 대한 665 ㎚에서의 형광 방출의 비율)는 1시간 배양 후에 PHERAstar FS 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 기록하였다. 바이오티닐화된 펩타이드 기질의 인산화는 바이오티닐화된 펩타이드에 대한 Eu+ cryptate conjugated antiphosphotyrosine 항체 및 streptaviding-XL665의 결합을 유도한다. 공여체 (Eu3+ crypate) 및수용체 (XL665)의 근접성은 공여체 형광단 (620㎚)에서 수용체 형광단 (665㎚)으로의 높은 정도의 형광 공명 에너지의 전달을 일으킨다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트 결정질 형태 A*에 대한 IC50은 Graphpad Prism software에 의해 복용량-반응 % 억제 데이터를 4개의 파라미터 로지스틱 모델에 맞추어 파생되었다.
결과:
화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*)는 V600E 돌연변이 B-RAF, 야생형 B-RAF, 및 C-RAF 효소의 강력하고 가역적인 억제제이다. 또한, 지금까지 시험된 하기의 키나아제 중에서, 화합물 1 세스퀴-말레에이트는 EGFR, EPHA2, PDGFR-beta, FLT3, VEGFR2 및 RET를 강력하게 억제하고, HER2, SRC 및 TXK에 대한 약한 억제를 가지며 BTK, ITK 및 TEC에 대해서는 억제하지 못한다. , 화합물 1 세스퀴-말레에이트가 억제하는 키나아제 중 많은 것들이 항암 치료에 대한 잠재적인 타겟으로 확인되었으므로 종양의 넓은 범위에 대한 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 적용가능성 뿐만 아니라, 잠재적인 효능도 증가되었다.
Figure 112017113587030-pct00034
시험 2:화합물 1 세스퀴-말레에이트에 의한 인간 종양 세포주의 생체 외(In Vitro) 성장 억제(결정질 형태 A* 시험)
방법:
A375, Sk-Mel-28, HT29, Colo205, A431, 및 HCC827 세포주는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 세포 분석에 사용된 모든 세포주를 10% 소 태아 혈청 (FBS, Thermo Scientific), 100 units/mL 페니실린 (Gibco), 0.1 mg/mL 스트렙토마이신 (Gibco) 및 5% CO2를 갖는 가습된 37℃ 환경 내에서 보충된 지정된 배치에서 배양하였다. 세포주는 구입한 본래의 세포로부터 3회의 계대 (passage) 이내에 놓인 프로즌 스톡(frozen stocks)으로부터 복원되고 30회 이상 계대되지 않았다.
세포의 phospho-ERK 및 phospho-EGFR는 TR-FRET-기반 방법을 사용하여 측정하였다. 세포는 96-웰 플레이트의 웰 마다 3×104로 시딩(seed)하고, 16시간 동안 부착하였다. 그리고나서 성장 배지는 혈청을 함유하지 않은 배지 100 μL로 교체하였다. 이어서 세포를 10-point 적정의 화합물로 처리하였다. 화합물 처리 1시간 후에, 50 μL의 용해 완충액 (Cisbio)을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실혼헤서 30분 동안 진탕 배양하였다. 96-웰 플레이트 각각의 웰로부터 세포 용해물의 전체 16 μL를 384-웰의 소형 부피의 백색 플레이트로 이동하였다. 각각의 웰로부터 용해물을 실온에서 2시간 동안 anti-ERK 또는 anti-EGFR 항체 (Cisbio)로 라벨된 Eu3+- 또는 Tb3+- cryptate (공여체)의 2 μL 및 anti-phospho-ERK 또는 anti-phospho-EGFR 항체 (Cisbio)로 라벨된 D2 (수용채)의 2 μL와 함께 배양하였다. FRET 신호는 PHERAstar FS 리더기(BMG Labtech)를 사용하여 측정하였다. ERK 또는 EGFR 인산화에 대한 IC50 값은 GraphPad Prism software를 사용하여 결정하였다.
흑색종, 결장암, 유방암 및 폐암 세포의 패널(panel)에서 화합물의 성장 억제 활성은 ellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega)를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트의 웰 마다 시딩된 세포의 수는 3일 치료 기간 동안 로그 성장을 보장하기 위해 세포주 각각에 대해 최적화되었다. 세포를 16시간 동안 부착시킨 후 10-point 희석 시리즈로 2회 처리하였다. 화합물을 3일 노출 후에, 각각의 웰에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동일한 양의 CellTiter-Glo 시약을 첨가하였다. 혼합물을 세포 용해를 위해 2분 동안 오비탈 진탕기(orbital shaker)에 놓고, 발광 신호의 발생 및 안정화가 가능하도록 실온에서 10분 동안 배양하였다. 발광 신호는 PHERAstar FS 리더기 (BMG Labtech)를 사용하여 측정되었다. 세포 생존력에 대한 EC50 값은 GraphPad Prism software로 결정하였다.
결과:
세포 분석은 화합물 1 세스퀴-말레에이트가 많은 RAFs의 다운스트림(downstream)의 직접 신호전달 중간체를 억제하는 것을 확인하였다. 예를 들어, 화합물 1 세스퀴-말레에이트는 흑색종 A375 및 Sk-Mel-28이 유발한 B-RAF V600E 돌연변이에서 32 및 77㎚의 IC50을 갖는 ERK 인산화를 억제한다. 이는 또한 HT29 및 Colo205 대장암 세포가 유발한 B-RAF V600E 돌연변이에서 13 및 53㎚의 IC50을 갖는 ERK 인산화를 억제한다. 추가적으로 화합물 1 세스퀴-말레에이트는 EGFR 과발현 A431 및 EGFR 돌연변이 HCC827 폐암 세포주에서 385 및 161㎚의 IC50을 갖는 EGFR 인산화를 억제한다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트는 암 세포주 패널에서 항-증식 활성을 평가받았다. 그것은 B-RAF 돌연변이가 있는 많은 세포주에 대하여 항증식활성을 나타냈다(표 19).
Figure 112017113587030-pct00035
시험 3:화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 종양 이식 방법의 생체 내(In Vivo) 약리학
인간 암세포를 BALB/C 누드 마우스의 우측 겨드랑이 영역에 피하 접종하여 종양 이종이식편(xenografts)을 발생시켰다. 이식 당일 세포 배양 배지를 새로운 배지로 교체 하였다. 3시간 후에, 배지를 제거하고 세포를 수집하고 접종하기 전에 차가운 (4℃) PBS에 재-현탁하였다. 각 마우스 오른쪽 겨드랑이 지역은 세포 접종 전에 70% 에탄올로 닦았다. 각 동물에게 26-게이지 바늘을 통해 오른쪽 전면 측면에 원하는 세포가 있는 200 ㎕의 세포 현탁액을 피하 주사했다. 이식 후 종양 부피를 캘리퍼스(calliper)를 사용하여 2차원에서 매주 2회 측정하였다. 종양 부피는 다음 공식을 사용하여 계산하였다: V = 0.5 × (a × b2) 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다.
생체 내 유효성 실험 위해, 평균 종양 크기가 100~200 mm3에 도달했을 때, 계층화된 무작위 과정을 사용하여 그룹당 6-10 마리의 마우스를 갖는 원하는 그룹 수로 동물을 할당하였다. 상기 그룹은 대조군 (약물 치료 없음) 및 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*를 상이한 투여량 수준으로 처리한 그룹(1 내지 20 mg/kg 범위)으로 구성되었다. 모든 투여량은 유리-염기 무게를 기초로 한다. 약물은 매일 1회 (qd) 또는 2회 (bid) 경구 위관영양법(gavage)으로 투여했다; 투약 빈도는 종양 성장에 대한 개별적인 경우에 의존한다. 치료는 10 ml/kg 체중의 양으로 경구 위관 영양법(p.o.)으로 투여하였다. 투여 전에 체중을 평가하였고 투여량을 적절히 조절하였다. 개별 체중 및 종양 부피를 매주 2회 측정하였고, 실험 기간 동안 독성의 임상 징후가 있는지 매일 모니터링 하였다. 마우스의 종양 체적이 2000 mm3 이상에 도달하거나, 종양이 궤양을 입거나, 체중 감량이 20 %를 초과하면 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사했다. 모든 그룹 데이터는 t 검사(test)를 사용하여 분석하였다. p 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
종양 성장 억제(TGI)는 하기의 식을 사용하여 계산하였다:
treated t = 시간 t에서 치료된 종양의 부피
treated t0 = 시간 0에서 치료 된 종양의 부피
placebo t = 시간 t에서 위약(placebo) 종양 부피
placebo t0 = 시간 0에서 위약(placebo) 종양 부피
PD 실험에 있어서, 평균 종양 크기가 140-900 mm3에 도달한 경우에, 계층화된 무작위 과정을 사용하여 그룹당 4 마리의 마우스를 갖는 원하는 그룹 수로 동물을 할당하였다. 상기 그룹은 대조군 (약물 치료 없음) 및 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*를 상이한 투여량 수준으로 처리한 그룹(1 내지 20 mg/kg 범위)으로 구성되었다. 모든 투여량은 유리-염기 무게를 기초로 한다. 약물은 매일 1회 (qd) 또는 2회 (bid) 경구 위관영양법(gavage)으로 투여했다. 모든 치료는 10 ml/kg 체중의 양으로 경구 위관 영양법(p.o.)으로 투여하였다. 투여 전에 체중을 평가하였고 투여량을 적절히 조절하였다. 마우스는 투약 후에 원하는 시점에서 이산화탄소를 사용하여 안락사했다. 종양 조직을 안락사 직후 절개하고 액체 질소를 사용하여 MP 비드로 미리 채운 관에 급속 동결시키고 -80℃에서 p-ERK 분석 전에 저장하였다. 500 마이크로 리터의 완전한 용해 완충액을 MP 비드로 동결 된 종양에 첨가하였다. 종양 조직의 균질화를 MP 균질화 장치에서 수행하고 용해액을 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 회전시켜 불용성 물질을 제거하였다. AlphaScreen® SureFire® p-ERK1/2 분석법 (PerkinElmer)으로 인산화된 ERK1/2 수준을 측정하기 위해 단백질 용해물의 2개의 마이크로그램을 사용하였다.
결과:
화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*)는 B-RAF V600E에 대한 강력한 키나아제 저해 활성, 세포-기초한 분석에서의 항증식 활성 및 이종이식편 모델에서의 항종양 활성을 갖는다. 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*)는 인간 A375 흑색종 (B-RAF V600E 돌연변이), LOX 흑색종 (B-RAF V600E 돌연변이), Colo205 결장 암종 (B-RAF V600E 돌연변이), HT29 결장 암종(B-RAF V600E 돌연변이), HCC827 폐암 (EGFR 돌연변이) 및 누드 마우스의 A431 표피 암종 (EGFR 과발현) 이종이식편에 대하여 항종양 활성을 나타냈다. 게다가, 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*는 도세탁셀(docetaxel) 또는 MEK 억제제인 selumetinib (AZD6244)와 결합하여 인간 Calu-6 폐 선암종 (K-RAS 돌연변이) 종양에서 현저한 항종양 활성을 보였다.
화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 경구 투여는 마우스에서 A375 이종이식 편에서 ERK1/2 인산화의 시간-의존적 및 투여량-의존적 억제를 초래하였다. 종양 조직에서 p-ERK 수준의 억제는 화합물 1의 혈장 및 종양 약물 농도와 매우 관련된다. 또한, 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*) 및 MEK 억제제 AZD6244는 Calu-6 K-RAS 돌연변이 비-소세포 폐 선암종 이종이식편 모델에서 p-ERK를 억제하는 강한 상승 효과를 입증하였다.
시험 5:화합물 1 세스퀴-말레에이트(결정질 형태 A*)의 독성
쥐(rat) 및 개에서 28일 동안 GLP 실험 및 여러 연구논문적인 실험을 포함하는, 종합적인 비임상적 독성 실험 프로그램을, 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*)의 전임상적인 안전성의 평가를 위해 수행하였다. 이 실험들은 항암제의 전임상적인 개발에 대한 사용가능한 규제 지침을 고려하였다. 이러한 연구에서, 화합물 1 세스퀴-말레에이트는 유리한 독성 및 안전성 약리학적 특성을 입증하였다. 안전성 약리학적 시험 결과는 화합물 1 세스퀴-말레에이트 (결정질 형태 A*)가 호흡, 혈압 및 순환 기능에 영향을 미치지 않으며, 자율 신경계 활동 또는 중추 신경계에 영향이 없음을 나타냈다. 추가적인 독성 시험 결과는 기형 유발성, 돌연변이 유발성 및 생식 독성을 나타내지 않았다.
시험 6:화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 약물동력학
완전히-유효한 LC-MS/MS 방법은 단일 및 다중 투여 후 Sprague-Dawley 쥐 및 beagle 개에서 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 약물동력학적인 (PK) 실험에 잘 사용되었다.
화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*는 쥐 (51% 내지 102%) 및 개 (41% 내지 82%) 모두에서 높은 구강 생체이용률을 갖는다. 그것의 제거 반감기는 구강 투여 후 쥐에서 4.4에서 9.4시간, 그리고 개에서 3.3에서 4.9시간의 범위였다.
운동학(kinetic)은 쥐에서 0.5 내지 15 mg/kg 및 개에서 1.5 내지 15 mg/kg의 투여량 범위에 걸쳐 선형이었다. 여러 번의 투여 후에, 쥐에서 약간의 축적 (~ 2-배)이 관찰되었다. 이 약간의 축적은 개에서 여러 번의 투여 후에 나타났다.
시험 7:화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 ADME
화합물 1은 다양한 조직에 널리 분포되어 있으나, 뇌 조직에서 낮아, 약물이 혈액-뇌 장벽을 쉽게 가로지르지 못함을 나타낸다. CYP2C8 (IC50 = 1.03 ㎛) 및 CYP2C19 (IC50 = 1.96 ㎛)에 대한 약한 억제를 제외하고는, 쥐 간에서 P450 효소에 대한 유도 효과는 발견되지 않았고, 약물 대사 효소에 대한 억제 활성은 화합물 1 세스퀴-말레에이트에 관하여 발견되지 않았다. CYP3A는 화합물 1 대사를 담당하는 주요 CYP 아이소폼(isoform)이며 CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 및 CYP2D6는 화합물 1의 대사에 더 작은 규모로 기여했다.
시험 8:화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*와 유리 염기의 약물동력학적인 비교
약물 및 시약 : 미분화 후에 D90 = 4.1㎛, D10 = 1.5㎛, D50 = 2.4㎛의 입자 크기를 갖는 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*. 물질 함유량(순도)은 98.0 % 이상이었다.
실험 동물: 비글 개, 수컷 및 암컷.
약제학적 제제: 각 물질의 적절한 양의 무게를 재고 0.5% 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스(화합물 1의 유리 염기) 또는 0.5% 메틸 셀룰로오스 용액(화합물 1 세스퀴-말레에이트)에 분산시킨다. 화합물 1의 원하는 농도에서 현탁액을 준비한다. 본 발명에 있어서 화합물 1의 모든 투여 량 및 농도를 유리 염기로 계산하였다.
투여 및 시료 수집: 용량 투여 전에 투여 용액을 신선하게 준비할 것이다. 실제 체중 및 실제 주입 용량은 이에 따라 기록될 것이다. 개를 밤새 금식시키고 투약 4시간 후에 음식을 섭취하도록 허용했다. 각 현탁액을 0.5 내지 15 mg/kg 범위의 투여량으로 개에게 경구 투여하였다. 혈액 샘플 (~1.0 mL)은 투여-전과 투여 후 최대 36시간 까지 머리의 정맥 혈관총(cephalic vein plexus)을 통해 수집된다. 원심 분리로 전체 혈액을 처리하고 혈장 샘플을 수집하여 분석 전에 냉동 보관한다. 혈장 샘플은 단백질 침전 처리하였다. 혈장 샘플 중의 화합물 1의 농도를 유효한 액체 크로마토 그래피-탠덤(tandem) 질량 분광분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 결졍하였다. 혈장 농도-시간 데이터는 Pharsight WinNonlin을 사용하여 비-구획형 모델을 사용하여 분석하였다.
Figure 112017113587030-pct00037
상기 실험은 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*의 Cmax (ng/mL) 및 AUC0-inf (ng·h/mL)는 유리 염기 형태 보다 약 2-3배 만큼 높다는 것을 나타냈다. 그러므로, 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*는 화합물 1의 유기 염기(무정형 형태) 보다 상당히 우수한 상대적인 생체이용률을 갖는다.
시험 9:임상 시험
캡슐을 제조하기 위하여 화합물 1 세스퀴-말레에이트의 결정질 형태 A*를 사용하여, 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mg의 단일 복용량이 투여된 25명의 피험자에 대해 1상 임상 안전 실험을 완료 하였다. 그 결과, 5-50 mg의 단일 복용량이 안전하고 잘 견디는 것으로 나타났다. 화합물 1 치료는 BRAF V600E 흑색종 환자에서 부분적인 반응, BRAF V600E PTC 환자에서 부분적인 반응 및 BRAF V600E CRC 환자에서 일부 항-종양 활성을 일으켰다. 또한 16 KRAS 암 환자를 모집하고 치료했으며, 3명의 PR 및 최소한의 12명 환자가 2.2개월 이상 생존했다(KRAS 암 환자 치료에 대한 평균 PFS는 Oncotarget, 5, 19, 2014 참조). 이러한 예비적인 데이터는 화합물 1 세스퀴-말레에이트(결정질 형태 A*)가 Braf- 및 K-ras 돌연변이 암의 치료에 효과적이라는 것을 입증했다.
전술한 실시예 및 특정 실시예의 설명은 청구범위에 의해 한정된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아니라, 예시라는 것은 명백하다. 용이하게 이해 될 수 있는 바와 같이, 전술한 특징들의 수많은 변형 및 조합이 청구범위에 기재된 바와 같이 본 발명을 벗어나지 않고 이용될 수 있다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도한다. 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고 문헌으로 여기에 포함된다.
선행 문헌이 본 명세서에서 언급되는 경우, 그러한 참고 문헌은 임의의 국가의 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
다음의 청구범위 및 본 발명의 상세한 설명에서, 명시적인 언어 또는 필요한 의미로 인해 문맥이 다른 것을 요구하는 경우를 제외하고, 단어 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미, 즉 명시된 특징의 존재를 상술하지만 본 발명의 다양한 실시예에서 추가적인 특징의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서, 식별 인용에 의해 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.

Claims (48)

  1. 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온의 말레에이트 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염은 하기 화학식 (I)의 구조를 가지는 말레에이트 염:

    상기 화학식 (I)에서 n은 0.3 내지 1.5의 수임.
  3. 제2항에 있어서, 상기 n은 0.5±0.05, 1.0±0.1, 및 1.5±0.2으로 구성된 군에서 선택되는 수인 것을 특징으로 하는 말레에이트 염.
  4. 제2항에 있어서, 상기 염은 화학식 (II)의 구조를 가지는 말레에이트 염인 것을 특징으로 하는 말레에이트 염:

  5. 제2항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 결정질 형태인 것을 특징으로 하는 말레에이트 염:
    (a) 6.3±0.2, 8.9±0.2, 9.4±0.2, 11.2±0.2, 12.6±0.2, 13.4±0.2, 17.9±0.2, 18.6±0.2, 18.8±0.2, 19.3±0.2, 20.1±0.2, 20.7±0.2, 21.2±0.2, 21.8±0.2, 22.4±0.2, 22.6±0.2, 23.3±0.2, 23.8±0.2, 24.7±0.2, 25.6±0.2, 26.1±0.2, 27.4±0.2, 28.3±0.2, 28.6±0.2, 29.0±0.2, 29.4±0.2, 및 30.4±0.2 도(degree)로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 2θ 각도 값을 갖는 7개 이상의 회절 피크(peak)를 포함하는 분말 X-선 회절 패턴(powder X-ray diffraction pattern)에 의해 특성화되는 결정질 형태 A*;
    (b) 8.3±0.2, 11.2±0.2, 17.9±0.2, 18.4±0.2, 18.6±0.2, 19.3±0.2, 20.8±0.2, 및 22.5±0.2 도(degree)로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 2θ 각도 값을 갖는 3개 이상의 회절 피크(peak)를 포함하는 분말 X-선 회절 패턴(powder X-ray diffraction pattern)에 의해 특성화되는 결정질 형태 A; 또는
    (c) 3.30±0.2, 6.61±0.2, 9.88±0.2, 11.73±0.2, 13.14±0.2, 15.23±0.2, 16.56±0.2, 17.94±0.2, 18.72±0.2, 19.34±0.2, 19.93±0.2, 20.76±0.2, 22.04±0.2, 22.95±0.2, 23.86±0.2, 25.19±0.2, 26.61±0.2, 28.36±0.2, 30.13±0.2, 31.36±0.2, 33.49±0.2, 및 37.22±0.2로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 2θ 각도 값을 갖는 7개 이상의 회절 피크(peak)를 포함하는 분말 X-선 회절 패턴(powder X-ray diffraction pattern)에 의해 특성화되는 결정질 형태 N.
  6. 다음의 중 어느 하나의 단계를 포함하는 제5항의 말레에이트 염의 제조방법:
    (a) 용액 또는 현탁액(suspension)을 형성하기 위해 유리 염기(free base) 또는 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온의 말레에이트 이외의 염을 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키고; 혼합물을 형성하기 위해 상기 형성된 용액 또는 현탁액(suspension)을 말레산(maleic acid)과 혼합하고; (5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 말레에이트 염을 타겟(target) 결정질 형태로 침전시키는 단계; 및
    (b) 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 세스퀴-말레에이트 염을 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키거나 현탁시키고; (5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 말레에이트 염을 타겟(target) 결정질 형태로 침전시키는 단계;
    상기 (a) 또는 (b) 단계의 용매 또는 용매 혼합물은 물, 저급 알킬 알코올(lower alkyl alcohols), 케톤(ketones), 에터(ethers), 에스터(esters), 저급 지방족 카복시산(lower aliphatic carboxylic acids), 저급 지방족 나이트릴(lower aliphatic nitriles), 임의의 할로젠화 방향족(halogenated aromatic) 용매, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택됨.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a) 또는 (b) 단계는 결정질의 생성물을 수집하기 위하여 가열, 용해되지 않은 불순물을 제거하기 위한 여과, 용매 증류, 카운터 용매(counter solvent) 또는 용매 혼합물의 첨가, 씨결정(crystal seed)의 첨가, 침전 유도제의 첨가, 냉각, 침전, 및 여과하는 단계로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 상기 용매는 아이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 아세톤(acetone), THF(tetrahydrofuran), 1,4-다이옥세인(1,4-dioxane), 아세트산(acetic acid), 아세토나이트릴(acetonitrile), 물, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제6항에 있어서,
    1) 상기 (a) 또는 (b) 단계는 결정질 형태 A*를 생성하기 위해 용매로서 아이소프로판올(isopropanol)-물 (v/v > 60/40)을 사용하는 단계를 포함하고; 또는
    2) 상기 (a) 또는 (b) 단계는 결정질 형태 A를 생성하기 위해 용매로서IPA(icosapentaenoic acid)-물 (v:v=4:1) 혼합물을 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 말레에이트 염을 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물로,
    상기 암은 뇌암(brain cancer), 폐암(lung cancer), 신장암(kidney cancer), 골암(bone cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 유방암(breast), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer), 흑색종(melanoma), 피부암(skin cancer), 부신암(adrenal cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장암(colorectal cancer), 림프종(lymphoma), 또는 갑상선 종양(thyroid tumors)으로 구성된 군에서 선택되는 암 및 이들의 합병증(complications)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암은 BRAF, NRAS 및 KRAS 돌연변이 뇌암(brain cancer), 폐암(lung cancer), 신장암(kidney cancer), 골암(bone cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 유방암(breast), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer), 흑색종(melanoma), 피부암(skin cancer), 부신암(adrenal cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장암(colorectal cancer), 림프종(lymphoma), 또는 갑상선 종양(thyroid tumors) 및 이들의 합병증(complications)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  14. 다음 단계를 포함하는 제5항의 말레에이트 염의 제조방법으로:
    a) 50℃에서 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온과 말레산(maleic acid)의 혼합물을 i-PrOH과 H2O의 혼합 용매에 혼합하는 단계, 또는
    b) 50℃에서 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온과 혼합물 또는 현탁액(suspension) 또는 말레산(maleic acid) 용액을 i-PrOH과 H2O의 혼합 용매에 혼합하는 단계, 또는
    c) 50℃에서 혼합물 또는 현탁액(suspension) 또는 5-(((1R,1aS,6bR)-1-(6-(트리플루오르메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-1a,6b-다이하이드로-1H-사이클로프로파[b]벤조퓨란-5-일)옥시)-3,4-다이하이드로-1,8-나프티리딘-2(1H)-온 용액을 i-PrOH과 H2O의 혼합 용매에 말레산(maleic acid)과 혼합하는 단계,
    상기 (a), (b) 및 (c) 각각의 단계에서, 상기 i-PrOH의 양은 i-PrOH과 H2O의 전체 부피에 대하여 40vol% 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c) 각각의 단계에서, 상기 i-PrOH의 양은 i-PrOH과 H2O의 전체 부피에 대하여 60vol% 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 혼합 용매는 i-PrOH로 대체되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 혼합물을 실온에서 냉각한 후, 씨결정(crystal seeds)을 첨가하고 방치하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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