KR102641906B1 - 세포밖 소포체 및 이를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

세포밖 소포체 및 이를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크기 및 구성 인자가 균질한 박테리아 세포밖 소포체 및 이를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항암 활성이 더 높으면서 의약품으로 상업적 개발에 더욱 적합한 특성을 갖는 박테리아 세포밖 소포체를 제공한다.

Description

세포밖 소포체 및 이를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물{Extracellular vesicles and a composition for treating or preventing cancer comprising the same}
본 발명은 크기 및 구성 인자가 균질한 박테리아 세포밖 소포체 및 이를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명은 항암 활성이 더 높으면서 의약품으로 상업적 개발에 더욱 적합한 특성을 갖는 박테리아 세포밖 소포체를 제공한다.
박테리아 세포밖 소포체(extracellular vesicles, EVs)는 박테리아가 숙주 또는 다른 박테리아와의 커뮤니케이션을 위해 자연적으로 분비하는 이중 지질막 구조의 나노 입자들이다. 특히, 그람 음성 박테리아가 분비하는 세포밖 소포체는 OMV(outer membrane vesicles)라고도 하며, 평균 직경 크기는 약 20 nm 내지 200 nm으로 알려져 있다[J.H. Kim, et al., "Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles", Semin. Cell. Dev. Biol. 40, 97-104, (2015)].
최근 연구 결과에 의하면, 다양한 박테리아 세포밖 소포체가 암을 비롯한 여러 질병에 대한 직접적인 치료 효능이 있을 뿐만 아니라, 이들 질병을 치료하기 위한 약물 전달체로 사용 가능하다. 그리고 뇌수막염 등 다양한 질병을 예방하거나 치료하기 위한 백신 전달체로 임상에 사용되거나 개발되고 있다.
박테리아 세포밖 소포체는 인간을 비롯한 면역 시스템을 갖는 동물 숙주에 주입할 경우 숙주 면역 체계를 활성화시킬 수 있는 다양한 면역 유발 물질들을 가지고 있다. 이중 지질막 구조인 세포밖 소포체는 단백질, 지질, 핵산 등 다양한 구성 성분들을 이중 지질막과 내강 등에 가지고 있으며 이들 성분은 숙주 면역 세포의 다양한 TLRs(Toll like receptors)을 다양한 강도로 자극하여 복합적으로 활성화시킴으로써 강력한 항암 효과를 촉발하는 것으로 추정되었고, 이는 본 연구진의 선행 연구로 최초로 밝혀졌다. 정제한 다양한 박테리아 세포밖 소포체를 암을 가진 마우스의 정맥을 통해 주입할 경우, 암 조직을 효과적으로 제거하고 장기 항암 면역 반응을 유도하는 것을 보고하였다[O.Y. Kim, et al., "Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-γ-mediated antitumor response", Nature Communications. 8:626, (2017)].
더 나아가, 박테리아 세포밖 소포체는 나노 크기라는 특성 때문에 증진된 투과 및 유지 효과(enhanced permeability and retention effect: EPR 효과)로 암 조직에 특이적으로 누적되고, 자연살해세포와 T림프구로부터 항암 사이토카인인 IFN-γ의 분비를 촉진하는 작용 기전(mechanism of action)을 통하여 강력한 항암 면역 반응을 유도한다(Ibid.). 상기 선행 연구에 따르면, DLS(dynamic light scattering)로 측정한 대장균(Escherichia coli) 세포밖 소포체의 입자 크기는 약 20-200 nm에 해당하며, 이러한 범위 내의 다양한 크기를 갖는 입자들이 혼합되어 있는 혼합물 성격을 가진다. 박테리아 세포밖 소포체는 크기뿐만 아니라 구성 인자 또한 매우 다양하며, 이러한 다양성은 외막과 내막으로 구성된 그람 음성 박테리아에서 유래하는 세포밖 소포체에서 특히 두드러진다. 그람 음성 박테리아가 자연 분비하는 세포밖 소포체에는 세포 외막 유래 세포밖 소포체 외에도 세포 내막 유래 세포밖 소포체와 핵산 입자 등이 섞여 있다.
세포 외막 유래 세포밖 소포체는 세포 외막에 있는 지질다당류(LPS, lipopolysaccharies)를 막 표면에 가지고 있고, 세포 외막 단백질 및 주변 세포질(periplasm) 단백질을 포함하고 있다. 반면 세포 내막 유래 세포밖 소포체는 세포 내막, 세포 내막 단백질 및 세포질 단백질을 포함하고 있다. 세포 외막 및 내막 유래 세포밖 소포체는 세포 밖으로 분비되어 배양액에 혼재되는데, 세포 외막 유래 세포밖 소포체를 세포 내막 유래 세포밖 소포체로부터 구분하여 정제하기가 매우 어렵기에 종래 연구에 사용된 정제된 그람 음성 박테리아 세포밖 세포체는 세포 외막 및 내막 유래 세포밖 소포체가 포함된 것이었다.
이와 같이, 박테리아 세포밖 소포체의 크기와 구성 인자가 다양하고, 세포 내막 유래 세포밖 소포체가 혼재되어 있다는 것은 박테리아 세포밖 소포체 기반 의약품 개발에 있어서 약물의 일관적인 제조, CMC (Chemistry, Manufacturing, Control), 및 효능 측면에 있어 주요한 걸림돌로 작용한다.
따라서 박테리아 세포밖 소포체를 면역 항암제로 상업적으로 개발함에 있어서 일관성 있는 품질과 효능을 확보할 필요가 있다. 이를 위하여 그람 음성 박테리아로부터 분비되는 다양한 종류의 세포밖 소포체 군의 특성을 확인하는 것은 매우 유용한 기술이 될 것이다.
지금까지 누적된 많은 연구결과에 따르면 세포밖 소포체는 단일세포로부터 유래된 것이라 할지라도 구성 요소뿐 아니라 크기 또한 다양한 것으로 통상적으로 이해되고 있다. 따라서 자연 분비되는 세포밖 소포체를 통상의 분리 또는 정제 방법을 이용하여 정제된 세포밖 소포체는 구성 요소 및 크기 분포가 다양하다는 점을 자연적인 현상으로 수용해왔다.
그러나, 이러한 일반적인 이해와 달리 본 발명자들은 통상의 방법으로 정제한 박테리아 세포밖 소포체의 특성에 대한 추가 연구를 통하여 이들이 두 가지의 구별되는 세포밖 소포체 군들을 포함하고 있으며, 이들을 추가로 분리 또는 정제할 수 있다는 사실을 밝혀냈다.
상기 두 가지의 구별되는 세포밖 소포체 군을 분리·정제하여 특성을 확인한 결과, 이들은 크기가 상대적으로 큰 세포밖 소포체와 크기가 상대적으로 작고 균질한 세포밖 소포체들로 각각 이루어진 것을 발견하였다. 크기가 상대적으로 큰 세포밖 소포체를 P1, 크기가 작고 균질한 세포밖 소포체를 P2 로 명명하였다. P1의 세포밖 소포체들의 크기 범위는 약 30-200 nm인 반면, P2의 세포밖 소포체들의 크기 범위는 약 20-30 nm이다.
본 발명자들은 P1 및 P2 각각에 대한 규명 작업을 통해, 이들이 크기뿐 아니라 분광학적 특성 및 구성 단백질 측면에서 서로 명확히 구별되는 것을 확인하였다.
P1은 크기가 상대적으로 크고 비균질하며, 280 nm에서의 흡광도 값이 260 nm에서의 흡광도 값보다 작은(A280/A260<1) 분광학적 특성을 갖는 것으로 나타났고, 세포 내막 유래 단백질 및 세포질 유래 단백질을 다량 포함하였다.
반면 P2는 크기가 상대적으로 작고 균질하며, 280 nm에서의 흡광도 값이 260 nm에서의 흡광도 값보다 큰(A280/A260 >1) 분광학적 특성을 갖는 것으로 나타났고, 세포 외막 유래 단백질을 다량 포함하였다.
동적 광산란법(Dynamic Light Scattering: DLS) 분석에 기초한 P2의 평균 입자 크기는 약 20-30 nm 범위이며, 다분산도(polydispersity index)는 약 0.35 이하, 또는 약 0.3 이하, 또는 약 0.25 이하 수준으로 매우 균질한 특성을 가진다. 전자현미경 분석을 통하여 확인한 바 P2는 상기 범위의 세포밖 소포체가 전체 입자의 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상이다. 이들의 제타 전위(Zeta potential) 값은 약 -14 (±3) mV로 음전하를 띄고 있다.
또한 동물 모델에서 P1과 P2의 항암 효능을 비교하였는데, 동일 용량에서 P2가 P1에 비해 높은 항암 효능을 갖는 것을 확인하였다. 따라서 박테리아 세포밖 소포체의 주된 항암 효능이 P2에서 유래함을 확인하였다.
본 발명에 따른 박테리아 세포밖 소포체는 박테리아로부터 자연적으로 분비되고 정제된, 비균질한 특성을 갖는 세포밖 소포체와 비교하여 암 치료 또는 예방 효과가 우수하다. 또한 본 발명에 따른 박테리아 세포밖 소포체는 상대적으로 균질한 물리화학적 성질을 가져서 약물 개발 측면에서 품질 관리(Quality control, QC)가 용이하여 박테리아 세포밖 소포체 기반 항암제 개발에 더욱 유리하다.
도 1은 통상의 방법으로 정제된 세포밖 소포체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC, size-exclusion chromatography)를 이용해 분획한 용출 시간에 따른 흡광 크로마토그램(도 1a) 및 상기 SEC 용출 시간(retention time)에 따른 각 분획의 투과 전자현미경 관찰 결과(도 1b)이다.
도 2는 통상의 방법으로 정제된 세포밖 소포체를 원심 분리를 통해 P1과 P2로 분리하고, 각각에 대한 프로테오믹스 분석을 수행한 결과이다. P1과 P2에서 확인된 단백질의 함량(도 2a), 함량 순위가 상위 5%인 단백질들(도 2b), 세포 내 위치(subcellular localizations)에 따른 단백질의 숫자(도 2c)와 함량(도 2d)을 나타낸 결과이다.
도 3은 P1과 P2의 항암 활성을 용량에 따라 비교하기 위한 동물 실험 방법 및 디자인이다.
도 4는 P1(a)과 P2(b)의 항암 활성을 용량에 따라 비교한 동물 실험 결과이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 상기 용어로 한정하는 수치를 측정 또는 결정하는데 사용되는 장치, 기구 또는 방법 등에 따라 통상적으로 허용되는 오차 범위(표준편차)를 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 동적 광산란법(DLS)으로 측정한 세포밖 소포체의 크기는 ±5 nm의 오차 범위를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "크기"는 달리 언급하지 않는 한 "평균 직경"을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "분리" 또는 "정제"는 특별한 의미상의 차이 없이 상호 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 기타의 성분들을 제외하고 목적하는 성분만을 분획하는 행위에 한정되는 것이 아니라 목적하는 성분의 함량을 높이기 위한, 즉 선택적으로 농축(enrichment)하기 위한 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "통상의 방법으로 정제한 세포밖 소포체" 또는 "통상의 분리 또는 정제 방법을 이용하여 정제된 세포밖 소포체"는 본 발명 이전에 박테리아 세포 배양물로부터 세포밖 소포체 이외의 성분인 단백질, 지질, 유전 물질(DNA, RNA), 병독성 인자(virulence factor) 등 박테리아에서 유래하는 다양한 생물학적 활성 물질들을 제거하기 위한 일련의 과정을 거친 후 얻어진 세포밖 소포체를 의미한다. 따라서 상기 세포밖 소포체는 본 발명에 이르러 발견된 P1 또는 P2에 대해 특별한 분리, 정제 또는 농축 과정을 거치지 않은 상태로 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "P2" 또는 "크기가 상대적으로 작고 균질한 세포밖 소포체"는 본원 발명에 이르러 확인된, 약 20-30 nm 범위의 평균 입자 크기를 갖고 약 0.35 이하, 또는 약 0.3 이하, 또는 약 0.25 이하의 다분산도를 갖는, 매우 균질한 특성을 갖는 세포밖 소포체를 의미한다.
본 발명은 자연 분비 세포밖 소포체 군집 또는 그로부터 통상의 방법으로 정제된 세포밖 소포체 중 크기 분포가 매우 균질한 세포밖 소포체(P2)가 존재함을 밝힌 것이다.
따라서, 본 발명은 자연적으로 분비된 세포밖 소포체와 대비할 때 크기가 상대적으로 작고 균질한 세포밖 소포체(P2)의 함량이 높은 세포밖 소포체를 제공한다.
본 발명에 따른 세포밖 소포체 중 P2의 함량은 전체 입자의 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상이다.
본 발명에 따른 세포밖 소포체(P2)는 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 박테리아를 배양한 후, 박테리아 세포를 원심분리로 제거한 다음, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온교환크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법 이외에 통상의 원심분리, 여과, 투석, 한외 여과, 면역친화성 분리법, 미세유체기술 분리법, 수성 2상 시스템 및 폴리머 기반 침전법 등 해당 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 세포밖 소포체(P2)를 선택적으로 정제해 내기 위한 각 방법에 따른 구체적인 조건 및 실험 프로토콜은 본 발명에서 개시한 세포밖 소포체의 구성 및 특성을 이해한 통상의 기술자들이 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
상기 박테리아는 그람 음성 박테리아를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
상기 그람 음성 박테리아는 이스체리치아(Escherichia) 속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 헤모필루스(Hemophilus) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 시아노박테리움(Cyanobacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 클라미디아(Chlamydia) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 티오박터(Thiobacter) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 부르크홀데리아(Burkholderia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 리케넬라(Rikenella) 속, 알리스티페스(Alistipes) 속, 마리닐라빌리아(Marinilabilia) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속, 모르가넬라(Morganella) 속, 큐프리아비더스(Cupriavidus) 속, 예르시니아(Yersinia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 레지오넬라(Legionella) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 및 모락셀라(Moraxella) 속 박테리아 등을 포함하는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명자들이 확인한 바에 따르면, 통상의 세포밖 소포체 분리 정제에 활용되는 원심 분리 기술 및 크기배제 크로마토그래피 기술을 활용하여 박테리아 배양액으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 경우 P2의 존재를 확인하기 어려웠다. 예컨대, 세포밖 소포체의 침전을 유도하는 물질을 처리하고 침전된 세포밖 소포체를 회수하는 단계에서 주로 활용되는 원심 분리법에서 통상의 세포밖 소포체를 분리하기에 충분한 시간보다 더 장시간 원심분리를 진행해야 비로소 분리될 수 있거나, 크기배제 크로마토그래피를 통한 크기별 분획 기술을 활용한 정제 방법에서도 통상적으로 세포밖 소포체가 용출되는 시점보다 늦게 용출되어 핵산 입자 및 비교적 큰 단백질로 오인될 만큼 P2의 존재를 확인하기 어려운 사정이 존재하였다.
따라서 본 발명에 따른 P2의 존재 확인은 예기치 못한 발견이었다. 본 기술의 발명자들은, 이와 같이 세포밖 소포체의 통상적인 정제 방법에서 사용되는 분리 또는 정제 파라미터를 벗어나 독특한 특성을 가지는 해당 물질(P2)을 정제하여, 이들이 상대적으로 균질한 입자성을 가질 뿐 아니라, 세포밖 소포체의 핵심적인 특징인 분명한 단백질-지질 이중막 구조를 가지는 것을 확인하였다.
본 발명이 개시한 P2의 특성을 이해하게 되면 자연 분비 세포밖 소포체 군집 또는 그로부터 통상의 방법으로 정제된 세포밖 소포체로부터 P2를 쉽게 분리 또는 정제할 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 세포밖 소포체(P2)는 통상의 세포밖 소포체를 분리하기에 충분한 시간보다 더 장시간 원심분리를 진행하거나, 크기배제 크로마토그래피를 통한 크기별 분획 방법에서 본 명세서에 개시된 P2의 입자 크기 및 용출 시간을 참고하여 분리하거나, 0.1 μm 내지 0.05 μm의 공극 크기(pore size)를 가지는 필터법 및 한외여과법을 통하여 정제할 수 있다. 또한, 세포 배양액의 농축 후 침전 단계에서 편차 원심분리법(differential centrifugation)을 활용하여 낮은 원심분리 속도에서 큰 입자를 우선 제거한 후 상등액을 긴 시간 높은 속도의 원심분리를 통하여 분리 가능하다.
본 발명에 따른 세포밖 소포체(P2)는 크기 범위가 약 20-30 nm으로 통상의 방법으로 분리한 세포밖 소포체의 크기 범위 약 20-200 nm보다 작고 균질하다. 또한 프로테오믹스 정량 분석을 하였을 때 외막 단백질인 OmpF (Outer membrane protein F), LamB (Maltoporin), Lpp (Major outer membrane lipoprotien Lpp) 및 OmpA (Outer membrane protein A)로 이루어진 군에서 선택되는 단백질의 함량 순위가 상위 5% 이내이다.
동물 모델에서의 항암 효능을 비교 실험 결과, 동일 용량에서 P2가 P1에 비해 높은 항암 효능을 갖는 것을 확인하였다. 기존에는 포유류 유래 세포밖 소포체의 경우 크기가 큰 것이 약리 활성 면에서 더 효과적이고 크기가 작은 것들은 불순물로 여겨졌으며, 특히 20-30 nm의 작은 크기를 갖는 입자들은 통상적으로 단백질이나 핵산 덩어리인 것으로 여겨졌다. 박테리아 세포밖 소포체에도 이러한 가설이 공통될 것으로 예상되었으나, 본 발명에서는 이러한 예상과는 달리 크기가 작은 세포밖 소포체가 더욱 높은 항암 효능을 나타낸 것을 확인하였다.
후술하는 이론에 구속되는 것은 아니나, 이러한 결과는 P2가 면역시스템 자극을 통한 항암효과를 갖는 것으로 밝혀진 외막 유래 인자를 상대적으로 많이 가지고 있고, 크기가 작기 때문에 크기가 큰 세포밖 소포체에 비해 내부(내강)에 면역 활성화에 특별한 기여를 하지 못하는 다양한 물질들을 포함할 가능성이 낮기 때문인 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일면에 따라, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 세포밖 소포체(P2)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 암의 치료 및 예방 용도로 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 간암, 갑상선암, 고환암, 골암, 교모세포종, 구강암, 난소암, 뇌종양, 다발골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 두경부암, 림프종, 방광암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 직장암, 척수종양, 췌장암, 침샘암, 폐암, 피부암, 후두암, 흑색종 등을 포함하는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 항암 치료에 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 담체 등과 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 적합한 오일, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제나 수크로오즈, 알부민 등이 있다. 적합한 보존제로는 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethylsulfoxide), 글리세롤(glycerol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 수크로오스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 덱스트로스(dextrose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 등이 있다.
본 발명의 또다른 일 면에 따르면, 본 발명에 따른 세포밖 소포체를 포함하는 항암용 세포치료제 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 대상체는 포유동물을 의미하며, 바람직하게는 인간을 나타낸다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 다만, 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 어떠한 의미로도 본 발명의 권리 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 박테리아 세포밖 소포체의 제조 및 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SEC) 분석
1. 균주 배양 및 세포밖 소포체 정제
퍼멘터 시스템(75 L 규모)을 이용하여 E. coli BL21(DE3) ΔmsbB을 호기적 조건에서 16시간 배양한 후 6,000 × g, 20분 간의 원심 분리를 통하여 세포가 제거된 배양액을 준비하였다. 해당 배양액을 0.2 μm pore-sized filter로 여과한 후, 100 kDa MWCO(Molecular weight cut-off)의 멤브레인 필터를 이용한 접선 유도 여과(TFF, tangential flow filtration)를 통하여 10배 농축된 배양액을 생산하였다. 농축된 배양액을 50 μM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 30분간 진탕 반응시켜 단백질 분해 효소를 불활성화하였다. 이후 농축 배양액에 25 mM CaCl2을 포함한 완충 용액(pH 7.2)을 첨가하고 1시간 동안 냉장 진탕 반응시켜 세포밖 소포체를 선택적으로 침전시켰다. 원심 분리로 침전물을 회수한 후 완충 용액에 녹인 후 1 mM MgSO4와 Benzonase(2.5 U/mL)를 첨가하여 상온에서 1 시간 진탕 반응하여 핵산 불순물을 제거하였다.
이후 박테리아 세포밖 소포체보다 분자량이 작은 비입자성 오염체를 제거하기 위해 100 kDa MWCO 투석막에 해당 샘플을 담고 4℃에서 총 18시간 동안 5회 투석액을 교체하며 박테리아 세포밖 소포체를 정제하였다.
2. 정제된 세포밖 소포체의 SEC 분획 결과
위 1의 방법에 의해 정제된 세포밖 소포체를 S500을 채운 컬럼(10 x 200 mm)에 주입하여 1.0 mL/min의 유속으로 HEPES 완충용액으로 전개하면서 260 nm, 280 nm, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 구체적인 SEC 분획 조건은 하기와 같다:
컬럼: S500 (10 × 200 mm)
이동상: 20 mM HEPES, 500 mM NaCl (pH 7.2)
유속: 1.0 mL/min
주입된 샘플 부피: 0.1 mL in 20 mM HEPES, 1 M NaCl (pH 7.2)
도 1a에 나타난 바와 같이, 260 nm, 280 nm, 450 nm 흡광 크로마토그램에서 뚜렷하게 구분되는 두 개의 피크를 발견하였다. 용출 시간(retention time)에 따른 각 분획의 투과 전자 현미경(TEM, transmission electron microscopy)을 이용하여 관찰한 결과, 분획에 따라 관찰되는 입자의 크기가 뚜렷하게 구분되는 것을 확인하였다(도 1b, P1 및 P2).
실시예 2. P1 및 P2 분리 및 프로테오믹스 분석
실시예 1-1의 방법에 의해 정제된 세포밖 소포체를 13,000 × g에서 40분 간 원심 분리하였다. 원심 분리 후 펠렛(pellet)을 P1, 상층액(supernatant)을 P2로 지칭하였다. P1 및 P2로부터 단백질 추출 후 트립신(trypsin)을 처리하여 펩타이드(peptides)로 분해하고 LC-ESI-MS/MS로 프로테오믹스 분석을 수행하였다(도 2 및 표 1).
[표 1]
상기 표 1에 나타난 바와 같이, P1과 P2에서 각각 567개, 506개의 단백질이 확인되었다. P1에서 P2에 비해 함량이 풍부한 단백질(P1-enriched proteins)은 357개였고, 이 중 P1에서만 발견된 단백질은 198개, P2에 비해 1.5배 이상 함량이 풍부한 단백질은 159개였다. P2에서 P1에 비해 함량이 풍부한 단백질(P2-enriched proteins)은 297개였고, 이 중 P2에서만 발견된 단백질은 137개, P1에 비해 1.5배 이상 함량이 풍부한 단백질은 160개였다. 한편 P1 및 P2에서 모두 발견되고 함량이 1.5배 미만 차이 나는 단백질은 50개였다.
도 2a 및 표 1에 나타난 바와 같이, P1-enriched proteins 중 함량이 높은 단백질은 세포질 단백질(cytoplasmic proteins)이 많았는데, 대표적으로 Tuf (Elongation factor Tu), RplB(50S ribosomal protein L2)가 있었다. P2-enriched proteins 중 함량이 높은 단백질은 외막 단백질(outer membrane proteins)가 많았는데, 대표적으로 OmpF (Outer membrane protein F), LamB (Maltoporin), Lpp (Major outer membrane lipoprotien Lpp), OmpA (Outer membrane protein A)가 있었다.
도 2b에는 P1 및 P2의 단백질 중 함량 순위가 상위 5%에 속하는 단백질 종류를 나타내었다.
한편, P1의 경우 세포질 단백질이 개수나 함량 모두 P2에 비해 많았다. P2의 경우 외막 단백질이 개수나 함량 모두 P1에 비해 많았고, 주변 세포질 단백질(periplasmic proteins)의 개수가 P1에 비해 많았다(도 2c, 2d).
그람 음성 박테리아 세포밖 소포체에는 외막 유래 단백질이 농축(enrichment)되고, 세포질 단백질이 비농축(de-enrichment)됨을 고려할 때, P2는 그람 음성 박테리아 세포밖 소포체에 보다 가깝다고 할 수 있다.
실시예 3. P1 및 P2의 in vivo 항암 활성 확인
실시예 1-1의 방법에 의해 분리한 E. coli BL21 (DE3) ΔmsbB 세포밖 소포체를 실시예 2에서와 같이 13,000 × g에서 40분 간 원심 분리해서 분리한 분획(P1 - pellet, large extracellular vesicles; P2 - supernatants, small extracellular vesicles)의 항암 활성을 용량에 따라 비교하였다. 동물 실험 방법 및 디자인은 도 3에 나타난 바와 같이 수행하였다.
BALB/c 암컷 마우스의 우측 등쪽에 마우스 대장암 세포주 CT26(1×106 cells/head)를 주입하고, 1주일 뒤 암 조직을 확인하여 실험군을 나누었다. 대조군에는 완충 용액(buffer)을 주입하였고, 실험군에 따라 P1 및 P2를 2, 5, 10 μg/head로 대장암 세포주 주입 후 8일, 11일, 14일, 17일이 되는 시점에 암 조직에 직접 주입(intratumoral administration)하였다. 그리고 대장암 세포주 주입 후 22일이 되는 시점까지 암 조직의 크기를 측정하였다.
P1 및 P2 모두 용량 의존적으로 항암 효과는 증가하나, 동일 용량에서 P2의 항암 효과가 P1의 항암 효과보다 더 큰 것을 확인하였다(도 4).
즉, 통상의 방법으로 분리된 그람 음성 박테리아 세포밖 소포체를 추가로 정제하여 크기가 상대적으로 작고 균질하고, 항암 효능이 향상된 세포밖 소포체를 수득할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 280 nm에서의 흡광도 값이 260 nm 에서의 흡광도 값보다 큰 (A280/A260 >1) 박테리아 세포밖 소포체 분획.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인, 박테리아 세포밖 소포체 분획.
  6. 제5항에 있어서, 상기 그람 음성 박테리아는 이스체리치아(Escherichia) 속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 헤모필루스(Hemophilus) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 시아노박테리움(Cyanobacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 클라미디아(Chlamydia) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 티오박터(Thiobacter) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 부르크홀데리아(Burkholderia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 리케넬라(Rikenella) 속, 알리스티페스(Alistipes) 속, 마리닐라빌리아(Marinilabilia) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속, 모르가넬라(Morganella) 속, 큐프리아비더스(Cupriavidus) 속, 예르시니아(Yersinia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 레지오넬라(Legionella) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 및 모락셀라(Moraxella) 속 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 것인, 박테리아 세포밖 소포체 분획.
  7. 제6항에 있어서, OmpF (Outer membrane protein F), LamB (Maltoporin), Lpp (Major outer membrane lipoprotien Lpp) 및 OmpA (Outer membrane protein A)로 이루어진 군에서 선택되는 단백질의 함량 순위가 상위 5% 이내인 박테리아 세포밖 소포체 분획.
  8. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 세포밖 소포체 분획을 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 간암, 갑상선암, 고환암, 골암, 교모세포종, 구강암, 난소암, 뇌종양, 다발골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 두경부암, 림프종, 방광암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 직장암, 척수종양, 췌장암, 침샘암, 폐암, 피부암, 후두암, 흑색종 등을 포함하는 군에서 선택되는 것인, 암 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
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