KR102632036B1 - 양극성 나노초 펄스의 간섭에 의한 집중 원격 전기 자극 - Google Patents
양극성 나노초 펄스의 간섭에 의한 집중 원격 전기 자극 Download PDFInfo
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Abstract
심부 조직 및 장기에 선택적으로 비-침습적으로 목표 전기자극(ES) 하기 위한 전기 천공과 같은, 두 개의 생물학적으로 비효과적인 양극 나노초 전기 펄스 및 관련 양태를 중첩함으로써 생물학적으로 효과적인 단극성 나노초 전기 펄스를 생성하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 양극성 나노초 펄스의 간섭에 의한 집중 원격 전기 자극에 관한 것이다.
전기자극(ES)은 다양한 용용분야에서 생물학적 기능을 조작하는데 사용된다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 깊은 조직 및 기관에 ES를 선택적으로 비침습적으로 표적화할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 생물학적으로 효과적인 단극성(unipolar) 나노초 전기 펄스를 발생시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 생물학적으로 효과적인 단극성(unipolar) 나노초 전기 펄스를 발생시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 제1 및 제2 쌍의 전극으로부터 원격 장소에서 생물학적으로 효과적인 단극성 나노초 전기 펄스를 생성하기 위해 제1 쌍의 전극으로부터 발생한 제1의 생물학적으로 비효과적인 양극성(bipolar) 나노초 전기 펄스와 제2 쌍의 전극으로부터 발생한 제2의 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스를 중첩하는 단계를 포함한다. 생물학적으로 효과적인 단극성 나노초 전기 펄스는 중첩하는 단계 없이 발생한 제1 또는 제2의 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스에 비해 개선된 자극 효율을 갖는다. 중첩하는 단계 없이 발생한 제1 또는 제2의 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스는 제1 또는 제2의 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스의 제1 위상의 자극 효과를 상쇄(cancellation) 또는 감소시키는 제1 또는 제2의 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스의 제2 위상에 의해 야기되는 상쇄 효과를 유도한다. 또한, 생물학적으로 효과적인 단극성 나노초 전기 펄스의 개선된 자극 효과는 상쇄 효과의 상쇄 또는 감소에 의해 야기된다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 쌍의 전극은 독립적인 나노초 전기 펄스-전달 채널에 각각 연결된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2쌍의 전극은 선형 배열로 각각 정렬된다. 일부 실시예에서, 단극성 나노초 전기 펄스는 대상에 비침습적으로 전달된다. 선택적으로, 단극성 나노초 전기 펄스는 대상의 국소화된 세포, 조직 또는 기관에 비침습적으로 전달된다. 특정 실시예에서, 단극성 나노초 전기 펄스는 대상의 국소화된 세포, 조직 또는 기관에 비침습적으로 전달된다. 일부 실시예에서, 조직은 깊은 조직이다. 다른 실시예에서, 단극성 나노초 전기 펄스는 일반적으로 시험관내에서(in vitro) 또는 생체밖에서(ex vivo) 샘플에 전달된다. 선택적으로, 샘플은 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 생물학적으로 효과적인 단극성 나노초 전기 펄스의 개선된 자극 효율은 상쇄 또는 상쇄 효과의 감소 정도에 방향적으로 비례한다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스는 이상형(biphasic) 또는 삼상형(triphasic)이다. 일부 실시예에서, 제1 및/또는 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 나노초 전기 펄스는 적어도 제1 및 제2 위상을 갖고, 제1 위상의 진폭은 100/70/40%이다.
다른 양태는 여기에 기재된 방법을 수행하기 위한 장비에 관한 것이다. 또 다른 양태는 장비의 사용에 관한 것이다.
다양한 nsEP 파라미터를 사용하여 CANCAN에 의해 신체의 목표 심부를 비-침습적으로 전기천공 또는 전기자극할 수 있다.
도1은 양극성 또는 단극성 nsEP에 의한 Ca2+ 활성화를 나타낸다. 위쪽은 일 실시예에 따르는 자극 형태 및 진폭이고, 아래쪽은 CHO 세포의 피크 Ca2+ 반응이다(평균 +/- s.e., n = 20-28).
도2는 일 실시예에 따르는 위상화된 양극성 자극의 중첩에 의한 원격 ES의 개념을 나타낸다. 위쪽의 A-A' 및 B-B'은 두 쌍의 접지-절연된 자극 전극이고, 점선은, C-c~ 영역의 중복부분을 갖는, 자극이 전달되는 볼륨에 가까이 간다. 아래쪽의 A-A' 및 B-B' 사이에 가해지는 감쇠(damped) 사인파는 C-C' 영역의 단극성(monopolar) 펄스 안에 중첩된다.
도3은 일 실시예에 따르는 CANCAN 개념을 예시하는 개략도이다. 위쪽에서, A-A' 및 B-B'는 두 개의 독립적인 nsEP-전달 전극 쌍이다. A와 B 사이의 점선은 각각의 전극 쌍으로부터 전기장이 전달되는 영역을 나타내며, 구역 C-C에서 서로 중첩되고 무효화된다. 아래쪽에서, 각각의 전극 쌍은, 생물학적으로 비효율적인 감쇠된 사인파(DSW)를 전달한다. B-B'로부터의 DSW가 위상 편이되면, 두 개의 DSW는 C-C 영역에서 생물학적으로 효율적인 단극성 펄스로 중첩된다. 이 구역에서, "상쇄의 상쇄(cancellation of cancellation)", 또는 CANCAN이 존재한다.
도4a 내지 4c는 일 실시예에 따르는 CANCAN 실험에 대해 사용되는 전극의 예시적인 모델링을 나타낸다.
도5a 내지 5d는 일 실시예에 따르는 예시적인 전기장(electric field) 선량 측정을 나타낸다.
도6a 내지 6d는 일 실시예에 따라 양극성 및 단극성 nsEP의 중첩이 CANCAN을 원격으로 야기하는 것을 나타낸다. 도6a는 4-전극 선형 배열의 각각의 전극 쌍으로부터 전달된 nsEP를 개략적으로 나타낸다. 채널1 전극(1 및 2)는 2위상 nsEP(bi-AB)를 전달하고, 채널 2 전극(3 및 4)는 단일위상 펄스(uni-C)를 전달한다. uni-C의 진폭은 bi-AB의 제2 위상의 진폭과 동일하며, 제1 위상(100%로 설정된)의 50%이었다. 'CANCAN' 노출은 uni-C가 위상-편이되고 bi-AB 전달과 동기화될 때 고려된다. 대안적으로, 두 개의 nsEP가 10-ms 간격으로 전달될 때, 노출은 "비동기화"된 것으로 간주된다. 2a 및 3a 사이의 화살표는 측정이 이뤄진 구역을 나타낸다. B) 각각의 노출 조건에 대해 중간 쌍의 전극(2 및 3)을 포함하는 대표적인 명시야(bright field, BF, 상단 패널) 또는 형광(YP, 하단 패널) 이미지. 기준자(scale bar)=500㎛. 각각의 이미지에서, 왼쪽 및 오른쪽 원은 각각 전극 2 및 3의 임프린트(imprint)에 대응한다. YP 흡수는 전극 사이의 X-축을 따라 그려진(도6b의 YP 패널의 좌측상의 백색 점선) 16 개의 관심 구역내에서 정량화되고, uni-A(C) 동안 국소 전기장의 함수로서 그려진다. 도6d는 전극 2 및 3 사이의 거리의 함수로서 "비동기화된" 노출에 대한 "CANCAN" 노출의 비를 나타낸다. 평균 ± S.E., n=5.
도7a 내지 도7g는 일 실시예에 따르는 CANCAN 효과를 향상시키는 다상(multiphasic) nsEP의 예시적인 동기화를 나타낸다. A)채널 1 전극(2 및 3)은 3상 양극성 nsEP(bi-ABC)를 전달하고 채널 2 전극(3 및 4)은 2상 nsEP (bi-DE)를 전달한다. 제2 및 제3 위상((각각, B/D 및 C/E)의 진폭은 각각 제1 위상(100%로 설정된)의 50% 및 25% (도7b & 7c), 70% 및 25% (도7d & 7e), 또는 70% 및 40% (도7f & 7g)가 되도록 각각의 실험 세트에서 조정되었다. YP 흡수는 전극 2 및 3 사이의 X-축을 따라 정량화되고(도7a의 2a와 3a 사이의 화살표), uni-A(도7b, d & f) 동안 국소 전기장의 함수로서 그려진다. 도7c, 7e, & 7g에서, 전극 사이의 거리의 함수로서 "CANCAN" 및 "비동기화된" 노출의 비가 그려진다. 평균 ± S.E., n=5-8.
도2는 일 실시예에 따르는 위상화된 양극성 자극의 중첩에 의한 원격 ES의 개념을 나타낸다. 위쪽의 A-A' 및 B-B'은 두 쌍의 접지-절연된 자극 전극이고, 점선은, C-c~ 영역의 중복부분을 갖는, 자극이 전달되는 볼륨에 가까이 간다. 아래쪽의 A-A' 및 B-B' 사이에 가해지는 감쇠(damped) 사인파는 C-C' 영역의 단극성(monopolar) 펄스 안에 중첩된다.
도3은 일 실시예에 따르는 CANCAN 개념을 예시하는 개략도이다. 위쪽에서, A-A' 및 B-B'는 두 개의 독립적인 nsEP-전달 전극 쌍이다. A와 B 사이의 점선은 각각의 전극 쌍으로부터 전기장이 전달되는 영역을 나타내며, 구역 C-C에서 서로 중첩되고 무효화된다. 아래쪽에서, 각각의 전극 쌍은, 생물학적으로 비효율적인 감쇠된 사인파(DSW)를 전달한다. B-B'로부터의 DSW가 위상 편이되면, 두 개의 DSW는 C-C 영역에서 생물학적으로 효율적인 단극성 펄스로 중첩된다. 이 구역에서, "상쇄의 상쇄(cancellation of cancellation)", 또는 CANCAN이 존재한다.
도4a 내지 4c는 일 실시예에 따르는 CANCAN 실험에 대해 사용되는 전극의 예시적인 모델링을 나타낸다.
도5a 내지 5d는 일 실시예에 따르는 예시적인 전기장(electric field) 선량 측정을 나타낸다.
도6a 내지 6d는 일 실시예에 따라 양극성 및 단극성 nsEP의 중첩이 CANCAN을 원격으로 야기하는 것을 나타낸다. 도6a는 4-전극 선형 배열의 각각의 전극 쌍으로부터 전달된 nsEP를 개략적으로 나타낸다. 채널1 전극(1 및 2)는 2위상 nsEP(bi-AB)를 전달하고, 채널 2 전극(3 및 4)는 단일위상 펄스(uni-C)를 전달한다. uni-C의 진폭은 bi-AB의 제2 위상의 진폭과 동일하며, 제1 위상(100%로 설정된)의 50%이었다. 'CANCAN' 노출은 uni-C가 위상-편이되고 bi-AB 전달과 동기화될 때 고려된다. 대안적으로, 두 개의 nsEP가 10-ms 간격으로 전달될 때, 노출은 "비동기화"된 것으로 간주된다. 2a 및 3a 사이의 화살표는 측정이 이뤄진 구역을 나타낸다. B) 각각의 노출 조건에 대해 중간 쌍의 전극(2 및 3)을 포함하는 대표적인 명시야(bright field, BF, 상단 패널) 또는 형광(YP, 하단 패널) 이미지. 기준자(scale bar)=500㎛. 각각의 이미지에서, 왼쪽 및 오른쪽 원은 각각 전극 2 및 3의 임프린트(imprint)에 대응한다. YP 흡수는 전극 사이의 X-축을 따라 그려진(도6b의 YP 패널의 좌측상의 백색 점선) 16 개의 관심 구역내에서 정량화되고, uni-A(C) 동안 국소 전기장의 함수로서 그려진다. 도6d는 전극 2 및 3 사이의 거리의 함수로서 "비동기화된" 노출에 대한 "CANCAN" 노출의 비를 나타낸다. 평균 ± S.E., n=5.
도7a 내지 도7g는 일 실시예에 따르는 CANCAN 효과를 향상시키는 다상(multiphasic) nsEP의 예시적인 동기화를 나타낸다. A)채널 1 전극(2 및 3)은 3상 양극성 nsEP(bi-ABC)를 전달하고 채널 2 전극(3 및 4)은 2상 nsEP (bi-DE)를 전달한다. 제2 및 제3 위상((각각, B/D 및 C/E)의 진폭은 각각 제1 위상(100%로 설정된)의 50% 및 25% (도7b & 7c), 70% 및 25% (도7d & 7e), 또는 70% 및 40% (도7f & 7g)가 되도록 각각의 실험 세트에서 조정되었다. YP 흡수는 전극 2 및 3 사이의 X-축을 따라 정량화되고(도7a의 2a와 3a 사이의 화살표), uni-A(도7b, d & f) 동안 국소 전기장의 함수로서 그려진다. 도7c, 7e, & 7g에서, 전극 사이의 거리의 함수로서 "CANCAN" 및 "비동기화된" 노출의 비가 그려진다. 평균 ± S.E., n=5-8.
본 발명은 전극을 삽입하지 않고 심부 조직 및 기관에 대해 선택적으로 전기자극(ES)을 집중하기 위한 방법 및 관련 양태에 관한 것으로, 예를 들어, 나노초 지속기간의 양극성 자극의 국소적 중첩에 의해 달성된다. 이 예들은 비-침습성 ES의 침투 깊이, 선택성, 및 정밀도를 증가시킨다. ES 방법의 예시적인 적용은 범위가, 많은 다른 것 중에서, 정신 장애, 파킨슨 병, 및 통증 조절에서 심부 종양의 표적화된 절제에 이른다.
전기자극(ES)은 생물학적 기능을 조작하는데 널리 사용된다. ES의 효과는 다양하며, 신경 및 근육 흥분, 면역 및 내분비 세포의 활성화, 세포 분화, 전기 천공법 등을 포함한다. ES는 심장 박동 조절(cardiac pacing), 제세동(defibrillation), 근육 훈련 및 재활, 통증 조절, 파킨슨 병 증상 완화, 신경근 및 정신 질환의 진단 및 처치를 포함하는 잘-확립된 임상 적용을 갖는다. 이전에는, 뇌 또는 신체의 특정 영역에 정확하게 ES를 집중시키는 유일한 방법은 삽입 또는 이식된 전극에 의해 직접 자극하는 것이다. 전극 배치와 관련된 조직 손상, 통증, 출혈 위험, 감염, 및 염증은 환자 검사, 질병 진단, 및 이식 수술을 정당화하지 않는 처치에 대해 이 기술을 사용하는 것을 제한한다.
본 발명은 심부 조직의 선택적인, 비침습적, 국소적 ES를 가능하게 하는 예를 제공한다. 특정 실시예에서, 본 발명은 자극 극성의 역전후에 자극 효과를 상쇄하기 위해 나노초 전기 펄스(nsEP)의 고유한 특성을 사용하는 것에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 양극성 nsEP의 제2 위상은 제1 위상의 자극 효과를 상쇄시키므로, 전체 양극성 자극은 그 절반보다 약해진다(도1). 결국, 두 개의 양극성 자극을 단극성 자극에 중첩시키는 것은 상쇄를 상쇄하고(CANCAN) 자극 효율을 회복시킨다. 도2의 예는 두 개의 감쇠 사인파가 전극으로부터 떨어진 영역 C-C인에 단극성 자극이 생성하는 방법을 나타낸다. 이 방식으로, CANCAN은 전극으로부터 떨어진 위치에서 선택적으로 ES를 가능하게 한다.
CANCAN 효과는 양극성 상쇄 현상을 기반으로 한다. 실시예에 기재된 바와 같이, 다양한 세포 유형(CHO, U937, cardiomyocytes) 에서 다양한 종료점을 사용하는(Ca2+ 가동화, 염료 흡수(dye uptake), 멤브레인 전도도, 세포 생존, 포스파티디세린 구체화(phosphatidylserine externalization) 양극성 상쇄는, 상이한 지속기간 및 형상의 nsEP에 대해, 반복적으로 입증되었다.
여기에 기재된 바와 같이, 방법 및 관련 양태는 최소로 파괴적이다(예를 들어, 비-침습적). 경쟁적인 접근법은 일반적으로 세포의 분리 및 다른 매질로의 이동을 위한 상이한 회전이 필요하다. 이 절차는 전기천공된 세포에 대해 유해하거나 치명적이므로, 형질전환된(transfected) 세포의 수율을 감소시키거나 실험을 실시할 수 없게 만든다. 여기에 개시된 방법 및 관련 양태는 또한 일반적으로 기존의 접근법보다 적은 절차 단계, 적은 비용, 및 적은 세포를 포함한다. 또한, 여기에 개시된 방법 및 관련 양태는 또한 일관되고 정확하게 규정된 전기장의 사용, 효과적인 매질 교환 및 약물의 적용/제거, 및 무균 상태로의 부가를 포함한다.
전기천공법(또는 전기투과)은 고전압 전기 펄스(EP)(4,5)에 노출시 발생하는 멤브레인 투과성의 증가를 설명한다. 전기천공법은 유전자 전기이동(8), 전기화학요법(9), 및 비가역적 전기천공법 또는 Ca2+ 전기천공법(10, 11)에 의한 종양 절제를 포함하는 많은 생체의학적 응용 분야를 갖는다. 종래의 전기천공 프로토콜은 밀리 및 마이크로초 지속시간 EP(각각 ㎳- 및 ㎲-EP)를 활용하지만, 더 많은 최근 연구는 나노초 지속시간의 EP(nsEP)에 초점을 맞추고 있다. nsEP는 원형질막(14, 16)의 나노미터 크기의 구멍뿐만 아니라 세포내 막 구조(17-21)의 형성, 세포골격(cytoskeletal) 재구성 및 인지질 스크램블링(phospholipid scrambling)(21- 24), Ca2+ 가동화(mobilization, 20, 25, 26), 및 세포 사멸 경로의 유도(27-31)를 포함하는 ㎳- 및 ㎲-EP에 비해 세포에 대해 뚜렷한 영향을 미친다.
nsEP에 대해 고유하고 더 긴 ms- 및 ㎲-EP로부터 명확하게 구분되는 기능이 최근에 보고되었다(32-39). 양극성 nsEP에 노출된 세포는 동일한 전체 지속시간의 단극성 nsEP에 비해 덜 전기천공되고 더 우수한 세포 생존율을 가졌다(33). 마찬가지로 단극성 펄스의 지속시간의 두배인 양극성 nsEP는 두 배의 에너지를 전달함에도 불구하고 더 적은 멤브레인 투과성을 유발하였다(32). 전기장 반전에 의한 생물학적 효과의 감쇠는 "양극성 상쇄(bipolar cancellation)"로 불린다. 이는 제1 펄스의 완료 후 제2의 반대 극성 펄스의 적용이 제1 펄스의 효과를 원상태로 돌리거나 취소할 수 있기 때문이다. 양극성 상쇄는 상이한 종점(endpoint)에 대해, 멤브레인을 가로지르는 분자 및 이온의 이동(33, 34, 37-39), 포스파티틸세린 구체화(phosphatidylserine externalization, 39), Ca2+ 가동화(32, 36), 및 세포 생존(32, 33)을 포함하여, 다수의 세포 유형에서 나타났다. 양극성 상쇄는 10㎲(32) 또는 심지어 50㎲(38) 만큼 긴 펄스 분리를 위해 지속한다. 대조적으로, 동일한 극성의 두 펄스는 두 배 큰 투과성을 유발하였다(38, 40). 이 상쇄 효과는 각각의 위상에 대해 상이한 진폭(39) 또는 지속시간을 갖는 나노초 전기장 진동(NEFO)(34, 39) 및 비대칭 양극성 nsEP를 포함하여, 상이한 지속시간 및 형태의 nsEP에 대해 관찰되었다. 특히, NEFO에서 볼 수 있듯이, 제2 위상 진폭이 제1 위상의 23%로 감소된 경우에도, 효과의 상쇄가 여전히 관찰되었다. 따라서, 양극성 상쇄는 더 긴 ms- 및 ㎲-EP에 대해 관찰되지 않은 nsEP에 대해 고유한 강력하고 재현가능한 현상이다(41-44).
양극성 상쇄 현상은 방사 전자기 펄스로부터의 생물학적 효과 부족을 설명할 수 있다. 무선주파수(RF) 및 초-광대역(UWB) 방출을 포함하는 방사 전자기 펄스는 극도로 짧은 펄스 폭(나노초 단위)을 갖는 것을 특징으로 하며 본질적으로 양극성이다. 여러 연구에서 세포 성장 및 유전독성(genotoxicity, 48, 50, 52, 53), 심장 및 뉴런 흥분성(49, 51), 뿐만 아니라 심혈관, 신경, 운동, 발달 효과(45, 46, 54-56)를 포함하는, 시험관 내(48-53) 및 생체 내(54-56) 모두에서, 방사된 RF 및 UWB 펄스의 생물학적 효과를 조사했다. 다양한 연구로부터의 주요한 발견은 모의대조군-노출 조절의 효과는 유의미한 차이가 없다는 것이다. 이용된 가장 강력한 펄스 노출조차도 단순히 열 반응과 일치하는 효과를 만들어 냈다. 흥미롭게도, "마이크로파 환청(microwave hearing)" 효과는 펄스 RF 방출의 오직 가장 널리 인정되는 생물학효과이다. 따라서, 생물학적 효과의 부족 및 RF 및 UWB 방출의 비효율성은 양극성 상쇄의 결과일 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 표적화된, 비-침습성 전기천공 또는 전기 자극에 대한 양극성 nsEPDML 내재된 비효율성을 극복하기 위한 접근법을 제공한다. 이 개념은 양극성 nsEP 자체는 낮은 생물학적 효율을 갖는다는 사실을 이용한다. 도3에 도시된 바와 같이, 한쌍의 전극 사이에 인가된 감쇠 사인파(Damped Sine Wave, DSW)(A-A)는 생물학적으로 비효율적이다. 위상 편이된 제2 DSW(전극 사이에 인가된, B-B')는 비슷하게 비효율적이다. 그러나, 두 개의 DSW의 중첩 및 동기화는 두쌍의 전극으로부터 떨어진 영역안에 생물학적으로 효과적인 단극성 펄스를 생성한다(C-C). 즉, 두 개의 생물학적으로 비효율적인 DSW의 충첩 효과는 양극성 nsEP의 상쇄 효과를 상쇄시켜, 단극성 펄스를 생성한다. 이 개념은 "상쇄의 상쇄" 또는 CANCAN 효과라고 불린다.
다양한 예시적인 실시예가 여기에 설명되지만, 청구범위에 의해 기재된 바와 같은 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 다수의 변경이 다양한 실시예들에 대해 이뤄진다. 예를 들어, 다양한 설명된 방법 단계의 순서는 대안적인 실시예에서 종종 변경될 수 있고, 다른 대안적인 실시예에서 하나 이상의 방법 단계가 모두 생략될 수 있다. 다양한 장치 및 시스템 실시예의 선택적인 특징은 일부 실시예에 포함될 수 있고 다른 실시예에는 포함되지 않을 수 있다. 따라서, 이 발명은 주로 예시적인 목적으로 제공되며 여기에 설명된 시스템, 장비 및 방법의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 다양한 실시예의 임의의 및 모든 적용을 포함하도록 한다. 여기에 설명된 실시예, 및 여기에 구체적으로 설명되지 않은 다른 실시예들의 조합은 상기 설명을 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1
세포질내 유리(cytosolic free) Ca2+ 농도 ([Ca2+]i) 는 이전에 보고된 바와 같이 Fura-2 를 사용하는 비율측정 형광 이미지화에 의해 모니터링되었다. 요약하면, 염료가 들어있는 세포를 1X71 현미경(Olympus America, Center Valley, PA)상에 장착된 유리-바닥이 있는 챔버안에 넣었다. 챔버에는 140 NaCl, 5.4 KCl, 1 .5 MgCl2, 2 CaCl2, 10 글루코스, 및 10 HEPES (pH 7.3, 290-300 mOsm/kg)(mM)를 함유하는 용액이 관류되었다. Ca2+ 조건을 위해, CaCl2는 2 mM Na-EGTA로 대체되었다. 일부 실험에서, Ca2+ 는 10 μΜ 사이클로피아조산(CPA)를 사용하는 예비보온( preincubation)에 의해 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 고갈되었다. Fura-2는 고속 파장 스위처 Lambda DG4 (Sutter Instruments, Novato, CA)를 사용하여 340 및 380nm에서 대안적으로 여기되었다. iXon Ultra 897 후면-조명 CCD 카메라(Andor Technology, Belfast, UK)를 사용하여 510nmdo서 방출이 측정되었다. [Ca2+]i는 Metafluor v.7.5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 Fura-2 방출비로부터 계산되었다.
한 쌍의 0.1-mm 직경 텅스텐 막대를 사용하여 커버슬립상의 선택된 세포에 전달되었다. MPC-200 조정기(Sutter)를 사용하여, 텅스텐 막대들은 커버슬립 위 30㎛ 에 정확하게 위치하여, 선택된 세포들은 팁들 사이의 0.175mm 간극의 중간에 있도록 하였다. 전기장은 유한-요소 맥스웰 방정식 솔버 Amaze 3D (Field Precision, Albuquerque, NM)를 사용하는 3D 시뮬레이션에 의해 결정된다. NsEP는 외부에서 트리거되고 디지데이터 1440A 보드 및 Clampex v. 10.2 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하는 TTL 펄스 프로토콜에 의한 이미지 획득과 동기화되었다. 펄스 트레이스는 TDS 3052 오실로스코프(Tektronix, Beaverton, OR)를 사용하여 포착되었다. 이하, 보고된 양극성 펄스의 진폭은 제1 위상의 진폭이다. 각각의 세포는 한번만 노출되었다.
실시예 2
이 시험에서, CANCAN 개념의 실행가능성 추가로 테스트되었다. 두 개의 독립적인 nsEP-전달 전극 쌍을 사용하여, 아가로스 겔(agarose gel)안에 매립된 CHO-K1 세포의 투과성을 측정하였다. 두 개의 nsEP의 동기화 및 중첩은 각각의 자극 전극 쌍으로부터 떨어진 영역안에서 투과성 향상을 야기하며, 이는 단극성 펄스의 것과 동일하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 처음으로, 성공적인 CANCAN을 입증하는, 두 개의 독립적인 nsEP를 중첩함으로써 생물학적으로 효과적인 단극성 펄스를 원격으로 생성한다는 개념 증명을 보여주었다. 이 기술의 최적화는 비-침습성, 심부-조직 전기천공 또는 전기 자극에 대해 많은 영향을 미친다.
재료 및 방법
세포주 및 배지
중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)로부터 구입하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA), 100 lU/mL 페니실린, 및 0.1 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco Laboratories, Gaithersburg, MD)이 보충된 F-12K 배지(Mediatech Cellgro, Herndon, VA) 안에서 배양하였다.
3차원 세포 배양액
실험 당일에, 세포는, 이전에 설명된 방법과 유사하게, 아가로스 겔 3차원(3D) 배양물 안에 매립하였다. 요약하면, 60mm 접시의 바닥은 F-12K 성장 배지에서 7mL의 2% 저-겔화-온도 아가로스(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 로 코팅하였다. 세포를 채취하고 5 x 106 cells/mL 농도로 성장 배지의 0.75% 아가로스에 재현탁시켰다; 이 현탁액 4mL를 60mm 접시의 2% 아가로스 베이스 층위에 한 방울씩 가하였다. 아가로스 겔화를 촉진하고 세포 침강을 방지하기 위해 접시를 4℃에서 5분동안 배양한 다음, nsEP 노출 전에 적어도 30분동안 인큐베이터로 옮겼다. YO-PRO-1 요오드화물(YP; PBS 중 1 μΜ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 nsEP 노출 5분전에 각각의 접시에 첨가하고 염료가 아가로스 겔 전체에 걸쳐 평형이 되도록 37℃에서 배양하였다.
전극 및 nsEP 노출
아가로스 3D 배양물에 매립된 세포로의 nsEP 전달은 선형 어레이로 배열된 두 쌍의 스테인레스 스틸 바늘 전극을 사용하여 달성되었다(도4: 2mm 전극간 간격을 갖는 직경 1.66mm). 각각의 전극 쌍은 nsEP-전달 채널에 연결되었으며, 전극 1 및 2는 채널 1에 연결되고, 전극 3 및 4는 채널 2에 연결되었다(도4c). 선형 어레이의 중심에 위치하는 전극 2 및 3은 활성 상태(a)이고, 주변부의 전극(1 및 4)은 접지 상태(g)이었다. 선형 어레이는 미세조작기(micromanipulator) 상에 장착되어 전극을 아가로스 겔 함유 세포 안으로 정확하고 안정적으로 삽입할 수 있게 하였다.
nsEP는. 최근에 설명된(59) 바와 같이, 각각 단극성 또는 양극성 nsEP를 생성할 수 있는 3개의 개별 MOSFET-기반 펄스 발생기, 및 2 개의 별도의 고-전압 DC 전원 공급 장치의 조합을 사용하여 생성되었다. 각각의 발생기는 2개의 기본 모듈 스택으로 구성되어 있으며, 각각 충전 커패이터 및 MOSFET 스위치를 포함하여, 원하는 전압에 대해 양 또는 음의 펄스를 생성한다. 다상 펄스 발생기를 생성하도록 3개의 발생기를 조합하였고, 이어서 두 개의 독립적인 nsEP-전달 채널을 통해 전극에 연결하였다(상기 참조). 디지털 지연 발생기(모델 577-8C, Berkeley Nucleonics Corporation, San Rafael, CA)를 사용하여 펄스 지속시간(각각의 위상에 대해 600ns) 및 각각의 위상 사이의 지연을 조절하였다. nsEP의 정확한 형태 및 진폭은 Hantek DSO5202P 오실로스코프(칭다오, 산동성, 중국)를 사용하여 모니터링하였다. 각각의 위상의 진폭은 첫번째의 백분율(첫번째는 100%와 동일)로 표시하였으며, 해당 도면 범례에 표시하였다. 이하, 보고된 펄스 진폭 및 전기장 강도는 채널 1로부터 전달된 nsEP의 제1 위상의 피크에서 측정된 것들이다.
각각의 실험에서, 세포를 하기의 노출 조건 중 하나로서 100, 600-ns EP (10Hz)에 노출하였다: 채널1로부터 단극성; 채널1로부터 양극성(2상 또는 3상); 채널2로부터 단극성; 채널 2로부터 양극성(2상); "CANCAN" 노출(채널1 및 채널 2 nsEP 동기화 및 위상 편이된); 비동기화된(10ms 간격으로 전달된 채널 1 및 채널 2 nsEP); 모의대조군(nsEP 전달되지 않음). 정확한 비교를 위해, 모든 nsEP 및 모의대조군 노출은 동일한 세포 샘플에서 무작위 순서로 60mm 접시당 최대 8회 노출로 수행하였다. 모든 nsEP 노출은 실온(22±2℃)에서 수행하였다.
nsEP 선량측정 및 CANCAN 모델링
실험 조건과 일치하는 3D 모델은 상업적인 유한 요소 방법 솔버 COMSOL Multiphysics®, Release 5.0 (COMSOL Inc., Stockholm, Sweden)를 사용하여 구현하였다.
도4b 및 c에 도시된 바와 같이, 두 쌍의 스테인레스스틸 니들 전극(1.6mm 직경, 3cm 높이)을 선형 어레이로 배열하였다(전극간 2mm 간격). 전극들을 전도성 1.4S/m 및 비유전율 76을 갖는 용액안에 담그고 페트리 접시의 바닥면 위로 1mm에위치시켰다. 후자는 비유전율 3.8을 갖는 유전체 실린더(35mm 직경, 2mm 두께)로서 모델화하였다. 설명된 시스템은 공기의 구(35mm 직경)으로 둘러싸여 있다.
시뮬레이션 영역을 이산화하기 위해 선택된 사면체 메쉬는 22449.3mm3의 시뮬레이션 체적에서 0.10mm의 메쉬 요소 최소 크기, 2.45mm의 최대 크기, 및 최대 요소 수 401,038을 초래하였다. 이차 요소는 솔루션 영역 전체에 걸쳐 사용되어, 0.54 x 106 자유도를 제공하였다.
전류 인터페이스가 정상-상태 조건에서 맥스웰 방정식을 해경하기 위해 사용되었다.
V는 전기장 
을 계산하는데 사용된 전위이고, 전류 
이고, σ는 배지의 전도도이다. 정전기 조건하에서, 배질의 분산 속성은 무시되었다.
실험 도중에, 적절하게 동기화되고 지연된 다상 직사각형 펄스는 각각 두 개의 전극에 연결되는 두 개의 채널에 의해 전달되었다. 위상 A의 진폭을 기준(100%)로 취하고, 각각의 후속 위상의 진폭은 A의 백분율로서 설정하였다. 두 번의 펄스 노출이 모델화되었는데, 100/70/40% 및 100/50/25%이다.
시뮬레이션에서 각각의 위상 조합은 별도로 모델링되었다. 위상 A가 채널1에 의해 전달될 때, 전극 1 및 4는 접지상태로 설정되고, 1V가 전극(2)에 인가되고, 전극(3)은 회로로부터 분리되었다. 위상 B 및 D가 채널 1 및 2에 의해 각각 전달될 때, 전극 1 및 4는 접지 상태로 설정되지만, -0.7(70%) 또는 -0.5(50%)V 가 전극 2 및 3 모두에 인가되었다. 마지막으로, 위상 C 및 E가 채널 1 및 2에 의해 각각 전달될 때, 전극 1 및 4는 접지 상태로 설정되고, 0.4(40%) 또는 0.25(25%)V가 전극 2 및 3 모두에 인가되었다.
두 개의 다상 펄스의 중첩은 단극성 또는 양극성 노출의 별개 영역을 생성함
실험 연구에 대한 선량측정을 제공하고 CANCAN 개념을 검증하기 위해 도5a의 전극 어레이에 의해 생성된 |E| 분포의 수치 시뮬레이션을 계산하였다. 이 접근법은 두 개의 다상 펄스의 공간적 중첩을 이용하는데: 두 개의 채널에 의해 생성된 전기장은 동일한 방향의 성분에 대해 합산되는 반면, 반대의 경우 감산되어, 전극으로부터 떨어잔 영역에서 단극성 노출을 생성하고, 다른 곳에서는 양극성 노출을 생성한다. CANCAN 개념은 양극성 노출 영역, 즉 전극 근처에서의 생물학적 효과 감소, 및 오직 단극성 펄스만 전달되는 전극 사이에서의 향상을 보장한다.
도5b는 페트리 접시로부터 3.8mm에서, 즉, 세포의 층에 대응하여, 전극에 수직인 xy 평면에서의 상이한 위상 조합에 대한 |E| 분포를 나타낸다. 채널 1만 활성 상태일 때(도5b, 패널 A), |E|는 전극 1 및 2 사이에서 더욱 강했고, 전극 4를 향해 감쇠되었다. 전극 2은 접지되지 않았으므로, 전기장의 왜곡만 발생하였다. 두 채널이 동일한 극성의 전압을 전달할 때(도5b, 패널 B+D 및 C+E), 반대 방향의 E 성분의 감산은 전극 3 및 4 사이의 영역에서 |E|의 감소를 생성하였다.
도5b로부터, 전기장이 세 지점, 전극 2 또는 3 근처의 두 지점 및 전극 2 및 3 사이의 중심에 있는 한 지점에 대한 시간 함수로서 추출되었다. 도5c는 위상 A 동안(0-600ns) |E|가 최대값이었다는 것을 나타낸다. 후속 위상을 전달하는 동안(600-1800ns), |E|는 전극 2 및 3 사이의 중심에서 완전히 제거되어(0kV/cm), 단극성 펄스를 발생시켰다. 반면, 전극의 가장자리 근처에서 이 감소는 -20%로, 양극성 노출을 나타낸다.
3.6 x 3.6 mm 영역에서의 이 감소는 전극 2 및 3 사이에서 정량화되고 계산된다:
도5d는 100/50% 및 100/70%에 대한 R%를 나타낸다. 두 경우, 감소는 전극 사이의 중심에서 최대이고, 100/70% 노출에 대해 감쇠되었다. XDML 함수로서 R%를 플로팅은, 100/70% 조건이 더욱 효과적이고 표적화된 CANCAN 효과를 제공할 수 있다는 것을 시사하는, 이 차이를 강조한다.
세포 이미지화 및 데이터 처리
nsEP 노출 후, 접시를 15분간 덮은 다음, PBS를 사용하여 5회 세척하여 모든 YP를 제거하였다. 전기투과성 세포의 이미지는 Hamamatsu C9100 EM-CCD 카메라(Hamamatsu, Shizuoka Prefecture, 일본) 및 0.8x, 0.12 NA 대물렌즈가 장착된 올핌푸스 SZX16 형광 스테레오 현미경(Olympus America, Hamden, CT)을 사용하여 획득하였다. YP 방출은 X-Cite 시리즈 120Q 형광 광원(Excelitas Technologies Corporation, Waltham, MA) 및 GFP 필터(예를 들어, 460-490 nm/em. 510-)을 사용하여 검출하였다.
이미지는 MetaMorph 7.8.13 소프트웨어(Molecular Devices, Foster City, CA)를 사용하여 정량화하였다. YP 형광은 전극 2 및 3 사이의 x-평면을 따라 그려진 관심 영역(16) 내에서 측정되었고 전극 사이의 중심으로부터의 거리(mm, 도4a-4c 참조)의 함수로서 플로팅하였다. 각각의 이미지에 대해, 각각의 ROI 내의 형광 강조는 배경 형광에 대해 보정하였다. 데이터는 n번의 독립적인 실험에 대한 평균±SE로 시사하였다.
결과
양극성 및 단극성 nsEP의 동기화는 전기천공법의 향상을 야기함
CANCAN 가설에서, 본질적으로 비효율적인 2 개의 적절하게 형성된 양극성 nsEP의 중첩 및 동기화는 생물학적으로 효과적인 단극성 펄스를 원격으로 복원한다(도3 참조). 이는 전극으로부터 떨어진 특정 위치에서, 시간에 따라 서로 일치하는 각각의 후속 위상 동안 생성된 전기장은 서로를 무효화하기 때문에, 남는 것은 단극성 펄스로서의 제1 위상뿐이다. 이 무효화는 두 개의 독립적인 nsEP로부터의 전기장 성분이 반대 방향일 때 발생하며, 그 영역안에 0kV/cm의 |E| 강도를 생성한다(도5a-5d 및 재료 및 방법 참조).
실험적으로 CANCAN을 테스트하는 첫번째 접근법으로서, 단지 2개의 반대 극성 위상으로만 전기장 무효화에 대한 가능성을 평가하였다(도6a-6d). 성공적인 CANCAN은 적어도 부분적으로 양극성 상쇄 정도에 달려 있다. 따라서, 제2 위상의 진폭은 이전의 결과를 기반으로 하는 제1의 50%로 만들어져서 양극성 상쇄가 사다리꼴 nsEP에 대해 최대 50%의 제2 위상 진폭을 나타냈다(39). 전기장 모델링은 전극 2 및 3 사이의 중심에 존재하는, 최대 전기장 무효화, 및 반대로 최대 CANCAN 효과를 예측하였다(재료 및 방법 참조). 따라서 생물학적 효과를 평가하기 위해 이 영역(즉, 전극 2 및 3 사이의 x-평면을 따르는)에 집중하였다(도6b).
우리는 YO-PRO-1(YP) 염료의 흡수에 의해 아가로스 겔안에 매립된 CHO-K1 세포안의 전기투과를 측정하였다. 두 개의 독립적인 nsEP -전달 전극 쌍을 사용하여, 하나 또는 두 쌍의 전극으로부터의 단극성 또는 양극성 nsEP(100, 600ns, 10Hz)에 세포를 노출시켰다. 채널 1 전극(1 및 2)은 단극성(uni-A) 또는 양극성 nsEP(bi-뮤를 전달하였고; 채널 2 전극(3 및 4)은 동기적으로 전달될 때 bi-AB의 제2 위상과 일치하도록 위상-편이된 단극성 펄스(uni-C)를 전달하였다("CANCAN" 노출; 도6a). 우리는 bi-AB 가 전극 사이의 전체 길이를 따라 uni-A에 비해 투과도 면에서 ~2-3 배 감소를 야기하였다는 것을 발견하였는데(도6b 및 6c), 이는 3D 배양 모델에서 성공적인 양극성 상쇄를 나타낸다. uni-C에 의한 투과도는 전극 3(채널 2의 활성 전극) 근처에서 최대이며, 전극 3으로부터의 거리가 증가할 수도록 감소했다. bi-AB 및 uni-C가 비동기적으로 전달될 때(즉, bi-AB 와 uni-C 사이에 10-ms 지연으로), 전기투과 효과는 전극 사이의 길이 대부분을 따라 bi-AB와 다르지 않았다. 전극 3에 가까울수록, 이 효과는 채널 2 전기장으로부터의 효과가 감지됨에 따라 uni-C와 효과와 더욱 비슷해졌다. 대조적으로, bi-ABB 및 uni-C의 동기화된 전달은 전극들 사이의 중심에서의 비동기 전달보다 최대 ~3배 큰 전극들 사이의 전체 길이를 걸친 투과성의 향상을 야기하였다(도6d). 특히, 중심에서의 투과성의 정도는 uni-A 노출의 것과 동일하여, 전기장 모델링 결과와 일치하였다. 따라서, 이러한 발경은 양극성 및 단극성 nsEP의 동기화된 전달에 의해 생물학적으로 효과적인 단극성 펄스에 의한 원격 생성을 입증하고, 따라서 성공적인 CANCAN을 나타낸다.
다상 nsEP의 동기화는 원격으로 천기천공을 더 향상시킴
이전의 실험에서, 두 개의 독립적인 전극 쌍으부터 전달된 전기장의 무효화에 의해 원격으로 단극성 펄스를 생성하는 것이 가능하다는 것을 보여주었다. 따라서, 다음 실험 세트에서, 우리는 제3의 반대 극성 위상을 추가하여, 전기장 무효화의 효율성을 평가하여, 결국 CANCAN을 평가하였다(도7a-7g). 채널1 전극은 3위상(triphasic) 양극성 nsEP(bi-ABC)를 전달하고, 채널2는 2위상 nsEP(bi-DE)를 전달하여 D 및 E 위상이 각각 bi-ABC로부터의 위상 B 및 C와 일치하였다(도7a). 제 위상의 진폭은 제1 위상의 50%로 유지되었고, 제3 위상은 절반만큼 줄어서 위상 A의 25%가 되었다. 특히, 위상 C 및 E의 진폭은 펄스발생기의 한계로 인해, 이 실험에서 완전히 일치하지는 않았으며, 따라서 진폭은 각각 위상 A의 ~20% 및 30%였다. 각각의 위상은 목표로 하는 25% 위상 진폭의 5%내에 있기 때문에, 우리는 약간 일치하지 않은 진폭으로 이 실험을 수행하였다.
우리는 양극성 상쇄가 3위상 nsEP에서 발생한다는 것을 보여주는, uni-A에 비해 YP 흡수가 ~2-3배 감소에 의해, 채널 1의 bi-ABC가 투과성의 상쇄를 야기하였다는 것을 발견하였다(도7b). 마찬가지로, 채널2로부터 전달된 bi-DE는 uni-D에 비해 투과성이 ~2-배 감소하는 것을 야기하였다. 따라서, 그 자체의 각각의 양극성 nsEP는 상대적으로 낮은 생물학적 효율을 가졌다. 두 개의 양극성 nsEP를 비동기적으로 전달하는 것은 투과 효과를 향상시키지 않았다. 채널 1 전극 근처에서, 투과성의 정도는 bi-ABC의 것과 유사하며; 전극3과 가까울수록, 두 채널으로부터의 조합된 전기장의 영향은 본질적으로 bi-ABC 및 bi-DC로부터의 부가 효과인 투과 효과를 초래하였다. bi-DC의 효과는 전극 2근처에서 매우 작기(거의 0)때문에, 이 부가 효과는 주로 채널 1 근처에서 보이지 않았으며, 투과도(degree of permeabilization)에 무시할만한 영향을 미쳤다. 두 개의 양극성 nsEP가 동기적으로 전달되었을 때, 투과 효과는 비동기적인 전달에 비해 크게 향상되었으며(~3-4배 더 큼, 도7b 및 7c), 중심의 uni-A의 것과 더 유사하였다(실제로는, 더 큼). 중심의 uni-A 노출보가 큰 동기화된 전달에 의한 향상된 투과성은 위상 C 및 E의 진폭에 대해 약간 불일치하는 것 때문일 수 있다. 이것은 잠재적으로 제3 위상 동안 E의 불완전한 무효화를 초래하여, 감소되지 않고 전체 생물학적 효과에 기여하는 잔류 전기장을 생성한다. 그럼에도 불구하고, 우리는 생물학적으로 효과적인 nsEP를 원격으로 생성하기 위해 두 개의 비효과적인 양극성 nsEP의 중첩에 의해 CANCAN 효과를 보여준다.
후속 반대 극성 위상의 진폭 증가는 CANCAN을 개선함
성공적인 CANCAN을 위한 주요 목표 중 하나는 nsEP-전달 전극 근처의 단극성 펄스에 비해 낮은 효과를 가지면서, 단극성의 것과 동일한 효과를 원격으로 생성하는 것이다. 이전 실험에서, 우리는 전극 사이의 중심에 생물학적으로 동등한 단극성 nsEP를 성공적으로 생성하였지만, 생물학적 효과는 여전히 전극 근처의 단극성 펄스의 것과 유사하거나 더 컸다. 따라서, nsEP 파라미터를 수정함으로써 우리의 CANCAN 효과를 개선하고자 하였다. 전기장 모델링 효과는 70%의 제2 위상 진폭이 전극 근처에서 50% 제2 위상 진폭보다 작은 전기장 무효화를 제공할 수 있다고 예측하였다(도5a-5d 참조). 결과적으로, 2개의 nsEP가 동기적으로 전달될 때 전극 근처에서 더 우수한 양극성 상쇄를 초래할 수 있다. 따라서, 첫번째 접근법으로서, 제2 위상의 진폭만 위상 A의 70%로 증가시키고, 제3 위상의 진폭은 25%로 유지하였다. 이전 실험에서와 같이, 채널 1은 bi-ABC 3위상 nsEP를 전달하고, 채널 2는 bi-DE 2위상 nsEP를 전달하였다. 이전 결과와 일치하여, bi-ABC 및 bi-DE는 전극 2 및 3 사이의 전체 길이를 걸쳐, 각각, uni-A 및 uni-D보다 ~2-3 배 적은 투과성을 야기하였다(도7d). 비동기적으로 전달된 둘은 각각의 양극성 nsEP와 유사한 투과 효과를 각각 생성하였다. 즉, 전극 2 근처에서, 투과 정도는 bi-ABC의 것과 유사하지만, 전극 3에 가까울수록, 효과는 bi-DE와 유사하다. 두 개의 양극성 nsEP의 전달을 동기화하는 것은 전극 사이의 중심에서의 투과 효과를 향상시켰으며, 이는 비동기식 전달(도7e)보다 ~2배 크고 uni-A의 투과 효과와 유사하였다. ~2배의 양극성 상쇄 효율을 감안하면, 중심에서의 ~ 2배의 투과성 향상은 완전한 전기장 무효화를 가정할 때 이론적으로 기대할 수 있는 최대값이다. 특히, 전극에 가까울수록, 투과 정도는 각각의 채널로부터 전달된 단극성 nsEP(즉, 채널1로부터 uni-A 및 채널 2로부터 uni-D)의 투과 정도보다 작았으며, 전극 3 근처의 비동기적 전달과 다르지 않았다. 조합된 이 결과들은 70%의 제2 위상 진폭이면, 전극 근처에는 더 적은 전기장 무효화가 존재하여서 양극성 상쇄 효과가 우세하도록 한다는 것을 시사한다. 대조적으로, 전극 사이의 중심에서, 효과는 비동기 전달과 최대로 상이하고, uni-A 노출의 효과와 유사하여, 최대 전기장 우효화 및 CANCAN을 나타낸다.
다음 단계로서, 원격 CANCAN 효과를 더 개선하기 위해 양극성 상쇄 효율성을 향상시키기를 원했다. 이를 위해, 제3 위상의 진폭을 위상 A의 40%로 증가시켰는데(따라서 제2 위상과 유사한 정도만큼 감소함), 이는 더 우수한 양극성 상쇄를 제공할 수 있다. 제2 위상의 진폭은 이전 단계의 실험에서처럼 70%로 유지하였다. bi-ABC의 제3 위상의 진폭을 40%로 증가시키는 것은 양극성 상쇄의 효율성을 증가시켜, 전극 사이의 중심에서 uni-A에 비해 투과성이 ~3-4배 만큼 감소하였다는 것을 발견하였다(도7f). 2위상 bi-DE는 uni-D에 비해 ~2-3 배의 투과성 감보를 야기하였으며, 이는 상쇄 효율성이 위상 E의 진폭 증가에 의해 더 향상되지 않았다는 것을 나타낸다. 두 개의 nsEP가 비동기적으로 전달되었을 때, 투과 효과는 개별적으로 전달된 양극성 nsEP와 다르지 않았다. 그러나, bi-ABC 및 bi-DE의 동기화된 전달은 uni-A의 것과 유사하고 비동기 전달보다 ~3배 큰 전극 사이의 중심에서의 투과율 향상을 야기하였다. 동기 및 비동기 nsEP 사이의 효과 차이는 양극성 상쇄의 정도와 밀접하게 일치하였으며, 중심 영역에서의 완전한 전기장 무효화를 제시한다. 이전 결과에서처럼, 전극에 기까울수록, 투과 효과는 단극성 노출의 투과 효과보다 낮고 비동기 전달과 더욱 유사해졌다. 다시 말해서, 전극에 가까울수록, 전기장 무효화가 더 적으며, 대신에, 양극성 상쇄가 우세하다. 흥미롭게도, 동기화 된 노출 대 비동기화된 노출의 비율 그려서 생성된 곡선(도7g)은 도5d에 도시된 백분율 감소 곡선에 대한 형태를 연상시켰으며, 자기장 모델링 효과를 더욱 입증하였다. 따라서, 제3 위상의 진폭을 증가시키는 것은 양극성 상쇄의 효율성을 증가시켰으며, 반대로, 전극 사이의 중심에서의 CANCAN 의 효율성을 개선 및 향상시켰다.
논의
이 연구에서, 우리는 두 개의 생물학적으로 비효과적인 양극성 nsEP를 생물학적으로 효과적인 단극성 펄스 안에 중첩함으로써 원격 전기천공을 처음으로 보여주었다. 상쇄의 상쇄, 또는 CANCAN으로 불리는 이 효과는 각각의 양극성 nsEP의 일치 위상 동안 생성된 전기장이 반대 방향이고 서로를 무효화할 때 발생하여, 전극으로부터 떨어진 영역안에 단극성 노출만 남기지만, 다른 곳에는 양극성이 남는다. 결과적으로, CANCAN은 표적화된 전기천공을 위한 양극성 nsEP의 고유 비효율성(inherent inefficiency)에 의존한다. 두 개의 독립적인 nsEP의 전달을 동기화하는 것은 비동기 ns데 전달보다 원격으로(즉, 10ms 떨어져 전달된) 최대 ~3배 큰 전기천공을 야기하였다. CANCAN에 의한 전기천공의 분리된 향상은 nsEP 파라미터 변경에 의해 상이한 실험 세트에서 재현성있게 관찰되었다. 따라서, 우리는 목표로 하는 원격 전기천공을 야기하기 위해 CANCAN 개념에 대한 개념 증명을 시사한다.
CANCAN의 효율성은 달성된 양극성 상쇄의 정도에 정비례할 것으로 예상된다. 따라서, 양극성 상쇄, 및 CANCAN의 효율성을 테스트하기 위해, 각각의 실험 세트에서, 위상의 수 및 진폭을 포함하는 nsEP 파라미터를 수정하였다. 우리는 2위상 뿐만 아니라 3위상 nsEP를 인가할 때 성공적인 CANCAN을 관찰하였다. 가장 효율적인 CANCAN 효과는 제1 위상의 100/70/40%인 위상 진폭을 갖는 3위상 nsEP를 사용할 때 발생하였다(도7f 및 g). 이는 50%의 제2 위상 진폭이 최고의 상쇄 효율성을 제공하는 것을 보여주는 이전 결과를 고려할 경우 예상치 못한 것이었다(39). 이전의 연구 결과를 기반으로, 40% 제2 위상 진폭은 50% 진폭과 유사한 정도로 생물학적영향을 상쇄할 수 있다고 추측할 수 있다. 따라서, 40% 진폭에서 제3 위상의 부가는 그 자체에 충분한 상쇄를 야기할 수 있고, 제2 위상으로부터의 효과에 조합할 때, 전체 양극성 상쇄 효율성을 향상시킨다. 특히, 우리의 실험 결과는 전기장 모델링에서 이뤄진 예측을 확실하게 했다(도5a-5d). 상이한 위상 진폭에 대한 E의 백분율 감소를 정량화하는 것은 제2 위상이 제1 위상의 70%일 때 전극 근처에서의 E의 감소가 적다는 것을 나타내었고, 더욱 집중된 CANCAN 효과를 시사한다. 실제로, 우리의 실험 결과는 이를 입증하여, 2개의 nsEP의 동기화된 전달은 양극성 상쇄 정도와 일치하지만, 양극성 상쇄가 우세한 전극 근처에서는 다르지 않으면서, 원격으로 비동기화된 전달보다 최대 ~3 배 큰 효과를 생성하였다. 따라서, 최대 전기장 무효화가 예상되는 영역에서, CANCAN에 의한 전기천공의 향상은 양극성 상쇄의 정도를 기반으로 이론적으로 가능한 최대였다. 따라서, 전기장 모델링 및 실험적 접근법을 사용하여, CANCAN에 의한 가장 효율적인 집중된 전기천공은 제1 위상의 100/70/40%의 nsEP 진폭으로 발생한다는 것을 보여준다.
CANCAN에 의해 원격으로 단극성 펄스를 형성하는 것은 비침습적으로 심부 표적에 접근할 잠재성을 시사한다. 우리의 결과는 CANCAN에 의한 원격 전기천공에 대한 개념 증명을 제시하지만, CANCAN 효과는 마찬가지로 전기자극으로 확장될 수 있다. 전기천공 또는 전기자극을 이용하는 현행의(current) 치료 접근법은 침습적이며 접촉 전극의 삽입 또는 이식을 필요로 한다(60, 61). 결과적으로, 염증, 감염 또는 출혈을 포함하는, 수술과 연관된 일반적인 위험이 따른다. 경두개 전기자극(transcranial magnetic stimulation, TMS), 경피 전기 신경 자극(transcutaneous electrical nerve stimulation, TENS), 및 경두개 직류 자극(transcranial direct current stimulation, tDCS)를 포함하는, 전기자극을 위한 비-침습적 기술은 표적에 대한 정밀도 부족 및/또는 부족한 침투 깊이에 의해 제한된다(60, 62). 따라서, 비침습적 전기천공 또는 전기자극에 대한 기술을 개발할 필요가 있다. 최근의 연구는 비침습적 심부 외 자극을 위해 두 개의 일시적 간섭 전기장을 사용할 가능성을 평가하였다(63). 그들은 동시에 전달된 두 개의 고주파수 전기장이 뇌의 해마층 내의 위치에 신경 자극을 야기한다는 것을 보여주었다. 그들의 접근법은 음파와 관련된 오래된 현상을 기반으로 한다(64). 간단히 말해서, 고정된 진폭을 갖는 2개의 서브임계값 자극이 동시에 전달될 때, 역치상(suprathreshold) 진폭을 갖는 저주파수 발진 전기장 엔벨로프를 생성하기 위해 합산된다. 다시 말해서, 그들의 접근법은 두개의 서브임계값 자극의 합에 의존하여, 진폭이 원격으로 역치상된 자극을 생성한다. 대조적으로, CANCAN에 의한 전기자극 또는 전기천공은 펄스 진폭 또는 지속시간의 변화보다는, 이극에서 이극으로 펄스 형태의 변화에 대신 유일하게 의존한다. 따라서, CANCAN 개념은 신규하며, 표피 조직을 아끼지 않으면서, 심부 조직을 선택적으로 전기천공 또응 전기자극하기 위한 잠재성을 제시한다. 우리의 연구는 CANCAN을 위한 진보된 기술의 개발을 위한 기초를 제공한다. CANCAN의 잠재적인 개발은 신체의 목표 심부에 집중할 수 있는 펄스 RF 송신기를 활용할 것이다.
요약하면, CANCAN 효과에 의한 원격 전기천공을 위한 개념 증명을 여기에 제시한다. 우리는 두 개의 nsEP의 동기화된 전달은 원격으로 전기천공의 향상을 야기하여 비동기 전달보다 최대 ~3배 크고, 단극성 노출의 것과 유사하다는 것을 보여준다. CANCAN에 의해 전기천공의 원격 향상은 다양한 nsEP 파라미터를 사용하여 상이한 실험 세트에서 재현할 수 있었다. CANCAN 개념의 진보된 기술로의 개발은 신체의 목표 심부를 비-침습적으로 전기천공 또는 전기자극하기 위한 잠재력을 시사한다.
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Claims (33)
- 제1 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스를 발생시킬 수 있는 제1 자극(stimuli);
제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스를 발생시킬 수 있는 제2 자극을 포함하고,
제1 및 제2 자극은 제1 및 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스가 중첩되어 제1 및 제2 자극으로부터 떨어진 위치에 생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스를 생성하도록 구성되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항에 있어서,
제1 자극은 제1 쌍의 전극을 포함하고, 제2 자극은 제2 쌍의 전극을 포함하는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항에 있어서,
제1 자극 및 제2 자극은 전극 어레이에 연결된 펄스 발생기에 의해 생성되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제2항에 있어서,
제1 쌍의 전극 및 제2 쌍의 전극 중 적어도 하나는 한 쌍의 텅스텐 막대(rod)를 포함하는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제2항에 있어서,
제1 쌍의 전극 및 제2 쌍의 전극 중 적어도 하나는 적어도 0.1mm의 직경을 갖는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제2항에 있어서,
제1 및 제2 쌍의 전극은 제1 및 제2 쌍의 전극 사이에 적어도 0.175mm의 간극을 갖도록 구성되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제2항에 있어서,
제1 쌍의 전극 및 제2 쌍의 전극은 선형 배열(array)로 정렬되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
대상, 또는 대상의 국소화된 세포, 조직 또는 기관(organ)에 생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스를 비침습적으로 전달하도록 구성되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 하나 이상은 사인파 펄스, 직사각형 펄스, 또는 사다리꼴 펄스인
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
"제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 하나 이상은 다위상(multiphasic)인
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 적어도 하나는 2위상(biphasic)인
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제10항에 있어서,
다위상 펄스의 각각의 위상은 상이한 진폭을 갖는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 적어도 하나는 적어도 제1 및 제2 위상을 가지며, 제2 위상의 진폭은 제1 위상의 진폭의 25% 내지 100% 사이인
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 양극성 전기 펄스로부터의 전기장 성분은 대향되도록 구성되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
중첩은 국소적인 중첩을 포함하는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스는 중첩의 부재시 발생하는 제1 또는 제2 양극성 전기 펄스에 비해 개선된 자극 효율성을 갖는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제16항에 있어서,
중첩의 부재시 발생하는 제1 또는 제2 양극성 전기 펄스는 제1 또는 제2 양극성 전기 펄스의 제1 위상의 자극 효과를 상쇄 또는 감소시키는 제1 또는 제2 양극성 전기 펄스의 제2 위상에 의해 야기되는 상쇄 효과를 유도하고,
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스의 향상된 자극 효율성은 상쇄 효과를 상쇄 또는 감소시킴으로써 야기되는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제17항에 있어서,
상쇄 효과의 상쇄 또는 감소는 자극 극성의 역전을 포함하는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스 중 적어도 하나 또는 둘 다는 감쇠된 전기 펄스를 포함하는
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스 생성 장비.
- 시스템으로서,
제1 전기 펄스 전달 채널 및 제2 전기 펄스 전달 채널;
제1 전기 펄스 전달 채널로부터 전달될 제1 양극성 전기 펄스 및 제2 전기 펄스 전달 채널로부터 전달될 제2 양극성 전기 펄스를 발생시키도록 구성되는 적어도 하나의 펄스 발생기; 및
펄스 발생기에 동작가능하게 연결되는 적어도 하나의 전원 공급장치를 포함하고,
상기 시스템은, 제1 및 제2 전기 펄스 전달 채널로부터 떨어진 위치에서 단극성 전기 펄스를 생성하기 위해 제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스를 중첩하도록 구성되는
시스템.
- 제20항에 있어서,
제1 전기 펄스 전달 채널은 적어도 두 개의 제1 전극을 포함하고, 제2 전기 펄스 전달 채널은 적어도 두 개의 제2 전극을 포함하는
시스템.
- 제20항에 있어서,
제1 전기 펄스 전달 채널 및 제2 전기 펄스 전달 채널 중 하나 또는 둘 다는 바늘 전극을 포함하는
시스템.
- 제20항에 있어서,
제1 전기 펄스 전달 채널 및 제2 전기 펄스 전달 채널 중 하나 또는 둘 모두는, 선형 배열로 정렬되고 스테인레스 스틸 또는 텅스텐 로드로 제조된 전극들을 포함하는
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 적어도 하나는 최대 1800나노초의 지속기간을 갖는
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스는 생물학적으로 비효과적인 양극성 펄스이고, 단극성 전기 펄스는 생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스인
시스템.
- 제25항에 있어서,
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스는 중첩의 부재시 발생하는 제1 또는 제2 양극성 전기 펄스에 비해 개선된 자극 효율성을 갖고,
중첩의 부재시 발생하는 제1 또는 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스는 제1 또는 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스의 제1 위상의 자극 효과를 상쇄 또는 감소시키는 제1 또는 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스의 제2 위상에 의해 야기되는 상쇄 효과를 유도하고,
생물학적으로 효과적인 단극성 전기 펄스의 향상된 자극 효율성은 상쇄 효과를 상쇄 또는 감소시킴으로써 야기되는
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 생물학적으로 비효과적인 양극성 전기 펄스로부터의 전기장 성분은 대향되도록 구성되는
시스템.
- 삭제
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 하나 또는 둘 다는 감쇠 전기 펄스를 포함하는
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 적어도 하나는 사인파 펄스, 직사각형 펄스, 또는 사다리꼴 펄스인
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 펄스 발생기는 다위상 펄스 발생기인
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 하나 또는 둘 다는 다위상을 포함하고, 다위상 중 적어도 하나의 위상은 다위상의 다른 위상과 상이한 지속기간 또는 진폭을 갖는
시스템.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 양극성 전기 펄스 및 제2 양극성 전기 펄스 중 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 위상을 포함하는
시스템.
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