KR102618075B1 - Composition for rapid detection of Salmonella D group in feed containing oligonucleotide set - Google Patents
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
Abstract
본 발명은 살모넬라 종에 속하는 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한 살모넬라 D 그룹 신속 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 사료에서 관리되고 있는 5종의 유해미생물 살모넬라 D 그룹(살모넬라 티피, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 듀블린, 살모넬라 플로룸 및 살모넬라 갈리나룸)을 실시간 PCR을 이용하여 추가적인 전기영동 과정 없이 신속 정확하게 분석하여 상기 5종의 살모넬라 D 그룹을 검출할 수 있으며, 이로써 분석기간이 단축되고, 동시에 많은 시료를 분석을 실시할 수 있어 사료의 제조 및 유통과정에서 유해미생물을 안전하게 관리할 수 있는 우수한 효과가 있다.
The present invention relates to a composition comprising an oligonucleotide set for rapidly detecting Salmonella D group belonging to Salmonella species, a kit comprising the composition, and a method for rapid detection of Salmonella D group using the oligonucleotide set. Real-time PCR of five types of harmful microorganisms Salmonella D group (Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella dublin, Salmonella florum, and Salmonella gallinarum) managed in feed using an oligonucleotide set for detection according to one aspect of Using , the above five types of Salmonella D group can be detected through rapid and accurate analysis without an additional electrophoresis process. This shortens the analysis period and allows analysis of many samples at the same time, eliminating the risk of harmful substances during the manufacturing and distribution of feed. It has an excellent effect in safely managing microorganisms.
Description
본 명세서에는 살모넬라 종에 속하는 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한 살모넬라 D 그룹 신속 검출 방법이 개시된다.Disclosed herein are a composition comprising an oligonucleotide set for rapidly detecting Salmonella D group belonging to Salmonella species, a kit comprising the composition, and a method for rapid detection of Salmonella D group using the oligonucleotide set.
살모넬라 종(Salmonella spp.)은 통성혐기성 그람 음성 간균으로 장내세균과에 속하며, 동물과 사람에 장염, 위장염 및 패혈증 등을 일으키는 인수공통전염병의 원인균으로 알려져 있다. 살모넬라 종(Salmonella spp.)은 살모넬라증(Salmonellosis)의 원인체로 동물의 장관 내에 상재하고 있으며 주로 오염된 날고기, 가공육류(가공육, 돈육, 우육), 과일 및 야채 등에서도 식중독이 발생되고 있다. 현재까지 살모넬라 종(Salmonella spp.)은 약 2,500 종류의 다양한 혈청형이 있으며, 살모넬라 엔테리카 혈청형 엔테리티디스(Salmonella enterica serotype Enteritidis (S. Enteritidis))와 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움(Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium))이 식중독 사고를 일으키는 주요 혈청형이다. Salmonella spp. is a facultative anaerobic Gram-negative bacillus belonging to the Enterobacteriaceae family, and is known to be the causative agent of zoonotic diseases that cause enteritis, gastroenteritis, and sepsis in animals and humans. Salmonella spp. is the causative agent of salmonellosis and resides in the intestinal tract of animals, and food poisoning occurs mainly from contaminated raw meat, processed meat (processed meat, pork, beef), fruits and vegetables. To date, there are approximately 2,500 different serotypes of Salmonella spp., including Salmonella enterica serotype Enteritidis ( S. Enteritidis) and Salmonella enterica serotype Typhimurium. enterica serotype Typhimurium ( S. Typhimurium)) is the main serotype that causes food poisoning incidents.
또한 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 살모넬라 종과 숙주 특이성이 없는 살모넬라 종으로 구분된다. 살모넬라 티피(S. typhi)와 살모넬라 파라티피 A(S. paratyphi A)는 주로 사람에 대해 숙주 특이성을 나타내며, 살모넬라 듀블린(S. Dublin)은 소, 살모넬라 콜레라수이스(S. choleraesuis)는 돼지, 살모넬라 아보르투스 에퀴(S. abortus equi)는 말, 살모넬라 아보르투스 오비스(S. abortus ovis)는 양에 주로 감염되어 병원성을 나타낸다. 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis), 살모넬라 아나툼(S. anatum) 등은 숙주 특이성이 없이 다양한 동물에 감염되어 병원성을 나타낸다.Additionally, it is divided into Salmonella species with host specificity depending on the animal and Salmonella species without host specificity. Salmonella typhi ( S. typhi ) and Salmonella paratyphi A ( S. paratyphi A) show host specificity mainly to humans, Salmonella S. Dublin to cattle, and Salmonella choleraesuis ( S. choleraesuis ) to pigs. , Salmonella abortus equi ( S. abortus equi ) mainly infects horses and Salmonella abortus ovis ( S. abortus ovis ) is pathogenic in sheep. Salmonella typhimurium ( S. typhimurium ), Salmonella enteritidis ( S. enteritidis ), Salmonella anatum ( S. anatum ), etc. infect various animals without host specificity and show pathogenicity.
현재 사료에서 유해미생물로 관리되고 있는 살모넬라 D그룹 (살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 풀로룸(Salmonella Pullorum), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 온타리오(Salmonella Ontario))를 검출하는 방법은 대부분 증균 배양에 의한 검사법으로 전 증균, 선택 증균, 선택 배양, 확인 시험, 혈청군 결정 시험을 통해 최종적으로 살모넬라 D 그룹을 확인하는데 5~7일 정도 소요된다. 이러한 방법은 사료 중 유해미생물 검출을 위해 많은 시간이 소요되어 미생물의 신속검출법으로 사용하기에 한계가 있으며 과도한 노동력이 필요로 하여 효율성이 떨어지는 문제점이 있다. 최근 분자생물학적 분석기술의 발달로 DNA 분자수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자마커 개발이 활발히 진행되고 있으며, PCR (Polymerase chain reaction) 기술에 기반을 둔 다양한 DNA 분석기법이 유전자마커 분석에 이용되고 있다. 특히 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 방법은 추가적인 전기영동 과정 없이 실시간으로 검출 결과를 확인할 수 있어 신속검사법으로 활용되고 있다.Salmonella is currently managed as a harmful microorganism in feed. Group D (Salmonella Typhi , Salmonella Enteritidis, Salmonella Dublin, Salmonella Pullorum , Salmonella Gallinarum , Salmonella Ontario ) The most common method for detecting Salmonella is through enrichment culture, pre-enrichment, selective enrichment, selective culture, confirmation test, and serogroup determination test. It takes about 5 to 7 days to confirm Group D. This method requires a lot of time to detect harmful microorganisms in feed, which limits its use as a rapid detection method for microorganisms, and requires excessive labor, which reduces its efficiency. Recently, with the development of molecular biological analysis technology, the development of genetic markers including SNPs, such as searching for economic trait-related genes and discovering disease-related genes at the DNA molecular level, is actively underway, and various DNA analysis techniques based on PCR (Polymerase chain reaction) technology are being developed. It is used for genetic marker analysis. In particular, the real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) method is used as a rapid testing method because detection results can be confirmed in real time without an additional electrophoresis process.
현재까지 살모넬라 속 균 검출을 위한 PCR 기반의 분자생물학적 연구는 OriC, phoE, rfb, fim, spvA, sef, inv 등 다양한 표적 유전자를 대상으로 유전자마커 개발연구가 시도된 바 있다. 특히 rfb 유전자는 살모넬라 A, B, C2, D 혈청형을 구분할 수 있는 유용한 부위임이 확인되었으며, rfbS 유전자의 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 이용하여 항원 구조상 매우 유사하지만 닭에서 확연히 다른 질병의 원인이 되는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)과 풀로룸(Salmonella Pullorim)을 판별하는 분석기법이 연구된 바 있다.To date, PCR-based molecular biology research for the detection of Salmonella genus has attempted to develop genetic markers targeting various target genes such as OriC, phoE, rfb, fim, spvA, sef, and inv. In particular, the rfb gene was confirmed to be a useful site for distinguishing Salmonella A, B, C2, and D serotypes, and using the single nucleotide polymorphism (SNP) marker of the rfbS gene, it was found that although it is very similar in antigen structure, it is significantly different in chicken. Analysis techniques to identify Salmonella Gallinarum and Salmonella Pullorim, which cause disease, have been studied.
한편, 살모넬라 D 그룹 5종의 혈청형을 구분할 수 있는 방법이 개발되었으나, 5종의 혈청형 확인을 위해 많은 수의 PCR 반응 튜브를 사용해야 하는 등 고가의 분석 비용이 필요하여 비용 및 시간 경제적으로 신속하게 살모넬라 D 그룹을 검출할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.Meanwhile, a method has been developed to distinguish the five serotypes of the Salmonella D group, but it requires expensive analysis costs, such as using a large number of PCR reaction tubes to confirm the five serotypes, so it is not cost-effective and time-efficient. There is a need for research into methods for detecting Salmonella D group.
사료에서 유해 미생물로 관리되고 있는 살모넬라 D그룹을 보다 신속하고 간단하게 검출하기 위한 방법을 연구한 결과, 종래 다수의 PCR 반응 튜브의 사용했던 방법에서 벗어나 적은 비용으로 신속하게 이를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 세트를 발명하였다.As a result of research into a method for more quickly and simply detecting Salmonella D group, which is managed as a harmful microorganism in feed, an oligonucleotide was developed that can detect it quickly and at a low cost, breaking away from the conventional method of using multiple PCR reaction tubes. Invented the set.
이에, 일 측면에서, 본 발명의 목적은, 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 살모넬라 균 신속 검출 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, in one aspect, the purpose of the present invention is to provide a composition, a kit, and a method for rapid detection of Salmonella bacteria, including a set of oligonucleotides capable of rapidly detecting Salmonella D group.
일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 3의 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)인 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 속하는 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출하기 위한 조성물을 제공한다.In one aspect, the present invention includes a set of oligonucleotides for detection of SEQ ID NOs: 1 to 3, Salmonella typhi , Salmonella enteritidis , Salmonella dublin , Salmonella florum Provided is a composition for rapidly detecting Salmonella D group belonging to Salmonella spp. ( Salmonella pullorum) and Salmonella gallinarum .
다른 측면에서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for rapid detection of Salmonella D group, comprising the composition.
또 다른 측면에서, 본 발명은, (a) 사료 샘플로부터 게놈 DNA를 얻는 단계; (b) 상기 게놈 DNA에 대해, 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 속하는 살모넬라 D 그룹을 신속 검출하는 단계;를 포함하고, 상기 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)인, 살모넬라 D 그룹 신속 검출 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention includes the steps of: (a) obtaining genomic DNA from a feed sample; (b) performing real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) on the genomic DNA using the detection oligonucleotide set; And (c) analyzing the amplification product of the real-time polymerase chain reaction to quickly detect Salmonella D group belonging to Salmonella spp., wherein the Salmonella D group is Salmonella typhi , A method for rapid detection of Salmonella D group, which is Salmonella enteritidis , Salmonella dublin, Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum , is provided.
본 발명의 일 측면에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 사료에서 관리되고 있는 5종의 유해미생물 살모넬라 D 그룹(살모넬라 티피, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 듀블린, 살모넬라 플로룸 및 살모넬라 갈리나룸)을 실시간 PCR을 이용하여 추가적인 전기영동 과정 없이 신속 정확하게 분석하여 상기 5종의 살모넬라 D 그룹을 검출할 수 있으며, 이로써 분석기간이 단축되고, 동시에 많은 시료를 분석을 실시할 수 있어 사료의 제조 및 유통과정에서 유해미생물을 안전하게 관리할 수 있는 우수한 효과가 있다.Using the detection oligonucleotide set according to one aspect of the present invention, five types of harmful microorganisms Salmonella D group (Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella dublin, Salmonella florum and Salmonella gallinarum) managed in feed are detected. Using real-time PCR, the above five types of Salmonella D group can be detected through rapid and accurate analysis without an additional electrophoresis process. This shortens the analysis period and allows analysis of many samples at the same time, improving the manufacturing and distribution process of feed. It has an excellent effect in safely managing harmful microorganisms.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 게놈 DNA를 이용한 살모넬라 D 그룹 신속 검출 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 1에서 S01은 샘플 1-1, S08은 샘플 1-2, S09는 샘플 1-3, S10은 샘플 1-4, S11은 샘플 1-4, S04 및 S12는 각각 샘플 1-5 및 1-6, 및 E, BS, BB는 샘플 1-8의 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플 내 살모넬라 D 그룹에 속하는 균이 존재하는지 여부를 신속하게 판단할 수 있는 기준을 예시적으로 나타낸 도이다. 도 2에서 PC는 양성 대조군(positive control), NC는 음성 대조군(negative control), Not detection은 재실험 필요, invA는 살모넬라 속에 속하는 균은 존재하지만 살모넬라 D 그룹에 속하는 균은 존재하지 않은 경우, rfbS는 살모넬라 D 그룹이 존재하는 경우, invA&rfbS는 살모넬라 속에 속하는 균으로서 살모넬라 D 그룹이 존재하는 경우를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 배합사료에서 살모넬라 D 그룹에 속하는 균이 존재하는지 여부를 실시간 PCR 분석을 한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 단미사료에서 살모넬라 D 그룹에 속하는 균이 존재하는지 여부를 실시간 PCR 분석을 한 결과를 나타낸 도이다.
Figure 1 is a diagram showing the results of confirming whether Salmonella D group can be rapidly detected using genomic DNA using an oligonucleotide set for detection according to an embodiment of the present invention. In Figure 1, S01 is sample 1-1, S08 is sample 1-2, S09 is sample 1-3, S10 is sample 1-4, S11 is sample 1-4, and S04 and S12 are samples 1-5 and 1-5, respectively. 6, and E, BS, BB show results for samples 1-8.
Figure 2 is a diagram illustrating standards for quickly determining whether bacteria belonging to the Salmonella D group are present in a sample according to an embodiment of the present invention. In Figure 2, PC is a positive control, NC is a negative control, Not detection requires a retest, invA is when bacteria belonging to the Salmonella genus are present but bacteria belonging to the Salmonella D group are not present, rfbS is a diagram showing the case where the Salmonella D group is present, and invA&rfbS is a diagram showing the case where the Salmonella D group is present as a bacterium belonging to the Salmonella genus.
Figure 3 is a diagram showing the results of real-time PCR analysis to determine whether bacteria belonging to the Salmonella D group are present in the compound feed using an oligonucleotide set for detection according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a diagram showing the results of real-time PCR analysis to determine whether bacteria belonging to the Salmonella D group are present in single feed using an oligonucleotide set for detection according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
일 측면에서, 본 발명은 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 속하는 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 조성물로서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 3의 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 상기 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)인, 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 측면에서, 상기 조성물은 사료 유해미생물 살모넬라 D 그룹을 검출하기 위한 것일 수 있다.In one aspect, the present invention is a composition for rapid detection of Salmonella D group belonging to Salmonella spp., wherein the composition includes a set of oligonucleotides for detection of SEQ ID NOs: 1 to 3, and the Salmonella D group is Salmonella Typhi. ( Salmonella typhi ), Salmonella enteritidis ( Salmonella enteritidis ), Salmonella dublin ( Salmonella dublin ), Salmonella pullorum ( Salmonella pullorum ), and Salmonella gallinarum ( Salmonella gallinarum ), providing a composition for rapid detection of Salmonella D group. In one aspect of the present invention, the composition may be used to detect harmful feed microorganisms Salmonella D group.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella Pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)일 수 있다.The Salmonella D group according to one aspect of the present invention includes Salmonella Typhi , Salmonella Enteritidis , Salmonella Dublin, Salmonella Pullorum , and Salmonella Gallinarum . ) can be.
본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 검출은 상기 살모넬라 티피, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 듀블린, 살모넬라 플로룸 및 살모넬라 갈리나룸을 동시에 검출하는 것일 수 있다.Rapid detection of Salmonella D group according to one aspect of the present invention may simultaneously detect Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis, Salmonella Dublin, Salmonella florum, and Salmonella gallinarum.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 1 내지 3의 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 1 및 2의 검출용 프라이머; 및 서열번호 3의 검출용 프로브;를 포함하는 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 1의 검출용 전방향 프라이머, 및 서열번호 2의 검출용 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 검출용 프로브;를 포함하는 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention may include a set of oligonucleotides for detection of SEQ ID NOs: 1 to 3. Specifically, the composition according to one aspect of the present invention includes detection primers of SEQ ID NOs: 1 and 2; and a detection probe of SEQ ID NO: 3; and may include a set of oligonucleotides for detection. More specifically, the composition according to one aspect of the present invention includes a forward primer for detection of SEQ ID NO: 1, and a reverse primer for detection of SEQ ID NO: 2; and a detection probe of SEQ ID NO: 3; and may include a set of oligonucleotides for detection.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 4 내지 6의 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 7 내지 9의 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention includes an internal control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 4 to 6; and a positive control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 7 to 9. It may additionally include one or more sets selected from the group consisting of.
구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 4 및 5의 내부 대조군 프라이머; 및 서열번호 6의 내부 대조군 프로브;를 포함하는 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 4의 전방향 내부 대조군 프라이머, 및 서열번호 5의 역방향 내부 대조군 프라이머; 및 서열번호 6의 내부 대조군 프로브;를 포함하는 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 상기 내부 대조군은 동일한 검체 튜브에 목표로 하지 않은 염기서열을 넣어서 목표로 하는 염기서열과 동시에 증폭되게 하여 중합효소연쇄반응의 오작동, 시약의 적절성 또는 중합효소의 활성 또는 방해물질에 의한 증폭방해를 동정하기 위한 목적으로 사용된다.Specifically, the composition according to one aspect of the present invention includes internal control primers of SEQ ID NOs: 4 and 5; and an internal control probe of SEQ ID NO: 6. More specifically, the composition according to one aspect of the present invention includes a forward internal control primer of SEQ ID NO: 4, and a reverse internal control primer of SEQ ID NO: 5; and an internal control probe of SEQ ID NO: 6. The internal control involves placing a non-target base sequence in the same sample tube and amplifying it at the same time as the target base sequence to identify malfunction of the polymerase chain reaction, appropriateness of reagents, or interference with amplification due to polymerase activity or interfering substances. It is used for the purpose of:
구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 7 및 8의 양성 대조군 프라이머; 및 서열번호 9의 양성 대조군 프로브;를 포함하는 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 서열번호 7의 전방향 양성 대조군 프라이머, 및 서열번호 8의 역방향 양성 대조군 프라이머; 및 서열번호 9의 양성 대조군 프로브;를 포함하는 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다.Specifically, the composition according to one aspect of the present invention includes positive control primers of SEQ ID NOs: 7 and 8; and a positive control oligonucleotide set including a positive control probe of SEQ ID NO: 9. More specifically, the composition according to one aspect of the present invention includes a forward positive control primer of SEQ ID NO: 7, and a reverse positive control primer of SEQ ID NO: 8; and a positive control oligonucleotide set including a positive control probe of SEQ ID NO: 9.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)용일 수 있고, 구체적으로 단일 실시간 중합효소연쇄반응용일 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention may be used for real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), and may specifically be used for a single real-time polymerase chain reaction.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 중합효소연쇄반응, 구체적으로 실시간 중합효소연쇄반응, 보다 구체적으로 분자마커 특이 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention may further include a reagent for performing polymerase chain reaction, specifically real-time polymerase chain reaction, and more specifically, molecular marker-specific real-time polymerase chain reaction.
본 발명의 일 측면에 따른 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 보편적으로 사용되며, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하는 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 모두 포함하는 개념이다.Polymerase Chain Reaction (PCR) according to one aspect of the present invention is commonly used as a method of exponentially amplifying the starting nucleic acid material by sequentially synthesizing nucleic acids using a polymerase, and is a method of exponentially amplifying the starting nucleic acid material. A concept that includes both qualitative analysis PCR that confirms the presence or absence of nucleic acids, quantitative PCR that measures the amount of specific nucleic acids, and real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) that enables qualitative and quantitative analysis that tracks the PCR process in real time. am.
본 발명의 일 측면에 따른 분자마커 특이 실시간 중합효소연쇄반응은 DNA 염기서열 상의 SNP 대립형질 또는 특정 혈청형(그룹) 특이 염기서열에 특이성을 갖는 프라이머와 프로브 세트를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응 기법이다. Molecular marker-specific real-time polymerase chain reaction according to one aspect of the present invention is a real-time polymerase chain reaction technique that uses primers and probe sets with specificity for SNP alleles or specific serotype (group)-specific base sequences on DNA base sequences. .
본 발명의 일 측면에 따른 프로브 및 프라이머 세트는 전방향(Forward) 프라이머 및 역방향(Reverse) 프라이머를 포함하는 2종의 프라이머, 및 1종의 프로브 또는 프로브 조성물을 포함할 수 있다.The probe and primer set according to one aspect of the present invention may include two types of primers including a forward primer and a reverse primer, and one type of probe or probe composition.
상기 프라이머(Primer)는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 중합효소연쇄반응에 있어서 복제, 증폭되는 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 본 발명의 일 측면에서 SNP 대립형질 특이 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머는 프라이머 말단 염기가 SNP 염기와 결합되거나 결합되지 못하는 특징을 이용하는 증폭 불응성 돌연변이 시스템(Amplification refactory mutation system, ARMS) 기법이 적용될 수 있도록 설계된 프라이머를 제공할 수 있다.The primer refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be replicated, and serves as a starting point for the synthesis of primer extension products that are replicated and amplified in the polymerase chain reaction. In one aspect of the present invention, the primers used in the SNP allele-specific polymerase chain reaction may be applied to an amplification refactory mutation system (ARMS) technique that utilizes the characteristic that the primer terminal base binds or fails to bind to the SNP base. We can provide primers designed to do this.
상기 프로브(Probe)는 프라이머에 의해 복제, 증폭되는 핵산 가닥의 염기서열과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 중합효소연쇄반응으로 복제되는 핵산의 양을 실시간으로 검출하기 위해 올리뉴클레오티드 양 말단에 형광물질을 포함할 수 있다. 각 프로브의 양 말단에 표지되는 형광물질은 각각 리포터(reporter)와 소광제(quencher)로써 역할을 수행할 수 있다.The probe refers to a single-stranded oligonucleotide sequence that can specifically bind to the base sequence of the nucleic acid strand replicated and amplified by a primer, and detects the amount of nucleic acid replicated in real time through polymerase chain reaction. To achieve this, fluorescent substances may be included at both ends of the oligonucleotide. The fluorescent substances labeled at both ends of each probe can function as a reporter and quencher, respectively.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 올리고뉴클레오티드는 5’ 말단 또는 3’ 말단에 형광염료가 태깅되어 있을 수 있다. 구체적으로, 상기 형광염로는 리포터 또는 소광제일 수 있다.The oligonucleotide according to one aspect of the present invention may be tagged with a fluorescent dye at the 5' or 3' end. Specifically, the fluorescent salt may be a reporter or a quencher.
본 발명의 일 측면에 따른 리포터(reporter)는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하며, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TAMRA, Quasar610, Quasar670, 시아닌(Cyanine) 계열 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 리포터는 FAM, JOE, Quasar670, TAMRA로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.A reporter according to one aspect of the present invention is a substance that emits fluorescence by absorbing and emitting light of a specific wavelength, and refers to a substance that can label a probe to confirm whether hybridization has occurred between the target nucleic acid and the probe. fluorescein, fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, Alexa Fluor, FAM , JOE, ROX, HEX, Texas Red, TET, TAMRA, Quasar610, Quasar670, and cyanine-based dyes. Specifically, the reporter may be one or more selected from the group consisting of FAM, JOE, Quasar670, and TAMRA.
본 발명의 일 측면에 따른 소광제(quencher)는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher, BHQ), 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 소광제는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.Quencher according to one aspect of the present invention refers to a substance that reduces fluorescence intensity by absorbing light generated by a reporter, and includes Dabcyl, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, and Blackberry Quencher. ), Black Hole Quencher (BHQ), Iowa black FQ, Iowa black RQ, and IRDye QC-1. Since the range of reduction in fluorescence intensity varies depending on the type of quencher, it can be used taking this into account.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;를 추가적으로 포함하고, 상기 조성물은 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트; 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;가 양성인 경우 샘플 내에 상기 살모넬라 D 그룹이 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention includes the internal control oligonucleotide set; And the positive control oligonucleotide set; wherein the composition further includes the detection oligonucleotide set; the internal control oligonucleotide set; And if the positive control oligonucleotide set is positive, it may be determined that the Salmonella D group is present in the sample.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 사료에 포함된 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출할 수 있는 것일 수 있다.The composition according to one aspect of the present invention may be capable of rapidly detecting Salmonella D group contained in feed.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 조성물을 포함하는 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 키트를 제공한다. 상기 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 조성물에 대한 설명은 상기 키트에 적용될 수 있다.In another aspect, the present invention provides a kit for rapid detection of Salmonella D group, including the composition for rapid detection of Salmonella D group. The description of the composition for rapid detection of Salmonella D group can be applied to the kit.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있고, 상기 시약은 구체적으로 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다.The kit according to one aspect of the present invention may include reagents for performing real-time polymerase chain reaction, and the reagents may specifically include heat-resistant DNA polymerase, dNTPs, and buffer. The dNTPs include dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, and the heat-stable DNA polymerase can be a commercially available heat-stable polymerase such as Taq DNA polymerase.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다.The kit according to one aspect of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performance conditions.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 선택 증균 및 확인단계를 거치지 않고, 전 증균과정 후 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출하기 위한 것일 수 있다.The kit according to one aspect of the present invention may be used to quickly detect Salmonella D group after the entire enrichment process, without going through the selective enrichment and confirmation steps.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 사료 샘플로부터 게놈 DNA를 얻는 단계; (b) 상기 게놈 DNA에 대해, 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 속하는 살모넬라 D 그룹을 신속 검출하는 단계;를 포함하고, 상기 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)인, 살모넬라 D 그룹 신속 검출 방법을 제공한다. 상기 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 조성물에 대한 설명은 상기 검출 방법에 적용될 수 있다.In another aspect, the invention provides a method comprising: (a) obtaining genomic DNA from a feed sample; (b) performing real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) on the genomic DNA using the detection oligonucleotide set; And (c) analyzing the amplification product of the real-time polymerase chain reaction to quickly detect Salmonella D group belonging to Salmonella spp., wherein the Salmonella D group is Salmonella typhi , A method for rapid detection of Salmonella D group, which is Salmonella enteritidis , Salmonella dublin, Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum , is provided. The description of the composition for rapid detection of Salmonella D group can be applied to the detection method.
본 발명의 일 측면에 따른 사료 샘플은 사료 유래 샘플일 수 있다. 또는, 본 발명의 일 측면에 따른 사료은 배합사료 또는 단미사료일 수 있다.The feed sample according to one aspect of the present invention may be a feed-derived sample. Alternatively, the feed according to one aspect of the present invention may be a compound feed or a single feed.
본 발명의 일 측면에 따른 (b) 단계는 서열번호 4 내지 6의 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 7 내지 9의 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세트를 추가적으로 사용하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 (b) 단계는 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;를 추가적으로 사용하는 것을 포함하고, 상기 방법은 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트; 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;가 양성인 경우 샘플 내에 상기 살모넬라 D 그룹이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.Step (b) according to one aspect of the present invention includes an internal control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 4 to 6; and a positive control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 7 to 9. It may include additionally using one or more sets selected from the group consisting of. Specifically, step (b) includes the internal control oligonucleotide set; And the positive control oligonucleotide set; wherein the method includes the detection oligonucleotide set; the internal control oligonucleotide set; And if the positive control oligonucleotide set is positive, it may additionally include the step of determining that the Salmonella D group is present in the sample.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 검출 방법은 선택 증균 및 확인단계를 포함하지 않을 수 있다.The detection method according to one aspect of the present invention may not include selective enrichment and confirmation steps.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples and experimental examples. However, the examples and experimental examples below are provided only for illustrative purposes to aid understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.
[실시예] 살모넬라 D 그룹 특이 프라이머 및 프로브 세트 설계[Example] Design of Salmonella D group-specific primer and probe set
살모넬라 D 그룹을 시간 및 비용 효율적으로 신속하게 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 설계하였으며, 각각의 서열은 하기 표 1과 같다. 하기 표 1에, 벼 GAPDH 유전자의 염기서열을 이용하여 설계한 내부 대조군용 프라이머 및 프로브 서열(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군으로 상피세포에 대한 침습성에 관여하는 유전자로서 살모넬라 속 균 감염 여부 판정에 사용되는 주요 표적 유전자인 ‘invA’를 검출하는 프라이머 및 프로브 서열(서열번호 7 내지 9)도 나타내었다. 여기서 F는 전방향 프라이머(Forward primer), R은 역방향 프라이머(Revese primer), P는 프로브(Probe)를 의미한다.Primers and probes were designed to quickly detect Salmonella D group in a time- and cost-efficient manner, and the respective sequences are shown in Table 1 below. Table 1 below shows the internal control primer and probe sequences (SEQ ID NOs. 4 to 6) designed using the nucleotide sequence of the rice GAPDH gene and the positive control used to determine whether Salmonella infection is a gene involved in invasiveness to epithelial cells. Primer and probe sequences (SEQ ID NOs: 7 to 9) that detect 'invA', the main target gene used for, are also shown. Here, F stands for forward primer, R stands for reverse primer, and P stands for probe.
(IC)internal control
(IC)
(PC)positive control
(PC)
[실험예 1] 게놈 DNA를 이용한 살모넬라 D 그룹 신속 검출 확인[Experimental Example 1] Confirmation of rapid detection of Salmonella D group using genomic DNA
최적의 실시간 중합효소연쇄반응물 조성과 반응조건을 결정하였다. 구체적으로, 조성은 5x STexS-TaqMan (초록색) 4 ㎕, 10x OligoMix (노란색) 1 ㎕, 무수 DNase (흰색) 10 ㎕, 및 주형 DNA 5 ㎕이며, 반응조건은 하기 표 2와 같다.The optimal real-time polymerase chain reaction composition and reaction conditions were determined. Specifically, the composition is 4 μl of 5x STexS-TaqMan (green), 1 μl of 10x OligoMix (yellow), 10 μl of anhydrous DNase (white), and 5 μl of template DNA, and the reaction conditions are shown in Table 2 below.
구체적으로, 각 표준 균주의 활성 배양체로부터 DNeasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출 및 정제하였으며, 세부 방법은 키트 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 추출 및 정제된 DNA는 DS-11 Spectrophotometer (DeNovix)를 이용하여 농도와 순도를 확인한 후 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다. 다중 실시간 중합효소연쇄반응물은 다음과 같은 조건으로 제조하였다; 5x M-Taq-qPCRMix 4 ㎕, 올리고 혼합물 1 ㎕, 표준 DNA 혼합물 1 ㎕, 증류수 14 ㎕를 첨가하여 총량이 20 ㎕가 되도록 하였다.Specifically, DNA was extracted and purified from active cultures of each standard strain using DNeasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN), and detailed methods were performed according to the kit manufacturer's protocol. The extracted and purified DNA was stored frozen and used in experiments after checking the concentration and purity using a DS-11 Spectrophotometer (DeNovix). Multiple real-time polymerase chain reactions were prepared under the following conditions; 4 μl of 5x M-Taq-qPCRMix, 1 μl of oligo mixture, 1 μl of standard DNA mixture, and 14 μl of distilled water were added so that the total amount was 20 μl.
반응조건은 95℃에서 2분간 변성시킨 다음 95℃에서 30초, 55℃에서 40초 반응을 35회 반복 수행하였으며, 반응결과는 7500 software v2.3을 이용하여 확인하였다.The reaction conditions were denaturation at 95°C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 30 seconds at 95°C and 40 seconds at 55°C, and the reaction results were confirmed using 7500 software v2.3.
실시간 중합효소연쇄반응의 주형 DNA는 다음과 같다. 샘플 1-1 내지 1-7 각각은 순서대로 살모넬라 파라티피 A(S. paratyphi-A), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 파라티피 B(S. paratyphi-B) 및 살모넬라 파라티피 C(S. paratyphi-C)의 게놈 DNA를 포함하며, 샘플 1-8은 살모넬라 속 균을 포함하지 않는다. 상기 샘플 1-1, 1-6 및 1-7은 살모넬라 속에 속하지만 살모넬라 D 그룹이 아닌 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3)는 음성(-), 내부 대조군(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 양성(+)일 것으로 예상하였다. 반면, 상기 샘플 1-2 내지 1-5는 살모넬라 속에 속하고 살모넬라 D 그룹인 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3), 내부 대조군(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 모두 양성(+)일 것으로 예상하였다. 한편, 샘플 1-8은 살모넬라 속에 속하지 않은 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 내부 대조군(서열번호 4 내지 6)은 양성(+)이지만, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 음성(-)일 것으로 예상하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다. 도 1에서 S01은 샘플 1-1, S08은 샘플 1-2, S09는 샘플 1-3, S10은 샘플 1-4, S11은 샘플 1-4, S04 및 S12는 각각 샘플 1-5 및 1-6, 및 E, BS, BB는 샘플 1-8의 결과를 나타낸다.The template DNA for real-time polymerase chain reaction is as follows. Samples 1-1 to 1-7 each were, in order, Salmonella paratyphi A ( S. paratyphi -A), Salmonella pullorum, Salmonella enteritidis , Salmonella gallinarum , Salmonella It contains genomic DNA of Salmonella dublin, Salmonella paratyphi B ( S. paratyphi -B), and Salmonella paratyphi C ( S. paratyphi -C), and samples 1-8 do not contain Salmonella genus bacteria. The samples 1-1, 1-6 and 1-7 belong to the Salmonella genus but contain genomic DNA of bacteria other than the Salmonella D group, and are used as a set for rapid identification of the Salmonella D group according to one aspect of the present invention (SEQ ID NO: 1 to 3) were expected to be negative (-), and the internal control (SEQ ID NOS: 4 to 6) and positive control (SEQ ID NOS: 7 to 9) were expected to be positive (+). On the other hand, the samples 1-2 to 1-5 belong to the Salmonella genus and contain genomic DNA of bacteria of the Salmonella D group, and are used as a set for rapid identification of the Salmonella D group (SEQ ID NOs. 1 to 3) according to one aspect of the present invention. , the internal control (SEQ ID NO: 4 to 6) and the positive control (SEQ ID NO: 7 to 9) were all expected to be positive (+). Meanwhile, Samples 1-8 contain genomic DNA of bacteria that do not belong to the Salmonella genus, and the internal control (SEQ ID NOs. 4 to 6) is positive (+), but the Salmonella D group rapid identification set according to one aspect of the present invention (SEQ ID NO: 1 to 3) and positive control (SEQ ID NO: 7 to 9) were expected to be negative (-). The results are shown in Table 3 and Figure 1 below. In Figure 1, S01 is sample 1-1, S08 is sample 1-2, S09 is sample 1-3, S10 is sample 1-4, S11 is sample 1-4, and S04 and S12 are samples 1-5 and 1-5, respectively. 6, and E, BS, BB show results for samples 1-8.
(IC, JOE)Internal control set
(IC, JOE)
(PC, Quaza670)Positive control set
(PC, Quaza670)
표 3 및 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 측면에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용할 때 예상한 대로 살모넬라 D 그룹을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였으며, 복수의 균을 검출함에도 불구하고 사용하는 튜브에 수가 적어 비용 및 시간 효율적으로 신속하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.As shown in Table 3 and Figure 1, it was confirmed that the Salmonella D group could be specifically detected as expected when using the detection oligonucleotide set according to one aspect of the present invention, and even though multiple bacteria were detected It was found that the detection can be done quickly, cost-effectively and time-efficiently because the number of tubes used is small.
이를 토대로 본 발명의 일 측면에 따른 조성물을 이용하여 샘플 내 살모넬라 D 그룹이 존재하는지 여부를 신속하게 판단할 수 있는 기준을 도출하였으며, 이는 하기 표 4 및 도 2와 같다.Based on this, a standard was derived to quickly determine whether Salmonella D group exists in a sample using the composition according to one aspect of the present invention, which is shown in Table 4 and Figure 2 below.
[실험예 2] 배합사료에서 살모넬라 D 그룹 신속 검출 확인[Experimental Example 2] Confirmation of rapid detection of Salmonella D group in mixed feed
상기 실험예 1에서 도출된 살모넬라 D 그룹 신속 판단 기준을 이용하여, 상기 실시예의 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 배합사료에서도 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출할 수 있는지 여부를 확인하고자 하기 실험을 수행하였다.Using the Salmonella D group rapid determination criteria derived in Experimental Example 1, the following experiment was performed to determine whether Salmonella D group could be quickly detected in compound feed using the oligonucleotide set of the above example.
구체적으로, 배합사료(풀무원 아미오) 각 1종류를 방사선 멸균(25 kGy) 후 하기 표 5와 같이 살모넬라 종(Salmonella spp.), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 인위적으로 접종하였다. 또한, 각 배합사료 샘플 2-1 내지 2-6에 각각 순서대로 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 파라티피(S. paratyphi)를 각각 접종하여 사료표준분석방법에 따라 증균 배양하였다. 그런 다음 후 배양액(1~2 mL)을 취하여 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 추출하여 실시간 PCR을 활용하여 상기 표 2의 조건 하에서 분석하였다.Specifically, one type of compound feed (Pulmuone Amio) was sterilized by radiation (25 kGy), and then Salmonella spp., Bacillus subtilis , and Bifidobacterium bifidum ( Bifidobacterium bifidum , Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes , and Bacillus cereus were artificially inoculated. In addition, Salmonella typhi , Salmonella enteritidis , Salmonella dublin, Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum and Salmonella paratyphi ( S. paratyphi ) were each inoculated and enriched and cultured according to the standard feed analysis method. Then, the post-culture fluid (1-2 mL) was taken, DNA was extracted using the DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen), and analyzed using real-time PCR under the conditions in Table 2 above.
배합사료인 샘플 2-1 내지 2-6는 각각 순서대로 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 파라티피(S. paratyphi)의 표준 DNA 108 카피를 포함한다. 반면, 상기 샘플 2-1 내지 2-5는 살모넬라 속에 속하고 살모넬라 D 그룹인 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3), 내부 대조군(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 모두 양성(+)일 것으로 예상하였다. 반면, 상기 샘플 2-6은 살모넬라 속에 속하지만 살모넬라 D 그룹이 아닌 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3)는 음성(-), 내부 대조군(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 양성(+)일 것으로 예상하였다. 그 결과는 하기 표 6 및 도 3에 나타내었으며, 표 5에서 FAM은 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3), JOE는 내부 대조군(서열번호 4 내지 6), Q670은 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)를 나타내고, Ct ND는 미검출(Non Detection)을 의미한다. 이 때, 증폭 여부 판정 Ct 값 기준은 30 이하이다.Samples 2-1 to 2-6, which are compound feeds, are Salmonella typhi ( S. typhi ), Salmonella enteritidis , Salmonella dublin, Salmonella pullorum , and Salmonella gallina, respectively, in that order. It contains 10 8 copies of the standard DNA of Salmonella gallinarum and S. paratyphi . On the other hand, the samples 2-1 to 2-5 belong to the Salmonella genus and contain genomic DNA of bacteria of the Salmonella D group, and are used as a set for rapid identification of the Salmonella D group (SEQ ID NOs. 1 to 3) according to one aspect of the present invention. , the internal control (SEQ ID NO: 4 to 6) and the positive control (SEQ ID NO: 7 to 9) were all expected to be positive (+). On the other hand, the samples 2-6 included genomic DNA of bacteria belonging to the Salmonella genus but not the Salmonella D group, so the Salmonella D group rapid identification set (SEQ ID NOs: 1 to 3) according to one aspect of the present invention was negative ( -), internal control (SEQ ID NO: 4 to 6) and positive control (SEQ ID NO: 7 to 9) were expected to be positive (+). The results are shown in Table 6 and Figure 3 below. In Table 5, FAM is a set for rapid identification of Salmonella D group (SEQ ID NOs. 1 to 3) according to one aspect of the present invention, and JOE is an internal control (SEQ ID NOs. 4 to 6). ), Q670 represents a positive control (SEQ ID NO: 7 to 9), and Ct ND means non-detection. At this time, the Ct value standard for determining amplification is 30 or less.
또한, 상기 배합사료 샘플 2-1 내지 2-6에 대한 분자마커 특이성을 확인하고자, 내부 대조군(IC), 살모넬라 속에 속하는 균인지를 확인할 수 있는 표적 유전자(invA), 및 살모넬라 속에 속하면서 살모넬라 D 그룹에 속하는지를 확인할 수 있는 표적 유전자(rfbS)의 3종의 표적 유전자에 대한 PCR 분석을 수행하였으며, 각각의 Ct 값은 하기 표 7과 같다.In addition, in order to confirm the specificity of the molecular marker for the mixed feed samples 2-1 to 2-6, an internal control (IC), a target gene (invA) that can confirm whether the bacteria belong to the Salmonella genus, and Salmonella D group belonging to the Salmonella genus PCR analysis was performed on three target genes (rfbS) to confirm whether they belong to the target gene (rfbS), and the Ct values for each are shown in Table 7 below.
(S. typhi)salmonella typhi
( S. typhi )
(S. enteritidis)Salmonella Enteritidis
( S. enteritidis )
(Salmonella dublin)salmonella dublin
( Salmonella dublin )
(Salmonella pullorum)Salmonella florum
( Salmonella pullorum )
(Salmonella gallinarum)Salmonella gallinarum
( Salmonella gallinarum )
(S. paratyphi A)Salmonella Paratyphi A
( S. paratyphi A)
표 6 내지 7 및 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하면 배합사료에 살모넬라 D 그룹이 포함된 경우 비용 및 시간 효율적으로 신속하게 검출할 수 있음을 확인하였다.As shown in Tables 6 to 7 and Figure 3, by using the oligonucleotide set for rapid identification of Salmonella D group according to one aspect of the present invention, if Salmonella D group is included in the compound feed, it can be quickly detected in a cost- and time-efficient manner. It was confirmed that it was possible.
[실험예 3] 단미사료에서 살모넬라 D 그룹 신속 검출 확인[Experimental Example 3] Confirmation of rapid detection of Salmonella D group in sweet feed
상기 실험예 3과 동일한 방법으로 단미사료에서도 살모넬라 D 그룹을 신속하게 검출할 수 있는지를 확인할 수 있는 하기 실험을 수행하였다.The following experiment was performed to confirm whether Salmonella D group could be quickly detected even in single feed using the same method as Experiment 3 above.
단미사료인 샘플 3-1 내지 3-6는 각각 순서대로 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 파라티피(S. paratyphi)의 표준 DNA 108 카피를 포함한다. 반면, 상기 샘플 3-1 내지 3-5는 살모넬라 속에 속하고 살모넬라 D 그룹인 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3), 내부 대조군(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 모두 양성(+)일 것으로 예상하였다. 반면, 상기 샘플 3-6은 살모넬라 속에 속하지만 살모넬라 D 그룹이 아닌 균의 게놈 DNA을 포함하고 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3)는 음성(-), 내부 대조군(서열번호 4 내지 6) 및 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)은 양성(+)일 것으로 예상하였다. 그 결과는 하기 표 8 및 도 4에 나타내었으며, 표 6에서 FAM은 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 세트(서열번호 1 내지 3), JOE는 내부 대조군(서열번호 4 내지 6), Q670은 양성 대조군(서열번호 7 내지 9)를 나타내고, Ct ND는 미검출(Non Detection)을 의미한다. 이 때, 증폭 여부 판정 Ct 값 기준은 30 이하이다.Samples 3-1 to 3-6, which are single feeds, are respectively in that order Salmonella typhi , Salmonella enteritidis , Salmonella dublin , Salmonella pullorum , and Salmonella gallina. It contains 10 8 copies of the standard DNA of Salmonella gallinarum and S. paratyphi . On the other hand, the samples 3-1 to 3-5 belong to the Salmonella genus and contain genomic DNA of bacteria of the Salmonella D group, and are used as a set for rapid identification of the Salmonella D group according to one aspect of the present invention (SEQ ID NOs. 1 to 3). , the internal control (SEQ ID NO: 4 to 6) and the positive control (SEQ ID NO: 7 to 9) were all expected to be positive (+). On the other hand, Samples 3-6 contained genomic DNA of bacteria belonging to the Salmonella genus but not the Salmonella D group, so the Salmonella D group rapid discrimination set (SEQ ID NOs: 1 to 3) according to one aspect of the present invention was negative ( -), internal control (SEQ ID NO: 4 to 6) and positive control (SEQ ID NO: 7 to 9) were expected to be positive (+). The results are shown in Table 8 and Figure 4 below. In Table 6, FAM is a set for rapid identification of Salmonella D group (SEQ ID NOs. 1 to 3) according to one aspect of the present invention, and JOE is an internal control (SEQ ID NOs. 4 to 6). ), Q670 represents a positive control (SEQ ID NO: 7 to 9), and Ct ND means non-detection. At this time, the Ct value standard for determining amplification is 30 or less.
또한, 상기 단합사료 샘플 3-1 내지 3-6에 대한 분자마커 특이성을 확인하고자, 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 3종의 표적 유전자에 대한 PCR 분석을 수행하였으며, 각각의 Ct 값은 하기 표 9과 같다.In addition, in order to confirm the specificity of the molecular marker for the combined feed samples 3-1 to 3-6, PCR analysis was performed on three target genes in the same manner as in Experimental Example 2, and each Ct value is shown in the table below. Same as 9.
(S. typhi)salmonella typhi
( S. typhi )
(S. enteritidis)Salmonella Enteritidis
( S. enteritidis )
(Salmonella dublin)salmonella dublin
( Salmonella dublin )
(Salmonella pullorum)Salmonella florum
( Salmonella pullorum )
(Salmonella gallinarum)Salmonella gallinarum
( Salmonella gallinarum )
(S. paratyphi A)Salmonella Paratyphi A
( S. paratyphi A)
표 8 내지 9 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 측면에 따른 살모넬라 D 그룹 신속 판별용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하면 단미사료에 살모넬라 D 그룹이 포함된 경우 비용 및 시간 효율적으로 신속하게 검출할 수 있음을 확인하였다.As shown in Tables 8 to 9 and Figure 4, by using the oligonucleotide set for rapid identification of Salmonella D group according to one aspect of the present invention, if Salmonella D group is included in the sweet feed, it can be quickly detected in a cost- and time-efficient manner. It was confirmed that it was possible.
이를 통해, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 및 방법을 이용하면 사료 내에서 살모넬라 D 그룹에 속하는 5종의 균을 동시에 분석할 수 있어, 보다 신속하고 간단하게 적은 비용으로 살모넬라 속 균을 검출할 수 있음을 알 수 있었다.Through this, using the composition, kit, and method according to one aspect of the present invention, it is possible to simultaneously analyze five types of bacteria belonging to the Salmonella D group in feed, thereby detecting Salmonella bacteria more quickly, simply, and at a lower cost. I knew I could do it.
Claims (12)
상기 조성물은 서열번호 1 내지 3의 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고,
상기 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)인, 살모넬라 D 그룹 신속 검출용 조성물.A composition for rapid detection of Salmonella D group belonging to Salmonella spp.,
The composition includes a set of oligonucleotides for detection of SEQ ID NOs: 1 to 3,
The Salmonella D group is Salmonella typhi , Salmonella enteritidis, Salmonella dublin , Salmonella florum ( Salmonella pullorum ) and Salmonella gallinarum , Salmonella D group rapid. Composition for detection.
살모넬라 D 그룹 신속 검출은 상기 살모넬라 티피, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 듀블린, 살모넬라 플로룸 및 살모넬라 갈리나룸을 동시에 검출하는 것인, 조성물.According to paragraph 1,
Salmonella D group rapid detection is a composition that simultaneously detects the Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis, Salmonella Dublin, Salmonella florum and Salmonella gallinarum.
상기 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)용인, 조성물.According to paragraph 1,
The composition is for real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).
상기 조성물은 사료에 포함된 살모넬라 균을 검출하는 것인, 조성물.According to paragraph 1,
The composition detects Salmonella bacteria contained in feed.
상기 조성물은 서열번호 4 내지 6의 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 7 내지 9의 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세트를 추가적으로 포함하는, 조성물.According to paragraph 1,
The composition includes an internal control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 4 to 6; and a positive control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 7 to 9. The composition further comprises one or more sets selected from the group consisting of:
상기 조성물은 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;를 추가적으로 포함하고,
상기 조성물은 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트; 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;가 양성인 경우 샘플 내에 상기 살모넬라 D 그룹이 있는 것으로 판단하는 것인, 조성물.According to clause 5,
The composition includes the internal control oligonucleotide set; And the positive control oligonucleotide set;
The composition includes the detection oligonucleotide set; the internal control oligonucleotide set; and the positive control oligonucleotide set; wherein the composition determines that the Salmonella D group is present in the sample when the positive control oligonucleotide set is positive.
상기 올리고뉴클레오티드는 5’ 말단 또는 3’ 말단에 형광염료가 태깅되어 있는, 조성물.According to paragraph 1,
A composition wherein the oligonucleotide is tagged with a fluorescent dye at its 5' or 3' end.
상기 키트는 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트; 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;가 양성인 경우 샘플 내에 상기 살모넬라 D 그룹이 있는 것으로 판단하는 것인, 키트.According to clause 8,
The kit includes the detection oligonucleotide set; the internal control oligonucleotide set; And the positive control oligonucleotide set; a kit that determines that the Salmonella D group is present in the sample when the positive control oligonucleotide set is positive.
(b) 상기 게놈 DNA에 대해, 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 검출용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 속하는 살모넬라 D 그룹을 신속 검출하는 단계;를 포함하고,
상기 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)인, 살모넬라 D 그룹 신속 검출 방법.(a) obtaining genomic DNA from a feed sample;
(b) For the genomic DNA, real-time polymerase chain reaction using the detection oligonucleotide set according to any one of claims 1, 2, 3, 4, and 7. performing time PCR); and
(c) quickly detecting Salmonella D group belonging to Salmonella spp. by analyzing the amplification product of the real-time polymerase chain reaction,
The Salmonella D group is Salmonella typhi , Salmonella enteritidis, Salmonella dublin , Salmonella florum ( Salmonella pullorum ) and Salmonella gallinarum , Salmonella D group rapid. Detection method.
상기 (b) 단계는 서열번호 4 내지 6의 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 7 내지 9의 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세트를 추가적으로 사용하는 것을 포함하는, 검출 방법.According to clause 10,
Step (b) includes an internal control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 4 to 6; And a positive control oligonucleotide set of SEQ ID NOs: 7 to 9; A detection method comprising additionally using one or more sets selected from the group consisting of.
상기 (b) 단계는 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;를 추가적으로 사용하는 것을 포함하고,
상기 방법은 상기 검출용 올리고뉴클레오티드 세트; 상기 내부 대조군 올리고뉴클레오티드 세트; 및 상기 양성 대조군 올리고뉴클레오티드 세트;가 양성인 경우 샘플 내에 상기 살모넬라 D 그룹이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는, 검출 방법.
According to clause 11,
Step (b) includes the internal control oligonucleotide set; And the positive control oligonucleotide set;
The method includes the detection oligonucleotide set; the internal control oligonucleotide set; and the step of determining that the Salmonella D group is present in the sample when the positive control oligonucleotide set is positive.
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