KR102615997B1 - Specific primer set for detecting Pseudomonas fuscovaginae and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 검역 세균인 슈도모나스 푸스코바기내를 신속 정확하게 검출할 수 있으므로, 슈도모나스 푸스코바기내의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것이다.The present invention relates to a primer set for specifically detecting Pseudomonas fuscovaginae and its use. Since the primer set of the present invention can quickly and accurately detect Pseudomonas fuscovaginae, which is a quarantine bacterium, Pseudomonas fuscovaginae It will be possible to effectively prevent the introduction of Kobaginae into the country.
Description
본 발명은 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi and its use.
식물검역은 일정한 지역에 유입·정착한 병해충이 다른 지역으로 확산하는 것을 방지하기 위하여, 대상식물의 검사, 이동금지나 제한, 병균·해충이 부착된 식물의 소독(약제살포, 훈증, 수몰 등)·폐기(소각, 분쇄, 매립 등) 등의 조치를 취하는 일을 말한다. 지구상에 있는 나라마다 고유한 동물과 식물이 있듯이 병해충의 분포상황도 지역에 따라 서로 다르다. 병해충이 일정 지역에서만 살고 있는 것은 새로 정착할 지역의 기후와 환경이 생존에 적합하지 않은 탓도 있지만, 대부분의 병해충은 살기 좋은 다른 지역이 많이 있어도 스스로 이동하기 어렵기 때문이다.Plant quarantine involves inspection of target plants, prohibition or restriction of movement, and disinfection of plants attached to germs and pests (chemical spraying, fumigation, submersion, etc.) in order to prevent pests that have entered or settled in a certain area from spreading to other areas. ·This refers to taking measures such as disposal (incineration, crushing, landfill, etc.). Just as each country on Earth has its own unique animals and plants, the distribution of pests and diseases also differs depending on the region. The reason that pests only live in certain areas is because the climate and environment of the new area where they will settle is not suitable for survival, but it is also because most pests have difficulty moving on their own even if there are many other good areas to live in.
병해충의 이동은 대체로, 기주식물(寄主植物)과 그 생산물에 잠복하거나 묻어서 이동하는 경우, 포장재·용기 및 항공기·선박·자동차와 같은 수송수단에 묻어서 이동하는 경우, 자체비산(自體飛散)과 매개곤충이나 조류 등의 체내에 잠복하거나 몸에 묻어서 이동하는 경우, 바람·물·기류 등에 의하여 이동하는 경우 등이 있다.The movement of pests is generally carried out by lurking or being buried in host plants and their products, by being buried in packaging materials, containers, and means of transportation such as aircraft, ships, and automobiles, and by self-dispersal. There are cases where it lurks in the body of vector insects or birds, or when it moves by being buried in the body, or when it moves by wind, water, air currents, etc.
그러나 최근에 와서 교통수단과 산업의 발달로 국제교역량이 급증하고 여행자의 왕래가 빈번하게 됨에 따라 많은 종류의 병해충이 인위적인 요인에 의하여 멀리까지 신속하게 이동되고 있다. 일단 외국으로부터 침입한 새로운 병해충은 기후와 환경 조건이 알맞고 기주식물이 풍부할 경우에는 원산지에서보다 더욱 큰 피해를 입히는 실례가 많이 있다. 따라서 새로운 병해충이 유입되었을 때 일어날 수 있는 국가적인 재앙(災殃)을 사전에 방지하여 농림업 생산의 안정화를 이룩하고, 생태계(生態系)를 보호하여 자연을 아름답게 하고 인간생활을 쾌적하게 하기 위해서 다양한 병해충에 대한 식물검역의 필요성이 중요시 되고 있다. 이와 같은 식물검역을 세계 각국이 정부 차원에서 정책적으로 점차 강화하는 근본적인 이유는 새로운 병해충의 침입을 막는 데 소요되는 경비와 불편이, 침입된 병해충을 방제(防除)하는 데 소비되는 비용이나 피해액에 비하면 매우 경제적이기 때문이다.However, recently, with the development of transportation and industry, the volume of international trade has increased rapidly and the coming and going of travelers has become more frequent, and many types of pests and diseases are being quickly transported over long distances by artificial factors. There are many examples of new pests that invade from foreign countries causing greater damage than in their country of origin when the climate and environmental conditions are suitable and host plants are abundant. Therefore, in order to stabilize agricultural and forestry production by preventing national disasters that may occur when new pests are introduced, and to protect the ecosystem to make nature beautiful and human life comfortable, various pests and diseases are prevented. The need for plant quarantine is becoming important. The fundamental reason why countries around the world are gradually strengthening plant quarantine at the government level is that the cost and inconvenience required to prevent the invasion of new pests is compared to the cost and damage incurred to control the invaded pests. Because it is very economical.
슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)는 벼 또는 다른 벼과(gramineae) 식물의 잎집갈변병(sheath brown rot)을 유발한다. 슈도모나스 푸스코바기내에 감염되면 벼과 식물의 잎에서 갈색병반을 나타내거나 낟알의 변색 또는 불임 등의 증상을 보일 수 있다. Pseudomonas fuscovaginae causes sheath brown rot in rice or other gramineae plants. Infection with Pseudomonas fuscobagi may cause symptoms such as brown lesions on the leaves of rice plants, discoloration of grains, or infertility.
한편, 한국등록특허 제1867929호에 슈도모나스 푸스코바기내를 포함하는 다양한 '슈도모나스 속 세균의 동정 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1820088호에 슈도모나스 푸스코바기내의 유사균주인 '토마토의 식물병원균인 슈도모나스 시링게 pv. 토마토 특이적 프라이머 및 이를 이용한 슈도모나스 시링게 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 1867929 discloses various 'methods for identifying bacteria of the genus Pseudomonas' including Pseudomonas fuscova, and Korean Patent No. 1820088 discloses 'Plant pathogens of tomatoes', which are similar strains of Pseudomonas fuscova. In Pseudomonas syringae pv. Tomato-specific primers and a method for detecting Pseudomonas syringae using the same are disclosed, but there is no description of the primer set for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi of the present invention and its use.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)의 ptpI(phage tail protein I) 유전자의 염기서열에 기반한 프라이머 세트를 제작하였고, 상기 제작된 프라이머 세트가 유사균주에 반응하지 않고 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above-mentioned needs, and the present inventors produced a primer set based on the base sequence of the ptpI (phage tail protein I) gene of Pseudomonas fuscovaginae , and the constructed primer set was The present invention was completed by confirming that Pseudomonas fuscobagi can be specifically detected without reacting to similar strains.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 11 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problem, the present invention provides a primer set for specifically detecting Pseudomonas fuscovaginae , including oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 11 and 8.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides the oligonucleotide primer set; It provides a kit for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi, including a reagent for performing an amplification reaction.
또한, 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.Additionally, the present invention includes the steps of isolating genomic DNA from a plant sample; Using the isolated genomic DNA as a template, performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set according to the present invention to amplify the target sequence; and detecting the product of the amplification step. It provides a method for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi, including a.
본 발명의 프라이머 세트는 검역 세균인 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)를 신속 정확하게 검출할 수 있으므로, 슈도모나스 푸스코바기내의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것이다.Since the primer set of the present invention can quickly and accurately detect the quarantine bacterium Pseudomonas fuscovaginae , it will be able to effectively prevent the introduction of Pseudomonas fuscovaginae into the country.
도 1은 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae) ptpI 유전자 시퀀스 정렬 결과 및 슈도모나스 푸스코바기내 검출을 위한 후보 프라이머의 위치를 보여준다.
도 2는 슈도모나스 푸스코바기내 균주(레인 1; 양성대조군)와 유사균주(레인 2~22; 표 4) 시료를 이용한 6개의 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다. N: 음성대조군.
도 3은 슈도모나스 푸스코바기내 균주(레인 1)와 유사균주(레인 2~22; 표 4) 시료를 이용한 후보 프라이머 세트 no. 6의 검증 결과이다. N: 음성대조군.
도 4는 슈도모나스 푸스코바기내 균주(레인 1)와 부생균(saprophyte) 및 유사균주(레인 2~18; 표 5) 시료를 이용한 후보 프라이머 세트 no. 6의 검증 결과이다. N: 음성대조군.
도 5는 슈도모나스 푸스코바기내 균주(레인 1)와 유사균주(레인 2~22; 표 6) 시료를 이용한 후보 프라이머 세트 no. 6의 검증 결과이다. N: 음성대조군.
도 6은 End-point 테스트를 통한 후보 프라이머 세트 no. 6의 검출 한계 분석 결과이다. N: 음성대조군.Figure 1 shows the results of Pseudomonas fuscovaginae ptpI gene sequence alignment and the positions of candidate primers for detection of Pseudomonas fuscovaginae.
Figure 2 shows the verification results of six candidate primer sets using samples of Pseudomonas fuscobagi strain (lane 1; positive control) and similar strains (lanes 2 to 22; Table 4). N: Negative control group.
Figure 3 shows candidate primer set no. This is the verification result of 6. N: Negative control group.
Figure 4 shows candidate primer set no. This is the verification result of 6. N: Negative control group.
Figure 5 shows candidate primer set no. This is the verification result of 6. N: Negative control group.
Figure 6 shows candidate primer set no. through end-point testing. This is the detection limit analysis result of 6. N: Negative control group.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 11 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a primer set for specifically detecting Pseudomonas fuscovaginae , including the oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 11 and 8.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 11 및 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 8의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 11 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. The primer may include an oligonucleotide consisting of a segment of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, or 20 or more consecutive nucleotides in the sequences of SEQ ID NOs: 11 and 8, depending on the sequence length of each primer. there is. For example, the primer (20 oligonucleotides) of SEQ ID NO: 8 may include an oligonucleotide consisting of a segment of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more consecutive nucleotides within the sequence of SEQ ID NO: 8. . In addition, the primer may also include sequences in which the base sequences of SEQ ID NOs: 11 and 8 are added, deleted, or substituted.
본 발명의 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.The oligonucleotide primer of SEQ ID NO: 11 of the present invention is a forward primer, and the oligonucleotide primer of SEQ ID NO: 8 is a reverse primer.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, “primer” refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be copied, and can serve as a starting point for the synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow for initiation of synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the complexity of the DNA or RNA target desired as well as the conditions under which the primer is used, such as temperature and ionic strength.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.In the present specification, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids, Alternatively, it may include an intercalating agent.
본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.The present invention also provides the oligonucleotide primer set; and a kit for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi, including a reagent for performing an amplification reaction.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the kit of the present invention, reagents for performing the amplification reaction may include, but are not limited to, DNA polymerase, dNTPs, and buffer.
본 발명의 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하기 위한 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.The kit for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performance conditions. The guide is a printed material that explains how to use the kit, for example, how to prepare PCR buffer, and the suggested reaction conditions. Instructions include information leaflets in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. Additionally, the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 또한,The present invention also,
식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;isolating genomic DNA from a plant sample;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Using the isolated genomic DNA as a template, performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set according to the present invention to amplify the target sequence; and
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.It provides a method for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi, including the step of detecting the product of the amplification step.
본 발명의 방법은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.The method of the present invention includes isolating genomic DNA from a plant sample. Methods for isolating genomic DNA from the sample can be methods known in the art. For example, the CTAB method can be used, or the Wizard prep kit (Promega) can be used. The target sequence can be amplified by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using a primer set according to an embodiment of the present invention. Methods for amplifying target nucleic acids include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, There are strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among these, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a primer pair that specifically binds to the target nucleic acid using polymerase. These PCR methods are well known in the art, and commercially available kits can also be used.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물 시료는 식물체의 잎, 묘목, 줄기, 과수 또는 종자 등일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 식물체는 바람직하게는 벼과(Gramineae) 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 벼일 수 있으나, 슈도모나스 푸스코바기내에 감염될 수 있는 식물이면 그 종류에 제한이 없다.In the method according to one embodiment of the present invention, the plant sample may be a leaf, seedling, stem, fruit tree, or seed of a plant, but is not limited thereto, and the plant may preferably be a plant of the Gramineae family, and the plant sample may be a plant of the Gramineae family. Preferably, it may be rice, but there is no limit to the type of plant as long as it can be infected with Pseudomonas fuscobagi.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable label. The labeling material may be a material that emits fluorescence, phosphorescence, or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When amplifying a target sequence, if the 5'-end of the primer is labeled with Cy-5 or Cy-3 and PCR is performed, the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. In addition, labeling using a radioactive material may cause radioactivity to be incorporated into the amplification product as the amplification product is synthesized by adding a radioactive isotope such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution during PCR, thereby causing the amplification product to be radioactively labeled.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method for specifically detecting Pseudomonas fuscobagi includes the step of detecting the amplification product, and the detection of the amplification product is performed using a DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, This may be performed through, but is not limited to, radiometric measurements, fluorescence measurements, or phosphorescence measurements. As one of the methods for detecting amplification products, capillary electrophoresis can be performed. Capillary electrophoresis can be performed using, for example, the ABi Sequencer. Additionally, gel electrophoresis can be performed, and gel electrophoresis can use agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In addition, the fluorescence measurement method is to perform PCR by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, and the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling substance, and the labeled fluorescence is measured using a fluorometer. can do. In addition, the radioactivity measurement method involves adding a radioisotope such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution to label the amplification product when performing PCR, and then using a radioactivity measurement device, such as a Geiger counter or liquid scintillation. Radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 슈도모나스 푸스코바기내를 검출하기 위한 프라이머 세트 설계Example 1. Design of a primer set for detecting Pseudomonas fuscobagi
RefSeq(NCBI Reference Sequence Database)에서 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주의 게놈 서열을 다운받은 후 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae) LMG 2158(Accession No. NZ_LT629972.1; Assembly. GCF_900108595.1) 게놈 서열과 비교하여 슈도모나스 푸스코바기내에 특이적이면서 유전자 영역을 포함하는 500 bp 크기의 후보 유전자 268개를 확보하였으며, 상기 후보 유전자 중에서 해당 유전자의 염기서열이 gene ID 정보가 있는 부위이고, 6개의 슈도모나스 푸스코바기내 Reference Sequence 중 최소 4개 이상의 서열에서 공통부위를 가지며, 해당 균주를 제외한 다른 슈도모나스 속 균주에 특이성을 가지는 후보 유전자 10개를 선발하였다. 이 중에서 ptpI(phage tail protein I) 유전자를 타겟으로 하여 슈도모나스 푸스코바기내 특이적 검출을 위한 후보 프라이머 세트를 제작하였다(표 1 및 도 1). After downloading the genome sequence of the Pseudomonas genus strain from RefSeq (NCBI Reference Sequence Database), compare it with the genome sequence of Pseudomonas fuscovaginae LMG 2158 (Accession No. NZ_LT629972.1; Assembly. GCF_900108595.1) We secured 268 candidate genes with a size of 500 bp that are specific to Pseudomonas fuscobagi and include gene regions. Among the candidate genes, the nucleotide sequence of the gene is the region with gene ID information, and 6 reference genes in Pseudomonas fuscobagi Among the sequences, 10 candidate genes that had a common region in at least four sequences and were specific to strains of the Pseudomonas genus other than the strain in question were selected. Among these, a set of candidate primers for specific detection within Pseudomonas fuscobagi was created targeting the ptpI (phage tail protein I) gene (Table 1 and Figure 1).
슈도모나스 푸스코바기내의 ptpI 유전자는 NCBI Reference Sequence NZ_LT629972.1의 2,692,140~2,6922,790 bp, NZ_ALAQ01000073.1의 8,499~9,149 bp, NZ_JH605203.1의 29,121~29,771 bp, NZ_JTBY01000024.1의 14,380~15,010 bp, NZ_JSYZ01000002.1의 61,022~61,652 bp, NZ_AQOH01000312.1의 13,990~14,640 bp에 위치한다.The ptpI gene in Pseudomonas fuscobagi is 2,692,140~2,6922,790 bp in NCBI Reference Sequence NZ_LT629972.1, 8,499~9,149 bp in NZ_ALAQ01000073.1, 29,121~29,771 bp in NZ_JH605203.1, 14,380~15,010 bp of NZ_JTBY01000024.1 , located at 61,022~61,652 bp of NZ_JSYZ01000002.1 and 13,990~14,640 bp of NZ_AQOH01000312.1.
실시예 2. 슈도모나스 푸스코바기내를 검출하기 위한 프라이머 세트의 검증Example 2. Validation of a primer set for detecting Pseudomonas fuscobagi.
상기 실시예 1에서 제작된 6개의 후보 프라이머 세트의 검증을 위해 PCR을 수행하였다. 총 DNA 시료는 DNeasy Plant Mini 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 추출하였으며, PCR은 RT-PCR Premix(PLUTOS, 한국; 이하 P사) 또는 GoTaq® Master Mixes RTPCR Premix(Promega, 한국; 이하 G사)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 수행하였다. PCR 조건은 하기 표 2 및 표 3과 같다. PCR was performed to verify the six candidate primer sets produced in Example 1. Total DNA samples were extracted using the DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Germany), and PCR was performed using RT-PCR Premix (PLUTOS, Korea; hereinafter referred to as Company P) or GoTaq ® Master Mixes RTPCR Premix (Promega, Korea; hereinafter referred to as Company G). It was performed according to the manufacturer's method using . PCR conditions are shown in Tables 2 and 3 below.
2-1.2-1. 슈도모나스 푸스코바기내 종 특이성 확인Confirmation of species specificity within Pseudomonas Fuskova
슈도모나스 푸스코바기내 균주와 표 4의 유사균주를 이용하여 후보 프라이머의 검증을 수행하였다. P사의 PCR premix를 사용하여 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과, 프라이머 세트 no. 1과 6에서 예상되는 크기의 밴드가 가장 강하게 발현된 것을 확인하여, 프라이머 세트 no. 1과 6을 1차 선발하였다(도 2). Verification of candidate primers was performed using Pseudomonas fuscobagi strains and similar strains in Table 4. As a result of performing PCR under the conditions in Table 2 using Company P's PCR premix, primer set no. It was confirmed that bands of the expected size were expressed most strongly in 1 and 6, and primer set no. 1 and 6 were selected in the first round (Figure 2).
그 다음, 다른 PCR premix 제품(G사)과 프라이머 세트 no. 1과 6을 사용하여 표 3의 조건으로 PCR을 수행하였으며, 그 결과 프라이머 세트 no. 6에서 슈도모나스 푸스코바기내 시료에서만 예상되는 크기의 밴드가 강하게 발현되어 가장 특이성이 높게 나타난 것을 확인하였다(도 3).Next, another PCR premix product (G company) and primer set no. PCR was performed using 1 and 6 under the conditions in Table 3, and as a result, primer set no. In 6, it was confirmed that a band of the expected size was strongly expressed only in the Pseudomonas fuscobagi sample, showing the highest specificity (Figure 3).
또한, G사의 PCR premix와 프라이머 세트 no. 6을 사용하여 슈도모나스 푸스코바기내 균주와 부생균(saprophyte) 및 유사균주(표 5 및 표 6)를 대상으로 표 3의 조건(annealing temperature 64℃)으로 PCR을 수행한 결과, 슈도모나스 푸스코바기내 시료에서만 예상되는 크기의 밴드가 강하게 발현된 것을 확인하였다(도 4 및 도 5). In addition, G company's PCR premix and primer set no. As a result of performing PCR under the conditions in Table 3 (annealing temperature 64°C) on Pseudomonas fuskov strains, saprophytes, and similar strains (Table 5 and Table 6) using 6, the Pseudomonas fuskov samples were It was confirmed that a band of the expected size was strongly expressed only in (Figures 4 and 5).
이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트 no. 6은 슈도모나스 푸스코바기내를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트로 최종 선발하였다. 본 발명의 프라이머 세트 no. 6은 NCBI GenBank Accession No. NZ_ALAQ01000073.1의 8,499~9,149 bp에 존재하는 ptpI 유전자를 표적으로 한다.Through this, primer set no. of the present invention. 6 was finally selected as a primer set that can specifically detect Pseudomonas fuscobagi. Primer set no. of the present invention. 6 is NCBI GenBank Accession No. It targets the ptpI gene located at 8,499 to 9,149 bp of NZ_ALAQ01000073.1.
2-2.2-2. End-point 테스트를 통한 프라이머 세트의 검출 한계 분석Detection limit analysis of primer sets through end-point testing
최종 선발된 프라이머 세트 no. 6의 검출 한계를 확인하기 위해, 총 DNA 주형을 10(레인 1), 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8(레인 10) ng의 농도로 달리하여 민감도 분석을 수행하였다. The final selected primer set no. To confirm the detection limit of 6, the total DNA template was 10 (lane 1), 1, 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 , 10 Sensitivity analysis was performed by varying the concentration of -8 (lane 10) ng.
그 결과, 본 발명의 프라이머 세트 no. 6은 10-3 ng의 DNA 농도까지 검출 가능함을 확인하였다(도 6). 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트 no. 6이 슈도모나스 푸스코바기내에 대해 우수한 민감도를 가진 마커임을 알 수 있었다.As a result, primer set no. 6 confirmed that detection was possible up to a DNA concentration of 10 -3 ng (Figure 6). Through this, primer set no. of the present invention. It was found that 6 is a marker with excellent sensitivity for Pseudomonas fuscobagi.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Pseudomonas fuscovaginae and uses thereof <130> PN21484 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggaaaagct caccgtcgc 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tggaaaaggc cctygayctg g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catctacgca tggtacgagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgtcgtcgt gaatgctgag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaaactgct cgaacgtgtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctcgtacca ggcagaaatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acgccgtata ccttcgatgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcactgagga aaagctcacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttacccgcc aacagttctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atgactcagc gccttgtgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cagtggagtc tctgggcttc 20 <110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Pseudomonas fuscovaginae and uses it <130> PN21484 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggaaaaagct caccgtcgc 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tggaaaaggc cctygayctg g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catctacgca tggtacgagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgtcgtcgt gaatgctgag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaaactgct cgaacgtgtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctcgtacca ggcagaaatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acgccgtata ccttcgatgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcactgagga aaagctcacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttacccgcc aacagttctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atgactcagc gccttgtgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cagtggagtc tctgggcttc 20
Claims (5)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae)를 특이적으로 검출하는 방법.isolating genomic DNA from a plant sample;
Amplifying a target sequence by performing an amplification reaction using the isolated genomic DNA as a template and using the oligonucleotide primer set according to claim 1; and
A method for specifically detecting Pseudomonas fuscovaginae, comprising: detecting the product of the amplification step.
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| Hitendra Kumar Patel et al., BMC Microbiology, 14:274, 2014. |
| Martine Bangratz et al., PLOS ONE, 15(4), e0232115, 2020. |
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