KR102607001B1

KR102607001B1 - 감에서 분리된 고 분자량 다당류를 포함하는 다당류 조성물 및 이의 다양한 용도

Info

Publication number: KR102607001B1
Application number: KR1020210039759A
Authority: KR
Inventors: 황기철
Original assignee: 황기철
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-11-30
Also published as: KR20220134724A

Abstract

본 발명은 감에서 분리된 고 분자량 다당류를 포함하는 다당류 조성물 및 이의 다양한 용도에 관한 것으로, 특정 고 분자량 다당류를 포함함으로서 항염증, 주름개선, 항산화 효과가 우수한 다당류 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물, 약학 조성물 등 다당류 조성물의 다양한 용도를 제공할 수 있다.

Description

감에서 분리된 고 분자량 다당류를 포함하는 다당류 조성물 및 이의 다양한 용도{Polysaccharide composition containing high molecular weight polysaccharide isolated from persimmon and various uses thereof}

본 발명은 다당류 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 감에서 분리된 고 분자량 다당류를 포함하는 다당류 조성물 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.

피부는 장벽 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 하여 유해한 이물질로부터 우리를 보호하고 온도를 조절하고 수분 부족/과다를 방지하여 내부 환경을 조절한다. 그것은 표피, 진피 및 피하의 세 가지 주요 층으로 구성된다. 이 중 피부의 대부분을 차지하는 진피는 크게 물리적 성분과 세포 성분으로 나눌 수 있다. 진피의 물리적 구성 요소는 콜라겐, 엘라스틴, 세포 외 기질 및 효소로 구성되는 반면 세포 구성 요소에는 섬유아세포, 대식세포 및 비만 세포가 포함된다. 진피는 피부 지원 및 보호, 체온 조절, 감각 및 조직 회복 및 재생 동안 염증 반응과 같은 중요한 역할을 한다. 따라서 건강한 피부를 유지하고 노화 및 여러 질병으로부터 피부 손상을 보호한다. 합성 물질은 화장품의 주요 성분으로 널리 사용된다. 그러나 최근에는 화장품의 주요 활성 성분으로 많은 천연 화합물이 적용되었다. 최근 스킨케어 관심사는 화장품 및 화장품에서 새로운 천연 원과 그 추출물의 식별 및 적용에 초점을 맞추고 있다. 고대부터 화장품은 피부 위생과 건강을 유지하기 위해 사용되었다. 그러나 최근의 화장품 사용 개념은 건강한 피부를 유지하는 것뿐만 아니라 여러 피부 관련 질환을 치료하고 피부 노화를 예방하는 것이다. 21세기 초부터 천연 원료와 그 추출물은 합성 물질에 비해 독성과 자극성이 적고 부작용이 적기 때문에 화장품의 주성분과 부성분으로 점점 더 많이 사용되고 있다. 많은 약용 식물은 폴리페놀, 플라보노이드, 테르페노이드, 리그닌, 탄닌 및 알카로이드와 같은 약학적 활성 성분으로 인해 피부 건강에 유익한 영향을 미치는 것으로 간주된다. 그러나, 이러한 저 분자량 화합물과 달리, 피부 건강에 대한 천연 공급원으로부터 분리된 고 분자량 화합물, 특히 다당류의 효과는 광범위하게 조사되지 않았다. 최근에는 피부에 미치는 유익한 효과로 인해 다당류가 화장품 제제 제조에 점점 더 많이 사용되고 있다.

Ebenaceae과에 속하는 감 (Diospyros kaki)은 전 세계에서 재배되는 친숙하고 널리 퍼진 과일이다. 감의 펄프는 ferulic acid, p-coumaric acid 및 gallic acid를 포함한 생리 활성 폴리페놀뿐만 아니라 cis-mutatoxanthin, antheraxanthin, zeaxanthin, neolutein, cryptoxanthins, α-carotene, β-carotene 및 β- 크립토잔틴의 지방산 에스테르 등을 포함한다. 이러한 활성 화합물로 인해 감은 항산화, 항 유전 독성, 항-비만, 지질 저하, 항 콜레스테롤과 같은 다양한 생리적 특성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 감, 특히 감에서 분리된 다당류에서 고 분자량 화합물의 약리학적 활성을 조사하는 연구는 제한적이며, 감의 다당류가 피부 기능 개선 및 미용제로서의 적용에 미치는 영향은 현재까지 보고되지 않았다. 따라서 본 발명자들은 감에서 저 분자량 및 고 분자량 분획을 분리하고 분자 특성화를 수행하여, 고 분자량 분획물인 다당류가 피부에 미치는 다양한 약리학적 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

등록특허문헌 제10-1790618호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 감에서 분리한 특정 고 분자량 다당류를 포함함으로서 항-염증, 주름개선, 항산화 효과가 우수한 다당류 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 다당류 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선, 주름 개선용, 항산화용 식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 다당류 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선, 주름 개선용, 항산화용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 다당류 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 고 분자량 다당류를 포함하는 다당류 조성물을 제공한다.

상기 다당류 조성물은 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 감 또는 감 추출물에서 분리된 다당류일 수 있다.

상기 감 추출물을 추출하기 위한 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 1,3-부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있다. 상기 알코올은 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 및 부탄올 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이 사용될 수 있다. 상기 알코올은 바람직하게는 50 내지 95%(v/v), 더욱 바람직하게는 70 내지 95%(v/v) 알코올일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 감 추출물은 다당류를 포함할 수 있고, 상기 다당류 외에 중성 당, 우론산, 폴리페놀 등을 포함할 수 있다.

상기 다당류는 저 분자량 다당류, 고 분자량 다당류를 모두 포함할 수 있다.

상기 고 분자량 다당류는 아라비노스(Ara), 자일로스(Xyl), 람노스(Rha), 퓨코스(fucose), 만노스(Man), 갈락토스(Gal), 글루코스(Glc), 갈락투로닉 산(Galacturonic acid, GalA), 글루쿠로닉 산(glucuronic acid) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 다당류는 각각 다음과 같은 몰%(Mole %)로 포함될 수 있다: 만노스 0.5 내지 3.5 몰%, 람노스 1 내지 5 몰%, 갈락투로닉 산 70 내지 80 몰%, 글루코스 4 내지 6 몰%, 갈락토스 5 내지 10 몰%, 자일로스 1 내지 5 몰%, 아라비노스 5 내지 10 몰%.

본 발명의 일 실시예에서 상기 다당류는 각각 다음과 같은 몰%(Mole %)로 포함될 수 있다: 만노스 1 내지 3 몰%, 람노스 2 내지 3 몰%, 갈락투로닉 산 70 내지 77 몰%, 글루코스 4.5 내지 5.5 몰%, 갈락토스 6.5 내지 7.5 몰%, 자일로스 2.5 내지 3.5 몰%, 아라비노스 7 내지 8 몰%.

본 발명의 일 실시예에서 상기 다당류는 각각 다음과 같은 몰%(Mole %)로 포함될 수 있다: 만노스 2.2±0.8 몰%, 람노스 2.3±0.0 몰%, 갈락투로닉 산 73.2±2.1 몰%, 글루코스 5.0±0.3 몰%, 갈락토스 7.1±0.3 몰%, 자일로스 2.9±0.3 몰%, 아라비노스 7.4±0.4 몰%.

상기 다당류 조성물은 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용, 주름 개선용, 항산화용일 수 있다.

상기 염증 질환은 아토피 피부염, 여드름, 건선, 부비동염, 비염, 결막염, 천식, 피부염, 염증성 콜라겐 혈관질환, 사구체신염, 뇌염, 염증성 장염, 과민성 대장 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 패혈증, 패혈성 쇼크증, 폐섬유증, 관절염, 염증성 골용해, 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 염증성 장 질환, 관절염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 골관절염, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임병(Lyme disease), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 루프스, 동창성 루프스, 결핵성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크론병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파키슨병, 및 다발성경화증 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 주름 개선은 피부에 나타나는 주름을 개선 또는 주름 생성 억제 또는 예방을 모두 포함할 수 있고, 노화 또는 수분 부족, 상처에 의한 주름 등을 모두 포함한다. 또한, 상기 주름은 제한되는 것은 아니나, 일 예로 이마, 눈가, 입가 등에 나타나는 주름을 의미할 수 있다.

상기 항산화는 산화를 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 구체적으로, 활성산소종(ROS) 제거, ABTS 및 DPPH 자유 라디칼 소거, 산화질소 생성 억제 작용 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 다당류 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용, 주름 개선용, 항산화용 식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은 당 업계에서 식품을 제조하기 위해 통상적으로 사용하는 향미제, 풍미제, 안정화제, 증점제, 방부제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있고, 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 알지네이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 말토덱스트린, 이산화규소, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물 조성물은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐,과자, 등의 형태로 제조될 수 있다. 특히 이너뷰티용 식품으로도 활용할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 또는 건강기능식품 조성물 조성물은 섭취 대상의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 투여시간, 유효성분의 함량, 질환의 중증도 등에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 섭취 횟수는 1일 1회 또는 2회, 격일마다, 격주마다, 격월 등의 방식으로 섭취할 수 있다.

본 발명은 상기 다당류 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용, 주름 개선용, 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 다당류 이외에 당 업계에서 화장료 조성물을 제조할 때 통상적으로 사용하는 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 스킨소프너, 토너, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있으며, 당 업계에서의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 다당류 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 다당류 이외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 붕해제, 결합제, 활택제, 결합제, 향료 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 당 업계에서 제제화에 통상적으로 사용되는 방법으로 정제, 캡슐, 서방형 제제, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 단위 투약 주사제 앰플, 현탁액 등의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여 방식은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 골수내 투여, 경막내 투여, 심장내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 장관 투여, 구강 및 설하는 포함하는 국소 투여, 직장 투여, 국소 투여, 진피 투여, 점막 투여, 척추내 투여 등의 방법으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 경구 투여일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 투여 시 각 투여 방식에 절절한 제형으로 제제화되어 투여될 수 있으며, 제제화는 당 업계에서 널리 알려져 있는 방법으로 제제화될 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여 대상의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 투여 횟수는 1일 1회 또는 2회, 격일마다, 격주마다, 격월 등의 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 감에서 분리된 고 분자량 다당류를 포함하는 다당류 조성물 및 이의 다양한 용도에 관한 것으로, 특정 고 분자량 다당류를 포함함으로서 항염증, 주름개선, 항산화 효과가 우수한 다당류 조성물 및 이를 포함하는 식품(또는 건강기능식품) 조성물, 화장료 조성물, 약학 조성물 등 다당류 조성물의 다양한 용도를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 감 추출물에서 분리된 분획의 (a) RAW 264.7 세포의 생존력, (b) 산화 질소, (c) 종양 괴사 인자-알파, (d) 인터루킨-6 및 (e)의 억제에 미치는 영향 LPS-유도 RAW 264.7 세포에서 단핵구 화학 유인 단백질 -1 생산량을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 감 추출물에서 분리된 분획이 TNF-α 및 IFN-γ 유도 HaCaT 세포에서 (a) HaCaT 세포의 생존력과 (b) 인터루킨-6 및 (c) 인터루킨-8의 억제에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 감 추출물에서 분리된 분획이 HDFa에서 (a) 인간 진피 섬유 아세포 (HDFa)의 생존력과 (b) 메탈로프로테이나제-1 (MMP-1)의 억제에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 고성능 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 감 추출물에서 분리된 고 분자량 분획 (DK-H)의 분자량 측정결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 감 추출물의 제조 및 분별

2020년 상주군 (대한민국, 경북)에서 수확한 생감은 산주 아람 곶감 농업 협회 (대한민국 경북)에서 얻은 것이다. 감은 실온에서 50-60일 동안 건조되었다. 건조된 감 (3kg)을 물로 씻어 표면의 불순물을 제거한 다음, 3.96kg의 1,3-부틸렌글리콜 (JB Chem, Seoul, South Korea)을 첨가한 정제수 36.64L에 담갔다. 추출은 107℃에서 4 시간 동안 환류하여 상용 바이오 피드백 추출기 (대한미디어 (주), 경기도)에서 수행하였으며, 마지막으로 °Brix가 11.7인 DK를 얻었다. DK의 저 분자량 분획과 고 분자량 분획은 약간의 수정을 가하여 앞서 설명한 바와 같이 에탄올 분별법을 사용하여 얻었다. 구체적으로는 95% 에탄올 4 부피 (v/v)를 DK에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 교반하고, 원심 분리 (7,000 × g, 20 분, 4℃) 후, 상청액과 침전물을 분리하였다. 상층액을 회전식 증발기 (Eyela, Tokyo, Japan)에서 40℃에서 증발시킨 후 동결 건조기 (Ilshin Biobase Co., Ltd., Dongducheon, South Korea)를 사용하여 동결 건조하였다. 침전물을 소량의 물로 희석하고 투석 튜브 셀룰로오스 멤브레인 (MWCO 12,000-14,000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 투석하여 저 분자량 화합물을 제거하였다. 투석된 물질을 증발시킨 다음 상청액에 사용된 것과 동일한 절차에 따라 동결 건조시켰다. 건조된 상층액과 DK에서 분리된 침전물을 각각 DK-L (저 분자량 분획) 및 DK-H (고 분자량 분획)로 명명하였다.

<실험예> 하기의 실험예에서 수행된 각 과정은 다음과 같이 진행되었다.

- 분자량 결정

샘플의 분자량은 Agilent 1200 ELSD (Agilent Technologies)가 장착된 Agilent 1120 시리즈 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)을 사용하여 측정되었다. 샘플은 순수한 물의 이동상을 사용하여 Superdex 200 증가 10/300 GL 컬럼 (300 × 10 mm, 8.6 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, 스웨덴 웁살라)의 고정상에서 1.1mL/min 유속으로 분리되었다. 샘플의 분자량은 분자량 (p-180, p-41400, p-62600, p-144000, p-345000)에 따라 다양한 크기의 풀루란을 측정하여 얻은 검량선을 사용하여 계산하였다.

- RAW 264.7 쥐 대식세포를 사용한 세포 독성 및 항-염증 활성 평가

RAW 264.7 세포 (한국 세포주 은행; KCLB 서울, 대한민국)는 10% 소 태아 혈청 (FBS; Gibco)과 100U 페니실린/100 μg/mL 스트렙토마이신 (P/S; Gibco)을 함유하는 DMEM (Gibco, Bleiswijk, Nethelands)에서 유지되었고, 5% CO2 및 95% 습도에서 37℃에서 2 ~ 3 일마다 계대 배양하였다. 밀도가 2 x 10⁵ cells/mL (200 μL) 인 세포는 70%-80% confluency가 달성될 때까지 96-well plate에 시드되었다. 이후 배양액을 제거하고 P/S가 포함된 160μL의 무 혈청 DMEM과 20μL의 시료 용액을 세포에 첨가하였다. 30분 후, 10 μg/mL의 대장균 지질 다당류 (LPS; Sigma-Aldrich, 미국 미주리 주 세인트루이스)를 첨가한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 테스트 샘플의 세포 독성을 측정하기 위해 배양 배지를 제거하고 앞서 설명한대로 MTT (Life Technologies Co., Eugene, OR, USA) 분석을 수행하였다. 샘플의 항-염증 활성을 측정하기 위해, NO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), TNF-α (ThermoFisher Scientific), IL-6 (BD Biosciences, Torreyana Rd., 샌디에고, 캘리포니아, 미국) 및 MCP-1 (BD Biosciences) 수준은 Griess 분석 또는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)을 사용하여 배양 배지에서 결정되었다.

- HaCaT 인간 케라티노사이트를 이용한 항-아토피 활성 평가

HaCaT 세포 (CLS Cell Line Service, Eppelheim, Heidelberg, Germany)를 RAW 264.7 세포와 동일한 배지 및 조건에서 배양하고 유지하였다. 밀도가 1 x 10⁵ cells/mL (200 μL) 인 세포를 96-well plate에 70-80% confluency까지 파종하였다. 배양 배지를 무 혈청 DMEM으로 교체하고 24 시간 동안 배양하여 세포가 혈청이 결핍되도록 하였다. 그런 다음 테스트 샘플 (180 μL)을 포함하는 신선한 무 혈청 DMEM을 세포에 첨가하였다. 1 시간 후, TNF-α와 IFN-γ (TNF + IFN, 각각 10ng/mL)의 혼합물 20μL를 세포에 첨가한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 테스트 샘플의 세포 독성은 MTT 분석을 사용하여 측정되었고, IL-6 및 IL-8 (BD Biosciences)과 같은 아토피 관련 매개체는 ELISA를 사용하여 배양 배지에서 측정되었다.

- HDF, 인간 진피 섬유아세포를 이용한 주름 개선 활성 평가

HDFa (American Tissue Culture Collection, Manassas, VA, USA)는 2% FBS, 0.1% 재조합 인간 인슐린, 0.1% 겐타마이신 황산 암포테리신 B 및 0.1% 재조합 인간 섬유 아세포 성장 인자-B과 같은 성장 보조제 (Lonza)를 포함하는 섬유아세포 기저 배지 (Lonza, Verviers, Belgium)에서 배양되었다. 5 x 10⁴ cells/mL (200 μL) 밀도의 세포를 80-85% 합류가 될 때까지 96 웰 플레이트에 시드하였다. 배양 상청액을 시험 샘플을 함유하는 200 μL의 무 혈청 DMEM으로 대체 하였다. 24 시간 배양 후, MTT 분석을 사용하여 시험 샘플의 세포 독성을 측정하고, ELISA를 사용하여 배양 상청액에서 주름 형성 매개체인 MMP-1 (R&D Systems)의 수준을 결정하였다.

- 통계 분석

결과는 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였다. PASW Statistics 18 (IBM Co., Armonk, NY, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 차이는 Student's t-test 또는 one-way ANOVA에 이어 post-hoc Tukey의 테스트로 평가되었다. 0.05 미만의 p- 값 임계값은 유의미한 것으로 간주되었다.

<실험예 1> 감 추출물의 구성 및 당 성분 분석

샘플의 중성 당, 우론산, 폴리페놀 함량과 같은 일반적인 조성은 Gal, GalA 및 갈산의 표준 참조를 사용하여 phenol-sulfuric acid, m-hydroxibiphenyl 및 Folin-Ciocal-teu 방법으로 분석되었다. 샘플의 구성 당은 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템 (Ag-ilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 단당류의 PMP 유도체화를 통해 역상 -HPLC 방법에 의해 결정되었다. DAD, Agilent Technologies). PMP 유래 단당류는 0.1M 인산염 완충액 (pH 6.7) 및 아세토니트릴 (83:17, v/v)로 구성된 이동상을 사용하여 YMC Triart C18 컬럼 (250 × 4.6 mm, 5 μm; YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)의 고정상에서 유속 1mL/min로 분리되었다. 성분 당을 결정하는 데 사용된 Ara, Xyl, Rha, fucose, Man, Gal, Glc, GalA 및 글루쿠로닉 산(glucuronic acid)과 같은 표준 참조는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

감 추출물 (DK)의 피부 생리 활성을 높이기 위해 저 분자량 분획과 고 분자량 분획 (각각 DK-L 및 DK-H)을 분리하였다. 중성 당, 우론산, 폴리페놀 함량을 포함한 분획의 일반적인 조성은 표 1에 나타나 있다. DK 및 DK-L은 주로 중성 당으로 구성되어 있는 반면, DK-H는 중성 당 (460.6 mg/g) 및 우론산 (436.9 mg/g)이 풍부하였다. 흥미롭게도 DK-H는 DK 또는 DK-L보다 훨씬 더 많은 양의 우론산을 함유하고 있다. 또한 폴리페놀 함량은 다른 샘플보다 DK-H (109.6 mg/g)에서 유의하게 높았다.

감 추출물 (DK) 및 저 분자량 및 고 분자량 분획 (각각, DK-L 및 DK-H)의 화학 성분

샘플	중성 당 (mg Gal ¹ equivalent/g)	우론산 (mg GalA ² equivalent/g)	폴리페놀 (mg GA ³ equivalent/g)
DK	230.3±4.9^b	27.7±0.2^b	1.9±0.6^b
DK-L	210.1±2.7^c	16.8±0.3^b	0.7±0.2^b
DK-H	460.6±7.6^a	436.9±13.2^a	109.6±5.0^a

¹Galactose, ²Galacturonic acid, ³Gallic acid. 다른 위 첨자는 Tukey의 검정을 사용하여 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p < 0.05).

<실험예 2> 본 발명에 따른 감 추출물의 항산화 및 엘라스타제 억제 활성 평가

본 발명에 따른 감 추출물의 항산화 및 엘라스타제 억제 활성을 평가하기 위해 다음과 같은 방법으로 평가하였다. 구체적으로는 분류된 샘플의 항산화 억제 활성은 ABTS 및 DPPH 자유 라디칼 소거 분석과 FRAP 분석으로 측정한 반면, 엘라스타제 억제 활성은 이전에 Kim 등(In vitro anti-wrinkle and skin-moisturizing effects of evening primrose (Oenothera biennis) sprout and identification of its active components. Processes 2021, 9, 145)이 보고한 바와 같이 엘라 스타제 억제제 분석으로 평가하였다.

샘플의 항산화 및 엘라스타제 억제 활성에 해당하는 결과는 표 2에 나타나있다. 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 및 2,2-diphenyl- DK-H (각각 IC₅₀, 0.5 및 1.5 μg/mL)의 1-피크릴히드라질 (DPPH) 라디칼 소거 활성은 DK (각각 IC₅₀, 10.3 및 17.1 μg/mL) 및 DK-L 보다 유의하게 높은 것으로 나타났다(각각 IC₅₀, 24.0 및 32.8 μg/mL). 또한 DK-H (2203.8mmol/g)의 FRAP (ferric 환원 항산화력) 활성은 DK (65.6mmol/g) 및 DK-L (19.2mmol/g)보다 유의하게 높았다. 또한 DK-H의 in vitro 엘라스타제 억제 활성은 DK (IC₅₀, 647.1 μg/mL)보다 IC₅₀ 값이 8.1 μg/mL로 유의하게 더 높은 것으로 나타났다.

감 추출물 (DK)과 저 분자량 및 고 분자량 분획 (각각 DK-L 및 DK-H)의 항산화 및 엘라스타제 억제 활성

Sample	ABTS ¹ (IC ₅₀ ⁴ ,μg/mL)	DPPH ² (IC ₅₀ , μg/mL)	FRAP ³ (mmol/g)	Elastase inhibition (IC ₅₀ ,μg/mL)
DK	10.3±0.2^b	17.1±2.7^b	65.6±1.6^b	647.1±68.6^a
DK-L	24±0.4^a	32.8±3.1^a	19.2±2.6^b	n.d.
DK-H	0.5±0.0^c	1.5±1.6^c	2203.8±70.8^a	8.1±1.1^b

¹2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ²2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, ³ Ferric 환원 항산화력, 4: Half 최대 억제 농도. 다른 위 첨자는 Tukey의 검정을 사용하여 그룹간에 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).<실험예 3> 본 발명에 따른 감 추출물의 세포 독성 및 항-염증 활성 평가

본 발명에 따른 감 추출물의 세포 독성 및 항-염증 활성을 평가하기 위해 하기와 같이 실험을 진행하였고, 결과는 도 1에 도시하였다. 배양 배지와 지질 다당류 (LPS; 1μg/mL)는 각각 음성 대조군 (NC) 및 염증 유발 대조군 (LPS)으로 사용되었고, 덱사메타손 (20 μg/mL) 처리 후 LPS 유도를 양성 대조군 (PC)로 사용하였다. DK, DK-L 및 DK-H는 각각 감 추출물 및 이의 저 분자량 및 고 분자량 분획을 의미한다. 그룹 간의 통계적 차이는 Student's t-test로 분석되었다. 별표는 샘플과 LPS 처리 대조군 사이의 유의한 차이를 나타낸다. 크로스 해칭 패턴은 동일한 농도에서 DK와 DK-H 간의 유의한 차이를 나타낸다. * 및 #, p <0.05; ** 및 ##, p <0.01; *** 및 ###, p <0.001.

실험결과, RAW 264.7 세포에 대한 분획 샘플의 세포 독성 효과는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석으로 평가되었다 (도 1a). 1, 10 또는 100 μg/mL에서 어떤 샘플도 RAW 264.7 세포에 독성 영향을 미치지 않았다. 또한, DK-H는 동일한 용량의 DK에 비해 10 또는 100 μg/mL (LPS 유도 대조군에 대해 118.5% 및 121.1%)에서 세포의 생존력을 크게 증가시켰다. LPS-유도 RAW 264.7 세포에서 방출된 전 염증 매개체에 대한 샘플의 억제 활성은 도 1b-e에 도시되었다. 도 1b에서 볼 수 있듯이, LPS 처리 대조군과 비교하여 모든 그룹에서 산화질소 (NO) 생성의 유의한 억제가 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 특히, 억제는 DK 또는 DK-L 처리된 세포보다 DK-H 처리된 세포에서 유의하게 더 높았다 (1-100 μg/mL 용량에서 LPS 처리된 대조군에 비해 -46.6%). 또한, NO 생성의 개시는 모든 용량에서 DK로 처리된 세포보다 DK-H로 처리된 세포에서 유의하게 더 높았다. 또한, 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 생산의 감소는 LPS 처리된 대조군 세포와 비교하여 1 또는 10 μg/mL에서 DK, DK-L 또는 DK-H로 처리된 세포에서 유의미하지 않았다 (도 1c). 그러나, LPS 처리된 대조군에 비해 100 μg/mL DK (-17.9%) 또는 DK-H (-87.4%) 처리된 그룹에서 TNF-α 생성의 상당한 억제가 관찰되었다. 특히 DK-H의 TNF-α 억제 활성은 DK보다 유의하게 높았다. 인터루킨-6 (IL-6) 억제의 결과는 도 1d에 도시하였다. LPS 처리 대조군과 비교하여 100μg/mL DK (-17.6%)로 처리한 세포에서 IL-6 생성의 현저한 억제가 관찰되었지만, 10 또는 100μg/mL DK-H로 처리된 그룹에서 IL-6 생성의 가장 우세한 억제가 관찰되었다(각각, -33.7% 및 -99.6%). 단핵구 화학 유인 단백질-1 (MCP-1) 억제의 결과는 도 1e에 나타나있다. MCP-1 생산의 유의한 감소는 LPS 처리된 대조군과 비교하여 10 또는 100 μg/mL DK-H 처리 그룹 (-48.3% 및 -98.0%)에서만 관찰되었다.

<실험예 4> 본 발명에 따른 감 추출물의 항-아토피 활성 평가

본 발명에 따른 감 추출물의 항-아토피 활성 평가하기 위해 하기와 같이 실험을 진행하였고, 결과는 도 2에 나타내었다. 배양 배지 및 TNF-α + IFN-γ (각각 10 ng/mL)는 각각 음성 대조군 (NC) 및 아토피 유도 대조군으로 사용되었다. 덱사메타손 (20μg/mL)으로 처리한 후 세포의 TNF + IFN 자극을 양성 대조군 (PC)으로 사용하였다. DK, DK-L 및 DK-H는 각각 감 추출물과 저 분자량 및 고 분자량 분획을 의미한다. 그룹 간의 통계적 차이는 Student's t-test로 분석되었다. 별표는 각 샘플과 LPS 처리 대조군 사이의 유의한 차이를 나타낸다. 크로스 해칭 패턴은 동일한 농도에서 DK와 DK-H 간의 유의한 차이를 나타낸다. * 및 #, p <0.05; ** 및 ##, p <0.01; *** 및 ###, p <0.001.

TNF-α 및 인터페론-γ (IFN-γ)로 처리된 HaCaT 세포에 대한 테스트 샘플의 세포 독성 효과는 도 2a에 도시하였다. MTT 분석은 샘플이 실험된 농도에서 세포 독성 효과가 없음을 보여준다. 또한 DK (각각 10 및 100 μg/mL에서 12.8% 및 30.3% 증가), DK-L (1-100 μg/mL에서 10.0 내지 19.0% 증가)으로 처리된 그룹에서 세포 생존력의 상당한 증가가 관찰되었다. 또는 DK-H (각각 1 및 10 μg/mL에서 24.3% 및 119.4%)는 TNF-α 및 IFN-γ (TNF + IFN) 처리된 대조군과 비교하였다. IL-6 및 인터루킨-8 (IL-8) 생산에 대한 샘플의 억제 효과는 각각 도 2b와 c에 도시되었다. 도 2b에서 볼 수 있듯이 IL-6 생성은 10 및 100 μg/mL (각각 -27.3% 및 -121.4%)에서 DK 처리에 의해 현저하게 억제되었지만 TNF + IFN 처리에 비해 1 μg/mL에서는 억제되지 않았습니다. IL-6 생산은 모든 농도에서 DK-L (-35.2% 내지 -40.7%) 및 DK-H (-92.9% 내지 -172.3%) 처리에 의해 유의하게 억제되었다. 특히 IL-6의 억제는 다른 시료에 비해 모든 농도의 DK-H에서 더 우수하였다. IL-8 생산에 대한 샘플의 억제 효과는 도 2c에 도시되었다. 결과는 IL-8 생성이 모든 농도의 DK-H (각각 1, 10 및 100 μg/mL에서 -135.5%, -50.8%, -157.8% 및 -135.5%)에서 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 또한, TNF + IFN 처리된 대조군과 비교하여 100μg/mL의 DK (-27.5%)에서 IL-8 생성의 현저하게 억제되었다.

<실험예 5> 본 발명에 따른 감 추출물의 주름 개선 효과 평가

본 발명에 따른 감 추출물의 주름 개선 효과를 평가하기 위해 인간 진피 섬유아세포 (HDFa)를 사용하여 하기와 같이 실험을 진행하였다. 배양 배지와 레티노산 (2μg/mL)을 각각 음성 대조군 (NC)과 양성 대조군 (PC)으로 사용하였다. DK, DK-L 및 DK-H는 각각 감 추출물과 저 분자량 및 고 분자량 분획을 의미한다. 그룹 간의 통계적 차이는 Student 's t-test로 분석되었다. 별표는 각 샘플과 LPS 처리 대조군 사이의 유의한 차이를 나타낸다. 크로스 해칭 패턴은 동일한 농도에서 DK와 DK-H 간의 유의한 차이를 나타낸다. * 및 #, p <0.05; ** 및 ##, p <0.01; *** 및 ###, p <0.001.

실험 결과, MTT 분석은 주름 방지 활성을 평가하는데 사용된 농도가 세포 독성이 아님을 확인하였다 (도 3a). NC 그룹과 비교하여 DK 및 DK-L의 농도에서 세포 생존력의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나 10 및 100 μg/mL의 용량에서 DK-H는 NC 그룹에 비해 세포 생존력 (각각 + 16.7% 및 + 64.7%)을 크게 증가되었다. 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP-1) 생산에 대한 샘플의 효과는 도 3b에 나타나있다. DK- 처리는 10 및 100 μg/mL 농도 (각각-36.1% 및 -71.5%)에서 MMP-1 수준을 유의하게 감소시켰지만 NC 그룹과 비교할 때 1 μg/mL에서는 거의 감소되지 않았다. 또한, 모든 농도의 DK-L (-25.8% 내지 -31.8%) 및 DK-H (-68.6% 내지 -98.6%)에서 MMP-1 생산의 유의한 억제가 관찰되었다. 결과는 MMP-1 발현에 대한 DK-H의 억제 효과가 다른 샘플보다 우수하다는 것이 확인되었다.

<실험예 6> 본 발명에 따른 감 추출물의 구성 당 및 분자 특성 평가

본 발명에 따른 감 추출물의 당 구성 및 분자 특성을 평가하기 위해 다음과 같이 실험을 진행하였고, 결과는 도 4에 나타내었다. 생리학적으로 가장 활동적인 시료인 DK-H는 상세한 화학적 조성 분석을 거쳤다. 화학 성분 분석 결과 (표 1)를 바탕으로 가장 풍부한 성분인 DK-H의 당 성분을 분석하였다. DK-H는 Superdex 200 Increase 10/300 GL 패킹 컬럼과 ELSD (evaporative light scattering detector)가 장착된 크로마토그래피 시스템에 로드되었다. 분자량이 다른 풀루란 표준 (p-180, p-41400, p-62600, p-144000 및 p-345000)을 사용하여 검량선을 작성하였다.

단당류의 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론 (PMP) 유도체화를 통한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석 결과 DK-H는 아라비노스 (Ara), 갈락토스 (Gal), 포도당 (Glc), 자일로스 (Xyl), 람노스 (Rha) 및 만노스 (Man)를 포함하는 소량의 중성 당(각각 7.4, 7.1, 5.0, 2.9, 2.3 및 2.2 몰%, 표 3)을 포함하는 다량의 우론산, 갈락투론산 (GalA, 73.2 몰%)을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 또한, DK-H의 분자량 측정 분석 결과 평균 분자량이 532 kDa 인 거대 분자를 주로 포함하고 있는 것으로 나타났고 (도 4), DK 및 DK-L은 주로 분자량이 1,000 Da 미만인 저 분자량 화합물(데이터가 표시되지 않음)로 구성된다.

고성능 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 감 추출물에서 분리된 고 분자량 분획 (DK-H)의 당 조성 분석 결과

샘플	DK-H (Mole%)
Mannose	2.2±0.8
Rhamnose	2.3±0.0
Glucuronic acid	-
Galacturonic acid	73.2±2.1
Glucose	5.0±0.3
Galactose	7.1±0.3
Xylose	2.9±0.3
Arabinose	7.4±0.4
Fucose	-

분획의 항산화 활성을 비교했을 때, DK-H 처리는 DK 처리보다 ABTS 및 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 분석에서 IC₅₀ 값이 21.6 배 및 11.4 배 더 낮았고 FRAP 활성 분석에서 33.6 배 더 높은 값을 나타냈다. 이러한 결과는 DK가 DK-H로 분별될 때 항산화 활성이 급격히 증가한다는 것을 보여 주었으며, 이는 DK-H가 감과에서 항산화제 합성을 위한 새로운 성분으로 활용될 수 있음을 시사한다.

결과는 DK-H 처리가 DK 또는 DK-L 처리에 비해 LPS 유도 RAW 264.7 세포에서 전 염증 매개체 수준을 현저히 감소 시켰음을 보여주었다.

DK 및 DK-L에 비해 모든 시험 농도에서 DK-H 처리에 의해 IL-6 및 IL-8의 생성이 유의하게 억제되어 DK의 항 아토피 활성이 증가하였다.

Claims

감에서 분리된 다당류를 포함하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다당류는 아라비노스, 자일로스, 람노스, 퓨코스, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 갈락투로닉 산 및 글루쿠로닉 산 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다당류는 만노스 0.5 내지 3.5 몰%, 람노스 1 내지 5 몰%, 갈락투로닉 산 70 내지 80 몰%, 글루코스 4 내지 6 몰%, 갈락토스 5 내지 10 몰%, 자일로스 1 내지 5 몰%, 아라비노스 5 내지 10 몰%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다당류는 만노스 2.2±0.8 몰%, 람노스 2.3±0.0 몰%, 갈락투로닉 산 73.2±2.1 몰%, 글루코스 5.0±0.3 몰%, 갈락토스 7.1±0.3 몰%, 자일로스 2.9±0.3 몰%, 아라비노스 7.4±0.4 몰%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 화장료 조성물.
감에서 분리된 다당류를 포함하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 식품 또는 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 다당류는 아라비노스, 자일로스, 람노스, 퓨코스, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 갈락투로닉 산 및 글루쿠로닉 산 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 식품 또는 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 다당류는 만노스 0.5 내지 3.5 몰%, 람노스 1 내지 5 몰%, 갈락투로닉 산 70 내지 80 몰%, 글루코스 4 내지 6 몰%, 갈락토스 5 내지 10 몰%, 자일로스 1 내지 5 몰%, 아라비노스 5 내지 10 몰%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 식품 또는 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 다당류는 만노스 2.2±0.8 몰%, 람노스 2.3±0.0 몰%, 갈락투로닉 산 73.2±2.1 몰%, 글루코스 5.0±0.3 몰%, 갈락토스 7.1±0.3 몰%, 자일로스 2.9±0.3 몰%, 아라비노스 7.4±0.4 몰%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화용, 주름개선용 또는 염증인자 발현 저해용 다당류 식품 또는 건강기능식품 조성물.
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