KR102577818B1 - Ace2의 수준을 저감시키는 물질을 포함하는, 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 숙주 내 ACE2 단백질 수준을 저감시키는 효소의 의약적 용도에 관한 것이다. 상기 효소를 포함하는 조성물은 숙주 내 코로나 바이러스의 표면 스파이크 단백질의 수용체로 작용하는 ACE2의 단백질 수준을 감소시켜 숙주 세포에 대한 코로나 바이러스의 침입을 억제하는 기전을 갖는 항바이러스 의약으로 작용할 수 있다.

Description

ACE2의 수준을 저감시키는 물질을 포함하는, 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating COVID comprising agent reducing level of ACE2}

본 발명은 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 코로나 바이러스의 수용체 단백질인 단백질인 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)의 수준을 저감시켜 코로나 바이러스의 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 포함하는 의약조성물에 관한 것이다.

COVID-19는 신종 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (SARS-CoV2)에 의한 감염증/질환으로, 다른 코로나 바이러스인 사스바이러스 1 (SARS-CoV1)과 마찬가지로 주로 숙주의 호흡기를 통해 전파되는 급성 전염병이다.

SARS-CoV 감염은 숙주 세포 표면의 ACE2 (Angiotensin-converting enzyme 2)단백질을 수용체로 이용하여 일어나는데, 인간 숙주에서 ACE2가 바이러스 표면의 스파이크 단백질에 대한 수용체로 작용한 후 바이러스를 세포 내로 끌어들이는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 특히 인간의 폐포 및 소장 상피 세포에는 ACE2 단백질이 풍부하게 분포하고, 이로 인해 SARS-CoV의 진입 경로를 제공한다는 것이 알려져 있다 (Hamming, Inge, et al. "Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis." The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland 203 (2004): 631-637).

이에 따라 폐의 기도 및 공간, 특히 폐포 상피 세포를 둘러싸고 있는 세포의 표면에서 ACE2에 대한 SARS-CoV2 스파이크 단백질의 결합을 차단하는 것은 SARS-CoV2 감염 및 COVID-19를 잠재적으로 예방하거나 약화시키는 한 가지 접근 방식이될 수 있다 (Maishan, Mazharul, et al. "A decoy mutant ACE2 designed to reduce COVID-19." Trends in Pharmacological Sciences 43 (2022): 703-705).

그러므로, 이러한 접근 방식의 선상에서 SARS-CoV2의 표면 스파이크 단백질을 표적으로 하는 항바이러스 항체 개발이 시도될 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, 이 스파이크 단백질은 숙주의 ACE2 (angiotensin converting enzyme 2)에 결합함으로써 표적 세포에 부착 및 진입하는데 필요한 바이러스 감염성의 핵심 매개체이기 때문이다 (Feng, Siqin, et al. "Eltrombopag is a potential target for drug intervention in SARS-CoV2 spike protein." Infection, Genetics and Evolution 85 (2020): 104419).

그러나, 이러한 항체 접근법의 하나의 맹점은 단일클론 항체는 항원의 특정한 결합위치 (epitope)에만 강하게 결합하기 때문에 (Baum, Alina, et al. "Antibody cocktail to SARS-CoV-2 spike protein prevents rapid mutational escape seen with individual antibodies." Science 369 (2020): 1014-1018), 항체가 결합하는 항원의 위치에 돌연변이가 생기게 되면 항체와의 결합력이 약해져 의약으로서의 효과가 떨어질 수 있다는 것이다.

따라서, 빈번하게 일어나는 바이러스 표면 단백질의 변이에 영향받지 않고 작용할 수 있는, ACE2를 표적으로 하는 새로운 코로나 바이러스 감염억제제 또는 치료제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 코로나 바이러스 감염증 (COVID)을 치료 또는 예방하기 위한 방안을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 하나의 측면은

ACE2의 수준을 저감시키는 물질을 유효성분으로 포함하는, ACE2가 관여하는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 ACE2가 관여하는 질환은, 신종 중증 급성 호흡기증후군 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19)일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 ACE2 수준을 저감시키는 물질은 유비퀴틴화를 조절하는 효소일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 유비퀴틴화를 조절하는 효소는 YOD1일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 YOD1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드, 이의 기능적 단편 또는 변이체일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면은 YOD1 유전자 또는 YOD1 단백질을 사용하여 ACE2가 관여하는 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 구체예에서, 상기 YOD1 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 숙주 내 ACE2 단백질 수준을 저감시키는 효소의 의약적 용도에 관한 것이다. 상기 효소를 포함하는 조성물은 숙주 내 코로나 바이러스의 표면 스파이크 단백질의 수용체로 작용하는 ACE2의 단백질 수준을 감소시켜 숙주 세포에 대한 코로나 바이러스의 침입을 억제하는 기전을 갖는 항바이러스 의약으로 작용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 pcDNA3.1-6myc 발현벡터의 개략적인 모식도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 PCR로 증폭된 YOD1 유전자가 pcDNA3.1-6myc 발현벡터에 적절히 클로닝되었음을 보여주는 아가로스 겔-전기영동 사진이고,
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 각 벡터로 형질감염된 A549 세포의 전체 세포 용해물을 웨스턴 블롯팅한 결과를 보여주는 사진이고,
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 각 벡터로 형질감염된 A549 세포의 전체 세포 용해물을 항-ACE2로 면역침강시킨 뒤 웨스턴 블롯팅한 결과를 보여주는 사진이고,
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포에서 Myc-YOD1와 ACE2의 공발현 후 웨스턴 블롯팅한 결과를 보여주는 사진이고,
도 4b는 도 4a의 결과를 Image J 프로그램을 사용하여 통계분석한 결과이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 이유로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

여기에 기재되지 않은 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

최근 몇 년간의 전세계적인 SARS-CoV2의 감염 확대에 따라 이에 대한 치료나 예방법에 대한 관심이 커지고 있다. 본 발명은 SARS-CoV2를 포함하는 코로나 바이러스의 감염에 중요한 역할을 하는 ACE2 단백질 수준을 저감시키기 위한 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로, 본 발명자들은 탈유비퀴틴화 효소인 YOD1의 발현이 궁극적으로 ACE2의 분해를 촉진시킴을 보여줌으로써 숙주내 바이러스의 침입을 억제하는 새로운 접근법을 제시한다.

놀라운 것은 ACE2의 수준이 YOD1의 발현이 증가할수록 용량-의존적으로 감소하였다는 것이다. 본 발명자들은 프로테아좀 억제제 MG132를 처리한 결과로부터 YOD1와 같이 유비퀴틴화를 조절하는 효소가 SARS-CoV 감염의 수용체인 ACE2의 단백질 수준을 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통하여 감소시킴을 보여주었다.

일반적으로, SARS-CoV2를 비롯한 RNA 바이러스는 변이를 일으키기 쉽다. 스파이크 단백질과 같은 바이러스 표면 단백질은 백신의 주요 타겟이 될 수 있지만 변이가 쉽게 일어나기 때문에 이를 표적으로 하는 백신의 효과가 회피되어 버리는 문제가 있다. 그러나, 본원과 같이 바이러스 자체가 아니라 숙주의 수용체를 타겟으로 하는 접근법은 빈번한 바이러스 변이에 의한 영향을 잘 받지 않는 점에서 유리하다.

따라서, 본 발명은 ACE2 단백질의 수준을 저감시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 ACE2 관여 질환, 구체적으로는 코로나 바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 의약 조성물을 제공한다.

코로나 바이러스 감염증 (COVID)은 코로나 바이러스에 감염되어 생기는 질환으로, 중증 급성 호흡기증후군 (SARS), 중동 호흡기증후군 (MERS), 코로나 바이러스 감염증-19 (COVID-19) 등이 있다. 따라서, ACE2를 표적으로 하는 본 발명의 의약 조성물은 이들 코로나 바이러스의 감염 억제에 사용될 수 있다.

ACE2 단백질은 메탈로카복시펩티다제 (metallo-carboxypeptidase)의 하나로, 안지오텐신 전환효소와 상동인 1형 막관통 단백질이며, 진핵생물과 세균에서 발견된다. 이것은 체내 수분과 혈압을 조절하는 레닌-안지오텐신-알도스테론계 (RAAS)에서 역할을 담당하며, SARS-CoV와 SARS-CoV2를 포함한 여러 코로나 바이러스가 세포에 침입할 때 이용하는 수용체이기도 하다.

상기 ACE2 단백질은 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이에 상응하는 유전자 서열은 서열번호 2로 제시되어 있다 (GeneBank: AB046569.1).

한편, 진핵세포 내에서 일어나는 단백질의 분해는 리소좀 (lysosome)과 프로테아좀 (proteasome)에 의한 두 가지 경로에 의해 이루어지는데, 이 중 단백질이 선택적으로 분해되는 기전은 유비퀴틴-프로테아좀 경로 (유비퀴틴-프로테아좀 시스템, UPS; ubiquitin-proteasome system)를 통한 것이다. 이 단백질 분해 기전은 결합 효소에 의해 타겟 단백질에 유비퀴틴이 결합하여 유비퀴틴 사슬이 형성된 후 폴리유비퀴틴화된 단백질이 프로테아좀에 의해 인지되는 과정으로 진행된다 (Nandi, Dipankar, et al. "The ubiquitin-proteasome system." Journal of Biosciences 31 (2006): 137-155). 프로테아제 (protease)에 의한 단백질의 탈유비퀴틴화 (deubiquitination)는 가역적인 과정이다.

탈유비퀴틴화 효소는 기질 단백질의 유비퀴틴화를 조절하여 단백질의 안정성과 활성, 다양한 신호 전달, 세포주기, 세포사멸, 증식 등을 조절하는 데 중요한 역할을 한다 (Lim, Key-Hwan et al. "Decision for cell fate: deubiquitinating enzymes in cell cycle checkpoint." Cellular and Molecular Life Sciences 73 (2016): 1439-1455). YOD1은 Otubain 계열의 탈유비퀴틴화 효소로, 난소 종양 (OTU) 도메인을 특징으로 하는 탈유비퀴틴화 효소 서브패밀리에 속하며, 대체 스플라이싱으로 인해 여러 전사체 변형이 가능하다.

본 발명을 구현하기 위해 YOD1 단백질 또는 유전자는 구체적인 목적에 따라 인간이나 마우스 유래의 것을 포함하여, 다양한 기원의 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, YOD1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이에 상응하는 유전자 서열은 서열번호 4에 제시되어 있다 (NCBI 관련 서열: NM_018566.4).

이들 서열에서 일부 서열이 변형 (결실, 치환, 부가)되었으나 기능적으로 동등한 변이체나 단편도 본 발명의 범주에 포함된다. 즉, 상기 활성을 가지는 폴리펩타이드의 기능적 변이체 또는 단편과 이를 암호화하는 핵산도 이용가능하다.

상기 기능적 변이체란, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있지만, 이러한 변형이 생물학적 작용성에 유의한 변화를 초래하지 않은 것을 의미한다.

또한, 상기 단백질은 미리스틸화, 포스포릴화, 글리코실화, 단백 분해 절단 등을 포함하는 번역 후 변형을 포함할 수 있다.

본 발명을 구현하기 위한 YOD1 단백질은 포유동물, 예를 들면 쥐, 토끼, 돼지, 소, 말, 바람직하게는 인간의 조직이나 기관으로부터 얻어지는 천연 단백질일 수 있다. 또는 상기 단백질은 합성, 반합성 또는 재조합 방법으로 생산되는 단백질일 수 있다.

상기 YOD1 단백질은 공지된 폴리펩타이드 화학 합성 방법에 의하여 제조할 수 있다. 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, BocaRaton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 특히, 고체상 합성방법 (solid phase synthesis)을 이용할 수 있다.

다르게는, YOD1 단백질은 유전자 재조합 기술에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, YOD1 단백질을 암호화하는 서열번호 2의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하여 이것을 숙주세포에서 발현시켜 그 단백질을 분리한다. 유전공학적으로 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 공지된 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, YOD1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 적절한 발현 벡터, 예를 들면 대장균으로부터 유래된 플라스미드 (예: pET3A, pBluescript 또는 pUC19), 효모로부터 유래된 플라스미드 (pSH19 및 pSH15), 박테리오파아지 (예: 람다 파아지), 동물 바이러스(예: 레트로바이러스) 또는 곤충 바이러스 (예: 배큘로바이러스) 벡터에 클로닝하고, 이 재조합 벡터를 형질전환 또는 파아지 감염 등의 표준 기술을 이용하여 적절한 숙주 내로 도입한다. 형질전환체는 사용된 숙주 세포에 따라 적절한 조건에서 배양한다.

YOD1 단백질은 이 형질전환체의 배양물로부터 예를 들면 배양된 세포 또는 배양용액으로부터 추출하여 분리 정제할 수 있다. 배양액 또는 세포 추출물에 함유된 YOD1 단백질의 분리 및 정제는 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용하는 방법 등을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 "예방"이란 질환을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환에 걸릴 가능성이 있는 대상체내 본 발명의 조성물을 투여하여 코로나 바이러스의 감염 또는 이로 인한 질환이나 증상의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물은 코로나 바이러스의 예방에 기여할 수 있다. 바이러스 감염의 치료에는 항염증 작용에 기반한 접근이 있으나, 이는 감염이 일어난 후의 대처법이므로 예방과는 또다른 차원의 문제이다. 본 발명의 조성물은 감염되기 이전 상태이더라도 미리 투여함으로써, 바이러스 감염시 그 수용체가 되는 ACE2 단백질의 수준을 감소시킴으로써, 숙주 세포로의 침입을 방지한다는 의미에서 예방 의약으로 기여할 수 있다.

본 발명에서, "치료"란 대상체내 본 발명의 조성물을 투여하여 코로나 바이러스의 감염 또는 이로 인해 유발되는 질환이나 증상의 증세가 제거 또는 호전되는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 일단 감염이 일어나 바이러스가 증식한 후에도, 다른 세포로의 추가적인 감염을 방지한다는 의미에서는 치료제로 작용할 수 있다.

코로나 바이러스의 감염에 의한 질환이나 증상은 예를 들어, 고열, 기침, 숨가쁨, 폐렴, 설사와 같은 위-장관 증상, 신부전, 신장 기능장애 등의 기관 기능 부전, 패혈성 쇼크 및 사망에 제한되지 않으며, 상기 바이러스 감염에 의해 유발되는 모든 증상을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여형태에 따라 적절한 추가 성분을 배합할 수 있다. 예를 들면 본 조성물은 의약품에 일반적으로 포함되는 성분을 포함할 수 있다. 그 러한 성분의 예로서 분산제, 안정화제, 방부제, 향료, pH 조정제, 산화 방지제, 곰팡이 방지제 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 대상체의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-200 ㎎/kg 범위 내에서 조절될 수 있다.

실시예

1-1: YOD1과 ACE2 유전자 발현 벡터

HEK293T 세포에서 합성된 cDNA를 주형으로 100 ng/㎕를 0.5 ㎕, 2 mM의 최종 농도 dNTP 혼합물 (dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP,각 2 mM), 10 pmol/㎕의 프라이머 1 ㎕, 10x Pfu 완충용액 2 ㎕, Pfu 중합효소 (모두 LaboPass) 0.5 ㎕를 포함하는 용액을 최종 부피 20 ㎕ 반응액으로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 여기에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

정방향 프라이머: 5'-GAA TTC GGA TGT TTG GCC-3'

역방향 프라이머: 5'-CTC GAG TCA CAC TTC TCC-3'

PCR 반응은 먼저 95℃에서 3 분, 95℃에서 30 초, 50℃에서 30 초 및 72℃에서 60초의 사이클을 35 회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 3 분간 증폭하였다. 반응이 끝난 후 1.0％ 아가로즈 겔에 전기영동을 수행하여 증폭된 생성물을 확인하였다.

상기 증폭된 YOD1 cDNA 산물 (서열번호 1)과 pcDNA3.1-6myc 발현 벡터 (Addgene)(도 1)를 BamH I 및 Xba I 제한효소를 사용하여 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였다. 아가로즈겔 전기영동을 통해 상기 발현 벡터에 YOD1이 적절히 삽입되었음을 확인하고, 이 클로닝 결과물을 pcDNA3.1-6myc-YOD1라 명명하였다 (도 2 참조).

ACE2의 경우, pcDNA3 벡터에 ACE2 유전자 (서열번호 2)가 클로닝된 시판 벡터(Sino Biological, Cat: HG11598-UT)를 사용하였다.

1-2: 웨스턴 블롯팅을 통한 유비퀴틴화 분석

외인성으로 발현된 ACE2 단백질의 유비퀴틴화 분석을 위해 pcDNA3-ACE2 및 pRK5-HA-Ub 벡터(Addgene)를 A549 세포 (ATCC)에 형질감염 (Transfection) 시켰다. 이와 독립적으로, HeLa 세포 (ATCC)에도 같은 실험을 수행하였다. pRK5-HA-Ub 벡터는 HA가 태깅된 WT 유비퀴틴을 발현할 수 있는 시판 벡터 (Addgene)이다.

형질감염을 위해 준비된 HeLa 세포 또는 A549 세포에 pcDNA3-ACE2 벡터를 3 μg 분주하고, PEI 용액 (polyethylene imine)과 NaCl 150 mM (pH 7.1)을 첨가하여 배양하였다. 24 시간 뒤 RPMI 배지 (Sigma-Aldrich)로 기존 배지를 교체하고, pRK5-HA-Ub 벡터를 2 μg 분주하여 37℃, 5 % CO₂ 에서 48시간 이상 배양하였다.

대조군으로, 같은 조건에서 pcDNA3-ACE2 벡터를 3 μg, 공벡터인 pRK5-HA를 2 μg 형질감염시킨 세포를 이용하였다.

배양된 세포나 배양배지를 회수하기 4시간 전 MG132를 5-10 μmol 처리하였다. MG132 (carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal)는 26S 프로테아좀 복합체의 단백질 분해 활성을 효과적으로 차단하는 펩타이드 알데하이드로서, 여러 세포 유형에서 프로테아좀 활성을 조사하는데 일반적으로 사용되는 프로테아좀 억제제이다.

형질감염 3일 후에 전체 세포 용해물 (Whole cell lysate, WCL)의 단백질만을 분리해내기 위하여 용해완충액 [1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM phosphatase inhibitor cocktail (PIC)]을 사용하여 세포를 용해하였다. 전체 세포 용해물은 Bradford 방법 (BIO-RAD)에 의해 표준화되었고, 정량된 20~30 μg의 단백질을 2X SDS (sodium dodecyl sulfate) buffer와 함께 100℃에서 7분 끓여 변성시킨 뒤 SDS-PAGE를 시행하여 분리하였다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 플로라이드 (polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인 시트로 전달 (transfer)시켜 항-HA (12CA5 hybridoma cell media), 항-ACE2 (Santa Cruz) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology)과 같은 1차 항체와 2% 스킴밀크 (Skim milk) 용액에서 4℃에서 10시간 동안 반응시킨 뒤 항-마우스 2차 단일 항체를 이용하여 ECL (Enhanced chemiluminescence) 시스템으로 블롯을 감광필름에 현상하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, pRK5-HA-Ub로 형질감염되어 외인성 유비퀴틴이 발현된 A549 세포에서는 다양한 사이즈의 폴리유비퀴틴이 검출되었으나 (레인 2 및 레인 3), 공벡터로 감염되어 외인성 유비퀴틴이 발현되지 않는 대조군 (레인 1)에서 HA-Ub 밴드가 검출되지 않은 것을 확인하였다 (레인 1).

1-3: 면역침강을 통한 유비퀴틴화 분석

면역침강 분석 (immunoprecipitation analysis)에서는 1-2에서와 같이 세포용해물 (lysate)을 수득하고 항-ACE2의 1차 항체와 함께 4℃에서 10시간 동안 반응시켰다. 이것을 4℃에서 2시간 동안 아가로즈 비드 (agarose bead)와 반응시켜 각 세포주에서 발현된 단백질 중 ACE2를 침강시켜 수득하였다. 이것을 단백질 분해억제제 (Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF, (Sigma))를 포함하는 세척 완충액 (Washing buffer)으로 2회 세척하고 100℃에서 2X SDS 완충액과 함께 7분간 끓여 변성시키고 SDS-PAGE을 수행한 뒤 1-2의 조건과 같은 웨스턴 블롯팅 실험을 수행하였다. A549 세포에서의 실험결과를 도 3b에 나타낸다.

도 3b의 레인 3에서 ACE2 밴드가 두꺼워진 것은, 형질감염된 세포에 프로테아좀 억제제 MG132를 처리하였을 때 유비퀴틴-프로테아좀 경로의 저해로 인해 ACE2 단백질이 축적된 결과로 보이며, 이 결과는 ACE2가 유비퀴틴-프로테아좀 경로매개 단백질 분해를 겪는다는 것을 시사한다.

1-4: Myc-YOD1와 ACE2의 공발현 분석

1-1의 pcDNA3-ACE2 및 pcDNA3.1-6myc-YOD1를 HeLa 세포에 형질감염시켜 공발현을 유도하였다. 이와 독립적으로, A549 세포에도 같은 실험을 수행하였다.

형질감염 방법은 1-2에 기술과 것과 동일하다.

구체적으로, pcDNA3-ACE2를 상기 HeLa 세포에 2 μg 형질감염시키고 24 시간 배양한 뒤 다시 pcDNA3.1-6myc-YOD1를 각각 0, 1, 2, 4 μg씩 형질감염시켰다 (이때 DNA 도입량을 동일하게 하기 위해 공벡터인 pcDNA3.1-6myc을 순서대로 4, 3, 2, 0 μg 씩 추가하였다 (순서대로, 도 4a의 각 레인 및 도 4b의 각 막대로 나타낸 실험군임).

상기 형질감염된 세포를 3일에 걸쳐 배양 후 1-2의 실험방법과 동일하게 단백질을 추출하고, 웨스턴 블롯팅 실험을 수행하여 단백질 발현량을 확인하였다. HeLa 세포주에서의 분석 결과를 도 4a에 나타내었다.

즉, pcDNA3-ACE2 플라스미드 및 pcDNA3.1-6myc-YOD1 플라스미드가 형질감염된 세포주에서 항-Myc (9E10 hybridoma cell media) 및 항-ACE2를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과, YOD1의 단백질 발현이 증가될 때 그에 따라 ACE2 단백질 발현이 용량 의존적으로 감소됨이 보여진다. 이 같은 결과는, YOD1 효소가 직간접적으로 ACE2 단백질의 분해를 조절함을 시사한다.

통계분석을 위해 Image J 프로그램을 사용하여 웨스턴 블롯팅 밴드를 분석하였다. 모든 통계분석은 소프트웨어 Microsoft Excel과 Prism을 사용하였으며, 계산된 데이터의 유의성은 p value 값으로 표현하였다. 웨스턴 블롯팅 결과로부터 얻은 특정 밴드의 강도는 밀도 측정 분석에 의해 정량화되었고 대조군의 발현과 비교하여 배수 변화로 표현되었다 (*: 0.01 < p < 0.05, **: 0.001 < p < 0.01, ns: p > 0.05) (도 4b).

코로나 바이러스는 숙주 세포의 ACE2에 자신의 스파이크 단백질을 결합시키고 이것을 수용체로 하여 숙주 세포 내로 침입한다. ACE2 단백질의 발현을 억제하거나 이 단백질의 수준을 조절할 수 있는 물질은 바이러스의 세포 침입을 억제할 수 있으므로 항바이러스 의약에 사용될 수 있다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (8)

1. YOD1 단백질을 유효성분으로 포함하는, COVID-19 또는 SARS-CoV 감염증의 예방 또는 치료용 의약조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 YOD1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드인, 의약조성물.
3. YOD1 유전자 또는 YOD1 단백질을 사용하여 COVID-19 또는 SARS-CoV 감염증의 예방 또는 치료용 의약을 제조하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 YOD1 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 것인, 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 YOD1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
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