KR102575346B1 - 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 도입된 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법 및 이를 이용한 지질 생산 방법 - Google Patents

파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 도입된 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법 및 이를 이용한 지질 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain containing protein) 유전자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 지질 생산성이 증진된 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) 및 이를 이용한 지질 생산 방법에 관한 것으로서, 이에 따라 제조된 클라미도모나스 라인하드티는 지질, 전분 등과 같은 대사 물질을 대량 생산하는데 활용될 것으로 기대된다.

Description

파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 도입된 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법 및 이를 이용한 지질 생산 방법{Method for preparing microorganism with improved lipid productivity into which fasciclin domain containing protein gene is introduced, and method for manufacturing lipids using the same}
본 발명은 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain containing protein) 유전자가 도입된 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법 및 이를 이용한 지질 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자를 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)에 도입하여 지질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
최근 전세계적으로 화석에너지의 고갈과 지구온난화에 직면하여, 미국을 포함하는 선진국을 중심으로 환경 친화적인 바이오, 수소, 태양 등의 신 재생에너지 활용 및 확산을 위한 정책 입안과 함께 이들 신 재생에너지의 공급과 사용을 촉진하고 있다. 국내에서도 신 재생에너지 개발에 많은 노력을 하고 있지만, 현재 연구 단계에 머물고 있는 실정이다. 바이오 에너지는 재생가능하며, 이산화탄소를 고정함으로서 지구온난화 가속현상을 감소시킬 수 있는 장점이 있는데, 현재로서는 바이오 에탄올, 바이오 부탄올, 바이오 디젤 등에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
상기 바이오 에너지 중에서도, 가장 활발하게 연구가 진행되고 있는 것은 바이오 디젤이다. 바이오 디젤은 바이오 매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화(transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터 또는 에틸 에스터 형태로 전환되어 생성되는데, 150℃의 인화점을 가지고 있어 인화점이 64℃인 경유에 비해 불이 잘 붙지 않고, 낮은 온도에서 휘발성이 높은 휘발유(45℃보다 안정적이기 때문에 비가연성 액체로 분류되며, 고온에서 불이 붙기 때문에 안정성이 더 높다고 할 수 있다. 또한, 경유와 달리 바이오 디젤은 연소될 때 발암물질 및 돌연변이를 일으키는 유해 가스 방출량이 적으며 기타 배출물이 현저하게 낮은 비독성 에너지로 알려져 있다.
이러한 바이오 디젤은 미세조류를 이용하여 생물학적으로 생산할 수 있다고 알려져 있다. 미세조류는 사료 또는 비료의 용도로 사용되고 있으며, 특히 녹조류에 속하는 스피룰리나(Spirulina sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 두날리엘라(Dunaliella sp.), 노스톡(Nostoc sp.) 등은 건강식품으로도 이용되고 있다. 이러한 미세조류는 태양에너지의 이용효율이 식물에 비하여 약 25배 높기 때문에, 지질의 함량이 우수한 미세조류는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있다.
이처럼 지질의 함량이 우수한 미세조류로는 보트리오코코스(Botryococcus sp.)와 키오키트리움(Schiochytrium sp.)이 알려져 있는데, 상기 미세조류는 정상적인 생활환경에서는 지질의 함량이 높지 않지만, 영양공급이 중단된 상태에서 일정 시간이 경과하면, 세포 내에 지질을 축적하는 특성을 나타낸다.
이러한 특성을 이용하여 상기 미세조류를 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오 매스로 사용할 수 있으나, 상기 미세조류의 지질함량을 증가시키기 위해서는 상기 미세조류를 배양하여 증식하는 제1 공정과, 상기 증식된 미세조류에 영양공급을 중단하고 일정시간 동안 배양하여 세포 내 지질함량을 증대시키는 제2 공정이 수행되어야 한다. 상기 2 단계 공정에는 과다한 시간이 요구되기 때문에 아직까지는 바이오 디젤의 산업적 생산에 사용되지 못하고 있으므로, 바이오 디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
특히 바이오 디젤 생산을 위해 사용되고 있는 미세조류의 경우 세포 내의 대사 특성에 관한 연구가 부족하여 지질 생산성 증대를 위한 타겟 유전자 선별이 필요한 실정이다. 즉, 지질 함량이 증가된 재조합 균주를 개발하기 위하여 어떠한 유전자를 증폭해야 하는지에 관한 선행 연구가 부족하다.
이에 본 발명자들은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain containing protein) 유전자를 과다발현시킬 경우, 과다발현된 재조합 조류(algae)에서 지질 함량이 증가한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 지질 생산성이 증진된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미생물을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음을 포함하는 지질 생산 방법을 제공하는 것이다:
미생물을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계; 및
상기 미생물을 배양하는 배양 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 지질 생산성이 증진된 미생물의 지질 생산 용도에 관한 것이다.
본 발명은 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain containing protein) 유전자가 도입된 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법 및 이를 이용한 지질 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 도입된 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)는 지질 생산성의 증진을 나타낸다.
본 발명자들은 환경에 따른 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유전자의 발현 변화로부터 특이적으로 높게 발현하는 유전자들 중에서 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자를 발견하고 이 유전자를 미세조류 클라미도모나스 라인하드티에 형질전환하여 지질 함량을 평가하였다.
그 결과 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 발현된 재조합 미세조류 클라미도모나스 라인하드티가 지질 생산을 위한 배양 환경에서 야생형에 비하여 더 우수한 성장을 보일 뿐만 아니라 높은 함량의 지질을 합성한다는 것을 확인하였으므로, 이를 이용하여 지질, 전분 등과 같은 대사 물질을 대량 생산하는데 활용될 것으로 기대된다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다.
상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 방사무늬김에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터이다.
상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 방사무늬김에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방사무늬김에서 유래한 지질 생산성을 증가시키는 파시클린 도메인 함유 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
또는, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 3의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에서, 목적 단백질이 삽입된 발현벡터를 숙주 세포에 삽입함 으로써 지방 생산능력이 향상된 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.
상기 방사무늬김에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 지질 생산성이 증진된 미생물이다.
본 발명에 있어서 상기 미생물은 조류(algae)인 것일 수 있고, 예를 들어, 클라미도모나스 라인하드티인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 방사무늬김에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 형질전환된 클라미도모나스 라인하드티는 방사무늬김에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 도입되어 질소원 고갈 스트레스에 대한 저항성이 증가되었다.
본 발명의 또 다른 양태는 미생물을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법이다.
본 발명에 있어서 상기 미생물은 조류인 것일 수 있고, 예를 들어, 클라미도모나스 라인하드티인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 방사무늬김에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 지질 생산 방법이다:
미생물을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계; 및
상기 미생물을 배양하는 배양 단계.
본 발명에 있어서 상기 미생물은 조류인 것일 수 있고, 예를 들어, 클라미도모나스 라인하드티인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 방사무늬김에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 지질 생산 방법은 배양 단계의 수행 후 미생물 및 이의 배양액으로부터 지질을 회수하는 회수 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 형질전환된 클라미도모나스 라인하드티는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입되지 않은 야생형 대조군에 비하여 지질의 함량이 높아져 바이오디젤 생산량이 현저히 증가되는 효과를 나타내었고, 이는 향후 바이오 디젤 생산에 활용될 수 있다.
상기 바이오 디젤은 바이오 매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화(transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터(methyl ester) 또는 에틸 에스터(ethyl ester) 형태로 전환된 것일 수 있고, 예를 들어, 메틸 에스터의 형태인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain containing protein) 유전자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 지질 생산성이 증진된 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) 및 이를 이용한 지질 생산 방법에 관한 것으로서, 이에 따라 제조된 클라미도모나스 라인하드티는 지질, 전분 등과 같은 대사 물질을 대량 생산하는데 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain-containing protein) 유전자가 발현된 재조합 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 야생형 대비 지질 함량을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 방사무늬김으로부터 RNA 추출 및 cDNA합성
방사무늬김(Pyropia yezoensis)은 국립수산과학원 해조류연구센터로부터 분양 받아 사용하였다. 구체적으로, MGM(Modified Grund Media) 배지를 C10H14O6N2Na22H2O(Na2EDTA) 3.72 g, FeSO47H2O 0.28 g, Na2HPO412H2O 10.74 g, NaNO3 42.5 g, MnCl27H2O 0.019197 g 및 비타민 B12(Cyanocobalamin) 1 mg를 포함한 멸균된 해수 1리터(ℓ를 사용하여 제조하였다. 그 다음, 방사무늬김을 MGM 배지에 넣고, 식물 배양 접사(Plant culture dish; 100 X 40 mm)에 100 mL의 부피로 첨가한 후, 광도 >20 umol photon m-2s-1, 12:12 명(Light):암(Dark) 사이클, 온도 12℃를 유지하여 1 내지 10주 동안 배양하였다.
방사무늬김 엽상체 100 mg을 액체질소로 냉동시켜 멸균된 막자 사발로 잘게 분쇄하였다. RNA 정제 키트(RNA purification kit, QIAGEN RNeasy®Mini kit)를 사용하여, 가루가 된 조직 100 mg을 1.5 mL 마이크로 센트리퓨즈(micro centrifuge) 튜브에 넣고 450 uL RLT 버퍼를 넣고 교반한 후, QIAshredder 스핀 컬럼(spin column)에 옮겨 2분 동안 15000 rpm으로 원심분리하였다.
그 다음, 분리된 버퍼에 에탄올(ethanol) 200 uL 볼륨을 섞어주고, RNeasy 스핀 컬럼(spin column)에 걸어 15초 >8000 g로 원심분리하였다. 떨어진 버퍼를 제거하고 컬럼에 700 uL RW1 버퍼로 15초 >8000 g로 세척 후, 떨어진 버퍼를 제거하고 500 uL RPE 버퍼로 15초, 2분 >8000 g로 2번 세척하였다. 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로 센트리퓨즈 튜브에 옮겨 30 내지 50 uL의 RNase 제거수(RNase-free water)를 첨가하고 1분 >8000 g로 원심분리 후 각각의 RNA 시료를 수득하였다.
Biodrop(Biochrom, Germany)을 흡광도 230 nm와 흡광도 280 nm의 파장 범위로 설정하고 RNase 제거수 2 uL를 스팟에 넣고 베이스(base)를 잡았다. 상기 RNA 시료 2 uL를 스팟에 넣고 흡광도 260 nm를 통해 RNA 정량 값을 확인하였다.
상기 정량한 2 uL RNA 시료를 키트(Transcriptor Fiest Strand cDNA Synthesis Kit, Roche, Germany)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 정량된 각각의 2 uL RNA 시료에 올리고-dT 1 uL와 DEPC-water를 이용하여 총 13 uL로 맞춰 65℃에서 10분 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 처리 후 RT reaction(5x) 4 uL, 역전사효소(Reverse transcriptase) 1 uL, RNase 억제제(inhibitor) 0.5 uL, DNTP 2 uL를 첨가하여 50℃에서 60분, 85℃에서 5분 동안 인큐베이션(incubation)하여 각각의 cDNA를 합성하였다.
이후 합성된 cDNA에서 파시클린 도메인 함유 단백질(fasciclin domain-containing protein) 유전자를 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. 얻어진 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 명칭 서열 (5'->3')
1 forward primer CACAAAATGAAAACTTTAAAAATTATGAAAAAAATTG
2 reverse primer TTAACGTAATACACGATCAATAACGTGTA
3 fasciclin domain-containing protein 코딩 염기서열 CACAAAATGAAAACTTTAAAAATTATGAAAAAAATTGCATTAATTCTATTAGCAATGATTACAATCTCATCATGTAGTAATGACGATGACAACAACACAACACCTAAACCTTTAAACATTGTTGAGACAGCTCAATCTGTTGGGGATTTAAGTATCCTAGTAGATGCAGTAATACAAGCAGATTTAGTTGCAGCTTTATCAGCGTCTGGCAGTAGAACTGTTCTAGCACCTACAAATGCCGCTTTTACAGCATTTTTACAAGCTAAAGGATTTGATAATTTATCTGACGTACCAAATGATGTATTGACACAAATTCTTTTAAATCACGTTATACCAGATGCTAACATCCAATCTTCTGATTTACTAGGTAATGCTGCTTATACTAATACTATGGCAGATGGACCAAACGACACAAAACTAAGTCTTTACTATAATGGCTCTTCAAATACTGAAGTAGTATTTAATGGAGGCGCAACTACTGTAGCTGGTTTAATAGATGTATCTACATCAAACGGAATTGTTCATATTATTGATGAAGTTATAGACCTTCCAACTATTGCCACTTTTGCTACTACTAATGATGCTTTATCTATTTTAGTAGATGCCTTAGCGTATGCAGATACAGGATCTCCAACGGTACCTTACATTACAACAGTTTCAAATGCAGCTGCAGGACCATATACAGTATTTGCTCCAACTAATACAGCTTTTGCAAATTTATTAACAGATTTAGAAGTAAGTGCACTTACAGAAATAGAAACCTCAACTGTTGATGCTGTTTTATTAAAGCACATTGTTAATGCTAACGTTCAATCTAGCCAGTTAACTAGTGGTACGGTTACTACATTAGGAGGAGACATTACAGCAGCTGTCCCAGCCTTCACATTAACTGATGGAAGTGGAACGAGTCAAATAGTAACATCTTTAGTAGACATACAAGGAGTTAACGGAGTTGTA CACGTTATTGATCGTGTATTACGTTAA
4 fasciclin domain-containing protein 아미노산 서열 HKMKTLKIMKKIALILLAMITISSCSNDDDNNTTPKPLNIVETAQSVGDLSILVDAVIQADLVAALSASGSRTVLAPTNAAFTAFLQAKGFDNLSDVPNDVLTQILLNHVIPDANIQSSDLLGNAAYTNTMADGPNDTKLSLYYNGSSNTEVVFNGGATTVAGLIDVSTSNGIVHIIDEVIDLPTIATFATTNDALSILVDALAYADTGSPTVPYITTVSNAAAGPYTVFAPTNTAFANLLTDLEVSALTEIETSTVDAVLLKHIVNANVQSSQLTSGTVTTLGGDITAAVPAFTLTDGSGTSQIVTSLVDIQGVNGVVHVIDRVLR
실시예 2: 재조합 클라미도모나스의 제조
상기 증폭된 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)에서 지질 생산에 영향을 미치는지를 확인하였다.
구체적으로, 서열번호 5 및 6의 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자를 PCR 증폭한 후, 키트(GeneArt® Chlamydomonas TOPO® Engineering Kits (A14264))의 벡터 pChlamy_3/D-TOPO를 이용하여 유전자를 발현시켰다.
서열번호 명칭 서열 (5'->3')
5 forward primer CACCATGGCACAAAATGAAAACTTTAAAAATTATGAAAAAAATTG
6 reverse primer CCCTTTTAACGTAATACACGATCAATAACGTGTA
벡터 pChlamy_3/D-TOPO가 히그로마이신(hygromycin) 내성유전자를 가지므로, 야생형인 클라미도모나스 라인하드티 C137에 gene pulse(Bio-Rad)를 이용하여 전기천공법으로 형질 전환하였으며 2 내지 3주 동안 배양한 후, 15 mg/L 히그로마이신이 첨가된 배지에서 선별하여 형질전환체를 수득하였다.
실시예 3: 재조합 클라미도모나스에서의 지질 함량 확인
파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 발현된 재조합 클라미도모나스 라인하드티와 야생형 클라미도모나스 라인하드티를 MBBM(Modified Bold's Basal Medium) 배지에 넣은 다음 광도 20 umol photon m-2s-1, 12:12 명:암 사이클, 온도 20℃를 유지하여 6일 동안 배양하였다.
이후 배양이 끝난 균주들의 지질 함량을 공지된 방법에 따라 FA 메틸 에스터(FA methyl esters; FAMEs)의 형태로 추출하여 분석하였다.
구체적으로, 5 mg의 동결 건조된 균주 세포를 1 mL 2 M NaOH-CH3OH 용액에 현탁하고 실온(room temperature; RT)에서 1시간 동안 흔들며(110 rpm) 75℃에서 15분 동안 배양하였다. 냉각 후, 혼합물에 4 M HCl-CH3OH 1 mL를 첨가하고 HCl을 사용하여 pH를 2.0 미만으로 조정한 다음 75℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, FAME을 1 mL 헥산으로 추출하고 손으로 30초 동안 흔들어 준 다음 3,500 g에서 2분 동안 원심분리하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 방사무늬김 유래 파시클린 도메인 함유 단백질 유전자가 발현된 재조합 클라미도모나스 라인하드티에서는 71.65 mg/L의 지질량이 얻어졌으며, 야생형 클라미도모나스 라인하드티에서 측정된 51.21 mg/L에 비하여 높은 지질량을 갖는 것이 확인되었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for preparing microorganism with improved lipid productivity into which fasciclin domain containing protein gene is introduced, and method for manufacturing lipids using the same <130> PN210205 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 cacaaaatga aaactttaaa aattatgaaa aaaattg 37 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ttaacgtaat acacgatcaa taacgtgta 29 <210> 3 <211> 984 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pyropia yezoensis <400> 3 cacaaaatga aaactttaaa aattatgaaa aaaattgcat taattctatt agcaatgatt 60 acaatctcat catgtagtaa tgacgatgac aacaacacaa cacctaaacc tttaaacatt 120 gttgagacag ctcaatctgt tggggattta agtatcctag tagatgcagt aatacaagca 180 gatttagttg cagctttatc agcgtctggc agtagaactg ttctagcacc tacaaatgcc 240 gcttttacag catttttaca agctaaagga tttgataatt tatctgacgt accaaatgat 300 gtattgacac aaattctttt aaatcacgtt ataccagatg ctaacatcca atcttctgat 360 ttactaggta atgctgctta tactaatact atggcagatg gaccaaacga cacaaaacta 420 agtctttact ataatggctc ttcaaatact gaagtagtat ttaatggagg cgcaactact 480 gtagctggtt taatagatgt atctacatca aacggaattg ttcatattat tgatgaagtt 540 atagaccttc caactattgc cacttttgct actactaatg atgctttatc tattttagta 600 gatgccttag cgtatgcaga tacaggatct ccaacggtac cttacattac aacagtttca 660 aatgcagctg caggaccata tacagtattt gctccaacta atacagcttt tgcaaattta 720 ttaacagatt tagaagtaag tgcacttaca gaaatagaaa cctcaactgt tgatgctgtt 780 ttattaaagc acattgttaa tgctaacgtt caatctagcc agttaactag tggtacggtt 840 actacattag gaggagacat tacagcagct gtcccagcct tcacattaac tgatggaagt 900 ggaacgagtc aaatagtaac atctttagta gacatacaag gagttaacgg agttgtacac 960 gttattgatc gtgtattacg ttaa 984 <210> 4 <211> 327 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Pyropia yezoensis <400> 4 His Lys Met Lys Thr Leu Lys Ile Met Lys Lys Ile Ala Leu Ile Leu 1 5 10 15 Leu Ala Met Ile Thr Ile Ser Ser Cys Ser Asn Asp Asp Asp Asn Asn 20 25 30 Thr Thr Pro Lys Pro Leu Asn Ile Val Glu Thr Ala Gln Ser Val Gly 35 40 45 Asp Leu Ser Ile Leu Val Asp Ala Val Ile Gln Ala Asp Leu Val Ala 50 55 60 Ala Leu Ser Ala Ser Gly Ser Arg Thr Val Leu Ala Pro Thr Asn Ala 65 70 75 80 Ala Phe Thr Ala Phe Leu Gln Ala Lys Gly Phe Asp Asn Leu Ser Asp 85 90 95 Val Pro Asn Asp Val Leu Thr Gln Ile Leu Leu Asn His Val Ile Pro 100 105 110 Asp Ala Asn Ile Gln Ser Ser Asp Leu Leu Gly Asn Ala Ala Tyr Thr 115 120 125 Asn Thr Met Ala Asp Gly Pro Asn Asp Thr Lys Leu Ser Leu Tyr Tyr 130 135 140 Asn Gly Ser Ser Asn Thr Glu Val Val Phe Asn Gly Gly Ala Thr Thr 145 150 155 160 Val Ala Gly Leu Ile Asp Val Ser Thr Ser Asn Gly Ile Val His Ile 165 170 175 Ile Asp Glu Val Ile Asp Leu Pro Thr Ile Ala Thr Phe Ala Thr Thr 180 185 190 Asn Asp Ala Leu Ser Ile Leu Val Asp Ala Leu Ala Tyr Ala Asp Thr 195 200 205 Gly Ser Pro Thr Val Pro Tyr Ile Thr Thr Val Ser Asn Ala Ala Ala 210 215 220 Gly Pro Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Thr Ala Phe Ala Asn Leu 225 230 235 240 Leu Thr Asp Leu Glu Val Ser Ala Leu Thr Glu Ile Glu Thr Ser Thr 245 250 255 Val Asp Ala Val Leu Leu Lys His Ile Val Asn Ala Asn Val Gln Ser 260 265 270 Ser Gln Leu Thr Ser Gly Thr Val Thr Thr Leu Gly Gly Asp Ile Thr 275 280 285 Ala Ala Val Pro Ala Phe Thr Leu Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ser Gln 290 295 300 Ile Val Thr Ser Leu Val Asp Ile Gln Gly Val Asn Gly Val Val His 305 310 315 320 Val Ile Asp Arg Val Leu Arg 325 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 caccatggca caaaatgaaa actttaaaaa ttatgaaaaa aattg 45 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 cccttttaac gtaatacacg atcaataacg tgta 34

Claims (11)

  1. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
  2. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 지질 생산성이 증진된 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)인 것인, 지질 생산성이 증진된 미생물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 것인, 지질 생산성이 증진된 미생물.
  6. 미생물을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)인 것인, 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 것인, 지질 생산성이 증진된 미생물의 제조방법.
  9. 다음을 포함하는 지질 생산 방법:
    미생물을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계; 및
    상기 미생물을 배양하는 배양 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 클라미도모나스 라인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)인 것인, 지질 생산 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 유래한 것인, 지질 생산 방법.
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