KR102567876B1 - 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 급성 면역 억제 효과로 인해 스테로이드의 부작용을 줄일 수 있으며, 감염성 질환에서 히스톤 및 사이토 카인과 같은 내 독소를 제거함으로써 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 의한 기관 손상과 혈액 응고 메커니즘을 제어하여, 현재 SARS-CoV-2 전염병 상황에서 항 바이러스제 개발 전에 이환율 및 사망률의 개선에 중요한 역할을 할 수 있다.

Description

페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of SARS-CoV-2 comprising PEGylated Nanoparticle Albumin-Bound Steroidal Ginsenoside Derivatives}
본 발명은 페길화 나노입자 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페길화된 나노입자 알부민에 진세노사이드 유도체를 흡착시켜 SARS-CoV-2 환자에게 투여함으로써 SARS-CoV-2에 의한 조직손상, 염증반응을 억제하고 사이토카인 스톰을 개선하는 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 전 세계적인 새로운 질병이 대유행하고 있다. 2019 년 12 월에 시작된 이 중증 급성 호흡기 증후군-코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)로 인해 발생하는 코로나 바이러스 2019 (COVID-19) 대유행은 발생 이래, 전 세계적으로 큰 건강 위기를 야기하고 있다 (Huang, C 등, 2019). 전염병적으로 COVID-19는 다국적 제약 회사와 수많은 연구팀이 치료제 경쟁에 참여하도록 자극하고 있으며, 전례없는 규모의 세계적 노력이 COVID-19의 치료제 개발에 투입되고 있지만 SARS-CoV-2를 직접 목표로 하는 효과적으로 제거하는 약물은 아직 없는 실정이다. 현재 COVID-19 환자에게 유일하게 이용 가능한 옵션은 보조 산소 및 지시에 따라 기계적 환기 등을 포함한 서포팅 요법이며 (Jin, Y. H. 등, 2020), 긴급 사용을 위한 잠재적 백신은 2021.6 초기에나 이용 가능할 것으로 예상되고 있다 (Le, T. T. 등, 2020).
최근에 공개된 보고서는, 중증 COVID-19 환자에서 비정상적인 혈액 응고 및 사이토카인 방출 증후군(Cytokine release syndrome, CRS)과 관련하여 호중구의 증가, 알부민의 감소 및 D-이합체의 증가를 나타낸다고 보고하고 있다 (Zhang, B. 등, 2020). 또한, SARS-CoV-2 감염에 의한 과염증 반응은 급성 호흡 곤란 증후군 (Acute Respiratory Distress syndrome, ARDS), 패혈증, 통제할 수 없는 혈압 및 최종 사망을 초래하는 것으로 알려져 있다. 특히 고혈압, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환, 뇌 혈관 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 신장 기능 장애와 같은 임상 조건에서 예후는 감염된 환자에게는 매우 좋지 않다 (Zaim, S. 등, 2020).
중증 COVID-19 ICU 환자의 치료를 위해, 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드 (Russell, C. D. 등, 2020), 하이드록시 클로로퀸 (Geleris, J. 등, 2020) 및 로피나비르/리토나비어 (Zheng, M. 등, 2020) 와 같은 항바이러스 약물, 비타민 (Grant, W. B. 등, 2020), 알부민 (Riphagen, S. 등, 2020)이 사용되고 있다. 그러나 COVID-19 환자의 임상 관리에 대한 중간 지침에 따르면, 세계 보건기구(WHO)는 다른 이유로 표시되지 않는 한, 스테로이드 사용을 자제할 것을 조언하고 있다. 스테로이드가 면역 반응과 병원체 제거를 억제함에 따라, 바이러스성 폐렴의 환경에서의 일상적인 투여는 오히려 사망률을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Rodrigo, C. 등, 2016). 그럼에도 불구하고, 환자가 패혈증과 그에 따른 사이토 카인 폭풍이 발생할 때 스테로이드 사용은 불가피한 실정이다. 많은 임상의가 항바이러스 및 항염증제 요법의 조합을 적극적으로 사용하여 사이토카인 폭풍을 제어하고 동시에 바이러스 제거를 촉진하지만, ARDS 또는 패혈성 쇼크를 가진 중증 COVID-19 환자의 높은 사망률은 크게 변화하지 않았다.
한편, 회복 환자의 혈장은 SARS-CoV 및 MERS-CoV와 같은 다른 코로나 바이러스 치료에 성공적으로 사용된 이후 COVID-19를 관리하기 위한 첫 번째 옵션으로 제안되고 있다 (Rojas, M. 등, 2020). COVID-19 환자에게 항체, 알부민 및 혈장 단백질이 풍부한 면역 혈청을 주입한 경우, 증상이 호전되는 효과가 있으며, 회복기 혈장의 작용 메커니즘이 이러한 작용은 유사하다. 특히 회복기 혈장 및 면역 혈청의 효과에는, 히스톤에 결합하여 혈소판 응집을 억제하는 알부민의 활성이 포함된다 (Anderson, J. 등, 2020; Shen, C. 등, 2020). 패혈증 상태의 많은 환자에서 히스톤 H4는 혈액으로 방출되고 톨-유사 수용체-4 (Toll-like receptor 4, TLR-4)에 의해 포획되어 사이토카인 폭풍과 같은 과도한 염증 반응을 유도한다 (Ekaney, M. L. 등, 2014; Xu, J. 등, 2009).
알부민은 혈장 단백질로서 다양한 생물학적 과정을 수행하는데, 혈장 알부민은 독특한 리간드-전달 특성을 가지고 있어 혈장 알부민에 결합된 소수성 약물에 대하여 향상된 용해도를 부여하고, 생물학적 환경에서 약물 분자가 향상된 약물동력학적 특징을 나타낼 수 있도록 돕는다. 특히 알부민은 비독성, 비면역원성, 생체적합성 및 생분해성 등의 특성으로, 약물 전달용 담체로서의 역할을 할 수 있으며, 특히 종양 표적화를 위한 약물 전달 개발에도 이용될 수 있다(Kratz, 2008). 구체적인 예로 비소세포성 폐암 및 유방암에 대한 치료제로서 Celgene™사에서 개발한 아브락산(Abraxane, paclitaxelalbumin NPs)이 파클리탁셀-로딩된 나노입자 인간 혈청 알부민(Abraxane)이 2005 년에 미국 FDA의 승인을 받았으며, 약 7가지 알부민 기반 약물 또는 조영제(imaging agents)가 시장에 출시되었다. 또한 약 10가지의 상품이 암, 당뇨, C형 간염 및 류마티스성 관절염 등의 치료에 임상 적용되고 있다(Yu 등, 2014; Zhao 등, 2015).
한편 진세노사이드(ginsenosides) 또는 파낙소사이드(panaxosides)는 거의 독점적으로 식물 속 Panax(인삼)에서 발견되는 스테로이드 글루코시드 및 트리테르펜 사포닌으로, 진세노사이드의 면역강화를 비롯한 많은 약리활성이 알려져 있다. 가장 알려진 진세노사이드는 담마란 패밀리의 구성원으로, 4-링, 스테로이드 유사 구조로 구성된다. 각 진세노사이드에는 탄소-3 및 -20 위치 또는 탄소-3, -6 및 -20 위치에서 각각 2 개 또는 3 개의 하이드록실기가 결합되어 있다. 프로토파낙사디올에서, 당은 탄소 골격의 3-위치에 부착되는 반면, 프로토파낙사트리올에서 탄소 -6 위치에 부착된다. 이미 알려진 프로토파낙사디올은 Rb1, Rb2, Rg3, Rh2 및 Rh3 등을 포함하며, 프로토파낙사트리올에는 Rg1, Rg2 및 Rh1 등이 포함된다. 많은 종류의 진세노사이드가 발견되고 있으며, 희귀 진세노사이드의 약리활성이 밝혀지고 있다.
본 발명자들은 희귀 진세노사이드의 약리활성을 연구하던 중 희귀 진세노사이드 분획이 염증 개선에 중요한 역할을 하는 점을 확인하였으며, 특히 중증의 COVID-19 환자에서 알부민과 함께 주요 사이토카인 발현을 개선하는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
종래선행기술인 한국공개특허 제1020150055683호에는 진세노사이드를 함유하는 감기, 조류 인플루엔자 또는 돼지 인플루엔자의 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물과는 그 구성에 있어서 차이가 있다.
한국등록특허 제1774150호에는 BSA(Bovine serum albumin)와 진세노사이드의 결합체 및 이의 용도가 기재되어 있으나, 본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자와는 그 구성에서 차이가 있다.
한국공개특허 제1020150055683호, 진세노사이드를 함유하는 감기, 조류 인플루엔자 또는 돼지 인플루엔자의 예방 또는 치료용 조성물, 2015. 05. 22. 공개. 한국등록특허 제1774150호, BSA(Bovine serum albumin)와 진세노사이드의 결합체 및 이의 용도, 2017. 08. 28. 등록.
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본 발명의 목적은 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 스테로이드 진세노사이드 유도체는, Rg6 또는 RGX365인 것을 특징으로 한다. 진세노사이드 Rg6는 인삼에서 추출한 희귀 진세노사이드 중 하나로 스테로이드와 같은 구조를 갖고 있으며, Toll-like receptor (TLR) 4 유도 전신 염증 반응에 상당한 면역 억제 기능을 가지고 있는 것으로 알려지고 있다. Rg6는 생체 내 염증 반응 및 중증도를 조절하며, 지질다당류 (LPS) 유발 패혈성 쇼크 및 맹장 결찰 및 천자 (CLP) 유발 패혈증이 있는 마우스에서 회복을 유도한 보고가 있다
Rgx365는 본 발명자 그룹이 인삼의 희귀 진세노사이드를 분리하는 과정에서 추출한 프로토파낙사트리올 유형의 희귀 진세노사이드 분획으로, 여러 번 찐 후 건조하여 제조된 흑삼에서 희귀 사포닌인 진세노사이드 Rg6 및 프로토파낙사트리올형 진세노사이드 혼합물 Rgx365를 분리 정제했다. Rgx365는 Rg4와 Rg6를 다량 함유하고 있다. 본 발명자의 선행연구에서 Rgx365는 미세먼지 PM 2.5로 유도된 활성산소종(ROS)을 상당히 제거하고, P38 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK)의 ROS 유도 활성화를 억제하였다. Rgx365는 또한 살균, 항 당뇨, 상처 치유, 면역 자극 및 항산화 효과를 포함한 다양한 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 스테로이드성 진세노사이드를 포함하는 친유성 화합물이 알부민 표면의 소수성 포켓에 흡착되어 자가 조립을 통해 주입 가능한 나노 구조를 형성 할 수 있으며, 기능화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 도입하여 알부민의 부위별 변형을 수행하여 혈류 순환을 연장할 수 있을 것으로 예상하고 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자의 제조방법의 페길화 나노입자 알부민은 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 에 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드 (monomethoxyPEG maleimide) 를 사용하여 변형한 것일 수 있다.
페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 다음과 같은 관점에서 SARS-CoV-2 매개 과염증 반응을 완화할 수 있다. 먼저, 오래 지속되는 진세노사이드에 의하여 스테로이드에 의한 급성 면역 억제를 회피할 수 있다. 또한 과한 염증 반응을 수반하는 장기 손상과 혈액 응고를 제어할 수 있으며, 바이러스 감염으로 인한 변동하는 혈압을 정상화하는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자가 COVID 19 환자의 혈액 샘플에서 NF-κB 경로의 다운스트림 조절을 통해 히스톤 H4의 상승 및 이에 의한 사이토카인 폭풍을 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, 3D 혈관 모델 및 감염 유발 패혈증 마우스 모델을 통해 혈전 형성 및 혈관 염증 억제 등에 대한 이러한 약물의 효능을 평가한 결과, SARS-CoV-2 매개 질병에 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자가 효과가 있음을 확인하였다.
상기 페길화 나노입자 알부민은 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 에 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드 (monomethoxyPEG maleimide) 를 사용하여 변형한 것일 수 있다.
상기 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는
폴리에틸렌글리콜을 소혈청알부민(BSA)과 혼합하여 접합시켜 페길화된 소혈청알부민(PEG-BSA)을 제조하는 단계 (1);
상기 (1) 단계에서 제조된 페길화된 소혈청알부민(PEG-BSA)과 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해된 진세노사이드(Ginsenoside)를 혼합하고 초음파 펄스를 적가하여 현탁시키는 단계 (2);
상기 (2) 단계의 현탁액을 동결 건조하여 잔류 DMSO를 제거하고 물에 재현탁시키는 단계 (3);
상기 (3) 단계의 재현탁액을 여과하여 로딩되지 않은 진세노사이드를 제거하는 단계 (4);를 포함하는 제조방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 혈액 내 히스톤 H4 (Histone H4), 무세포 DNA (cell-free DNA, cfDNA), 호중구세포외트랩(Neutrophil extracellular traps, NET), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO) 활성, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase, NE)로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 감소시킬 수 있다.
SARS-CoV-2 감염 또는 SARS 감염 등은 혈액 응고, NETosis, 사이토카인 스톰 및 염증을 보인다. 특히 호중구는 포식 작용(phagocytosis), 탈과립(degranulation), 호중구 세포밖 덫(neutrophil extracellular traps, NET) 분비를 통하여 면역작용을 수행하는데, NET은 세포 밖에 존재하는 큰 그물 같은 구조로, 탈응축된 크로마틴을 뼈대로 하여 정렬된 세포질/과립 단백질로 구성되어 있다. NET은 박테리아, 균류, 바이러스, 기생충을 포획, 중화, 살해하며, 박테리아 및 균류의 전파를 억제하나, 적절하게 조절되지 않으면 NET은 면역 관련 질병을 발생시킬 수 있다. NET의 분비는 크게 두 가지 과정을 통해 이루어지는데, NETosis (slow cell death)는 호중구의 핵의 탈분엽화(delobulation)이 일어나고, 핵막이 해체된다음 세포의 탈극화(depolarization)가 일어나며, 크로마틴의 탈응축(decondensation)이 일어나면서 plasma membrane이 찢어지고 NET가 분비된다. 이 과정으로 호중구가 서서히 죽음에 이르기 때문에 slow cell death로 불린다.
본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 SARS-CoV-2 감염에 의한 NETosis 과정의 혈액 내 히스톤 H4 (Histone H4), 무세포 DNA (cell-free DNA, cfDNA), 호중구세포외트랩(Neutrophil extracellular traps, NET), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO) 활성, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase, NE)로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 SARS-CoV-2 에 의하여 증가된 사이토카인을 감소시키는 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. SARS-CoV-2 등에 의하여 감염환자의 체내에 사이토카인이 비정상적으로 증가할 수 있다. 이를 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome, CRS) 또는 심한 경우 사이토카이 폭풍(cytokine storm)이라 한다.
사이토카인 방출 증후군은 많은 수의 백혈구가 활성화되고 염증성 사이토카인을 방출할 때 발생하며, 이는 다시 더 많은 백혈구를 활성화시켜 심각한 상황을 초래한다.
상기 SARS-CoV-2 에 의하여 증가된 사이토카인은 IL-6(Interleukin 6), IL-8(Interleukin 8), IL-1 beta(Interleukin 1 beta), IFN-gamma, IL-4(Interleukin 4), TNF-alpha(Tumor necrosis factor-alpha), CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2), IL-10(Interleukin 10), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), IL-3(Interleukin 3), CXCL9(Chemokine (C-X-C motif) ligand 9), Pentraxin-3, IL-11(Interleukin 11), CCL3(C-C Motif Chemokine Ligand 3), CCL7(C-C Motif Chemokine Ligand 7), GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor), IL-5(Interleukin 5), IL-15(Interleukin 15), CRP(C-reactive protein), IL-16(Interleukin 16), IL-22(Interleukin 22), IL-27(Interleukin 27), IL-17A(Interleukin 17A), IL-34(Interleukin 34), IL-2(Interleukin 2), MMP-9(Matrix Metalloproteinase-9), CXCL10(C-X-C motif chemokine ligand 10), PF4(Platelet factor 4), Cystatin C, IL-13(Interleukin 13), TARC(thymus- and activation-regulated chemokine), TGF-alpha(Transforming growth factor alpha), HGF(Hepatocyte growth factor), IL-1 alpha(Interleukin 1 alpha), FGF-19(fibroblast growth factor 19), IL-31(Interleukin 31), PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor -AA), GRO-alpha((growth-regulated oncogene-alpha), IL-12(Interleukin 12), MPO(Myeloperoxidase), IL-24(Interleukin 24), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), GDF-15(Growth differentiation factor-15), RANTES (Regulated upon Activation, Normal T Cell Expressed and Presumably Secreted), FGF-7( Fibroblast Growth Factor 7), Osteopontin, CXCL11(C-X-C motif chemokine 11), IL-18 Bpa(Interleukin 18 Bpa), IL-23(Interleukin 23), SHBG(Sex hormone-binding globulin), Kallikerin 3, Dkk-1(Dickkopf Homolog 1), Angiopoetin-2, IL-1ra(Interleukin 1ra), Serpin E1, LI-32a(Interleukin 32a), Relaxin-2, CD40 Ligand, BAFF(B cell activator factor) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다.
본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 염증 혈관의 투과성을 감소시킬 수 있다.
또한 본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 C- 반응성 단백질 (CRP), 젖산 탈수소 효소 (LDH), 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT), 아스파르트 산 아미노 전이 효소 (AST) 및 크레아티닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 조직 손상 마커를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 NADPH oxidase 2 (Nox2), NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 (NLRP3), Interleukin 1 beta (IL1b), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1), Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) 및 Vascular cell adhesion protein 1 (Vcam1)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 발현을 감소시킬 수 있다.
상기 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명은 페길화 알부민 결합 스테로이드 진세노사이드 유도체 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 급성 면역 억제 효과로 인해 스테로이드의 부작용을 줄일 수 있으며, 감염성 질환에서 히스톤 및 사이토 카인과 같은 내 독소를 제거함으로써 과도한 염증 반응에 의한 기관 손상과 혈액 응고 메커니즘을 제어하고, 현재 SARS-CoV-2 전염병 상황에서 항 바이러스제 개발 전에 이환율 및 사망률의 개선에 중요한 역할을 할 수 있다.
도 1은 Histone H4가 SARS-CoV-2 환자의 혈장에서 유의하게 증가한 것을 보여주는 결과이다. (A) 대조군, SARS-CoV-2 환자(non-ICU), SARS-CoV-2 환자(ICU)의 혈장에서 혈청 히스톤 H4 수준 (B) 생존 및 사망 사례에서 SARS-CoV-2 환자의 혈장에서 혈청 히스톤 H4 수준 (C) SARS-CoV-2 환자의 폐 조직에 대한 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 이미지
도 2A는 본 발명의 PNAB-진세노사이드의 제작과정을 도시한 것이며 2B는BSA-PEG 컨쥬게이션을 확인한 SDS-PAGE 사진이다.
도 3은 본 발명의 BSA : PEG의 중량비로써 공급 비율이 5 : 1 일 때 PEG화된 알부민(BSA-PEG)에 대한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 결과를 BSA의 그것과 함께 나타낸 것이다.
도 4A는 PEG화된 알부민 결합 Rg6 및 RGX365(이하 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365)의 입자크기 분포를 나타낸 그래프이며 4B는 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 나타낸 것이다. (스케일 막대 : 100nm)
도 5는 나노파티클로부터 진세노사이드의 방출을 수학적으로 분석하여 나타낸 것이다. (A) 시간 및 pH에 따른 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 누적 방출량 (B) PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 각 모델에 따른 결정계수(R2) 및 용출 상수(K0, K1, KH 및 KBL)
도 6은 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 히스톤 H4 매개 호중구 세포외 트랩 (NET) 억제효과를 나타내는 그래프이다. (A) 히스톤 H4의 PNAB-진세노사이드 복합체에 대한 결합 분석 결과. (B-E) PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 SARS-CoV-2 환자에서 증가된 (B) cfDNA, (C) NET, (D) MPO 활성 및 (E) NE 에 대한 억제하여 NETosis 억제효과를 나타냄 (** p <0.01)
도 7은 BSA-Rg6 및 BSA-RGX365 처리가 SARS-CoV-2 환자의 혈장에서 사이토 카인 폭풍을 억제하는 것을 보여주는 표이다.
도 8은 BSA-Rg6 및 BSA-RGX365 처리에 따른 SARS-CoV-2 감염 중증환자(ICU)의 혈장 내 (A) NF-κB (B) IL-1β (C) IL-4 (D) IL-6 (E) IL-8 (F) IFN-γ (G) TNF-α의 농도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 SARS-CoV-2 매개 사이토카인 폭풍을 억제하는 RGX365의 작용을 나타내는 모식도이다.
도 10은 SARS-CoV-2 감염 중증환자(ICU)의 혈장 내 PBMCs의 BSA-Rg6 및 BSA-RGX365 처리에 따른 상대적 세포 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 11은 SARS-CoV-2 감염 중증환자(ICU)의 혈장 내 BSA-Rg6 및 BSA-RGX365 처리에 따른 SREBP2, Caspase-1 및 Caspase-3/7의 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 SARS-CoV-2 감염 중증환자(ICU)의 혈장 내 BSA-Rg6 및 BSA-RGX365 처리에 따른 SREBF2, NOX2, NRLP3, MCP1, VCAM1, ICAM1 및 ELAM1의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 엔지니어드 3차원 혈관 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365가 SARS-CoV-2 환자의 혈장으로 유도한 혈관 투과성 및 혈관 염증을 완화하는 효과를 보여주는 도면이다. (A) 엔지니어드 3차원 혈관 모델을 사용하여 혈관 기능의 회복을 위한 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효능 테스트의 개략도 (B) 엔지니어드 혈관에서 40kDa FITC-덱스트란(녹색)의 분자 수송상태를 나타내는 면역 형광 이미지 (C) PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 처리 후 정량화된 내피 투과성 (** p <0.01)
도 14는 엔지니어드 3차원 혈관 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365가 SARS-CoV-2 환자의 혈장으로 유도한 혈전 형성 및 혈관 염증을 완화하는 효과를 보여주는 도면이다.(A) PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 처리 후 조작 된 혈관의 면역 형광 이미지 (빨간색 : F- 액틴, 녹색 : ICAM-1, 파란색 : 피브리노겐) (B) 혈전 형성 및 혈관 염증의 완화에 있어서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효과를 나타낸 모식도
도 15는 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 치료 후 혈관 기능 회복에 대한 효과를 나타낸 것이다. (A) 엔지니어드 3D 관류 혈관 모델을 TNF-α로 파괴 후, PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효능 테스트 개략도 (B) 혈관에서 40kDa FITC- 덱스트란(녹색)의 분자 수송상태를 나타내는 면역 형광 이미지 (C) PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 처리 후 정량화된 내피 투과성 (*** p <0.001).
도 16은 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 패혈증 마우스 모델의 생존율 및 조직손상에 미치는 효과를 나타내는 도면이다. (A) PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 처리 후 CLP 패혈증 마우스 모델의 시간 경과에 따른 생존율 (PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 (5 mg/kg)는 CLP-수술 24 시간 후에 정맥으로 전달) (B) PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 처리 후 마우스 폐 조직의 조직학적 분석
도 17은 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 패혈증 마우스 모델의 생존율 및 사이토카인 폭풍, 조직손상에 미치는 효과를 나타내는 도면이다. (A) 기관지 폐포 세척 (BAL)에서 혈관 투과성, 폐 ICAM-1 발현, 백혈구 및 호중구 이동, 폐 조직의 NF-κB 및 SREBP2 활동을 포함한 병리학 특징 (* p <0.05). (D) C-반응성 단백질 (CRP), 젖산 탈수소 효소 (LDH), 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT), 아스파르테이트 아미노 전이 효소 (AST) 및 크레아티닌 (* p <0.05)을 포함한 조직 손상 마커의 발현. (E) IL-1β, IL-6, IL-8 및 INF-γ 등의 사이토카인의 발현 (* p <0.05).
도 18는 CLP 마우스 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 염증 관련 유전자(Nox2, Nrlp3, IL1b, Mcp1, Icam1 및 Vcam1) 발현에 미치는 영향을 나타낸 RT-PCR 분석 그래프이다 (* p <0.05).
도 19는 SREBP2 경로에서의 Rg6 또는 RGX365의 작용을 나타내는 모식도이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
1. 실험방법
1.1. 실험재료
BSA, 포스페이트 모노베이직, 타우로콜산 (TC), 중수소 산화물, 디메틸 설폭 사이드 -d6 및 알부민-플루오레세인 이소티오시아 네이트 접합체는 Sigma-Aldrich Co.(미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. mPEG-MAL(2 kDa)은 Biochempeg (미국 뉴욕주 워터타운)에서 구입하였다.
혈장 샘플은 대한민국 대구의 공중 보건소에서 SARS-CoV-2 감염 진단을 받은 후 영남 대학교 병원 입원 환자로부터 전혈을 채취하여 얻었다. SARS-CoV-2-감염 환자 중 진행성 패혈성 쇼크 또는 급성 호흡기 증후군 질환 (ARDS) 환자는 중환자실(ICU)에 입원하고 경증 환자는 일반 병동에 입원했으며, 이때 COVID-19 패혈증 환자는 패혈증 컨센서스 회의위원회 66에서 제공한 기준에 따라 분류된 환자들이었다. 이후, 모든 환자에 대해 임상 데이터가 수집되었다. 전혈 수집 후 12 시간 내에 5 분 동안 2000×g에서 원심분리하여 혈장 샘플을 제조하였다. 인간 연구 프로토콜은 대구 영남대학교병원 임상시험 심사위원회의 승인을 받았다 (YUH-2020-03-057, 2020-05-031-001).
1.2. 혈액 세포 수 결정
환자의 정맥혈 샘플에서 완전한 혈액 세포 수를 얻었다. 결과는 입원 후 24 시간 이내에 분석되었으며, 혈액 세포 수는 Sysmex XE-2100 자동 혈액학 시스템 (Sysmex Corp. Kobe, Japan)을 사용하여 수행되었다.
1.3. 히스톤 H4 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA)
혈장 내 히스톤 H4 농도는 인간 히스톤 H4 ELISA 키트 (MBS101164, MyBioSource Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 결정되었다.
1.4. 혈장 cfDNA의 정량화
SARS-CoV-2-감염 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 단리하기 위해, 혈장의 원심 분리 후 Qiagen QIAamp DNA 혈액 미니 키트를 제조사의 지침 (Qiagen, Valencia, CA, USA)에 따라 사용하였다 16,800×g에서 10 분 동안. 정제된 cfDNA를 NanoDrop 분광 광도계 (Thermo Scientific, Loughborough, UK)를 사용하여 정량화하였다.
1.5. NET ELISA
분리된 호중구에 NETs 생성을 유도하기 위하여 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 콘트롤 배지 (RPMI 1640, 글루타민, 페니실린 및 스트렙토 마이신)에서 호중구 1×105 cells을 25 nM의 phorbol-myristate acetate (PMA, Sigma-Aldrich, MO, USA)로 자극한 후, Singer, M.(2016) 등의 방법으로 형광 측정 기술을 사용하여 평가하였다. NET 생성은 임의의 형광 단위 (AFU)로서 측정되었다.
1.6. MPO 및 NE ELISA
SARS-CoV-2-감염된 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 탈과립시 과립 매트릭스 단백질의 방출을 정량화하기 위해, 혈장을 인간 MPO ELISA 키트 (BMS2038INST, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 인간 호중구 엘라스타제 (NE) ELISA 키트 (MBS725923, MyBioSource Inc., 미국 캘리포니아 주 샌디에고)를 이용하여 분석하였다.
1.7. 단백질 프로파일링
Human XL Cytokine Array Kit (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 지시된 대로 정상인 또는 SARS-CoV-2 환자의 혈장 풀을 처리하였다. 현상된 필름을 스캔하고, 수득된 이미지를 ImageJ 버전 1.43 (NIH, Bethesda, MD, USA)을 사용하여 분석하였다.
1.8. NF - κB 활성
핵 추출물 및 TransAM 분석은 Xu, J.(2014)의 방법대로 수행되었다. 개별 NF-κB 서브 유닛의 활성은 ELISA-기반 NF-κB 패밀리 전사인자 분석키트 (43296; Active Motif, Carlsbad, 캘리포니아, 미국)로 결정하였다. 핵 추출물 2 ㎍을 NF-κB 컨센서스 올리고 뉴클레오티드로 코팅된 96-웰 플레이트에서 배양한 후, 포획된 복합체를 특이적 NF-κB 1 차 항체와 함께 인큐베이션한 후 키트에 포함된 HRP-접합 2 차 항체를 사용하여 검출하였다. 마지막으로, 450 nm에서의 광학 밀도(OD)는 Tecan Spark 마이크로 플레이트 리더 (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 사용하여 측정하었다.
1.9. 사이토카인 ELISA
인간 ELISA 키트 (Quantikine ELISA, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IFN-γ 및 TNF-α의 혈청 내 수준을 측정하였다. 결과는 pg / mL로 표현하였다.
1.10. WST -1 세포 증식 분석
PBMC를 각각 본 발명의 나노파티클에 노출시킨 후, 웰당 10 μL의 WST-1 시약을 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 소정 시점에서, 흡광도 측정은 Tecan Spark 마이크로 플레이트 리더 (Tecan, Austria GmbH, Austria)로 480nm 및 600nm (배경)에서 수행되었다.
1.11. 실시간 PCR
본 발명의 나노파티클을 포함 또는 포함하지 않고 PBMC 배양에서 cDNA를 생성하기 위해, 1 ㎍의 총 RNA를 확장 역전사 폴리머라제 (Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 랜덤 6 량체로 역전사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Roche Diagnostics GmbH의 LightCycler FastStart DNA 마스터 SYBR Green I을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. LightCycler 조건은 다음과 같다 : 95 ℃에서 10 분 동안 초기 변성 후, 95 ℃에서 10 분 변성, 60 ℃에서 5 분 어닐링 및 72 ℃에서 15 분 동안의 신장을 45 사이클을 실시하였다. 샘플에서 특이적 mRNA의 양은 상응하는 유전자-특이적 표준 곡선에 따라 측정되었다.
실시간 PCR 프라이머 서열은 다음과 같다.
1. hSREBF2 :
F-CCTTCCTGTGCCTCTCCTTTA, R-AGGCATCATCCAGTCAAACCA
2. hNOX2 :
F-AACGAATTGTACGTGGGCAGA, R-GAGGGTTTCCAGCAAACTGAG
3. hNLRP3 :
F-TGCCGGGGCCTCTTTTCAGT, R-CCACAGCGCCCCAACCACAA
4. hMCP-1 :
F-CGCTCAGCCAGATGCAATCAATGC, R-GGTTTGCTTGTCCAGGTGGTCCA
5. hVCAM1 :
F-TGTCAATGTTGCCCCCAGAGATACA, R-GGCTGTAGCTCCCCGTTAGGGA
6. hICAM1 :
F-GTGTCCTGTATGGCCCCCGACT, R-ACCTTGCGGGTGACCTCCCC
1.12. 카스파제 검출 검정
Caspase-Glo® 1 인플라마좀 검정 키트 (G9951, Promega, Madison, WI, USA) 및 Caspase-Glo® 3/7 분석 시스템 (G8090, Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 PBMC의 카스파제 활성화를 측정하였다.
1.13. BSA-mPEG의 합성
PEG-MAL (20mg)을 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) (100mg) 용액에 천천히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 6-8 kDa의 분자량 컷오프 (Cellu-Sep T2; Membrane Filtration Products, Texas, Seguin, USA)를 갖는 투석 막을 사용하여 이중 탈이온수 (DDW)에 대해 투석 하였다. 투석 생성물 (즉, BSA-mPEG)을 동결 건조시키고 사용할 때까지 -70 ℃에서 보관하였다.
1.14. BSA 및 BSA-mPEG의 특성 분석
BSA 및 BSA-mPEG는 매트릭스-보조 레이저 탈착 및 이온화 비행시간 (MALDI-TOF; Voyager DE-STR, Applied Biosystems, USA)을 특징으로 하였다. SDS-PAGE는 10 % 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 수행되었다. 샘플을 110V에서 120 분 동안 전기영동시켰다. 전기영동 후, DDW에서 겔을 5 분 동안 3 회 세척하여 SDS를 제거하고, 겔을 쿠마시 블루 염색으로 60 분 동안 염색하고, 증류수로 20 분 동안 3 회 세척하였다. PEG 부분을 염색하기 위해, 겔을 5 % 염화 바륨 용액에 15 분 동안 침지시키고, DDW로 30 분 동안 세척하고, 0.05M 아이오다이드 용액으로 15 분 동안 염색하였다.
1.15. RGX365의 제조
RGX365는 본 발명자그룹의 선행특허의 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. 진세노사이드 Re 304g에 증류수 45㎖를 첨가하여 121℃, 013MPa 조건으로 6시간 동안 처리한 다음 컬럼 분리하였다. 컬럼에 원료비례 10배 이상인 합성흡착제 300g을 넣고 용리 용매로 충분히 세정하였다. 증류수 5ℓ를 흘린 후 발효주정 5ℓ를 흘려주었다. 이때 컬럼 내 기포가 혼입되지 않도록 주의하며, 다시 물 5ℓ를 흘려 컬럼 준비를 하였다. 상기 진세노사이드 Re를 6시간 동안 처리한 반응물은 발효 주정(50 ㎖)과 증류수(300㎖)를 이용하여 용해시키고 물 분액물을 만들어 컬럼 내 부었다. 물 분액을 부어준 후 증류수 약 5ℓ를 흘려준 다음, 20% 발효주정, 25% 발효주정, 30% 발효주정 용매로 순차적 흘려 이물을 제거하였다. 35~70% 발효주정 용매에서 RGX365를 분획으로 얻었으며, 이를 감압농축하여 RGX365 18g을 얻었다.
상기 RGX365에 포함된 진세노사이드는 Rg2 7.4 g(41.1중량%), Rg4 6.4 g(35.4중량%), Rg6 2.6 g(14.2중량%) 및 Rh1 0.8 g(4.4중량%)이었다.
1.16. NAB- 및 PNAB - 진세노사이드의 제조
디메틸설폭사이드 (DMSO; 180 μL)에 용해된 Rg6 또는 RGX365 (3 mg) 및 DDW (45 μl)에 용해된 BSA 또는 BSA-mPEG (5 mg)를 30 초 동안 인버팅(inverting)하여 혼합하였다. 이후, DDW (775 μL)를 가하고 초음파 처리기(VC-750; Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA)를 사용하여 20 %의 진폭으로 2 초 및 3 초의 펄스 주기로 혼합물에 적가 하였다. 생성된 용액을 즉시 동결 건조하여 잔류 DMSO를 제거하였다. 동결 건조된 생성물을 DDW (1 mL)에 재현탁시키고 0.45 μm 기공 크기의 시린지 필터를 통해 여과하여 로딩되지 않은 진세노사이드를 제거하였다.
1.17. NAB- 및 PNAB -진세노사이드의 특성 분석
NAB- 및 PNAB- 진세노사이드의 유체역학적 직경, PDI 및 제타 전위는 동적 광산란 방법 (Zetasizer Ultra; Malvern Panalytical, Malvern, UK)을 사용하여 측정되었다. 제제의 형태는 TEM (Talos L120C; FEI, 체코)을 사용하여 관찰되었다. 제제를 200-메쉬 탄소-코팅된 구리 그리드의 표면에 놓고 우라닐 아세테이트 (UA)로 음각염색시켰다. EE 측정을 위해, NAB- 또는 PNAB-진세노사이드의 분취량 (10 μL)을 0.1 % (v/v) 포름산을 함유하는 아세토니트릴 (ACN; 990 μL)과 5 분 동안 볼텍스 혼합하였다. 혼합물을 2 분 동안 초음파 처리하고 13,000 ×g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액 (50 μL)을 0.1 % (v/v) 포름산 및 내부 표준 (TC, 50 ng / mL)을 포함하는 ACN (950 μL)과 혼합하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 분석샘플)로 분석하였다. 크로마토그래피 분리는 Agilent 1260 Infinity HPLC 시스템 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 분석 샘플의 분취량 (20 μL)을 C18 가드컬럼 (4 × 2.0 mm; Phenomenex, CA, USA)과 함께 Kinetex 2.6 μm C18100Å 컬럼 (100 × 4.6 mm; Phenomenex, CA, USA)에 주입하고, 25 ℃에서. 등용매조건 하에서 0.35 mL/분의 유속으로 용출을 수행하였으며, 총 실행 시간은 5 분이었다. 이동상은 0.1 % (v/v) 포름산 (80:20, v/ v)을 갖는 ACN 및 DDW로 구성되었다. 질량 분석은 API 3200 LC / MS / MS (SCIEX, Framingham, Massachusetts, USA)를 사용하여 수행하였다. 이온 스프레이 소스 온도, 커튼 가스 압력, 가스 1 및 가스 2의 최적화된 이온화 소스 설정은 각각 250 ℃, 25psi, 50psi 및 50psi였다. Rg6 및 -4500V, 145V, 5V, 130eV의 경우 이온 스프레이 전압, 디클러스터링 전위, 진입전위, 충돌 에너지 및 충돌 가스가 5500V, 150V, 1V, 52eV 및 26V로 설정되었다. TC의 경우 각각 28V. 모니터링된 이온 전이 (m/z)는 Rg6의 경우 789.5 → 349.1이고 TC의 경우 514.1 → 79.9이었다.
1.18. 약물 방출 분석
투석법을 사용하여 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 약물 방출 특성을 평가했다. 제형 (약 450μg의 Rg6 및 Rgx365를 함유하는 PNAB-Rg6 또는 PNAB-Rgx365)을 미니 -GeBAflex 튜브(분자량 컷오프 : 6-8kDa; Gene Bio-Application Ltd., Yavne, Israel)에 충전하고, 방출 매체 (1.8 mL; pH 6.6 또는 7.4의 인산염 완충 식염수, PBS)에 담근 다음 37 ℃ 50rpm으로 진탕했다. 튜브는 실험 시작 이후 2, 4, 8, 24, 48 및 72 시간에 신선한 배지로 채워진 다른 용기로 옮겼다. 수집된 방출 배지 (10 μL)를 PBS (90 μL)로 희석하고 0.1 % (v / v) 포름산 및 내부 표준 물질 (TC, 20 ng / mL)을 포함하는 ACN (900 μL)과 3 분 동안 와류 혼합했다. 생성된 혼합물을 16,000 × g에서 5 분 동안 원심 분리하고, NAB- 및 PNAB-진세노사이드의 물리화학적특성 분석에서 언급된 동일한 LC-MS / MS 방법을 사용하여 상청액의 Rg6 농도를 결정했다. 누적 방출 (F; %) 대 시간 (t)은 0 차, 1 차, Higuchi 및 Baker-Lonsdale 모델을 사용하여 수학적으로 예측되었으며, 각 모델의 방정식은 다음과 같다.
0차 모델 Zero-order model:
1차 모델 First-order model:
히구치 모델 Higuchi model:
베이커-론스데일 모델
Baker-Lonsdale model:
여기서 k0, k1, kH 및 kBL은 각 모델의 용출 상수에 해당된다.
1.19. 혈관 모델 실험
미세 바늘을 템플릿으로 사용하여 엔지니어드 혈관을 제작했다. 콜라겐 마이크로 채널은 졸-스테이트 I 형 래트 테일 콜라겐 (Corning, Bedford, MA, USA)을 삽입한 후 겔화 후 제거하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포를 콜라겐 채널의 내강 표면에 파종하고 5 일 동안 배양하여 단단한 혈관 구조를 만들었다. 투과성 분석은 40kDa FITC-Dextran 용액 (10μM, Sigma-Aldrich, 미국 미주리 주 세인트루이스)을 관류성 혈관에 도입하고 공 초점 현미경 (LSM700, Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 분자 수송을 모니터링하였다. 투과성은 맞춤형 MATLAB 코드 (The Mathworks Inc., Natick, USA)를 사용하여 정량화하였다. 엔지니어드 혈관에서 SARS-CoV-2 매개 염증을 유도하기 위해 SARS-CoV-2 환자의 혈장을 혈관에 도입하고 2 시간 동안 배양했다. SARS-CoV-2 환자의 혈장은 응고되기 때문에 충분한 유동성을 확보하기 위해 주사 전 1 : 2 비율 (혈장 : 배지)로 희석했다. 면역 형광 이미징의 경우, phalloidin tetramethylrhodamine B isothiocyanate (F-actin, P1951, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), Anti-ICAM-1 항체 (ICAM-1, ab2213, abcam, Bristol, 영국) 및 항-피브리노겐 항체 (피브리노겐의 경우, ab118488, 브리스톨, 영국)가 사용되었다.
1.20. 동물 사육
수컷 C57BL / 6 마우스 (6-7 주령, 무게 18-20g) 및 수컷 ICR 마우스 (4 주령, 무게 21-24g)는 오리엔트 바이오 및 나라 바이오텍 (한국)에서 구입했다. 각각 12 일간의 순응 기간 후에 사용하였다. 동물은 12:12 시간의 명암 주기로 제어된 온도 20~25 ℃ 및 습도 40 % ~ 45 % 하에 폴리카보네이트 케이지 당 5 마리를 수용하고 정상적인 설치류 펠렛 사료를 공급하였으며, 물을 때에 따라 임의로 공급하였다. 모든 동물은 충남 대학교에서 발행한 실험 동물 관리 및 사용 지침 (IRB 번호; CNU-01050)에 따라 처리되었다.
1.21. 맹장 결찰 및 천자
CLP-유도된 패혈성 마우스 모델은 사용하였다. 2cm 중간선으로 절개하여 맹장과 인접한 장을 노출시켰다. 맹장은 맹장 끝에서 5.0 mm 떨어진 3.0-실크 봉합사를 사용하여 단단히 결찰시켰고, 22 게이지 바늘로 구멍을 뚫은 다음 천공 부위에서 대변이 나오도록 부드럽게 짜냈다. 맹장을 복강으로 되돌리고 개복술 부위를 4.0- 실크를 사용하여 봉합했다. 샴 수술을 위해 동물의 맹장을 외과 적으로 노출시켰지만 결찰이나 구멍을 뚫지 않았다.
1.22. 헤마톡실린 및 에오신 염색
수컷 C57BL / 6 마우스는 CLP를 받고 CLP (n = 5) 후 24 시간에 진세노 사이드 Rg6, Rgx365, PNAB-Rg6 또는 PNAB-Rgx365 (5mg / kg)를 정맥으로 투여했다. 마우스를 CLP 72 시간 후 안락사 시켰다. 마우스에서 폐의 표현형 변화를 분석하기 위해 각 마우스에서 폐 샘플을 제거하고, PBS (pH 7.4)에서 3 회 세척하여 남아있는 혈액을 제거하고 PBS, pH 7.4의 4 % 포름 알데히드 용액 (일본 도쿄, 준세이)에 고정했다. 4 ℃에서 20 시간 동안 고정 후, 샘플을 에탄올 시리즈를 통해 탈수하고 파라핀에 매립하고 4μm 섹션으로 분할하고 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 60 ℃ 오븐에서 탈 파라핀화하고, 재수화한 다음, 헤마톡실린 (Sigma, Saint Louis, MO, USA)으로 염색했다. 과도한 염색을 제거하기 위해 슬라이드를 0.3 % 산성 알코올에 3 회 빠르게 담근 후 에오신 (Sigma, Saint Louis, MO, USA)으로 대조 염색했다. 그 후, 에탄올 시리즈와 자일렌으로 세척한 다음 커버슬립하였다. 맹검 관찰을 통해 폐 표본의 광학 현미경 분석을 수행하여 폐 구조, 조직 부종 및 염증 세포의 침윤을 평가했다.
1.23. 패혈증 마우스 혈장의 임상 화학 및 사이토카인 수준 확인
생화학 키트 (MyBioSource Inc., San Diego, Inc.)를 사용하여 아스파테이트 트랜스 아미나제 (AST), 알라닌 트랜스 아미나제 (ALT), 혈액 요소 질소 (BUN), 크레아티닌 및 LDH를 분석하기 위해 신선한 혈청을 사용했다.. IL-1β, IL-6, IL-10, 단핵구 화학 유인 단백질-1 (MCP-1) 및 TNF-α의 농도를 결정하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용했다 (R&D Systems, Minneapolis, 미네소타, 미국). 값은 ELISA 플레이트 판독기 (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 사용하여 측정하였다.
1.24. 생체 내 투과성 및 백혈구 / 호중구 이동 분석
CLP 모델 마우스에 진세노사이드 Rg6, Rgx365, PNAB-Rg6 또는 PNAB-Rgx365 (5mg / kg)를 정맥 주사했다. 24 시간 후, 생리 식염수 중의 1 % Evans blue 염료 용액을 각 마우스에 정맥 내 주사하였다. 48 시간 후 마우스를 희생시키고, 생리 식염수 (5 mL)로 세척하고 200 × g에서 10 분 동안 원심분리한 후 복막 삼출물을 수집하였다. 상청액의 흡광도는 650nm에서 판독하였다. 혈관 투과율은 에반스 블루 염료의 표준 곡선에 따라 복막강으로 누출된 염료 (μg / mouse)로 표시되었다. 백혈구/호중구 이동의 평가를 위해, CLP 수술을 받은 마우스는 24 시간 동안 CLP 수술 후 각 약물로 처리되었습니다. 그 다음 마우스를 희생시키고 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 0.8 mL의 생리 식염수로 세척 하였다. BAL 유체 (200 μL)는 자동 혈액 분석기 (Mindray, BC 5000 Vet, Shenzhen, China)에 의해 계수되었으며, 결과는 BAL 유체 당 백혈구/호중구 × 105로 표시하였다.
1.25. ICAM의 발현 확인
폐 조직에서 세포간 접착 분자-1 (ICAM-1)의 발현은 직접 ELISA에 의해 결정되었다. 용해된 폐 조직을 Nunc-ImmunoTM MicroWellTM 96 웰 플레이트에 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양했다. 세척 후, 항-마우스 단일 클론 ICAM-1 항체 (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA, 각각 1:50)를 첨가하였다. 1 시간 후 (37 ℃, 5 % CO2), 세포를 3 회 세척 한 다음 1 : 2000 퍼옥시다제 결합 항-마우스 IgG 항체 (100 μL; Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 첨가했다. 1 시간 후, 세포를 다시 세 번 세척하고 o- 페닐렌 디아민 기질 (Sigma, Saint Louis, MO, USA)을 사용하여 현상하였다. 490 nm에서 흡광도를 측정하여 비색 분석을 수행했다. 모든 측정은 삼반복 웰로 수행되었다.
1.26. 패혈증 마우스 혈장의 사이토 카인 수준 확인
생화학 키트 (MyBioSource Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 AST, ALT, BUN, 크레아티닌 및 LDH 수준을 분석하였다. 값은 ELISA 플레이트 판독기 (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 사용하여 측정하였다.
1.27. 통계 분석
모든 실험을 독립적으로 3 회 이상 수행하였다. 통계적으로 유의미한 차이는 짝이없는 t- 검정을 사용하여 결정되었다. 통계 분석은 Graphpriism 소프트웨어 7.0은 사용되었습니다. 유의성은 P <0.05로 설정된 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였으며, 각 실험에 대한 p- 값은 그림 범례에 나타내었다.
2. 실험결과
2.1. SARS- CoV -2 감염 환자의 혈액 내 히스톤 H4 수준 증가
SARS-CoV-2 폐렴과 같은 전염병의 경우, 혈액 응고, NETosis, 사이토카인 스톰, 및 염증을 포함하여 환자의 혈액에서 명백한 임상 징후가 일반적으로 관찰된다. 이러한 임상징후들은 중환자실(Intensive Care Unit, ICU) 또는 사망 사례에서 심각하게 나타난다. 현재까지 SARS-CoV-2 감염을 치료하기 위해 승인된 치료제가 없다는 것을 고려할 때, 이같은 임상징후를 관리하는 것은 환자 상태를 개선하기 위한 주요 전략이다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 환자 혈액 샘플을 분석하는 동안, 우리는 히스톤 H4 수준이 ICU 환자의 혈장에서 고도로 상향 조절됨을 발견했다. 진핵 세포에서 염색질 구조를 구성하는 5 가지 주요 히스톤 단백질 중 하나인 히스톤 H4는 패혈증의 중요한 위험 인자로 연관되어 있으며, 혈류에 방출되어 비정상적인 혈액 응고 및 NETosis를 유발한다. 최근 연구에 의하면, SARS-CoV-2 ICU 환자 혈장에서 D-이량체 농도로 확인되는 비정상 응고 및 cfDNA, NET, MPO 활성 및 NE 에 의해 NETosis도 확인되었으며, 증가된 히스톤 H4 수준과 혈액 응고/NETosis 가 상관 관계가 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 선행연구에 의하면, 알부민은 히스톤 H4- 유도 혈소판 응집을 억제할 가능성이 있으며, 이에 따라 알부민을 혈액 응고 관리를 위한 치료제로 사용될 가능성도 있다.
본 발명자들은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 SARS-CoV-2 환자의 혈장을 분석하였고, SARS-CoV-2 환자 혈장에서 히스톤 H4의 수준이 높게 상향 조절되었음을 확인하였다 (도 1). 임상 결과 데이터에서 히스톤 H4 수준은 비 ICU 환자보다 ICU 환자에서 높았으며, (도 1A), 사망한 사례의 경우 생존 환자보다 높았다 (도 1B). 전산화 단층 촬영 (CT) 이미지는 이러한 ELISA 분석 결과를 뒷받침하였으며, 이는 낮은 히스톤 H4보다 높은 히스톤 H4 사례에서 현저히 높은 폐염증을 보여주었다 (도 1C).
2.2. PNAB -진세노사이드의 제조 및 특성 분석
상기와 같은 COVID-19 환자 혈장 샘플의 분석을 통해, 우리는 (1) 혈청 알부민 수준이 감소하고, (2) 혈액 응고 및 NETosis가 히스톤 H4 증가와 관련하여 증가했으며, (3) 혈액과 폐 조직에서 심각한 사이토카인 폭풍 및 염증이 있음을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 혈액 응고, NETosis 및 사이토카인 스톰을 동시에 처리하기 위해 염증성 사이토카인을 조절할 수 있는 스테로이드 진세노사이드를 알부민 담체를 이용하여 전달할 수 있는 PNAB-진세노사이드를 설계하였다.
PNAB-진세노사이드는 첫째, PNAB-진세노사이드의 투여는 COVID-19 환자의 혈청 알부민 풀을 보충할 수 있으며, 이는 중증 저혈압 환자에서 광범위하게 적용되는 임상 치료법이다. 특히, 본 발명의 PNAB-진세노사이드는 종래의 비가역적인 변성 및 가교 결합 과정을 포함하는 알부민 나노파티클 제조방법과는 달리, 단일 단백질 구조를 유지하면서 가역적 소수성 상호 작용에 기초하여 제조되었다. 둘째, 인삼 (Panax 속)에서 발견되는 스테로이드 글리코사이드인 진세노사이드는 심각한 염증 반응을 억제할 수 있다. 셋째, PNAB-진세노사이드는 PEG 부분으로 기능화되어 노출 증가 및 혈액 순환 시간 연장과 같은 개선된 약동학적 특성을 나타내며, 이는 제제의 효능을 더욱 향상시킬 수 있다.
PNAB-진세노사이드를 제조하기 위해, 소혈청 알부민 (BSA)을 코어 물질로 채택하고 모노메톡시 PEG 말레이미드 (mPEG-MAL)를 사용하여 변형하여, BSA 표면상의 티올기와 선택적으로 반응할 수 있도록 하였다 (도 2A). PEG 컨쥬게이션의 성공 여부는 MALDI-TOF를 사용하여 평가하였으며, 여기서 BSA 및 PEG화된 BSA (BSA-mPEG)의 질량 대 전하 비 (m/z) 값은 각각 66,435 및 71,618 인 것으로 관찰되었다(도 3). mPEG-MAL의 분자량을 고려하면, 접합체의 PEG-BSA의 몰 치환은 2.5 인 것으로 계산되었다. PEG 컨쥬게이션은 SDS-PAGE의 요오드화 바륨 (BaI2) 염색을 사용하여 추가로 확인하였다 (도 2B). 쿠마시 블루 염색에서 관찰된 확장된 BSA-mPEG 밴드는 BaI2 염색에서도 같은 자리에서 관찰되어 단백질과 PEG가 성공적으로 컨쥬게이션되었음을 확인하였다 (도 2B). 밴드의 확장은 주로 mPEG-MAL의 분자량 분포에 기인한다.
마지막으로, Rg6 또는 RGX365를 초음파 처리를 사용하여 BSA-mPEG에 흡착시킨 후, 각각의 나노 입자, 즉 PNAB-Rg6 또는 PNAB-RGX365로 자가조립하였다 (도 2A). NAB- 및 PNAB-진세노사이드의 강도-가중 유체 역학적 직경 (IHD) 및 상응하는 다분산지수 값을 표 1에 기재하였다.
Composition Mean diameter (nm) Polydispersity index Zeta potential (mV) Encapsulation efficiency ( % )
PNAB - Rg6 47.88 ± 0.38 1.16 ± 0.01 -11.86 ± 0.97 65.29 ± 1.43
PNAB - RGX365 48.85 ± 3.29 1.00 ± 0.10 -16.00 ± 0.83 25.80 ± 1.66
본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 IHD는 약 30-50nm이지만 수 가중 HD (NHD)는 10nm 미만으로 소수성화물 분자가 있는 경우 알부민의 자기 조립이 가능하다. 도 4A에서 보는 바와 같이, 단량체 및 자가조립된 나노 입자 알부민은 제제에 공존하며, 이는 대략 1.00의 높은 다 분산 지수 (PDI) 값을 설명한다 (표 1). NAB-진세노사이드의 표면 전하는 -18.05 내지 -20.7 mV의 범위인 것으로 측정되었다 (표 1). 그러나, PNAB- 진세노사이드는 PEG 분자의 차폐 효과로 인해 -11.86에서 -16.00mV로 증가된 값을 나타냈다. NAB- 및 PNAB-Rg6의 봉입률 (EE) 값은 각각 54.22 % 및 65.29 % 였으며, NAB- 및 PNAB-RGX365는 각각 33.10 % 및 25.80 %의 상대적으로 낮은 EE를 나타내지만 (표 1), 치료효과를 나타내기에 충분한 양의 진세노사이드가 나노파티클에 로딩되었다. 조립된 NAB- 및 PNAB- 진세노사이드의 구형 나노파티클은 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지로 확인하였다 (도 4B).
나노파티클로부터 진세노사이드의 방출을 수학적으로 분석하였으며, 1 차 모델이 가장 높은 결정계수(R2)를 보이는 것을 확인하였다 (도 5). 이는 약물의 단백결합(흡착) 현상이 속도론적으로 1차 모델에 따른다는 일반적인 이론과 일치하는 현상이며, 진세노사이드가 알부민 나노파티클에 단백결합으로 흡착되어 있음을 간접적으로 암시한다.
2.3. 중증 COVID -19 환자에서 조직 손상, 염증 및 혈액 응고 증가
표 2는 영남 대학교 병원에 입원한 COVID-19 환자의 기준 특성 및 임상 결과를 나타낸 것이다. ICU 환자의 혈장에서 조직 손상을 나타내는 효소 지표인 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 증가된 수준은 CT 영상으로 확인된 증가된 히스톤 H4 수준 및 폐 염증의 임상 데이터를 뒷받침한다 (표 2).
Total
(n=80)		 Non-ICU
(n=60)		 ICU
(n=20)		 P value
Characteristics
Age, y 55.6 (21-84) 49.6 (42-58) 77.5 (65-92) <0·0001
Sex
Men 35 (43.8) 29 (48.3) 6 (30)
Women 45 (56.2) 31 (51.7) 14 (70)
Laboratory finding
White blood cell count, × 109/L 6.5 (4.7-9.3) 6.1 (4.3-7.8) 10.2 (7.2-14.1) <0·0001
Lymphocyte count, × 109/L 1.2 (0.7-1.5) 0.6 (0.5-0.8) 1.1 (0.8-1.4) <0·0001
Albumin, g/L 31.8 (28.4-35.6) 33.4 (29.8-35.8) 27.4 (24.5-30.2) <0·0001
Lactate dehydrogenase, U/L 312 (221.5-421.2) 255.7 (211.9-322.4) 607 (401.6-823.7) <0·0001
D-dimer, μg/mL 0.9 (0.5-3.5) 0.6 (0.2-1.1) 6.1 (2.1-24.2) <0·0001
Clinical outcomes
Remained in hospital 14 (17.5) 11 (18.3) 3 (15)
Discharged 49 (61.3) 49 (81.7) 0 (0)
Died 17 (21.2) 0 (0) 17 (85)
D-이량체의 수준은 SARS-CoV-2 ICU 환자에서 고도로 상향 조절되어 비-ICU 사례와 비교하여 10 배 증가한 것으로 나타났다 (표 2). 높은 수준의 D-이량체는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 반응으로 혈액 응고의 존재를 나타낸다. 또한, 히스톤 H4는 호중구 세포외 트랩 (NET) 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 증상의 중증도가 증가함에 따라 혈액 알부민 수치가 감소한 것으로 나타났다 (표 2). 최근 중국 우한에서 사망한 사례의 경우, 혈청 알부민 수치가 감소하였다고 보고되었으며, 한국 대구에서도 동일한 결과가 나타났다.
2.4. PNAB - Rg6 및 PNAB - Rgx365의 히스톤 H4-유도 NETosis 억제 효과
본 발명에 의한 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 히스톤 H4-유도 NET을 억제을 억제하였다. SARS-CoV-2 ICU 환자의 혈장에 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365를 도입하고, 히스톤 H4의 농도를 ELISA를 사용하여 측정하였다. 도 6A에서 보는 바와 같이, PNAB-Rg6- 및 PNAB-RGX365- 결합 히스톤 H4는, 결합되지 않고 상청액에 현탁된 히스톤 H4보다 2 배 이상 높았다. 이 결과는 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365가 혈청 히스톤 H4를 흡수할 수 있음을 보여준다.
PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 SARS-CoV-2 ICU 환자-유래 호중구의 NETosis를 억제하였다. 도 6B에서 보는 바와 같이, PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 cell free DNA (cfDNA)의 수준을 감소시켰다 (도 6B). 또한 NETosis와 관련된 단백질 NET, myeloperoxidase (MPO) 활성 및 호중구 엘라스타제 (neutrophil elastase, NE)의 수준을 정상 범위로 회복시켰다 (도 6C-E). 이러한 결과는 PNAB-스테로이드 진세노사이드가 히스톤 H4- 매개 NET를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
2.5. PNAB - Rg6 및 PNAB - RGX365의 SARS- CoV -2-매개 사이토카인 스톰을 억제 효과
SARS-CoV-2 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서도 사이토 카인 폭풍과 관련하여 극적으로 증강된 혈청 사이토카인 수준이 관찰되었다 (도 7). SARS-CoV-2 환자에서 혈청 사이토카인이 과도한 수준으로 관찰되는 사이토카인 스톰이 일반적으로 관찰된다. 이 SARS-CoV-2 환자의 혈장에서 PNAB-Rg6 또는 PNAB-RGX365를 처리하면 염증성 사이토 카인 수준이 현저히 감소했다 (도 7).
PNAB-Rg6 또는 PNAB-RGX365는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 패혈증 사례를 포함하여 SARS-CoV-2 ICU 환자로부터 유래된 PBMC에서 매우 효과적이었다. 특히, PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 처리는 핵인자-κB (NF-κB) 신호 경로의 활성화를 억제하였고, 이러한 억제는 PNAB-RGX365에서 더욱 효과적이었다 (도 8A). 또한, 본 발명의 PNAB-스테로이드 진세노사이드은 인터루킨(IL) -1β, IL-4, IL-6, IL-8, 인터페론 (IFN)-γ, 종양괴사인자 (TNF)-α와 같은 PBMC에 의해 생성된 염증성 사이토카인의 수준을 감소시켰다 (도 8B-G).
이러한 결과는 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 치료 시, SARS-CoV-2 환자의 PBMC에서 사이토카인 폭풍을 조절할 수 있음을 시사한다. 즉, 도 9에서 보는 바와 같이, 스테로이드 진세노사이드 (Rg6, RGX365)는 (1) RGX365는 SARS-CoV-2- 감염 호중구의 NETosis를 억제하고 (2) SARS-CoV-2 바이러스에 의해 직접 활성화될 수 있는 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화 저해하며 (3) 염증성 사이토카인의 과잉 생산을 개선시킨다.
2.6. PNAB - Rg6 및 PNAB - RGX365의 SARS- CoV -2 ICU 환자의 PBMC에서 SREBP -2 매개 인플라마좀 형성 억제 효과
사이토카인 폭풍은 SARS-CoV-2 환자의 중요한 특징 중 하나이다. 본 발명자들은 두 신호 경로, NF-κB 및 SREBP2 경로를 통해 사이토카인 폭풍 문제를 평가하였다. SARS-CoV-2 ICU 환자로부터 유래된 PBMC에서, NF-κB 신호 전달이 상향 조절되며, NF-κB 신호 전달 경로가 사이토카인 생산과 강한 상관 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 NF-κB의 다운 스트림 신호 전달에 속하는 SREBP2는 감염시 염증 형성을 조절한다.
SARS-CoV-2 ICU 환자의 PBMC의 생존력은 염증 신호 경로의 과도한 활성화로 인해 시간에 따라 감소하였다 (도 10). 본 발명자들은 PBMC 생존율의 구제에서 PNAB-스테로이드 진 세노 사이드의 효과를 평가 하였다. PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 ICU 환자에서 분리된 PBMC의 생존률을 증가시켰다 (도 10). 또한, PNAB-Rg6 또는 PNAB-RGX365 처리 시, SREBP2 및 카스파제(Caspase) 활성 수준이 감소하였다 (도 11A-C). SREBP2는 인플라마좀 형성과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 이후 카스파제-1 활성을 활성화시키고 IL-1β의 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365 처리에 의해 SREBP2, 카스파제-1 및 카스파제-3/7의 활성이 정상 수준으로 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 실시간 중합 효소 연쇄 반응 실험을 통하여 본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365가 염증 관련 mRNA 발현을 조절하는 것을 확인하였다. PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365의 처리에 의하여 SREBP2, NOX2, NRLP3, MCP1, VCAM1, ICAM1 및 ELAM1을 포함한 염증 관련 mRNA 발현이 억제되었다 (도 12). NOX2는 반응성 산소 종 (ROS)을 형성하는 NADPH 산화 효소 2 (NOX2)를 암호화한다. NLR 패밀리 피린 도메인에 의해 암호화 된 단백질은 NF-κB 신호 전달 경로의 상류 활성화제로서 기능하고 염증을 조절한다. 단핵구 화학유인 단백질 1 (MCP1)은 단핵구 이동 및 침윤을 조절하는 케모카인이며, 죽상 동맥경화증의 양과 상관 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 혈관 세포 접착 분자 1 (VCAM1), 세포 간 접착 분자 1(CAM1), 및 내피 백혈구 부착 분자 1 (ELAM-1)은 염증 관련 세포-접착과 관련이 있다. 본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 이들 유전자의 발현을 감소시켰다 (도 12).
2.7. PNAB - Rg6 및 PNAB - RGX365의 혈전 형성 및 혈관 염증 완화 효과
SARS-CoV-2 환자에서 혈관 손상은 조직 손상을 유발할 수 있기 때문에 문제가 된다. 혈관 기능 회복에 대한 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효과는 엔지니어드 3차원 관류 혈관 모델(engineered 3D perfusable blood vessel model)을 사용하여 평가하였다. SARS-CoV-2 환자와 유사한 혈관 염증을 유도하기 위해 SARS-CoV-2 환자의 혈장을 엔지니어드 혈관에 도입하고 2 시간 동안 배양하였다. (도 13A). SARS-CoV-2 환자의 혈장은 상당히 응고되기 때문에 충분한 유동성을 확보하기 위해 주사 전에 혈장을 1 : 2 비율 (혈장 : 배지)로 희석했다. PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365를 24 시간 동안 처리한 경우, 혈관 투과성이 대조군 (PBS 처리)에 비해 현저하게 감소하여 장벽 기능의 회복을 보여주었다 (도 13B, 13C). 또한 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 혈전 형성 (섬유소원, 파란색으로 염색) 및 혈관 염증 (ICA-1, 녹색으로 염색)을 감소시켰다 (도 14A). 도 14b는 혈전 형성 및 혈관 염증의 완화에 있어서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효과를 나타낸 모식도이다.
혈관 기능 회복에 있어서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효능은 사이토카인 (TNF-α) 매개 혈관 파괴 모델에서도 확인되었다 도 15A에서 보는 바와 같이, 엔지니어드 3D 관류 혈관 모델을 TNF-α로 파괴 후, PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365를 주입하는 경우, 혈관 내피 투과성이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. SARS-CoV-2 환자의 심각한 혈액 응고 및 혈관 손상 문제를 고려할 때, PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 혈관 기능 회복에 뛰어난 효과룰 나타내었다.
2.8. PNAB - Rg6 및 PNAB - RGX365의 NF - κB 및 SREBP2 신호 전달 경로 억제를 통한 패혈성 마우스 모델의 사망률 억제
중증 SARS-CoV-2 환자는 매우 높은 농도의 사이토카인이 혈관 손상과 후속 조직 부전을 유발하여 패혈증이 나타난다. 이러한 문제를 해결하기 위해 패혈증 마우스 모델을 사용하여 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 효능을 확인하였다. 패혈증 동물 모델로 가장 널리 사용되는 방법인 마우스 맹장 결찰 및 천자 (CLP) 기술을 이용하였다. 정맥 주사된 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 CLP 작동 마우스의 생존율을 각각 40 % 및 60 %로 높였다 (도 16A). 생존 마우스 폐 조직의 조직학적 분석 결과 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365를 투여한 경우, 혈액 누출 및 염증이 감소한 것을 확인하였다. (도 16B). 효능은 PNAB-Rgx365 투여의 경우 더 높았다.
또한 두 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 내피 투과성을 감소시키고, 폐 ICAM-1 발현을 억제 시켰으며 (도 17A), 기관지 폐포 세척액 (BAL)에서 백혈구(leukocytes)와 호중구(neutrophils) 이동이 감소하였다 (도 17A). 염증 과정을 조절하는 것으로 알려진 NF-κB 및 SREBP2 신호는 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 투여 후 정상 수준으로 회복되었다 (도 17A). 그 결과, PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 투여 후 C- 반응성 단백질 (CRP), 젖산 탈수소 효소 (LDH), 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT), 아스파르트 산 아미노 전이 효소 (AST), 크레아티닌을 포함한 조직 손상 마커가 감소했다 (도 17B). 뿐만 아니라, IL-1β, IL-6, IL-8 및 IFN-γ를 포함한 염증성 사이토카인의 발현 수준이 감소하여 사이토카인 폭풍이 억제된 것을 확인하였다 (도 17C).
또한 패혈성 마우스 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 염증 관련 유전자의 발현을 억제하였다. 도 18은 CLP 마우스 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365의 염증 관련 유전자(Nox2, Nrlp3, IL1b, Mcp1, Icam1 및 Vcam1) 발현에 미치는 영향을 나타낸 RT-PCR 분석 그래프이다 (* p <0.05). PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365 처리는 NADPH oxidase 2 (Nox2), NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 (NLRP3), Interleukin 1 beta (IL1b), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1), Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) 및 Vascular cell adhesion protein 1 (Vcam1)의 발현 수준을 억제했다.
상기와 같이 패혈증 동물 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 감염 매개 패혈증 예방에 대하여 뚜렷한 치료 효과가 있음을 보여주었다.
염증반응에서, 감소된 혈청 알부민 수준에 반응하여, 인슐린-유도된 유전자-1 단백질 (INSIG1)이 SREBP2-SCAP 복합체로부터 분리되고, SREBP2-SCAP 복합체는 골지 장치로 전위된다고 알려져 있다. 이후, 스핑고신-1-포스페이트(S1P)와 S2P는 SREBP2의 C- 말단과 N- 말단을 분리하고, SREBP2 N- 말단은 핵으로 이동하여 염증을 활성화시킨다. Rg6 및 RGX365는 C- 및 N-말단으로 들어가 궁극적으로 염증과 패혈증을 억제하는 것으로 추측된다 (도 19). 구조적으로, Rg6 및 RGX365(Rg4 및 Rg6를 주로 포함)의 주성분인 Rg4가 SREBP2 억제제로 알려진 베툴린과 유사하다.
상기의 결과를 통해 본 발명의 PNAB-스테로이드 진세노사이드는 SARS-CoV-2 환자의 명백한 임상적 징후를 조절할 수 있는 것을 확인하였다. 본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 1) 급성 면역 억제 효과로 인해 스테로이드의 부작용을 줄일 수 있으며, 2) 감염성 질환에서 히스톤 및 사이토카인과 같은 내 독소를 제거함으로써 과도한 염증 반응에 의한 기관 손상과 혈액 응고 메커니즘을 제어하고, 3) 패혈성 쇼크로 인한 저혈압으로 환자가 사망하는 것을 예방할 수 있다. 특히 본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-RGX365는 SARS-CoV-2 감염 환자의 증상 치료로서 큰 가치가 있으며, 현재 SARS-CoV-2 전염병 상황에서 항 바이러스제 개발 전에 이환율 및 사망률의 개선에 중요한 역할을 할 수 있다.
또한 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 현저한 효과를 나타내었다. 1) 중증의 SARS-CoV-2 환자로부터 분리된 PBMC에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 히스톤 H4 유도 NET, 사이토카인 폭풍 및 염증을 억제하였다. 2), 엔지니어드 3차원 혈관 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 혈전 형성 및 혈관 염증을 억제하는 효과를 나타냈다. 3), CLP 패혈증 마우스 모델에서 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365는 생존율의 증가, 조직 손상 예방 및 사이토카인 폭풍 억제 효과를 보여 주었다. 기내 및 생체 내 모델 실험을 통하여 본 발명의 PNAB-Rg6 및 PNAB-Rgx365가 특히 중증 SARS-CoV-2 환자의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물에 있어서,
    상기 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자는
    폴리에틸렌글리콜을 소 혈청 알부민(BSA)과 혼합하여 접합시켜 페길화된 소 혈청 알부민(PEG-BSA)을 제조하는 단계 (1);
    상기 (1) 단계에서 제조된 페길화된 소 혈청 알부민(PEG-BSA)과 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해된 진세노사이드(Ginsenoside)를 혼합하고 초음파 펄스를 적가하여 현탁시키는 단계 (2);
    상기 (2) 단계의 현탁액을 동결 건조하여 잔류 DMSO를 제거하고 물에 재현탁시키는 단계 (3);
    상기 (3) 단계의 재현탁액을 여과하여 로딩되지 않은 진세노사이드를 제거하는 단계 (4);를 포함하는 제조방법에 의하여 제조된 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하며,
    상기 진세노사이드는, 진세노사이드 Rg6 또는 RGX365이며,
    상기 RGX365는 진세노사이드를 Rg2 41.1중량%, Rg4 35.4중량%, Rg6 14.2중량% 및 Rh1 4.4중량%로 포함한 혼합물인 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 알부민은 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)에 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드 (monomethoxyPEG maleimide)를 사용하여 변형한 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자는 혈액 내 히스톤 H4 (Histone H4), 무세포 DNA (cell-free DNA, cfDNA), 호중구세포외트랩(Neutrophil extracellular traps, NET), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO) 활성, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase, NE)로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 감소시키는 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자는 SARS-CoV-2에 의하여 증가된 사이토카인을 감소시키는 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 SARS-CoV-2 에 의하여 증가된 사이토카인은 IL-6, IL-8, IL-1 beta, IFN-gamma, IL-4, TNF-alpha, CCL2, IL-10, BDNF, IL-3, CXCL9, Pentraxin-3, IL-11, CCL3, CCL7, GM-CSF, M-CSF, IL-5, IL-15, CRP, IL-16, IL-22, IL-27, IL-17A, IL-34, IL-2, MMP-9, CXCL10, PF4, Cystatin C, IL-13, TARC, TGF-alpha, HGF, IL-1 alpha, FGF-19, IL-31, PDGF-AA, GRO-alpha, IL-12, MPO, IL-24, G-CSF, GDF-15, RANTES, FGF-7, Osteopontin, CXCL11, IL-18 Bpa, IL-23, SHBG, Kallikerin 3, Dkk-1, Angiopoetin-2, IL-1ra, Serpin E1, LI-32a, Relaxin-2, CD40 Ligand, BAFF 로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자는 염증 혈관의 투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자는 C- 반응성 단백질 (CRP), 젖산 탈수소 효소 (LDH), 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT), 아스파르트 산 아미노 전이 효소 (AST) 및 크레아티닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 조직 손상 마커를 감소시키는 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자는 NADPH oxidase 2 (Nox2), NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 (NLRP3), Interleukin 1 beta (IL1b), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1), Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) 및 Vascular cell adhesion protein 1 (Vcam1)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 페길화 알부민 포함 진세노사이드 나노입자를 포함하는 SARS-CoV-2 예방 또는 치료용 조성물.
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