KR102554777B1

KR102554777B1 - B 스트렙토코쿠스 gbs로부터 유래된 폴리사카라이드를 포함하는 면역원성 폴리사카라이드 단백질 접합체

Info

Publication number: KR102554777B1
Application number: KR1020197012869A
Authority: KR
Inventors: 리나 스리람 베이글; 아마르딥 싱 부펜더 발라; 미구엘 앙겔 가르시아; 레이 후; 라크스미 칸드케; 신디 수동 양; 애나리자 시빌 앤더슨; 아바리 크리스나 프라사드
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2023-07-11
Also published as: US20220000999A1; US12016913B2; US20180125958A1; JP2022024175A; US11147865B2; JP7295206B2; IL266488A; AU2017357679B2; IL305459A; WO2018087635A1; CN110049776A; RU2019113795A; MX2019005423A; BR112019008844A2; EP3538144A1; KR20190064616A; US20200368340A1; US20240299523A1; AU2017357679A1; US10751402B2

Abstract

본 발명은 담체 단백질에 접합된, 통상적으로 B군 스트렙토코쿠스 (GBS)로 지칭되는 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae)로부터의 피막 폴리사카라이드 (CP)를 포함하고, 임의로 알루미늄-기재 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본원에 개시된 조성물을 사용하여 대상체에서 GBS에 대한 면역 반응을 유도하고/거나 대상체에서 침습성 GBS 질환을 감소시키거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 생성된 항체는 수동 면역요법을 통해 GBS 감염을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.

Description

B 스트렙토코쿠스 GBS로부터 유래된 폴리사카라이드를 포함하는 면역원성 폴리사카라이드 단백질 접합체

스트렙토코쿠스 아갈락티아에는 그람 양성 폴리사카라이드 피막화된 유기체이며 이는 또한 B군 스트렙토코쿠스 (GBS)로 공지되어 있다. 이들은 인간 위장 및 생식 관의 흔한 공생자이고 또한 유아 및 노인에서의 심각한 질환의 원인이다 (Baker, C.J., Vaccine, 31(Suppl. 4):D3-D6 (2013)). 유아에서의 GBS 감염에 대한 주요 위험 인자는 모체 콜로니화이다 (Dillon, H.C., et al., J. Pediatr., 110(1):31-36 (1987)). 많게는 4명 중 1명의 여성이 GBS를 직장-질내에 보유하며, 이는 분만 전 또는 그 동안에 양수 또는 아기를 감염시켜 패혈증, 폐렴 및 수막염을 유발할 수 있다 (Baker 2013; Heath, P.T., et al., BMJ Clin. Evid. (Online), pii:0323 (2014)). GBS 수막염으로부터 생존한 유아의 25퍼센트는 신경학적 손상을 앓고 있으며 19%는 인지 지연, 뇌성 마비, 실명 및 청각 상실을 경험한다 (Libster, R., et al., Pediatrics, 130(1):e8-152012 (2012)). GBS는 또한 유산 및 조기 분만을 유발할 수 있고 사산과 연관된다 (McDonald, H.M., et al., Infect. Dis. Obstetr. Gynecol., 8(5-6):220-227 (2000); Randis, T.M., et al., J. Infect. Dis., 210(2):265-273 (2014): Kessous, R., et al., J. Matern. Fetal Neonatal Med., 25(10):1983-1986 (2012)). 매우 낮은 출생 체중의 유아는 감염의 위험이 훨씬 더 크며, 최대 3%가 감염되고, 즉각적 항생제 치료에도 불구하고 최대 30%의 사망률을 갖는다 (Heath 2014).

1990년대 후반에 미국에서의 GBS 스크리닝 및 분만시 항생제 예방 (IAP)의 도입은 생후 첫 주 내에 발생하는 신생아 질환 (조기 발병 질환 [EOD])의 감소된 비율을 입증하였으나, 그 후에 생후 첫 3개월 내에 나타나는 후기 발병 질환 (LOD)의 비율에는 어떠한 측정가능한 영향도 미치지 않았다. 미국에서의 EOD 및 LOD 사례의 비율은 현재 각각 1,000명 출생당 0.25 및 0.27이다 (http://www.cdc.gov/abcs/reports-findings/survreports/gbs13.pdf에서 입수가능한 문헌 [Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Active Bacterial Core (ABC) Surveillance Report (2013)]). 균혈증 및 수막염을 포함한 침습성 폐렴구균성 질환의 예방을 위한 뉴모코쿠스 접합체 백신의 도입 후에, 및 GBS 질환의 예방을 위한 IAP에도 불구하고, GBS는 미국에서 유아에서의 신생아 패혈증 (EOD) 및 수막염 (< 2개월)의 가장 흔한 단일 원인이 되었다 (Verani, J.R., et al., MMWR, 59(RR10):1-32 (2010); Thigpen, M.C., et al., N. Engl. J. Med., 364(21):2016-2025 (2011)). 미국에서와는 달리, 네덜란드 또는 영국에서 침습성 GBS 질환에 대한 예방 가이드라인 및 IAP의 도입은 EOD의 발생률을 감소시키지는 않았다 (Bekker, V., et al., The Lancet Infectious Dis., 14(11):1083-1089 (2014); Lamagni, T.L., et al., Clin. Infect. Dis., 57(5):682-688 (2013)). 이러한 효과의 결여는 범용 스크리닝의 결여 및 가장 고위험군 (예를 들어, 열, 장기 파열 막)의 모체에게만 IAP를 제한하는 것에 기인할 수 있다. EOD의 비율은 IAP를 사용하지 않는 국가에서 유의하게 더 높으며, 평균 발생률은 1000명 정상 출생당 0.75 (95% CI 0.58-0.89)로 보고되었다 (Edmond, K.M, et al., Lancet, 379(9815):547-556 (2012)).

GBS 질환에 대한 위험이 있는 또 다른 집단은 고령층이다. 위험 인자는 만성 의료 문제, 예컨대 당뇨병, 암, 심부전, 신경계 및 비뇨기과 상태를 포함한다. CDC ABC 감시 데이터에 따르면, 2013년에 미국에서의 침습성 GBS의 연간 발생률은 0.28/1,000명 성인 또는 ≥ 65세의 성인에서 12,400건 사례/년이었다. 이러한 비율은 고령층에서의 침습성 폐렴구균성 질환의 발생률 (vs. >65세에 대해 0.30/1,000명)에 근접한다. 이들 비율은 미국 및 유럽 둘 다에서 계속해서 증가할 것으로 예상된다 (CDC 2013; Lamagni 2013).

유아 및 고령층 중에서 GBS 질환을 예방하기 위한 하나의 접근법은 폴리사카라이드-기반 백신의 사용이다. 모체 GBS 예방 백신의 실행은, IAP가 사용되는지 여부와 상관없이 미국에서의 유아 중에서 GBS 질환을 예방할 잠재력을 갖는다. 폴리사카라이드는 그 자체로 면역원성일 수 있지만, 폴리사카라이드의 단백질 담체에의 접합이, 특히 유아 및 고령층에서 면역원성을 개선시키는데 사용되었다. 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신은 일반적으로 단백질 담체에 연결된, 박테리아의 표면 코트로부터의 폴리사카라이드를 사용하여 제조된다. 폴리사카라이드-단백질 접합체는 백신 내에 함유된 폴리사카라이드를 표면 상에 디스플레이하는 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하여, 질환을 예방한다. 따라서, 병원성 박테리아로부터의 폴리사카라이드 접합체를 사용하는 백신접종은 숙주 면역을 부스팅하기 위한 잠재적 전략이다.

박테리아를 덮고 있는 폴리사카라이드는, 심지어 박테리아의 단일 종 내에서도 매우 다양하다. 예를 들어, GBS에서는 박테리아 폴리사카라이드 피막에서의 변이로 인해 10종의 상이한 혈청형이 존재한다. 따라서, 폴리사카라이드-기반 백신은 상이한 순환 혈청형에 대한 적용범위의 폭을 보장하기 위해 폴리사카라이드들의 패널로 이루어지는 것이 바람직하다.

담체 단백질은 표적 병원체에 대한 특이적 면역 반응을 부스팅하는, 표적 병원체로부터의 관련 단백질 항원, 또는 아주반트 또는 일반적인 면역 반응 자극제로서 더 많이 역할을 하는 일반적으로 면역원성인 단백질일 수 있다.

GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 V의 개별 1가 폴리사카라이드-단백질 접합체는 비-임신 성인에서의 임상 시험 1 및 2상에서 평가되었다 (Brigtsen, A.K., et al., J. Infect. Dis., 185(9):1277-1284 (2002); Baker, C.J., et al., J. Infect. Dis., 188(1):66-73 (2003); Baker, C.J., et al., J. Infect. Dis., 189(6):1103-1112 (2004); Baker, C.J., et al., Vaccine, 25(1):55-63 (2007)). 2가 II-TT 및 III-TT 당접합체 백신 및 Ia-CRM₁₉₇, Ib-CRM₁₉₇ 및 III-CRM₁₉₇ 당접합체를 포함하는 3가 백신이 또한 연구되었다 (Baker 2003; Clicaltrials.gov NCT01193920, NCT01412801, 및 NCT01446289). 그러나, GBS 백신은 아직 승인되지 않았다.

더욱이, 3가 백신은 남아프리카에서 신생아 질환을 유발하는 침습성 균주의 >90%를 커버하는 한편 (Madzivhandila, M., et al., PloS One, 6(3):e17861 (2011)), 이들 동일한 혈청형은, 티게시클린 평가 및 감시 시험 (T.E.S.T., http://www.testsurveillance.com/)으로부터 2004-2013년 사이에 수집된 901개의 샘플의 전세계적 수집물로부터의 최근 신생아 분리주의 감시에 기초하여, 북미 및 유럽에서 각각 침습성 분리주의 단지 62% 및 66%만을 나타낸다.

T.E.S.T. 샘플로부터 얻은 균주의 분석은 수집된 균주의 95%가 5종의 기록된 주요 혈청형 (Ia, Ib, II, III 및 V) 중 1종에 속하고 추가의 3%가 혈청형 IV였다는 것을 보여주었다. 일련의 간행물은 또한 미국 및 유럽에서 지난 10년에 걸쳐 혈청형 IV의 출현을 확인하였다 (Diedrick, M.J., et al., J. Clin. Microbiol., 48(9):3100-3104 (2010); Teatero (2014); Meehan, M. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 33(7):1155-1162 (2014); Florindo, C., et al., Euro Surveillance: Bulletin European sur les Maladies Transmissibles (European Communicable Disease Bulletin), 19(23) (2014); Palmiero, J.K., et al., J. Clin. Microbiol., 48(12):4397-4403 (2010)). 유아에의 GBS의 전파에 대한 위험 인자인 성인에서의 직장/질 보유를 조사하는 연구는 또한 분리주의 97%가 이들 6종의 혈청형 중 1종에 속하고, 혈청형 IV가 ~4%의 빈도를 나타내는 것을 발견하였다. 연구는 건강한 미국 성인에서 베타-용혈성 스트렙토코쿠스 (GBS를 포함함), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 보유를 모니터링하기 위해 설계되었다 (문헌 [Matson, M.A., et al., ICAAC, Abstract I-306 (Washington, DC, Sep. 5-9, 2014)] 참조).

유사하게, T.E.S.T. 샘플의 분석은 미국에서의 ≥ 65세의 노인으로부터의 혈액 분리주의 98%가 동일한 6종의 우세한 혈청군에 속한다는 것을 보여주었다. 고령층의 분리주 및 다른 집단 사이의 가장 주목할만한 차이점은 혈청군 분포이다. 고령 환자로부터의 분리주의 경우, 혈청형 V 균주가 가장 큰 군을 구성한다 (34% vs. 신생아의 경우 18% 또는 성인 보유 균주의 경우 18%).

다른 연구는 혈청형 출현율의 지리적 분산이 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 혈청형 VI 및 VIII 분리주는 일본에서 건강한 임신 여성의 우세한 이주종이라는 것이 밝혀졌다 (Lachenauer, C.S., et al., J. Infect. Dis.,179(4):1030-1033 (1999)).

따라서, 전세계의 광범위한 인구 중에서 출현 혈청형 IV에 의해 유발되는 것들을 포함한 GBS 질환을 예방하거나 치료하기 위한 수단으로서 수동 면역을 부여하기 위한 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신 또는 모노클로날 항체에 대한 필요가 존재한다. 추가로, 관련 기술분야에 공지된 임의의 용기에서 안정하고 용이하게 재현탁가능한 상기 백신 또는 면역원성 조성물에 대한 필요가 존재한다.

본 발명은 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하고 임의로 아주반트를 포함하는 신규 면역원성 조성물에 관한 것이다. 하기 내용은 본 발명의 일부 측면 및 실시양태를 기재한다.

한 측면에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 B군 스트렙토코쿠스 (GBS)로부터의 피막 폴리사카라이드 및 임의로 알루미늄-기재 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 알루미늄-기재 아주반트는 인산알루미늄, 알루미늄 히드록실 포스페이트 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 이러한 실시양태에서, 알루미늄-기재 아주반트는 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 농도로 존재한다.

또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 6가 GBS 접합체 조성물이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS)로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하고, 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택되고; 조성물은 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 안정화제, 아주반트, 동결보호제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 유리 라디칼 산화의 억제제, 담체 또는 그의 혼합물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 피막 폴리사카라이드가 동일한 담체 단백질에 개별적으로 접합된 것인 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 시린지에 충전된다. 한 실시양태에서, 시린지는 유리이다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 1 mm 내지 약 15 mm의 헤드스페이스를 갖는 시린지에 충전된다.

본 발명의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물은 약 50회 이하의 진탕으로 재현탁된다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 포스페이트를 추가로 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 포스페이트는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도로 존재한다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 염화나트륨은 약 10 mM 내지 약 350 mM의 농도로 존재한다.

추가 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml의 총 접합체 용량을 포함한다.

추가의 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.

본 발명의 한 측면에서, 면역원성 조성물은 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄, 약 15 mM 내지 약 25 mM의 포스페이트, 약 225 mM 내지 약 265 mM의 염화나트륨, 및 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml의 총 접합체 용량을 포함하며, 여기서 면역원성 조성물은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 수산화알루미늄, 약 15 mM 내지 약 25 mM의 포스페이트, 약 120 mM 내지 약 170 mM의 염화나트륨, 및 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml의 총 접합체 용량을 포함하며, 여기서 면역원성 조성물은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, GBS에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 GBS와 연관된 질환 또는 상태를 예방하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 임신 계획 중인 여성 또는 임신한 여성이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 임신한 여성은 임신 후반기, 예컨대 적어도 임신 20주 또는 적어도 임신 27주이다. 바람직한 실시양태에서, 임신한 여성은 임신 27주 내지 36주이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 노인, 예컨대 50세 이상, 65세 이상 및 85세 이상의 성인이다. 추가 실시양태에서, 대상체는 면역손상된다. 한 측면에서, 대상체는 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, B군 스트렙토코쿠스는 스트렙토코쿠스 아갈락티아에이다.

본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 면역원성 조성물 중 피막 폴리사카라이드에 결합하는 항체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 대상체에게의 면역원성 조성물의 투여시에 생성된다. 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 측면은 (a) 본원에 기재된 면역원성 조성물을 사용하여 항체 제제를 생성하는 단계; 및 (b) 항체 제제를 대상체에게 투여하여 수동 면역을 부여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 수동 면역을 부여하는 방법에 관한 것이다.

도 1: GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇ 1가 백신으로 면역화된 마우스로부터의 혈청 및 단리된 IgG의 옵소닌 활성의 비교.
도 2: 50℃에서의 가속 저장 (4주) 후 GBS Ia-CRM₁₉₇의 안정성 (SEC MALLS를 사용하여 분자량의 % 변화에 의해 나타낸 바와 같음).
도 3: 50℃에서의 가속 저장 (4주) 후 GBS Ib-CRM₁₉₇의 안정성 (SEC MALLS를 사용하여 분자량의 % 변화에 의해 나타낸 바와 같음).
도 4: 50℃에서의 가속 저장 (4주) 후 GBS II-CRM₁₉₇의 안정성 (SEC MALLS를 사용하여 분자량의 % 변화에 의해 나타낸 바와 같음).
도 5: 50℃에서의 가속 저장 (4주) 후 GBS III-CRM₁₉₇의 안정성 (SEC MALLS를 사용하여 분자량의 % 변화에 의해 나타낸 바와 같음).
도 6: 50℃에서의 가속 저장 (4주) 후 GBS IV-CRM₁₉₇의 안정성 (SEC MALLS를 사용하여 분자량의 % 변화에 의해 나타낸 바와 같음).
도 7: 50℃에서의 가속 저장 (4주) 후 GBS V-CRM₁₉₇의 안정성 (SEC MALLS를 사용하여 분자량의 % 변화에 의해 나타낸 바와 같음).
도 8: 37℃에서의 저장 후 GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇ 및 GBS IV-CRM₁₉₇의 안정성 (유리 시알산에 의해 나타낸 바와 같음).
도 9: 숙시네이트를 완충제로서 사용하는 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇)에서의 pH의 안정성.
도 10: 히스티딘을 완충제로서 사용하는 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇)에서의 pH의 안정성.
도 11: 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 히스티딘 완충제 농도의, 10 mcg/ml의 용량의 알루미늄에 대한 GBS 접합체의 결합에 대한 효과.
도 12: 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 히스티딘 완충제 농도의, 40 mcg/ml의 용량의 알루미늄에 대한 GBS 접합체의 결합에 대한 효과.
도 13: 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 폴리소르베이트-80 농도의, 교반 응력시 총 항원성의 퍼센트 손실에 대한 효과.
도 14: 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 알루미늄 농도의, 알루미늄에 대한 GBS 접합체 결합에 대한 효과.
도 15: 10 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 5.5% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 16: 10 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 7.0% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 17: 10 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉7, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 8.5% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 18: 50 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 5.5% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 19: 50 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 7.0% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 20: 50 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 8.5% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 21: 40 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 7.0% (w/v) 수크로스의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 22: 40 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 2.0% (w/v) 수크로스 및 4.0% (w/v) 만니톨의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 23: 40 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 3.0% (w/v) 수크로스 및 3.0% (w/v) 만니톨의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 24: 40 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 2.0% (w/v) 수크로스 및 4.0% (w/v) 글리신의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 25: 40 mcg/ml 용량의 동결건조된 6가 GBS 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇) 중 3.0% (w/v) 수크로스 및 3.0% (w/v) 글리신의, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복에 대한 효과.
도 26: 시간 0, 2주 및 3개월에서 팁 다운 배향으로 PFS에 저장된 고용량 및 저용량의 GBS6 및 1가 제제의 재현탁의 비교.
도 27: 팁 다운 및 수평 배향으로 PFS에 저장된 고용량 및 저용량의 GBS6 및 1가 제제의 재현탁의 비교.
도 28: pH의 함수로서의 AlPO₄의 제타 전위.
도 29: pH의 함수로서의 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V의 접합체의 제타 전위.
도 30: 시간 0, 2주 및 3개월에서 팁 다운 배향으로 PFS에 저장된 고용량 및 저용량의 상이한 GBS6 및 1가 제제의 침강 속도의 비교.
도 31: 용량 수준 (혈청형당 농도)의 함수로서의 GBS6 제제의 침강 속도.
도 32: 저용량 (60 mcg/mL) 및 고용량 (240 mcg/mL)에서의 pH의 함수로서의 GBS6 제제의 침강 속도.
도 33: 침강 속도에 대한 용량 및 NaCl 농도의 효과.
도 34: 45분 후에 상이한 항원 제제의 침강 거동에 대한 비교.
도 35a: 상이한 항원 제제의 상세한 입자 크기 분포.
도 35b: ≥ 10 μm 또는 ≥ 25 μm로 카테고리화된 상이한 항원 제제의 입자 크기 분포.
도 36: 다양한 헤드스페이스를 갖는 PFS 내 GBS6 제제.
도 37: 수평 위치로 2주 저장 후 다양한 농도의 AlPO₄를 갖는 고용량 GBS6 제제를 재현탁시키는데 필요한 진탕 횟수.
도 38: 수평 위치로 2주 저장 후 다양한 농도의 AlPO₄와의 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V의 접합체의 결합.
도 39: 재현탁에 대한 상이한 응집제 및 알루미늄 염의 효과.
도 40: 침강 속도에 대한 상이한 응집제 및 알루미늄 염의 효과.
도 41: 고용량 GBS6 제제의 재현탁 시간에 대한 NaCl 농도의 효과.
도 42: 재현탁 시간에 대한 NaCl 및 포스페이트 이온의 조합의 효과.
도 43a: 2시간 후 침강에 대한 NaCl 및 인산칼륨 농도의 효과.
도 43b: 30분 후 침강에 대한 NaCl 및 인산칼륨 농도의 효과.
도 44: 대조군 GBS6 제제와 비교하여 20 mM 포스페이트 및 240 mM NaCl을 포함하는 GBS6 제제의 결합된 항원성 퍼센트.
도 45: 보다 용이한 재현탁 (≤ 10회 진탕)을 촉진하는 최적의 강건한 제제화 조건에 대한 예측 프로파일러 권장사항.
도 46: 예측 프로파일러 권장사항에 기초한 GBS6 제제에 대한 결합된 항원성 퍼센트.
도 47: 다양한 농도의 OH(Al)₃과의 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V의 결합.

본 발명은 기재된 특정한 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않으며, 따라서 방법 및 조건은 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 인식되고 공지된 의미를 갖지만, 편의성 및 완전성을 위해 특정한 용어 및 그의 의미가 하기 및 명세서 전체에 걸쳐 제시된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 단수 형태는 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 및/또는 본 개시내용 등을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해지는 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 값의 통계적으로 의미있는 범위 이내에 있음을 의미한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 및 보다 더 전형적으로 5% 이내에 있을 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용가능한 변화는 연구 하에 있는 특정한 시스템에 좌우되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지될 수 있다. 범위가 본 출원 내에서 언급될 때마다, 그 범위 이내의 모든 정수가 또한 본 발명의 실시양태로서 고려된다.

본 개시내용에서, 용어 예컨대 "포함한다", "포함된", "포함하는", "함유한다", "함유하는" 등은 미국 특허법에서 이들에게 부여되는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어 이들은 "포함한다", "포함된", "포함하는" 등을 의미할 수 있다. 이러한 용어는 임의의 다른 성분을 배제하지 않으면서 특정한 성분 또는 성분의 세트를 포함하는 것을 지칭한다. 용어 예컨대 "로 본질적으로 이루어지는" 및 "로 본질적으로 이루어지다"는 미국 특허법에서 이들에게 부여되는 의미를 갖고, 예를 들어 이들은 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 손상시키지 않는 추가의 성분 또는 단계의 포함을 허용하며, 즉, 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 손상시키는 열거되지 않은 추가의 성분 또는 단계를 배제하고, 선행 기술, 예컨대 본원에 인용되거나 또는 본원에 참조로 포함된 관련 기술분야의 문헌의 성분 또는 단계를 배제하는데, 이는 선행 기술에 비해, 예를 들어 본원에서 인용되거나 또는 본원에 참조로 포함된 문헌에 비해 특허성, 예를 들어 신규성, 비-자명성, 진보성이 있는 실시양태를 정의하는 것이 본 문헌의 목적이기 때문이다. 그리고, 용어 "이루어지다" 및 "이루어지는"은 미국 특허법에서 이들에게 부여되는 의미를 가지며; 즉, 이들 용어는 폐쇄형이다. 따라서, 이들 용어는 특정한 성분 또는 성분의 세트를 포함하고 모든 다른 성분을 배제하는 것을 지칭한다.

용어 "항원"은 일반적으로 생물학적 분자, 통상적으로는 동족 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 적어도 1개의 에피토프를 함유하는 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 지질 또는 접합체를 지칭하거나; 또는 일부 경우에, 동물 내에 주사되거나 흡수되는 조성물을 포함한, 동물에서 항체의 생산 또는 T-세포 반응 또는 둘 다를 자극할 수 있는 면역원성 물질을 지칭한다. 면역 반응은 전체 분자 또는 분자의 1개 이상의 다양한 부분 (예를 들어, 에피토프 또는 합텐)에 대해 생성될 수 있다. 용어는 개별 분자 또는 항원 분자의 동종 또는 이종 집단을 지칭하는데 사용될 수 있다. 항원은 항체, T 세포 수용체 또는 특정 체액성 및/또는 세포성 면역의 다른 요소에 의해 인식된다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원 에피토프를 포함한다. 주어진 항원의 에피토프는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수많은 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, NJ] 참조). 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어 단백질 분자의 부분에 상응하는 다수의 펩티드를 고체 지지체 상에서 공동으로 합성하고, 펩티드가 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen, H.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984); Geysen, H.M., et al., Molec. Immunol., 23(7):709-715 (1986)] (모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는, 예를 들어 X선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명에 의해서와 같이 아미노산의 공간 입체형태를 결정함으로써 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상기 문헌] 참조). 추가로, 본 발명의 목적을 위해, "항원"은 또한, 단백질이 면역학적 반응을 도출하는 능력을 유지하고 있는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로, 사실상 보존적이지만, 비-보존적일 수 있음)을 포함하는 단백질을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 이들 변형은, 부위-지정 돌연변이유발을 통해, 또는 특정한 합성 절차를 통해, 또는 유전 공학 접근법을 통해 의도적인 것일 수 있거나, 또는 예컨대 항원을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통해 우발적인 것일 수 있다. 추가로, 항원은 미생물, 예를 들어 박테리아로부터 유래, 수득 또는 단리될 수 있거나, 또는 전체 유기체일 수 있다. 유사하게, 예컨대 핵산 면역화 적용에서 항원을 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 또한 정의에 포함된다. 합성 항원, 예를 들어 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유래된 항원이 또한 포함된다 (Bergmann, C., et al., Eur. J. Immunol., 23(11):2777-2781(1993); Bergmann, C.C., et al., J. Immunol., 157(8):3242-3249(1996); Suhrbier, A., Immunol. and Cell Biol., 75(4):402-408 (1997)).

상호교환가능하게 사용되는 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 동물에서 면역 반응을 유도하는 적어도 1종의 면역원성 조성물을 포함하는 제약 조성물을 지칭한다.

피막 폴리사카라이드

본원에 사용된 용어 "사카라이드"는 단일 당 모이어티 또는 모노사카라이드 단위 뿐만 아니라 공유 연결되어 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 형성하는 2개 이상의 단일 당 모이어티 또는 모노사카라이드 단위의 조합을 지칭한다. 용어 "사카라이드"는 용어 "탄수화물"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 폴리사카라이드는 선형 또는 분지형일 수 있다.

본원에 사용된 "모노사카라이드"는 올리고사카라이드에서의 단일 당 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "디사카라이드"는 글리코시드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 모노사카라이드 단위 또는 모이어티로 구성된 폴리사카라이드를 지칭한다.

한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 올리고사카라이드 (OS)이다. 본원에 사용된 "올리고사카라이드"는 2개 이상의 모노사카라이드 단위 또는 모이어티를 함유하는 화합물을 지칭한다. 올리고사카라이드와 관련하여, 개별 단량체 단위 또는 모이어티는 모노사카라이드이며, 이는 히드록실 기를 통해 또 다른 모노사카라이드 단위 또는 모이어티에 결합되거나 또는 결합될 수 있다. 올리고사카라이드는 보호된 단일 잔기 당으로부터의 화학적 합성에 의해 또는 생물학적으로 생산된 폴리사카라이드의 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 올리고사카라이드는 시험관내 효소적 방법에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 폴리사카라이드 PS는 적어도 5개의 모노사카라이드 단위 또는 모이어티의 선형 또는 분지형 중합체를 지칭한다. 명확성을 위해, n이 약 5 초과, 예컨대 약 10 초과인 다수의 반복 단위가 본원에서 폴리사카라이드로 지칭될 것이다.

한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 세포 표면 폴리사카라이드이다. 세포 표면 폴리사카라이드는 펩티도글리칸 층, 세포벽 및 피막을 포함한, 최외각 박테리아 세포 막 또는 박테리아 세포 표면 상에 위치한 적어도 한 부분을 갖는 폴리사카라이드를 지칭한다. 전형적으로, 세포 표면 폴리사카라이드는 생체내 면역 반응을 유도하는 것과 연관된다. 세포 표면 폴리사카라이드는 "세포벽 폴리사카라이드" 또는 "피막 폴리사카라이드"일 수 있다. 세포벽 폴리사카라이드는 전형적으로 박테리아 표면 상에 불연속 층을 형성한다.

한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 피막 폴리사카라이드이다. 피막 폴리사카라이드는 글리코시드 연결에 의해 연결된 1개 이상의 모노사카라이드의 반복 단위를 포함하는 당중합체를 지칭한다. 피막 폴리사카라이드는 전형적으로 박테리아 세포 주위에 피막-유사 층을 형성한다. "피막의 폴리사카라이드" 또는 "피막 폴리사카라이드"는 스트렙토코쿠스의 대부분의 분리주의 세포벽의 외부인 폴리사카라이드 피막을 지칭한다. 예를 들어, 모든 GBS 피막 폴리사카라이드는 박테리아 병독성에 필요한 말단 α2-3-연결된 시알산을 갖는 분지형 반복 구조를 갖는다. 피막-연관 시알산 (HPLC 검정에 의해 정량화됨)은 시험관내 배양된 T.E.S.T.로부터의 침습성 신생아 분리주의 > 94%에서 검출되었다.

본 발명자들은 GBS 피막 폴리사카라이드의 시알산 수준이 면역 반응을 생성하는데 중요한 특징이라는 것을 발견하였다. 선행 개시내용은 단지 혈청형 V에 대한 시알산 수준에 관한 상충하는 정보만을 제공하며, 탈시알릴화된 혈청형 V가 바람직하다는 것 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/035519) 및 혈청형 V에 대해 시알산 함량 >50%가 사용될 수 있다는 것 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/053612)을 발견하였다. 그러나, 이들 참고문헌에서의 어떠한 것도 면역원성에 대한 적어도 대부분의 GBS 폴리사카라이드에서의 시알산 수준의 중요성을 기재하지는 않는다. 본 발명자들은 놀랍게도 GBS 피막 폴리사카라이드가 천연 시알산 수준 (즉 100% 또는 약 95% 초과)을 갖는 폴리사카라이드와 대등한 면역 반응을 제공하기 위해 접합 전에 약 60% 이상의 시알산을 필요로 한다는 것을 발견하였다. 혈청형 V에 대해 개시된 선행 범위 내에 있는 심지어 58%의 시알산 수준도 면역원성에 부정적으로 영향을 미쳤다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 및 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

100% 시알산 수준이 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산에 상응한다는 것에 주목하여야 한다. 따라서, 피막 폴리사카라이드는 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

일부 피막 폴리사카라이드 (CP) 혈청형의 말단 시알산 잔기는 부분적으로 O-아세틸화 (OAc)된다 (Lewis, A.L., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 101(30):11123-8 (2004)). 혈청형 Ib, III, IV, V, VI 및 IX는 부분적으로 O-아세틸화되고 (최대 ~40%), 반면 혈청형 Ia, II 및 VII은 O-아세틸화를 거의 또는 전혀 갖지 않는다 (약 5% 미만) (Lewis 2004). 본 발명의 한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 O-아세틸화 수준 (약 0% 내지 약 40%)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화 (약 5% 미만)될 수 있다. 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드의 O-아세틸화도는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 양성자 NMR에 의해 결정될 수 있다 (Lemercinier, X., et al., Carbohydrate Research, 296:83-96 (1996); Jones, C., et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30:1233-1247 (2002); 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2005/033148 및 WO 00/56357). 통상적으로 사용되는 또 다른 방법은 문헌 [Hestrin, S., J. Biol. Chem., 180:249-261 (1949)]에 의해 기재되어 있다.

또한, 100% O-아세테이트는 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 1.0 mM O-아세테이트에 상응한다. 따라서, 부분적으로 O-아세틸화된 폴리사카라이드는 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.35 또는 약 0.4 mM O-아세테이트를 포함한다. 탈-O-아세틸화된 폴리사카라이드는 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 또는 0.05 mM 미만의 O-아세테이트를 포함한다.

일반적으로 또한 침습성 질환을 유발할 수 있는 스트렙토코쿠스 미생물은, 박테리아를 피막화하고 숙주 선천성 면역계에 의한 클리어런스에 대한 그의 저항성을 증진시키는 CP를 생산할 수 있다. CP는 박테리아를 식세포작용 및 세포내 사멸에 저항성이도록 하는 보호 피막 내에 박테리아 세포를 숨기는 역할을 한다. 피막이 결여된 박테리아는 식세포작용에 보다 취약하다. 피막 폴리사카라이드는 빈번하게 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함한 많은 박테리아 병원체에 대한 중요한 병독성 인자이다.

피막 폴리사카라이드는 박테리아의 특정한 종을 혈청형결정하는데 사용될 수 있다. 유형결정은 통상적으로 피막 폴리사카라이드에 특징적인 특정 구조 또는 고유 에피토프에 대해 생성된 특정 항혈청 또는 모노클로날 항체와의 반응에 의해 달성된다. 10종의 GBS 혈청형이 있다: Ia, Ib, 및 II-IX (http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/19/4/12-1572_article에서 입수가능한 문헌 [Ferrieri, P., et al., Emerg. Infect. Dis. [Internet], 19(4) (2013)]).

본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 스트렙토코쿠스 아갈락티아에로부터 단리된다. 폴리사카라이드는 에스. 아갈락티아에의 임의의 피막화된 균주, 예컨대 090, A909 (ATCC 수탁 번호 BAA-1138), 515 (ATCC 수탁 번호 BAA-1177), B523, CJB524, MB 4052 (ATCC 수탁 번호 31574), H36B (ATCC 수탁 번호 12401), S40, S42, MB 4053 (ATCC 수탁 번호 31575), M709, 133, 7357, PFEGBST0267, MB 4055 (ATCC 수탁 번호 31576), 18RS21 (ATCC 수탁 번호 BAA-1175), S16, S20, V8 (ATCC 수탁 번호 12973), DK21, DK23, UAB, 5401, PFEGBST0708, MB 4082 (ATCC 수탁 번호 31577), M132, 110, M781 (ATCC 수탁 번호 BAA-22), D136C(3) (ATCC 수탁 번호 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; ATCC 수탁 번호 31475), M132, K79, COH1 (ATCC 수탁 번호 BAA-1176), PFEGBST0563, 3139 (ATCC 수탁 번호 49446), CZ-NI-016, PFEGBST0961, 1169-NT1, CJB111 (ATCC 수탁 번호 BAA-23), CJB112, 2603 V/R (ATCC 수탁 번호 BAA-611), NCTC 10/81, CJ11, PFEGBST0837, 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214, CZ-PW-119, 7271, CZ-PW-045, JM9130013, JM9130672, IT-NI-016, IT-PW-62, 및 IT-PW-64로부터 단리될 수 있다.

본원에 기재된 폴리사카라이드는, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 포함한 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 단리될 수 있다. 본원에 사용된 "단리된"은 특정한 공급원으로부터 수득되고 분리된 것을 지칭한다. 용어 "단리된"은 그의 각각의 자연 발생 형태, 상태 및/또는 환경에 있지 않음을 추가로 지칭한다. 예를 들어, "스트렙토코쿠스로부터 단리된"은 스트렙토코쿠스 세포로부터 수득되고 분리된 물질을 지칭한다. 단리된 폴리사카라이드는 자연 발생이 아니다. 용어 "단리된"은 물질이 그의 원래 환경으로부터 제거되어 있음 (예를 들어, 그것이 자연 발생인 경우 자연 환경으로부터 또는 그것이 재조합 물질인 경우 그의 숙주 유기체로부터, 또는 하나의 환경으로부터 상이한 환경으로 옮겨짐)을 의미한다. 예를 들어, "단리된" 피막 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드는 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성되거나 달리 화학 반응의 일부로서 혼합물 중에 존재하는 경우에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 본 발명에서, 단백질 또는 폴리사카라이드는 박테리아 세포로부터 또는 세포 파편으로부터 단리되어, 이들이 면역원성 조성물의 제조에 유용한 형태로 제공되도록 할 수 있다. 용어 "단리된" 또는 "단리하는"은 정제하는 것 또는 정제를 포함할 수 있으며, 이는 관련 기술분야에 공지된 단리된 폴리사카라이드를 정제하는 방법 및/또는 본원에 기재된 방법을 포함한다. 어구 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 폴리펩티드/단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포 성분으로부터 분리된 것인 폴리펩티드/단백질의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 피막 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 오염 단백질 또는 폴리사카라이드 또는 다른 세포 물질을 갖는 피막 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드의 제제를 포함한다. 폴리펩티드/단백질이 재조합적으로 생산되는 경우에, 이는 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다. 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드가 화학적 합성에 의해 생산되는 경우에, 이는 바람직하게는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉, 이는 단백질 또는 폴리사카라이드의 합성에 수반되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드의 이러한 제제는 약 30%, 20%, 10%, 5% (건조 중량 기준) 미만의 관심 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드 단편 이외의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다.

본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 박테리아로부터 단리된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 재조합적으로 생산된다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드는 합성이거나 또는 통상적인 방법에 따라 화학적으로 합성된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 폴리사카라이드를 생산하기 위한 생합성 경로를 클로닝 및 발현시킨 후 대용 숙주에서의 발현에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 면역원성이다. 예를 들어, 본 발명자들은 본원에 기재된 각각의 폴리사카라이드가 면역 반응을 유도하거나 도출할 수 있다는 것을 발견하였다. 용어 "면역원성"은 포유동물에서 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 개시하고/거나, 촉발하고/거나, 유발하고/거나, 증진시키고/거나, 개선시키고/거나, 증대시키는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간, 영장류, 토끼, 돼지, 마우스 등이다.

피막 폴리사카라이드의 분자량은 면역원성 조성물에 사용하기 위한 고려사항이다. 고분자량 피막 폴리사카라이드는 항원 표면 상에 존재하는 에피토프의 보다 높은 결합가로 인해 특정 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 고분자량 피막 폴리사카라이드의 단리 및 정제는 본 발명의 접합체, 조성물 및 방법에 사용하기 위해 고려된다.

그러나 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 담체 단백질에의 접합 전에 천연 피막 폴리사카라이드의 분자량 (MW) 미만인 분자량 범위로 사이징될 수 있다. 정제된 피막 폴리사카라이드의 크기는 유리한 여과성 특징 및/또는 수율을 갖는 접합체를 생성하기 위해 감소된다.

하나의 이러한 실시양태에서, 정제된 피막 폴리사카라이드의 크기는 고압 균질화에 의해 감소된다. 고압 균질화는 충분히 작은 치수를 갖는 유동 경로를 통해 공정 스트림을 펌핑함으로써 높은 전단율을 달성한다. 전단율은 보다 큰 인가 균질화 압력을 사용함으로써 증가되고, 노출 시간은 균질화기를 통해 공급 스트림을 재순환시킴으로써 증가될 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리사카라이드는 옵소닌 활성을 유도할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리사카라이드는 옵소닌 및 식세포 활성 (예를 들어, 옵소닌식세포 활성)을 유도할 수 있다.

옵소닌 활성 또는 옵소닌화는 옵소닌 (예를 들어, 항체 또는 보체 인자)이 항원 (예를 들어, 본원에 기재된 단리된 폴리사카라이드)에 결합하여, 항원의 식세포 또는 포식 세포 (예를 들어, 대식세포, 수지상 세포 및 다형핵 백혈구 (PMNL))에의 부착을 용이하게 하는 과정을 지칭한다. 일부 박테리아, 예컨대, 예를 들어 전형적으로 피막의 존재로 인해 포식되지 않는 피막화된 박테리아는 옵소닌 항체로 코팅되는 경우에 식세포에 의해 인식될 가능성이 보다 커지게 된다. 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 면역 반응, 예컨대, 예를 들어 옵소닌성인 항체를 유도한다. 한 실시양태에서, 옵소닌 활성은 그람 양성 코쿠스에 대한 것, 바람직하게는 스트렙토코쿠스 종에 대한 것, 보다 바람직하게는 에스. 아갈락티아에의 적어도 1종의 균주에 대한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리사카라이드는 살박테리아 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 살박테리아 활성은 그람 양성 코쿠스에 대한 것, 바람직하게는 스트렙토코쿠스 종에 대한 것, 보다 바람직하게는 에스. 아갈락티아에의 적어도 1종의 균주에 대한 것이다.

옵소닌화, 식세포작용 및/또는 살박테리아 활성을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 예컨대, 예를 들어 생체내 박테리아 부하의 감소를 측정하는 것 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 종으로 챌린지된 포유동물에서 균혈증 수준을 측정하는 것) 및/또는 시험관내 박테리아 세포 사멸을 측정하는 것 (예를 들어, 시험관내 옵소닌식세포 검정)이다. 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 적절한 대조군과 비교하여, 예컨대, 예를 들어 열-사멸 그람 양성 코쿠스에 대해 생성된 항혈청과 비교하여 옵소닌, 식세포 및/또는 살박테리아 활성을 유도할 수 있다.

혈청형 Ia

한 실시양태는 혈청형 Ia GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 혈청형 Ia의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드의 분자량은, 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 25 kDa 내지 약 750 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 25 kDa 내지 약 200 kDa이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 100 kDa 내지 약 400 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

특정한 실시양태에서, 천연 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형 Ia의 크기를 폴리사카라이드의 구조적 특색, 예컨대 시알산을 보존하면서 감소시키기 위해 고압 균질화 공정이 사용된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드는 약 5% 미만 O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 090, A909 (ATCC 수탁 번호 BAA-1138), 515 (ATCC 수탁 번호 BAA-1177), B523, CJB524, 및 MB 4052 (ATCC 수탁 번호 31574)를 포함한다.

혈청형 Ib

한 실시양태는 혈청형 Ib GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 혈청형 Ib의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 25 kDa 내지 약 750 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 25 kDa 내지 약 400 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 H36B (ATCC 수탁 번호 12401), S40, S42, MB 4053 (ATCC 수탁 번호 31575), M709, 133, 7357, 및 PFEGBST0267을 포함한다.

혈청형 II

한 실시양태는 혈청형 II GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 혈청형 II의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 II 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 25 kDa 내지 약 750 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 25 kDa 내지 약 400 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 II 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 II 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 II 피막 폴리사카라이드는 약 5% 미만 O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 혈청형 II 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 MB 4055 (ATCC 수탁 번호 31576), 18RS21 (ATCC 수탁 번호 BAA-1175), S16, S20, V8 (ATCC 수탁 번호 12973), DK21, DK23, UAB, 5401, 및 PFEGBST0708을 포함한다.

혈청형 III

한 실시양태는 혈청형 III GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 혈청형 III의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 III 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 25 kDa 내지 약 750 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 25 kDa 내지 약 200 kDa이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 100 kDa 내지 약 400 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

특정한 실시양태에서, 천연 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형 III의 크기를 폴리사카라이드의 구조적 특색, 예컨대 시알산을 보존하면서 감소시키기 위해 고압 균질화 공정이 사용된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 III 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 III 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 III 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 III 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 MB 4082 (ATCC 수탁 번호 31577), M132, 110, M781 (ATCC 수탁 번호 BAA-22), D136C(3) (ATCC 수탁 번호 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; ATCC 수탁 번호 31475), M132, K79, COH1 (ATCC 수탁 번호 BAA-1176), 및 PFEGBST0563을 포함한다.

혈청형 IV

한 실시양태는 혈청형 IV GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 혈청형 IV의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 25 kDa 내지 약 750 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 25 kDa 내지 약 400 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 IV 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 3139 (ATCC 수탁 번호 49446), CZ-NI-016, 및 PFEGBST0961을 포함한다.

혈청형 V

한 실시양태는 혈청형 V GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 혈청형 V의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 V 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 25 kDa 내지 약 750 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 접합 전의 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 25 kDa 내지 약 400 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 V 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 V 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 V 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 V 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 1169-NT1, CJB111 (ATCC 수탁 번호 BAA-23), CJB112, 2603 V/R (ATCC 수탁 번호 BAA-611), NCTC 10/81, CJ11, 및 PFEGBST0837을 포함한다.

혈청형 VI

GBS 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드는 문헌 [von Hunolstein, C., et al., Infection and Immunity, 6194):1272-1280 (1993)]에 의해 기재되며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 혈청형 VI의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

a)

또는

b)

접합 전의 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 VI 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 IIII 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214, 및 CZ-PW-119를 포함한다.

혈청형 VII

GBS 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드는 문헌 [Kogan, G., et al., Carbohydrate Research, 277(1):1-9 (1995)]에 의해 기재되며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 혈청형 VII의 반복 단위는 하기와 같다:

접합 전의 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 이상을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 VII 피막 폴리사카라이드는 약 5% 미만 O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 7271 및 CZ-PW-045를 포함한다.

혈청형 VIII

GBS 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드는 문헌 [Kogan, G., et al., The Journal of Biological Chemistry, 271(15):8786-8790 (1996)]에 의해 기재되며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 혈청형 VIII의 반복 단위는 하기와 같다:

접합 전의 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 JM9130013 및 JM9130672를 포함한다.

혈청형 IX

GBS 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드는 문헌 [Berti, F., et al., The Journal of Biological Chemistry, 289(34):23437-2348 (2014)]에 의해 기재되며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 혈청형 IX의 구조는 하기와 같이 도시될 수 있다:

접합 전의 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa이다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드는 그의 천연 시알산 수준, 예컨대 약 100% 또는 약 95% 초과를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 최대 약 40% (약 60% 초과의 시알릴화 수준), 예컨대 최대 약 35% (약 65% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 30% (약 70% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 25% (약 75% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 20% (약 80% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 15% (약 85% 초과의 시알릴화 수준), 최대 약 10% (약 90% 초과의 시알릴화 수준), 또는 최대 약 5% (약 95% 초과의 시알릴화 수준) 탈시알릴화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 약 1.0 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는다. 추가 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 접합 전에 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산, 예컨대 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산, 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산, 또는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 가질 수 있다.

혈청형 IX 피막 폴리사카라이드는 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화된 (즉, 약 5% 미만 O-아세틸화된) 것이다. 본 발명의 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드의 일부 예시적인 균주는 IT-NI-016, IT-PW-62, 및 IT-PW-64를 포함한다.

폴리사카라이드-단백질 접합체

본원에 사용된 "접합체"는 통상적으로 원하는 범위의 분자량의 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 포함하며, 여기서 피막 폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 접합체는 일부 양의 유리 피막 폴리사카라이드를 함유할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 본원에 사용된 "유리 피막 폴리사카라이드"는 접합된 피막 폴리사카라이드-담체 단백질과 비-공유 회합된 (즉, 그에 비-공유 결합되거나, 그에 흡착되거나, 또는 그 내부에 또는 그에 의해 포획된) 피막 폴리사카라이드를 지칭한다. 용어 "유리 피막 폴리사카라이드", "유리 폴리사카라이드" 및 "유리 사카라이드"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고 동일한 의미를 전달하도록 의도된다. 담체 분자의 성질에 관계없이, 이는 피막 폴리사카라이드에 직접적으로 또는 링커를 통해 접합될 수 있다. 본원에 사용된 "접합시키기 위한", "접합된" 및 "접합시키는"은 박테리아 피막 폴리사카라이드가 담체 분자에 공유 부착되는 과정을 지칭한다. 접합은 박테리아 피막 폴리사카라이드의 면역원성을 증진시킨다. 접합은 하기 기재되는 방법에 따라 또는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 수행될 수 있다.

본원에 사용된 "접합체 면역원성 조성물"은 면역원성 물질이 담체 단백질에 공유 연결되는 항원 폴리사카라이드를 포함하여 폴리사카라이드-단백질 접합체를 생산하는 것인 면역원성 조성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리사카라이드-단백질 접합체는 다가 면역원성 조성물로서 제제화될 수 있다.

본원에 사용된 용어 폴리사카라이드의 또는 담체 단백질-폴리사카라이드 접합체의 "분자량"은 다중각도 레이저 광 산란 검출기 (MALLS)와 조합된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계산된 분자량을 지칭한다.

본원에 사용된 "폴리사카라이드-단백질 접합체"는 폴리사카라이드 분자가 단백질 담체 분자에 1개 이상의 공유 결합을 통해 접합된 것을 지칭한다. 폴리사카라이드를 표적 숙주에서 면역원성인 것으로 공지된 또 다른 종으로부터의 단백질에 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 담체 분자는 담체 단백질이다. 본원에 정의된 바와 같이, 이러한 외래 단백질은 "담체 단백질"로 지칭된다. 담체 단백질은 폴리사카라이드의 항원성 및 면역원성을 증진시키는 역할을 한다. 본원에 사용된 용어 "담체 효과"는 담체로서 보다 면역원성인 분자 (예를 들어, 이종 단백질)에 부착됨으로써 약한 면역원성 또는 비-면역원성 분자의 항원성 및 면역원성이 증진되는 과정을 지칭한다. 이 경우에, 조합된 폴리사카라이드-단백질 접합체에서의 폴리사카라이드는 그것이 단독으로 제시되었을 경우보다 더 면역원성이 된다. 담체 단백질은 항체 반응을 생성하기 위한 T-세포 도움을 자극하기 위한 T 세포 에피토프를 함유한다.

본원에 사용된 "담체 단백질" 또는 "단백질 담체"는 면역 반응이 요구되는 항원 (예컨대 피막 폴리사카라이드)에 접합될 수 있는 임의의 단백질 분자를 지칭한다. 항원, 예컨대 폴리사카라이드의 담체 단백질에의 접합은 항원을 면역원성이도록 할 수 있다. 담체 단백질은 바람직하게는 비-독성이고 비-반응원성이고 충분한 양 및 순도로 수득가능한 단백질이다. 담체 단백질의 예는 파상풍, 디프테리아, 백일해, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 이. 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종으로부터의 독소, 톡소이드 또는 독소의 임의의 돌연변이 교차-반응성 물질 (CRM₁₉₇)이다. 담체 단백질은 표준 접합 절차로 처리될 수 있어야 한다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, CRM₁₉₇은 담체 단백질로서 사용된다.

교차-반응 물질 또는 CRM은 본 발명의 일부 실시양태에 대해 특히 유용하다. 특정 박테리아 독소와 항원적으로 유사하나, 비-독성인 유전자 변경 단백질을 생산할 수 있다. 이들은 "교차 반응 물질" 또는 CRM으로 불린다. CRM₁₉₇ (와이어쓰/화이자 인크., 노스캐롤라이나주 샌포드)은 그것이 천연 디프테리아 독소로부터의 단일 아미노산 변화를 갖고 그와 면역학적으로 구별불가능하기 때문에 주목할 만하다. 문헌 [Pappenheimer, A.M., et al., Immunochem., 9(9):891-906 (1972)]; 미국 특허 번호 5,614,382를 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. CRM₁₉₇은 카사미노산 및 효모 추출물-기재 배지 중에서 성장한 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. CRM₁₉₇은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온-교환 크로마토그래피를 통해 정제된다. CRM₁₉₇ 단백질을 생산하는 씨. 디프테리아에 균주 C7 (β197)의 배양물은 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었고, 수탁 번호 ATCC 53281이 배정되었다. 다른 디프테리아 톡소이드도 또한 담체 단백질로서 사용하는데 적합하다. CRM3201은 백일해 독소의 유전자 조작된 변이체이다. 문헌 [Black, W.J., et al., Science, 240(4852):656-659 (1988)]을 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

디프테리아 톡소이드 (DT), CRM₁₉₇ 및 백일해 톡소이드 이외에도, 담체 단백질의 추가의 예는 파상풍 톡소이드 (TT), 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이 열 불안정성 톡소이드 (LT), 이. 콜라이 열 안정성 톡소이드 (ST), 에스. 뉴모니아에로부터의 뉴몰리신 (야생형 또는 감소된 독성을 갖는 돌연변이체), 뉴모코쿠스 표면 단백질 A (PspA), 뉴모코쿠스 어드헤신 단백질 A (PsaA), 스트렙토코쿠스로부터의 C5a 펩티다제, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcal aureus)로부터의 헤몰리신, 비피막형 헤모필루스 인플루엔자에(Nontypeable Haemophilus influenzae) (NTHi) 단백질, 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 외독소/톡소이드, B형 간염 표면 항원, B형 간염 코어 항원, 로타바이러스 VP 7 단백질, 및 호흡기 세포융합 바이러스 F 및 G 단백질, 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA), 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD), 및 재조합적으로-생산된 비-독성 돌연변이체 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A를 포함하는 슈도모나스 외독소 또는 그의 유도체를 포함한다. 박테리아 외막 단백질, 예컨대 외막 단백질 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 또는 씨. 디피실레(C. difficile) 장독소 (독소 A) 및 세포독소 (독소 B)가 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)가 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질은 디프테리아 톡소이드이다. 보다 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM₁₉₇이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드이다.

다가 접합체 면역원성 조성물의 합성을 위해, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 2가지 상이한 종의 박테리아로부터 정제된 폴리사카라이드의 혼합물을 담체 단백질에 접합시킴으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 다가 접합체 면역원성 조성물은 동일한 박테리아의 2종 이상의 상이한 혈청형을 갖는 박테리아로부터 정제된 폴리사카라이드를 조합하고 이들을 혼합물로서 담체 단백질에 접합시킴으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 상이한 폴리사카라이드를 사용하는 개별 반응에서 단일 유형의 폴리사카라이드를 담체 단백질과 반응시킴으로써 생산된 폴리사카라이드-단백질 접합체가 혼합될 수 있다. 따라서, 다가 면역원성 조성물은 연결된 폴리사카라이드의 동종 또는 이종 집단을 지니는 담체 단백질을 포함할 수 있다.

피막 폴리사카라이드의 담체 단백질에의 접합 후에, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 다양한 기술에 의해 정제된다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양과 관련하여 풍부화됨). 이들 기술은, 예를 들어 농축/투석여과 작업, 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함한다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체 및 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 II 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드, 또는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드를 포함하는 적어도 1종의 추가의 접합체를 제공한다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리사카라이드는 약 5 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량을 갖고; 접합체는 약 300 kDa 내지 약 20,000 kDa의 분자량을 갖고; 접합체는 총 폴리사카라이드에 비해 약 40% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 접합체는 총 폴리사카라이드에 비해 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다.

한 실시양태에서, 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및/또는 IX 폴리사카라이드는 접합 전에 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 50 kDa 내지 약 750 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 75 kDa 내지 약 750 kDa, 약 75 kDa 내지 약 500 kDa, 약 75 kDa 내지 약 450 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 350 kDa, 약 75 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 250 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 750 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 650 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 550 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 및 750 kDa, 약 200 kDa 내지 약 700 kDa, 약 200 kDa 내지 약 650 kDa, 약 200 kDa 내지 약 600 kDa, 약 200 kDa 내지 약 550 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 650 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 550 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 450 kDa, 약 250 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 및 750 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa, 약 300 kDa 내지 약 650 kDa, 약 300 kDa 내지 약 600 kDa, 약 300 kDa 내지 약 550 kDa, 또는 약 300 kDa 내지 약 500 kDa의 분자량을 갖는다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 정수는 본 개시내용의 한 실시양태로서 고려된다.

한 실시양태에서, 접합체는 약 300 kDa 내지 약 20,000 kDa, 예컨대 약 300 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 7,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 6,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 5,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 4,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 3,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 2,000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 1,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 20,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 7,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 6,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 5,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 4,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 3,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 2,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 1,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 20,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 7,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 6,000 kDa, 약 1,000 kDa 내지 약 5,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 20,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 7,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 6,000 kDa, 약 1,500 kDa 내지 약 5,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 20,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 7,000 kDa, 약 2,000 kDa 내지 약 6,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 20,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 7,000 kDa, 약 2,500 kDa 내지 약 6,000 kDa, 약 3,000 kDa 내지 약 20,000 kDa, 약 3,000 kDa 내지 약 15,000 kDa, 약 3,000 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 3,000 kDa 내지 약 9,000 kDa, 약 3,000 kDa 내지 약 8,000 kDa, 약 3,000 kDa 내지 약 7,000 kDa, 또는 약 3,000 kDa 내지 약 6,000 kDa의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 II 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 III 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 V 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 범위의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 0.97 또는 0.98 mM 시알산을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 접합체는 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 또는 0.95 mM 시알산을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 II 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 III 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 V 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드 접합체는 적어도 임의의 상기 값의 시알산 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 또는 0.05 mM 미만의 O-아세테이트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 접합체는 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.35 또는 약 0.4 mM O-아세테이트를 포함한다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 IV 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 Ia 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 Ib 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 II 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 III 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 V 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VI 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VII 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 VIII 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

한 실시양태에서, GBS 혈청형 IX 피막 폴리사카라이드 접합체는 임의의 상기 값의 O-아세테이트 함량을 갖는다.

추가 실시양태에서, 면역원성 접합체는 GBS 피막 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만의 유리 GBS 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 면역원성 접합체는 GBS 피막 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 5% 미만의 미반응 유리 사카라이드를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 접합체 중 담체 단백질에 대한 GBS 피막 폴리사카라이드의 비 (중량 대 중량)는 약 0.5 내지 약 3.0이다. 한 측면에서, 접합체 중 담체 단백질에 대한 GBS 피막 폴리사카라이드의 비는 약 0.5 내지 약 2.0, 약 0.5 내지 약 1.5, 약 0.5 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.5, 또는 약 1.0 내지 약 2.0이다. 바람직한 실시양태에서, 접합체 중 담체 단백질에 대한 GBS 피막 폴리사카라이드의 비는 약 0.8 내지 약 1.0이다.

또 다른 실시양태에서, 접합체의 접합도는 2 내지 15, 2 내지 13, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 15, 3 내지 13, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 5 내지 15, 5 내지 10, 8 내지 15, 8 내지 12, 10 내지 15, 또는 10 내지 12이다. 바람직한 실시양태에서, 접합체의 접합도는 2 내지 5이다.

접합

접합은 폴리사카라이드로부터의 원자가 단백질 표면으로부터의 원자에 공유 결합되는 경우, 직접적일 수 있다. 대안적으로, 접합은 폴리사카라이드 및 단백질 둘 다와 반응하고 그 둘을 연결하여 탄수화물을 단백질에 테더링하는 링커 분자를 통한 것일 수 있다.

담체 및 1종 이상의 항원, 예컨대 폴리사카라이드가 접합되는 (즉, 공유 회합되는) 경우, 접합은 관련 기술분야에 공지된 임의의 화학적 방법, 과정 또는 유전자 기술에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 담체 폴리펩티드 및 탄수화물, 올리고사카라이드, 지질, 리포올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드-단백질 접합체, 폴리사카라이드-단백질 접합체, 펩티드-단백질 접합체, 올리고사카라이드-펩티드 접합체, 폴리사카라이드-펩티드 접합체, 단백질-단백질 접합체, 리포올리고사카라이드-단백질 접합체, 폴리사카라이드-단백질 접합체, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원은 (1) 단백질 관능기를 통한 직접 커플링 (예를 들어, 티올-티올 연결, 아민-카르복실 연결, 아민-알데히드 연결; 효소 직접 커플링); (2) 아민의 동종이관능성 커플링 (예를 들어, 비스-알데히드 사용); (3) 티올의 동종이관능성 커플링 (예를 들어, 비스-말레이미드 사용); (4) 광활성화 시약을 통한 동종이관능성 커플링; (5) 아민의 티올에 대한 이종이관능성 커플링 (예를 들어, 말레이미드 사용); (6) 광활성화 시약 (예를 들어, β-카르보닐디아조 패밀리)을 통한 이종이관능성 커플링; (7) 아민-반응성 기의 폴리- 또는 올리고사카라이드 내로의 브로민화시아노겐 활성화 또는 카르복시메틸화를 통한 도입; (8) 티올-반응성 기의 폴리- 또는 올리고사카라이드 내로의 이종이관능성 화합물, 예컨대 말레이미도-히드라지드를 통한 도입; (9) 소수성 기의 단백질 내로의 도입을 통한 단백질-지질 접합; 및 (10) 반응성 기의 지질 내로의 혼입을 통한 단백질-지질 접합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 기술에 의해 접합될 수 있다. 또한, 이종이관능성 "비-공유 커플링" 기술, 예컨대 비오틴-아비딘 상호작용이 고려된다. 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드의 면역원성 담체 단백질에의 접합을 실시하기 위한 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법이 또한 본 발명의 일부 실시양태의 범주 내에 있다.

한 실시양태에서, GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 폴리사카라이드를 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)로 활성화시켜 시아네이트 에스테르를 형성함으로써 수득된다. 활성화된 폴리사카라이드는 담체 단백질 상의 아미노 기에 직접적으로 또는 스페이서 (링커) 기를 통해 커플링될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 시스타민 또는 시스테아민이어서 티올화 폴리사카라이드를 제공할 수 있고, 이는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어, GMBS를 사용함) 또는 할로아세틸화 담체 단백질 (예를 들어, 아이오도아세트이미드, SIB, SlAB, 술포-SIAB, SIA 또는 SBAP를 사용함)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있다.

한 측면에서, 시아네이트 에스테르 (임의로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드 (ADH)와 커플링되고 아미노-유도체화된 사카라이드는 단백질 담체 상의 카르복실 기를 통한 카르보디이미드 (예를 들어, EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질에 접합된다. 이러한 접합체는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/29094에 기재되어 있다.

다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC 및 TSTU를 사용한다. 다수는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/42721에 기재되어 있다. 접합은 카르보닐 링커를 수반할 수 있으며, 이는 사카라이드의 유리 히드록실 기의 1,1 카르보닐디이미다졸 (CDI) 또는 1,1 카르보닐 디 1,2,4 트리아졸 (CDT)과의 반응 (문헌 [Bethell, et al., J. Biol. Chem., 254:2572-2574 (1979); Hearn, et al., J. Chromatogr., 218:509-518 (1981)] 참조)에 이어서 카르바메이트 연결을 형성하기 위한 단백질과의 반응에 의해 형성될 수 있다. 이것은 아노머 말단의 1급 히드록실 기로의 환원, 1급 히드록실 기의 임의적인 보호/탈보호, CDI/CDT 카르바메이트 중간체를 형성하기 위한 1급 히드록실 기의 CDI/CDT와의 반응, 및 CDI/CDT 카르바메이트 중간체의 단백질 상의 아미노 기와의 커플링을 수반할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 환원성 아미노화는 2개의 단계: (1) 개별 헥사사카라이드 단위에서의 이웃자리 디올로부터 알데히드 관능기를 생성하기 위한 폴리사카라이드의 산화 및 (2) 접합체를 형성하기 위한 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 환원을 수반한다.

한 실시양태에서, GBS 피막 폴리사카라이드는

(a) 단리된 GBS 피막 폴리사카라이드를 산화제와 반응시키는 단계; 및

(b) 켄칭제의 첨가에 의해 산화 반응을 켄칭하여 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드를 생성하는 단계

를 포함하는 과정에 의해 활성화 (산화)된다.

본 발명의 한 측면에서, 단리된 피막 폴리사카라이드의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10.0 mg/mL, 예컨대 약 0.5 mg/mL 내지 약 5.0 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 3.0 mg/mL, 또는 약 2.0 mg/mL이다.

특정한 실시양태에서, 산화제는 퍼아이오데이트이다. 퍼아이오데이트는 이웃자리 히드록실 기를 산화시켜 카르보닐 또는 알데히드 기를 형성하고, C-C 결합의 절단을 유발한다. 용어 '퍼아이오데이트'는 퍼아이오데이트 및 과아이오딘산 둘 다를 포함한다. 이 용어는 또한 메타퍼아이오데이트 (IO₄ ^-) 및 오르토퍼아이오데이트 (IO₆ ^5-) 둘 다를 포함한다. 용어 '퍼아이오데이트'는 또한 소듐 퍼아이오데이트 및 포타슘 퍼아이오데이트를 포함한 퍼아이오데이트의 다양한 염을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 산화제는 소듐 퍼아이오데이트이다. 바람직한 실시양태에서, GBS 피막 폴리사카라이드의 산화에 사용되는 퍼아이오데이트는 메타퍼아이오데이트이다. 바람직한 실시양태에서 혈청형 피막 폴리사카라이드의 산화에 사용되는 퍼아이오데이트는 소듐 메타퍼아이오데이트이다.

또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 0.01 내지 10.0, 0.05 내지 5.0, 0.1 내지 1.0, 0.5 내지 1.0, 0.7 내지 0.8, 0.05 내지 0.5, 또는 0.1 내지 0.3 몰 당량의 산화제와 반응한다. 특정한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.05, 약 0.1, 약 0.15, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.35, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.55, 약 0.6, 약 0.65, 약 0.7, 약 0.75, 약 0.8, 약 0.85, 약 0.9, 또는 약 0.95 몰 당량의 산화제와 반응한다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.1 몰 당량의 산화제와 반응한다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.15 몰 당량의 산화제와 반응한다. 추가의 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.25 몰 당량의 산화제와 반응한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.5 몰 당량의 산화제와 반응한다. 대안적 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.6 몰 당량의 산화제와 반응한다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드는 약 0.7 몰 당량의 산화제와 반응한다.

본 발명의 한 측면에서, 산화 반응의 지속기간은 약 1시간 내지 약 50시간, 약 10시간 내지 약 30시간, 약 15시간 내지 약 20시간, 약 15시간 내지 약 17시간, 또는 약 16시간이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 산화 반응의 온도는 약 2℃ 내지 약 25℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃로 유지된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 반응의 온도는 약 23℃로 유지된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 반응의 온도는 약 5℃로 유지된다.

추가 측면에서, 산화 반응은 인산나트륨, 인산칼륨, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 및 비스-트리스로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제 중에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서, 완충제는 인산칼륨이다.

추가의 측면에서, 완충제는 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 1 mM 내지 약 300mM, 또는 약 50 mM 내지 약 200mM의 농도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서 완충제는 약 100mM의 농도를 갖는다.

한 측면에서, 산화 반응은 약 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서, pH는 약 6.0이다.

한 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는 약 0.5 mg/L 내지 약 5.0 mg/mL의 단리된 피막 폴리사카라이드를 약 0.05 내지 약 0.3 몰 당량의 퍼아이오데이트와 약 20℃ 내지 25℃에서의 온도에서 반응시킴으로써 수득된다.

또 다른 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는 약 0.5 mg/L 내지 약 5.0 mg/mL의 단리된 피막 폴리사카라이드를 약 0.05 내지 약 0.3 몰 당량의 퍼아이오데이트와 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 반응시킴으로써 수득된다.

또 다른 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예컨대 겔 투과 크로마토그래피 (GPC), 투석, 또는 한외여과/투석여과에 따라 정제된다. 예를 들어, 활성화된 피막 폴리사카라이드는 한외여과 장치를 사용하여 농축 및 투석여과에 의해 정제된다.

한 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드의 산화도는 5 내지 25, 예컨대 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15이다. 바람직한 실시양태에서 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드의 산화도는 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16이다.

또 다른 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 예컨대 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 75 kDa 내지 약 400 kDa, 약 75 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 300 kDa 내지 약 700 kDa의 분자량을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는 약 75 kDa 내지 약 400 kDa의 분자량을 갖는다.

한 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는, 임의로 사카라이드의 존재 하에 동결건조된다. 바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티니트로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 수크로스이다. 동결건조된 활성화된 피막 폴리사카라이드는 이어서 담체 단백질을 포함하는 용액과 배합될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는 담체 단백질과 배합되고, 임의로 사카라이드의 존재 하에 동결건조된다. 한 측면에서, 사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티니트로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 수크로스이다. 공동-동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질은 이어서 용액 중에 재현탁되고 환원제와 반응될 수 있다.

활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드는

(a) 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드를 담체 단백질과 배합하는 단계, 및

(b) 배합된 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 환원제와 반응시켜 GBS 피막 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체를 형성하는 단계

를 포함하는 과정에 의해 담체 단백질에 접합될 수 있다.

극성 비양성자성 용매 중에서의 환원성 아미노화에 의한 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드의 단백질 담체와의 접합은, 예를 들어 미반응 (유리) 폴리사카라이드의 수준이 유의하게 상승되는 수용액 중에서의 환원성 아미노화와 비교하여 유리 폴리사카라이드의 낮은 수준을 유지하는데 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (a) 및 단계 (b)는 극성 비양성자성 용매 중에서 수행된다.

한 실시양태에서, 단계 (a)는 동결건조된 GBS 피막 폴리사카라이드를 담체 단백질 및 극성 비양성자성 용매를 포함하는 용액 중에 용해시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (a)는 공동-동결건조된 GBS 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 극성 비양성자성 용매 중에 용해시키는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 극성 비양성자성 용매는 디메틸술폭시드 (DMSO), 술폴란, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 극성 비양성자성 용매는 DMSO이다.

단계 (a) 및 (b)가 수용액 중에서 수행되는 경우, 단계 (a) 및 (b)는 수성 배지 내, 바람직하게는 PBS, MES, HEPES, 비스-트리스, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 비신 또는 HEPB로부터 선택된 완충제 중에서 약 6.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.0, 또는 약 7.0 내지 약 7.5의 pH에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서 완충제는 PBS이다. 바람직한 실시양태에서 pH는 약 7.3이다.

한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10.0 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 5.0 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 2.0 mg/mL이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 활성화된 혈청형 GBS 피막 폴리사카라이드의 농도는 약 0.1 mg/mL, 약 0.2 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.9 mg/mL, 약 1.0 mg/mL, 약 1.1 mg/mL, 약 1.2 mg/mL, 약 1.3 mg/mL, 약 1.4 mg/mL, 약 1.5 mg/mL, 약 1.6 mg/mL, 약 1.7 mg/mL, 약 1.8 mg/mL, 약 1.9 mg/mL, 약 2.0 mg/mL, 약 2.1 mg/mL, 약 2.2, 약 2.3 mg/mL, 약 2.4 mg/mL, 약 2.5 mg/mL, 약 2.6 mg/mL, 약 2.7 mg/mL, 약 2.8 mg/mL, 약 2.9 mg/mL, 또는 약 3.0 mg/mL이다.

바람직한 실시양태에서 활성화된 혈청형 GBS 피막 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 초기 비 (중량 대 중량)는 5:1 내지 0.1:1, 2:1 내지 0.1:1, 2:1 내지 1:1, 1.5:1 내지 1:1, 0.1:1 내지 1:1, 0.3:1 내지 1:1, 0.6:1 내지 1:1이다. 바람직한 실시양태에서 활성화된 혈청형 GBS 피막 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 초기 비는 약 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1이다.

한 실시양태에서, 환원제는 소듐 시아노보로히드라이드, 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, 브뢴스테드 또는 루이스 산의 존재 하에서의 소듐 또는 징크 보로히드라이드, 아민 보란, 예컨대 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-디보란-메탄올, 디메틸아민-보란, t-BuMeⁱPrN-BH₃, 벤질아민-BH₃ 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란 (PEMB)이다. 바람직한 실시양태에서, 환원제는 소듐 시아노보로히드라이드이다.

또 다른 실시양태에서, 단계 (b)에 사용되는 환원제의 양은 약 0.1 내지 약 10.0 몰 당량, 약 0.5 내지 약 5.0 몰 당량, 또는 약 1.0 내지 약 2.0 몰 당량이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)에 사용되는 환원제의 양은 약 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0 몰 당량이다.

바람직한 실시양태에서, 단계 (b)의 지속기간은 1시간 내지 60시간, 10시간 내지 50시간, 40시간 내지 50시간, 또는 42시간 내지 46시간이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)의 지속기간은 약 44시간이다.

추가 실시양태에서, 단계 (b)에서의 반응의 온도는 10℃ 내지 40℃, 15℃ 내지 30℃, 또는 20℃ 내지 26℃로 유지된다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 반응의 온도는 약 23℃로 유지된다.

추가의 실시양태에서, 담체 단백질에 공유 연결된 GBS 피막 폴리사카라이드를 포함하는 면역원성 접합체의 제조 과정은 보로히드라이드의 첨가에 의해 미반응 알데히드를 캡핑하는 단계 (켄칭 단계) (단계 (c))를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 캡핑 시약은 소듐 보로히드라이드 (NaBH₄), 소듐 시아노보로히드라이드, 리튬 보로히드라이드, 포타슘 보로히드라이드, 테트라부틸암모늄 보로히드라이드, 칼슘 보로히드라이드 및 마그네슘 보로히드라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 보로히드라이드이다. 바람직한 실시양태에서, 캡핑 시약은 소듐 보로히드라이드이다.

또 다른 실시양태에서, 단계 (c)에 사용되는 보로히드라이드의 양은 약 0.1 내지 약 10.0 몰 당량, 약 0.5 내지 약 5.0 몰 당량, 또는 약 1.0 내지 3.0 몰 당량이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에 사용되는 보로히드라이드의 양은 약 2.0 몰 당량이다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에 사용되는 보로히드라이드는 약 2.0 몰 당량의 농도의 NaBH₄이다.

한 실시양태에서, 단계 (c)의 지속기간은 0.1시간 내지 10시간, 0.5시간 내지 5시간, 2시간 내지 4시간이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)의 지속기간은 약 3시간이다.

또 다른 실시양태에서, 단계 (c)에서의 반응의 온도는 약 15℃ 내지 약 45℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 또는 약 20℃ 내지 약 26℃로 유지된다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 반응의 온도는 약 23℃로 유지된다.

GBS 피막 폴리사카라이드의 담체 단백질에의 접합 및 캡핑 후에, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 정제될 수 있다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양과 관련하여 풍부화됨). 이들 기술은 투석, 농축/투석여과 작업, 접선 흐름 여과, 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피 (DEAE 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피), 및 심층 여과를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체는 약 300 kDa 내지 약 20,000 kDa, 예컨대 약 1,000 kDa 내지 약 15,000 kDa 또는 약 1,000 kDa 내지 약 10,000 kDa의 분자량을 갖는다.

본 발명의 한 측면에서, GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 상기 기재된 환원성 아미노화 방법에 의해 수득된다. 예를 들어, 한 측면에서 본 개시내용은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 포함하는 GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제공하며 이는

(a) 단리된 GBS 피막 폴리사카라이드를 산화제와 반응시키는 단계;

(b) 켄칭제의 첨가에 의해 산화 반응을 켄칭하여 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드를 생성하는 단계;

(c) 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드를 담체 단백질과 배합하는 단계;

(d) 배합된 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 환원제와 반응시켜 GBS 피막 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체를 형성하는 단계; 및 임의로

(e) 소듐 보로히드라이드 (NaBH₄)의 첨가에 의해 미반응 알데히드를 캡핑하는 단계

를 포함하는 방법에 의해 생산되거나 또는 수득가능하다.

바람직한 실시양태에서, 단계 (c) 및 (d)는 DMSO 중에서 수행된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 상기 기재된 바와 같이 환원성 아미노화를 사용하여, 그러나 활성화/산화 단계에서 공산화제로서는 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 (TEMPO) 자유 라디칼 및 N-클로로숙신이미드 (NCS)를 사용하여 제조된다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/097099를 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 실시양태에서, GBS 피막 폴리사카라이드로부터의 당접합체는 NCS를 공산화제로서 사용하여 사카라이드의 1급 알콜을 알데히드로 산화시키기 위해 TEMPO 자유 라디칼을 사용 (이하 "TEMPO/NCS 산화")하여 제조되며, 이는 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/097099의 실시예 7에 기재되어 있다. 따라서 한 측면에서, GBS 피막 폴리사카라이드의 접합체는 a) GBS 피막 폴리사카라이드를 TEMPO 및 NCS와 용매 중에서 반응시켜 활성화된 사카라이드를 생산하는 단계; 및 b) 활성화된 사카라이드를 1개 이상의 아민 기를 포함하는 담체 단백질과 반응시키는 단계 (이하 "TEMPO/NCS-환원성 아미노화")를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다. 한 실시양태에서, 용매는 수성 용매 또는 DMSO일 수 있다.

한 측면에서, GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 상기 방법에 의해 수득된다. 예를 들어, 한 측면에서 본 개시내용은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 포함하는 GBS 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제공하며 이는 a) 사카라이드를 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 (TEMPO) 및 N-클로로숙신이미드 (NCS)와 용매 중에서 반응시켜 활성화된 사카라이드를 생산하는 단계; 및 b) 활성화된 사카라이드를 1개 이상의 아민 기를 포함하는 담체 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되거나 또는 수득가능하다. 한 실시양태에서, 용매는 수성 용매 또는 DMSO일 수 있다.

면역원성 조성물

개별 접합체가 정제된 후에, 이들은 조합되어, 예를 들어 백신에서 사용될 수 있는 본 발명의 면역원성 조성물로 제제화될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물의 제제화는 관련 기술분야에서 인식되는 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

면역원성 조성물에 대한 "면역 반응"은 대상체에서의 관심 조성물에 존재하는 분자 (예를 들어, 항원, 예컨대 단백질 또는 폴리사카라이드)에 대한 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응의 발생이다. 본 발명의 목적상, "체액성 면역 반응"은 항체-매개 면역 반응이고 본 발명의 면역원성 조성물 중에 존재하는 항원에 대한 친화도를 갖는 항체의 생성을 수반하는 반면, "세포-매개 면역 반응"은 T-림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 면역 반응이다. "세포-매개 면역 반응"은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 부류 I 또는 부류 II 분자와 회합된 항원 에피토프의 제시에 의해 도출된다. 이는 항원-특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 또는 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 (CTL)를 활성화시킨다. CTL은 MHC 또는 CD1에 의해 코딩되고 세포의 표면 상에 발현된 단백질과 회합되어 제시된 펩티드 또는 지질 항원에 대한 특이성을 갖는다. CTL은 세포내 미생물의 세포내 파괴, 또는 이러한 미생물로 감염된 세포의 용해를 유도하고 촉진하는 것을 돕는다. 세포성 면역의 또 다른 측면은 헬퍼 T-세포에 의한 항원-특이적 반응을 수반한다. 헬퍼 T-세포는 상기 기능을 자극하는 것을 돕는 역할을 하고, 그의 표면 상의 전형적 또는 비전형적 MHC 분자와 회합된 펩티드 항원을 디스플레이하는 세포에 대한 비특이적 이펙터 세포의 활성에 초점을 맞춘다. "세포-매개 면역 반응"은 또한 시토카인, 케모카인, 및 활성화된 T-세포 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래된 것들을 포함한 다른 백혈구에 의해 생산된 다른 이러한 분자의 생산을 지칭한다. 세포-매개 면역학적 반응을 자극하는 특정한 항원 또는 조성물의 능력은 다수의 검정, 예컨대 림프증식 (림프구 활성화) 검정, CTL 세포독성 세포 검정에 의해, 감작화된 대상체에서의 항원에 대해 특이적인 T-림프구에 대한 검정에 의해, 또는 항원으로의 재자극에 대한 반응에서의 T 세포에 의한 시토카인 생산의 측정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Erickson, A.L., et al., J. Immunol., 151(8):4189-4199 (1993); Doe, B., et al., Eur. J. Immunol. 24(10):2369-2376 (1994)]을 참조한다.

용어 "면역원성"은 체액성 또는 세포-매개 면역 반응 중 하나, 또는 둘 다를 도출하는 항원 또는 백신의 능력을 지칭한다.

각각이 본원에서 상호교환가능하게 사용된 "면역원성 양", 또는 "면역학적 유효량" 또는 "용량"은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 검정에 의해 측정된 바와 같은, 세포성 (T 세포) 또는 체액성 (B 세포 또는 항체) 반응 중 하나, 또는 둘 다의 면역 반응을 도출하기에 충분한 항원 또는 면역원성 조성물의 양을 지칭한다.

본원에 사용된 "면역 간섭" 또는 "유의한 면역 간섭"은 1가 백신으로 투여되는 경우에 동일한 항원에 대한 면역 반응과 비교하여 다가 또는 다성분 백신 중 개별 항원에 대한 면역 반응에서의 통계적으로 유의한 감소를 지칭한다.

"보호성" 면역 반응은, 대상체를 감염으로부터 보호하는 역할을 하는, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 도출하는 면역원성 조성물의 능력을 지칭한다. 제공된 보호는 절대적일 필요는 없으며, 즉 대상체의 대조군 집단, 예를 들어 백신 또는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 감염된 동물과 비교하여 통계적으로 유의한 개선이 존재하는 경우에, 감염이 전적으로 예방되거나 또는 근절될 필요는 없다. 보호는 감염의 증상의 중증도 또는 발병 급속도를 완화시키는 것으로 제한될 수 있다. 면역 반응이 "보호성 면역 반응"을 나타내는지 여부를 결정하기 위한 여러 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체 수준의 증가는 결합 검정, 예컨대 하기에 추가로 기재된 전세포 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다. 다른 검정은 기능적 항체 반응, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이 옵소닌식세포작용 검정 (OPA)으로 시험될 수 있는 박테리아 사멸의 촉진을 측정하는 것을 포함한다. 특정한 상황에서, "보호성 면역 반응"은 대상체의 적어도 50%에서 특정한 항원에 특이적인 항체 수준의 2-배 증가 또는 항체 수준의 4-배 증가를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 상황에서, "보호성 면역 반응"은 적어도 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 박테리아 수의 감소를 포함할 수 있다.

조성물 중 특정한 접합체의 양은 일반적으로 그 접합체에 대해, 접합된 및 비-접합된 총 폴리사카라이드에 기초하여 계산된다. 예를 들어, 20% 유리 폴리사카라이드를 갖는 GBS 피막 폴리사카라이드 접합체는 100 mcg/ml GBS 피막 폴리사카라이드 용량 중 약 80 mcg/ml의 접합된 GBS 피막 폴리사카라이드 및 약 20 mcg/ml의 비-접합된 GBS 피막 폴리사카라이드를 가질 것이다. 접합체에 대한 단백질 담체의 기여도는 통상적으로 접합체의 용량을 계산하는 경우에 고려되지 않는다. 접합체의 양은 스트렙토코쿠스 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각각의 용량은 약 0.01 mg/ml 내지 약 100 mcg/ml, 특히 약 1 mcg/ml 내지 약 70 mcg/ml, 및 보다 특히 약 5 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 각각의 폴리사카라이드를 포함할 것이다. 면역원성 조성물 중 상이한 폴리사카라이드 성분의 "면역원성 양"은 나뉘어질 수 있고, 각각은 약 0.01 mcg/ml, 약 0.1 mcg/ml, 약 0.25 mcg/ml, 약 0.5 mcg/ml, 약 1 mcg/ml, 약 2 mcg/ml, 약 3 mcg/ml, 약 4 mcg/ml, 약 5 mcg/ml, 약 6 mcg/ml, 약 7 mcg/ml, 약 8 mcg/ml, 약 9 mcg/ml, 약 10 mcg/ml, 약 15 mcg/ml, 약 20 mcg/ml, 약 25 mcg/ml, 약 30 mcg/ml, 약 40 mcg/ml, 약 50 mcg/ml, 약 60 mcg/ml, 약 70 mcg/ml, 약 80 mcg/ml, 약 90 mcg/ml, 또는 약 100 mcg/ml의 임의의 특정한 폴리사카라이드 항원을 포함할 수 있다. 다가 면역원성 조성물의 용량 또는 면역원성 양은 달리 나타내지 않는 한 각각의 폴리사카라이드의 용량을 나타낼 것이다. 예를 들어, 10 mcg/ml 용량의 6가 면역원성 조성물은 60 mcg/ml의 총 항원 또는 접합체 용량에 대해 10 mcg/ml의 각각의 6종의 폴리사카라이드를 함유할 것이다.

본 발명의 한 측면에서, 총 접합체 용량은 적어도 약 60 mcg/ml, 예컨대 적어도 약 120 mcg/ml 또는 적어도 약 240 mcg/l이다. 한 실시양태에서, 총 접합체 용량은 약 60 mcg/ml 내지 약 600 mcg/ml, 예컨대 약 60 mcg/ml 내지 약 540 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 480 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 420 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 300 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 240 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 180 mcg/ml, 약 60 mcg/ml 내지 약 120 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 600 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 540 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 480 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 420 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 300 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 240 mcg/ml, 약 120 mcg/ml 내지 약 180 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 600 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 540 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 480 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 420 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 300 mcg/ml, 약 180 mcg/ml 내지 약 240 mcg/ml, 약 240 mcg/ml 내지 약 600 mcg/ml, 약 240 mcg/ml 내지 약 540 mcg/ml, 약 240 mcg/ml 내지 약 480 mcg/ml, 약 240 mcg/ml 내지 약 420 mcg/ml, 약 240 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml, 또는 약 240 mcg/ml 내지 약 300 mcg/ml이다. 바람직한 실시양태에서, 총 접합체 용량은 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml, 및 가장 바람직하게는 약 120 mg/ml 내지 약 240 mcg/ml이다.

면역원으로서의 항원의 유효성은 면역검정, 면역침전 검정, 기능적 항체 검정, 예컨대 시험관내 옵소닌 검정 및 관련 기술분야에 공지된 많은 다른 검정을 사용하여 혈청 중 항원에 대해 특이적인 순환 항체의 수준을 측정함으로써 B 세포 활성의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. T-세포 면역원으로서의 항원의 유효성의 또 다른 측정은 증식 검정에 의해, 세포용해 검정, 예컨대 T 세포의 그의 특이적 표적 세포를 용해시키는 능력을 측정하기 위한 크로뮴 방출 검정에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 본 발명에서, "면역원성 양"은 또한 항원의 투여 후에 유도된 항원 특이적 항체의 혈청 수준을 측정함으로써 또는 그렇게 유도된 항체가 본원에 기재된 바와 같은 특정한 백혈구의 옵소닌식세포 능력을 증진시키는 능력을 측정함으로써 규정될 수 있다. 면역 반응의 보호 수준은 면역화된 숙주를 주사된 항원으로 챌린지시킴으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응이 요구되는 항원이 박테리아인 경우에, "면역원성 양"의 항원에 의해 유도된 보호 수준은, 동물을 박테리아 세포로 챌린지시킨 후의 퍼센트 생존율 또는 퍼센트 사망률을 검출함으로써 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 보호 양은 박테리아 감염과 연관된 적어도 1종의 증상, 예를 들어 감염과 연관된 열을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다중-항원 또는 다중-성분 백신 또는 면역원성 조성물 중 각각의 항원의 양은 각각의 다른 성분에 대하여 달라질 것이고, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 면역원성 및/또는 생체내 효능을 측정하는 절차를 포함할 것이다.

용어 "면역원성 조성물"은 대상체에서 면역 반응을 도출하는데 사용될 수 있는 항원, 예를 들어 미생물 또는 그의 성분을 함유하는 임의의 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물을 전신 경피 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써 GBS에 감염되기 쉬운 인간을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이들 투여는 근육내 (i.m.), 복강내 (i.p.), 피내 (i.d.) 또는 피하 경로를 통한 주사; 패치 또는 다른 경피 전달 장치에 의한 적용; 또는 구강/소화관, 기도 또는 비뇨생식관으로의 점막 투여를 통한 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신의 제조 또는 동물을 수동적으로 보호하거나 치료하는데 사용될 수 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 도출에 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은, 유효량의 적어도 1종의 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드-단백질 접합체 또는 그의 생물학적 등가물을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 피막 폴리사카라이드는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택되고 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는다. 또 다른 예에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 추가 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 IV로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 5종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 6종의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 에스. 아갈락티아에의 2 내지 10종의 상이한 혈청형을 포함한다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10-가 GBS 접합체 조성물이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 5-가 GBS 접합체 조성물이다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 6-가 GBS 접합체 조성물이다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 7-가 GBS 접합체 조성물이다. 추가 실시양태에서, 면역원성 조성물은 8-가 GBS 접합체 조성물이다.

조성물 중에 6종 미만, 5종 미만, 또는 4종 미만의 GBS 항원을 사용하는 것 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/082527 및 WO 2006/082530 참조) 및 특히 다가 조성물 중 혈청형 V의 사용과 관련한 면역 간섭의 경험 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/035519 참조)의 선행 교시에도 불구하고, 본 발명은 4종 이상의 GBS 항원의 사용에서도 다가 조성물 중 혈청형 V의 사용에서도 임의의 유의한 면역 간섭을 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명은 적어도 4종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형, 예컨대 적어도 5종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형, 적어도 6종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형, 적어도 7종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형, 적어도 8종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형, 또는 적어도 9종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 조성물은 유의한 면역 간섭을 갖지 않는다. 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형 V를 포함한다.

폴리사카라이드-단백질 접합체는 동일한 또는 상이한 단백질 담체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 접합체는 동일한 단백질 담체를 포함하고 사카라이드는 단백질 담체의 동일한 분자에 접합된다 (담체 분자는 그에 접합된 2종 이상의 상이한 폴리사카라이드를 가짐) [예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/083251 참조]. 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 단백질 담체의 상이한 분자에 각각 개별적으로 접합된다 (단백질 담체의 각각의 분자가 단지 그에 접합된 1가지 유형의 사카라이드만을 가짐). 상기 실시양태에서, 피막 사카라이드는 담체 단백질에 개별적으로 접합된 것으로 언급된다.

특정한 면역원성 조성물에 대한 성분의 최적량은 대상체에서 적절한 면역 반응의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체에게 적절히 간격을 두고 1회 또는 수회 부스터 면역화를 수행할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 복수의 피막 폴리사카라이드 단백질 접합체 이외에도 1종 이상의 보존제를 추가로 포함할 수 있다. FDA는 다중-용량 (다-용량) 바이알 내의 생물학적 제품이 단지 몇 가지 예외를 제외하고는 보존제를 함유할 것을 요구하고 있다. 본 발명은 이러한 다중-용량 바이알의 사용을 고려한다. 보존제를 함유하는 백신 제품은 벤제토늄 클로라이드 (안트락스), 2-페녹시에탄올 (DTaP, HepA, 라임, 폴리오 (비경구)), 및 페놀 (뉴모, 티포이드 (비경구))을 함유하는 백신을 포함한다. 주사가능한 약물에 사용하도록 승인된 보존제는, 예를 들어 클로로부탄올, m 크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알콜, 페놀, 및 질산페닐제2수은을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리사카라이드 중 적어도 1종 및 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 안정화제, 아주반트, 동결보호제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 자유 라디칼 산화의 억제제, 희석제 또는 담체, 또는 그의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

면역원성 조성물은 HEPES, PIPES, MES, 트리스 (트리메타민), 포스페이트, 아세테이트, 보레이트, 시트레이트, 글리신, 히스티딘 및 숙시네이트로부터 선택되나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 생리학상 허용되는 완충제를 임의로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 또는 포스페이트이다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 15 mM 내지 약 50 mM, 약 15 mM 내지 약 40 mM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 15 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM의 농도의 완충제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 10 mM 내지 약 25 mM, 예컨대 약 15 mM 내지 약 25 mM, 및 가장 바람직하게는 약 20 mM의 농도의 완충제를 포함한다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 20 mM의 농도의 히스티딘을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 20 mM의 농도의 포스페이트를 포함한다.

특정 실시양태에서, 제제는 약 5.0 내지 약 7.5, 예컨대 5.3 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 5.3 내지 약 7.1, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.3 내지 약 7.0, 또는 약 6.5 내지 약 7.0의 pH 범위 내로 완충된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5의 pH로 완충된다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 약 6.0 내지 약 7.5, 예컨대 약 6.5 내지 약 7.5 및 가장 바람직하게는 약 6.5 또는 약 7.0의 pH 범위로 완충된다.

면역원성 조성물은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트-80 (트윈 80), 폴리소르베이트-60 (트윈 60), 폴리소르베이트-40 (트윈 40), 폴리소르베이트-20 (트윈 20), 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (브리즈 58, 브리즈 35를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 뿐만 아니라 기타 예컨대 트리톤 X-100; 트리톤 X-114, NP40, 스팬 85 및 비-이온성 계면활성제의 플루로닉 시리즈 (예를 들어, 플루로닉 121)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 비-이온성 계면활성제를 임의로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리소르베이트-80 또는 폴리소르베이트-40, 바람직하게는 폴리소르베이트-80 (PS80)을 포함한다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.001% 내지 약 2% (v/w), 약 0.001% 내지 약 1%, 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.001% 내지 약 0.1%, 약 0.001% 내지 약 0.05%, 약 0.001% 내지 약 0.01%, 약 0.001% 내지 0.005%, 약 0.005% 내지 약 2%, 약 0.005% 내지 약 1%, 약 0.005% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.1%, 약 0.005% 내지 약 0.05%, 약 0.005% 내지 약 0.01%, 약 0.01% 내지 약 2%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.01% 내지 약 0.5%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 약 0.01% 내지 약 0.04%, 약 0.01% 내지 약 0.03%, 약 0.015% 내지 약 2%, 약 0.015% 내지 약 1%, 약 0.015% 내지 약 0.5%, 약 0.015% 내지 약 0.1%, 약 0.015% 내지 약 0.05%, 약 0.015% 내지 약 0.04%, 약 0.015% 내지 약 0.03%, 약 0.02% 내지 약 2%, 약 0.02% 내지 약 1%, 약 0.02% 내지 약 0.5%, 약 0.02% 내지 약 0.1%, 약 0.02% 내지 약 0.05%, 약 0.02% 내지 약 0.04%, 약 0.02% 내지 약 0.03%, 약 0.05% 내지 약 2%, 약 0.05% 내지 약 1%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.05% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.5% 또는 약 0.1% 내지 약 0.25%의 농도의 계면활성제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.01% 내지 약 0.03%, 및 가장 바람직하게는 약 0.02%의 농도의 계면활성제를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.001% 내지 약 2% (최대 약 0.25%가 바람직함) 농도의 폴리소르베이트-80 또는 약 0.001% 내지 1% (최대 약 0.5%가 바람직함) 농도의 폴리소르베이트-40을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.02%의 농도의 PS80을 포함한다.

제약상 허용되는 담체는, 본 발명의 탄수화물을 단백질에 부착하는데 사용되고 그 탄수화물에 대한 면역 반응을 변형시키는 "담체 단백질"과 혼동되어서는 안된다. 본원에 기재된 단백질 담체와의 혼동을 피하기 위해, 용어 제약상 허용되는 희석제가 제약상 허용되는 담체보다 바람직할 것이나, 이들 용어는 때때로 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "제약상 허용되는 담체"는 연방 정부의 규제 기관, 주 정부, 또는 기타 규제 기관에 의해 승인되었거나, 또는 미국 약전 또는 인간 뿐만 아니라 비-인간 포유동물을 포함한 동물에서의 사용에 대해 일반적으로 인식되는 기타 약전에 열거된 담체를 의미한다. 용어 "담체"는 제약 조성물과 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 적합한 제약상 허용되는 희석제는 임의의 및 모든 통상적인 용매, 분산 매질, 충전제, 고체 담체, 수용액, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 이러한 제약상 허용되는 희석제는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일일 수 있다. 물, 주사용수 (WFI), 멸균 등장성 염수 용액, 포스페이트 완충 염수, 아주반트 현탁액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 및 그의 조합은, 특히 주사액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제는 미량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 보관 수명 또는 체내 유효성을 증진시킨다. 제약상 허용되는 희석제의 제조 및 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 희석제는 물, 주사용수 (WFI), 아주반트 현탁액, 또는 염수이다. 특정한 실시양태에서, 희석제는 본원에 기재된 임의의 아주반트의 현탁액이다. 바람직한 실시양태에서, 희석제는 알루미늄-기재 아주반트 현탁액, 예컨대 인산알루미늄 현탁액이다.

적합한 제약 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨, 팔라티니트, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 글리신, 아르기닌, 리신, 염화나트륨 (NaCl), 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 부형제는 NaCl이다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 450 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 350 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 250 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 20 mM 내지 약 500 mM, 약 20 mM 내지 약 450 mM, 약 20 mM 내지 약 400 mM, 약 20 mM 내지 약 350 mM, 약 20 mM 내지 약 300 mM, 약 20 mM 내지 약 250 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 50 mM 내지 약 500 mM, 약 50 mM 내지 약 450 mM, 약 50 mM 내지 약 400 mM, 약 50 mM 내지 약 350 mM, 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 50 mM 내지 약 250 mM, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 450 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 350 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 250 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 120 mM 내지 약 470 mM, 약 120 mM 내지 약 420 mM, 약 120 mM 내지 약 370 mM, 약 120 mM 내지 약 320 mM, 약 120 mM 내지 약 270 mM, 약 120 mM 내지 약 220 mM, 약 120 mM 내지 약 170 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 450 mM, 약 150 mM 내지 약 400 mM, 약 150 mM 내지 약 350 mM, 약 150 mM 내지 약 300 mM, 약 150 mM 내지 약 250 mM, 약 150 mM 내지 약 200 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 450 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 350 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM, 약 200 mM 내지 약 250 mM, 약 225 mM 내지 약 465 mM, 약 225 mM 내지 약 425 mM, 약 225 mM 내지 약 365 mM, 약 225 mM 내지 약 325 mM, 약 225 mM 내지 약 265 mM, 약 250 mM 내지 약 500 mM, 약 250 mM 내지 약 450 mM, 약 250 mM 내지 약 400 mM, 약 250 mM 내지 약 350 mM, 약 250 mM 내지 약 300 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 450 mM, 약 300 mM 내지 약 400 mM, 약 300 mM 내지 약 350 mM, 약 350 mM 내지 약 500 mM, 약 350 mM 내지 약 450 mM, 약 350 mM 내지 약 400 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 450 mM, 또는 약 450 mM 내지 약 500 mM의 농도의 부형제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 10 mM 내지 약 350 mM, 예컨대 약 130 mM 내지 약 170 mM 및 약 225 mM 내지 약 265 mM, 및 가장 바람직하게는 약 150 mM 또는 약 245 mM의 농도의 부형제를 포함한다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 부형제는 약 150 mM의 농도의 NaCl이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 부형제는 약 245 mM의 농도의 NaCl이다.

원하는 경우, 조성물은 또한 미량의 습윤제, 벌크화제, 유화제, 또는 pH 완충 작용제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조 분말 또는 케이크 등의 형태를 취할 수 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 면역원성 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은, 임의로 적어도 1종의 부형제의 존재 하에 동결건조된다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 1종의 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨, 팔라티니트, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 글리신, 아르기닌, 리신, 염화나트륨 (NaCl), 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 1종의 부형제는 수크로스, 만니톨 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 부형제는 수크로스이다. 또 다른 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 추가의 부형제를 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 추가의 부형제는 만니톨 또는 글리신이다.

또 다른 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 예컨대 약 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% 또는 10.0%의 적어도 1종의 사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 약 5.5% (w/v) 초과, 예컨대 약 7.0% (w/v) 초과의 적어도 1종의 부형제를 포함한다. 추가 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 예컨대 약 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% 또는 10.0%의 추가의 부형제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 적어도 1종의 부형제 및 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 추가의 부형제를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 물, 주사용수 (WFI), 아주반트 현탁액 또는 염수로 재구성된다. 바람직한 실시양태에서, 희석제는 알루미늄-기재 아주반트 현탁액, 예컨대 인산알루미늄 현탁액이다.

한 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 단리된 폴리사카라이드 및 담체 분자를 포함한다. 적합한 담체 분자는 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 (예컨대 오일 액적 또는 리포솜), 및 불활성 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 미립자 담체의 예는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 폴리(락티드) 및 PLG로서 공지된 폴리(락티드-코-글리콜리드)로부터 유래된 마이크로입자를 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물은, 면역계를 교란시키거나 또는 변경하여 체액성 및/또는 세포-매개 면역의 상향-조절 또는 하향-조절이 관찰되도록 하는 작용제인 1종 이상의 추가의 "면역조정제"를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 면역계의 체액성 및/또는 세포-매개 부문의 상향-조절이 바람직하다. 특정 면역조정제의 예는, 예를 들어 아주반트 또는 시토카인, 또는 그 중에서도 미국 특허 번호 5,254,339에 기재된 이스코매트릭스 (씨에스엘 리미티드, 오스트레일리아 파크빌)를 포함한다. 용어 "아주반트"는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 아주반트의 비제한적 예는 리비 아주반트 시스템 (리비 인크., 몬타나주 해밀턴); 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄 겔; 유중수 에멀젼, 예컨대 완전 및 불완전 프로인트 아주반트; 블록 공중합체 (CytRx, 조지아주 애틀랜타); SAF-M (키론, 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN)® 아주반트; 사포닌; 퀼 A 또는 다른 사포닌 분획; 모노포스포릴 지질 A; 및 아브리딘 지질-아민 아주반트를 포함한다. 본 발명의 백신에서의 아주반트로서 유용한 수중유 에멀젼의 비제한적 예는 MF59 (미국 특허 번호 6,299,884) (5% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80, 및 0.5% 스팬 85 (임의로 다양한 양의 MTP-PE 함유)를 함유하며, 이는 미세유동화기, 예컨대 모델 110Y 미세유동화기 (마이크로플루이딕스, 매사추세츠주 뉴턴)를 사용하여 서브마이크미터 입자로 제제화됨), 및 SAF (10% 스쿠알렌, 0.4% 폴리소르베이트 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하며, 이는 서브마이크로미터 에멀젼으로 미세유동화되거나 볼텍싱되어 더 큰 입자 크기의 에멀젼을 생성함); 변형된 SEAM62 (5% (v/v) 스쿠알렌 (시그마), 1% (v/v) 스팬® 85 세제 (아이씨아이 서팩턴츠), 0.7% (v/v) 폴리소르베이트 80 세제 (아이씨아이 서팩턴츠), 2.5% (v/v) 에탄올, 200 mcg/ml 퀼 A, 100 mcg/ml 콜레스테롤, 및 0.5% (v/v) 레시틴 함유); 및 변형된 SEAM 1/2 (5% (v/v) 스쿠알렌, 1% (v/v) 스팬® 85 세제, 0.7% (v/v) 폴리소르베이트 80 세제, 2.5% (v/v) 에탄올, 100 mcg/ml 퀼 A, 및 50 mcg/ml 콜레스테롤 함유)를 포함한다.

면역 반응을 증진시키기 위해 사용되는 적합한 아주반트는, 비제한적으로, 미국 특허 번호 4,912,094에 기재된 MPL™ (3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A, 코릭사, 몬타나주 해밀턴)을 추가로 포함한다. 또한 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그의 유도체 또는 유사체가 아주반트로서 사용하는데 적합하며, 이는 코릭사 (몬타나주 해밀턴)로부터 입수가능하고, 미국 특허 번호 6,113,918에 기재되어 있다. 1종의 이러한 AGP는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노] 에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노시드이며, 이는 또한 529로 공지되어 있다 (이전에는 RC529로 공지됨). 이러한 529 아주반트는 수성 형태 (AF)로서 또는 안정한 에멀젼 (SE)으로서 제제화된다.

또 다른 아주반트는 시클로덱스트린 유도체 (미국 특허 번호 6,165,995); 다가음이온성 중합체 (미국 특허 번호 6,610,310); 뮤라밀 펩티드, 예컨대 N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), 및 N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE); 암피겐; 아브리딘; L121/스쿠알렌; D-락티드-폴리락티드/글리코시드; 플루로닉 폴리올; 사멸된 보르데텔라; 사포닌, 예컨대 미국 특허 번호 5,057,540에 기재된 스티뮬론(Stimulon)™ QS-21 (안티제닉스, 매사추세츠주 프레이밍햄); 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis); 박테리아 리포폴리사카라이드; 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,207,646); 유럽 특허 번호 1,296,713 및 1,326,634에 기재된 IC-31 (인터셀 아게, 오스트리아 비엔나); 백일해 독소 (PT) 또는 그의 돌연변이체, 콜레라 독소 또는 그의 돌연변이체 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,285,281, 7,332,174, 7,361,355 및 7,384,640); 또는 이. 콜라이 열-불안정성 독소 (LT) 또는 그의 돌연변이체, 특히 LT-K63, LT-R72 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,149,919, 7,115,730 및 7,291,588)를 포함한다.

백신에 포함될 수 있는 다른 "면역조정제"는, 예를 들어 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,723,127 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18 (및 그의 돌연변이체 형태); 인터페론-α, β 및 γ; 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,078,996 및 ATCC 수탁 번호 39900 참조); 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF); 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF); 또는 종양 괴사 인자 α 및 β 중 1종 이상을 포함한다. 본원에 기재된 면역원성 조성물에 유용한 또 다른 아주반트는, 비제한적으로 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함한 케모카인; 부착 분자, 예컨대 셀렉틴, 예를 들어 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴; 뮤신-유사 분자, 예를 들어 CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1; 인테그린 패밀리의 구성원, 예컨대 LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95; 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 구성원, 예컨대 PECAM, ICAM, 예를 들어 ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3; 공동-자극 분자, 예컨대 B7-1, B7-2, CD40 및 CD40L; 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한 성장 인자; Fas, TNF 수용체, Flt, 아포-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, 아포-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6를 포함한 수용체 분자; 및 카스파제 (ICE)를 포함한다.

면역조정제 및/또는 아주반트를 사용할 지에 대한 결정 또는 사용될 면역조정제 및/또는 아주반트의 선택은 백신 또는 면역원성 조성물이 투여될 대상체, 주사의 경로, 및 제공될 주사의 횟수에 따라 좌우될 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 대상체가 자연적으로 병원체에 노출된 경우, 아주반트는 백신 항원이 효과적으로 기억 반응을 유도할 수 있기 때문에 필요하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 1종 이상의 아주반트를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 알루미늄-기재 아주반트를 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 알루미늄 아주반트는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 또는 알루미늄 히드록실 포스페이트이다. 특정한 실시양태에서, 아주반트는 인산알루미늄이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 QS-21을 아주반트로서 포함한다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.9 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.8 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.7 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.4 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.3 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.95 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.85 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.65 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.55 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml, 0.25 mg/ml 내지 약 0.35 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 0.9 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 0.8 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 0.7 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 0.65 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 0.75 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 0.75 mg/ml 내지 약 0.95 mg/ml, 0.75 mg/ml 내지 약 0.9 mg/ml, 및 0.75 mg/ml 내지 약 0.85 mg/ml의 농도의 아주반트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/ml의 농도의 아주반트를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 아주반트는 약 0.5 mg/ml의 농도의 알루미늄-기재 아주반트이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 알루미늄-기재 아주반트는 인산알루미늄 또는 알루미늄 히드록실 포스페이트이다. 또 다른 실시양태에서, 알루미늄-기재 아주반트는 수산화알루미늄이다.

알루미늄-기재 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물은 시간의 함수로서 상 분리되는 경향이 있으며; 알루미늄 입자는 저장 동안 침전물이 침강함에 따라 액체로부터 분리될 것임을 주목하여야 한다. 성공적인 투여를 보장하기 위해, 면역원성 조성물은 투여 전에 시각적으로 균일하고 재현탁되어야 한다. 따라서, 조성물이 균일하게 재현탁되기에 용이하다는 것이 중요하다. 본 발명의 한 측면에서, 면역원성 조성물은 약 50회 이하의 진탕, 예컨대 약 40회 이하의 진탕, 약 30회 이하의 진탕, 약 25회 이하의 진탕, 약 20회 이하의 진탕, 약 15회 이하의 진탕, 약 10회 이하의 진탕 또는 약 5회 이하의 진탕으로 재현탁된다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 10회 이하의 진탕으로 재현탁된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 50회 진탕, 예컨대 약 1 내지 약 40회 진탕, 약 1 내지 약 30회 진탕, 약 1 내지 약 25회 진탕, 약 1 내지 약 20회 진탕, 약 1 내지 약 15회 진탕, 약 1 내지 약 10회 진탕, 또는 약 1 내지 약 5회 진탕으로 재현탁된다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 10회 진탕으로 재현탁된다.

본 발명의 한 측면에서, 면역원성 조성물은 용기에 충전된다. 한 실시양태에서, 용기는 바이알, 플라스크, 백 및 시린지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 용기는 유리, 금속 (예컨대 강철, 스테인레스 스틸 및 알루미늄), 및 중합체 (예컨대 열가소성 물질, 엘라스토머, 열가소성 물질-엘라스토머)로 제조된다. 한 실시양태에서, 용기는 실리콘화된다. 바람직한 실시양태에서, 용기는 시린지이고, 가장 바람직하게는 유리 시린지이다.

하나의 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 1 mm 내지 약 15 mm, 예컨대 약 1 mm 내지 약 11 mm, 약 1 mm 내지 약 10 mm, 약 1 mm 내지 약 9 mm, 약 1 mm 내지 약 8 mm, 약 1 mm 내지 약 7mm, 약 1 mm 내지 약 6 mm, 약 1 mm 내지 약 5 mm, 약 1 mm 내지 약 4 mm, 약 1 mm 내지 약 3 mm, 약 2 mm 내지 약 15 mm, 약 2 mm 내지 약 11 mm, 약 2 mm 내지 약 10 mm, 약 2 mm 내지 약 9 mm, 약 2 mm 내지 약 8 mm, 약 2 mm 내지 약 7mm, 약 2 mm 내지 약 6 mm, 약 2 mm 내지 약 5 mm, 약 2 mm 내지 약 4 mm, 약 3 mm 내지 약 15 mm, 약 3 mm 내지 약 11 mm, 약 3 mm 내지 약 10 mm, 약 3 mm 내지 약 9 mm, 약 3 mm 내지 약 8 mm, 약 3 mm 내지 약 7mm, 약 32 mm 내지 약 6 mm, 약 3 mm 내지 약 5 mm, 약 4 mm 내지 약 15 mm, 약 4 mm 내지 약 11 mm, 약 4 mm 내지 약 10 mm, 약 4 mm 내지 약 9 mm, 약 4 mm 내지 약 8 mm, 약 4 mm 내지 약 7mm, 약 4 mm 내지 약 6 mm, 약 5 mm 내지 약 15 mm, 약 5 mm 내지 약 11 mm, 약 5 mm 내지 약 10 mm, 약 5 mm 내지 약 9 mm, 약 5 mm 내지 약 8 mm, 또는 약 5 mm 내지 약 7mm의 헤드스페이스를 갖는 시린지에 충전된다. 바람직한 실시양태에서, 헤드스페이스는 약 2 mm 내지 약 6 mm, 및 가장 바람직하게는 약 4 mm이다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 폴리사카라이드-단백질 접합체, 완충제, 계면활성제, 부형제 및 임의로 아주반트를 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5의 pH로 완충된다.

하나의 이러한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 완충제, 계면활성제, 부형제 및 임의로 아주반트를 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5의 pH로 완충되고, 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 히스티딘, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 임의로 인산알루미늄을 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.0의 pH로 완충된다.

하나의 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 히스티딘, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 임의로 인산알루미늄을 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.0의 pH로 완충되고, 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는다.

바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 5 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 약 10 mM 내지 약 25 mM의 히스티딘, 약 0.01% 내지 약 0.03% (v/w)의 폴리소르베이트-80, 약 10 mM 내지 약 250 mM의 염화나트륨 및 임의로 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 포함하며, 여기서 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 포스페이트, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 인산알루미늄을 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5의 pH로 완충된다.

추가의 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 포스페이트, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 인산알루미늄을 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5의 pH로 완충되고, 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는다.

바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 5 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 약 10 mM 내지 약 25 mM의 포스페이트, 약 0.01% 내지 약 0.03% (v/w)의 폴리소르베이트-80, 약 10 mM 내지 약 350 mM의 염화나트륨, 및 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 포함하며, 여기서 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는다.

하나의 이러한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 2종의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 완충제, 계면활성제, 부형제 및 임의로 아주반트를 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5의 pH로 완충되고, 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 IV 및 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

하나의 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 2종의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 히스티딘, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 임의로 인산알루미늄을 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.0의 pH로 완충되고, 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 IV 및 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 5 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 각각의 적어도 2종의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 약 10 mM 내지 약 25 mM의 히스티딘, 약 0.01% 내지 약 0.03% (v/w)의 폴리소르베이트-80, 약 10 mM 내지 약 250 mM의 염화나트륨 및 임의로 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 IV 및 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

또 다른 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 2종의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 포스페이트, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 인산알루미늄을 포함하며, 여기서 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5의 pH로 완충되고, 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 IV 및 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 5 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 각각의 적어도 2종의 GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체, 약 10 mM 내지 약 25 mM의 포스페이트, 약 0.01% 내지 약 0.03% (v/w)의 폴리소르베이트-80, 약 10 mM 내지 약 350 mM의 염화나트륨, 및 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 IV 및 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.

면역원성 조성물의 평가

다양한 시험관내 시험이 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 평가하는데 사용된다. 예를 들어, 시험관내 옵소닌 검정은 스트렙토코쿠스 세포, 해당 항원에 대한 특이적 항체를 함유하는 열 불활성화된 혈청, 및 외인성 보체 공급원의 혼합물을 함께 인큐베이션함으로써 수행된다. 새롭게 단리된 다형핵 세포 (PMN의 것) 또는 분화된 이펙터 세포 예컨대 HL60 및 항체/보체/스트렙토코쿠스 세포 혼합물의 인큐베이션 동안 옵소닌식세포작용이 진행된다. 항체 및 보체로 코팅된 박테리아 세포는 옵소닌식세포작용 시에 사멸된다. 옵소닌식세포작용으로부터 회수된 생존 박테리아의 콜로니 형성 단위 (cfu)는 검정 혼합물을 플레이팅함으로써 결정된다. 검정 대조군과의 비교에 의해 결정된 바와 같이, 역가는 50% 박테리아 사멸을 제공하는 최고 희석의 역수로서 보고된다.

전세포 ELISA 검정은 또한 시험관내 면역원성 및 항원의 표면 노출을 평가하는데 사용될 수 있으며, 여기서 관심 박테리아 균주 (에스. 아갈락티아에)는 플레이트, 예컨대 96 웰 플레이트 상에 코팅되고, 면역화된 동물로부터의 시험 혈청은 박테리아 세포와 반응한다. 시험 항원에 대해 특이적인 항체가 항원의 표면 노출된 에피토프와 반응성인 경우, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 유동 세포측정법은 피막 폴리사카라이드 항원의 표면 노출 및 모노클로날 항체를 포함한 항체의 특이성을 측정하는데 사용될 수 있다.

원하는 시험관내 활성을 나타내는 항원은 이어서 생체내 동물 챌린지 모델에서 시험될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 면역화 방법 및 경로 (예를 들어, 비강내, 비경구, 경구, 직장, 질, 경피, 복강내, 정맥내, 피하 등)에 의한 동물 (예를 들어, 마우스)의 면역화에 사용된다. GBS 면역원성 조성물을 사용한 동물의 면역화 후에, 동물은 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 균주로 챌린지되고 스트렙토코쿠스 감염에 대한 내성에 대해 검정된다.

한 실시양태에서, 병원체-무함유 마우스는 에스. 아갈락티아에로 면역화되고 챌린지된다. 예를 들어, 마우스는 면역원성 조성물 중 1회 이상의 용량의 원하는 항원으로 면역화된다. 후속하여, 마우스는 에스. 아갈락티아에로 챌린지되고 생존은 챌린지 후 시간 경과에 따라 모니터링된다.

사용 방법

본원에 사용된 "면역손상된"은 면역계의 세포성 및/또는 체액성 부문(들)에 대한 결핍을 앓고 있는 대상체를 지칭한다. 따라서, 면역 과정에서의 약간의 장애로부터 완전한 면역 억제까지 달라지는 면역 기능의 결핍의 정도가 고려된다.

용어 "대상체"는 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 또는 임의의 다른 동물을 지칭한다. 용어 "대상체"는 또한 인간을 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 가정용 애완 동물을 포함한다. 가정용 애완동물의 비제한적 예는 개, 고양이, 돼지, 토끼, 래트, 마우스, 저빌, 햄스터, 기니 피그, 페릿, 조류, 뱀, 도마뱀, 어류, 거북이, 및 개구리를 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 가축 동물을 포함한다. 가축 동물의 비제한적 예는 알파카, 들소, 낙타, 소, 사슴, 돼지, 말, 라마, 노새, 당나귀, 양, 염소, 토끼, 순록, 야크, 닭, 거위, 및 칠면조를 포함한다.

본원에 사용된 "치료" (그의 변형, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료된" 포함)는 (i) 전통적인 백신에서와 같은, 감염 또는 재감염의 예방, (ii) 증상의 중증도 감소 또는 증상의 제거, 및 (iii) 해당 병원체 또는 장애의 실질적 또는 완전한 제거 중 어느 하나 이상을 지칭한다. 따라서, 치료는 예방적으로 (감염 전에) 또는 치료적으로 (감염 후에) 실시될 수 있다. 본 발명에서, 예방적 또는 치료적 치료가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에 따르면, 미생물 감염 (예를 들어 박테리아, 예컨대 에스. 아갈락티아에)에 대해 숙주 동물을 예방적으로 및/또는 치료적으로 면역화시키는 것을 포함하여 치료하는 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 대상체에게 예방적 및/또는 치료적 면역을 부여하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 또한 생의학 연구 적용을 위해 대상체에 대해 실시될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역원성 조성물을 투여함으로써 대상체에서 GBS에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역원성 조성물을 투여함으로써 대상체에서 B군 스트렙토코쿠스와 연관된 질환 또는 상태를 예방하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 GBS에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 임신 계획 중인 여성 또는 임신한 여성이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 임신한 여성은 임신 후반기, 예컨대 적어도 임신 20주 또는 적어도 27주이다. 바람직한 실시양태에서, 임신한 여성은 임신 27주 내지 36주이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 노인, 예컨대 50세 이상, 65세 이상, 및 85세 이상의 성인이다. 추가 실시양태에서, 대상체는 면역손상된다. 한 측면에서, 대상체는 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, B군 스트렙토코쿠스는 에스. 아갈락티아에이다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 GBS 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형을 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 접합체는 GBS 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종의 추가의 혈청형을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 접합체는 GBS 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3종의 추가의 혈청형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서 접합체는 GBS 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4종의 추가의 혈청형을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 IV를 포함한다. 추가 실시양태에서 접합체는 GBS 혈청형 IV 및 혈청형 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 5종의 추가의 혈청형을 포함한다. 추가 실시양태에서 조성물은 GBS 혈청형 V를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 V를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 면역원성 조성물은 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V로부터의 6종의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함한다. 본 발명의 한 측면은 면역 간섭을 갖지 않는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

면역원성 조성물의 면역원성 양 또는 유효량은 대상체가 점진적으로 증가하는 양의 면역원성 조성물로 면역화되고 면역 반응이 분석되어 최적 투여량이 결정되는 것인 용량 반응 연구를 수행함으로써 결정될 수 있다. 연구를 위한 출발점은 동물 모델에서의 면역화 데이터로부터 추론될 수 있다. 투여량은 개체의 특정 상태에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 수단에 의해 상용 시험에서 결정될 수 있다.

면역학적 유효량의 면역원성 조성물은 적절한 용량 횟수로 대상체에게 투여되어 면역 반응을 도출한다. 투여량은 개체의 특정한 상태, 예컨대 연령 및 체중에 따라 달라질 수 있다. 이러한 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 수단에 의해 상용 시험에서 결정될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물이 투여된 환자는 에스. 아갈락티아에 보유 비율의 감소를 나타낸다. 면역원성 조성물의 투여 후 이러한 보유의 감소 또는 비-보유자로서 소비된 긴 시간은 의료 필요 관점에서 유의하다. 예를 들어, 보유자에서의 전체 에스. 아갈락티아에 보유의 감소는 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 투여 후에 평가될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물의 투여 1일 전에, 18-50세 성인의 군은 비강, 인후, 액와, 직장, 회음부 및 질 스왑 후에 배양하여 그의 보유 상태를 결정함으로써 보유에 대해 스크리닝될 수 있다. 다음으로, 군은 대조군을 제공받는 군과 함께, 본 발명의 면역원성 조성물이 투여될 수 있다. 비강, 인후, 액와, 직장, 회음부 및 질 스왑은 면역원성 조성물의 투여가 수행된 후 12주 기간에 걸쳐 매주 및 최대 6개월간 매월 수행되고 위약과 비교된다. 하나의 1차 종점은 면역화 후 3개월 간격으로 면역원성 조성물의 투여 후 환자에서의 보유 비율을 위약과 비교하는 것이다.

항체

"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 문맥에 의해 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 조작된 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화 및/또는 유도체화되어 이펙터 기능, 안정성 및 다른 생물학적 활성이 변경됨) 및 그의 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (상어 및 낙타류 항체 포함), 및 항체 부분, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체임) 및 본원에 기재된 바와 같은 항체 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 포괄하는 것으로 의도된다. 항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위-부류)의 항체를 포함하고, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5개의 주요 부류가 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이고, 이들 중 몇몇은 인간에서 추가로 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나뉘어질 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.

"항체 단편"은 단지 무손상 항체의 한 부분만을 포함하며, 여기서 부분은 바람직하게는 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 그 부분과 통상적으로 연관된 기능들 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 모두를 보유한다.

본원에 사용된 항체의 "기능적 활성" 또는 "기능적 항체"는, 최소한으로, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 추가의 기능은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 면역계의 추가의 성분을 포함할 수 있으며 이는 예컨대 옵소닌화, ADCC 또는 보체-매개 세포독성을 통한 병원체의 클리어런스 또는 사멸을 가져온다. 항원 결합 후에, 임의의 후속 항체 기능은 항체의 Fc 영역을 통해 매개될 수 있다. 항체 옵소닌식세포작용 검정 (OPA)은 이펙터 세포 (백혈구)에 의한 박테리아의 시험관내 Ig 보체-보조 사멸을 측정하기 위해 설계된, 따라서 생물학적 과정을 모방하는 시험관내 검정이다. 항체 결합은 또한 그것이 결합하는 항원의 생물학적 기능을 직접적으로 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, "기능적 항체"는 동물 효능 모델에서의 박테리아의 사멸 또는 항체가 박테리아를 사멸시킨다는 것을 입증하는 옵소닌식세포 사멸 검정에 의해 측정된 바와 같이 기능적인 항체를 지칭한다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리사카라이드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체를 지칭한다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 및 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며 이는 항체의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

특정한 폴리사카라이드 또는 특정한 폴리사카라이드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인" 항체는 임의의 다른 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 그 특정한 폴리사카라이드 또는 특정한 폴리사카라이드 상의 에피토프에 결합하는 것이다.

용어 "표지"가 본원에 사용되는 경우, 이는 "표지된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소적 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 1종 이상의 항원에 특이적으로 및 선택적으로 결합하는 항체 및 항체 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 본 발명의 면역원성 조성물의 대상체에게의 투여 시에 생성된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 1종 이상의 항원에 대해 지시된 정제되거나 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 동물 효능 모델에서 또는 옵소닌식세포 사멸 검정을 통해 박테리아를 사멸시킴으로써 측정된 바와 같이 기능적이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 대상체에게 수동 면역을 부여한다. 본 발명은 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용하여, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 본 발명의 항체 또는 항체 조성물을 생산하는 세포 또는 세포주 (예컨대 하이브리도마 세포 또는 항체의 재조합 생산을 위한 다른 조작된 세포주) 및 트랜스제닉 동물을 추가로 제공한다.

본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 생성하고, 상기 항체 또는 항체 조성물을 사용하여 대상체에게 수동 면역을 부여하는 것을 포함하는, 대상체에서 에스. 아갈락티아에와 연관된 스트렙토코쿠스 감염, 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한, 진단 방법, 예를 들어 본 발명의 면역원성 조성물의 1종 이상의 항원의 존재를 검출하거나 또는 그의 수준을 정량화하는데 유용할 수 있다.

반복 구조, 예컨대 본 발명의 폴리사카라이드에 대한 항체 반응은 일부 고유 특색을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 반복 단위의 규칙성은 매우 상이한 분자량의 항원 분자가 폴리사카라이드에 특이적인 항체에 결합할 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 둘째로, 더 큰 길이의 폴리사카라이드의 반복 구조는 T-세포 비의존성 항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, T-세포 헬퍼 에피토프를 갖는 단백질 담체에 접합된 폴리사카라이드를 사용하는 경우, T-세포 비의존성 및 T-세포 의존성 항체 반응 둘 다가 자극될 수 있다. 따라서, 면역 반응은 폴리사카라이드 크기의 적절한 선택 및 담체 단백질의 사용 여부에 의해 조절될 수 있다.

폴리클로날 항체

특정 실시양태에서, 항-폴리사카라이드 항체는 폴리클로날 항체이다. 본원에 정의된 바와 같이 폴리클로날 항체는, 혈청의 제제로부터 유래된 상이한 특이성을 갖고 상이한 B-세포 클론으로부터 기원하는 항체의 혼합물을 지칭한다. 폴리클로날 항체의 제제 및 특징화는 관련 기술분야에 공지되어 있다.

폴리클로날 항체는 본원에 기재된 면역원 또는 면역원성 조성물의 1회 이상의 주사, 및 원하는 경우에, 아주반트, 완충제 및/또는 희석제의 투여에 의해 대상체, 예를 들어 포유동물에서 생성된다. 다양한 동물 종은 특정 항혈청의 생산에 사용될 수 있다. 전형적으로 항-사카라이드 폴리클로날 항혈청의 생산에 사용되는 동물은 비인간 영장류, 염소, 양, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터 또는 기니 피그이다. 전형적으로, 아주반트의 존재 또는 부재 하에서의 면역원 또는 면역원성 조성물은 다중 주사에 의해 포유동물 내로 주사된다. 면역원성 물질은 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 본원에 기재된 폴리사카라이드-단백질 접합체, 또는 면역원의 더 큰 조립물을 포함할 수 있다. 전형적으로, 제1 면역화 후 처음 2-6주에, 혈액을 면역화된 동물로부터 수집하고, 응고되도록 하여 혈청을 수거한다. 혈청은 면역화된 동물로부터의 항-사카라이드 폴리클로날 항체를 함유하고, 종종 항혈청으로 지칭된다.

모노클로날 항체

항-사카라이드 모노클로날 항체는 공지된 하이브리도마 기술의 사용을 통해 제조될 수 있다. 전형적으로, 모노클로날 항체를 제조하는 것은 첫째로 적합한 표적 동물 숙주를 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 또는 본 발명의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 선택된 면역원으로 면역화시키는 것을 수반한다. 원하는 경우에, 아주반트, 완충제 및/또는 희석제가 포함될 수 있다. 면역화는 B 림프구가 폴리사카라이드 또는 그의 접합체에 특이적으로 결합하는 항체를 생산 또는 발현하도록 도출하기에 충분한 방식으로 수행된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화된다.

림프구는 이어서 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 림프구의 공급원은 모노클로날 항체가 인간 또는 동물 기원의 것인지를 결정한다. 일반적으로, 인간 기원의 항체 및 세포가 요구되는 경우에 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되고, 비-인간 포유동물 공급원이 요구되는 경우에 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다.

불멸화 세포주는 전형적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 모 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유할 것이며 ("HAT 배지"), 상기 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.

불멸화 세포주는 실제 고려사항, 예컨대 기원 종, 융합 및 성장 특징에 대해 선택된다. 예를 들어, 적합한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지지하고, 배지, 예컨대 HAT 배지에 감수성이 있는 것들이다. 불멸화 세포주의 예는 뮤린 골수종 세포주를 포함한다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 기재되었다.

모노클로날 항체는 하이브리도마 세포에 의해 배양 배지 내로 분비된다. 배양 배지는 이어서 폴리사카라이드를 인식 및 결합하는 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 특정한 모노클로날 항체의 항-폴리사카라이드 결합 특이성은 관련 기술분야에 널리 공지된 수많은 절차 중 하나에 의해 결정된다. 예를 들어, 항체 결합 특이성은 면역침전, 방사선면역검정 (RIA), 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어)에 의해 결정될 수 있다. 모노클로날 항체에 의해 인식되는 정확한 에피토프는 에피토프 맵핑에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

원하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 한계 희석에 의해 서브클로닝되고, 표준 방법을 사용하여 배양된다. 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체내에서 성장된다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제된다.

대안적으로, 원하는 특이성을 갖고 원하는 기원 종으로부터의 항체는 파지 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 수득될 수 있다. 추가적으로, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용하기 위한 특히 적용가능한 방법 및 시약의 예는 관련 기술분야에서 발견될 수 있다.

항체의 용도

한 측면에서, 본 발명은 GBS 항체 및/또는 항체 단편을 생산하기 위한 본원에 기재된 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 본원에 기재된 폴리사카라이드-단백질 접합체 및/또는 그로부터 생성된 항체는 ELISA- 및 마이크로어레이-관련 기술을 포함한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 면역진단 기술에 사용될 수 있다. 추가로, 이들 시약은, 예를 들어 면역원성 폴리사카라이드 접합체에 대한 혈청 항체 수준을 포함한 항체 반응을 평가하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 검정 방법론은 표지, 예컨대 형광, 화학발광, 방사성, 효소적 표지 또는 염료 분자, 및/또는 생물학적 샘플 중 항원 또는 항체와 고체 지지체에 결합된 상응하는 항체 또는 항원 사이의 복합체의 직접 또는 간접 검출을 위한 2차 면역학적 시약의 사용을 수반할 수 있다.

생산된 항체 또는 항체 단편은 또한 수동 면역요법에서 또는 스트렙토코쿠스 감염에 대한 예방을 위해 유용할 수 있다.

폴리사카라이드를 생산하는 방법

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리사카라이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 방법은 GBS를 배양하고 박테리아에 의해 생산된 폴리사카라이드를 수집하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, GBS는 에스. 아갈락티아에를 포함한다. 박테리아는 에스. 아갈락티아에의 임의의 균주일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 에스. 아갈락티아에의 피막화된 균주이다. 본 발명에 사용하기 위한 에스. 아갈락티아에 균주는 090, A909 (ATCC 수탁 번호 BAA-1138), 515 (ATCC 수탁 번호 BAA-1177), B523, CJB524, MB 4052 (ATCC 수탁 번호 31574), H36B (ATCC 수탁 번호 12401), S40, S42, MB 4053 (ATCC 수탁 번호 31575), M709, 133, 7357, PFEGBST0267, MB 4055 (ATCC 수탁 번호 31576), 18RS21 (ATCC 수탁 번호 BAA-1175), S16, S20, V8 (ATCC 수탁 번호 12973), DK21, DK23, UAB, 5401, PFEGBST0708, MB 4082 (ATCC 수탁 번호 31577), M132, 110, M781 (ATCC 수탁 번호 BAA-22), D136C(3) (ATCC 수탁 번호 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; ATCC 수탁 번호 31475), M132, K79, COH1 (ATCC 수탁 번호 BAA-1176), PFEGBST0563, 3139 (ATCC 수탁 번호 49446), CZ-NI-016, PFEGBST0961, 1169-NT1, CJB111 (ATCC 수탁 번호 BAA-23), CJB112, 2603 V/R (ATCC 수탁 번호 BAA-611), NCTC 10/81, CJ11, PFEGBST0837, 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214, CZ-PW-119, 7271, CZ-PW-045, JM9130013, JM9130672, IT-NI-016, IT-PW-62, 및 IT-PW-64를 포함한다.

본원에 기재된 폴리사카라이드는 적절한 배지 중에서 GBS를 배양함으로써 생산될 수 있다. 적절한 배지는 콜럼비아 브로쓰를 포함할 수 있다. 배지는 덱스트로스, 헤민 및/또는 글루코스를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배지는 콜럼비아 브로쓰 및 덱스트로스를 포함한다. 에스. 아갈락티아에가 콜럼비아 브로쓰 및 덱스트로스를 사용하여 배양되는 경우에, 바람직하게는 배양을 위한 온도는 20 내지 40℃, 바람직하게는 37℃이다. 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 호기성 조건 하에 배양된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 12 내지 60시간 동안 배양된다.

폴리사카라이드는 표적 물질을 배양물로부터 수집하기 위한 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대, 예를 들어 가열, 효소 처리, 원심분리, 침전, 활성탄으로의 처리 및/또는 여과를 사용함으로써 수득된 배양물로부터 수집될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 및 2008/0102498; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/118752 참조). 한 실시양태에서, 박테리아 및 폴리사카라이드를 함유하는 배양물은 원심분리되고 효소, 예컨대, 예를 들어 리소자임, RNase, DNase, 프로나제, 뮤타놀리신, 및 그의 조합으로 처리된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 적절한 유기 용매는 수득된 상청액에 첨가되어 단백질을 침전시키고, 침전물은 원심분리에 의해 제거된다. 이어서 폴리사카라이드는 적절한 유기 용매를 상청액에 추가로 첨가함으로써 침전될 수 있고, 폴리사카라이드는 원심분리에 의해 수집될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 폴리사카라이드는 박테리아가 제거된 상청액에 에탄올을 약 25 부피%의 최종 농도로 첨가하고, 단백질을 함유하는 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 그에 에탄올을 약 75 부피%의 최종 농도로 추가로 첨가하고, 이어서 침전물을 원심분리에 의해 수집함으로써 수득될 수 있다. 생성된 침전물은 질소로 건조될 수 있다. 생성된 침전물은 트리스 및 0.05% Na 아지드 중에서 재현탁될 수 있다.

본 발명의 추가 측면은, 유기 시약, 예컨대 유도체화된 히드록실 아민 화합물을, N- 및 O-아세틸 기는 보존하면서 대체로 무손상인 고분자량 CP의 단리를 위해 사용하는 신규 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 용해시키지 않기 때문에, 원심분리에 의해 단리된 CP는 세포내 성분으로 최소한으로 오염되고 더 높은 전체 수율에 이를 수 있다. 더욱이, 이들 시약은 B군 항원 불순물을 그의 다중 포스포디에스테르 연결로 인해 매우 작은 단편으로 절단하며 이는 투석여과에 의해 용이하게 제거될 수 있다.

한 실시양태에서, CP는 히드록실 아민을 피막 폴리사카라이드 생산 박테리아를 포함하는 세포 페이스트와 반응시킴으로써 단리된다. 특정한 실시양태에서, 방법은 원심분리하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 여과하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드 생산 박테리아는 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스타필로코쿠스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 티피, 헤모필루스 인플루엔자에, 클레브시엘라 뉴모니아에, 엔테로코쿠스 파에시움, 및 엔테로코쿠스 파에칼리스로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 한 측면에서, 히드록실 아민은 실시예 2의 표 2에 열거된 것들일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 히드록실 아민은 디벤질 히드록실아민; 디에틸 히드록실아민; 히드록실아민; 에틸렌디아민; 트리에틸렌테트라민; 1,1,4,7,10,10 헥사메틸 트리에틸렌 테트라민; 및 2,6,10 트리메틸 2,6,10 트리아자운데칸으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 한 측면에서, 히드록실 아민의 농도는 약 5 mM 내지 약 200 mM, 예컨대 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 75 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 25 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 10 mM 내지 약 200 mM, 예컨대 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 25 mM 내지 약 200 mM, 약 25 mM 내지 약 150 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 50 mM 내지 약 100 mM, 및 약 50 mM 내지 약 75 mM이다.

또 다른 측면에서, 반응의 pH는 약 5.5 내지 약 9.5, 예컨대 약 5.5 내지 약 9.0, 약 5.5 내지 약 8.5, 약 5.5 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 9.5, 약 6.0 내지 약 9.0, 약 6.0 내지 약 8.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 6.5 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 7.0 내지 약 9.0, 7.0 내지 약 8.5, 및 약 7.0 내지 약 8.0으로 유지된다.

본 발명의 추가 측면에서, 반응은 약 20℃ 내지 약 85℃, 예컨대 약 20℃ 내지 약 80℃, 약 20℃ 내지 약 75℃, 약 20℃ 내지 약 70℃, 약 20℃ 내지 약 65℃, 약 20℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 55℃, 약 20℃ 내지 약 50℃, 약 25℃ 내지 약 85℃, 약 25℃ 내지 약 80℃, 약 25℃ 내지 약 75℃, 약 25℃ 내지 약 70℃, 약 25℃ 내지 약 65℃, 약 25℃ 내지 약 60℃, 약 25℃ 내지 약 55℃, 약 25℃ 내지 약 50℃, 약 30℃ 내지 약 85℃, 약 30℃ 내지 약 80℃, 약 30℃ 내지 약 75℃, 약 30℃ 내지 약 70℃, 약 30℃ 내지 약 65℃, 약 30℃ 내지 약 60℃, 약 30℃ 내지 약 55℃, 약 30℃ 내지 약 50℃, 약 35℃ 내지 약 85℃, 약 35℃ 내지 약 80℃, 약 35℃ 내지 약 75℃, 약 35℃ 내지 약 70℃, 약 35℃ 내지 약 65℃, 약 35℃ 내지 약 60℃, 약 35℃ 내지 약 55℃, 약 40℃ 내지 약 85℃, 약 40℃ 내지 약 80℃, 약 40℃ 내지 약 75℃, 약 40℃ 내지 약 70℃, 약 40℃ 내지 약 65℃, 약 40℃ 내지 약 60℃, 약 45℃ 내지 약 85℃, 약 45℃ 내지 약 80℃, 약 45℃ 내지 약 75℃, 약 45℃ 내지 약 70℃, 약 45℃ 내지 약 65℃, 약 50℃ 내지 약 85℃, 약 50℃ 내지 약 80℃, 약 50℃ 내지 약 75℃, 약 50℃ 내지 약 70℃, 약 55℃ 내지 약 85℃, 약 55℃ 내지 약 80℃, 약 55℃ 내지 약 75℃, 약 60℃ 내지 약 85℃, 및 약 65℃ 내지 약 85℃의 온도에서 일어난다.

또 다른 측면에서, 반응 시간은 약 10시간 내지 약 90시간, 예컨대 약 10시간 내지 약 85시간, 약 10시간 내지 약 80시간, 약 10시간 내지 약 75시간, 약 10시간 내지 약 70시간, 약 10시간 내지 약 60시간, 약 10시간 내지 약 50시간, 약 10시간 내지 약 40시간, 약 10시간 내지 약 30시간, 약 10시간 내지 약 25시간, 약 10시간 내지 약 20시간, 약 10시간 내지 약 15시간, 약 15시간 내지 약 90시간, 약 15시간 내지 약 85시간, 약 15시간 내지 약 80시간, 약 15시간 내지 약 75시간, 약 15시간 내지 약 70시간, 약 15시간 내지 약 60시간, 약 15시간 내지 약 50시간, 약 15시간 내지 약 40시간, 약 15시간 내지 약 30시간, 15시간 내지 약 20시간, 예컨대 약 20시간 내지 약 90시간, 약 20시간 내지 약 85시간, 약 20시간 내지 약 80시간, 약 20시간 내지 약 75시간, 약 20시간 내지 약 70시간, 약 20시간 내지 약 60시간, 약 20시간 내지 약 50시간, 약 20시간 내지 약 40시간, 약 20시간 내지 약 30시간, 및 약 20시간 내지 약 25시간이다.

대안적으로, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 화학적으로 합성된다. 폴리사카라이드는 통상적인 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서 폴리사카라이드는 폴리사카라이드를 생산하기 위한 생합성 경로를 클로닝 및 발현시킨 후 대용 숙주에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 변형되어 본원에 기재된 폴리사카라이드와 구조적 유사성을 갖는 폴리사카라이드를 생산할 수 있으며, 여기서 숙주 세포에서 생산된 폴리사카라이드의 반복 단위는 본원에 기재된 폴리사카라이드의 반복 단위와 부분적으로 동일하다. 폴리사카라이드는, 예를 들어 폴리사카라이드의 반복 단위가 누락 분지를 갖는 경우, 본원에 기재된 폴리사카라이드와 구조적으로 유사하나, 이는 본원에 기재된 폴리사카라이드의 반복 단위와 비교하여 크기에 있어서 불균질하고/거나 분지화 배열에 있어서 불균질하다. 바람직하게는, 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 일부 실시양태를 입증한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이고, 본 발명의 조건 및 범주에 대해 전적으로 제한적인 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 전형적인 반응 조건 (예를 들어, 온도, 반응 시간 등)이 제공된 경우, 일반적으로 덜 편리하기는 하지만, 특정 범위 초과 및 미만 둘 다의 조건이 또한 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 지칭된 모든 부 및 퍼센트는 중량을 기준으로 하고 모든 온도는 섭씨 온도로 표현된다.

추가로, 달리 상세하게 기재된 경우를 제외하고는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 상용되는 표준 기술을 사용하여 하기 실시예를 수행하였다. 상기 언급된 바와 같이, 하기 실시예는 예시적 목적을 위해 제시되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 탈-O-아세틸화된 폴리사카라이드를 사용하는 폴리사카라이드-단백질 접합체의 제조

각각의 혈청형에 대한 에스. 아갈락티아에 균주를 규정된 배지에서 pH-제어하에 침지된 배지 중에서 발효시켰다. 사용한 절차 및 배지는 실험을 통해 최적화하였으며, 이는 문헌 [von Hunolstein, C. et al., Appl. Micro. Biotech. 38(4):458-462 (1993)]에 이전에 기재된 기본 기술의 확장이었다. 피막 폴리사카라이드를 세포로부터 NaOH 처리에 의해 분리하였다. 정화 후에, 일련의 UF/DF, 침전, 및 탄소 여과 단계로 정제된 폴리사카라이드를 수득하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,652,480을 참조한다. 환원성 아미노화 화학을 사용하여 활성화된 폴리사카라이드를 CRM₁₉₇에 접합시켰다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,360,897을 참조한다.

실시예 2. O-아세틸화된 폴리사카라이드의 단리

발효 브로쓰 (1.2L)의 열 사멸 및 원심분리 후에 수득된 GBS 피막 폴리사카라이드 (CP) 혈청형 Ia로부터의 세포 페이스트를 175 mL의 25 mM 인산칼륨 완충제 (25 mM, pH 6.9) 중에서 재현탁시켰다. 현탁액을 수성 히드록실 아민 O-술폰산 용액과 10 mM의 최종 농도로 혼합하였다. 현탁액의 pH는 약 5.8로 결정되었다. 현탁액을 55℃에서 72시간 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 약 10,000 rpm에서 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 조 절단된 CP를 함유하는 상청액을 분자량 및 수율에 대해 분석하였다. 나머지 부분을 주사용수 (WFI)를 사용하여 30 kDa MWCO 막을 사용하는 투석여과에 의해 정제에 적용하였다. 정제된 폴리사카라이드를 분자량에 대해 다중각도 광 산란 검출기와 조합된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-MALS)에 의해 분석하였다 (표 1).

표 1. 투석여과에 의한 GBS 혈청형 Ia의 정제

여러 히드록실 아민, 질소- 및 산소-치환된 화합물 둘 다를 그의 활성에 대해 상기 기재된 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 수율을 조 상청액의 다중-각도 광 산란 검출기와 조합된 겔 투과 크로마토그래피 (GPC-MALS)에 의해 굴절률 (RI) 반응 및 0.135인 비 굴절률 증분 (dn/dc) 값의 제곱을 사용하여 계산하였다. 수율은 히드록실 아민의 유형 및 조건, 예컨대 농도, 온도 및 반응 시간의 최적화에 좌우되었다 (표 2 참조). 일반적으로, 증가된 히드록실 아민 농도, 더 높은 온도 및 더 긴 반응 시간은 더 높은 수율에 이르게 하였다.

표 2. 다양한 히드록실 아민의 스크리닝 및 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형 Ia의 조건의 최적화

치환 및 비치환된 히드록실 아민은 GBS 피막 폴리사카라이드를 세포벽으로부터 방출시키는데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 N- 및 O- 아세틸 기가 보존된 고분자량 CP의 단리를 유발한다. 스크리닝된 여러 화합물 중, 디벤질 히드록실 아민이 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. 데이터는 표 3에 제시된다 ([디벤질 히드록실아민] - 50 mM ; ph - 7-8; 온도 - 50℃; 시간 - 24시간).

표 3. 디벤질 히드록실아민을 사용한 GBS CP 방출 데이터

NA - 혈청형 Ia는 O-아세틸화되지 않음

디벤질 히드록실 아민은 물 중에서 불량한 용해도를 갖기 때문에, 자유롭게 수용성이고 디벤질 히드록실아민과 유사하거나 또는 그보다 더 높은 활성을 갖는 히드록실 아민의 대안적 유도체가 바람직하다. 몇몇 화합물을 스크리닝한 후에, 디에틸 히드록실 아민이 우수한 대안인 것으로 밝혀졌다. 데이터는 표 4에 제시된다 ([디에틸 히드록실아민] - 100 mM; pH - 7-8; 온도 - 60℃; 시간 - 19시간).

표 4. 디에틸 히드록실아민을 사용한 GBS CP 방출 데이터

히드록실 아민 (NH₂-OH)은 또한 세포벽으로부터의 CP 절단에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 데이터는 표 5에 제시된다 ([히드록실아민] - 100 mM; pH - 7-7.5; 온도 - 65℃; 시간 - 17시간). 혈청형 III에 대해, 수율은 17시간 후에 54%였으나; 수율은 3.5일 후에 최대 70%로 증가하였다.

표 5. 히드록실아민을 사용한 GBS CP 방출 데이터

세포로부터의 GBS 피막 폴리사카라이드의 방출에 대한 올리고아민의 스크리닝

히드록실 아민 및 그의 치환된 화합물은 GBS 세포벽으로부터의 피막 폴리사카라이드의 절단에 대해 매우 효율적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이들은 혈청형 II 및 V에 대해 덜 효율적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 올리고아민을 이들이 다중 아민 관능기로 인해 더 활성일 수 있다는 믿음으로 인해 시험하였다.

에틸렌 디아민은 피막 폴리사카라이드를 모든 혈청형으로부터 방출시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 데이터는 표 6에 제시된다 ([에틸렌디아민] - 50 또는 100 mM; pH 8.0 ; 16시간; 80℃; 25 mM EDTA).

표 6: 에틸렌디아민을 사용한 GBS CP 방출 데이터

다른 대표적인 올리고아민을 혈청형 Ia 및 V 세포 페이스트를 사용하여 그의 활성에 대해 시험하였지만, 이는 또한 혈청형 V에 대해 덜 효율적인 것으로 밝혀졌다. 데이터는 표 7 ([트리에틸렌테트라민] - 100 mM; pH - 8.9; 온도 - 60℃; 시간 - 15시간), 8 ([1,1,4,7,10,10 헥사메틸 트리에틸렌 테트라민] - 10 mM; pH - 6.3; 온도 - 60℃; 시간 - 20시간), 및 9 ([2,6,10 트리메틸 2,6,10 트리아자운데칸] - 10 mM; pH - 7-8; 온도 - 60℃; 시간 - 19시간)에 제시된다.

표 7. 트리에틸렌테트라민을 사용한 GBS CP 방출 데이터

nd - 결정되지 않음

표 8. 1,1,4,7,10,10 헥사메틸 트리에틸렌 테트라민을 사용한 GBS CP 방출 데이터

nd - 결정되지 않음

표 9. 2,6,10 트리메틸 2,6,10 트리아자운데칸을 사용한 GBS CP 방출 데이터

nd - 결정되지 않음

실시예 3. 환원성 아미노화에 의한 GBS 피막 폴리사카라이드의 접합

폴리사카라이드의 활성화

폴리사카라이드 산화를 100 mM 인산칼륨 완충제 (pH 6.0 ± 0.5) 중에서 계산된 양의 500 mM 인산칼륨 완충제 (pH 6.0) 및 주사용수 (WFI)를 순차적으로 첨가함으로써 수행하여 2.0 g/L의 최종 폴리사카라이드 농도를 제공하였다. 필요한 경우에, 반응 pH를 대략 pH 6.0으로 조정하였다. pH 조정 후, 반응 온도를 23℃로 조정하였다. 산화를 대략 0.25 몰 당량의 소듐 퍼아이오데이트의 첨가에 의해 개시하였다. 산화 반응을 대략 5 ± 3℃에서 16시간 동안 수행하였다.

활성화된 폴리사카라이드의 농축 및 투석여과를 5K MWCO 한외여과 카세트를 사용하여 수행하였다. 투석여과를 20배 투석여과부피의 WFI에 대해 수행하였다. 정제된 활성화된 폴리사카라이드를 이어서 5 ± 3℃에서 저장하였다. 정제된 활성화된 사카라이드를, 특히, (i) 비색 검정에 의한 사카라이드 농도; (ii) 비색 검정에 의한 알데히드 농도; (iii) 산화도; 및 (iv) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특징화하였다.

활성화된 폴리사카라이드의 산화도 (DO = 당 반복 단위의 몰 / 알데히드의 몰)를 하기와 같이 결정하였다:

당 반복 단위의 몰을 다양한 비색 방법에 의해, 예를 들어 안트론 방법을 사용함으로써 결정하였다. 안트론 방법에 의해, 먼저 폴리사카라이드를 황산 및 열의 작용에 의해 모노사카라이드로 분해한다. 안트론 시약은 헥소스와 반응하여 황록색 복합체를 형성하고 그의 흡광도를 625nm에서 분광광도계로 판독한다. 검정의 범위 내에서, 흡광도는 존재하는 헥소스의 양에 정비례한다.

알데히드의 몰을 또한 동시에, MBTH 비색 방법을 사용하여 결정한다. MBTH 검정은 알데히드 기 (제공된 샘플로부터의 것)를 3-메틸-2-벤조티아졸론 히드라존 (MBTH 검정 시약)과 반응시키는 것에 의한 아진 화합물의 형성을 수반한다. 과량의 3-메틸-2-벤조티아졸론 히드라존은 산화되어 반응성 양이온을 형성한다. 반응성 양이온 및 아진은 반응하여 청색 발색단을 형성한다. 형성된 발색단을 이어서 650 nm에서 분광기로 판독한다.

활성화된 폴리사카라이드와 수크로스 부형제와의 배합, 및 동결건조

활성화된 폴리사카라이드를 활성화된 폴리사카라이드 그램당 수크로스 25 그램의 비로 수크로스와 배합하였다. 배합된 혼합물의 병을 이어서 동결건조시켰다. 동결건조 후, 동결건조된 활성화된 폴리사카라이드를 함유하는 병을 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 계산된 양의 CRM₁₉₇ 단백질을 개별적으로 쉘-냉동하고 동결건조시켰다. 동결건조된 CRM₁₉₇을 -20 ± 5℃에서 저장하였다.

동결건조된 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 재구성

동결건조된 활성화된 폴리사카라이드를 무수 디메틸 술폭시드 (DMSO)에서 재구성하였다. 폴리사카라이드의 완전 용해 시에, 재구성을 위해 동등량의 무수 DMSO를 동결건조된 CRM₁₉₇에 첨가하였다.

접합 및 캡핑

재구성된 활성화된 폴리사카라이드를 재구성된 CRM₁₉₇과 반응 용기 내에서 합한 후, 철저하게 혼합하여 투명한 용액을 수득한 후에 소듐 시아노보로히드라이드로 접합을 개시하였다. 반응 용액 중 최종 폴리사카라이드 농도는 대략 1 g/L였다. 1.0 - 1.5 MEq의 소듐 시아노보로히드라이드를 반응 혼합물에 첨가하고 23 ± 2℃에서 20-48시간 동안 인큐베이션함으로써 접합을 개시하였다. 2 MEq의 소듐 보로히드라이드 (NaBH₄)를 첨가하여 미반응 알데히드를 캡핑함으로써 접합 반응을 종결하였다. 이 캡핑 반응을 23 ± 2℃에서 3 ± 1시간 동안 계속하였다.

접합체의 정제

접합체 용액을 100-300K MWCO 막을 사용하는 접선 흐름 여과에 의한 정제를 위한 준비로 냉각된 5 mM 숙시네이트-0.9% 염수 (pH 6.0)를 사용하여 1:10 희석하였다.

희석된 접합체 용액을 5 μm 필터에 통과시키고, 매질로 5 mM 숙시네이트 / 0.9% 염수 (pH 6.0)를 사용하여 투석여과를 수행하였다. 투석여과가 완료된 후, 접합체 보유물을 0.22μm 필터에 이동시켰다. 접합체를 5 mM 숙시네이트 / 0.9% 염수 (pH 6)를 사용하여 대략 0.5 mg/mL의 표적 사카라이드 농도로 추가로 희석하였다. 대안적으로, 접합체를 100-300K MWCO 막을 사용하는 접선 흐름 여과에 의해 20 mM 히스티딘-0.9% 염수 (pH 6.5)를 사용하여 정제하였다. 최종 0.22μm 여과 단계를 완료하여 면역원성 접합체를 수득하였다.

실시예 4: 다양한 접합 조건의 GBS 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V 접합체를, 시약에 대한 용매 (수성 매질 대 DMSO)를 포함한 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 (PO/RAC) 조건을 의도적으로 달리하고, 초기 폴리사카라이드 중 시알산의 수준, 및 산화도/사카라이드 에피토프 변형을 달리함으로써 생성하였다. 일반적으로, 용매로서 DMSO를 사용하여 생산된 접합체는 수성 매질을 사용하여 생산된 접합체보다 더 낮은 수준의 미반응 (유리) 폴리사카라이드, 더 높은 접합체 분자량, 및 더 높은 사카라이드/단백질 비를 갖는 것으로 밝혀졌다.

더 낮은 수준의 미반응 (유리) 폴리사카라이드를 갖는 접합체를 생산하는 접합 과정이 유리하고 바람직하다. 높은 수준의 미반응 (유리) 폴리사카라이드는 폴리사카라이드-단백질 접합체에 의해 생성된 T-세포 의존성 반응을 희석하고 그로 인해 접합체에 의해 생성된 면역원성 반응을 낮추는 잠재력을 갖는 과도한 T-세포 비의존성 면역 반응을 유발할 수 있다는 것이 널리 공지되어 있다.

선택된 GBS 폴리사카라이드를 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 화학적으로 탈시알릴화하여 (문헌 [Chaffin, D.O, et al., J Bacteriol 187(13):4615-4626 (2005)] 참조) 면역원성에 대한 % 탈시알릴화의 영향을 결정하기 위한 접합체 변이체를 생성하였다. 약 40% 초과의 탈시알릴화 (즉, 약 60% 미만의 시알산 수준)는 면역원성에 부정적인 영향을 미쳤다.

대부분의 경우에 유사하게, 약 5 미만의 산화도, 또는 약 20% 초과의 사카라이드 에피토프 변형은 면역원성에 부정적인 영향을 미쳤다. 산화가 피막 폴리사카라이드 상의 시알산을 통해 발생하기 때문에, 결과는 약 20% 초과의 사카라이드 에피토프 변형이 시알산 함량을 감소시키고 이는 감소된 면역원성을 유발한다는 것을 나타내는 것으로 보인다.

반대로, 다양한 사카라이드/단백질 비 또는 폴리사카라이드 분자량을 갖는 접합체는 마우스에서 면역원성 반응을 생성하였으며, 이는 이들 속성과 관련하여 비교적 넒은 범위의 수용 기준을 나타내었다.

추가의 접합체 변이체를 또한 대안적 화학 경로를 사용하여 생성하였다. 하나의 대안적 화학은 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시키고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행함으로써 접합체를 생성하는 것을 포함하였다. 또 다른 대안적 화학에서, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, 접합체를 (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO [(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실] 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학 (TEMPO/RAC)을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. 이들 대안적 화학에 의해 생성된 모든 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 PO/RAC 이외의 대안적 화학 경로의 적합성을 나타낸다. 그러나, 일부 접합 화학은 일부 혈청형에서 다른 것들 보다 더 우수하게 수행되었다.

OPA는 문헌 [Nanra, J.S., et al., Hum. Vaccin. Immunother., 9(3):480-487 (2013)]에 따라, B군 스트렙토코쿠스 분리주를 스타필로코쿠스 아우레우스 분리주로 대체하고 예비옵소닌화 단계를 생략하여 수행하였다. 투여 3 후 (PD3) OPA 역가를 각각의 접합체의 각각의 용량 중 1 mcg/ml로 면역화된 10-20마리 마우스의 군으로부터의 기하평균으로서 제공한다.

GBS 혈청형 Ia 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체

PO/RAC를 사용하여 생성된 접합체 및 16-17의 DO (대략 6% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드는 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 1 및 3). 그러나, 5.4의 DO (대략 19% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하는 것은 면역원성에 부정적인 영향을 미쳤다 (접합체 2). 유사하게, 50%의 시알산 수준은 면역원성 반응을 거의 생성하지 않았다 (접합체 4). 결과는 표 10에 제시된다.

표 10. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건의 GBS 혈청형 Ia-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

추가의 접합체 변이체를 대안적 접합 화학 및 접합체 분자 속성을 사용하여 생성하였다 (결과는 표 11에 제시됨). 접합체 5를 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시킴으로써 생성하고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행하였다. 접합체 6을, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. 접합체 7을 PO/RAC에 의해 및 접합 파라미터를 의도적으로 달리하여 높은 사카라이드/단백질 비 (SPR)를 갖는 접합체를 생산함으로써 생성하였다. 접합체 8을 PO/RAC에 의해 낮은 MW (40 kDa)를 갖는 폴리사카라이드를 사용하여 생성하였다. 모든 이들 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 이외의 대안적 접합 화학, 뿐만 아니라 대안적 접합체 속성, 예컨대 초기 폴리사카라이드의 SPR 및 낮은 MW의 적합성을 나타낸다.

표 11. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건 및 대안적 화학 옵션의 GBS 혈청형 Ia-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

GBS 혈청형 Ib 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체

PO/RAC 및 15.8의 DO (대략 6% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하여 DMSO 중에서 생성된 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 9 및 11). DMSO 중에서 PO/RAC에 의해 생성된 접합체는 모든 다른 접합체 분자 속성이 유사한 경우에 수성 매질 중에서 PO/RAC에 의해 생성된 접합체보다 약간 더 면역원성이었다 (각각 접합체 9 및 11). 그러나, 4.7의 DO (대략 21% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하는 것은 면역원성에 부정적인 영향을 미쳤다 (접합체 10). PO/RAC 및 95% 탈시알릴화된 (5% 시알산 수준) 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체에서, 면역원성은, 매우 적은 반응자와 함께, 거의 완전히 제거되었다 (접합체 12). 결과는 표 12에 제시된다.

표 12. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건의 GBS 혈청형 Ib-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

추가의 접합체 변이체를 대안적 접합 화학 및 접합체 분자 속성을 사용하여 생성하였다 (결과는 표 13에 제시됨). 접합체 13을 PO/RAC에 의해 초기 폴리사카라이드 중 낮은 시알릴화 (65%)를 갖는 폴리사카라이드를 사용하여 생성하였다. 접합체 14를 PO/RAC에 의해 및 접합 파라미터를 의도적으로 달리하여 높은 사카라이드/단백질 비 (SPR)를 갖는 접합체를 생산함으로써 생성하였다. 접합체 15를 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시킴으로써 생성하고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행하였다. 접합체 16을, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. 모든 이들 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 이외의 대안적 접합 화학, 뿐만 아니라 대안적 접합체 속성, 예컨대 초기 폴리사카라이드의 SPR 및 낮은 MW의 적합성을 나타낸다.

표 13. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건 및 대안적 화학 옵션의 GBS 혈청형 Ib-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

GBS 혈청형 II 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체

PO/RAC 및 4-15의 DO (대략 7-23% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 17- 20). PO/RAC 및 74% 시알릴화 수준 (26% 탈시알릴화됨)을 갖는 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체가 또한 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 20). 결과는 표 14에 제시된다.

표 14. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건의 GBS 혈청형 II-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

추가의 접합체 변이체를 대안적 접합 화학 및 접합체 분자 속성을 사용하여 생성하였다 (결과는 표 15에 제시됨). 접합체 21 및 22를 PO/RAC에 의해 및 접합 파라미터를 의도적으로 달리하여 각각 낮은 및 높은 사카라이드/단백질 비 (SPR)를 갖는 접합체를 생산함으로써 생성하였다. 접합체 23을, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. 접합체 24를 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시킴으로써 생성하고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행하였다. 모든 이들 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 이외의 대안적 접합 화학, 뿐만 아니라 대안적 접합체 속성, 예컨대 SPR의 적합성을 나타낸다.

표 15. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건 및 대안적 화학 옵션의 GBS 혈청형 II-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

GBS 혈청형 III 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체

PO/RAC 및 10-17의 DO (대략 6-10% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하여 DMSO 중에서 생성된 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 25 및 30). 2.9의 DO (대략 34% 사카라이드 에피토프 변형) 또는 높은 사카라이드/단백질 비 (2.1)를 갖는 접합체 (각각 접합체 26 및 27)는 비교적 덜 면역원성인 것으로 입증되었다. PO/RAC 및 81% 시알릴화 수준 (19% 탈시알릴화됨)을 갖는 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체는 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 30). 그러나, 58% 시알릴화 수준 (42% 탈시알릴화됨)을 갖는 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체는 불량하게 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 29). DMSO 중에서 PO/RAC에 의해 생성된 접합체는 모든 다른 접합체 분자 속성이 유사한 경우에 수성 매질 중에서 PO/RAC에 의해 생성된 접합체보다 약간 더 면역원성이었다 (각각 접합체 25 및 28). 결과는 표 16에 제시된다.

표 16. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건의 GBS 혈청형 III-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

추가의 접합체 변이체를 대안적 접합 화학 및 접합체 분자 속성을 사용하여 생성하였다 (결과는 표 17에 제시됨). 접합체 31 - 35를 PO/RAC에 의해 및 접합 파라미터를 의도적으로 달리하여 다양한 MW를 갖는 접합체를 생산함으로써 생성하였다. 접합체 36을 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시킴으로써 생성하고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행하였다. 접합체 37을, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. 모든 이들 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 이외의 대안적 접합 화학, 뿐만 아니라 대안적 접합체 속성, 예컨대 MW의 적합성을 나타낸다. 낮게는 5의 DO (대략 20% 사카라이드 에피토프 변형)로 생성된 접합체는 2.9의 DO (대략 34% 사카라이드 에피토프 변형)로 생성된 접합체 (상기 표 16에서의 접합체 26)와 비교하여 마우스에서 여전히 면역원성이었다 (표 17에서의 접합체 32).

표 17. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건 및 대안적 화학 옵션의 GBS 혈청형 III-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

GBS 혈청형 IV 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체

PO/RAC 및 6.9-14.2의 DO (대략 7-14% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 38-41). PO/RAC 및 60% 시알릴화 수준 (40% 탈시알릴화됨)을 갖는 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체가 또한 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 41). 결과는 표 18에 제시된다.

표 18. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건의 GBS 혈청형 IV-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

추가의 접합체 변이체를 대안적 접합 화학 및 접합체 분자 속성을 사용하여 생성하였다. 결과는 표 19에 제시된다. 접합체 42 및 45를 PO/RAC에 의해 및 접합 파라미터를 의도적으로 달리하여 각각 높은 DO (더 낮은 산화 수준) 및 높은 SPR을 갖는 접합체를 생산함으로써 생성하였다. 접합체 43을 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시킴으로써 생성하고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행하였다. 접합체 44를, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. 모든 혈청형 IV 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 이외의 대안적 접합 화학, 뿐만 아니라 접합체 속성, 예컨대 SPR의 적합성을 나타낸다. 최대 적어도 20의 DO (더 낮은 산화) (대략 5% 사카라이드 에피토프 변형)로 생성된 접합체는 마우스에서 여전히 면역원성이었다.

표 19. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건 및 대안적 화학 옵션의 GBS 혈청형 IV-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

GBS 혈청형 V 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체

PO/RAC 및 4.4-14.6의 DO (대략 7-23% 사카라이드 에피토프 변형)를 갖는 활성화된 폴리사카라이드를 사용하여 생성된 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었다 (접합체 46 및 47). 탈시알릴화된 (5% 시알릴화 수준) 접합체는 면역원성이 아니었고 (접합체 49), 수성 용매를 사용하는 PO/RAC 공정을 사용하여 생성된 접합체는 낮은 면역 반응을 생성하였다 (접합체 48). 결과는 표 20에 제시된다.

표 20. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건의 GBS 혈청형 V-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

추가의 접합체 변이체를 대안적 접합 화학 및 접합체 분자 속성을 사용하여 생성하였다. 결과는 표 21에 제시된다. 접합체 50 및 53을 PO/RAC에 의해 및 접합 파라미터를 의도적으로 달리하여 각각 더 낮은 시알릴화 수준 (81% 시알릴화) 및 낮은 MW를 갖는 접합체를 생산함으로써 생성하였다. 접합체 51을 폴리사카라이드를 카르보닐디트리아졸 (CDT)과 반응시킴으로써 생성하고, 접합 반응을 DMSO 중에서 수행하였다. 접합체 52를, 상기 실시예 3에 상술된 바와 같이, (소듐 퍼아이오데이트 대신) TEMPO 시약을 사용하는 폴리사카라이드의 산화에 이어 DMSO 중에서 환원성 아미노화 화학을 사용하는 접합에 의해 생성하였다. CDT 화학을 사용하여 생성된 접합체를 제외한, 모든 혈청형 V 접합체는 마우스에서 면역원성인 것으로 입증되었으며, 이는 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학 이외의 대안적 접합 화학, 뿐만 아니라 접합체 속성, 예컨대 MW의 적합성을 나타낸다. CDT 화학을 사용하여 생성된 접합체는 RAC에 의해 생성된 다른 접합체와 비교하여 유의하게 덜 면역원성인 것으로 나타났다. 81% 시알릴화를 갖는 접합체 (접합체 50)는 >95% 시알릴화를 갖는 접합체 (접합체 53)와 비교하여 더 낮지만, 5% 시알릴화를 갖는 접합체 (상기 표 20의 접합체 49)보다는 더 높은 면역 반응을 제공하였다.

표 21. 퍼아이오데이트 산화/환원성 아미노화 화학의 다양한 공정 조건 및 대안적 화학 옵션의 GBS 혈청형 V-CRM₁₉₇ 접합체에 대한 효과

실시예 5: GBS III-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇ 1가 접합체 백신이 마우스에서 OPA 반응을 생성함

암컷 CD-1 마우스를 1 mcg, 0.1 mcg 또는 0.01 mcg의 CRM₁₉₇에 접합된 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 III (GBS III-CRM₁₉₇) 또는 CRM₁₉₇에 접합된 GBS 혈청형 V (GBS V-CRM₁₉₇)로 3회 피하로 제0주, 제3주 및 제6주에 면역화시켰다. 투여 3 후 (PD3) 혈청을 옵소닌식세포 검정 (OPA)에 의해 평가하였다. OPA를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 접합체 둘 다는 마우스에서 OPA 반응을 유도하였다 (표 22). 검출가능한 OPA 반응이 없는 샘플은 50의 값을 배정하였다.

표 22: GBS III 및 GBS V 접합체는 마우스에서 OPA 반응을 유도함

실시예 6: GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇ 1가 접합체 백신이 마우스에서 OPA 반응을 생성함

6 세트의 암컷 CD-1 마우스를 1 mcg의 CRM₁₉₇에 접합된 개별 GBS 피막 폴리사카라이드 (CP)를 함유하는 백신으로 제0주, 제3주 및 제6주에 3회 피하로 면역화시켰다. 초기 연구는 마우스가 시험된 6종의 혈청형 중 어느 것에 대해서도 기존 OPA 역가를 갖지 않는다는 것을 보여주었다. PD3으로부터의 혈청을 백신에 함유된 동족 GBS 혈청형에 대한 OPA에 의해 분석하였다. OPA를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 하기 표 23 및 24에 제시된다.

표 23: 개별 GBS CP-CRM₁₉₇ 접합체로의 면역화 후 마우스의 기하평균 OPA 역가

표 24: 개별 GBS CP-CRM₁₉₇ 접합체로의 면역화 후 마우스의 배수 상승 OPA 역가

NB: 배수 상승은 마우스가 기존 역가를 갖지 않았다고 가정하여 계산함.

실시예 7: GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇ 1가 접합체 백신으로 면역화된 마우스로부터 단리된 IgG와 비교된 혈청의 옵소닌 활성

암컷 CD-1 또는 BALB/c 마우스를 1 mcg의 CRM₁₉₇에 접합된 개별 GBS CP로 3회 피하로 제0주, 제3주 및 제6주에 면역화시켰다. AlPO₄ 또는 QS-21을 아주반트로서 사용하였다. PD3 혈청을 혈청형-특이적 OPA에 의해 시험하고 이어서 이뮤노글로불린 G 분획을 단리하고 OPA 활성에 대해 시험하였다. 정제된 IgG OPA 활성을 5mg/ml (정상 마우스 혈청에서의 IgG의 양의 범위 내임)로 정규화하였다. 모든 6종의 GBS CP 접합체는 옵소닌 활성을 갖는 IgG 항체를 유도하였다 (도 1).

실시예 8: GBS Ia-TT, GBS Ib-TT, GBS II-TT, GBS III-TT, GBS IV-TT 및 GBS V-TT 1가 접합체 백신이 토끼에서 OPA 반응을 생성함

토끼를 50 mcg/ml의 파상풍 톡소이드에 접합된 GBS 혈청형 Ia 폴리사카라이드, 10 mcg/ml의 파상풍 톡소이드에 접합된 GBS 혈청형 Ib 폴리사카라이드, 50 mcg/ml의 파상풍 톡소이드에 접합된 GBS 혈청형 II 폴리사카라이드, 50 mcg/ml의 파상풍 톡소이드에 접합된 GBS 혈청형 III 폴리사카라이드, 50 mcg/ml의 파상풍 톡소이드에 접합된 GBS 혈청형 IV 폴리사카라이드, 또는 50 mcg/ml의 파상풍 톡소이드에 접합된 GBS 혈청형 V 폴리사카라이드로 3회 면역화시켰으며, 제1 투여에서는 완전 프로인트 아주반트로 및 제2 및 제3 투여에서는 불완전 프로인트 아주반트로 보조하였다. 접합체를 >95%의 시알산 수준을 갖는 폴리사카라이드 및 CDAP (1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트) 화학을 사용하여 생산하였다. PD3 면역 반응을 실시예 4에 기재된 바와 같이 OPA에 의해 측정하였다. 혈청 역가는 표 25에 제시된 한편 정제된 IgG 역가는 하기 표 26에 제시된다. TT에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V 폴리사카라이드는 토끼에서 고도로 면역원성이었다.

표 25: 개별 GBS CP-TT 접합체로의 면역화 후 토끼 혈청의 기하평균 OPA 역가

표 26: 개별 GBS CP-TT 접합체로의 면역화 후 정제된 토끼 IgG의 기하평균 OPA 역가

실시예 9: 6가 GBS 접합체 백신이 비인간 영장류에서 OPA 반응을 생성함

3개의 군의 레서스 마카크를 6가 B군 스트렙토코쿠스 (GBS6) 백신으로 3회 근육내로 제0주, 제4주 및 제8주에 면역화시켰다. GBS6 백신은 GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇을 포함하였다. 2개의 군은 인산알루미늄 (AlPO₄)을 아주반트로서 포함하고, 5 mcg의 각각의 접합체 또는 50 mcg의 각각의 접합체를 투여하였다. 제3 군은 5 mcg의 각각의 접합체를 투여하고, 어떠한 아주반트도 함유하지 않았다. 하기 표 27은 면역화 스케줄을 기재한다.

표 27: 레서스 마카크의 면역화 스케줄

면역전 혈청 및 PD3으로부터의 혈청을 백신에 함유된 모든 6종의 GBS 혈청형에 대해 OPA에 의해 분석하였다. OPA를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 하기 표 28 및 29에 제시된다. 모든 6종의 혈청형에 대해, AlPO₄ 보조 제제는 검출가능한 OPA 반응 (면역전으로부터 PD3까지의 역가의 상승, 또는 배수 상승 면역전/PD3 > 1)을 도출하였다. 비-보조 5 mcg/접합체 투여는 6종의 혈청형 중 5종에 대해 검출가능한 OPA 반응을 도출하였다.

표 28: GBS6으로의 면역화 전 및 후 레서스 마카크의 기하평균 OPA 역가

표 29: GBS6으로의 면역화 후 레서스 마카크의 OPA 역가 배수 상승

실시예 10: 6가 GBS 접합체 백신이 래트에서 OPA 반응을 생성함

암컷 스프라그-돌리 래트를 인산알루미늄 (AlPO₄)과 함께 또는 그 없이 제제화된 실시예 9에 기재된 바와 같은 GBS6 폴리사카라이드 접합체 백신 중 5 mcg/ml의 각각의 접합체로 2회 피하로 면역화시켰다. 면역전 (기준선) 및 투여 2 후 혈청을 모든 6종의 동족 GBS 혈청형에 대한 OPA 검정 역가에 대해 평가하였다. OPA 역가를 각각의 혈청형에 대해 GBS 384 웰 검정 포맷에서 측정하고 배수 상승을 계산하였다. GBS6 백신이 투여된 래트는 제2 투여 후에 각각의 혈청형에 대해 강건한 기능적 항체 반응을 가졌으며; AlPO₄의 부재 하에, 혈청형 중에서 7 내지 205-배 증가를 보인 반면에, 그의 존재 하에 이는 11 내지 294-배의 범위였다 (표 30).

표 30. 6가 GBS 접합체 백신으로 면역화된 래트에서의 옵소닌식세포 활성 (OPA) 검정 역가의 투여 2 후 (PD2) 배수 상승

실시예 11: 임신한 어미의 1가 또는 6가 GBS 당접합체 백신으로의 면역화가 출생 후 그의 자손에서 GBS III 또는 V 감염에 대한 보호 효과를 나타냄

암컷 CD-1 마우스를 5 mcg/ml의 각각의 접합체 및 100 mcg/ml AlPO₄를 함유하는 실시예 9에 기재된 바와 같은 GBS6 백신, GBS III 또는 V 1가 당접합체 백신 (각각 10 mcg/ml의 접합체 및 100mcg/ml AlPO₄ 함유), 또는 비히클 대조군 단독으로 3회 피하로 면역화시켰다. 마우스를 제3 면역화 전에 교배시켰다. 면역화된 마우스의 자손을 제공받은 백신에 따라 치사 용량의 GBS 혈청형 III 또는 GBS 혈청형 V 박테리아로 챌린지시키고, 생존을 90시간 동안 모니터링하였다. 어미의 GBS6 + AlPO₄ 또는 GBS III-CRM197 + AlPO₄로의 면역화는 그의 새끼에게 치사 GBS 혈청형 III 챌린지에 대해 유의한 보호 (p<0.0001)를 제공하였다. 마찬가지로, 어미의 GBS V-CRM197 + AlPO4로의 면역화는 그의 새끼에게 치사 GBS 혈청형 V 챌린지에 대해 유의한 보호 (p<0.0001)를 제공하였다. 결과는 표 31에 제시된다.

표 31: 1가 및 6가 GBS 백신으로의 면역화가 자손에서의 생존을 증가시킴

실시예 12: 새끼 래트에서의 GBS III 모노클로날 항체의 수동 면역화가 보호 효과를 나타냄

B군 스트렙토코쿠스 혈청형 III (GBS III) 모노클로날 항체 (mAb)를 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 V를 포함하는 5가 백신으로 마우스를 면역화시킴으로써 생성하였다. GBS III-특이적 mAb 클론을 선택하고, GBS III의 CP를 인식하는 mAb를 표준 절차를 사용하여 생성하였다. GBS 혈청형 III mAb를 임상 GBS III 분리주로의 챌린지 16시간 전에 새끼 래트 (군당 n=10; 2개의 독립적 실험이 제시됨)에게 수동적으로 투여하였다. 챌린지 4시간 후에 혈액을 수거하고 남아있는 CFU를 계수하였다. GBS III mAb로의 처리는 새끼 래트에서 회수된 CFU를 4 로그 또는 그 초과만큼 감소시켰다 (표 32).

표 32: GBS III mAb가 새끼 래트에서 회수된 CFU를 감소시킴

실시예 13: 임신한 마우스에서의 GBS Ib, III & V 모노클로날 항체의 수동 면역화가 출생 후 그의 자손에서 보호 효과를 나타냄

모노클로날 항체 (mAb)를 5가 백신 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇)으로 면역화된 마우스로부터 표준 절차를 사용하여 생성하였다. mAb는 이어서 각각의 5종의 혈청형의 피막 폴리사카라이드를 특이적으로 인식하는 것으로서 확인되었다. 500 mcg/ml 용량의 GBS 혈청형 Ib (GBS Ib) mAb, GBS 혈청형 III (GBS III) mAb, GBS 혈청형 V (GBS V) mAb, 또는 이소형-매칭된 대조군 mAb를 임신한 마우스에게 분만 대략 24 내지 48시간 전에 수동적으로 투여하였다. 출생 24 내지 48시간 후에, 면역화된 뮤린 어미의 자손을 치사 용량의 GBS Ib, GBS III 또는 GBS V 박테리아로 챌린지시켰다. 생존을 96시간 동안 모니터링하였다. GBS 챌린지 후 대조군 mAb와 비교하여 GBS Ib mAb, GBS III mAb 또는 GBS V mAb로 면역화된 어미에게 태어난 새끼에서 유의하게 더 높은 생존이 관찰되었다 (표 33).

표 33: GBS III & V mAb가 자손에서의 생존을 증가시킴

실시예 14: GBS 접합체의 안정성

GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇, 및 GBS V-CRM₁₉₇을 다양한 pH 수준에서의 10 mM 숙시네이트-포스페이트 및 155 mM NaCl 중에서 개별적으로 제제화하여 가속 저장 조건 하에서의 접합체의 안정성을 시험하였다. SEC MALLS에 의해 결정된 바와 같이, 분자량에서의 퍼센트 변화를 50℃에서의 저장 4주 후에 측정하였다. 결과는 도 2-7에 제시된다.

GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇ 및 GBS IV-CRM₁₉₇ 접합체를 시알릴화의 안정성에 대해 표 34에 제시된 다양한 완충제 조건 하에서 시험하였다. 유리 시알산 (N 아세틸 뉴라민산; NANA)을 HPLC를 사용하여 37℃에서의 저장 1개월 후에 측정하였다. 결과는 도 8에 제시된다.

연구 둘 다는 접합체가 pH 6.0 초과에서, 및 최적으로는 약 pH 6.5에서 더 우수하게 거동하였다는 것을 시사하였다.

표 34. 시알릴화 안정성 시험을 위한 완충제 조건

실시예 15: GBS6 제제

완충제의 선택을 결정하기 위해, GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇ (GBS6)을 상기 표 33에 나타낸 바와 같이 동일한 완충제 조건을 사용하여 함께 제제화하였다. 제제의 실제 pH를 하기 시점에서 시험하였다: 0 (제제가 제조된 시점), 5℃에서의 1개월 후, 25℃에서의 1개월 후, 및 37℃에서의 1개월 후. 숙시네이트를 완충제로서 사용한 제제에서는 pH에서의 이동이 관찰된 반면, 히스티딘을 완충제로서 사용한 제제에서는 어떠한 이동도 관찰되지 않았다. 결과는 도 9-10에 제시된다.

GBS 접합체의 알루미늄에 대한 결합에서의 히스티딘 완충제 농도의 효과를 또한 시험하였다. 150 mM NaCl, 0.01% 폴리소르베이트-80 (pH 6.5), 및 0.5 mg/ml의 AlPO₄로서의 알루미늄을 포함하는 제제를 2개의 상이한 농도의 접합체 (10 mcg/ml 및 40 mg/ml의 각각의 혈청형) 및 여러 상이한 농도의 히스티딘으로 시험하였다. 알루미늄에 결합된 접합체의 퍼센트를 백신 중 각각의 접합체의 총량 및 알루미늄에 결합된 각각의 접합체의 양을 측정함으로써 결정하였다. 결합된 접합체는, 백신 제제를 원심분리하고, 알루미늄 펠릿을 재현탁시키고, 알루미늄을 가용화시키고, 결합된 접합체를 각각의 혈청형에 대한 혈청헝-특이적 폴리클로날 항체를 사용한 비탁측정법을 사용하여 측정함으로써 측정하였다. 결과는 도 11-12에 제시된다. 히스티딘 완충제의 농도가 알루미늄에 결합된 각각의 혈청형의 퍼센트에 영향을 미치고, 영향은 더 높은 용량보다 더 낮은 용량에서 더 현저한 것으로 밝혀졌다.

교반 연구를 수행하여 바람직할 폴리소르베이트-80 (PS80)의 양을 결정하였다. 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.5 mg/ml AlPO₄ (존재하는 경우), 및 PS80 부재, 0.01% PS80, 0.02% PS80, 또는 0.03% PS80 (pH 6.5)을 포함하는 GBS6 제제를 교반 응력 시에 손실된 총 항원성의 백분율에 대해 시험하였다. 제제로 사전충전된 시린지를 500 RPM에서 72시간 동안 실온에서 교반하였다. 대조군 샘플 (교반되지 않음)을 실온에서 72시간 동안 저장하였다. 결과는 도 13에 제시된다.

GBS6 제제에서의 알루미늄의 농도를 또한 연구하여 알루미늄에 대한 GBS 접합체 결합에 대한 효과를 결정하였다. 10 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.02% PS80, 및 0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.75 mg/ml, 또는 1.0 mg/ml의 인산알루미늄 (AlPO₄)으로서의 알루미늄 (pH 6.5)을 포함하는 GBS6 제제를 알루미늄에 결합된 접합체의 퍼센트에 대해 시험하였다. AlPO₄에 대한 결합의 백분율은 AlPO₄ 농도 증가에 따라 증가한다. 결과는 도 14에 제시된다.

실시예 16: GBS6 동결건조 제제

GBS6 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ 및 GBS V-CRM₁₉₇)의 다양한 동결건조 제제를 안정성에 대해 시험하였다. 20 mM 히스티딘 (pH 6.5), 0.02% PS80, 약 28 mM NaCl, 및 5.5%, 7.0%, 또는 8.5% (w/v) 수크로스를 포함하는 낮은 (10 mcg/ml) 및 높은 (50 mcg/ml) 용량 제제를 동결건조시켰다. 동결건조 제제의 안정성을 5℃에서의 4개월, 37℃에서의 4개월, 및 50℃에서의 1개월 후에 pH 및 수분을 측정함으로써 시험하였다. 모든 제제는 pH 및 수분에 기초하여 안정하였다 (데이터는 제시되지 않음). 추가로, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복의 백분율을 5℃ 및 37℃ 둘 다에서의 1, 4 및 9개월 후 및 50℃에서의 1, 2 및 4주 후에 모든 제제에 대해 시험하였다. 결과는 도 15-20에 제시된다.

부형제에서의 하기 변동을 또한 40 mcg/ml 용량의 GBS6 제제에 대해 제조하고 평가하였다: 1) 7% (w/v) 수크로스, 2) 2% (w/v) 수크로스 및 4% (w/v) 만니톨, 3) 3% (w/v) 수크로스 및 3% (w/v) 만니톨, 4) 2% (w/v) 수크로스 및 4% (w/v) 글리신, 또는 5) 3% (w/v) 수크로스 및 3% (w/v) 글리신. 모든 5종의 제제에 대한 pH 및 수분은 5℃에서의 3개월, 25℃에서의 3개월, 37℃에서의 3개월, 및 50℃에서의 1개월 후에 안정하였다 (데이터는 제시되지 않음). 추가로, 각각의 혈청형에 대한 항원성 회복의 백분율을 52-8℃, 25℃ 및 37℃에서의 1, 3 및 7개월 후 및 50℃에서의 1, 2 및 4주 후에 모든 제제에 대해 측정하였다. 결과는 도 21-25에 제시된다.

재구성된 동결건조된 제제 및 액체 제제 중 GBS6 백신을 위한 인산알루미늄 아주반트에 결합된 항원의 퍼센트를 비탁측정법을 사용하여 시험하였다. 20 mM 히스티딘, 0.02% PS80, 7.0% (w/v) 수크로스, 및 500 mcg/ml의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 함유하는 동결건조된 제제 및 액체 제제 둘 다를 낮은 (10 mcg/ml) 및 높은 (50 mcg/ml) 용량으로 제조하였다. 다양한 농도의 염화나트륨 (NaCl)을 또한 시험하여 항원 결합에 대한 효과를 결정하였다. 동결건조 제제 및 액체 제제에 대한 결과는 각각 표 35 및 36에 제시된다. 동결건조된 조성물 및 액체 조성물 둘 다에 대한 저용량 제제는 약 150 mM 및 그 초과의 NaCl의 농도가 사용된 경우에 대등한 결과를 가졌다.

표 35. 다양한 수준의 NaCl을 사용하여 재구성된 동결건조된 제제 중 인산알루미늄에 결합된 항원의 퍼센트

표 36. 다양한 수준의 NaCl을 사용한 액체 제제 중 인산알루미늄에 결합된 항원의 퍼센트

실시예 17: GBS6 제제의 재현탁 특성

pH 6.5에서 240 mcg/mL (고) 또는 60 mcg/mL (저) 총 용량의 폴리사카라이드-단백질 접합체, 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.02% PS80, 및 0.5 mg/mL의 AlPO₄를 포함하는 GBS6 제제를 제조하였다. 각각의 혈청형의 유사한 1가 제제를 또한 240 mcg/mL (고) 또는 60 mcg/mL (저) 용량으로 제조하였다. 샘플을 1) 바이알당 0.73 mL의 충전 부피로 2 mL 유리 바이알 내에 충전하거나, 또는 2) 0.58 mL 충전 부피로 BD HYPAK SCF^TM PRTC (벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니) 1 mL 짧은 유리 사전충전 시린지 (PFS) 내에 충전하고, 약 5±1 mm의 헤드스페이스를 유지하면서, 4432/50 마개 (웨스트 파마슈티칼 서비시즈, 인크.)로 캡핑하였다. 바이알 내 제제는 세워서 저장하였고, 반면 PFS 내 제제는 5℃에서 2가지 상이한 배향, 즉 팁 다운 및 수평으로 유지하였다.

2주 및 3개월 저장 후에 제제를 완전히 재현탁시키는데 필요한 진탕 횟수에 의해 재현탁을 측정하였다. 2주 및 3개월 저장 후에 바이알에 충전된 모든 제제를 재현탁시키는데 5회 미만의 진탕이 소요되었다. 수평으로 저장된 경우에, PFS 내 GBS6 저용량 제제는 또한 3개월 저장 후에 단지 3회 진탕만을 필요로 하였다. 그러나, 저용량 제제는 2주 또는 3개월 저장시 팁 다운 저장된 PFS에서 재현탁되는데 약 15회 진탕을 요구하였다. 비교하면, PFS 내 고용량 제제는 저장을 위한 배향과 무관하게 재현탁시키기 어려웠다. GBS6 고용량 제제는 심지어 수평 저장으로도 50회 초과의 진탕를 필요로 하였다. 추가로, 고용량 제제를 재현탁시키는데 필요한 진탕 횟수는 시간 경과에 따라 증가하였다. 충전 (T0) 후 16시간 이하 동안 팁 다운 저장된 PFS 내 GBS6 고용량 제제를 완전히 재현탁시키기 위해 약 100회 진탕이 필요하였고, 3개월 저장으로 200회 초과의 진탕까지 증가하였다. 최종적으로, 혈청형 Ia, III, IV 및 V로부터의 폴리사카라이드 접합체를 사용하여 제조된 일부 1가 제제는 두 배향으로 저장된 PFS에서 재현탁시키기 어려웠고, 시간 경과에 따라 보다 많은 진탕을 필요로 하였으며, 이는 1가 제제의 재현탁 거동이 혈청형-특이적이었다는 것을 시사한다. T0, 2주 및 3개월에서 팁 다운 배향으로 PFS에 저장된 고용량 및 저용량의 GBS6 및 1가 제제의 재현탁을 비교하는 데이터가 도 26에 제시된다. 팁 다운 및 수평 배향으로 PFS에 저장된 고용량 및 저용량의 GBS6 및 1가 제제의 재현탁을 비교하는 데이터가 도 27에 제시된다.

재현탁이 바이알 내 연장된 저장, 팁 다운 배향의 PFS, 및 수평 배향의 PFS에 의해 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해 고용량 및 저용량의 GBS6 제제를 추가로 시험하였다. 추가로, 저용량 및 고용량 제제를 비교하기 위해 중간 용량 (120 mcg/mL 총 용량의 폴리사카라이드-단백질 접합체) 제제를 또한 시험하였다. 저용량 제제는 팁 다운 배향으로 PFS에 6개월 저장한 후에 재현탁시키기 보다 어려워졌으며, 50회 초과의 진탕을 필요로 하는 것으로 발견되었다. 중간 용량 제제는 팁 다운 배향으로 PFS에 단지 1개월만 저장한 후에도 재현탁시키기 어려웠고, 수평 배향으로 PFS에 1개월 저장한 후에는 재현탁시키는데 30회 진탕을 필요로 하였다. 결과는 표 37에 제시된다.

표 37. 바이알 및 사전충전 시린지에 저장된 3가지 상이한 용량의 GBS6 제제의 재현탁 거동의 비교

* 1개월 저장 시간

NT - 시험하지 않음

이들 연구로부터, 바이알 또는 수평 방식으로의 PFS에 pH 6.5에서의 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.02% PS80, 및 0.5 mg/mL의 AlPO4를 포함하는 제제를 저장함으로써 재현탁과 연관된 어려움이 완화될 수 있는 것으로 결정되었다. 그러나, 수평 배향으로 PFS에 저장된 제제의 경우 그것이 60 mcg/ml 이하의 총 용량의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 갖는다면 재현탁은 단지 허용가능한 한계 (즉, 10회 미만의 진탕) 내에 있을 것이다.

재현탁에 대한 다음 3가지 물리적 특성의 효과를 시험하기 위해 추가의 연구를 수행하였다: (1) 제타사이저 나노 ZS (말번 인스트루먼츠 리미티드)를 사용하여 표면 전하 또는 제타 전위; (2) 마스터사이저 3000 레이저 회절 입자 크기 분석기 (말번 인스트루먼츠 리미티드)를 사용하여 입자 크기; 및 (3) 루미사이저(LUMISIZER)® 분산 분석기 (엘.유.엠. 게엠베하)를 사용하여 침전 또는 침강 속도. pH의 함수로서의 AlPO₄ 및 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V의 접합체의 제타 전위가 각각 도 28 및 29에 제시된다. 다양한 GBS6 및 1가 GBS 제제의 제타 전위 및 입자 크기가 표 38에 요약되어 있다. 15종 제제의 제타 전위 값은 약 -7 내지 -10 mV였다. 이들 샘플에 대한 표면 전하와 재현탁 사이의 상관관계는 관찰되지 않았다. 다른 한편으로, 재현탁은 입자 크기에 의해 영향을 받았다. GBS6 및 1가 제제에서 저용량 제제에 대한 입자 크기는 고용량 제제의 경우보다 더 컸고, 일반적으로 입자 크기가 작을수록 제제를 균일하게 재현탁시키는 것이 더 어려웠다.

표 38. 고용량 및 저용량의 GBS6 및 1가 제제의 제타 전위 및 입자 크기의 비교

시간 0, 2주 및 3개월에서 제제 중 알루미늄 입자에 대해 침강 속도를 측정하였다. 고용량 제제는 저용량 제제보다 더 낮은 침강 속도를 나타냈다. 침강 속도는 5℃에서 3개월 저장 후에 변화하지 않았다. 재현탁과 침강 속도 사이에 직접적인 상관관계가 관찰되었다: 침강 속도가 빠를수록, 제제를 재현시키기 용이하였다. 나아가, 고용량 제제보다 더 큰 입자 크기를 갖는 저용량 제제는 보다 빠른 침강 속도 및 보다 용이한 재현탁을 나타냈다. 데이터가 도 30에 제시된다.

실시예 18: GBS6 제제 인자의 침강 속도에 대한 효과

재현탁 특징에 대한 제제 인자, 예컨대 항원 농도, pH 및 염 농도의 영향을 연구하였다. 첫째로, pH 6.5에서의 히스티딘 완충제 중 다양한 항원 농도에서의 GBS6 제제를 조사하였다. 이 연구로부터 제시된 데이터는 보다 높은 항원 농도가 보다 느린 침강 속도로 이어졌다는 것을 입증하였으며 (도 31 참조; 각각의 혈청형에 대해 제시된 투여량), 이는 재현탁에서의 어려움을 야기할 것이다. 저농도에서, 입자는 충돌 및/또는 브라운 운동에 의한 서로의 간섭없이 자유롭게 침강할 수 있다.

둘째로, pH 6.0, 6.5 및 7.0에서의 히스티딘 완충제 중 60 mcg/mL 및 300 mcg/mL의 총 항원 농도에서의 GBS6 제제의 침강 거동을 조사하였다. 60 mcg/mL GBS6 제제의 침강 거동은 pH가 침강 속도에 유의한 효과를 갖는다는 것을 나타냈다. 그러나, 300 mcg/mL GBS6 제제의 침강 속도에 대해서는 pH가 유의한 효과를 갖지 않았다. 데이터가 도 32에 제시된다. pH가 7.0에서 pH 6.0으로 감소하였을 때 AlPO₄의 표면 전하는 -10.3 mV에서 -7.9 mV로 감소하였다 (데이터는 제시되지 않음). 전형적으로, 높은 제타 전위는 입자 사이에 존재하는 우세한 척력 때문에 입자가 매질 중에 완전히 분산되어 있음을 나타낼 것이다. 이 경우, 입자는 별개의 개체로서 현탁액 중에 존재하고, 침강 속도는 입자 크기의 넓은 분포 때문에 종종 느려져, 입자가 상이한 속도로 침강되도록 한다.

최종적으로, AlPO₄의 물리화학적 특성에 대한 이온 강도의 효과 및 현탁액 특성에 대한 그의 후속 영향을 또한 검사하였다. GBS6 제제를 3가지 상이한 용량 수준 (60 mcg/mL, 150 mcg/mL, 및 20 mcg/mL 총 항원) 및 2가지 상이한 NaCl 농도 (22 mM 및 150 mM)로 제조하였다. 제타 전위 값은 염 농도가 낮은 경우에 보다 음성이 되었다. 최소 염 농도 (22 mM)를 갖는 모든 3가지 용량의 GBS6 제제는 음으로 하전되었다. 제타 전위 값은 약 -16 내지 약-17 mV였다. 비교하면, 150 mM NaCl을 갖는 고용량 및 저용량 GBS6 제제는 약 -8 mV이다. 보다 높은 염 농도는 표면 전하를 감소시켰고 침강 속도를 가속화하였으며, 이는 재현탁을 개선시킬 수 있었다. 데이터가 도 33 및 표 39에 제시된다.

표 39. 상이한 용량 및 NaCl 농도를 갖는 GBS6 제제의 제타 전위 및 입자 크기의 비교

실시예 19: 상이한 항원 및 알루미늄 염의 재현탁 거동

항원 농도와 제제를 재현탁시키는데 있어서의 어려움 사이의 상관관계가 GBS에 특이적인지 또는 다른 항원, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드 및 비-GBS 폴리사카라이드-단백질 접합체에 대한 공통 속성인지 여부를 추가로 조사하기 위해 연구를 수행하였다. CRM₁₉₇을 포함하는 제제; GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V로부터의 폴리사카라이드의 조합물; BSA; 또는 20종의 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체의 조합물 (20vPnC)을 실시예 17 및 18에서 시험된 GBS 제제와 동일한 완충제 매트릭스 및 0.5 mg/mL AlPO₄ 아주반트 중 동일한 고용량 (240 mcg/mL 총 항원)으로 제제화하였다. 알히드로겔(ALHYDROGEL)® 85 (브렌태그 바이오섹터 A/S)로 제제화된 GBS6을 또한 비교자로서 포함시켰다. 샘플을 하기 속성에 대해 시험하였다: 1) 재현탁 시간 (200 rpm으로 30 - 45분 원심분리 후 수동 운동 진탕기를 사용하여 1.5 mL 원심분리 튜브에 펠릿을 재현탁시키는데 필요한 시간), 2) 시각적 관찰에 의해 실린더 내 침강 (상이한 시간 간격에서의 침강 층 높이), 3) 입자 크기, 4) 표면 전하, 및 5) 마이크로-플로우 이미징(MICRO-FLOW IMAGING)® (MFI) 유동 DPA 4200 현미경 (브라이트웰 테크놀로지스 인크.)을 사용하여 입자 크기 분포.

상이한 항원은 다양한 침강 및 재현탁 거동을 나타냈다 (데이터는 각각 도 34 및 표 40에 제시됨). 보다 빨리 침강된 제제는 앞서 관찰된 바와 같이 재현탁시키기 보다 용이하였다. 재현탁과 평균 입자 크기 또는 입자 크기 분포 사이의 상관관계는 관찰되지 않았다. 입자 크기 분포 데이터는 도 35a 및 35b에 제시된다. 그러나, 알히드로겔® 85를 포함하는 GBS6 제제는 재현탁시키기 가장 용이하였고, 유의하게 보다 큰 입자 크기, 보다 빠른 침강 속도 및 낮은 표면 전하를 나타냈으며, 이는 입자 크기 및 표면 전하가 재현탁과 상관관계가 있다는 것을 시사한다. 수산화알루미늄은 pH 6.5에서 양으로 하전되는 반면, 접합체는 음으로 하전되어, 강한 정전기적 상호작용 및 보다 높은 전하 중화로 이어진다는 것이 주목되어야 한다. 대조적으로, AlPO₄는 pH 6.5에서 음으로 하전된다.

표 40. 상이한 항원 제제의 입자 크기, 재현탁 시간 및 제타 전위의 비교

실시예 20: 장치 구성의 변형

연구는 제제가 바이알에서는 용이하게 재현탁되었지만 PFS에서는 그렇지 않았다는 것 (둘 다 유형 1 유리로부터 제조되고 고무 마개를 사용함)을 나타냈다. 그러나, 두 시스템 사이의 주요 차이는 보다 균일하게 재현탁된 생성물을 유도하도록 제제의 자유 혼합을 가능하게 하는 이용가능한 헤드 스페이스이다. 따라서, PFS 내 보다 높은 헤드스페이스가 보다 많은 혼합을 가능하게 할 것인지를 이해하기 위해 PFS 내 재현탁에 영향을 미치는 인자로서 헤드스페이스의 효과를 조사하였다. 시린지를 고용량 GBS6 제제 (AlPO₄ 존재)로 충전시키고, 다양한 헤드스페이스 (2 mm, 6 mm 및 10 mm; 도 36에 제시됨)를 갖는 마개로 막고, 2-8℃에서 수평 배향으로 저장하였다. 재현탁 거동 (# 진탕)을 2주 저장 시간 후에 시험하였다. 데이터는 헤드스페이스를 증가시키는 것이 재현탁에 필요한 진탕 횟수를 감소시킨다는 것을 나타냈다. 데이터는 표 41에 제시된다. 재현탁의 용이성은 보다 용이한 혼합을 가능하게 하는 보다 높은 헤드스페이스로 인한 증가된 난류에 기인하였다. 이러한 거동은 바이알에서도 명백하며, (보다 큰 헤드스페이스로 인한) 어떠한 재현탁 문제점도 나타내지 않는다.

표 41. GBS6 제제의 재현탁 특징에 대한 증가하는 헤드스페이스의 효과

저장 시간: 2-8℃에서 2주

*3개의 샘플의 평균

실시예 21: 알루미늄 농도의 영향

제제를 재현탁시키는 능력에 대한 알루미늄 농도의 영향을 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 이것은 감소하는 AlPO₄ 농도를 갖는 GBS6 제제를 평가함으로써 수행하였다. 0.5 - 0.05 mg/mL 범위의 알루미늄 수준의 농도를 갖는 동일한 완충제 매트릭스 중 고용량 (240 mcg/mL 총 항원)으로 GBS6 제제를 제조하였다. 샘플을 0.58 mL 충전 부피로 BD HYPAK SCF^TM PRTC (벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니) 1 mL 짧은 유리 PFS 내에 충전하고, 약 ~0.4 mm의 헤드스페이스를 유지하면서, 4432/50 마개 (웨스트 파마슈티칼 서비시즈, 인크.)로 캡핑하고, 수평으로 저장하였다. 재현탁을 5℃에서 0, 1, 2 및 4주에 시험하였다. 개별 제제 중 각각의 혈청형에 대한 총 및 결합된 항원성을 혈청형-특이적 폴리클로날 항체를 사용하여 비탁측정법에 의해 분석하였다.

알루미늄 수준의 감소는 재현탁에 긍정적인 효과를 가졌지만, 0.3 mg/mL 알루미늄을 갖는 제제는 여전히 T0에서 20회 초과의 진탕 및 2주에서 50회 초과의 진탕을 필요로 하였다. 0.05 mg/mL 알루미늄을 함유하는 제제는 2주 수평 저장 후에 약 20회 진탕을 필요로 하였다. 데이터는 도 37에 제시된다.

알루미늄에 결합된 항원의 양의 감소가 또한 관찰되었다. 데이터는 도 38에 제시된다.

실시예 22: 상이한 응집제의 스크리닝

미립자를 갖는 현탁액은 느린 침강 속도를 나타내고, 재현탁시키기 어려운 또는 불가능한 저부피 고밀도 침강을 유발할 것이다. 재현탁 특성은 제약 조작에 의해, 예컨대 현탁된 입자 상의 표면 전하를 중화시키고 더 큰 입자 응집물 또는 클러스터의 형성을 가능하게 하여 침강 속도를 증가시키고 재현탁을 개선시키는 응집제를 첨가함으로써 제어될 수 있다. 비-응집 및 응집된 현탁액 사이의 침강 거동의 차이는 표 42에 예시된다.

표 42. 비-응집 및 응집된 현탁액의 비교

재현탁 특성을 개선시키기 위한 접근법으로서 GBS6 제제 내로의 응집제의 혼입을 취하였다. 하기 응집제 및 알루미늄-기재 염을 고용량 GBS6 제제의 침강 속도 및 재현탁에 대한 그의 효과에 대해 평가하였다:

응집제:

1. GBS6 대조군 (pH 6.5에서의 20 mM His 완충제, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 및 0.5 mg/mL AlPO4를 포함하는 GBS6)

2. 황산암모늄 (0.25 mg/mL)

3. 황산암모늄 및 KCl (0.25 mg/mL 및 20 mM)

4. CaCl₂ (0.25 mg/mL)

5. SDS (1%)

6. 인산칼륨 (50mM)

7. NaCl (1M)

알루미늄-기재 염:

1. 알히드로겔® 85 (브렌태그 바이오섹터 A/S) [Al(OH)₃; 0.25 mg/mL]

2. 아주-포스(ADJU-PHOS)® (브렌태그 바이오섹터 A/S) (0.5 mg/mL)

3. AlPO₄ 및 Al(OH)₃ (각각 0.25 mg/mL의 1:1 혼합물)

상기 열거된 응집제 중 하나 또는 상기 열거된 알루미늄-기재 염 중 하나를 사용하여 pH 6.5에서의 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 및 0.5 mg/mL AlPO₄를 포함하는 고용량 (240 μg/mL) GBS6 제제를 제조하였다. 샘플을 가속 재현탁 시간 (샘플을 1.5 mL 원심분리 튜브에서 200 rpm으로 45분 동안 회전시킨 후), 침강 속도, 입자 크기, 표면 전하, 및 총 및 결합된 접합체에 대해 시험하였다.

시험된 모든 응집제 중에서, NaCl 및 인산칼륨은 재현탁 시간을 GBS6 대조군에 대한 180초와 비교하여 20초 미만으로 크게 감소시킬 수 있었다. 데이터는 도 39 및 표 42에 제시된다. 이들 2개의 샘플의 침강 속도는 또한 칼슘 또는 암모늄 염 또는 SDS를 갖는 다른 제제보다 더 빨랐다. 데이터는 도 40에 제시된다. 1 M NaCl을 함유하는 제제는 응집의 이론에 기초하여 예상되는 바와 같이 큰 입자 크기 및 낮은 표면 전하를 가졌다. 그러나, 50 mM 포스페이트를 함유하는 샘플에서는 동일하게 관찰되지 않았으며, 이는 포스페이트가 NaCl과 상이한 메카니즘을 통해 재현탁을 용이하게 하였다는 것을 시사한다. 데이터는 표 42에 제시된다.

시험된 2종의 알루미늄 염 중에서, 알히드로겔® 85는 아주-포스®보다 우수한 재현탁 거동을 나타냈다. 알히드로겔® 85를 함유하는 제제에 대한 주요 우려는, 그것이 AlPO₄와 비교하여 항원에 대한 더 높은 결합 강도에 의해 나타난 바와 같이 항원에 단단히 결합한다는 것이다. 데이터는 표 43에 제시된다. 이러한 현상은 백신의 면역 반응에 대해 불리한 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 문헌 [Egan, P.M., et al., Vaccine, 27:3175-3180 (2009)].

표 43. 응집제 또는 알루미늄 염을 갖는 GBS6 제제의 재현탁 특징

실시예 23: NaCl 및 포스페이트 수준의 최적화

NaCl 및 인산칼륨의 농도를, 목적하는 재현탁 특징을 충족시킬 뿐만 아니라 다른 속성, 예컨대 반응원성 및 백신의 효능과 연관된 2가지 중요한 측면인 오스몰랄농도 및 알루미늄에 대한 항원 결합을 충족시킬 수준으로 최적화하기 위한 연구를 수행하였다.

pH 6.5에서의 다양한 농도의 NaCl (150 - 690 mM), 20 mM 히스티딘, 0.02% PS80, 및 0.5 mg/mL AlPO₄를 포함하는 고용량 (240 mcg/mL 총 항원) GBS6 제제를 제조하였다. 또한 다양한 인산칼륨 농도 (10 - 50 mM) 및 2종의 상이한 NaCl 농도 (150 mM 및 240 mM)를 포함하는 제제를 제조하여 2종의 염의 조합 효과를 조사하였다. 제제화된 벌크 샘플을 침강 속도, 원심분리 후의 재현탁 시간, 입자 크기 및 표면 전하에 대해 시험하였다.

NaCl 농도를 증가시키는 것은 재현탁 시간을 유의하게 감소시켰다. 데이터는 도 41에 제시된다. 300 mM NaCl에서 재현탁 시간의 급격한 감소가 존재하였으며, 이는 제제가 탈응집에서 응집 상태로 변하였다는 것 및 300 mM NaCl 농도가 이러한 전이에 대한 임계 응고 농도 (CCC)였다는 것을 시사한다. CCC는 10 mM 이상의 포스페이트의 존재 하에 240 mM로 감소하였으며, 이는 NaCl 및 포스페이트에 의한 상승작용적 효과가 존재하였다는 것을 시사한다. 데이터는 도 42에 제시된다. 도 43a 및 43b에 제시된 바와 같이 240 mM NaCl과 10 - 30 mM 포스페이트를 함유하는 샘플에서 빠른 침강 및 응집된 침전물이 관찰되었다. 제타 전위 및 입자 크기 데이터는 NaCl 농도의 증가가 표면 전하의 감소 및 입자 크기의 증가로 이어진다는 것을 밝혀냈으며, 이는 응집 이론을 지지하였다. 이러한 경향은 포스페이트에서는 명확하지 않았다. 데이터는 표 44에 제시된다. 본 연구로부터의 결과에 기초하여, 240 mM NaCl 및 20 mM 포스페이트는 최적의 표적 농도로 간주되었다.

표 44. 제타 전위 및 입자 크기에 대한 NaCl 및 포스페이트의 효과

pH 6.5에서의 40 mcg/mL의 폴리사카라이드 농도의 각각의 혈청형 (240 mcg/mL 총 항원), 20 mM 포스페이트, 240 mM NaCl, 0.02% PS80, 및 0.5 mg/mL AlPO₄를 포함하는 GBS6 제제의 3개의 배치를 추가로 특징화하였다. pH 6.5에서의 20 mM His 완충제, 150 mM NaCl, 0.02% PS80, 및 0.5 mg/mL AlPO₄를 포함하는 GBS6의 제제를 대조군으로서 포함시켰다. pH6.5에서의 추가의 NaCl 및 포스페이트를 갖는 모든 3종의 제제는 16초 (대조군의 120초와 비교하여)의 평균 재현탁 시간 및 500 mOsm 초과의 오스몰랄농도로 용이한 재현탁을 나타냈다. 결합된 항원성은 각각의 혈청형에 대해 대조군보다 약 20% 더 낮았다. 데이터는 표 45에 제시된다.

표 45. 추가의 NaCl 및 포스페이트를 갖는 GBS6 제제의 특징화

*3개의 배치의 평균.

실시예 24: 240 mM NaCl 및 20 mM 포스페이트를 함유하는 GBS6 제제의 단기 안정성

pH 6.5에서의 20 mM 포스페이트, 240 mM NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80 및 0.5 mg/mL AlPO₄를 포함하는 3가지 용량 (60 mcg/mL, 120 mcg/mL 및 240 mcg/mL의 총 항원)의 GBS6 제제를 0.58 mL 충전 부피로 BD HYPAK SCF^TM PRTC (벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니) 1 mL 짧은 유리 PFS 내에 충전하고, 약 ~0.4 mm의 헤드스페이스를 유지하면서, 4432/50 마개 (웨스트 파마슈티칼 서비시즈, 인크.)로 캡핑하였다. 팁 다운 및 수평 둘 다의 배향으로의 재현탁을 RT에서 1개월 및 5℃에서 3개월 동안 안정성에 대해 모니터링하였다.

1개월 데이터는 수평으로 저장된 PFS가 모든 3가지 용량 수준에 대해 10회 이하의 진탕으로 재현탁될 수 있다는 것을 제시하였다. 그러나, 팁 다운 저장된 PFS는 여전히 40회 이상의 진탕을 필요로 하였다. 데이터는 표 46에 제시된다. 각각의 혈청형의 총 항원성 및 AlPO₄에 대한 결합은 RT에서 1개월 동안 안정하였다. 데이터는 표 47에 제시된다.

표 46. 수평 대 팁 다운으로 저장된 PFS의 재현탁 거동의 비교

표 47. GBS 제제의 총 항원성

실시예 25: PFS 내 응집제를 갖는 GBS 제제에 대한 실험 설계 (DoE) 및 설계 품질 (QbD) 개념의 적용

PFS에 대한 최적 GBS6 제제를 결정하기 위해 실험 설계 (DoE)를 실행하였다. 반응 표면 방법론 사용하여 다음 3종의 인자를 평가하였다 (박스-벤켄 설계): 1) pH (6.0, 6.5, 및 7.0); 2) NaCl 농도 (220 mM, 240 mM, 및 260 mM); 및 3) 포스페이트 농도 (15 mM, 20 mM, 및 25 mM). 모든 제제는 달리 240 mg/mL 용량 (60 ug/mL의 각각의 혈청형, 0.02% PS80, 약물 물질로부터 전달된 약 10 mM 히스티딘, 및 0.5 mg/mL AlPO₄)을 포함하였다. 총 15종의 제제를 재현탁의 용이성에 대해 조사하였다 (표 48 참조).

표 48. DoE 연구 제제

임의의 연관된 가변성을 설명하기 위해, 연구를 삼중으로 및 2종의 오퍼레이터에 의해 수행하였다. 샘플을 0.58 mL 충전 부피로 BD HYPAK SCF^TM PRTC (벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니) 1 mL 짧은 유리 PFS 내에 충전하고, 약 ~0.4 mm의 헤드스페이스를 유지하면서, 4432/50 마개 (웨스트 파마슈티칼 서비시즈, 인크.)로 캡핑하였다. 충전된 시린지를 3개월 동안 2-8℃ 및 25℃에서 수평으로 저장하였다. 재현탁을 단지 5℃에서 모니터링하고, 비탁측정법에 의한 강도를 5℃ 및 25℃에서 모니터링하였다. 재현탁 결과는 표 49에 제시된다.

표 49. 3개월에서 재현탁에 필요한 진탕 횟수

*3개의 샘플의 평균

JMP 통계 소프트웨어 (SAS 인스티튜트)를 사용하여 데이터를 분석하고, 재현탁을 위해 ≤ 10회의 진탕을 필요로 하는 최적의 가장 강건한 제제를 예측하였다. 오퍼레이터 중 하나에 대한 재현탁 데이터에 기초한 JMP로부터의 예측 프로파일러는 도 45에 제시된다. pH 및 염은 진탕 횟수에 영향을 미치는 유의한 개별 인자였다. 추가로, 포스페이트와 pH 사이의 상호작용이 유의하였다. 바람직성 지수에 기초하여, 하기 조건은 보다 용이한 재현탁을 가능하게 하였다 (#진탕 ≤ 10): pH 7.0 ± 0.5, 245 ± 20 mM NaCl, 및 20±5 mM 포스페이트. 제2 오퍼레이터로부터의 데이터를 분석하였을 때 유사한 결과가 얻어졌다.

그러나, 권장된 제제 파라미터에서, 결합의 정도는 보다 낮았다. 도 46에 제시된 바와 같이, 각각의 GBS 혈청형에 대한 접합체의 결합은 10 - 20% 사이에서 다양하였다. 추가로, 권장된 제제는 보다 높은 오스몰랄농도 (약 500 mOsm/kg)를 가졌지만, 여전히 백신에 대한 범위 내에 있었다.

실시예 26: Al(OH)₃-기재 GBS6 제제

실시예 22에 기재된 바와 같이, Al(OH)₃을 갖는 GBS6 제제는 우수한 재현탁 거동을 가졌지만, 항원과의 결합 강도가 보다 높았으며, 이는 면역 반응에 불리한 영향을 미칠 수 있었다. 따라서, GBS 접합체에 대한 Al(OH)₃의 결합을 특징화하고 Al(OH)₃의 흡착 강도를 조정하기 위한 실험을 수행하였다.

pH 6.5에서의 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 및 0.02% PS80을 포함하는 고용량 (240 mcg/mL의 총 접합체) GBS6 제제를 다양한 농도의 Al(OH)₃ (0.7 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.15 mg/mL, 0.1 mg/mL, 및 0.05 mg/mL)으로 제조하였다. 비탁측정법에 의해 총 및 상청액 항원성을 측정함으로써 결합을 결정하였다. 도 47에 제시된 바와 같이, Al(OH)₃에 대한 결합은 모든 6종의 혈청형에 대해 0.5 mg/mL Al(OH)₃에서 플래토 상태였다. 흡착 능력 및 흡착 계수는 랭뮤어 방정식에 의해 결정하였다. 데이터는 비교자로서의 AlPO₄에 대한 데이터와 함께 표 50에 제시된다.

표 50. AlPO₄ 및 Al(OH)₃에 대한 GBS 접합체 결합의 특징

Al(OH)₃의 결합 강도를 조정하기 위해서는, 수산화알루미늄 상의 표면 히드록실을 포스페이트로 대체하고 리간드 교환을 감소시키기 위해 제제 중 완충제를 인산나트륨으로 교체하였다. pH 6.5에서의 150 mM NaCl, 0.02% PS80, 및 0.15 mg/ML Al(OH)₃을 포함하는 GBS6 제제를 3가지 상이한 포스페이트 농도 (10 mM, 20 mM, 및 30 mM) 및 다양한 용량 (15 mcg/mL, 30 mcg/mL, 60 mcg/mL, 90 mcg/mL, 120 mcg/mL, 150 mcg/mL, 및 210 mcg/mL 총 접합체)으로 제조하였다. 결합을 총 및 상청액 항원성에 의해 결정하였다. 흡착 능력 및 계수를 랭뮤어 방정식에 의해 결정하였다. 데이터는 비교자로서의 AlPO₄ 제제에 대한 데이터와 함께 표 51에 제시된다.

표 51. Al(OH)₃에의 GBS 접합체 결합에 대한 포스페이트 농도의 효과

* AlPO₄ 제제는 약물 물질로부터 전달된 ~10mM 히스티딘을 함유한다.

** AlPO₄ 제제의 결합은 3개의 배치로부터 평균낸다.

*** 추출 조건: 24시간 동안 RT에서 회전하는 0.1N NaOH.

Al(OH)₃에 대한 GBS6의 결합 능력 및 계수는 AlPO₄에 대한 경우보다 3 - 4배 더 높았다. 그러나, 제제 내에 포스페이트를 도입함으로써 GBS6에 대한 수산화알루미늄의 흡착 강도를 조정하였다. 포스페이트 농도는 흡착 강도 및 능력에 불리한 영향을 미쳤다. 포스페이트는 또한 항원 결합 퍼센트에 영향을 미쳤지만, 여전히 AlPO₄의 수준 초과였다. 추가로, GBS는 포스페이트의 존재 하에 알루미늄으로부터 완전히 추출될 수 있었다. 결과에 기초하여, pH6.5에서의 20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 및 0.2% PS80이 수산화알루미늄에 의해 최적인 것으로 결정되었다.

본 발명의 측면

하기 항목은 본 발명의 추가의 실시양태를 기재한다:

C1. B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 포함하며, 여기서 피막 폴리사카라이드는 약 60% 초과의 시알산 수준을 갖는 것인 면역원성 폴리사카라이드-단백질 접합체.

C2. C1에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 접합체.

C3. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 Ia인 면역원성 접합체.

C4. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 Ib인 면역원성 접합체.

C5. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 II인 면역원성 접합체.

C6. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 III인 면역원성 접합체.

C7. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 IV인 면역원성 접합체.

C8. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 V인 면역원성 접합체.

C9. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 VI인 면역원성 접합체.

C10. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 VII인 면역원성 접합체.

C11. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 VIII인 면역원성 접합체.

C12. C2에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 IX인 면역원성 접합체.

C13. C1 내지 C12 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 95% 초과의 시알산 수준을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C14. C1 내지 C13 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 100%의 시알산 수준을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C15. C1 내지 C14 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.6 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C16. C1 내지 C15 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.65 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C17. C1 내지 C16 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.7 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C18. C1 내지 C17 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.75 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C19. C1 내지 C18 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.8 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C20. C1 내지 C19 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.85 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C21. C1 내지 C20 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.9 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C22. C1 내지 C21 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폴리사카라이드의 mM당 적어도 약 0.95 mM 시알산을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C23. C1 내지 C22 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa의 분자량을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C24. C1 내지 C23 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 25 kDa 내지 약 750 kDa의 분자량을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C25. C1 내지 C24 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 25 kDa 내지 약 400 kDa의 분자량을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C26. C1 내지 C25 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 25 kDa 내지 약 200 kDa의 분자량을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C27. C1 내지 C25 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 100 kDa 내지 약 400 kDa의 분자량을 갖는 것인 면역원성 접합체.

C28. C1 내지 C27 중 어느 하나에 있어서, 접합체의 분자량이 약 300 kDa 내지 약 20,000 kDa인 면역원성 접합체.

C29. C1 내지 C28 중 어느 하나에 있어서, 접합체의 분자량이 약 1,000 kDa 내지 약 15,000 kDa인 면역원성 접합체.

C30. C1 내지 C29 중 어느 하나에 있어서, 접합체의 분자량이 약 1,000 kDa 내지 약 10,000 kDa인 면역원성 접합체.

C31. C1 내지 C30 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 0% 내지 약 40% O-아세틸화된 것인 면역원성 접합체.

C32. C1 내지 C31 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 5% 미만 O-아세틸화된 것인 면역원성 접합체.

C33. C1 내지 C32 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 4% 미만 O-아세틸화된 것인 면역원성 접합체.

C34. C1 내지 C33 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 3% 미만 O-아세틸화된 것인 면역원성 접합체.

C35. C1 내지 C34 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 2% 미만 O-아세틸화된 것인 면역원성 접합체.

C36. C1 내지 C35 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 약 1% 미만 O-아세틸화된 것인 면역원성 접합체.

C37. C1 내지 C36 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.1 mM O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C38. C1 내지 C37 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.2 mM O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C39. C1 내지 C38 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.3 mM O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C40. C1 내지 C39 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.35 mM O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C41. C1 내지 C40 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 적어도 약 0.4 mM O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C42. C1 내지 C41 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.01 mM 미만의 O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C43. C1 내지 C42 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.05 mM 미만의 O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C44. C1 내지 C43 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.04 mM 미만의 O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C45. C1 내지 C44 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.03 mM 미만의 O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C46. C1 내지 C45 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 사카라이드 반복 단위의 mM당 약 0.02 mM 미만의 O-아세테이트를 포함하는 것인 면역원성 접합체.

C47. C1 내지 C46 중 어느 하나에 있어서, 폴리사카라이드가 각각 개별적으로 담체 단백질에 접합되는 것인 면역원성 접합체.

C48. C1 내지 C47 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질이 CRM₁₉₇ 또는 파상풍 톡소이드인 면역원성 접합체.

C49. C1 내지 C48 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질이 CRM₁₉₇인 면역원성 접합체.

C50. 피막 폴리사카라이드 생산 박테리아를 포함하는 세포 브로쓰와 유기 시약을 반응시키는 것을 포함하는, 피막 폴리사카라이드를 단리하는 방법.

C51. C50에 있어서, 박테리아가 용해되지 않는 것인 방법.

C52. C50 또는 C51에 있어서, 박테리아가 열 사멸되는 것인 방법.

C53. C50 내지 C52 중 어느 하나에 있어서, 원심분리하여 세포 페이스트를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

C54. C50 내지 C53 중 어느 하나에 있어서, 여과 단계를 추가로 포함하는 방법.

C55. C54에 있어서, 상기 여과 단계가 투석여과인 방법.

C56. C50 내지 C56 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드 생산 박테리아가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스타필로코쿠스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 티피, 헤모필루스 인플루엔자에, 클레브시엘라 뉴모니아에, 엔테로코쿠스 파에시움, 및 엔테로코쿠스 파에칼리스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

C57. C56에 있어서, 박테리아가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에인 방법.

C58. C50 내지 C57 중 어느 하나에 있어서, 상기 유기 시약이 유도체화된 히드록실 아민 화합물인 방법.

C59. C50 내지 C58 중 어느 하나에 있어서, 히드록실 아민이 실시예 2의 표 2에 열거된 임의의 히드록실 아민인 방법.

C60. C50 내지 C59 중 어느 하나에 있어서, 히드록실 아민이 디벤질 히드록실아민; 디에틸 히드록실아민; 히드록실아민; 에틸렌디아민; 트리에틸렌테트라민; 1,1,4,7,10,10 헥사메틸 트리에틸렌 테트라민; 및 2,6,10 트리메틸 2,6,10 트리아자운데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

C61. C50 내지 C60 중 어느 하나에 있어서, 히드록실 아민의 농도가 약 5 mM 내지 약 200 mM인 방법.

C62. C50 내지 C61 중 어느 하나에 있어서, 반응의 pH가 약 5.5 내지 약 9.5인 방법.

C63. C50 내지 C62 중 어느 하나에 있어서, 반응이 약 20℃ 내지 약 85℃의 온도에서 일어나는 것인 방법.

C64. C50 내지 C63 중 어느 하나에 있어서, 반응 시간이 약 10시간 내지 약 90시간인 방법.

C65. C1 내지 C49 중 어느 하나의 면역원성 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법이며, 여기서 피막 폴리사카라이드는 C50 내지 C64 중 어느 하나의 방법에 따라 단리되는 것인 방법.

C66. C50 내지 C64 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 피막 폴리사카라이드를 포함하는 면역원성 폴리사카라이드-단백질 접합체.

C67. C1 내지 C49 및 C66 중 어느 하나의 면역원성 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.

C68. 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 B군 스트렙토코쿠스 (GBS) 혈청형 IV 및 Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.

C69. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 Ia인 면역원성 조성물.

C70. C69에 있어서, GBS 혈청형 Ib로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C71. C69 또는 C70에 있어서, GBS 혈청형 II로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C72. C69 내지 C71 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 III으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C73. C69 내지 C72 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C74. C69 내지 C73 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VI으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C75. C69 내지 C74 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C76. C69 내지 C75 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C77. C69 내지 C76 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C78. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 Ib인 면역원성 조성물.

C79. C78에 있어서, GBS 혈청형 II로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C80. C78 또는 C79에 있어서, GBS 혈청형 III으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C81. C78 내지 C80 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C82. C78 내지 C81 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VI으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C83. C78 내지 C82 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C84. C78 내지 C83 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C85. C78 내지 C84 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C86. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 II인 면역원성 조성물.

C87. C86에 있어서, GBS 혈청형 III으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C88. C86 또는 C87에 있어서, GBS 혈청형 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C89. C86 내지 C88 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VI으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C90. C86 내지 C89 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C91. C86 내지 C90 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C92. C86 내지 C91 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C93. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 III인 면역원성 조성물.

C94. C93에 있어서, GBS 혈청형 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C95. C93 또는 C94에 있어서, GBS 혈청형 VI으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C96. C93 내지 C95 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C97. C93 내지 C96 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C98. C93 내지 C97 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C99. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 V인 면역원성 조성물.

C100. C99에 있어서, GBS 혈청형 VI으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C101. C99 또는 C100에 있어서, GBS 혈청형 VII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C102. C99 내지 C101 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C103. C99 내지 C102 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C104. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 VI인 면역원성 조성물.

C105. C104에 있어서, GBS 혈청형 VII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C106. C104 또는 C105에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C107. C104 내지 C106 중 어느 하나에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C108. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 VII인 면역원성 조성물.

C109. C108에 있어서, GBS 혈청형 VIII로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C110. C108 또는 C109에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C111. C68에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 VIII인 면역원성 조성물.

C112. C111에 있어서, GBS 혈청형 IX로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C113. C112에 있어서, 적어도 1종의 추가의 혈청형이 IX인 면역원성 조성물.

C114. 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 IV로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.

C115. 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III 및 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.

C116. 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하며, 여기서 접합체는 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.

C117. Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.

C118. C117에 있어서, 적어도 5종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 면역원성 조성물.

C119. C117 또는 C118에 있어서, 적어도 6종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 면역원성 조성물.

C120. C117 내지 C119 중 어느 하나에 있어서, 적어도 7종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 면역원성 조성물.

C121. C117 내지 C120 중 어느 하나에 있어서, 적어도 8종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 면역원성 조성물.

C122. C117 내지 C121 중 어느 하나에 있어서, 적어도 9종의 GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 면역원성 조성물.

C123. C117 내지 C122 중 어느 하나에 있어서, GBS 피막 폴리사카라이드 혈청형 V를 포함하는 면역원성 조성물.

C124. C117 내지 C123 중 어느 하나에 있어서, 면역 간섭을 갖지 않는 면역원성 조성물.

C125. C67 내지 C124 중 어느 하나에 있어서, 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 안정화제, 아주반트, 동결보호제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 자유 라디칼 산화의 억제제, 담체, 또는 그의 혼합물을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C126. C67 내지 C125 중 어느 하나에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C127. C126에 있어서, 완충제가 HEPES, PIPES, MES, 트리스 (트리메타민), 포스페이트, 아세테이트, 보레이트, 시트레이트, 글리신, 히스티딘 및 숙시네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C128. C127에 있어서, 완충제가 히스티딘인 면역원성 조성물.

C129. C67 내지 C128 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C130. C129에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-20, 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C131. C130에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트-80인 면역원성 조성물.

C132. C67 내지 C131 중 어느 하나에 있어서, 부형제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C133. C132에 있어서, 부형제가 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨, 팔라티니트, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 글리신, 아르기닌, 리신, 염화나트륨 (NaCl), 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C134. C133에 있어서, 부형제가 염화나트륨인 면역원성 조성물.

C135. C67 내지 C134 중 어느 하나에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C136. C135에 있어서, 아주반트가 알루미늄-기재 아주반트 또는 QS-21인 면역원성 조성물.

C137. C136에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트가 인산알루미늄, 알루미늄 히드록실 포스페이트, 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C138. C137에 있어서, 아주반트가 인산알루미늄인 면역원성 조성물.

C139. C138에 있어서, 아주반트가 알루미늄 히드록실 포스페이트인 면역원성 조성물.

C140. C67 내지 C139 중 어느 하나에 있어서, 완충제, 계면활성제, 부형제 및 임의로 아주반트를 포함하고, 약 6.0 내지 약 7.0의 pH로 완충되는 면역원성 조성물.

C141. C67 내지 C140 중 어느 하나에 있어서, 히스티딘, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨 및 임의로 인산알루미늄을 포함하고, 약 6.0 내지 약 7.0의 pH로 완충되는 면역원성 조성물.

C142. C67 내지 C141 중 어느 하나에 있어서, 약 10 mM 내지 약 25 mM의 히스티딘, 약 0.01% 내지 약 0.03% (v/w)의 폴리소르베이트-80, 약 10 mM 내지 약 250 mM의 염화나트륨 및 임의로 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 포함하는 면역원성 조성물.

C143. C67 내지 C142 중 어느 하나에 있어서, 약 5 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 용량을 포함하는 면역원성 조성물.

C144. C67 내지 C143 중 어느 하나에 있어서, 임의로 적어도 1종의 부형제의 존재 하에 동결건조되는 면역원성 조성물.

C145. C144에 있어서, 적어도 1종의 부형제가 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨, 팔라티니트, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 글리신, 아르기닌, 리신, 염화나트륨 (NaCl), 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C146. C145에 있어서, 적어도 1종의 부형제가 수크로스인 면역원성 조성물.

C147. C144 내지 C146 중 어느 하나에 있어서, 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 적어도 1종의 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.

C148. C144 내지 C147 중 어느 하나에 있어서, 추가의 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.

C149. C148에 있어서, 추가의 부형제가 만니톨 또는 글리신인 면역원성 조성물.

C150. C148 또는 C149에 있어서, 약 1% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 추가의 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.

C151. C143 내지 C150 중 어느 하나에 있어서, 물, 주사용수 (WFI), 아주반트 현탁액 또는 염수로 재구성되는 면역원성 조성물.

C152. C67 내지 C151 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.

C153. C67 내지 C152 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 GBS에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.

C154. C153에 있어서, 대상체가 임신 계획 중인 여성 또는 임신한 여성인 면역원성 조성물.

C155. C154에 있어서, 여성이 임신 후반기인 면역원성 조성물.

C156. C155에 있어서, 임신한 여성이 적어도 임신 20주인 면역원성 조성물.

C157. C156에 있어서, 임신한 여성이 임신 27주 내지 36주인 면역원성 조성물.

C158. C157에 있어서, 대상체가 50세 이상의 성인인 면역원성 조성물.

C159. C158에 있어서, 대상체가 65세 이상의 성인인 면역원성 조성물.

C160. C159에 있어서, 대상체가 85세 이상의 성인인 면역원성 조성물.

C161. C153 내지 C160 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 면역손상된 것인 면역원성 조성물.

C162. C161에 있어서, 대상체가 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 갖는 것인 면역원성 조성물.

C163. C153 내지 C162 중 어느 하나에 있어서, B군 스트렙토코쿠스가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에인 면역원성 조성물.

C164. 대상체에게 유효량의 C67 내지 C150 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, B군 스트렙토코쿠스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.

C165. 대상체에게 유효량의 C67 내지 C151 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 B군 스트렙토코쿠스와 연관된 질환 또는 상태를 예방하거나 감소시키는 방법.

C166. C164 또는 C165에 있어서, 대상체가 임신 계획 중인 여성 또는 임신한 여성인 방법.

C167. C166에 있어서, 여성이 임신 후반기인 방법.

C168. C166 또는 C167에 있어서, 임신한 여성이 적어도 임신 20주인 방법.

C169. C166 내지 C168 중 어느 하나에 있어서, 임신한 여성이 임신 27주 내지 36주인 방법.

C170. C164 또는 C165에 있어서, 대상체가 50세 이상의 성인인 방법.

C171. C170에 있어서, 대상체가 65세 이상의 성인인 방법.

C172. C170 또는 C171에 있어서, 대상체가 85세 이상의 성인인 방법.

C173. C164 내지 C172 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 면역손상된 것인 방법.

C174. C173에 있어서, 대상체가 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 갖는 것인 방법.

C175. C164 내지 C174 중 어느 하나에 있어서, B군 스트렙토코쿠스가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에인 방법.

C176. C1 내지 C49 및 C66 중 어느 하나의 면역원성 접합체에서의 피막 폴리사카라이드에 결합하는 항체.

C177. C176의 항체를 포함하는 조성물.

C178. 대상체에게 C67 내지 C151 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.

C179. C178의 방법에 의해 생산된 항체.

C180. (a) C67 내지 C151 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 사용하여 항체 제제를 생성하는 단계; 및

(b) 항체 제제를 대상체에게 투여하여 수동 면역을 부여하는 단계

를 포함하는, 대상체에게 수동 면역을 부여하는 방법.

C181. (a) GBS 피막 폴리사카라이드를 산화제와 반응시켜 활성화된 폴리사카라이드를 생성하는 단계; 및

(b) 활성화된 폴리사카라이드를 담체 단백질과 반응시켜 폴리사카라이드-단백질 접합체를 생성하는 단계

를 포함하는, C1 내지 C49 및 C66 중 어느 하나의 면역원성 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.

C182. C181에 있어서, 단계 (b)를 극성 비양성자성 용매 중에서 수행하는 방법.

C183. C182에 있어서, 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO), 술폴란, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

C184. C183에 있어서, 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO)인 방법.

C185. C181 내지 C184 중 어느 하나에 있어서, 폴리사카라이드를 0.01 내지 10.0 몰 당량의 산화제와 반응시키는 방법.

C186. C181 내지 C185 중 어느 하나에 있어서, 산화제가 퍼아이오데이트인 방법.

C187. C186에 있어서, 퍼아이오데이트가 소듐 퍼아이오데이트인 방법.

C188. C181 내지 C187 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 산화 반응이 1시간 내지 50시간인 방법.

C189. C181 내지 C188 중 어느 하나에 있어서, 산화 반응의 온도가 약 2℃ 내지 약 25℃로 유지되는 것인 방법.

C190. C181 내지 C189 중 어느 하나에 있어서, 산화 반응을 인산나트륨, 인산칼륨, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 및 비스-트리스로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제 중에서 수행하는 방법.

C191. C190에 있어서, 완충제가 약 1 mM 내지 약 500 mM의 농도를 갖는 것인 방법.

C192. C181 내지 C191 중 어느 하나에 있어서, 산화 반응을 약 4.0 내지 약 8.0의 pH에서 수행하는 것인 방법.

C193. C181에 있어서, 산화제가 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 (TEMPO)인 방법.

C194. C193에 있어서, N-클로로숙신이미드 (NCS)가 공산화제인 방법.

C195. C181 내지 C194 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)가 켄칭제의 첨가에 의해 산화 반응을 켄칭하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

C196. C182 내지 C195 중 어느 하나에 있어서, 폴리사카라이드의 농도가 약 0.1 mg/mL 내지 약 10.0 mg/mL인 방법.

C197. C181 내지 C196 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 폴리사카라이드의 산화도가 5 내지 25인 방법.

C198. C181 내지 C197 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 폴리사카라이드를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

C199. C188에 있어서, 활성화된 폴리사카라이드를 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티니트로 이루어진 군으로부터 선택된 사카라이드의 존재 하에 동결건조시키는 방법.

C200. C181 내지 C199 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가

(1) 활성화된 폴리사카라이드를 담체 단백질과 배합하는 단계, 및

(2) 배합된 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 환원제와 반응시켜 GBS 피막 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체를 형성하는 단계

를 포함하는 것인 방법.

C201. C200에 있어서, 단계 (2)에서의 활성화된 폴리사카라이드의 농도가 약 0.1 mg/mL 내지 약 10.0 mg/mL인 방법.

C202. C200 또는 C201에 있어서, 활성화된 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 초기 비 (중량 대 중량)가 5:1 내지 0.1:1인 방법.

C203. C200 내지 C202 중 어느 하나에 있어서, 환원제가 소듐 시아노보로히드라이드, 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, 브뢴스테드 또는 루이스 산의 존재 하에서의 소듐 또는 징크 보로히드라이드, 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-디보란-메탄올, 디메틸아민-보란, t-BuMeⁱPrN-BH₃, 벤질아민-BH₃ 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란 (PEMB)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

C204. C203에 있어서, 환원제가 소듐 시아노보로히드라이드인 방법.

C205. C200 내지 C204 중 어느 하나에 있어서, 환원제의 양이 약 0.1 내지 약 10.0 몰 당량인 방법.

C206. C200 내지 C205 중 어느 하나에 있어서, 단계 (2)의 환원 반응의 지속기간이 1시간 내지 60시간인 방법.

C207. C200 내지 C206 중 어느 하나에 있어서, 환원 반응의 온도가 10℃ 내지 40℃로 유지되는 것인 방법.

C208. C181 내지 C207 중 어느 하나에 있어서, 보로히드라이드의 첨가에 의해 미반응 알데히드를 캡핑하는 단계 (단계 (c))를 추가로 포함하는 방법.

C209. C208에 있어서, 보로히드라이드의 양이 약 0.1 내지 약 10.0 몰 당량인 방법.

C210. C208에 있어서, 보로히드라이드가 소듐 보로히드라이드 (NaBH₄), 소듐 시아노보로히드라이드, 리튬 보로히드라이드, 포타슘 보로히드라이드, 테트라부틸암모늄 보로히드라이드, 칼슘 보로히드라이드 및 마그네슘 보로히드라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

C211. C292에 있어서, 보로히드라이드가 소듐 보로히드라이드 (NaBH₄)인 방법.

C212. C207 내지 C211 중 어느 하나에 있어서, 캡핑 단계의 지속기간이 0.1시간 내지 10시간인 방법.

C213. C207 내지 C212 중 어느 하나에 있어서, 캡핑 단계의 온도가 약 15℃ 내지 약 45℃로 유지되는 것인 방법.

C214. C181 내지 C213 중 어느 하나에 있어서, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

C215. C181 내지 C214 중 어느 하나에 있어서, 폴리사카라이드-단백질 접합체가 폴리사카라이드의 총량에 비해 약 40% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함하는 것인 방법.

C216. C181 내지 C215 중 어느 하나에 있어서, 접합체 중 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 비 (중량 대 중량)가 약 0.5 내지 약 3.0인 방법.

C217. C181 내지 C216 중 어느 하나에 있어서, 접합체의 접합도가 2 내지 15인 방법.

C218. (a) 단리된 GBS 피막 폴리사카라이드를 산화제와 반응시키는 단계;

(b) 켄칭제의 첨가에 의해 단계 (a)의 산화 반응을 켄칭하여 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드를 생성하는 단계;

(d) 배합된 활성화된 GBS 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 환원제와 반응시켜 GBS 피막 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체를 형성하는 단계; 및

를 포함하며, 여기서 단계 (c) 및 (d)는 DMSO 중에서 수행하는 것인, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.

C219. 담체 단백질에 접합된 B군 스트렙토코쿠스 (GBS)로부터의 피막 폴리사카라이드 및 알루미늄-기재 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물.

C220. C219에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트가 인산알루미늄, 알루미늄 히드록실 포스페이트 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C221. C219 또는 C220에 있어서, 아주반트가 인산알루미늄인 면역원성 조성물.

C222. C219 또는 C220에 있어서, 아주반트가 수산화알루미늄인 면역원성 조성물.

C223. C219 내지 C222 중 어느 하나에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트가 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C224. C223에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트가 약 0.5 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C225. C219 내지 C224 중 어느 하나에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

C226. C219 내지 C225 중 어느 하나에 있어서, 6가 GBS 접합체 조성물인 면역원성 조성물.

C227. C225에 있어서, GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물.

C228. C219 내지 C227 중 어느 하나에 있어서, 시린지에 충전되는 면역원성 조성물.

C229. C228에 있어서, 시린지가 유리인 면역원성 조성물.

C230. C219 내지 C229 중 어느 하나에 있어서, 약 1 mm 내지 약 15 mm의 헤드스페이스를 갖는 시린지에 충전되는 면역원성 조성물.

C231. C230에 있어서, 약 2 mm 내지 약 6 mm의 헤드스페이스를 갖는 시린지에 충전되는 면역원성 조성물.

C232. C219 내지 C231 중 어느 하나에 있어서, 약 50회 이하의 진탕으로 재현탁되는 면역원성 조성물.

C233. C232에 있어서, 약 10회 이하의 진탕으로 재현탁되는 면역원성 조성물.

C234. C219 내지 C233 중 어느 하나에 있어서, 포스페이트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C235. C234에 있어서, 포스페이트가 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C236. C235에 있어서, 포스페이트가 약 20 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C237. C219 내지 C236 중 어느 하나에 있어서, 염화나트륨을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C238. C219 내지 C237 중 어느 하나에 있어서, 염화나트륨이 약 10 mM 내지 약 350 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C239. C238에 있어서, 염화나트륨이 약 225 mM 내지 약 265 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C240. C239에 있어서, 염화나트륨이 약 240 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C241. C219 내지 C238 중 어느 하나에 있어서, 염화나트륨이 약 200 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C242. C241에 있어서, 염화나트륨이 약 150 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.

C243. C219 내지 C242 중 어느 하나에 있어서, 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml의 총 접합체 용량을 포함하는 면역원성 조성물.

C244. C243에 있어서, 총 접합체 용량이 약 120 mg/ml 내지 약 240 mcg/ml인 면역원성 조성물.

C245. C219 내지 C244 중 어느 하나에 있어서, 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는 면역원성 조성물.

C246. C245에 있어서, 약 7.0의 pH를 갖는 면역원성 조성물.

C247. 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 인산알루미늄, 약 15 mM 내지 약 25 mM의 포스페이트, 약 225 mM 내지 약 265 mM의 염화나트륨, 및 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml의 총 접합체 용량을 포함하며, 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는 면역원성 조성물.

C248. 약 0.25 mg/ml 내지 약 0.75 mg/ml의 수산화알루미늄, 약 15 mM 내지 약 25 mM의 포스페이트, 약 120 mM 내지 약 170 mM의 염화나트륨, 및 약 60 mcg/ml 내지 약 360 mcg/ml의 총 접합체 용량을 용량을 포함하며, 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는 면역원성 조성물.

C249. C219 내지 C248 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.

C250. C219 내지 C249 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 GBS에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.

C251. C250에 있어서, 대상체가 임신 계획 중인 여성 또는 임신한 여성인 면역원성 조성물.

C252. C251에 있어서, 여성이 임신 후반기인 면역원성 조성물.

C253. C252에 있어서, 임신한 여성이 임신 적어도 20주인 면역원성 조성물.

C254. C253에 있어서, 임신한 여성이 임신 27주 내지 36주인 면역원성 조성물.

C255. C250에 있어서, 대상체가 50세 이상의 성인인 면역원성 조성물.

C256. C255에 있어서, 대상체가 65세 이상의 성인인 면역원성 조성물.

C257. C256에 있어서, 대상체가 85세 이상의 성인인 면역원성 조성물.

C258. C250 내지 C257 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 면역손상된 것인 면역원성 조성물.

C259. C258에 있어서, 대상체가 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 갖는 것인 면역원성 조성물.

C260. C250 내지 C259 중 어느 하나에 있어서, B군 스트렙토코쿠스가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에인 면역원성 조성물.

C261. 대상체에게 유효량의 C219 내지 C248 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, B군 스트렙토코쿠스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.

C262. 대상체에게 유효량의 C219 내지 C248 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 B군 스트렙토코쿠스와 연관된 질환 또는 상태를 예방하거나 감소시키는 방법.

C263. C261 또는 C262에 있어서, 대상체가 임신 계획 중인 여성 또는 임신한 여성인 방법.

C264. C263에 있어서, 여성이 임신 후반기인 방법.

C265. C263 또는 C264에 있어서, 임신한 여성이 임신 적어도 20주인 방법.

C266. C263 내지 265 중 어느 하나에 있어서, 임신한 여성이 임신 27주 내지 36주인 방법.

C267. C261 또는 C262에 있어서, 대상체가 50세 이상의 성인인 방법.

C268. C267에 있어서, 대상체가 65세 이상의 성인인 방법.

C269. C267 또는 C268에 있어서, 대상체가 85세 이상의 성인인 방법.

C270. C261 내지 C269 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 면역손상된 것인 방법.

C271. C270에 있어서, 대상체가 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 갖는 것인 방법.

C272. C261 내지 C271 중 어느 하나에 있어서, B군 스트렙토코쿠스가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에인 방법.

C273. 대상체에게 C219 내지 C248 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.

C274. C273의 방법에 의해 생산된 항체.

C275. (a) C219 내지 C248 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 사용하여 항체 제제를 생성하는 단계; 및

를 포함하는, 대상체에게 수동 면역을 부여하는 방법.

Claims

폴리사카라이드-담체 단백질 접합체를 포함하는 6가 면역원성 조성물이며, 여기서
(i) 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 B군 스트렙토코쿠스 (GBS)의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 혈청형은 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV 및 V를 포함하고, 여기서 담체 단백질은 CRM₁₉₇이고, 여기서 각각의 접합체는 60% 초과의 시알산 수준을 갖고;
(ii) 면역원성 조성물은 염화나트륨, 히스티딘 및 폴리소르베이트-80을 추가로 포함하는 것인,
폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 6가 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제2항에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트가 인산알루미늄, 알루미늄 히드록실 포스페이트 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
제3항에 있어서, 아주반트가 인산알루미늄인 면역원성 조성물.
제3항에 있어서, 아주반트가 수산화알루미늄인 면역원성 조성물.
제2항에 있어서, 알루미늄-기재 아주반트가 0.25 mg/ml 내지 0.75 mg/ml, 또는 0.5 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 시린지에 충전되는 면역원성 조성물.
제7항에 있어서, 시린지가 유리인 면역원성 조성물.
제7항에 있어서, 1 mm 내지 15 mm, 또는 2 mm 내지 6 mm의 헤드스페이스를 갖는 시린지에 충전되는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 50회 이하, 또는 10회 이하의 진탕으로 재현탁되는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포스페이트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제11항에 있어서, 포스페이트가 15 mM 내지 25 mM, 또는 20 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨이 10 mM 내지 350 mM, 225 mM 내지 265 mM, 240 mM, 200 mM, 또는 150 mM의 농도로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 60 mcg/ml 내지 360 mcg/ml, 또는 120 mg/ml 내지 240 mcg/ml의 총 접합체 용량을 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 6.5 내지 7.5의 pH를 갖는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 GBS에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
제17항에 있어서, 대상체가 50세 이상의 성인인 면역원성 조성물.
제17항에 있어서, 대상체가 면역손상된 것인 면역원성 조성물.
제17항에 있어서, 대상체가 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 갖는 것인 면역원성 조성물.
제17항에 있어서, B군 스트렙토코쿠스가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae)인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 B군 스트렙토코쿠스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 패혈증, 폐렴 및 수막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 B군 스트렙토코쿠스와 연관된 질환 또는 상태를 예방하거나 감소시키기 위한 면역원성 조성물.
제22항에 있어서, 대상체가 50세 이상의 성인인 면역원성 조성물.
제22항에 있어서, 대상체가 면역손상된 것인 면역원성 조성물.
제23항에 있어서, 대상체가 비만, 당뇨병, HIV 감염, 암, 심혈관 질환 또는 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 의학적 상태를 갖는 것인 면역원성 조성물.
제22항에 있어서, B군 스트렙토코쿠스가 스트렙토코쿠스 아갈락티아에인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 생산하기 위한 면역원성 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제