CN110049776A - 包含衍生自b族链球菌gbs的多糖的缀合蛋白质的免疫原性多糖 - Google Patents

包含衍生自b族链球菌gbs的多糖的缀合蛋白质的免疫原性多糖 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫原性组合物，包含缀合至载体蛋白质的来自一般称为B族链球菌(GBS)的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的荚膜多糖(CP)，和任选地包括铝基佐剂。本发明还涉及用本文公开的组合物在受试者中诱导对GBS的免疫应答和/或在受试者中减少或预防侵入性GBS疾病的方法。所得抗体能够经由被动免疫治疗用来治疗或预防GBS感染。

Description

包含衍生自B族链球菌GBS的多糖的缀合蛋白质的免疫原性 多糖
发明领域
本发明涉及免疫原性组合物，包含缀合至载体蛋白质的来自一般称为B族链球菌(GBS)的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的荚膜多糖(CP)和任选地包括铝基佐剂。本发明还涉及用本文公开的组合物在受试者中诱导对GBS的免疫应答和/或在受试者中减少或预防侵入性GBS疾病的方法。所得抗体能够经由被动免疫治疗用来治疗或预防GBS感染。
发明背景
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是革兰氏阳性的多糖包囊的有机体，其也称为B族链球菌(GBS)。它们是人类胃肠道和生殖道的常见共生体并且还导致婴儿和较老成人严重疾病(Baker,C.J.,Vaccine,31(Suppl.4):D3-D6(2013))。婴儿GBS感染的主要风险因素是母体定殖(Dillon,H.C.,et al.,J.Pediatr.,110(1):31-36(1987))。由于四分之一的女性直肠-阴道携带GBS，其能够在分娩之前或期间感染羊水或婴儿导致脓毒症，肺炎和脑膜炎(Baker 2013；Heath,P.T.,et al.,BMJ Clin.Evid.(Online),pii:0323(2014))。经GBS脑膜炎存活的百分之二十五的婴儿罹患神经病学病损，其中19％经历认知延缓，大脑性瘫痪，失明和听力缺失(Libster,R.,et al.,Pediatrics,130(1):e8-152012(2012))。GBS还能够导致流产和早产并且与死产有关(McDonald,H.M.,et al.,Infect.Dis.Obstetr.Gynecol.,8(5-6):220-227(2000)；Randis,T.M.,et al.,J.Infect.Dis.,210(2):265-273(2014):Kessous,R.,et al.,J.Matern.Fetal NeonatalMed.,25(10):1983-1986(2012))。极低出生体重儿的感染风险显著更高、多至3％感染且死亡率多至30％，即使立即进行抗生素治疗(Heath 2014)。
20世纪90年代在U.S.引入GBS筛选和产间抗生素预防(IAP)展示降低的生命第一周的新生儿发病率(早期发作疾病[EOD])，但是对于此后生命首3个月出现的晚期发作疾病(LOD)具有不可测量的影响。在U.S.EOD和LOD病例的比率目前分别是0.25和0.27每1,000次出生(Centers for Disease Control and Prevention(CDC),Active Bacterial Core(ABC)Surveillance Report(2013)，可在http://www.cdc.gov/abcs/reports-findings/survreports/gbs13.pdf获得)。在引入肺炎球菌缀合物疫苗预防侵入性肺炎球菌疾病包括菌血症和脑膜炎、并且尽管进行IAP预防GBS疾病之后，GBS已成为U.S.婴儿的新生儿脓毒症(EOD)和脑膜炎(<2mo)唯一最为常见的病因(Verani,J.R.,et al.,MMWR,59(RR10):1-32(2010)；Thigpen,M.C.,et al.,N.Engl.J.Med.,364(21):2016-2025(2011))。不同于U.S.，在荷兰或U.K.引入对侵入性GBS疾病的预防指南和IAP并未降低EOD发生率(Bekker,V.,etal.,The Lancet Infectious Dis.,14(11):1083-1089(2014)；Lamagni,T.L.,et al.,Clin.Infect.Dis.,57(5):682-688(2013))。该效果缺乏可以是由于缺少一般筛选和将IAP限制于最高风险组的母亲(例如发热、延长的破裂膜)。EOD率在不使用IAP的国家中显著较高，其平均发生率报告为0.75每1,000此活产(95％CI 0.58-0.89)(Edmond,K.M,et al.,Lancet,379(9815):547-556(2012))。
具有GBS疾病风险的又一人群是老年人。风险因素包括慢性医学问题比如糖尿病，癌症，心力衰竭，神经病学病况，和泌尿外科学病况。根据CDC ABC监视数据，在U.S.侵入性GBS在2013的年发生率是在≥65岁的成人中12,400例/年或0.28/1,000成人。该比率逼近侵入性肺炎球菌疾病在老年人中的发生率(vs.0.30/1,000，>65)。这些比率预期将继续在U.S.和欧洲升高(CDC 2013；Lamagni 2013)。
在婴儿和老年人中预防GBS疾病的一个途径是使用基于多糖的疫苗。在U.S.实施母体GBS预防性疫苗具有在婴儿中预防GBS疾病的潜力，无论是否使用IAP。尽管多糖本身能够是免疫原性，多糖与蛋白质载体的缀合已被用来改善免疫原性，特别在婴儿和老年人中。多糖-蛋白质缀合物疫苗用一般来自细菌表面外壳的多糖与蛋白质载体连接来制备。多糖-蛋白质缀合物-诱导对表面展示疫苗所含多糖的细菌的免疫应答，从而预防疾病。相应地，用来自病原细菌的多糖缀合物接种是促进宿主免疫的有效策略。
覆盖细菌的多糖显著变化，甚至在单个细菌种类中如此。例如，在GBS中存在十种不同血清型，原因是细菌多糖荚膜的变化。因此，希望基于多糖的疫苗由一组多糖组成以确保对不同的循环血清型的覆盖宽度。
载体蛋白质能够是来自靶标病原物的有关蛋白质抗原，促进对该病原物的特异性免疫应答；或一般免疫原性的蛋白质，其更多是充当佐剂或一般免疫应答刺激剂。
GBS血清型Ia，Ib，II，III和V的单独一价多糖-蛋白质缀合物已在1和2期临床试验中在非怀孕成人中评价(Brigtsen,A.K.,et al.,J.Infect.Dis.,185(9):1277-1284(2002)；Baker,C.J.,et al.,J.Infect.Dis.,188(1):66-73(2003)；Baker,C.J.,et al.,J.Infect.Dis.,189(6):1103-1112(2004)；Baker,C.J.,et al.,Vaccine,25(1):55-63(2007))。二价的II-TT和III-TT糖缀合物疫苗和包含Ia-CRM197，Ib-CRM197和III-CRM197糖缀合物的三价疫苗也已有研究(Baker 2003；Clicaltrials.gov NCT01193920,NCT01412801,和NCT01446289)。然而，GBS疫苗仍未获批准。
此外，虽然三价疫苗覆盖>90％的在南非导致新生儿疾病的侵入性品系(Madzivhandila,M.,et al.,PloS One,6(3):e17861(2011))，但是基于对最近新生儿分离物的监视，这些相同血清型在北美和欧洲分别代表仅62％和66％的侵入性分离物，所述分离物来自Tigecycline Evaluation and Surveillance Trial在2004-2013年从全球收集的901个样品(T.E.S.T.,http://www.testsurveillance.com/)。
分析得自T.E.S.T.样品的品系显示95％的收集品系属于五种记载的主要血清型(Ia，Ib，II，III和V)之一而另外3％是血清型IV。一系列的公开也已确认血清型IV在最近十年出现在美洲和欧洲(Diedrick,M.J.,et al.,J.Clin.Microbiol.,48(9):3100-3104(2010)；Teatero(2014)；Meehan,M.et al.,Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.,33(7):1155-1162(2014)；Florindo,C.,et al.,Euro Surveillance:Bulletin European surles Maladies Transmissibles(European Communicable Disease Bulletin),19(23)(2014)；Palmiero,J.K.,et al.,J.Clin.Microbiol.,48(12):4397-4403(2010))。调查成人直肠/阴道携带(向婴儿传播GBS的风险因素)的研究，也发现97％的分离物属于这六种血清型之一，其中血清型IV代表～4％的频率。该研究设计用来监测β-溶血性链球菌(包括GBS)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在健康美国成人中的携带(参见Matson,M.A.,et al,ICAAC,Abstract I-306(Washington,DC,9月.5-9,2014))。
类似地，分析T.E.S.T.样品显示98％的来自≥65岁的较老成人的U.S.血液分离物属于相同的六种优势血清群。在老年人分离物与其它群体之间最显著的差异是血清群分布。来自老年患者的分离物中，血清型V品系构成最大组(34％vs.18％新生儿或18％成人携带品系)。
其它研究已发现血清型优势存在地理差异。例如，血清型VI和VIII分离物已显示优势定殖于日本的健康怀孕女性中(Lachenauer,C.S.,et al.,J.Infect.Dis.,179(4):1030-1033(1999)。
因此，需要多糖-蛋白质缀合物疫苗或单克隆抗体来赋予被动免疫，其充当在全世界的宽范围人群中预防或治疗GBS疾病的手段，包括由兴起中的血清型IV引起的那些。此外，需要所述疫苗或免疫原性组合物是稳定的并且可容易地再悬浮于本领域已知的任何容器当中。
发明概要
本发明涉及新的免疫原性组合物，包含GBS多糖-蛋白质缀合物和任选地包括佐剂。下述内容描述本发明的某些方面和实施方式。
在一个方面，本发明涉及免疫原性组合物，包含缀合至载体蛋白质的来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖和任选地铝基佐剂。在一种实施方式中，铝基佐剂选自磷酸铝，羟基磷酸铝，和氢氧化铝。在一种所述实施方式中，铝基佐剂的浓度是约0.25mg/ml至约0.75mg/ml。
在又一实施方式中，荚膜多糖选自血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII和IX。在又一实施方式中，免疫原性组合物是六价GBS缀合物组合物。在一种所述实施方式中，免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V的荚膜多糖。
在又一实施方式中，本发明涉及包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)和选自血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII和IX的荚膜多糖；和所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂，缓冲剂，稳定剂，佐剂，冷冻保护剂，盐，二价阳离子，非离子洗涤剂，自由基氧化抑制剂，载体或其混合物中的一种或多种。
在又一实施方式中，本发明涉及如本文描述的免疫原性组合物，其中荚膜多糖单独地缀合至相同的载体蛋白质。
在本发明的又一方面，将免疫原性组合物充入注射器。在一种实施方式中，注射器是玻璃质的。在又一实施方式中，将免疫原性组合物充入具有约1mm至约15mm顶部空间的注射器。
在本发明的又一方面中，免疫原性组合物在约50次或更少的振摇内再悬浮。
在一种实施方式中，免疫原性组合物还包含磷酸。在一种所述实施方式中，磷酸的浓度是约15mM至约25mM。
在又一实施方式中，免疫原性组合物还包含氯化钠。在一种所述实施方式中，氯化钠的浓度是约10mM至约350mM。
在又一实施方式中，免疫原性组合物包含约60mcg/ml至约360mcg/ml的总缀合物剂量。
在额外的实施方式中，免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含约0.25mg/ml至约0.75mg/ml磷酸铝，约15mM至约25mM磷酸，约225mM至约265mM氯化钠，和约60mcg/ml至约360mcg/ml的总缀合物剂量，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
在本发明的又一方面，免疫原性组合物包含约0.25mg/ml至约0.75mg/ml氢氧化铝，约15mM至约25mM磷酸，约120mM至约170mM氯化钠，和约60mcg/ml至约360mcg/ml的总缀合物剂量，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
本发明的又一方面涉及诱导对GBS的免疫应答的方法，包括向受试者给予有效量的如本文描述的免疫原性组合物。在一种实施方式中，本发明涉及在受试者中预防或减少与GBS有关的疾病或病况的方法，包括向受试者给予有效量的本文描述的免疫原性组合物。在特别的实施方式中，受试者是计划怀孕的女性或怀孕的女性。在一种所述实施方式中，怀孕的女性处于怀孕的后半程，比如至少处于20周或至少27周妊娠。在优选的实施方式中，怀孕的女性处于27周至36周妊娠。在又一实施方式中，受试者是较老的成人，比如50岁或更老、65岁或更老和85岁或更老的成人。在又一实施方式中，受试者是免疫受损的。在一个方面，受试者可以具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病或肝病。在优选的实施方式中，B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
本发明的额外方面涉及本发明免疫原性组合物中结合至荚膜多糖的抗体。在某些实施方式中，在将免疫原性组合物给予受试者的情况下产生抗体。在又一方面涉及包含本发明抗体的组合物。
本发明的又一方面涉及将被动免疫赋予受试者的方法，包括下述步骤：(a)用本文描述的免疫原性组合物产生抗体制剂；和(b)将所述抗体制剂给予受试者以赋予被动免疫。
附图说明
图1：比较来自用GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197一价疫苗免疫的小鼠的血清和分离IgG的调理活性。
图2：在50℃加速储存(4周)后GBS Ia-CRM197的稳定性(用分子量％变化显示，使用SEC MALLS)。
图3：在50℃加速储存(4周)后GBS Ib-CRM197的稳定性(用分子量％变化显示，使用SEC MALLS)。
图4：在50℃加速储存(4周)后GBS II-CRM197的稳定性(用分子量％变化显示，使用SEC MALLS)。
图5：在50℃加速储存(4周)后GBS III-CRM197的稳定性(用分子量％变化显示，使用SEC MALLS)。
图6：在50℃加速储存(4周)后GBS IV-CRM197的稳定性(用分子量％变化显示，使用SEC MALLS)。
图7：在50℃加速储存(4周)后GBS V-CRM197的稳定性(用分子量％变化显示，使用SEC MALLS)。
图8：在37℃储存后GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS III-CRM197和GBS IV-CRM197的稳定性(用游离唾液酸显示)。
图9：六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)的pH稳定性，用琥珀酸作缓冲剂。
图10：六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)的pH稳定性，用组氨酸作缓冲剂。
图11：六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)中组氨酸缓冲剂浓度对GBS缀合物与剂量10mcg/ml的铝结合的效果。
图12：六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)的组氨酸缓冲剂浓度对GBS缀合物与剂量40mcg/ml的铝结合的效果。
图13：六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)的聚山梨醇-80浓度对搅动压力的情况下总抗原性百分比损失的效果。
图14：六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)的铝浓度对GBS缀合物结合至铝的效果。
图15：在10mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)中的5.5％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图16：在10mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的7.0％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图17：在10mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的8.5％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图18：在50mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的5.5％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图19：在50mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的7.0％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图20：在50mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的8.5％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图21：在40mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的7.0％(w/v)蔗糖对各血清型抗原性恢复的效果。
图22：在40mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的2.0％(w/v)蔗糖和4.0％(w/v)甘露醇对各血清型抗原性恢复的效果。
图23：在40mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的3.0％(w/v)蔗糖和3.0％(w/v)甘露醇对各血清型抗原性恢复的效果。
图24：在40mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的2.0％(w/v)蔗糖和4.0％(w/v)甘氨酸对各血清型抗原性恢复的效果。
图25：在40mcg/ml剂量的冻干六价GBS疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBSII-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197，和GBS V-CRM197)中的3.0％(w/v)蔗糖和3.0％(w/v)甘氨酸对各血清型抗原性恢复的效果。
图26：GBS6和一价配制剂以高剂量和低剂量储存在PFS中以顶端倒置取向在0、2周和3个月时间的再悬浮比较。
图27：GBS6和一价配制剂以高剂量和低剂量储存在PFS中以顶端倒置取向和水平取向的再悬浮比较。
图28：AlPO4的Zeta电势随pH的变化。
图29：GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V缀合物的Zeta电势随pH的变化。
图30：不同的GBS6和一价配制剂以高剂量和低剂量储存在pFS中以顶端倒置取向在0、2周和3个月时间的沉降速率比较。
图31：GBS6配制剂沉降速率随剂量水平(每血清型的浓度)的变化。
图32：GBS6配制剂沉降速率在低剂量(60mcg/mL)和高剂量(240mcg/mL)随pH的变化。
图33：剂量和NaCl浓度对沉降速率的效果。
图34：不同抗原配制剂在45分钟之后的沉降行为比较。
图35A：不同抗原配制剂的详细颗粒尺寸分布。
图35B：不同抗原配制剂的颗粒尺寸分布，归类为≥10μm或≥25μm。
图36：在变化顶部空间的PFS中的GBS6配制剂。
图37：以水平位置储存2周之后再悬浮具有变化浓度AlPO4的高剂量GBS6配制剂所需的振摇次数。
图38：以水平位置储存2周之后GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V缀合物与变化浓度的AlPO4的结合。
图39：不同的絮凝剂和铝盐对再悬浮的效果。
图40：不同的絮凝剂和铝盐对沉降速率的效果。
图41：NaCl浓度对高剂量GBS6配制剂再悬浮时间的效果。
图42：NaCl和磷酸根离子的组合对再悬浮时间的效果。
图43A：NaCl和磷酸钾浓度对在2小时之后沉降的效果。
图43B：NaCl和磷酸钾浓度对在30分钟之后沉降的效果。
图44：包含20mM磷酸和240mM NaCl的GBS6配制剂的百分比结合抗原性，与对照GBS6配制剂比较。
图45：对于最佳的和稳健的配制条件的预测刻划器推荐，其促进更容易的再悬浮(≤10次振摇)。
图46：基于预测刻划器推荐的GBS6配制剂的百分比结合抗原性。
图47：GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V与变化浓度的Al(OH)3的结合。
发明详述
应理解本发明并不局限于所描述的特别方法和实验条件，原因是所述方法和条件可以变化。还应理解本文所用的术语仅用于描述特别实施方式的意图，而并非意在限制。
尽管在本发明实践或测试中能够使用与本文描述的那些相似或等价的任何方法和物质，现描述优选的方法和物质是。本文提及的全部公开通过援引全部并入本文。
本文所用的术语具有本领域技术人员承认和已知的含义，然而为了方便和完整性，在下文和整个说明书中描述特别的术语及其含义。
如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式"一"、"一个"和"一种"包括其复数，除非上下文清楚地另有所指。从而，例如提及"一种方法"包括一种或多种方法和/或步骤，其是本文描述类型和/或在参阅本公开后对本领域技术人员变得明显类型等。
术语"约"或"大约"意指一个数值的有统计学意义的范围。上述范围能够在给定值或范围的一个数量级之内，一般在20％以内，更一般在10％以内，和甚至更一般在5％以内。术语"约"或"大约"涵盖的所允许的变化取决于研究的具体系统，并且能够由本领域普通技术人员容易地认识到。只要在本申请中描述范围，在该范围内的每个整数也预期是本发明的实施方式。
在本公开中，术语比如"包含"，"包含的"，"包括"，"含有"，"涵盖"等能够具有U.S.专利法赋予的含义；例如，它们能够意指"包括"，"包括的"，"囊括"等。所述术语是指包含入特别成分或一组成分而不排除任何其它成分。术语比如"基本上由...组成"和"基本上由...组成的"具有U.S.专利法赋予的含义，例如，它们允许包含入不减损本发明新或基础特征的额外成分或步骤，也即，它们排除减损本发明新或基础特征的额外的未描述成分或步骤，和它们排除现有技术比如本文引用的或通过援引并入本文的本领域文献的成分或步骤，特别是因为本文的目的是定义相对现有技术例如相对本文引用的或通过援引并入本文的文献可专利的例如新的、非显而易见的、创造性的实施方式。并且，术语"由...组成"和"由...组成的"具有U.S.专利法赋予的含义；亦即这些术语是封闭式的。相应地，这些术语是指包含入特别成分或一组成分并且排除全部其它成分。
术语"抗原"一般地是指生物学分子，通常是蛋白质、肽、多糖、脂质或缀合物，其含有同源抗体能够选择性结合的至少一个表位；或在某些情况下，是指免疫原性物质，其能够在动物中刺激抗体产生或T-细胞应答或两者，包括注射或吸收至动物中的组合物。免疫应答可以对整个分子，或对分子的一个或多个不同部分(例如表位或半抗原)产生。术语可以用来指单独分子或指均质或异质群体的抗原分子。抗原被抗体、T细胞抗原受体或特定体液和/或细胞免疫的其它要素识别。术语"抗原"包括全部有关的抗原表位。给定抗原的表位能够用任何数量的本领域熟知的表位测绘技术来鉴定(参见例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,NJ)。例如，线性表位可以确定如下：例如在固体载体上同时合成大量肽，所述肽相应于蛋白质分子部分，和在肽仍连接至载体的情况下将所述肽与抗体反应。所述技术是本领域已知的和描述于例如U.S.专利号4,708,871；Geysen,H.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998-4002(1984)；Geysen,H.M.,et al.,Molec.Immunol.,23(7):709-715(1986)，全部通过援引整体并入本文。类似地，构象表位可以鉴定如下：比如通过例如X射线晶体学和2维核磁共振确定氨基酸的空间构象(参见例如上文所述之Epitope Mapping Protocols)。另外，出于本发明意图，"抗原"还可以用来指包括天然序列的修饰比如缺失、添加和取代(一般是保守的但可以是非保守的)的蛋白质，只要该蛋白质维持引起免疫学应答的能力。这些修饰可以是有意的，例如通过位点引导的诱变，或通过特别合成程序，或通过基因工程改造途径；或者可以是偶然的，比如通过宿主突变，其产生抗原。另外，抗原能够是从微生物例如细菌衍生、获得或分离的，或者能够是整个有机体。类似地，比如在核酸免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在定义当中。也包括合成抗原例如多表位、侧翼表位，和其它重组或合成衍生的抗原(Bergmann,C.,et al.,Eur.J.Immunol.,23(11):2777-2781(1993)；Bergmann,C.C.,et al.,J.Immunol.,157(8):3242-3249(1996)；Suhrbier,A.,Immunol.and Cell Biol.,75(4):402-408(1997))。
可互换使用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"是指药物组合物，包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫原性组合物。
荚膜多糖
如本文所用，术语"糖类"是指单个糖部分或单糖单元以及两个或更多个单个糖部分的组合或共价连接形成二糖、低聚糖和多糖的单糖单元。术语"糖类"可以与术语"碳水化合物"可互换地使用。多糖可以是线性或支化的。
"单糖"如本文所用是指低聚糖中的单个糖残基。术语"二糖"如本文所用是指由通过糖苷键一起连接的两个单糖单元或部分构成的多糖。
在一种实施方式中，多糖是低聚糖(OS)。"低聚糖"如本文所用是指含有两个或更多个单糖单元或部分的化合物。在低聚糖的上下文中，单独的单体单元或部分是单糖，其是或能够是通过羟基结合至又一单糖单元或部分的。低聚糖能够通过从保护的单个残基糖化学合成或通过化学降解生物学制备的多糖来制备。另选地，低聚糖可以通过体外酶法制备。
在优选的实施方式中，多糖PS是指至少5个单糖单元或部分的线性或支化的聚合物。清楚起见，其中n大于约5、比如大于约10的较大重复单元数在本文称为多糖。
在一种实施方式中，多糖是细胞表面多糖。细胞表面多糖是指多糖，具有位于最外层的细菌细胞膜或细菌细胞表面(包括肽聚糖层、细胞壁和荚膜)的至少一个部分。一般来说，细胞表面多糖与在体内诱导免疫应答有关。细胞表面多糖可以是"细胞壁多糖"或"荚膜多糖。"细胞壁多糖一般地在细菌表面形成不连续层。
在一种实施方式中，多糖是荚膜多糖。荚膜多糖是指糖聚合物，其包括通过糖苷连接部分联接的一个或多个单糖的重复单元。荚膜多糖一般在细菌细胞周围形成荚膜状层。"荚膜性多糖"或"荚膜多糖"是指多糖荚膜，其在链球菌的绝大多数分离物的细胞壁外部。例如，全部GBS荚膜多糖具有支化的重复结构，具有细菌毒力所需的末端α2-3-连接的唾液酸。荚膜相关的唾液酸(HPLC测试定量)已在>94％的体外培养的来自T.E.S.T.的侵入性新生儿分离物中被检测到。
发明人已发现GBS荚膜多糖的唾液酸水平是产生免疫应答的重要特征。在先公开仅提供虑及血清型V唾液酸水平的矛盾信息，发现去唾液酸的血清型V是优选的(国际专利申请公开No.WO 2012/035519)和对血清型V来说唾液酸含量>50％能够使用(国际专利申请公开No.WO 2014/053612)。然而，这些参考文献并未描述唾液酸水平对至少多数GBS多糖的免疫原性的重要性。发明人令人惊讶地发现，GBS荚膜多糖在缀合之前需要约60％或更多唾液酸来提供可与具有天然唾液酸水平(也即100％或大于约95％)的那些多糖比拟的免疫应答。甚至在先前对血清型V公开范围内的58％唾液酸水平负面地影响免疫原性。
相应地，在本发明的一种实施方式中，荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖可以去唾液酸多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，和多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)。
应注意100％唾液酸水平相应于约1.0mM唾液酸每mM多糖。因此，荚膜多糖可以具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
某些荚膜多糖(CP)血清型的末端唾液酸残基是部分O-乙酰化的(OAc)(Lewis,A.L.,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,101(30):11123-8(2004))。血清型Ib，III，IV，V，VI和IX是部分O-乙酰化的(多至～40％)，而血清型Ia，II和VII几乎不或不具有O-乙酰化(小于约5％)(Lewis 2004)。在本发明的一种实施方式中，荚膜多糖包含其天然O-乙酰化水平(约0％至约40％)。在又一实施方式中，荚膜多糖可以是去-O-乙酰化的(小于约5％)。多糖或低聚糖的O-乙酰化度能够通过本领域已知的任何方法确定，例如通过质子NMR(Lemercinier,X.,et al.,Carbohydrate Research,296:83-96(1996)；Jones,C.,et al.,Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,30:1233-1247(2002)；Int’l Patent Appl.Pub.Nos.WO 2005/033148和WO 00/56357)。又一常用方法描述于Hestrin,S.,J.Biol.Chem.,180:249-261(1949)。
另外，100％O-乙酸酯相应于约1.0mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。相应地，部分O-乙酰化的多糖包含至少约0.1，0.2，0.3，0.35或约0.4mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。去-O-乙酰化的多糖包含小于约0.01，0.02，0.03，0.04或0.05mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
能够导致侵入性疾病的链球菌微生物一般也能够产生包囊细菌并增强其抵抗宿主先天免疫系统清除的CP。CP的功能是将细菌细胞隐匿在保护性荚膜中，其使得细菌抵抗噬菌作用和细胞内杀灭。缺少荚膜的细菌更易受噬菌作用影响。荚膜多糖频繁地是许多细菌病原体的重要毒力因子，包括流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
荚膜多糖能够用来为特别种类的细菌血清分型。分型通常实现如下：与对荚膜多糖的特定结构或独特表位特征产生的单克隆抗体或特异性抗血清反应。存在10种GBS血清型：Ia，Ib，和II-IX(Ferrieri,P.,et al.,Emerg.Infect.Dis.[Internet],19(4)(2013)，可获得于http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/19/4/12-1572_article。
在本发明的一种实施方式中，多糖分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。多糖可以分离自无乳链球菌(S.agalactiae)的任何包囊品系，比如090，A909(ATCC保藏号BAA-1138)，515(ATCC保藏号BAA-1177)，B523，CJB524，MB 4052(ATCC保藏号31574)，H36B(ATCC保藏号12401)，S40，S42，MB 4053(ATCC保藏号31575)，M709，133，7357，PFEGBST0267，MB 4055(ATCC保藏号31576)，18RS21(ATCC保藏号BAA-1175)，S16，S20，V8(ATCC保藏号12973)，DK21，DK23，UAB，5401，PFEGBST0708，MB 4082(ATCC保藏号31577)，M132，110，M781(ATCC保藏号BAA-22)，D136C(3)(ATCC保藏号12403)，M782，S23，120，MB4316(M-732；ATCC保藏号31475)，M132，K79，COH1(ATCC保藏号BAA-1176)，PFEGBST0563，3139(ATCC保藏号49446)，CZ-NI-016，PFEGBST0961，1169-NT1，CJB111(ATCC保藏号BAA-23)，CJB112，2603V/R(ATCC保藏号BAA-611)，NCTC 10/81，CJ11，PFEGBST0837，118754，114852，114862，114866，118775，B 4589，B 4645，SS1214，CZ-PW-119，7271，CZ-PW-045，JM9130013，JM9130672，IT-NI-016，IT-PW-62，和IT-PW-64。
本文描述的多糖可以通过本领域已知的方法分离，包括例如本文描述的方法。如本文所用，"分离的"是指从特别来源获得和分开。术语"分离的"还是指并非处于其各自的天然形式、状态和/或环境。例如，"分离自链球菌"是指从链球菌细胞获得和分开的物质。分离的多糖并非天然的。术语"分离的"意指物质是从其初始环境(例如，如果其是天然的则是天然环境，或如果其是重组个体则是其宿主有机体，或从一个环境带至不同的环境)除去的。例如，"分离的"荚膜多糖、蛋白质或肽基本上不含细胞物质或来自细胞的其它污染性蛋白质或由其衍生蛋白质的组织来源，或者在化学合成或作为化学反应的一部分存在于混合物中的情况下基本上不含化学前体或其它化学品。在本发明中，蛋白质或多糖可以分离自细菌细胞或细胞碎屑，从而它们以用于制备免疫原性组合物的形式提供。术语"分离的"或"分离"可以包括纯化或净化，包括本领域已知的纯化分离多糖的方法和/或本文描述的方法。语言"基本上不含细胞物质"包括配制多肽/蛋白质，其中所述多肽/蛋白质与细胞的细胞组分分开，所述多肽/蛋白质是由所述细胞分离或重组产生的。从而，基本上不含细胞物质的荚膜多糖、蛋白质或肽包括荚膜多糖、蛋白质或肽的制剂，具有小于约30％，20％，10％，5％，2.5％，或1％(按干重计)的污染性蛋白质或多糖或其它细胞物质。在多肽/蛋白质重组产生的情况下，其也优选基本上不含培养基，即培养基占小于约20％，10％，或5％的蛋白质制剂体积。在多肽/蛋白质或多糖通过化学合成产生的情况下，其优选基本上不含化学前体或其它化学品，也即其与牵涉于蛋白质或多糖合成中的化学前体或其它化学品分开。相应地，所述多肽/蛋白质或多糖制剂具有小于约30％，20％，10％，5％(按干重计)的不同于有关多肽/蛋白质或多糖片段的化学前体或化合物。
在本发明的一种实施方式中，多糖分离自细菌。在本发明的又一实施方式中，多糖是重组产生的。在又一实施方式中，多糖是合成的或根据常规方法化学合成的。在本发明的又一实施方式中，多糖制备如下：在克隆和表达产生多糖的生物合成途径之后在代用物宿主中表达。在一种实施方式中，多糖是免疫原性的。例如，发明人发现本文描述的每个多糖能够诱导或引起免疫应答。术语"免疫原性"是指在哺乳动物中引发、触发、导致、增强、改善和/或扩大体液和/或细胞介导的免疫应答的能力。在一种实施方式中，哺乳动物是人，灵长类，兔，猪，小鼠等。
荚膜多糖的分子量用于免疫原性组合物中的一个考虑因素。高分子量荚膜多糖能够诱导某些抗体免疫应答，原因是表位的较高化合价存在于抗原表面。高分子量荚膜多糖的分离和纯化预期用于本发明的缀合物、组合物和方法中。
然而，在一种实施方式中，多糖的尺寸可以是低于在缀合至载体蛋白质之前的天然荚膜多糖分子量的分子量(MW)范围。纯化的荚膜多糖的尺寸被降低以便产生具有有利可过滤性特征和/或收率的缀合物。
在一种所述实施方式中，纯化的荚膜多糖的尺寸通过高压匀化降低。高压匀化通过将过程物流泵送通过充分小尺度的流路而实现高剪切速率。剪切速率通过使用较大的施加匀化压力来增加，而暴露时间能够通过将进料流再循环通过匀化器来增加。
在一种实施方式中，本文描述的多糖能够诱导调理活性。在又一实施方式中，本文描述的多糖能够诱导调理活性和吞噬性活性(例如调理吞噬性活性)。
调理活性或调理作用是指调理素(例如抗体或补体因子)借助其结合至抗原(例如本文描述的分离多糖)的过程，其促进抗原附着至吞噬细胞或吞噬性细胞(例如巨噬细胞，树突状细胞和多形核白细胞(PMNL)。某些细菌比如由于存在荚膜而一般不被吞噬的包囊细菌在包覆调理抗体的情况下变得更可能被吞噬细胞识别。在一种实施方式中，多糖诱导对例如调理的抗体的免疫应答。在一种实施方式中，调理活性针对革兰氏阳性球菌，优选针对链球菌种类，更优选针对至少一种无乳链球菌品系。
在又一实施方式中，本文描述的多糖能够诱导杀菌性免疫应答。在一种实施方式中，杀菌活性针对革兰氏阳性球菌，优选针对链球菌种类，更优选针对至少一种无乳链球菌品系。
测量调理作用、噬菌作用和/或杀菌活性的方法是本领域已知的，例如测量体内细菌载量的降低(例如测量链球菌种类攻击的哺乳动物中的菌血症水平)和/或测量体外细菌细胞杀灭(例如体外调理吞噬性测试)。在一种实施方式中，多糖与适当对照相比能够诱导调理活性、吞噬活性和/或杀菌活性，例如与针对热灭活的革兰氏阳性球菌喂养的抗血清相比。
血清型Ia
一种实施方式包括血清型Ia GBS荚膜多糖。血清型Ia的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型Ia荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约25kDa至约750kDa，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在一种优选实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约25kDa至约200kDa。在又一优选的实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约100kDa至约400kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在特别的实施方式中，高压匀化过程用来降低天然GBS荚膜多糖血清型Ia的尺寸，同时保持多糖的结构特征比如唾液酸。
在本发明的一种实施方式中，血清型Ia荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型Ia荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型Ia荚膜多糖是小于约5％O-乙酰化的。本发明血清型Ia荚膜多糖的一些示范性品系包括090，A909(ATCC保藏号BAA-1138)，515(ATCC保藏号BAA-1177)，B523，CJB524，和MB 4052(ATCC保藏号31574)。
血清型Ib
一种实施方式包括血清型Ib GBS荚膜多糖。血清型Ib的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型Ib荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约25kDa至约750kDa，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在一种优选实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约25kDa至约400kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型Ib荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型Ib荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型Ib荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型Ib荚膜多糖的一些示范性品系包括H36B(ATCC保藏号12401)，S40，S42，MB 4053(ATCC保藏号31575)，M709，133，7357，和PFEGBST0267。
血清型II
一种实施方式包括血清型II GBS荚膜多糖。血清型II的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型II荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约25kDa至约750kDa，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在一种优选实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约25kDa至约400kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型II荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型II荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型II荚膜多糖是小于约5％O-乙酰化的。本发明血清型II荚膜多糖的一些示范性品系包括MB 4055(ATCC保藏号31576)，18RS21(ATCC保藏号BAA-1175)，S16，S20，V8(ATCC保藏号12973)，DK21，DK23，UAB，5401，和PFEGBST0708。
血清型III
一种实施方式包括血清型III GBS荚膜多糖。血清型III的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型III荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约25kDa至约750kDa，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在一种优选实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约25kDa至约200kDa。在又一优选的实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约100kDa至约400kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在特别的实施方式中，高压匀化过程用来降低天然GBS荚膜多糖血清型III的尺寸，同时保持多糖的结构特征比如唾液酸。
在本发明的一种实施方式中，血清型III荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型III荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型III荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型III荚膜多糖的一些示范性品系包括MB 4082(ATCC保藏号31577)，M132，110，M781(ATCC保藏号BAA-22)，D136C(3)(ATCC保藏号12403)，M782，S23，120，MB 4316(M-732；ATCC保藏号31475)，M132，K79，COH1(ATCC保藏号BAA-1176)，和PFEGBST0563。
血清型IV
一种实施方式包括血清型IV GBS荚膜多糖。血清型IV的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型IV荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约25kDa至约750kDa，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在一种优选实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约25kDa至约400kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型IV荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型IV荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型IV荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型IV荚膜多糖的一些示范性品系包括3139(ATCC保藏号49446)，CZ-NI-016，和PFEGBST0961。
血清型V
一种实施方式包括血清型V GBS荚膜多糖。血清型V的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型V荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约25kDa至约750kDa，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在一种优选实施方式中，在缀合之前的荚膜多糖分子量是约25kDa至约400kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型V荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型V荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型V荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型V荚膜多糖的一些示范性品系包括1169-NT1，CJB111(ATCC保藏号BAA-23)，CJB112，2603V/R(ATCC保藏号BAA-611)，NCTC 10/81，CJ11，和PFEGBST0837。
血清型VI
GBS血清型VI荚膜多糖描述于von Hunolstein,C.,et al.,Infection andImmunity,6194):1272-1280(1993)，通过援引将其全部公开并入本文。血清型VI的结构能够描述如下：
a)
或
b)
在缀合之前的血清型VI荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型VI荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95poly％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型VI荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM糖类，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型VI荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型IIII荚膜多糖的一些示范性品系包括118754，114852，114862，114866，118775，B 4589，B 4645，SS1214，和CZ-PW-119。
血清型VII
GBS血清型VII荚膜多糖描述于Kogan,G.,et al.,Carbohydrate Research,277(1):1-9(1995)，通过援引将其全部公开并入本文。血清型VII的重复单元如下：
在缀合之前的血清型VII荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型VII荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型VII荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型VII荚膜多糖是小于约5％O-乙酰化的。本发明血清型VII荚膜多糖的一些示范性品系包括7271和CZ-PW-045。
血清型VIII
GBS血清型VIII荚膜多糖描述于Kogan,G.,et al.,The Journal of BiologicalChemistry,271(15):8786-8790(1996)，通过援引将其全部公开并入本文。血清型VIII的重复单元如下：
在缀合之前的血清型VIII荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型VIII荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型VIII荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型VIII荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型VIII荚膜多糖的一些示范性品系包括JM9130013和JM9130672。
血清型IX
GBS血清型IX荚膜多糖描述于Berti,F.,et al.,The Journal of BiologicalChemistry,289(34):23437-2348(2014)，通过援引将其全部公开并入本文。血清型IX的结构能够描述如下：
在缀合之前的血清型IX荚膜多糖分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在本发明的一种实施方式中，血清型IX荚膜多糖包含其天然唾液酸水平，比如约100％或大于约95％。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以是多至约40％(唾液酸化水平大于约60％)，比如多至约35％(唾液酸化水平大于约65％)，多至约30％(唾液酸化水平大于约70％)，多至约25％(唾液酸化水平大于约75％)，多至约20％(唾液酸化水平大于约80％)，多至约15％(唾液酸化水平大于约85％)，多至约10％(唾液酸化水平大于约90％)，或多至约5％(唾液酸化水平大于约95％)去唾液酸的。
在又一实施方式中，血清型IX荚膜多糖在缀合之前具有约1.0mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。在又一实施方式中，荚膜多糖在缀合之前可以具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖，比如至少约0.65mM唾液酸每mM多糖，至少约0.7mM唾液酸每mM多糖，至少约0.75mM唾液酸每mM多糖，至少约0.8mM唾液酸每mM多糖，至少约0.85mM唾液酸每mM多糖，至少约0.9mM唾液酸每mM多糖，或至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
血清型IX荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。在本发明的一种实施方式中，多糖是去-O-乙酰化的(也即，小于约5％O-乙酰化的)。本发明血清型IX荚膜多糖的一些示范性品系包括IT-NI-016，IT-PW-62和IT-PW-64。
多糖-蛋白质缀合物
如本文所用，"缀合物"包含通常希望范围的分子量的荚膜多糖和载体蛋白质，其中荚膜多糖缀合至载体蛋白质。缀合物可以或可以不含一定量的游离荚膜多糖。如本文所用，"游离荚膜多糖"是指荚膜多糖，其非共价地与缀合的荚膜多糖-载体蛋白质关联(也即非共价结合至其、吸附至其或包埋在其中或与其一起包埋)。术语"游离荚膜多糖"、"游离多糖"和"游离糖类"可以互换使用和期望传递相同含义。无论载体分子的性质，其能够直接或通过连接体缀合至荚膜多糖。如本文所用，"缀合"、"缀合的"和"缀合至"是指过程，细菌荚膜多糖借助其共价连接至载体分子。缀合增强细菌荚膜多糖的免疫原性。缀合能够根据描述如下的方法或通过本领域已知过程进行。
"缀合物免疫原性组合物"如本文所用是指免疫原性组合物，其中免疫原性物质包括抗原多糖，所述抗原多糖共价连接至载体蛋白质产生多糖-蛋白质缀合物。在一种实施方式中，本发明的多糖-蛋白质缀合物可以配制为多价免疫原性组合物。
如本文所用，多糖或载体蛋白质-多糖缀合物的术语"分子量"是指分子量，其通过尺寸排阻色谱法(SEC)和与之组合的多角度激光散射检测器(MALLS)计算。
如本文所用，"多糖-蛋白质缀合物"是指通过一个或多个共价键缀合至蛋白质载体分子的多糖分子。可以希望的是，将多糖缀合至来自已知在靶标宿主中免疫原性的又一种类的蛋白质。相应地，在一种实施方式中，载体分子是载体蛋白质。如本文定义，上述外源蛋白质称为"载体蛋白质。"载体蛋白质的功能是增强多糖的抗原性和免疫原性。如本文所用，术语"载体效果"是指过程，其中弱免疫原性或非免疫原性分子的抗原性和免疫原性通过连接至免疫原性更高的载体分子(例如异源蛋白质)而被增强。在该情况下，在合并的多糖-蛋白质缀合物中的多糖变得比其单独存在更具免疫原性。载体蛋白质含有刺激T-细胞辅助的T细胞表位，用于产生抗体应答。
"载体蛋白质"或"蛋白质载体"如本文所用是指任何蛋白质分子，其可以缀合至希望对其免疫应答的抗原(比如荚膜多糖)。抗原比如多糖缀合至载体蛋白质能够产生抗原免疫原性。载体蛋白质优选是蛋白质，其是非毒性和非产生反应性的并且可以足够的量和纯度获得。载体蛋白质的实例是毒素，类毒素或毒素的任何突变型交叉反应性物质(CRM197)，来自破伤风，白喉，百日咳，假单胞菌属的种，大肠杆菌，葡萄球菌的种和链球菌的种。载体蛋白质应适应标准缀合程序。在本发明的特别实施方式中，CRM197用作载体蛋白质。
交叉反应性物质或CRMs特别可用于本发明的某些实施方式。可以产生基因改变的蛋白质，其在抗原性上类似某些细菌毒素，但却是非毒性的。它们称为"交叉反应物质"或CRM。CRM197(Wyeth/Pfizer Inc.，Sanford，NC)是值得注意的，原因是其具有从天然白喉毒素的单个氨基酸改变和在免疫学上无法与其分辨。参见Pappenheimer,A.M.,et al.,Immunochem.,9(9):891-906(1972)；U.S.专利号5,614,382，通过援引将其全部公开并入本文。CRM197是白喉毒素的非毒性变种(也即类毒素)，分离自在酪蛋白氨基酸和酵母提取物基培养基中生长的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)品系C7(β197)的培养物。CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀和离子-交换色谱法纯化。产生CRM197蛋白质的白喉棒杆菌品系C7(β197)的培养物已保藏于American Type Culture Collection,Rockville,Maryland和已赋予保藏号ATCC 53281。其它白喉类毒素也适于用作载体蛋白质。CRM3201是百日咳毒素的基因操纵变种。参见Black,W.J.,et al.,Science,240(4852):656-659(1988)，通过援引将其公开全部并入本文。
除了白喉类毒素(DT)、CRM197和百日咳类毒素之外，载体蛋白质的其它实例还包括破伤风类毒素(TT)，霍乱类毒素(例如描述于国际专利申请公开No.WO 2004/083251)，大肠杆菌热不稳定型类毒素(LT)，大肠杆菌热稳定型类毒素(ST)，来自肺炎链球菌(野生型或低毒性突变型)的肺炎球菌自溶酶，肺炎球菌表面蛋白质A(PspA)，肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)，来自链球菌的C5a肽酶，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)的溶血素，不可分类的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)蛋白质，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D，产气荚膜梭菌外毒素/类毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，轮状病毒属VP 7蛋白，和呼吸系统合胞体病毒F和G蛋白，卵清蛋白，钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)，结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)，和假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素或其衍生物，包括重组产生的非毒性突变型绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A。还能够使用细菌外膜蛋白质比如外膜蛋白质复合物c(OMPC)，孔蛋白，转铁蛋白结合性蛋白，或艰难梭菌肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B)。其它蛋白质，比如卵清蛋白、镇眼帽贝血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)还能够用作载体蛋白质。在优选的实施方式中，载体蛋白质是白喉类毒素。更优选，载体蛋白质是CRM197。在本发明的又一实施方式中，载体蛋白质是破伤风类毒素。
为了合成多价缀合物免疫原性组合物，多糖-蛋白质缀合物可以制备如下：将纯化自两个不同种类细菌的多糖混合物与载体蛋白质缀合。另选地，多价缀合物免疫原性组合物可以制备如下：将自相同细菌的两个或更多个不同血清型的细菌纯化的多糖合并和将它们作为混合物缀合至载体蛋白质。另选地，可以混合制备如下的多糖-蛋白质缀合物：在使用不同多糖的分开反应中将单一类型多糖与载体蛋白质反应。从而，多价免疫原性组合物可以包括载体蛋白质，其携带均质或异质群体的连接的多糖。
在荚膜多糖缀合至载体蛋白质之后，通过各种技术纯化多糖-蛋白质缀合物(富集多糖-蛋白质缀合物的量)。这些技术包括例如浓缩/透析过滤操作，沉淀/洗脱，柱色谱法和深度过滤。
如上文所述，本发明涉及缀合物，包含缀合至载体蛋白质的GBS荚膜多糖。本发明的一种实施方式提供缀合物，其包含缀合至载体蛋白质的GBS血清型IV荚膜多糖，和至少一种额外缀合物，其包含缀合至载体蛋白质的GBS血清型Ia荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型Ib荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型II荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型IIII荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型V荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型VI荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型VII荚膜多糖，缀合至载体蛋白质的GBS血清型VIII荚膜多糖，或缀合至载体蛋白质的GBS血清型IX荚膜多糖。在本发明的一个方面，多糖具有约5kDa至1,000kDa的分子量；缀合物具有约300kDa至约20,000kDa的分子量；和缀合物包含相对总多糖小于约40％的游离多糖。在一种实施方式中，缀合物包含相对总多糖小于约30％，小于约25％，小于约20％，小于约15％，小于约10％，或小于约5％的游离多糖。
在一种实施方式中，血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII和/或IX多糖在缀合之前具有的分子量是约5kDa至约1,000kDa，比如约50kDa至约750kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约250kDa，约50kDa至约200kDa，约75kDa至约750kDa，约75kDa至约500kDa，约75kDa至约450kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约350kDa，约75kDa至约300kDa，约75kDa至约250kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约750kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约650kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约550kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至750kDa，约200kDa至约700kDa，约200kDa至约650kDa，约200kDa至约600kDa，约200kDa至约550kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约250kDa至约750kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约650kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约550kDa，约250kDa至约500kDa，约250kDa至约450kDa，约250kDa至约400kDa，约300kDa至750kDa，约300kDa至约700kDa，约300kDa至约650kDa，约300kDa至约600kDa，约300kDa至约550kDa，或约300kDa至约500kDa。在任何上述范围内的任何整数预期是本公开的实施方式。
在一种实施方式中，缀合物具有的分子量是约300kDa至约20,000kDa，比如约300kDa至约15,000kDa，约300kDa至约10,000kDa，约300kDa至约9,000kDa，约300kDa至约8,000kDa，约300kDa至约7,000kDa，约300kDa至约6,000kDa，约300kDa至约5,000kDa，约300kDa至约4,000kDa，约300kDa至约3,000kDa，约300kDa至约2,000kDa，约300kDa至约1,000kDa，约500kDa至约20,000kDa，约500kDa至约15,000kDa，约500kDa至约10,000kDa，约500kDa至约9,000kDa，约500kDa至约8,000kDa，约500kDa至约7,000kDa，约500kDa至约6,000kDa，约500kDa至约5,000kDa，约500kDa至约4,000kDa，约500kDa至约3,000kDa，约500kDa至约2,000kDa，约500kDa至约1,000kDa，约1,000kDa至约20,000kDa，约1,000kDa至约15,000kDa，约1,000kDa至约10,000kDa，约1,000kDa至约9,000kDa，约1,000kDa至约8,000kDa，约1,000kDa至约7,000kDa，约1,000kDa至约6,000kDa，约1,000kDa至约5,000kDa，约1,500kDa至约20,000kDa，约1,500kDa至约15,000kDa，约1,500kDa至约10,000kDa，约1,500kDa至约9,000kDa，约1,500kDa至约8,000kDa，约1,500kDa至约7,000kDa，约1,500kDa至约6,000kDa，约1,500kDa至约5,000kDa，约2,000kDa至约20,000kDa，约2,000kDa至约15,000kDa，约2,000kDa至约10,000kDa，约2,000kDa至约9,000kDa，约2,000kDa至约8,000kDa，约2,000kDa至约7,000kDa，约2,000kDa至约6,000kDa，约2,500kDa至约20,000kDa，约2,500kDa至约15,000kDa，约2,500kDa至约10,000kDa，约2,500kDa至约9,000kDa，约2,500kDa至约8,000kDa，约2,500kDa至约7,000kDa，约2,500kDa至约6,000kDa，约3,000kDa至约20,000kDa，约3,000kDa至约15,000kDa，约3,000kDa至约10,000kDa，约3,000kDa至约9,000kDa，约3,000kDa至约8,000kDa，约3,000kDa至约7,000kDa，或约3,000kDa至约6,000kDa。
在一种实施方式中，GBS血清型IV荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型Ia荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型Ib荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型II荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型III荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型V荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型VI荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型VII荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型VIII荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，GBS血清型IX荚膜多糖缀合物具有任何上述范围的分子量。
在一种实施方式中，本发明缀合物具有至少约0.6，0.65，0.7，0.75，0.8，0.85，0.9，0.95，0.97或0.98mM唾液酸每mM多糖。在优选的实施方式中，缀合物具有至少约0.9或0.95mM唾液酸每mM多糖。
在一种实施方式中，GBS血清型IV荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型Ia荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型Ib荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型II荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型III荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型V荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型VI荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型VII荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，GBS血清型VIII荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中GBS，血清型IX荚膜多糖缀合物具有至少任何上述值的唾液酸含量。
在一种实施方式中，本发明缀合物包含小于约0.01，0.02，0.03，0.04，或0.05mMO-乙酸酯每mM糖类重复单元。在又一实施方式中，缀合物包含至少约0.1，0.2，0.3，0.35或约0.4mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
在一种实施方式中，GBS血清型IV荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型Ia荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型Ib荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型II荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型III荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型V荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型VI荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型VII荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中，GBS血清型VIII荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在一种实施方式中GBS，血清型IX荚膜多糖缀合物具有任何上述值的O-乙酸酯含量。
在又一实施方式中，免疫原性缀合物包含与GBS荚膜多糖总量相比小于约40％，小于约35％，小于约30％，小于约25％，小于约20％，小于约15％，小于约10％，或小于约5％的游离GBS荚膜多糖。在优选的实施方式中，免疫原性缀合物包含与GBS荚膜多糖总量相比小于约5％的未反应游离糖类。
在又一实施方式中，在缀合物中GBS荚膜多糖与载体蛋白质的比率(重量)是约0.5至约3.0。在一个方面，在缀合物中GBS荚膜多糖与载体蛋白质的比率是约0.5至约2.0，约0.5至约1.5，约0.5至约1.0，约1.0至约1.5，或约1.0至约2.0。在优选的实施方式中，在缀合物中GBS荚膜多糖与载体蛋白质的比率是约0.8至约1.0。
在又一实施方式中，缀合物的缀合度是2至15，2至13，2至10，2至8，2至6，2至5，2至4，3至15，3至13，3至10，3至8，3至6，3至5，3至4，5至15，5至10，8至15，8至12，10至15，或10至12。在优选的实施方式中，缀合物的缀合度是2至5。
缀合
缀合可以是直接的，其中多糖原子共价键合至蛋白质表面的原子。另选地，缀合可以是通过连接体分子的，其与多糖和蛋白质反应并且连接这两者，将碳水化合物链系至蛋白质。
在缀合载体和一种或多种抗原比如多糖(也即共价联接)的情况下，缀合可以通过本领域已知的任何化学方法、过程或基因技术进行。例如，载体多肽和选自包含碳水化合物、低聚糖、脂质、脂低聚糖、多糖、低聚糖-蛋白质缀合物、多糖-蛋白质缀合物、肽-蛋白质缀合物、低聚糖-肽缀合物、多糖-肽缀合物、蛋白质-蛋白质缀合物、脂低聚糖-蛋白质缀合物、多糖-蛋白质缀合物、或其任何组合的组的一种或多种抗原可以通过包括但不限于下述的技术缀合：(1)经由蛋白质官能团直接偶联(例如硫醇-硫醇连接，胺-羧基连接，胺-醛连接；酶直接偶联)；(2)胺的同双官能偶联(例如用二-醛)；(3)硫醇的同双官能偶联(例如用二-马来酰亚胺)；(4)经由光敏剂的同双官能偶联；(5)胺与硫醇的异双官能偶联(例如用马来酰亚胺)；(6)经由光敏剂的异双官能偶联(例如β-羰基重氮基家族)；(7)经由溴化氰活化或羧甲基化将胺-反应性基团引入多聚糖或低聚糖；(8)经由异双官能化合物比如马来酰亚胺基-酰肼将硫醇-反应性基团引入多聚糖或低聚糖；(9)经由将疏水基团引入蛋白质的蛋白质-脂质缀合和(10)经由将反应性基团掺入脂质的蛋白质-脂质缀合。另外预期的是异双官能"非共价偶联"技术比如生物素-抗生物素蛋白相互作用。本领域熟知引起低聚糖和多糖与免疫原性载体蛋白质缀合的其它方法也属于本发明某些实施方式的范围。
在一种实施方式中，GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物获得如下：用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。活化的多糖可以直接或经由间隔物(连接体)基团偶联至载体蛋白质上的氨基。例如，间隔物能够是胱氨或半胱胺从而提供硫醇化多糖，其能经由在与马来酰亚胺-活化的载体蛋白质(例如用GMBS)或卤代乙酰化的载体蛋白质(例如用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反应之后获得的硫醚连接偶联至载体。
在一个方面，氰酸酯(任选通过CDAP化学制得)与己烷二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联而氨基-衍生化的糖类用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学经由蛋白质载体上的羧基缀合至载体蛋白质。所述缀合物描述于例如国际专利申请公开Nos.WO 93/15760，WO 95/08348，和WO 96/29094。
其它适宜的技术使用碳二亚胺，酰肼，活性酯，降冰片烷，对-硝基苯甲酸，N-羟基琥珀酰亚胺，S--NHS，EDC，和TSTU。许多描述于国际专利申请公开No.WO 98/42721。缀合可以牵涉可以形成如下的羰基连接体：糖类游离羟基与1,1碳酰二咪唑(CDI)或1,1羰基二1,2,4三唑(CDT)的反应(参见Bethell,et al.,J.Biol.Chem.,254:2572-2574(1979)；Hearn,et al.,J.Chromatogr.,218:509-518(1981))随后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接。这可以牵涉将异头物末端还原为伯羟基，任选保护/脱保护伯羟基，将伯羟基与CDI/CDT反应形成CDI/CDT氨基甲酸酯中间体，和将CDI/CDT氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基偶联。
在优选的实施方式中，本发明的GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物用还原胺化制备。还原胺化牵涉两个步骤：(1)氧化多糖以从单个六糖单元的连位二元醇产生醛官能和(2)还原活化的多糖和载体蛋白质以形成缀合物。
在一种实施方式中，GBS荚膜多糖通过包括下述步骤的过程活化(氧化)：
(a)将分离的GBS荚膜多糖与氧化剂反应；和
(b)加入猝灭剂猝灭氧化反应，获得活化的GBS荚膜多糖。
在本发明的一个方面，分离荚膜多糖的浓度是约0.1mg/mL至约10.0mg/mL，比如约0.5mg/mL至约5.0mg/mL mg/mL，约1.0mg/mL至约3.0mg/mL，或约2.0mg/mL。
在特别的实施方式中，氧化剂是高碘酸盐。高碘酸盐氧化连位羟基形成羰基或醛基和导致C-C键裂解。术语'高碘酸盐'包括高碘酸盐和高碘酸。该术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和原高碘酸盐(IO6 5-)。术语'高碘酸盐'也包括高碘酸盐的各种盐包括高碘酸钠和高碘酸钾。在优选的实施方式中，氧化剂是高碘酸钠。在优选的实施方式中，用于氧化GBS荚膜多糖的高碘酸盐是偏高碘酸盐。在优选的实施方式中，用于氧化血清型荚膜多糖的高碘酸盐是偏高碘酸钠。
在又一实施方式中，多糖与0.01至10.0，0.05至5.0，0.1至1.0，0.5至1.0，0.7至0.8，0.05至0.5，或0.1至0.3摩尔当量的氧化剂反应。在特别的实施方式中，多糖与约0.05，约0.1，约0.15，约0.2，约0.25，约0.3，约0.35，约0.4，约0.45，约0.5，约0.55，约0.6，约0.65，约0.7，约0.75，约0.8，约0.85，约0.9，或约0.95摩尔当量的氧化剂反应。在又一实施方式中，多糖与约0.1摩尔当量的氧化剂反应。在又一实施方式中，多糖与约0.15摩尔当量的氧化剂反应。在额外的实施方式中，多糖与约0.25摩尔当量的氧化剂反应。在又一实施方式中，多糖与约0.5摩尔当量的氧化剂反应。在备择实施方式中，多糖与约0.6摩尔当量的氧化剂反应。在又一实施方式中，多糖与约0.7摩尔当量的氧化剂反应。
在本发明的一个方面，氧化反应的持续时间是约1小时至约50小时，约10小时至约30小时，约15小时至约20小时，约15小时至约17小时，或约16小时。
在本发明的又一方面，氧化反应的温度保持在约2℃至约25℃，约2℃至约8℃，或约20℃至约25℃。在一种优选实施方式中，反应温度保持在约23℃。在又一优选的实施方式中，反应温度保持在约5℃。
在又一方面，氧化反应在选自磷酸钠，磷酸钾，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和Bis-Tris的缓冲剂中进行。在优选的实施方式中，缓冲剂是磷酸钾。
在额外的方面，缓冲剂具有的浓度是约1mM至约500mM，约1mM至约300mM，或约50mM至约200mM。在优选的实施方式中，缓冲剂具有的浓度是约100mM。
在一个方面，氧化反应在pH约4.0至约8.0，约5.0至约7.0，或约5.5至约6.5进行。在优选的实施方式中，pH是约6.0。
在一种实施方式中，活化的GBS荚膜多糖获得如下：将约0.5mg/L至约5.0mg/mL的分离荚膜多糖与约0.05至约0.3摩尔当量的高碘酸盐在温度约20℃至25℃反应。
在又一实施方式中，活化的GBS荚膜多糖获得如下：将约0.5mg/L至约5.0mg/mL的分离荚膜多糖与约0.05至约0.3摩尔当量的高碘酸盐在温度约2℃至约8℃反应。
在又一实施方式中，活化的GBS荚膜多糖根据本领域技术人员已知的方法比如凝胶渗透色谱法(GPC)、透析或超滤/透析过滤纯化。例如，活化的荚膜多糖通过浓缩和用超滤装置透析过滤纯化。
在一种实施方式中，活化的GBS荚膜多糖的氧化度是5至25，比如5至15，5至10，10至25，10至20，10至15。在优选的实施方式中活化的GBS荚膜多糖的氧化度是10至20，11至19，12至18，13至17，或14至16。
在又一实施方式中，活化的GBS荚膜多糖具有分子量约5kDa至约1,000kDa，比如约50kDa至约300kDa，约75kDa至约400kDa，约75kDa至约200kDa，约100kDa至约700kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约300kDa，约200kDa至约400kDa，约300kDa至约700kDa。在优选的实施方式中，活化的GBS荚膜多糖具有分子量约75kDa至约400kDa。
在一种实施方式中，活化的GBS荚膜多糖是冻干的，任选在糖类存在下进行。在优选的实施方式中，糖类选自蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方式中，糖类是蔗糖。冻干的活化荚膜多糖能够然后与包含载体蛋白质的溶液混合。
在又一实施方式中，活化的GBS荚膜多糖与载体蛋白质混合和冻干，任选地在糖类存在下进行。在一个方面，糖类选自蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方式中，糖类是蔗糖。共冻干的多糖和载体蛋白质能够然后再悬浮于溶液中和与还原剂反应。
活化的GBS荚膜多糖能够通过包括下述步骤的过程缀合至载体蛋白质：
(a)将活化的GBS荚膜多糖与载体蛋白质混合，和
(b)将混合的活化的GBS荚膜多糖和载体蛋白质与还原剂反应以形成GBS荚膜多糖-载体蛋白质缀合物。
活化的GBS荚膜多糖通过在极性非质子溶剂中还原胺化与蛋白质载体缀合适宜保持低水平的游离多糖，与之相对的是例如在水溶液中还原胺化，其中未反应(游离)多糖水平显著升高。在优选的实施方式中，步骤(a)和步骤(b)在极性非质子溶剂中进行。
在一种实施方式中，步骤(a)包含在包含载体蛋白质和极性非质子溶剂的溶液中溶解冻干的GBS荚膜多糖。在又一实施方式中，步骤(a)包含在极性非质子溶剂中溶解共冻干的GBS荚膜多糖和载体蛋白质。
在一种实施方式中，极性非质子溶剂选自二甲亚砜(DMSO)，环丁砜，二甲基甲酰胺(DMF)，和六甲基磷酰胺(HMPA)。在优选的实施方式中，极性非质子溶剂是DMSO。
在步骤(a)和(b)在水溶液中进行的情况下，步骤(a)和(b)在缓冲剂中在含水介质中中进行，优选选自PBS，MES，HEPES，Bis-Tris，ADA，PIPES，MOPSO，BES，MOPS，DIPSO，MOBS，HEPPSO，POPSO，TEA，EPPS，N-二羟乙基甘氨酸或HEPB，pH为约6.0至约8.5，约7.0至约8.0，或约7.0至约7.5。在优选的实施方式中，缓冲剂是PBS。在优选的实施方式中，pH是约7.3。
在一种实施方式中，步骤(b)中活化的GBS荚膜多糖的浓度是约0.1mg/mL至约10.0mg/mL，约0.5mg/mL至约5.0mg/mL，或约0.5mg/mL至约2.0mg/mL。在优选的实施方式中，步骤(b)中活化的血清型GBS荚膜多糖的浓度是约0.1mg/mL，约0.2mg/mL，约0.3mg/mL，约0.4mg/mL，约0.5mg/mL，约0.6mg/mL，约0.7mg/mL，约0.8mg/mL，约0.9mg/mL，约1.0mg/mL，约1.1mg/mL，约1.2mg/mL，约1.3mg/mL，约1.4mg/mL，约1.5mg/mL，约1.6mg/mL，约1.7mg/mL，约1.8mg/mL，约1.9mg/mL，约2.0mg/mL，约2.1mg/mL，约2.2，约2.3mg/mL，约2.4mg/mL，约2.5mg/mL，约2.6mg/mL，约2.7mg/mL，约2.8mg/mL，约2.9mg/mL，或约3.0mg/mL。
在优选的实施方式中活化的血清型GBS荚膜多糖与载体蛋白质的初始比率(重量)是5:1至0.1:1，2:1和0.1:1，2:1和1:1，1.5:1和1:1，0.1:1和1:1，0.3:1和1:1，0.6:1和1:1。在优选的实施方式中，活化的血清型GBS荚膜多糖与载体蛋白质的初始比率是约0.4:1，0.5:1，0.6:1，0.7:1，0.8:1，0.9:1，1:1，1.1:1，1.2:1，1.3:1，1.4:1，1.5:1，1.6:1，1.7:1，1.8:1，1.9:1，2:1。
在一种实施方式中，还原剂是在质子酸或路易斯酸，胺硼烷比如吡啶硼烷，2-皮考啉硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，叔-BuMeiPrN-BH3，苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)存在下的氰基硼氢化钠，三乙酰氧基硼氢化钠，硼氢化钠或锌。在优选的实施方式中，还原剂是氰基硼氢化钠。
在又一实施方式中，步骤(b)中所用的还原剂的量是约0.1至约10.0摩尔当量，约0.5至约5.0摩尔当量，或约1.0至约2.0摩尔当量。在优选的实施方式中，步骤(b)中所用的还原剂的量是约1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，或2.0摩尔当量。
在优选的实施方式中，步骤(b)的持续时间是1小时至60小时，10小时至50小时，40小时至50小时，或42小时至46小时。在优选的实施方式中，步骤(b)的持续时间是约44小时。
在又一实施方式中，步骤(b)的反应温度保持在10℃至40℃，15℃至30℃，或20℃至26℃。在优选的实施方式中，步骤(b)的反应温度保持在约23℃。
在额外的实施方式中，制备包含共价连接至载体蛋白质的GBS荚膜多糖的免疫原性缀合物的过程还包括加入硼氢化物封端未反应醛(猝灭)的步骤(步骤(c))。
在一种实施方式中，封端剂是硼氢化物，选自硼氢化钠(NaBH4)，氰基硼氢化钠，硼氢化锂，硼氢化钾，硼氢化四丁基铵，硼氢化钙，和硼氢化镁。在优选的实施方式中，封端剂是硼氢化钠。
在又一实施方式中，步骤(c)中所用硼氢化物的量是约0.1至约10.0摩尔当量，约0.5至约5.0摩尔当量，或约1.0至3.0摩尔当量。在优选的实施方式中，步骤(c)中所用硼氢化物的量是约2.0摩尔当量。
在一种优选实施方式中，步骤(c)中所用硼氢化物是浓度约2.0摩尔当量的NaBH4。
在一种实施方式中，步骤(c)的持续时间是0.1小时至10小时，0.5小时至5小时，2小时至4小时。在优选的实施方式中，步骤(c)的持续时间是约3小时。
在又一实施方式中，步骤(c)中的反应温度保持在约15℃至约45℃，约15℃至约30℃，或约20℃至约26℃。在优选的实施方式中，步骤(c)中的反应温度保持在约23℃。
在GBS荚膜多糖与载体蛋白质缀合和封端之后，多糖-蛋白质缀合物能够通过技术人员已知的各种技术纯化(富集多糖-蛋白质缀合物的量)。这些技术包括透析，浓缩/透析过滤操作，切向流过滤，沉淀/洗脱，柱色谱法(DEAE或疏水相互作用色谱法)，和深度过滤。
在又一实施方式中，免疫原性缀合物包含与GBS荚膜多糖总量相比小于约40％，小于约35％，小于约30％，小于约25％，小于约20％，小于约15％，小于约10％，或小于约5％的游离GBS荚膜多糖。在优选的实施方式中免疫原性缀合物包含与GBS荚膜多糖总量相比小于约5％的未反应游离糖类。
在优选的实施方式中，GBS多糖-蛋白质缀合物具有分子量约300kDa至约20,000kDa，比如约1,000kDa至约15,000kDa或约1,000kDa至约10,000kDa。
在又一实施方式中，缀合物中GBS荚膜多糖与载体蛋白质的比率(重量)是约0.5至约3.0。在一个方面，在缀合物中GBS荚膜多糖与载体蛋白质的比率是约0.5至约2.0，约0.5至约1.5，约0.5至约1.0，约1.0至约1.5，或约1.0至约2.0。在优选的实施方式中，在缀合物中GBS荚膜多糖与载体蛋白质的比率是约0.8至约1.0。
在又一实施方式中，缀合物的缀合度是2至15，2至13，2至10，2至8，2至6，2至5，2至4，3至15，3至13，3至10，3至8，3至6，3至5，3至4，5至15，5至10，8至15，8至12，10至15，或10至12。在优选的实施方式中，缀合物的缀合度是2至5。
在本发明的一个方面，GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物通过上文所述的还原胺化方法获得。例如，在一个方面本公开提供GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物，包含多糖缀合至载体蛋白质，其通过包括下述步骤的方法制备或可获得：
(a)将分离的GBS荚膜多糖与氧化剂反应；
(b)加入猝灭剂猝灭氧化反应获得活化的GBS荚膜多糖；
(c)将活化的GBS荚膜多糖与载体蛋白质混合,
(d)将混合的活化GBS荚膜多糖和载体蛋白质与还原剂反应以形成GBS荚膜多糖-载体蛋白质缀合物，和任选地
(e)加入硼氢化钠(NaBH4)封端未反应的醛。
在优选的实施方式中，步骤(c)和(d)在DMSO中进行。
在本发明的又一方面，本发明的GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物用如上文所述的还原胺化制备，但是用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)自由基和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)充当活化/氧化步骤中的共氧化剂。参见国际专利申请公开No.WO 2014/097099，通过援引将其全部并入本文。在所述实施方式中，来自GBS荚膜多糖的糖缀合物用将糖类伯醇氧化为醛的TEMPO自由基制备，用NCS作为共氧化剂(此后"TEMPO/NCS氧化")，比如描述于国际专利申请公开No.WO 2014/097099实施例7和。因此在一个方面，GBS荚膜多糖的缀合物可通过包括下述步骤的方法获得：a)将GBS荚膜多糖与溶剂中的TEMPO和NCS反应产生活化的糖类；和b)将活化的糖类与包含一个或多个胺基的载体蛋白质反应(此后"TEMPO/NCS-还原胺化")。在一种实施方式中，溶剂可以是水性溶剂或DMSO。
在一个方面，GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物提供所述方法获得。例如，在一个方面本公开提供GBS荚膜多糖-蛋白质缀合物，包含缀合至载体蛋白质的多糖，其通过包括下述步骤的方法制备或可获得：a)将糖类与溶剂中的2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)反应产生活化的糖类；和b)将活化的糖类与包含一个或多个胺基的载体蛋白质反应。在一种实施方式中，溶剂可以是水性溶剂或DMSO。
免疫原性组合物
在纯化单独缀合物之后，它们可以组合以配制本发明免疫原性组合物，其可以用于例如疫苗当中。本发明免疫原性组合物的配制剂能够用本领域知晓的方法实现。
对免疫原性组合物的"免疫应答"是受试者中发展出对有关组合物中存在的分子(例如抗原比如蛋白质或多糖)的体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。出于本发明意图，"体液免疫应答"是抗体介导的免疫应答和牵涉产生对本发明免疫原性组合物存在的抗原有亲和力的抗体，而"细胞介导的免疫应答"是由T-淋巴细胞和/或其它白血细胞介导的。"细胞介导的免疫应答"是通过提呈与主要组织相容性复合体(MHC)的I类或II类分子关联的抗原表位引起的。这活化抗原-特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。CTL具有肽或脂质抗原的特异性，所述肽或脂质抗原是与通过MHC或CD1编码并在细胞表面表达的蛋白质关联提呈的。CTL辅助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏，或感染所述微生物的细胞的裂解。细胞免疫的又一方面牵涉通过辅助T-细胞的抗原特异性应答。辅助T-细胞的作用是辅助刺激功能，并使得非特异性效应细胞的活性聚焦于对抗其表面上显示肽抗原和与之关联的经典或非经典MHC分子的细胞。"细胞介导的免疫应答"也是指产生细胞因子、趋化因子和通过活化的T-细胞和/或其它白血细胞产生的其它所述分子，包括衍生自CD4+和CD8+T-细胞的那些。特别抗原或组合物刺激细胞介导的免疫应答的能力可以通过许多测试来确定，比如淋巴组织增生(淋巴细胞活化)测试，CTL细胞毒性细胞测试，测试对敏化受试者中的抗原特异性的T-淋巴细胞，或通过应答抗原再刺激测量T细胞产生细胞因子。所述测试是本领域熟知的。参见例如Erickson,A.L.,et al.,J.Immunol.,151(8):4189-4199(1993)；Doe,B.,et al.,Eur.J.Immunol.24(10):2369-2376(1994)。
术语"免疫原性"是指抗原或疫苗引起免疫应答(体液免疫应答或细胞介导免疫应答或两者)的能力。
本文可互换使用的"免疫原性量"或"免疫学有效量"或"剂量"一般是指足以引起免疫应答的抗原或免疫原性组合物的量，无论是细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)应答或两者，其通过本领域技术人员已知的标准测试来测量。
"免疫干扰"或"显著免疫干扰"如本文所用是指，与在给予一价疫苗的情况下对相同抗原的免疫应答相比，在多价或多组分疫苗中统计学显著的对单独抗原的免疫应答降低。
"保护性"免疫应答是指免疫原性组合物引起体液或细胞介导的免疫应答的能力，其功能是保护受试者免受感染。所提供的保护不需要是绝对的，即不需要完全预防或根除感染，条件是与受试者对照群体例如未给予疫苗或免疫原性组合物的感染动物相比存在统计学显著的改善。保护可以局限于缓和感染症状发作的严重性或快速性。本领域已知数种测试来确定免疫应答是否指示"保护性免疫应答。"例如，抗体水平增加可以通过结合测试测量，比如下文进一步描述的全细胞ELISA测试。其它测试包括测量有功能的抗体应答比如促进细菌灭除，其能够用下文描述的调理吞噬测试(OPA)来测试。在特殊情况下，"保护性免疫应答"能够包括引发抗体水平的2倍增加或4倍增加的抗体水平，其在至少50％的受试者中是对特定抗原特异性的。在又一情况下，"保护性免疫应答"能包括至少10％，25％，50％，65％，75％，80％，85％，90％，95％或更多的细菌计数降低。
在组合物中特别缀合物的量一般基于该缀合物的总多糖(缀合和非缀合)计算。例如，具有20％游离多糖的GBS荚膜多糖缀合物在100mcg/ml GBS荚膜多糖剂量中将具有约80mcg/ml缀合的GBS荚膜多糖和约20mcg/ml非缀合的GBS荚膜多糖。在计算缀合物剂量时通常不考虑蛋白质载体对缀合物的贡献。缀合物的量能够取决于链球菌血清型而变化。一般来说，各剂量将包含约0.01mg/ml至约100mcg/ml，特别是约1mcg/ml至约70mcg/ml，和更特别约5mcg/ml至约50mcg/ml的各多糖。免疫原性组合物中不同多糖组分的"免疫原性量"可以变化和可以各自包含约0.01mcg/ml，约0.1mcg/ml，约0.25mcg/ml，约0.5mcg/ml，约1mcg/ml，约2mcg/ml，约3mcg/ml，约4mcg/ml，约5mcg/ml，约6mcg/ml，约7mcg/ml，约8mcg/ml，约9mcg/ml，约10mcg/ml，约15mcg/ml，约20mcg/ml，约25mcg/ml，约30mcg/ml，约40mcg/ml，约50mcg/ml，约60mcg/ml，约70mcg/ml，约80mcg/ml，约90mcg/ml，或约100mcg/ml的任何特定多糖抗原。多价免疫原性组合物的剂量或免疫原性量会指示每种多糖的剂量，除非另有指定。例如，10mcg/ml剂量的六价免疫原性组合物会含有10mcg/ml的各自六种多糖，总抗原或缀合物剂量是60mcg/ml。
在本发明的一个方面，总缀合物剂量是至少约60mcg/ml，比如至少约120mcg/ml或至少约240mcg/l。在一种实施方式中，总缀合物剂量是约60mcg/ml至约600mcg/ml，比如约60mcg/ml至约540mcg/ml，约60mcg/ml至约480mcg/ml，约60mcg/ml至约420mcg/ml，约60mcg/ml至约360mcg/ml，约60mcg/ml至约300mcg/ml，约60mcg/ml至约240mcg/ml，约60mcg/ml至约180mcg/ml，约60mcg/ml至约120mcg/ml，约120mcg/ml至约600mcg/ml，约120mcg/ml至约540mcg/ml，约120mcg/ml至约480mcg/ml，约120mcg/ml至约420mcg/ml，约120mcg/ml至约360mcg/ml，约120mcg/ml至约300mcg/ml，约120mcg/ml至约240mcg/ml，约120mcg/ml至约180mcg/ml，约180mcg/ml至约600mcg/ml，约180mcg/ml至约540mcg/ml，约180mcg/ml至约480mcg/ml，约180mcg/ml至约420mcg/ml，约180mcg/ml至约360mcg/ml，约180mcg/ml至约300mcg/ml，约180mcg/ml至约240mcg/ml，约240mcg/ml至约600mcg/ml，约240mcg/ml至约540mcg/ml，约240mcg/ml至约480mcg/ml，约240mcg/ml至约420mcg/ml，约240mcg/ml至约360mcg/ml，或约240mcg/ml至约300mcg/ml。在优选的实施方式中，总缀合物剂量是约60mcg/ml至约360mcg/ml，和最优选约120mg/ml至约240mcg/ml。
抗原作为免疫原的有效性能够测量如下：通过测量血清中对抗原特异性的体液抗体水平来测量B细胞活性水平，使用免疫测定，免疫沉淀测试，功能抗体测试，比如体外调理测试和本领域已知的许多其它测试。抗原作为T-细胞免疫原的有效性的又一种度量能够测量如下：增殖测试，溶细胞测试比如铬释放测试，其测量T细胞裂解其特异性靶标细胞的能力。另外，在本发明中，"免疫原性量"还可以定义如下：测量在给予抗原之后诱导的抗原特异性抗体的血清水平或测量如此诱导的抗体增强如本文描述的特定白血细胞的调理吞噬性能力的能力。免疫应答的保护水平可以测量如下：用已注射的抗原攻击免疫宿主。例如，如果希望免疫应答的抗原是细菌，通过"免疫原性量"的抗原诱导的保护水平能够测量如下：在用细菌细胞攻击动物之后检测百分比存活率或百分比死亡率。在一种实施方式中，保护量可以测量如下：测量至少一种与细菌感染有关的症状例如与感染有关的发热。在多抗原或多组分疫苗或免疫原性组合物中的各抗原的量将相对各其它组分变化并且能够通过技术人员已知的方法确定。所述方法会包括例如测量免疫原性和/或体内效力的程序。
术语"免疫原性组合物"涉及含有抗原例如微生物或其组分的任何药物组合物，该组合物能够用来在受试者中引起免疫应答。本发明免疫原性组合物能够用来治疗易受GBS感染影响的人，通过经由全身性透皮或粘膜途径给予免疫原性组合物进行。这些给予能够包括经由肌内(i.m.)，腹腔内(腹膜内)，真皮内(i.d.)或皮下途径注射；通过贴剂或其它透皮递送装置施用；或经由粘膜给药至口腔/消化道，呼吸道或泌尿生殖道。在一种实施方式中，免疫原性组合物可以用于制备疫苗或用于引发多克隆或单克隆抗体，其能用来被动保护或治疗动物。
在一个方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包括有效量的至少一种多糖，低聚糖，多糖-蛋白质缀合物或其生物学等价物，如本文描述。例如，在一种实施方式中，免疫原性组合物包括多糖-蛋白质缀合物，其中荚膜多糖选自B族链球菌血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII和IX和其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。在又一实例中，免疫原性组合物包括多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型IV和选自血清型Ia，Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型的荚膜多糖。在又一实施方式中，免疫原性组合物包含多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少两种额外血清型的荚膜多糖。在又一实施方式中，免疫原性组合物包含多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX至少三种额外血清型的荚膜多糖。在又一实施方式中，免疫原性组合物包含多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少四种额外血清型的荚膜多糖。在特别的实施方式中，免疫原性组合物多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型Ia，Ib，II，III和V的荚膜多糖。在又一实施方式中，免疫原性组合物多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型Ia，Ib，II，III和IV的荚膜多糖。在又一实施方式中，免疫原性组合物多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少五种额外血清型的荚膜多糖。在一种所述实施方式中，免疫原性组合物包含六种多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含来自B族链球菌血清型Ia，Ib，II，III，IV和V的荚膜多糖。
在一种实施方式中，本发明免疫原性组合物包含2至10种不同血清型的无乳链球菌。因此在一种实施方式中，本发明免疫原性组合物是2、3、4、5、6、7、8、9或10-价GBS缀合物组合物。在一种所述实施方式中，免疫原性组合物是5-价GBS缀合物组合物。在又一实施方式中，免疫原性组合物是6-价GBS缀合物组合物。在又一实施方式中，免疫原性组合物是7-价GBS缀合物组合物。在又一实施方式中，免疫原性组合物是8-价GBS缀合物组合物。
尽管在先教导在组合物中使用小于六、小于五或小于四种GBS抗原(参见国际专利申请公开Nos.WO 2006/082527和WO 2006/082530)并且经历免疫干扰，特别是有关在多价组合物中使用血清型V(参见国际专利申请公开No.WO 2012/035519)，但是本发明在使用四种或更多种GBS抗原或者在多价组合物中使用血清型V的情况下并未显示任何显著的免疫干扰。相应地，本发明涉及多价包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，所述缀合物包含至少四种GBS荚膜多糖血清型，比如至少五种GBS荚膜多糖血清型，至少六种GBS荚膜多糖血清型，至少七种GBS荚膜多糖血清型，至少八种GBS荚膜多糖血清型，或至少九种GBS荚膜多糖血清型，其中该组合物并不具有显著免疫干扰。在特别的实施方式中，免疫原性组合物包含GBS荚膜多糖血清型V。
多糖-蛋白质缀合物可以包含相同或不同的蛋白质载体。在一种实施方式中，缀合物包含相同蛋白质载体而糖类缀合至蛋白质载体的相同分子(载体分子缀合了2个或更多的不同多糖)[参见例如国际专利申请公开No.WO 2004/083251]。在又一实施方式中，多糖各自单独地缀合至不同的蛋白质载体的分子(蛋白质载体的各分子仅缀合了一种类型的多糖)。在所述实施方式中，荚膜糖类据称单独地缀合至载体蛋白质。
对于特别免疫原性组合物的组分最佳量能够通过标准研究确定，其牵涉观察受试者中的适当免疫应答。在初始接种之后，受试者能够接受一个或适当隔开的数个加强免疫接种。
本发明免疫原性组合物可以除了多个荚膜多糖蛋白质缀合物之外还包含一种或多种防腐剂。FDA要求多剂量(多剂量的)小瓶中的生物学产品含有防腐剂，仅存在数个例外。本发明预期使用所述多剂量小瓶。含有防腐剂的疫苗产品包括含有苄索氯铵(炭疽)，2-苯氧乙醇(DTaP，HepA，莱姆病，脊髓灰质炎(肠胃外))和苯酚(Pneumo，Typhoid(肠胃外)的疫苗。批准用于可注射药物的防腐剂包括例如三氯叔丁醇，间甲酚，羟苯甲酯，羟苯丙酯，2-苯氧乙醇，苄索氯铵，苯扎氯铵，苯甲酸，苯甲醇，苯酚，和硝酸苯汞。
在又一方面，本发明涉及组合物，包括本文描述的任何多糖中至少一种和药学上可接受的赋形剂，缓冲剂，稳定剂，佐剂，冷冻保护剂，盐，二价阳离子，非离子洗涤剂，自由基氧化抑制剂，稀释剂或载体，或其混合物。
免疫原性组合物任选地能够包含一种或多种生理学上可接受的缓冲液，选自但不限于HEPES，PIPES，MES，三(三甲胺)，磷酸，乙酸，硼酸，柠檬酸，甘氨酸，组氨酸和琥珀酸。在优选的实施方式中，缓冲剂是组氨酸或磷酸。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约5mM至约50mM，约5mM至约40mM，约5mM至约30mM，约5mM至约20mM，约5mM至约10mM，约10mM至约50mM，约10mM至约40mM，约10mM至约35mM，约10mM至约30mM，约10mM至约25mM，约10mM至约20mM，约10mM至约15mM，约15mM至约50mM，约15mM至约40mM，约15mM至约35mM，约15mM至约30mM，约15mM至约25mM，或约15mM至约20mM的缓冲剂。在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约10mM至约25mM，比如约15mM至约25mM，和最优选约20mM的缓冲剂。
在一种优选实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约20mM的组氨酸。在又一优选的实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约20mM的磷酸。
在某些实施方式中，配制剂缓冲至约5.0至约7.5，比如5.3至约7.5，约5.5至约7.5，约6.0至约7.5，约6.5至约7.5，约5.3至约7.1，约5.5至约7.0，约6.0至约7.0，约6.0至约6.5，约6.3至约7.0，或约6.5至约7.0的pH范围内。在又一实施方式中，配制剂缓冲至约6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，或7.5的pH。在优选的实施方式中，配制剂缓冲至约6.0至约7.5，比如约6.5至约7.5和最优选约6.5或约7.0的pH范围。
免疫原性组合物任选地能够包含一种或多种非离子表面活性剂，包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚山梨醇-80(吐温80)，聚山梨醇-60(吐温60)，聚山梨醇-40(吐温40)，聚山梨醇-20(吐温20)，和聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于BRIJ 58，BRIJ 35，以及其它比如TRITON X-100；TRITON X-114，NP40，SPAN 85和PLURONIC系列的非离子表面活性剂(例如，PLURONIC 121)。在一种实施方式中，免疫原性组合物包含聚山梨醇-80或聚山梨醇-40，优选聚山梨醇-80(PS80)。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约0.001％至约2％(v/w)，约0.001％至约1％，约0.001％至约0.5％，约0.001％至约0.1％，约0.001％至约0.05％，约0.001％至约0.01％，约0.001％至0.005％，约0.005％至约2％，约0.005％至约1％，约0.005％至约0.5％，约0.005％至约0.1％，约0.005％至约0.05％，约0.005％至约0.01％，约0.01％至约2％，约0.01％至约1％，约0.01％至约0.5％，约0.01％至约0.1％，约0.01％至约0.05％，约0.01％至约0.04％，约0.01％至约0.03％，约0.015％至约2％，约0.015％至约1％，约0.015％至约0.5％，约0.015％至约0.1％，约0.015％至约0.05％，约0.015％至约0.04％，约0.015％至约0.03％，约0.02％至约2％，约0.02％至约1％，约0.02％至约0.5％，约0.02％至约0.1％，约0.02％至约0.05％，约0.02％至约0.04％，约0.02％至约0.03％，约0.05％至约2％，约0.05％至约1％，约0.05％至约0.5％，约0.05％至约0.1％，约0.1％至约2％，约0.1％至约1％，约0.1％至约0.5％或约0.1％至约0.25％的表面活性剂。在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约0.01％至约0.03％，和最优选约0.02％的表面活性剂。
在又一实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约0.001％至约2％(优选多至约0.25％)的聚山梨醇-80或浓度约0.001％至1％(优选多至约0.5％)的聚山梨醇-40。
在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约0.02％的PS80。
药学上可接受的载体不能与"载体蛋白质"混淆，后者用于将本发明碳水化合物附着至蛋白质和修饰对该碳水化合物的免疫应答。为了避免与本文所描述的蛋白质载体混淆，术语药学上可接受的稀释剂比药学上可接受的载体优选，但是这些术语可以有时候可互换地使用。术语"药学上可接受的载体"意指由联邦管理机构、州政府或其它管理机构批准的载体，或者在美国药典或其它一般承认药典列举用于动物包括人类以及非人类哺乳动物中的载体。术语"载体"是指药物组合物与之一起给予的稀释剂，佐剂，赋形剂或媒介物。适宜的药学上可接受的稀释剂包括任意的各种常规溶剂，分散介质，填料，固体载体，水溶液，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延缓剂等。所述药学上可接受的稀释剂能够是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水、注射用水(WFI)、无菌等渗盐水溶液、磷酸缓冲盐水、佐剂悬浮液、葡萄糖和甘油水溶液及其组合能够用作液体载体，特别是用于可注射溶液。药学上可接受的稀释剂可以还包含次要量的辅助物质比如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强存放期或在体内的有效性。药学上可接受的稀释剂的制备和使用是本领域熟知的。适宜的药物载体的实例描述于E.W.Martin的"Remington'sPharmaceutical Sciences"。在一种实施方式中，稀释剂是水，注射用水(WFI)，佐剂悬浮液或盐水。在特别的实施方式中，稀释剂是本文描述的任何佐剂的悬浮液。在优选的实施方式中，稀释剂是铝基佐剂悬浮液，比如磷酸铝悬浮液。
适宜的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇，异麦芽糖醇，明胶，麦芽，稻，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，氯化钠(NaCl)，干脱脂乳，甘油，丙二醇，水，乙醇等。在优选的实施方式中，赋形剂是NaCl。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约10mM至约500mM，约10mM至约450mM，约10mM至约400mM，约10mM至约350mM，约10mM至约300mM，约10mM至约250mM，约10mM至约200mM，约10mM至约150mM，约10mM至约100mM，约10mM至约50mM，约10mM至约30mM，约10mM至约20mM，20mM至约500mM，约20mM至约450mM，约20mM至约400mM，约20mM至约350mM，约20mM至约300mM，约20mM至约250mM，约20mM至约200mM，约20mM至约150mM，约20mM至约100mM，约20mM至约50mM，约20mM至约30mM，50mM至约500mM，约50mM至约450mM，约50mM至约400mM，约50mM至约350mM，约50mM至约300mM，约50mM至约250mM，约50mM至约200mM，约50mM至约150mM，约50mM至约100mM，约100mM至约500mM，约100mM至约450mM，约100mM至约400mM，约100mM至约350mM，约100mM至约300mM，约100mM至约250mM，约100mM至约200mM，约100mM至约150mM，约120mM至约470mM，约120mM至约420mM，约120mM至约370mM，约120mM至约320mM，约120mM至约270mM，约120mM至约220mM，约120mM至约170mM，约150mM至约500mM，约150mM至约450mM，约150mM至约400mM，约150mM至约350mM，约150mM至约300mM，约150mM至约250mM，约150mM至约200mM，约200mM至约500mM，约200mM至约450mM，约200mM至约400mM，约200mM至约350mM，约200mM至约300mM，约200mM至约250mM，约225mM至约465mM，约225mM至约425mM，约225mM至约365mM，约225mM至约325mM，约225mM至约265mM，约250mM至约500mM，约250mM至约450mM，约250mM至约400mM，约250mM至约350mM，约250mM至约300mM，约300mM至约500mM，约300mM至约450mM，约300mM至约400mM，约300mM至约350mM，约350mM至约500mM，约350mM至约450mM，约350mM至约400mM，约400mM至约500mM，约400mM至约450mM，或约450mM至约500mM的赋形剂。在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约10mM至约350mM，比如约130mM至约170mM和约225mM至约265mM，和最优选约150mM或约245mM的赋形剂。
在一种优选实施方式中，赋形剂是浓度约150mM的NaCl。在又一优选的实施方式中，赋形剂是浓度约245mM的NaCl。
如果希望，组合物还能够含有次要量的润湿剂，填充剂，乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物能够呈溶液，悬浮液，乳液，冻干的粉末或饼等形式。配制剂应适应给药模式。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，则预期其在本发明免疫原性组合物中使用。
在一种实施方式中，免疫原性组合物是冻干的，任选在至少一种赋形剂存在下进行。在优选的实施方式中，至少一种赋形剂选自淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇，异麦芽糖醇，明胶，麦芽，稻，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，氯化钠(NaCl)，干脱脂乳，甘油，丙二醇，水和乙醇。在优选的实施方式中，至少一种赋形剂选自蔗糖，甘露醇和甘氨酸。在特别的实施方式中，至少一种赋形剂是蔗糖。在又一实施方式中，冻干组合物包含额外的赋形剂。在一种所述实施方式中，额外的赋形剂是甘露醇或甘氨酸。
在又一实施方式中，冻干组合物包含约1％(w/v)至约10％(w/v)，比如约1.5％，2.0％，2.5％，3.0％，3.5％，4.0％，4.5％，5.0％，5.5％，6.0％，6.5％，7.0％，7.5％，8.0％，8.5％，9.0％，9.5％或10.0％的至少一种糖类。在优选的实施方式中，冻干组合物包含大于约5.5％(w/v)比如大于约7.0％(w/v)的至少一种赋形剂。在又一实施方式中，冻干组合物包含约1％(w/v)至约10％(w/v)，比如约1.5％，2.0％，2.5％，3.0％，3.5％，4.0％，4.5％，5.0％，5.5％，6.0％，6.5％，7.0％，7.5％，8.0％，8.5％，9.0％，9.5％或10.0％的额外的赋形剂。在优选的实施方式中，冻干组合物包含约1％(w/v)至约10％(w/v)的所述至少一种赋形剂和约1％(w/v)至约10％(w/v)的额外的赋形剂。
在又一实施方式中，冻干组合物在水，注射用水(WFI)，佐剂悬浮液或盐水中重构。在优选的实施方式中，稀释剂是铝基佐剂悬浮液，比如磷酸铝悬浮液。
在一种实施方式中，组合物包括分离的本文描述的多糖和载体分子。适宜的载体分子可以包括蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙二醇的酸，聚合的氨基酸，氨基酸共聚物，脂质聚集体(比如油微滴或脂质体)和无活性的病毒颗粒。粒状载体的实例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-co-乙交酯)(称为PLG)的微粒。
本发明免疫原性组合物能够还包含一种或多种额外的"免疫调节剂"，其是扰乱或改变免疫系统从而观察到体液免疫和/或细胞介导免疫的上调或下调的试剂。在一种特别实施方式中，优选的是免疫系统的体液和/或细胞介导臂的上调。某些免疫调节剂的实例包括例如佐剂或细胞因子，或ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)，尤其是描述于U.S.专利号5,254,339。术语"佐剂"是指增强对抗原免疫应答的化合物或混合物，如后文描述。
能够用于本发明组合物中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.，Hamilton，Mont.)；矿物凝胶比如氢氧化铝胶；油包水乳液比如弗氏完全和不完全佐剂；嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)；SAF-M(Chiron，Emeryville，Calif.)；佐剂；皂甙；Quil A或其它皂甙级分；一磷酰基脂质A；和阿夫立定脂质-胺佐剂。在本发明疫苗中用作佐剂的水包油乳液的非限制性实例包括MF59(U.S.专利号6,299,884)(含有5％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.5％Span 85(任选地含有各种量的MTP-PE)，其用微流体化器比如模型110Y微流体化器(微流控，Newton，MA)配制成亚微米颗粒)，和SAF(含有10％角鲨烯、0.4％聚山梨酯80、5％PLURONIC-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化为亚微米乳液或涡流搅拌产生较大颗粒尺寸乳液)；修饰的SEAM62(含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)85洗涤剂(ICI表面活性剂)、0.7％(v/v)聚山梨酯80洗涤剂(ICI表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200 mcg/ml Quil A、100 mcg/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂)；和修饰的SEAM 1/2(含有5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)85洗涤剂、0.7％(v/v)聚山梨酯80洗涤剂、2.5％(v/v)乙醇、100 mcg/ml Quil A和50 mcg/ml胆固醇)。
用来增强免疫应答的适宜佐剂还包括但不限于MPLTM(3-O-脱酰化的一磷酰基脂质A，Corixa，Hamilton，MT)，其描述于U.S.专利号4,912,094。还适于用作佐剂的是合成脂质A类似物或氨基烷基氨基葡萄糖磷酸酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可获自Corixa(Hamilton，MT)并且其描述于U.S.专利号6,113,918。One such AGP是2-[(R)-3-十四碳酰基氧基十四碳酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四碳酰氧基十四碳酰基]-2-[(R)-3-十四碳酰基氧基十四碳酰基-氨基]-b-D-葡萄吡喃糖苷，其也称为529(原称为RC529)。该529佐剂配制为含水形式(AF)或稳定乳液(SE)。
其它佐剂还包括环糊精衍生物(U.S.专利号6,165,995)；聚阴离子聚合物(U.S.专利号6,610,310)；胞壁酰肽，比如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，和N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)；Amphigen；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；PLURONIC多元醇；灭活的博德特氏菌；皂甙，比如StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，描述于U.S.专利号5,057,540；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成多核苷酸比如含有CpG基序的寡核苷酸(例如U.S.专利号6,207,646)；IC-31(IntercellAG，Vienna，奥地利)，描述于欧洲专利号1,296,713和1,326,634；百日咳毒素(PT)或其突变型，霍乱毒素或其突变型(例如U.S.专利号7,285,281，7,332,174，7,361,355和7,384,640)；或大肠杆菌热不稳定型毒素(LT)或其突变型，特别LT-K63，LT-R72(例如U.S.专利号6,149,919，7,115,730和7,291,588)。
能够包括在疫苗中的其它"免疫调节剂"包括例如下述的一种或多种：白细胞介素1-α，1-β，2，4，5，6，7，8，10，12(参见例如U.S.专利号5,723,127)，13，14，15，16，17和18(及其突变形式)；干扰素-α，β和γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见例如U.S.专利号5,078,996和ATCC保藏号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；或肿瘤坏死因子α和β。也与本文描述的免疫原性组合物使用的其它佐剂包括趋化因子，包括但不限于MCP-1，MIP-1α，MIP-1β和RANTES；粘着分子，比如选择素例如L-选择素、P-选择素和E-选择素；粘蛋白类分子例如CD34，GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族的成员比如LFA-1，VLA-1，Mac-1和p150.95；免疫球蛋白总类的成员比如PECAM，ICAMs例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3；共刺激分子比如B7-1，B7-2，CD40和CD40L；生长因子类，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；和半胱天冬酶(ICE)。
应理解决定是否使用免疫调节剂和/或佐剂或选择使用哪种免疫调节剂和/或佐剂将取决于疫苗或免疫原性组合物将给予至的受试者，注射途径和待给予的注射数。例如，如果受试者已天然暴露于病原物，可以不需要佐剂，原因是疫苗抗原能够有效地诱导记忆应答。在某些实施方式中，免疫原性组合物将包括一种或多种佐剂。在一种实施方式中，免疫原性组合物包含铝基佐剂。在一种所述实施方式中，铝佐剂是氢氧化铝，磷酸铝或羟基磷酸铝。在特别的实施方式中，佐剂是磷酸铝。在本发明的又一实施方式中，免疫原性组合物包含QS-21作为佐剂。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约0.1mg/ml至约1.0mg/ml，0.1mg/ml至约0.9mg/ml，0.1mg/ml至约0.8mg/ml，0.1mg/ml至约0.7mg/ml，0.1mg/ml至约0.6mg/ml，0.1mg/ml至约0.5mg/ml，0.1mg/ml至约0.4mg/ml，0.1mg/ml至约0.3mg/ml，0.1mg/ml至约0.2mg/ml，0.25mg/ml至约0.95mg/ml，0.25mg/ml至约0.85mg/ml，0.25mg/ml至约0.75mg/ml，0.25mg/ml至约0.65mg/ml，0.25mg/ml至约0.55mg/ml，0.25mg/ml至约0.45mg/ml，0.25mg/ml至约0.35mg/ml，0.5mg/ml至约1.0mg/ml，0.5mg/ml至约0.9mg/ml，0.5mg/ml至约0.8mg/ml，0.5mg/ml至约0.75mg/ml，0.5mg/ml至约0.7mg/ml，0.5mg/ml至约0.65mg/ml，0.5mg/ml至约0.6mg/ml，0.75mg/ml至约1.0mg/ml，0.75mg/ml至约0.95mg/ml，0.75mg/ml至约0.9mg/ml，和0.75mg/ml至约0.85mg/ml的佐剂。在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含浓度约0.25mg/ml至约0.75mg/ml，和最优选约0.5mg/ml的佐剂。
在优选的实施方式中，佐剂是铝基的，浓度约0.5mg/ml。在一种所述实施方式中，铝基佐剂是磷酸铝或羟基磷酸铝。在又一实施方式中，铝基佐剂是氢氧化铝。
应注意包含铝基佐剂的免疫原性组合物倾向于随时间分相；铝颗粒将在储存期间从液体作为沉淀物沉淀。为了确保成功给药，免疫原性组合物必须在视觉上均匀和在给药之前再悬浮。相应地，重要的是容易均匀地再悬浮组合物。在本发明的一个方面，免疫原性组合物在约50次或更少次振摇，比如约40或更少次振摇，约30或更少次振摇，约25或更少次振摇，约20或更少次振摇，约15或更少次振摇，约10或更少次振摇，或约5或更少次振摇内再悬浮。在优选的实施方式中，免疫原性组合物在约10次或更少的振摇内再悬浮。在本发明的又一方面，免疫原性组合物在约1至约50次振摇，比如约1至约40次振摇，约1至约30次振摇，约1至约25次振摇，约1至约20次振摇，约1至约15次振摇，约1至约10次振摇，或约1至约5次振摇内再悬浮。在优选的实施方式中，免疫原性组合物在约1至约10次振摇内再悬浮。
在本发明的一个方面，将免疫原性组合物充入容器。在一种实施方式中，容器选自小瓶，烧瓶，口袋和注射器。在一种实施方式中，容器由玻璃，金属(比如钢、不锈钢和铝)，和聚合物(比如热塑性塑料、弹性体、热塑性-弹性体)制成。在一种实施方式中，容器是硅化的。在优选的实施方式中，容器是注射器，和最优选玻璃注射器。
在一种特别实施方式中，将免疫原性组合物充入注射器，其具有约1mm至约15mm，比如约1mm至约11mm，约1mm至约10mm，约1mm至约9mm，约1mm至约8mm，约1mm至约7mm，约1mm至约6mm，约1mm至约5mm，约1mm至约4mm，约1mm至约3mm，约2mm至约15mm，约2mm至约11mm，约2mm至约10mm，约2mm至约9mm，约2mm至约8mm，约2mm至约7mm，约2mm至约6mm，约2mm至约5mm，约2mm至约4mm，约3mm至约15mm，约3mm至约11mm，约3mm至约10mm，约3mm至约9mm，约3mm至约8mm，约3mm至约7mm，约32mm至约6mm，约3mm至约5mm，约4mm至约15mm，约4mm至约11mm，约4mm至约10mm，约4mm至约9mm，约4mm至约8mm，约4mm至约7mm，约4mm至约6mm，约5mm至约15mm，约5mm至约11mm，约5mm至约10mm，约5mm至约9mm，约5mm至约8mm，或约5mm至约7mm的顶部空间。在优选的实施方式中，顶部空间是约2mm至约6mm，和最优选约4mm。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含如本文描述的多糖-蛋白质缀合物，缓冲剂，表面活性剂，赋形剂和任选的佐剂，其中组合物缓冲至约6.0至约7.5的pH。
在一种所述实施方式中，免疫原性组合物包含GBS多糖-蛋白质缀合物，缓冲剂，表面活性剂，赋形剂和任选的佐剂，其中组合物缓冲至约6.0至约7.5的pH和其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含GBS多糖-蛋白质缀合物，组氨酸，聚山梨醇-80，氯化钠和任选的磷酸铝，其中组合物缓冲至约6.0至约7.0的pH。
在一种特别实施方式中，免疫原性组合物包含GBS多糖-蛋白质缀合物，组氨酸，聚山梨醇-80，氯化钠和任选的磷酸铝，其中组合物缓冲至约6.0至约7.0的pH和其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。
在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含约5mcg/ml至约50mcg/ml GBS多糖-蛋白质缀合物，约10mM至约25mM组氨酸，约0.01％至约0.03％(v/w)聚山梨醇-80，约10mM至约250mM氯化钠，和任选的约0.25mg/ml至约0.75mg/ml作为磷酸铝的铝，其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。
在又一实施方式中，免疫原性组合物包含GBS多糖-蛋白质缀合物，磷酸，聚山梨醇-80，氯化钠和磷酸铝，其中组合物缓冲至约6.0至约7.5的pH。
在额外的实施方式中，免疫原性组合物包含GBS多糖-蛋白质缀合物，磷酸，聚山梨醇-80，氯化钠和磷酸铝，其中组合物缓冲至约6.0至约7.5的pH和其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。
在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含约5mcg/ml至约50mcg/ml GBS多糖-蛋白质缀合物，约10mM至约25mM磷酸，约0.01％至约0.03％(v/w)聚山梨醇-80，约10mM至约350mM氯化钠，和约0.25mg/ml至约0.75mg/ml作为磷酸铝的铝，其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。
在一种所述实施方式中，免疫原性组合物包含至少两种GBS多糖-蛋白质缀合物，缓冲剂，表面活性剂，赋形剂和任选的佐剂，其中组合物缓冲至约6.0至约7.5的pH和其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖血清型IV和选自Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型。
在一种特别实施方式中，免疫原性组合物包含至少两种GBS多糖-蛋白质缀合物，组氨酸，聚山梨醇-80，氯化钠和任选的磷酸铝，其中组合物缓冲至约6.0至约7.0的pH和其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖血清型IV和选自Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型。
在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含各约5mcg/ml至约50mcg/ml的至少两种GBS多糖-蛋白质缀合物，约10mM至约25mM组氨酸，约0.01％至约0.03％(v/w)聚山梨醇-80，约10mM至约250mM氯化钠和任选的约0.25mg/ml至约0.75mg/ml作为磷酸铝的铝，其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖血清型IV和选自Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型。
在又一特别的实施方式中，免疫原性组合物包含至少两种GBS多糖-蛋白质缀合物，磷酸，聚山梨醇-80，氯化钠和磷酸铝，其中组合物缓冲至约6.0至约7.5的pH和其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖血清型IV和选自Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型。
在一种优选实施方式中，免疫原性组合物包含各约5mcg/ml至约50mcg/ml的至少两种GBS多糖-蛋白质缀合物，约10mM至约25mM磷酸，约0.01％至约0.03％(v/w)聚山梨醇-80，约10mM至约350mM氯化钠和约0.25mg/ml至约0.75mg/ml作为磷酸铝的铝，其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖血清型IV和选自Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型。
免疫原性组合物的评价
用各种体外测试来评价本发明免疫原性组合物的免疫原性。例如，体外调理测试进行如下：将链球菌细胞、含有对有关抗原特异性的抗体的热灭活血清和外源补体源的混合物一起温育。调理吞噬在温育新鲜分离的多形核细胞(PMN's)或分化的效应细胞比如HL60s和抗体/补体/链球菌细胞混合物期间进行。细菌细胞被抗体包覆而补体在调理吞噬时被杀灭。从调理吞噬恢复的存活细菌的菌落形成单元(cfu)通过平板接种测试混合物来确定。滴定度报告为提供50％细菌杀灭的最高稀释度的倒数，通过与测试对照比较来确定。
全细胞ELISA测试还可以用来评价抗原的表面暴露和体外免疫原性，其中将有关细菌品系(无乳链球菌)包衣至板比如96孔板上，和将来自免疫动物的试验血清与细菌细胞反应。如果对试验抗原特异性的抗体与抗原的表面暴露表位反应，其能够通过本领域技术人员已知的标准方法检测。另选地，流式细胞术可以用来测量荚膜多糖抗原的表面暴露和抗体包括单克隆抗体的特异性。
展示希望体外活性的抗原可以然后在体内动物挑战模型中测试。在某些实施方式中，免疫原性组合物通过本领域技术人员已知的免疫方法和途径(例如，鼻内、肠胃外、口服、直肠、阴道、透皮、腹腔内、静脉内、皮下等)用于动物(例如小鼠)的免疫。在用GBS免疫原性组合物免疫动物之后，用无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)品系攻击动物并测试对链球菌感染的抗性。
在一种实施方式中，免疫不含病原物的小鼠和用无乳链球菌攻击。比如说，用一次或多次给药的免疫原性组合物中的希望抗原免疫小鼠。随后，用无乳链球菌攻击小鼠和在攻击后监测随时间的生存。
使用方法
"免疫受损的"如本文所用是指受试者，其罹患免疫系统细胞和/或体液臂的缺乏。相应地，预期的是免疫功能的缺乏程度从免疫过程的轻度病损变化至完全免疫抑制。
术语"受试者"是指哺乳动物，鸟，鱼，爬行动物或任何其它动物。术语"受试者"也包括人。术语"受试者"也包括家养宠物。家养宠物的非限制实例包括：犬，猫，猪，兔，大鼠，小鼠，沙鼠，仓鼠，豚鼠，雪貂，鸟类，蛇，蜥蜴，鱼，龟和蛙。术语"受试者"也包括牲畜动物。牲畜动物的非限制实例包括：羊驼，野牛，骆驼，牛，鹿，猪，马，美洲驼，骡，驴，绵羊，山羊，兔，驯鹿，牦牛，鸡，鹅和火鸡。
如本文所用，"治疗"(包括其变化例如"治疗的"或"被治疗")是指下述的任何一种或多种：(i)预防感染或再感染，如传统疫苗，(ii)降低症状严重性或消除症状，和(iii)实质或完全消除有关的病原或障碍。于是，治疗可以预防性(在感染之前)或治疗性(在感染之后)施行。在本发明中，能够使用预防性或治疗性的治疗。根据本发明的具体实施方式提供组合物和方法，其治疗包括预防性和/或治疗性使得宿主动物对微生物感染(例如细菌比如无乳链球菌)免疫。本发明方法用于将预防性和/或治疗性免疫赋予受试者。本发明方法还能够在受试者上实施用于生物医药研究应用。
在又一方面，本发明涉及通过向受试者给予有效量的本文描述的免疫原性组合物而在受试者中诱导对GBS的免疫应答的方法。在一种实施方式中，本发明涉及通过向受试者给予有效量的本文描述的免疫原性组合物而在受试者中预防或减少与B族链球菌有关的疾病或病况的方法。在一个方面，本发明涉及本文描述的免疫原性组合物，用作药物。在一个方面，本发明涉及本文描述的免疫原性组合物，用于在受试者中诱导对GBS的免疫应答的方法。在特别的实施方式中，受试者是计划怀孕的女性或怀孕的女性。在一种所述实施方式中，怀孕的女性处于怀孕的后半程，比如至少20周或至少27周妊娠。在优选的实施方式中，怀孕的女性处于27周至36周妊娠。在又一实施方式中，受试者是较老的成人，比如50岁或更老，65岁或更老和85岁或更老的成人。在又一实施方式中，受试者是免疫受损的。在一个方面，受试者可以具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病或肝病。在优选的实施方式中，B族链球菌是无乳链球菌。
在一种实施方式中，免疫原性组合物包含多糖-蛋白质缀合物，包含GBS血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少一种额外血清型。在又一实施方式中，缀合物包含GBS血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少两种额外血清型。在额外的实施方式中，缀合物包含GBS血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少三种额外血清型。在又一实施方式中缀合物包含GBS血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少四种额外血清型。在特别的实施方式中，缀合物包含GBS血清型Ia，Ib，II，III和IV。在又一实施方式中缀合物包含GBS血清型IV和选自血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX的至少五种额外血清型。在又一实施方式中组合物包含GBS血清型V。在特别的实施方式中，缀合物包含GBS血清型Ia，Ib，II，III和V。在优选的实施方式中，免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V的六种多糖-蛋白质缀合物。本发明的一个方面涉及不具免疫干扰的免疫原性组合物。
免疫原性组合物的免疫原性或有效量能够通过进行剂量应答研究确定，其中受试者用渐增量的免疫原性组合物免疫和分析免疫应答以确定最佳剂量。研究的起始点能够推断自动物模型的免疫数据。剂量能够取决于个体特定条件变化。该量能够在常规试验中通过本领域技术人员已知的手段确定。
向受试者给予适当给药数的免疫学有效量的免疫原性组合物以引起免疫应答。剂量能够变化取决于个体特定条件比如年龄和重量。该量能够在常规试验中通过本领域技术人员已知的手段确定。
在一种实施方式中，给予本发明免疫原性组合物的患者显示无乳链球菌携带率的降低。在给药免疫原性组合物之后所述携带降低或作为非携带者的延长时间段从医学需要角度来看是显著的。例如，携带者中的总无乳链球菌携带降低可以在一次给予本发明免疫原性组合物之后评价。例如，在给药免疫原性组合物之前1天，可以通过用鼻、咽喉、腋窝、直肠、会阴和阴道拭子并随后培养以确定其携带状态来筛选18-50岁的成人组的携带情况。随后，能够给予该组本发明免疫原性组合物，其中一组接受对照。鼻、咽喉、腋窝、直肠、会阴和阴道拭子在12周时间段每周进行，和在给药免疫原性组合物之后每月进行多至6月，并与安慰剂对比。主要目的是在给药免疫原性组合物vs安慰剂之后，以3个月间隔在免疫后比较患者携带率。
抗体
"抗体"是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一种抗原识别位点特异性结合至靶标比如碳水化合物，多核苷酸，脂质，多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，除非上下位另有指定，该术语期望不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，还涵盖基因工程抗体(例如嵌合、人源化和/或衍生化以改变效应子功能、稳定性和其它生物学活性)及其片段(比如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv)，单链(ScFv)和域抗体，包括鲨鱼和驼羊抗体)，和包含抗体部分的融合蛋白质，多价抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展示所希望的生物学活性)和如本文描述的抗体片段，和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体比如IgG、IgA或IgM(或其子类)，和抗体不需要属于任何特定类别。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白能够划分为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且它们当中数种可以进一步划分为子类(同种型)例如人中的IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。相应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。
"抗体片段"仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留通常与该部分存在于完整抗体中有关的功能中的至少一种、优选绝大多数或全部。
抗体的"功能活性"或"功能抗体"如本文所用是指抗体，其至少能够特异性结合抗原。额外功能是本领域已知的和可以包括免疫系统的额外组分，其比如通过调理作用、ADCC或补体介导的细胞毒性引起病原物的清除或杀灭。在抗原结合之后，任何后续抗体功能能够通过抗体的Fc区域介导。抗体调理吞噬测试(OPA)是体外测试，其设计用来体外测量Ig补体辅助的效应细胞(白血细胞)的细菌杀灭，从而模仿生物学过程。抗体结合还可以直接抑制其结合的抗原的生物学功能。在某些实施方式中，"功能抗体"是指有功能的抗体，其通过在动物效力模型中杀灭细菌或展示抗体杀灭细菌的调理吞噬性杀灭测试来测量。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其特异性结合至本文描述的多糖。"分离的"抗体如本文所用是指抗体，其已被鉴定并从其天然环境组分分离和/或回收。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，和可以包括酶、激素类和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在示范性实施方式中，抗体将(1)纯化为通过Lowry方法测定大于95％重量和最优选大于99％重量的抗体，(2)纯化至足够的程度从而通过使用转杯式序列分析仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列，或(3)纯化至均匀，其通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下用Coomassie蓝或优选银染料进行。分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体，原因是抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
"特异性结合至"特定多糖或特定多糖上的表位或对特定多糖或特定多糖上的表位"特定性"的抗体是结合至所述特定多糖或特定多糖上的表位但不实质结合至任何其它多糖或多糖表位的那些。
词汇"标记"用于本文时是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至抗体以便产生"标记的"抗体。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)或在酶标记的情况下可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。
本发明还提供抗体和抗体组合物，其特异性和选择性结合至本发明免疫原性组合物的一种或多种抗原。在某些实施方式中，抗体在向受试者给予本发明免疫原性组合物时产生。在某些实施方式中，本发明提供纯化或分离的抗体，其针对本发明免疫原性组合物的一种或多种抗原。在某些实施方式中，本发明抗体通过在动物效力模型中杀灭细菌或经由调理吞噬性的杀灭测试所测是有功能的。在某些实施方式中，本发明抗体向受试者赋予被动免疫。本发明还提供编码本发明抗体或抗体片段的多核苷酸分子，和用本领域技术人员熟知的技术产生本发明抗体或抗体组合物的细胞或细胞系(比如杂交瘤细胞或其它基因工程细胞系，用于重组产生抗体)和转基因动物。
本发明抗体或抗体组合物可以用于在受试者中治疗或预防链球菌感染、与无乳链球菌有关的疾病或病况的方法中，所述方法包括产生多克隆或单克隆抗体制剂，和用所述抗体或抗体组合物赋予受试者被动免疫。本发明抗体还可以用于诊断方法，例如检测本发明免疫原性组合物的一种或多种抗原的存在或对其水平定量。
应答重复结构比如本发明多糖的抗体可以展示某些独特的特征。例如，重复单元的规律性可以意味着具有非常不同的分子量的抗原分子能够结合至多糖特异性的抗体。第二，较大长度多糖的重复结构能够诱导T-细胞独立性的抗体应答。因此，在使用缀合至具有T-辅助细胞表位的蛋白质载体的多糖时，T-细胞独立性和T-细胞依赖性的抗体应答均能被刺激。因此，免疫应答能够通过适当选择多糖大小和是否使用载体蛋白质来修饰。
多克隆抗体
在某些实施方式中，抗多糖抗体是多克隆抗体。多克隆抗体如本文所定义是指具有不同特异性的抗体的混合物，其衍生自血清制剂和源自不同的B-细胞克隆。多克隆抗体的制备和表征是本领域已知的。
多克隆抗体在受试者中例如在哺乳动物中培养：一次或多次注射给予本文描述的免疫原或免疫原性组合物和如果希望的佐剂、缓冲剂和/或稀释剂。一系列动物种类可以用于制备特异性抗血清。一般来说，用于制备抗糖类多克隆抗血清的动物是非人灵长类，山羊，绵羊，兔，小鼠，大鼠，仓鼠或豚鼠。一般来说，通过多次注射将含或包含佐剂的免疫原或免疫原性组合物注射入哺乳动物中。免疫原性物质可以包括多糖、低聚糖、本文描述的多糖、多糖-蛋白质缀合物，或免疫原的较大组装物。一般来说，在首次免疫之后2-6周开始，从免疫动物收集血液，使其凝块和收获血清。血清含有来自免疫动物的抗糖类多克隆抗体和常常称为抗血清。
单克隆抗体
抗糖类单克隆抗体可以通过使用已知的杂交瘤技术制备。一般来说，制备单克隆抗体牵涉首先用包含多糖、低聚糖、本发明的多糖或多糖-蛋白质缀合物的所选免疫原免疫适宜靶标动物宿主。如果希望，可以包括佐剂，缓冲剂和/或稀释剂。进行免疫的方式足以引起B淋巴细胞产生或表达特异性结合至多糖或其缀合物的抗体。另选地，淋巴细胞在体外免疫。
然后用适宜融合剂比如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。淋巴细胞的来源决定单克隆抗体是人类或动物来源。通常，如果希望人源抗体和细胞则使用外周血液淋巴细胞("PBLs")，而如果希望非人类哺乳动物来源则使用脾细胞或淋巴结细胞。
无限增生化细胞系一般是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞在适宜培养基中培养，其优选含有抑制未融合的无限增生化细胞生长或生存的一种或多种物质。例如，如果亲代细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷("HAT medium")，这些物质阻止HGPRT-缺乏型细胞的生长。
无限增生化细胞系出于实际考虑比如来源种类，融合和生长特征选择。例如，适宜的无限增生化细胞系是那些，其有效融合、支持所选产抗体细胞稳定高水平表达抗体、和对培养基比如HAT培养基敏感。无限增生化细胞系的实例包括：鼠类骨髓瘤系。人类骨髓瘤和小鼠-人类种间骨髓瘤细胞系也已描述用于制备人类单克隆抗体。
单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌入培养基中。然后测试培养基中存在的识别和结合多糖的单克隆抗体。杂交瘤细胞所产生的特定单克隆抗体的抗多糖结合特异性通过本领域熟知的许多程序之一确定。例如，抗体结合特异性可以确定如下：免疫沉淀，放射免疫测定(RIA)，西方印迹，酶联免疫吸附测试(ELISA)或表面等离子体共振(例如Biacore)。单克隆抗体识别的精确表位通过表位测绘来确定。所述技术和测试是本领域熟知的。
在鉴定产生具有希望特异性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆通过有限稀释和用标准方法培养进行亚克隆。对于该目的适宜的培养基包括例如Dulbecco改良Eagle培养基和RPMI-1640培养基。另选地，杂交瘤细胞在哺乳动物体内作为腹水生长。由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基或腹水通过常规免疫球蛋白纯化程序分离或纯化，例如蛋白质A-琼脂糖，羟基磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析或亲和力色谱法。
另选地，具有希望特异性和来自希望来源种类的抗体能够通过使用噬菌体展示文库获得。额外地，特别适于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例能够在本领域找到。
抗体的使用
在一个方面，本发明涉及本文描述的免疫原性组合物用于产生GBS抗体和/或抗体片段的用途。本文描述的多糖-蛋白质缀合物和/或自其产生的抗体可以用于本领域技术人员已知的各种免疫诊断的技术，包括ELISA-和微阵列-相关技术。此外，这些试剂可以用来评价例如对免疫原性多糖缀合物的抗体应答，包括血清抗体水平。本发明测试方法可以牵涉使用标记比如荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记或染料分子，和/或第二免疫学试剂，其用于直接或间接检测在生物学样品中的抗原或抗体与结合至固体载体的相应抗体或抗原的复合物。
所产生的抗体或抗体片段还可以用于被动免疫治疗或预防链球菌感染。
产生多糖的方法
在还又一方面，本发明涉及产生本文描述的多糖的方法。方法包括培养GBS和收集细菌产生的多糖。在一种实施方式中，GBS包括无乳链球菌。细菌可以是任何无乳链球菌品系。在优选的实施方式中，细菌是包囊的无乳链球菌品系。用于本发明的无乳链球菌品系包括090，A909(ATCC保藏号BAA-1138)，515(ATCC保藏号BAA-1177)，B523，CJB524，MB 4052(ATCC保藏号31574)，H36B(ATCC保藏号12401)，S40，S42，MB 4053(ATCC保藏号31575)，M709，133，7357，PFEGBST0267，MB 4055(ATCC保藏号31576)，18RS21(ATCC保藏号BAA-1175)，S16，S20，V8(ATCC保藏号12973)，DK21，DK23，UAB，5401，PFEGBST0708，MB 4082(ATCC保藏号31577)，M132，110，M781(ATCC保藏号BAA-22)，D136C(3)(ATCC保藏号12403)，M782，S23，120，MB 4316(M-732；ATCC保藏号31475)，M132，K79，COH1(ATCC保藏号BAA-1176)，PFEGBST0563，3139(ATCC保藏号49446)，CZ-NI-016，PFEGBST0961，1169-NT1，CJB111(ATCC保藏号BAA-23)，CJB112，2603V/R(ATCC保藏号BAA-611)，NCTC 10/81，CJ11，PFEGBST0837，118754，114852，114862，114866，118775，B 4589，B 4645，SS1214，CZ-PW-119，7271，CZ-PW-045，JM9130013，JM9130672，IT-NI-016，IT-PW-62，和IT-PW-64。
本文描述的多糖可以通过在适当的培养基中培养GBS而产生。适当的培养基可以包括哥伦比亚肉汤。培养基可以包括葡萄糖，氯化高铁血红素和/或葡萄糖。优选，培养基包括哥伦比亚肉汤和葡萄糖。如果无乳链球菌用哥伦比亚肉汤和葡萄糖培养，则优选的培养温度是20至40℃，优选37℃。在优选的实施方式中，细菌在需氧条件下培养。在又一优选的实施方式中，细菌培养12至60小时。
多糖可以从所得培养物收集：使用本领域已知的从培养物收集靶标物质的方法，例如加热，酶处理，离心，沉淀，用活性碳处理，和/或过滤。(参见例如U.S.专利申请公开Nos.2006/0228380，2006/0228381，2007/0184071，2007/0184072，2007/0231340和2008/0102498；国际专利申请公开No.WO 2008/118752)。在一种实施方式中，离心含有细菌和多糖的培养物和用酶例如溶菌酶，RNase，DNase，链霉蛋白酶，变溶菌素及其组合处理。例如，在一种实施方式中，将适当的有机溶剂加至获得的上清液以沉淀蛋白质，和离心除去沉淀。然后，多糖可以通过进一步向上清液加入适当的有机溶剂沉淀，和可以离心收集多糖。更特别地，本文描述的多糖可以获得如下：将最终浓度约25体积％的乙醇加入已除去细菌的上清液，离心除去含有蛋白质的沉淀，进一步对其加入乙醇至最终浓度约75体积％，然后离心收集沉淀。所得沉淀可以用氮干燥。所得沉淀可以再悬浮于Tris和0.05％叠氮化Na。
本发明的又一方面提供新方法，用有机试剂比如衍生化的羟胺化合物分离大致完整的高分子量CPs同时保留N-和O-乙酰基。由于该方法不裂解细胞，离心分离的CPs被最少的细胞内组分污染和可以导致较高的总收率。此外，这些试剂将B族抗原杂质裂解为很小片段(原因是存在多个磷酸二酯连接)，其能够通过透析过滤容易地除去。
在一种实施方式中，CP是分离如下：将羟胺与包含产荚膜多糖细菌的细胞糊反应。在特别的实施方式中，方法还包括离心步骤。在又一实施方式中，方法还包括过滤步骤。在又一实施方式中，产荚膜多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，伤寒杆菌(Salmonella typhi)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
在本发明的一个方面，羟胺可以是列于实施例2表2的那些。在优选的实施方式中，羟胺选自二苄基羟胺；二乙基羟胺；羟胺；乙二胺；三亚乙基四胺；1,1,4,7,10,10六甲基三亚乙基四胺；和2,6,10,三甲基2,6,10三氮杂十一烷。
在本发明的一个方面，羟胺浓度是约5mM至约200mM，比如约5mM至约150mM，约5mM至约100mM，约5mM至约75mM，约5mM至约50mM，约5mM至约25mM，约5mM至约10mM，10mM至约200mM，比如约10mM至约150mM，约10mM至约100mM，约10mM至约75mM，约10mM至约50mM，约10mM至约25mM，约25mM至约200mM，约25mM至约150mM，约25mM至约100mM，约25mM至约75mM，约25mM至约50mM，约50mM至约200mM，约50mM至约150mM，50mM至约100mM，和约50mM至约75mM。
在又一方面，反应pH保持在约5.5至约9.5，比如约5.5至约9.0，约5.5至约8.5，约5.5至约8.0，约5.5至约7.5，约5.5至约7.0，约5.5至约6.5，约6.0至约9.5，约6.0至约9.0，约6.0至约8.5，约6.0至约8.0，约6.0至约7.5，约6.0至约7.0，约6.5至约9.5，约6.5至约8.5，约6.5至约8.0，约6.5至约7.5，约7.0至约9.5，约7.0至约9.0，7.0至约8.5，和约7.0至约8.0。
在本发明的又一方面中，反应发生在温度约20℃至约85℃，比如约20℃至约80℃，约20℃至约75℃，约20℃至约70℃，约20℃至约65℃，约20℃至约60℃，约20℃至约55℃，约20℃至约50℃，约25℃至约85℃，约25℃至约80℃，约25℃至约75℃，约25℃至约70℃，约25℃至约65℃，约25℃至约60℃，约25℃至约55℃，约25℃至约50℃，约30℃至约85℃，约30℃至约80℃，约30℃至约75℃，约30℃至约70℃，约30℃至约65℃，约30℃至约60℃，约30℃至约55℃，约30℃至约50℃，约35℃至约85℃，约35℃至约80℃，约35℃至约75℃，约35℃至约70℃，约35℃至约65℃，约35℃至约60℃，约35℃至约55℃，约40℃至约85℃，约40℃至约80℃，约40℃至约75℃，约40℃至约70℃，约40℃至约65℃，约40℃至约60℃，约45℃至约85℃，约45℃至约80℃，约45℃至约75℃，约45℃至约70℃，约45℃至约65℃，约50℃至约85℃，约50℃至约80℃，约50℃至约75℃，约50℃至约70℃，约55℃至约85℃，约55℃至约80℃，约55℃至约75℃，约60℃至约85℃，和约65℃至约85℃。
在还又一方面，反应时间是约10小时至约90小时，比如约10小时至约85小时，约10小时至约80小时，约10小时至约75小时，约10小时至约70小时，约10小时至约60小时，约10小时至约50小时，约10小时至约40小时，约10小时至约30小时，约10小时至约25小时，约10小时至约20小时，约10小时至约15小时，约15小时至约90小时，约15小时至约85小时，约15小时至约80小时，约15小时至约75小时，约15小时至约70小时，约15小时至约60小时，约15小时至约50小时，约15小时至约40小时，约15小时至约30小时，15小时至约20小时，比如约20小时至约90小时，约20小时至约85小时，约20小时至约80小时，约20小时至约75小时，约20小时至约70小时，约20小时至约60小时，约20小时至约50小时，约20小时至约40小时，约20小时至约30小时，和约20小时至约25小时。
另选地，在本发明的又一实施方式中，多糖是化学合成的。多糖可以根据常规方法化学合成。
在本发明的又一实施方式中多糖制备如下：在克隆和表达产生多糖的生物合成途径之后在代理宿主中表达。例如，可以修饰宿主细胞以产生与本文描述的多糖具有结构相似性的多糖，其中宿主细胞中产生的多糖的重复单元部分等同于本文描述的多糖的重复单元。多糖在结构上与本文描述的多糖类似，条件是例如多糖的重复单元与本文描述的多糖的重复单元相比具有缺失分支，尺寸异质和/或支化排列异质。优选，宿主细胞是细菌宿主细胞。
实施例
下述实施例展示本发明的某些实施方式。然而，应理解这些实施例仅用于示例而非意在完全定义本发明的条件和范围。应认识到，在给出典型反应条件(例如温度、反应时间等)的情况下，还能够使用在指定范围之上或之下的条件，尽管一般方便性更劣。本文提及的全部部分和百分比基于重量和全部温度用摄氏度表达，除非另有指定。
另外，下述实施例用本领域技术人员熟知和常规的标准技术进行，除非另有详细描述。如上文所指，下述实施例展示用于示例性意图，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：用去-O-乙酰化的多糖制备多糖-蛋白质缀合物
用于各自血清型的无乳链球菌品系在定义的培养基中用pH-控制在浸没的培养物中发酵。所用的程序和培养基通过实验优化并且是预先描述于von Hunolstein,C.et al.,Appl.Micro.Biotech.38(4):458-462(1993)的基础技术的延展。荚膜多糖通过NaOH处理从细胞除去。在澄清之后，一系列UF/DF、沉淀和碳过滤步骤提供纯化多糖。参见例如U.S.专利号8,652,480还原胺化化学用来将活化多糖缀合至CRM197。参见例如U.S.专利号5,360,897。
实施例2.O-乙酰化的多糖的分离
将在热杀灭和离心发酵肉汤(1.2L)之后获得的来自GBS荚膜多糖(CP)血清型Ia的细胞糊再悬浮于175mL的25mM磷酸钾缓冲剂(25mM，pH 6.9)。悬浮液与羟胺O-磺酸水溶液混合至最终浓度10mM。悬浮液pH测定为约5.8。悬浮液在55℃搅拌72小时。然后，悬浮液在约10,000rpm离心和收集上清液。分析含粗制裂解CP的上清液的分子量和收率。通过用30kDaMWCO膜用注射用水(WFI)透析过滤对剩余部分进行纯化。通过尺寸排阻色谱法和与之组合的多角度光散射检测器(SEC-MALS)(表1)进一步分析纯化多糖的分子量。
表1.通过透析过滤的GBS血清型Ia纯化
样品 Mw(kDa) 多分散性(PD)
粗制物 340 1.2
纯化多糖 320 1.3
用上文描述的方法筛选数种羟胺即氮和氧同时取代的化合物的活性。收率通过粗制上清液的凝胶渗透色谱法和与之组合的多角光散射检测(GPC-MALS)计算，使用折光率(RI)应答和0.135的比折光率增加(dn/dc)值的平方。收率取决于羟胺类型和条件比如浓度、温度和反应时间的优化(参见表2)。通常，增加的羟胺浓度，更高温度和更长反应时间导致更高收率。
表2.GBS荚膜多糖血清型Ia的各种羟胺的筛选和条件优化
发现取代的和未经取代的羟胺很有效地从细胞壁释放GBS荚膜多糖。该途径引起高分子量CPS的分离并保留N-和O-乙酰基。在筛选的数种化合物中，发现二苄基羟胺最为有效。数据示于表3([二苄基羟胺]-50mM；ph-7-8；温度-50℃；时间-24小时)。
表3.GBS CPs释放数据，用二苄基羟胺
GBS类型 Ia Ib III
多糖释放收率 86％ 81％ 46％
总纯化收率 63％ 54％ 30％
分子量(Mw) 330kDa 212kDa 171kDa
O-乙酰化(NMR) NA 31％ 37％
N-乙酰化(NMR) 106％ 104％ 87％
NA-血清型Ia是未O-乙酰化的
由于二苄基羟胺具有劣水溶解度，希望的是羟胺的备择衍生物，其自由可溶于水和具有与二苄基羟胺相似或较高的活性。在筛选数种化合物之后，发现二乙基羟胺是良好备择。数据示于表4([二乙基羟胺]-100mM；pH-7-8；温度-60℃；时间-19小时)。
表4.GBS CPs释放数据,用二乙基羟胺
GBS类型 Ia Ib III
多糖释放收率％ 100 94 59
分子量(Mw) 890kDa 560kDa 309kDa
也发现羟胺(NH2-OH)有效地从细胞壁裂解CPS。数据显示在表5([羟胺]-100mM；pH-7-7.5；温度-65℃；时间-17小时)。对于血清型III，收率是在17小时之后54％；然而，在3.5天之后收率增加至70％。
表5.GBS CPs释放数据，用羟胺
GBS类型 Ia III
多糖释放收率％ 100 54
分子量(Mw) 1160kDa 500kDa
筛选低聚胺，从细胞释放GBS荚膜多糖
发现羟胺及其取代的化合物很有效地从GBS细胞壁裂解荚膜多糖。然而，发现它们对血清型II和V效果较差。因此测试低聚胺，理由是据信它们的活性由于多个胺官能而可能更高。
发现乙二胺有效地从全部血清型释放荚膜多糖。数据示于表6([乙二胺]-50或100mM；pH 8.0；16小时；80℃；25mM EDTA)。
表6：GBS CPs释放数据，用乙二胺
GBS血清型 回收(％) Mw(kDa)
Ia 96％ 242
Ib 83％ 225
II 30％ 76
III 68％ 94
V 30％ 235
用血清型Ia和V细胞糊测试其它代表性低聚胺的活性，但是也发现对血清型V效果较差。数据示于表7([三亚乙基四胺]-100mM；pH-8.9；温度-60℃；时间-15小时)，8([1,1,4,7,10,10六甲基三亚乙基四胺]-10mM；pH-6.3；温度-60℃；时间-20小时)，和9([2,6,10,三甲基2,6,10三氮杂十一烷]-10mM；pH-7-8；温度-60℃；时间-19小时)。
表7.GBS CPs释放数据，用三亚乙基四胺
三亚乙基四胺
GBS类型 Ia V
多糖释放收率％ 100 ～10，在2.5天之后
分子量(Mw) 1280 nd
nd-未确定
表8.GBS CPs释放数据，用1,1,4,7,10,10六甲基三亚乙基四胺
1,1,4,7,10,10六甲基三亚乙基四胺
GBS类型 Ia V
多糖释放收率％ 100 ～1％
分子量(Mw) 980 nd
nd-未确定
表9.GBS CPs释放数据，用2,6,10,三甲基2,6,10三氮杂十一烷
2,6,10,三甲基2,6,10三氮杂十一烷
GBS类型 Ia V
多糖释放收率％ 100 ～1％
分子量(Mw) 1100 nd
nd＝未确定
实施例3.GBS荚膜多糖通过还原胺化缀合
活化多糖
多糖氧化在100mM磷酸钾缓冲剂(pH 6.0±0.5)中进行：依次加入计算量的500mM磷酸钾缓冲剂(pH 6.0)和注射用水(WFI)，提供最终多糖浓度2.0g/L。如果需要的，将反应pH调节至大约pH 6.0。在pH调节之后，将反应温度调节至23℃。加入大约0.25摩尔当量的高碘酸钠引发氧化。氧化反应于5±3℃在大约16小时期间进行。
活化多糖的浓缩和透析过滤用5K MWCO超滤盒进行。透析过滤对20-倍透析体积的WFI进行。然后将纯化的活化多糖储存于5±3℃。纯化的活化糖尤其表征如下：(i)比色测试糖浓度；(ii)比色测试醛浓度；(iii)氧化度；和(iv)SEC-MALLS测试分子量。
活化多糖的氧化度(DO＝糖重复单元摩尔/醛摩尔)确定如下：
糖重复单元的摩尔通过各种比色方法例如用蒽酮方法确定。借助蒽酮方法，首先通过硫酸和热作用将多糖分解为单糖。蒽酮试剂与己糖反应形成黄绿色复合物，其吸光度用分光光度法于625nm读取。在测试范围内，吸光度直接与存在的己糖量成比例。
醛的摩尔也用MBTH比色方法同时测定。MBTH测试牵涉通过将醛基(来自样品)与3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH测试试剂)反应形成吖嗪化合物。过量3-甲基-2-苯并噻唑酮腙氧化以形成反应性阳离子。反应性阳离子和吖嗪反应形成蓝色生色团。所形成的生色团然后于650nm分光读取。
将活化多糖与蔗糖赋形剂混合，和冻干
将活化多糖与蔗糖混合为25克蔗糖每克活化多糖的比率。然后冻干混合物瓶。在冻干后，将含冻干活化多糖的瓶储存在-20±5℃。计算量的CRM197蛋白质被壳式冷冻和分开冻干。冻干CRM197储存在-20±5℃。
重构冻干的活化多糖和载体蛋白质
冻干的活化多糖在无水二甲亚砜(DMSO)中重构。在多糖完全溶解后，将相等量的无水DMSO加入冻干CRM197以重构。
缀合和封端
将重构的活化多糖与重构的CRM197在反应容器中组合，随后彻底混合，获得透明溶液，随后用氰基硼氢化钠引发缀合。反应溶液中的最终多糖浓度是大约1g/L。缀合引发如下：将1.0-1.5MEq氰基硼氢化钠加入反应混合物和于23±2℃温育20-48小时。缀合反应终止如下：将2MEq硼氢化钠(NaBH4)加入封盖未反应的醛。该封端反应于23±2℃继续3±1小时。
纯化缀合物
缀合物溶液用冷5mM琥珀酸-0.9％盐水(pH 6.0)稀释1:10，准备用于通过切向流过滤用100-300K MWCO膜纯化。
使稀释的缀合物溶液通过5μm滤器，和透析过滤用5mM琥珀酸/0.9％盐水(pH 6.0)作为培养基进行。在透析过滤完成之后，将缀合物渗余物转移通过0.22μm滤器。缀合物进一步用5mM琥珀酸/0.9％盐水(pH6)稀释至大约0.5mg/mL的靶标糖浓度。另选地，缀合物用20mM组氨酸-0.9％盐水(pH 6.5)通过用100-300K MWCO膜切向流过滤纯化。完成最终0.22μm过滤步骤，获得免疫原性缀合物。
实施例4：改变缀合条件对GBS多糖-CRM197缀合物的效果
通过有意变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学(PO/RAC)条件产生GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V缀合物，包括试剂的溶剂(含水介质vs DMSO)，初始多糖的唾液酸水平变化，和氧化/糖类表位修饰的程度。通常，发现用DMSO作为溶剂产生的缀合物与用含水介质产生的缀合物相比具有更低水平的未反应(游离)多糖，更高的缀合物分子量，和更高的糖类/蛋白质比率。
产生具有较低水平未反应(游离)多糖的缀合物的缀合过程是有利的和优选的。熟知的是，高水平的未反应(游离)多糖可以导致过度的T-细胞独立性免疫应答，其具有稀释多糖-蛋白质缀合物产生的T-细胞依赖性应答的能力，由此降低该缀合物产生的免疫原性应答。
所选GBS多糖通过本领域已知方法化学去唾液酸(参见Chaffin,D.O,et al.,JBacteriol 187(13):4615-4626(2005))，产生缀合物变种以确定％去唾液酸对免疫原性的影响。大于约40％的去唾液酸(也即唾液酸水平小于约60％)对免疫原性具有负面影响。
类似地，在绝大多数情况中，氧化度小于约5或糖类表位修饰大于约20％对免疫原性具有负面影响。由于氧化通过荚膜多糖上的唾液酸发生，结果显得指出大于约20％的糖类表位修饰使唾液酸含量降低，其引起降低的免疫原性。
相反地，具有各种糖类/蛋白质比率或多糖分子量的缀合物都在小鼠中产生免疫原性应答，指出有关这些特质的相对宽范围的接受标准。
额外的缀合物变型也用备择化学途径产生。一种备择化学包括通过将多糖与羰基双三唑(CDT)反应和在DMSO中进行缀合反应而产生缀合物。在又一备择化学中，缀合物产生如下：用TEMPO[(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基]试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后在DMSO中用还原胺化化学(TEMPO/RAC)缀合，如上文实施例3详述。这些备择化学产生的全部缀合物都在小鼠中展示免疫原性，指出除PO/RAC之外的备择化学途径的适用性。然而，某些缀合化学对某些血清型与其他血清型相比更佳地进行。
OPA按照Nanra,J.S.,et al.,Hum.Vaccin.Immunother.,9(3):480-487(2013)进行，将B族链球菌分离物取代为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离物和省略预调理作用步骤。提供第三次给药后(PD3)OPA滴定度，其是10-20只小鼠的组的几何平均值，所述小鼠用各次给药1mcg/ml的各自缀合物免疫。
GBS血清型Ia多糖-CRM197缀合物
用PO/RAC和具有16-17的DO(大约6％糖类表位修饰)的活化多糖产生的缀合物展示免疫原性(缀合物1和3)。然而，使用具有5.4的DO(大约19％糖类表位修饰)的活化多糖对免疫原性具有负面影响(缀合物2)。类似地，50％的唾液酸水平几乎不产生免疫原性应答(缀合物4)。结果示于表10。
表10.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件对GBS血清型Ia-CRM197缀合物的效果
额外的缀合物变型用备择的缀合化学和缀合物分子特质产生(结果示于表11)。缀合物5产生如下：将多糖与羰基双三唑(CDT)反应和在DMSO中进行缀合反应。缀合物6产生如下：用TEMPO试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后在DMSO中用还原胺化化学缀合，如上文实施例3详述。缀合物7通过PO/RAC产生并有意变化缀合参数以产生高糖类/蛋白质比率(SPR)的缀合物。缀合物8通过PO/RAC产生，用具有低MW(40kDa)的多糖。全部这些缀合物在小鼠中展示免疫原性，指出除高碘酸盐氧化/还原胺化化学之外的备择缀合化学以及备择缀合物特质比如SPR和低初始多糖MW的适用性。
表11.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件和备择化学选择对GBS血清型Ia-CRM197缀合物的效果
GBS血清型Ib多糖-CRM197缀合物
用PO/RAC和具有15.8的DO(大约6％糖类表位修饰)的活化多糖在DMSO中产生的缀合物在小鼠中展示免疫原性(缀合物9和11)。通过PO/RAC在DMSO中产生的缀合物与通过PO/RAC在含水介质中产生的缀合物相比免疫原性稍高，在全部其它缀合物分子特质都相似(缀合物9和11，分别)。然而，使用具有4.7的DO(大约21％糖类表位修饰)的活化多糖对免疫原性具有负面影响(缀合物10)。在用PO/RAC和95％去唾液酸(5％唾液酸水平)的多糖产生的缀合物(缀合物12)中免疫原性几乎完全废除，具有很少的应答者。结果示于表12。
表12.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件对GBS血清型Ib-CRM197缀合物的效果
额外的缀合物变型用备择缀合化学和缀合物分子特质产生(结果示于表13)。缀合物13通过PO/RAC产生，在初始多糖中用具有低唾液酸化(65％)的多糖。缀合物14通过PO/RAC产生和有意变化缀合参数以产生高糖类/蛋白质比率(SPR)的缀合物。缀合物15产生如下：将多糖与羰基双三唑(CDT)反应和在DMSO中进行缀合反应。缀合物16产生如下：用TEMPO试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后用还原胺化化学在DMSO中缀合，如上文实施例3详述。全部这些缀合物在小鼠中展示免疫原性，指出除高碘酸盐氧化/还原胺化化学之外的备择缀合化学以及备择缀合物特质比如SPR和低初始多糖MW的适用性。
表13.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件和备择化学选择对GBS血清型Ib-CRM197缀合物的效果
GBS血清型II多糖-CRM197缀合物
用PO/RAC和具有4-15的DO(大约7-23％糖类表位修饰)的活化多糖产生的缀合物在小鼠中展示免疫原性(缀合物17-20)。用PO/RAC和74％唾液酸化水平(26％去唾液酸)的多糖产生的缀合物也展示免疫原性(缀合物20)。结果示于表14。
表14.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件对GBS血清型II-CRM197缀合物的效果
额外的缀合物变型用备择缀合化学和缀合物分子特质产生(结果示于表15)。缀合物21和22通过PO/RAC产生和有意变化缀合参数以产生分别低和高糖类/蛋白质比率(SPR)的缀合物。缀合物23产生如下：用TEMPO试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后用还原胺化化学在DMSO中缀合，如上文实施例3详述。缀合物24产生如下：将多糖与羰基双三唑(CDT)反应，和在DMSO中进行缀合反应。全部这些缀合物在小鼠中展示免疫原性，指出除高碘酸盐氧化/还原胺化化学之外的备择缀合化学以及备择缀合物特质比如SPR的适用性。
表15.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件和备择化学选择对GBS血清型II-CRM197缀合物的效果
GBS血清型III多糖-CRM197缀合物
用PO/RAC和具有10-17的DO(大约6-10％糖类表位修饰)的活化多糖在DMSO中产生的缀合物在小鼠中展示免疫原性(缀合物25和30)。具有2.9的DO(大约34％糖类表位修饰)或高糖类/蛋白质比率(2.1)的缀合物(缀合物26和27，分别)展示相对低的免疫原性。用PO/RAC和81％唾液酸化水平(19％去唾液酸)的多糖产生的缀合物展示免疫原性(缀合物30)。然而，用58％唾液酸化水平(42％去唾液酸)的多糖产生的缀合物展示劣免疫原性(缀合物29)。通过PO/RAC在DMSO中产生的缀合物与通过PO/RAC在含水介质中产生的缀合物相比免疫原性稍高，全部其它缀合物分子特质相似(缀合物25和28，分别)。结果示于表16。
表16.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件对GBS血清型III-CRM197缀合物的效果
额外的缀合物变型用备择缀合化学和缀合物分子特质产生(结果示于表17)。缀合物31-35通过PO/RAC产生和有意变化缀合参数以产生变化MW的缀合物。缀合物36产生如下：将多糖与羰基双三唑(CDT)反应和在DMSO中进行缀合反应。缀合物37产生如下：用TEMPO试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后用还原胺化化学在DMSO中缀合，如上文实施例3详述。全部这些缀合物在小鼠中展示免疫原性指出，除高碘酸盐氧化/还原胺化化学之外的备择缀合化学以及备择缀合物特质比如MW的适用性。与用2.9的DO(大约34％糖类表位修饰)产生的缀合物(缀合物26，上表16)相比，用低至5的DO(大约20％糖类表位修饰)产生的缀合物在小鼠中仍有免疫原性(缀合物32，表17)。
表17.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件和备择化学选择对GBS血清型III-CRM197缀合物的效果
GBS血清型IV多糖-CRM197缀合物
用PO/RAC和具有6.9-14.2的DO(大约7-14％糖类表位修饰)的活化多糖产生的缀合物在小鼠中展示免疫原性(缀合物38-41)。用PO/RAC和60％唾液酸化水平(40％去唾液酸)的多糖产生的缀合物也展示免疫原性(缀合物41)。结果示于表18。
表18.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件对GBS血清型IV-CRM197缀合物的效果
额外的缀合物变型用备择缀合化学和缀合物分子特质产生。结果示于表19。缀合物42和45通过PO/RAC产生和有意变化缀合参数以产生分别高DO(较低氧化水平)和高SPR的缀合物。缀合物43产生如下：将多糖与羰基双三唑(CDT)反应，和在DMSO中进行缀合反应。缀合物44产生如下：用TEMPO试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后用还原胺化化学在DMSO中缀合，如上文实施例3详述。全部血清型IV缀合物在小鼠中展示免疫原性，指出除高碘酸盐氧化/还原胺化化学之外的备择缀合化学以及缀合物特质比如SPR的适用性。用多至至少20的DO(较低氧化)(大约5％糖类表位修饰)产生的缀合物在小鼠中仍有免疫原性。表19.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件和备择化学选择对GBS血清型IV-CRM197缀合物的效果
GBS血清型V多糖-CRM197缀合物
用PO/RAC和具有4.4-14.6的DO(大约7-23％糖类表位修饰)的活化多糖产生的缀合物在小鼠中展示免疫原性(缀合物46和47)。去唾液酸的(5％唾液酸化水平)缀合物无免疫原性(缀合物49)，和用PO/RAC过程用含水溶剂产生的缀合物导致低免疫应答(缀合物48)。结果示于表20。
表20.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件对GBS血清型V-CRM197缀合物的效果
额外的缀合物变型用备择缀合化学和缀合物分子特质产生。结果示于表21。缀合物50和53通过PO/RAC产生和有意变化缀合参数以产生分别较低唾液酸化水平(81％唾液酸化)和低MW的缀合物。缀合物51产生如下：将多糖与羰基双三唑(CDT)反应和在DMSO中进行缀合反应。缀合物52产生如下：用TEMPO试剂(而不是高碘酸钠)氧化多糖随后用还原胺化化学在DMSO中缀合，如上文实施例3详述。全部血清型V缀合物，除了用CDT化学产生的缀合物，在小鼠中展示免疫原性，指出除高碘酸盐氧化/还原胺化化学之外的备择缀合化学以及缀合物特质比如MW的适用性。用CDT化学产生的缀合物显示与通过RAC产生的其它缀合物相比显著更低的免疫原性。81％唾液酸化的缀合物(缀合物50)提供的免疫应答与>95％唾液酸化的缀合物(缀合物53)相比更低，但是高于5％唾液酸化的缀合物(缀合物49，上表20)。
表21.变化高碘酸盐氧化/还原胺化化学过程条件和备择化学选择对GBS血清型V-CRM197缀合物的效果
实施例5：GBS III-CRM197和GBS V-CRM197一价缀合物疫苗在小鼠中产生OPA应答
雌性CD-1小鼠用1mcg、0.1mcg或0.01mcg的缀合至CRM197的B族链球菌(GBS)血清型III(GBS III-CRM197)或缀合至CRM197的GBS血清型V(GBS V-CRM197)免疫，在第0、3和6周三次经皮下进行。通过调理吞噬性测试(OPA)评价第三次给药后(PD3)的血清。OPA如实施例4的描述进行。两种缀合物均诱导小鼠中的OPA应答(表22)。不具有可检测OPA应答的样品赋予的值50。
表22：GBS III和GBS V缀合物诱导小鼠中的OPA应答
实施例6：GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197一价缀合物疫苗在小鼠中产生OPA应答
六组雌性CD-1小鼠在第0、3和6周三次经皮下用含有1mcg单独的缀合至CRM197的GBS荚膜多糖(CP)的疫苗免疫。初始研究已显示小鼠对所测的六种血清型中任意都不具有预先存在的OPA滴定度。通过OPA分析来自PD3的血清，与疫苗中包含的同源GBS血清型对比。OPA如实施例4的描述进行。结果示于下表23和24。
表23：在与单独的GBS CPS-CRM197缀合物免疫之后小鼠的几何平均OPA滴定度
血清型 几何平均OPA滴定度
Ia 300
Ib 417
II 610
III 188
IV 3140
V 378
表24：在用单独的GBS CPS-CRM197缀合物免疫之后小鼠的OPA滴定度倍数升高
血清型 几何平均OPA滴定度
Ia 6
Ib 8
II 12
III 4
IV 63
V 8
NB：倍数升高的计算假定小鼠不具有预先存在的滴定度。
实施例7：血清的调理活性，与从用GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197一价缀合物疫苗免疫的小鼠分离的IgG比较
雌性CD-1或BALB/c小鼠用1mcg单独的缀合至CRM197的GBS CP在第0、3和6周三次经皮下免疫。AlPO4或QS-21用作佐剂。PD3血清通过血清型特异性OPA测试，然后分离免疫球蛋白G级分和测试OPA活性。将纯化IgG OPA活性标准化至5mg/ml(在普通小鼠血清IgG量的范围内)。全部六种GBS CPS缀合物都诱导了具有调理活性的IgG抗体(图1)。
实施例8：GBS Ia-TT，GBS Ib-TT，GBS II-TT，GBS III-TT，GBS IV-TT和GBS V-TT，一价缀合物疫苗在兔子中产生OPA应答
兔子用50mcg/ml缀合至破伤风类毒素的GBS血清型Ia多糖、10mcg/ml缀合至破伤风类毒素的GBS血清型Ib多糖、50mcg/ml缀合至破伤风类毒素的GBS血清型II多糖、50mcg/ml缀合至破伤风类毒素的GBS血清型III多糖、50mcg/ml缀合至破伤风类毒素的GBS血清型IV多糖、或50mcg/ml缀合至破伤风类毒素的GBS血清型V多糖免疫三次，在第一次给予中用弗氏完全佐剂辅佐而在第二和第三次给予中用弗氏不完全佐剂辅佐。用具有>95％唾液酸水平的多糖和CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)化学产生缀合物。PD3免疫应答通过OPA测量，如实施例4的描述。血清滴定度示于表25而纯化IgG滴定度示于下表26。缀合至TT的GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV和V多糖是在兔子中高度免疫原性的。
表25：在用单独的GBS CPS-TT缀合物免疫之后兔血清的几何平均OPA滴定度
GBS血清型 几何平均OPA滴定度
Ib 11550
II 36753
IV 34345
表26：在用单独的GBS CPS-TT缀合物免疫之后，纯化兔IgG的几何平均OPA滴定度
实施例9：六价GBS缀合物疫苗产生非人灵长类中的OPA应答三组猕猴用六价B族链球菌(GBS6)疫苗在第0、4和8周经肌肉内免疫三次。GBS6疫苗包含GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197。两组包括磷酸铝(AlPO4)作为佐剂和给予5mcg的各缀合物或50mcg的各缀合物。第三组给予5mcg各缀合物且不含佐剂。下表27描述免疫方案。
表27：猕猴的免疫方案
通过OPA分析免疫前血清和PD3血清的疫苗中所含的全部六种GBS血清型。OPA如实施例4的描述进行。结果示于下表28和29。对于全部六种血清型，AlPO4辅佐的制剂都引起可检测的OPA应答(滴定度从免疫前至PD3增加，或免疫前/PD3的倍数>1)。非辅佐的5mcg/缀合物剂量引起对六种血清型中五种的可检测的OPA应答。
表28：在用GBS6免疫之前和之后，猕猴的几何平均OPA滴定度
表29：在用GBS6免疫之后，猕猴的OPA滴定度倍增
血清型 5mcg+AlPO<sub>4</sub> 50mcg+AlPO<sub>4</sub> 5mcg，无佐剂
Ia 30 69 4
Ib 72 56 6
II 18 12 6
III 74 41 6
IV 30 37 3
V 24 37 1
实施例10：六价GBS缀合物疫苗产生大鼠中的OPA应答
雌性Sprague-Dawley大鼠用5mcg/ml在如实施例9的描述的GBS6多糖缀合物疫苗中的各缀合物经皮下免疫两次，用或不用磷酸铝(AlPO4)配制。对全部六种同源GBS血清型，评价免疫前(基线)和第二次给予后的血清的OPA测试滴定度。对各血清型在GBS 384孔测试形式中测量OPA滴定度和计算倍增。给予GBS6疫苗的大鼠在第二次给予之后对各血清型具有稳健的功能抗体应答；在不存在AlPO4的情况下，在各血清型中观察到7至205倍的增加，而在存在AlPO4的情况下，该范围是11至294倍(表30)。
表30.第2次给予后(PD2)在用六价GBS缀合物疫苗免疫的大鼠中调理吞噬性活性(OPA)测试滴定度的倍增
表30.第2次给予后(PD2)在用六价GBS缀合物疫苗免疫的大鼠中调理吞噬性活性(OPA)测试滴定度的倍增
实施例11：用一价或六价GBS糖缀合物疫苗免疫怀孕母鼠显示其子代出生后对GBSIII或V感染的保护性效果
雌性CD-1小鼠用如实施例9描述的GBS6疫苗(含有5mcg/ml各缀合物和100mcg/mlAlPO4)、GBS III或V一价糖缀合物疫苗(各含有10mcg/ml缀合物和100mcg/ml AlPO4)，或单独的媒介物对照经皮下免疫三次。小鼠在第三次免疫之前生育。按照所接受的疫苗用致死量的GBS血清型III或GBS血清型V细菌攻击免疫小鼠的子代，和监测生存90小时。用GBS6+AlPO4或GBS III-CRM197+AlPO4免疫母鼠为其幼鼠提供对致死性GBS血清型III攻击的显著保护(p<0.0001)。类似地，用GBS V-CRM197+AlPO4免疫母鼠为其幼鼠提供对致死性GBS血清型V攻击的显著保护(p<0.0001)。结果示于表31。
表31：用一价和六价GBS疫苗免疫增加子代生存
实施例12：GBS III单克隆抗体在幼年大鼠中的被动免疫显示保护性效果
B族链球菌血清型III(GBS III)单克隆抗体(mAb)产生如下：用包含血清型Ia，Ib，II，III和V的五价疫苗免疫小鼠。选择GBS III-特异性的mAb克隆，和用标准程序产生识别GBS III的CP的mAb。将GBS血清型III mAb被动地给予幼年大鼠(n＝10每组；2个独立实验显示)，在16小时之后用临床GBS III分离物攻击。在攻击之后4小时收获血液和计数剩余的CFU。用GBS III mAb处理将幼年大鼠中回收的CFU降低了4logs或更多(表32)。
表32：GBS III mAb降低幼年大鼠中的回收CFU
实施例13：GBS Ib、III&V单克隆抗体在怀孕小鼠中的被动免疫在其子代出生之后显示保护性效果
单克隆抗体(mAb)用标准程序产生自用五价疫苗(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197和GBS V-CRM197)免疫的小鼠。mAbs然后确认为特异性识别五种血清型各自的荚膜多糖。将500mcg/ml剂量的GBS血清型Ib(GBS Ib)mAb、GBS血清型III(GBS III)mAb、GBS血清型V(GBS V)mAb或同种型匹配的对照mAb在分娩之前大约24至48小时被动地给予怀孕小鼠。在出生之后24至48小时，用致死量GBS Ib、GBS III或GBS V细菌攻击免疫母鼠的子代。监测生存96小时。在GBS攻击之后，在用GBS Ib mAb、GBS III mAb或GBSV mAb免疫的母鼠的幼兽中观察到与对照mAb相比显著更高的生存(表33)。
表33：GBS III&V mAb增加子代生存
实施例14：GBS缀合物的稳定性
GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197单独地在10mM琥珀酸-磷酸和155mM NaCl中于变化的pH水平配制，从而试验缀合物在加速储存条件下的稳定性。在50℃储存4周之后通过SEC MALLS测量分子量百分比变化。结果示于图2-7。
在示于表34的各种缓冲剂条件下测试GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS III-CRM197和GBS IV-CRM197缀合物的唾液酸化稳定性。在37℃储存1个月之后用HPLC测量游离唾液酸(N乙酰基神经氨酸；NANA)。结果示于图8。
两个研究均表明缀合物在pH高于6.0和最佳在约pH 6.5表现更好。
表34.唾液酸化稳定性测试的缓冲条件
pH 盐 盐浓度(mM) 缓冲剂 缓冲剂浓度(mM)
5.8 无 0 琥珀酸 10
6.2 无 0 琥珀酸 10
6.6 无 0 琥珀酸 10
6.9 无 0 琥珀酸 10
5.8 NaCl 150 琥珀酸 10
6.3 NaCl 150 琥珀酸 10
6.6 NaCl 150 琥珀酸 10
6.9 NaCl 150 琥珀酸 10
6.1 无 0 组氨酸 10
6.5 无 0 组氨酸 10
6.9 无 0 组氨酸 10
6.1 NaCl 150 组氨酸 10
6.5 NaCl 150 组氨酸 10
6.9 NaCl 150 组氨酸 10
实施例15：GBS6配制剂
为了确定缓冲剂的选择，用上表33所指的相同缓冲剂条件将GBS Ia-CRM197，GBSIb-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197(GBS6)一起配制。配制剂的真实pH在下述时间点测试：0(在制备配制剂时)，在5℃经过1个月之后，在25℃经过1个月之后，和在37℃经过1个月之后。在用琥珀酸作缓冲剂的配制剂中观察到pH变化，而在用组氨酸作缓冲剂的配制剂中没有观察到变化。结果示于图9-10。
也测试了组氨酸缓冲剂浓度对GBS缀合与铝结合的效果。用两种不同浓度的缀合物(10mcg/ml和40mg/ml各血清型)和数种不同浓度的组氨酸测试包含150mM NaCl，0.01％聚山梨醇-80(pH 6.5)，和0.5mg/ml铝(AlPO4)的配制剂。结合至铝的缀合物百分比确定如下：测量疫苗中各缀合物的总量和结合至铝的各缀合物的量。结合的缀合物测量如下：离心疫苗配制剂，再悬浮铝丸，将铝溶剂化，和使用散射测浑法用对各血清型的血清型-特异性多克隆抗体来测量结合的缀合物。结果示于图11-12。发现的是，组氨酸缓冲剂的浓度影响结合至铝的各血清型的百分比，并且该影响在较低剂量比较高剂量更显著。
进行搅动研究来确定希望的聚山梨醇-80(PS80)的量。测试包含20mM组氨酸，150mM NaCl，0.5mg/ml AlPO4(如果存在)和无PS80、0.01％PS80、0.02％PS80或0.03％PS80(pH 6.5)的GBS6配制剂在搅动压力下的总抗原性损失百分比。预填充配制剂的注射器在室温下于500RPM搅动72小时。对照样品(未搅动)在室温下储存72小时。结果示于图13。
也研究铝在GBS6配制剂中的浓度以确定对GBS缀合物结合至铝的效果。测试包含10mM组氨酸，150mM NaCl，0.02％PS80，和0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml或1.0mg/ml作为磷酸铝(AlPO4)的铝(pH6.5)的GBS6配制剂的结合至铝的缀合物百分比。结合至AlPO4的百分比随AlPO4浓度增加而增加。结果示于图14。
实施例16：GBS6冻干配制剂
测试GBS6(GBS Ia-CRM197，GBS Ib-CRM197，GBS II-CRM197，GBS III-CRM197，GBS IV-CRM197和GBS V-CRM197)的各种冻干配制剂的稳定性。将包含20mM组氨酸(pH 6.5)，0.02％PS80，约28mM NaCl和5.5％、7.0％或8.5％(w/v)蔗糖的低(10mcg/ml)和高(50mcg/ml)剂量配制剂冻干。冻干配制剂的稳定性测试如下：在5℃经过4个月、在37℃经过4个月和在50℃经过1个月之后测量pH和水分。全部配制剂基于pH和水分稳定(数据未显示)。此外，在5℃和37℃经过1、4和9个月之后和在50℃经过1、2和4周之后测试全部配制剂对各血清型的抗原性恢复百分比。结果示于图15-20。
还对40mcg/ml剂量的GBS6配制剂准备和评价了赋形剂的下述变化：1)7％(w/v)蔗糖，2)2％(w/v)蔗糖和4％(w/v)甘露醇，3)3％(w/v)蔗糖和3％(w/v)甘露醇，4)2％(w/v)蔗糖和4％(w/v)甘氨酸，或5)3％(w/v)蔗糖和3％(w/v)甘氨酸。全部五种配制剂的pH和水分在5℃经过3个月，在25℃经过3个月，在37℃经过3个月，和在50℃经过1个月之后是稳定的(数据未显示)。此外，在52-8℃、25℃和37℃经过1、3和7个月之后和在50℃经过1、2和4周之后测试全部配制剂对各血清型的抗原性恢复百分比。结果示于图21-25。
在重构冻干配制剂和液体配制剂中抗原结合至GBS6疫苗磷酸铝佐剂的百分比用散射测浑法测试。含有20mM组氨酸，0.02％PS80，7.0％(w/v)蔗糖和500mcg/ml作为磷酸铝的铝的冻干配制剂和液体配制剂均以低(10mcg/ml)和高(50mcg/ml)剂量制备。也测试变化浓度的氯化钠(NaCl)以确定对抗原结合的效果。冻干配制剂和液体配制剂的结果分别示于表35和36。冻干组合物和液态组合物的低剂量配制剂均在使用约150mM和较高NaCl浓度的情况下具有可比拟的结果。
表35.在具有变化水平NaCl的重构冻干配制剂中结合至磷酸铝的抗原的百分比
表36.在具有变化水平NaCl的液体配制剂中结合至磷酸铝的抗原的百分比
实施例17：GBS6配制剂的再悬浮特性
制备GBS6配制剂，包含240mcg/mL(高)或60mcg/mL(低)总剂量的多糖-蛋白质缀合物，20mM组氨酸，150mM NaCl，0.02％PS80，和0.5mg/mL的AlPO4(pH 6.5)。各血清型的相似一价配制剂也于240mcg/mL(高)或60mcg/mL(低)剂量制备。将样品充入1)2mL玻璃小瓶，填充体积为0.73mL每小瓶或2)BD HYPAK SCFTM PRTC(Becton,Dickinson and Company)1mL短玻璃质预填充注射器(PFS)，填充体积0.58mL和用4432/50塞(West PharmaceuticalServices，Inc.)封盖，保持顶部空间约5±1mm。于5℃，小瓶中的配制剂直立储存，而PFS中的那些则以两种不同取向即顶端倒置和水平储存。
再悬浮通过在储存2周和3个月之后完全再悬浮配制剂所需的振摇次数来度量。在储存2周和3个月之后再悬浮充入小瓶的全部配制剂需要少于5次振摇。在水平储存的情况下，PFS中的GBS6低剂量配制剂在储存3个月之后也仅需要3次振摇。然而，在储存2周或3个月之后在PFS中顶端倒置储存的低剂量配制剂需要约15次振摇来再悬浮。相比之下，PFS中的高剂量配制剂无论储存取向如何都难以再悬浮。GBS6高剂量配制剂即使水平储存也需要大于50次振摇。此外，再悬浮高剂量配制剂所需的振摇次数随时间增加。在PFS中顶端倒置储存的GBS6高剂量配制剂在填充后多至16小时(T0)需要约100次振摇来完全再悬浮，而在储存3个月之后则增加至大于200次振摇。最终，用来自血清型Ia、III、IV和V的多糖缀合物制备的某些一价配制剂在PFS中以两种取向储存的情况下难以再悬浮和随时间需要更多振摇来再悬浮，这意味着一价配制剂的再悬浮行为是血清型特异性的。在T0、2周和3个月再悬浮在PFS中以顶端倒置取向储存的高剂量和低剂量的GBS6和一价配制剂的比较数据示于图26。再悬浮在PFS中以顶端倒置取向和水平取向储存的高剂量和低剂量的GBS6和一价配制剂的比较数据示于图27。
进一步测试高剂量和低剂量的GBS6配制剂以确定再悬浮是否会受到在小瓶中、在PFS顶端倒置取向和在PFS中水平取向的长期储存的影响。此外，也测试中等剂量(120mcg/mL总剂量的多糖-蛋白质缀合物)配制剂以与低剂量和高剂量配制剂比较。发现的是，低剂量配制剂在PFS中以顶端倒置取向储存6个月之后变得更难再悬浮，需要大于50次振摇。中等剂量配制剂在PFS中以顶端倒置取向储存仅1个月之后就难以再悬浮，在PFS中以水平取向储存1个月之后需要30次振摇来再悬浮。结果示于表37。
表37.于三种不同剂量储存在小瓶和预填充注射器中的GBS6配制剂的再悬浮行为比较
*1个月储存时间
NT-未测试
从这些研究确定的是，与再悬浮有关的困难能够通过将包含20mM组氨酸、150mMNaCl、0.02％PS80和0.5mg/mL的AlPO4(pH 6.5)的配制剂储存在小瓶中或以水平方式储存在PFS中来减轻。然而，对于在PFS中以水平取向储存的配制剂来说如果其具有60mcg/ml或更低的多糖-蛋白质缀合物总剂量则再悬浮将仅在可接受的限制以内(即少于10次振摇)。
进行额外研究来试验三种物理特性对再悬浮的效果：(1)表面电荷或Zeta电势，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.)；(2)颗粒尺寸，使用Mastersizer3000激光衍射颗粒尺寸分析仪(Malvern Instruments Ltd.)；和(3)沉淀或沉降速率，使用分散液分析仪(L.U.M.GmbH)。GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V缀合物和AlPO4的Zeta电势随pH的变化分别示于图28和29。各种GBS6和一价GBS配制剂的Zeta电势和颗粒尺寸概括于表38中。15种配制剂的ζ电势值是约-7至-10mV。未观察到在表面电荷与这些样品再悬浮之间的关联。另一方面，再悬浮受到颗粒尺寸影响。在GBS6和一价制剂中低剂量配制剂的颗粒尺寸大于高剂量配制剂，并且一般来说颗粒尺寸越小则均匀再悬浮配制剂就越困难。
表18.比较高剂量和低剂量的GBS6和一价配制剂的Zeta电势和颗粒尺寸
在0、2周和3个月的时间测量配制剂中铝颗粒的沉降速率。高剂量配制剂显示比低剂量配制剂更低的沉降速率。沉降速率在5℃储存3个月之后不变。观察到在再悬浮与沉降速率之间的直接关联：沉降速率越快则配制剂再悬浮越容易。此外，具有比高剂量配制剂更大的颗粒尺寸的低剂量配制剂展示更快的沉降速率和更容易的再悬浮。数据示于图30。
实施例18：GBS6配制剂因素对沉降速率的效果
研究配制剂因素比如抗原浓度，pH和盐浓度对再悬浮特征的影响。首先，研究在组氨酸缓冲液(pH 6.5)中各种抗原浓度的GBS6配制剂。该研究的数据显示，更高的抗原浓度导致更慢的沉降速率(参见图31；显示各血清型剂量)，其会导致再悬浮困难。在低浓度，颗粒能够自由沉降而不存在碰撞和/或布朗运动的相互干扰。
其次，研究在pH 6.0、6.5和7.0的组氨酸缓冲液中总抗原浓度60mcg/mL和300mcg/mL的GBS6配制剂的沉降行为。60mcg/mL GBS6配制剂的沉降行为显示pH对沉降速率具有显著效果。然而，pH对300mcg/mL GBS6配制剂的沉降速率没有显著效果。数据示于图32。在pH从7.0降至pH 6.0的情况下AlPO4的表面电荷从-10.3mV降至-7.9mV(数据未显示)。一般来说，高ζ电势会指示颗粒完全分散在介质中，原因是颗粒之间存在的优势排斥力。在该情况下，颗粒作为分离个体存在于悬浮液中，和沉降速率常常是缓慢的，原因是颗粒尺寸的宽分布导致颗粒以不同速率沉降。
最终，也检查了离子强度对AlPO4理化特性的效果及其对悬浮特性的后续影响。在3个不同剂量水平(60mcg/mL，150mcg/mL和20mcg/mL总抗原)和2个不同NaCl浓度(22mM和150mM)制备GBS6配制剂，在盐浓度低的情况下Zeta电势值变得负值更大。具有最低盐浓度(22mM)的全部3个剂量的GBS6配制剂带负电。Zeta电势值是约-16至约-17mV。相比之下，150mM NaCl的高剂量和低剂量GBS6配制剂则是约-8mV。较高盐浓度降低表面电荷和加速沉降速率，其能改善再悬浮。数据示于图33和表39。
表39.比较不同剂量和NaCl浓度的GBS6配制剂的Zeta电势和颗粒尺寸
实施例19：不同抗原和铝盐的再悬浮行为
进行研究以进一步考察在抗原浓度与再悬浮配制剂的困难程度之间的关联是对GBS特异性还是对其它抗原比如蛋白质、多糖和非GBS多糖-蛋白质缀合物的普遍特质。包含CRM197；来自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV和V的多糖组合；BSA；或20种肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物的组合(20vPnC)的配制剂以相同高剂量(240mcg/mL总抗原)在相同缓冲剂基质中配制和0.5mg/mL AlPO4佐剂如实施例17和18中测试的GBS配制剂。用85(Brenntag Biosector A/S)配制的GBS6也包括为比较物质。测试样品的下述特质：1)再悬浮时间(在1.5mL离心管中用手动摇动器于200rpm离心30-45分钟之后再悬浮丸剂需要的时间)，2)视觉观察量筒中的沉降(不同时间间隔的沉降床高度)，3)颗粒尺寸，4)表面电荷，和5)颗粒尺寸分布，使用MICRO-FLOW (MFI)Flow DPA 4200显微镜(Brightwell Technologies Inc.)。
不同的抗原展示变化的沉降和再悬浮行为(数据分别示于图34和表40)。如先前观察，沉降更快的配制剂更容易再悬浮。未观察到在再悬浮与平均颗粒尺寸或颗粒尺寸分布之间的关联。颗粒尺寸分布数据示于图35A和35B。然而包含85的GBS6配制剂最容易再悬浮和显示显著较大的颗粒尺寸、更快的沉降速率和低表面电荷，意味着颗粒尺寸和表面电荷与再悬浮有关联。应注意氢氧化铝在pH 6.5带正电而缀合物带负电，导致强静电相互作用和较高的电荷中和。与之相对，AlPO4在pH 6.5带负电。
表40.比较不同抗原配制剂的颗粒尺寸、再悬浮时间和Zeta电势
实施例20：装置构造的修饰
研究指出配制剂在小瓶中容易再悬浮但在PFS中则不容易再悬浮，两者都由1类玻璃制成且使用橡胶塞。然而两种系统之间的关键差异是可获得的顶部空间，其允许配制剂自由混合，导致更均匀再悬浮的产品。因此，研究顶部空间效果作为影响在PFS中再悬浮的因素，从而理解PFS中较高的顶部空间是否会允许更多的混合。用高剂量GBS6配制剂(含AlPO4)填充注射器，以变化的顶部空间(2mm，6mm和10mm；示于图36)封塞，并以水平取向储存于2-8℃。在2周储存时间之后测试再悬浮行为(#振摇)。数据指出，增加顶部空间降低再悬浮需要的振摇次数。数据示于表41。再悬浮变得容易是由于增加的湍流，其是由于允许更容易的混合的更高顶部空间。该行为在小瓶中也是显著的，其不显示任何再悬浮挑战(由于更大的顶部空间)。
表41.增加顶部空间对GBS6配制剂再悬浮特征的效果
顶部空间(±1mm) #振摇*
2 >50
6 17
10 10
储存时间：于2-8℃经过2周
*3份样品的平均值
实施例21：铝浓度的影响
进行研究以确定铝浓度对再悬浮配制剂的能力的影响。这通过随AlPO4浓度降低评价GBS6配制剂来完成。GBS6配制剂于高剂量(240mcg/mL总抗原)在相同缓冲剂基质中制备，铝水平浓度的范围是0.5-0.05mg/mL。将样品充入BD HYPAK SCFTM PRTC(Becton,Dickinson and Company)1mL短、玻璃质PFS中，0.58mL填充体积；用4432/50塞(WestPharmaceutical Services,Inc.)封盖，保持顶部空间约～0.4mm；和水平储存。在5℃于0，1，2和4周测试再悬浮。通过散射测浑法用血清型-特异性多克隆抗体分析单独配制剂对各血清型的总抗原性和结合抗原性。
尽管铝水平的降低对再悬浮具有正面效果，含0.3mg/mL铝的配制剂仍需要在T0大于20次振摇和于2周大于50次振摇。含0.05mg/mL铝的配制剂在水平储存2周之后需要约20次振摇。数据示于图37。
也观察到结合至铝的抗原量的降低。数据示于图38。
实施例22：筛选不同的絮凝剂
具有细颗粒的悬浮液显示缓慢沉降速度和将引起低体积、高密度的沉降，其会难以或不可能再悬浮。再悬浮特性能够通过药物操作来控制，比如加入絮凝剂以中和悬浮颗粒的表面电荷和允许形成较大的颗粒絮状物或簇，于是增加沉降速度和改善再悬浮。在非絮凝与絮凝悬浮液之间的沉降行为差异在表42中说明。
表42.比较非絮凝和絮凝悬浮液
非絮凝悬浮液 絮凝悬浮液
1 固体作为单独的颗粒存在，低团聚 固体作为聚集体存在
2 颗粒展示排斥力 颗粒展示吸引力或低排斥力
3 沉降速率缓慢和颗粒尺寸小 沉降速率高，颗粒形成松散聚集体
4 颗粒沉淀为饼 颗粒沉淀为絮
将絮凝剂掺入GBS6配制剂是改善再悬浮特性的途径。评价下述絮凝剂和铝基盐对高剂量GBS6配制剂的沉降速率和再悬浮的效果：
絮凝剂：
1.GBS6对照(GBS6包含20mM His缓冲剂，150mM NaCl，0.02％PS80，和0.5mg/mLAlPO4(pH 6.5))
2.硫酸铵(0.25mg/mL)
3.硫酸铵和KCl(0.25mg/mL和20mM)
4.CaCl2(0.25mg/mL)
5.SDS(1％)
6.磷酸钾(50mM)
7.NaCl(1M)
铝基盐：
1.85(Brenntag Biosector A/S)[Al(OH)3；0.25mg/mL]
2.(Brenntag Biosector A/S)(0.5mg/mL)
3.AlPO4和Al(OH)3(1:1混合，各0.25mg/mL)
制备高剂量(240μg/mL)GBS6配制剂，包含20mM组氨酸，150mM NaCl，0.02％PS80，和0.5mg/mL AlPO4(pH 6.5)，使用上文所列絮凝剂之一或上文所列铝基盐之一。测试样品的加速再悬浮时间(在1.5mL离心管中将样品于200rpm旋转45分钟之后)，沉降速率，颗粒尺寸，表面电荷，以及总缀合物和结合缀合物。
在所测全部絮凝剂中，NaCl和磷酸钾能够显著降低再悬浮时间至小于20秒，与之相对GBS6对照为180秒。数据示于图39和表42。这两种样品的沉降速率也比含钙或铵盐或SDS的其它配制剂更快。数据示于图40。含有1M NaCl的配制剂具有大颗粒尺寸和低表面电荷，正如基于絮凝理论所期望。然而，对含50mM磷酸的样品的观察并不相同，意味着磷酸经过与NaCl不同的机理促进再悬浮。数据示于表42。
在测试的两种铝盐中，85展示比优异的再悬浮行为。含85配制剂的主要问题是其紧密地结合至抗原，显示为与AlPO4相比与抗原的较高结合强度。数据示于表43。该现象已报告为对疫苗的免疫应答具有不利影响。Egan,P.M.,et al.,Vaccine,27:3175-3180(2009)。
表43.具有絮凝剂或铝盐的GBS6配制剂的再悬浮特征
实施例23：NaCl和磷酸水平的优化
进行研究以将NaCl和磷酸钾浓度优化为这样的水平，其会不仅符合所希望的再悬浮特征，但也符合其它特质比如质量渗透摩尔浓度和与铝的抗原结合，其是与疫苗反应产生性和效能有关的两个重要方面。
制备高剂量(240mcg/mL总抗原)GBS6配制剂，包含变化浓度的NaCl(150-690mM)，20mM组氨酸，0.02％PS80和0.5mg/mL AlPO4(pH 6.5)。也制备配制剂，包含变化的磷酸钾浓度(10-50mM)和2种不同NaCl浓度(150mM和240mM)，目的是研究两种盐的组合效果。测试配制的批量样品的沉降速率，在离心之后再悬浮时间，颗粒尺寸和表面电荷。
增加NaCl浓度显著降低再悬浮时间。数据示于图41。于300mM NaCl存在再悬浮时间的急剧降低，意味着从配制剂去絮凝变为絮凝状态，并且300mM NaCl浓度是该转变的临界凝结浓度(CCC)。在10mM或更多磷酸的情况下CCC降低至240mM，意味着NaCl和磷酸存在增效效果。数据示于图42。对含10-30mM磷酸和240mM NaCl的样品观察到快速沉降和絮凝沉淀物，示于图43A和43B。Zeta电势和颗粒尺寸数据揭示NaCl浓度增加导致表面电荷降低和颗粒尺寸增加，其支持絮凝理论。该趋势对磷酸不清楚。数据示于表44。基于该研究的结果，240mM NaCl和20mM磷酸被视为最佳靶标浓度。
表44.NaCl和磷酸对Zeta电势和颗粒尺寸的效果
表44.NaCl和磷酸对Zeta电势和颗粒尺寸的效果
进一步表征三批GBS6配制剂，包含多糖浓度40mcg/mL的各血清型(240mcg/mL总抗原)，20mM磷酸，240mM NaCl，0.02％PS80和0.5mg/mL AlPO4(pH 6.5)。包含20mM His缓冲剂，150mM NaCl，0.02％PS80和0.5mg/mL AlPO4(pH 6.5)的GBS6配制剂包括作为对照。具有额外NaCl和磷酸(pH6.5)的全部3种配制剂展示容易的再悬浮，平均再悬浮时间为16秒(对照120秒)和质量渗透摩尔浓度高于500mOsm。对于各血清型结合抗原性低于对照约20％。数据示于表45。
表45.具有额外NaCl和磷酸的GBS6配制剂的表征
*3批的平均值。
实施例24：含有240mM NaCl和20mM磷酸的GBS6配制剂的短期稳定性
将3种剂量(60mcg/mL，120mcg/mL和240mcg/mL的总抗原)的包含20mM磷酸，240mMNaCl，0.02％聚山梨酯80和0.5mg/mLAlPO4(pH 6.5)的GBS6配制剂充入BD HYPAK SCFTMPRTC(Becton,Dickinson and Company)1mL短、玻璃质PFS，0.58mL填充体积和用4432/50塞(West Pharmaceutical Services，Inc.)封盖，保持顶部空间约～0.4mm。在RT经过1个月和于5℃经过3个月监测以顶端倒置和水平取向的再悬浮的稳定性。
对于全部3种剂量水平，1个月的数据显示水平储存的PFS能以10或更少次振摇再悬浮。然而，顶端倒置储存的PFS仍需要40或更多次振摇。数据示于表46。各血清型的总抗原性和与AlPO4的结合在RT稳定1个月。数据示于表47。
表46.比较水平vs顶端倒置储存的PFS的再悬浮行为
表47.GBS配制剂的总抗原性
实施例25：GBS配制剂的实验设计(DoE)和设计品质(QbD)概念应用，在PFS中使用絮凝剂
执行实验设计(DoE)以确定对PFS的最佳GBS6配制剂。用响应表面方法(Box-Behnken设计)评价三个因素：1)pH(6.0，6.5，和7.0)；2)NaCl浓度(220mM，240mM，和260mM)；和3)磷酸浓度(15mM，20mM，和25mM)。全部配制剂另外包含240mg/mL剂量(60ug/mL的各血清型，0.02％PS80，约10mM从药物物质带来的组氨酸，和0.5mg/mLAlPO4。研究总共15种配制剂的再悬浮容易性(参见表48)。
表48.DoE研究配制剂
配制剂 NaCl(mM) Na-磷酸(mM) pH
1 240 20 6.5
2 260 15 6.5
3 240 15 7.0
4 220 25 6.5
5 260 25 6.5
6 240 25 6.0
7 240 20 6.5
8 240 15 6.0
9 220 20 7.0
10 240 20 6.5
11 260 20 6.0
12 240 25 7.0
13 220 15 6.5
14 220 20 6.0
15 260 20 7.0
为了解释任何关联的可变性，研究重复三次且由两位操作者进行。将样品充入BDHYPAK SCFTM PRTC(Becton,Dickinson and Company)1mL短、玻璃质PFS，0.58mL填充体积和用4432/50塞(West Pharmaceutical Services，Inc.)封盖，保持顶部空间约～0.4mm。填充注射器在2-8℃和25℃水平储存3个月。仅在5℃监测再悬浮，和在5℃和25℃通过散射测浑法监测强度。再悬浮结果示于表49。
表49.再悬浮需要的振摇次数，于3个月
配制剂 操作员1* 操作员2*
1 11 8
2 8 6
3 7 4
4 11 8
5 8 8
6 19 12
7 7 7
8 19 14
9 10 6
10 8 6
11 11 13
12 8 4
表49.再悬浮需要的振摇次数，于3个月
配制剂 操作员1* 操作员2*
13 11 11
14 28 17
15 5 5
*3个样品的平均值
用JMP统计学软件(SAS Institute)来分析数据和预测最佳和最稳健的配制剂，其需要≤10次振摇来再悬浮。基于操作者之一的再悬浮数据的JMP预测刻划器示于图45。pH和盐是影响振摇次数的显著单独因素。此外，在磷酸与pH之间的相互作用显著。基于合意性指数，下述条件允许较容易的再悬浮(#振摇≤10)：pH 7.0±0.5，245±20mM NaCl，和20±5mM磷酸。在分析第二操作员数据时获得相似结果。
然而，在采用推荐的配制剂参数的情况下结合程度较低。如图46所示，各GBS血清型的缀合物结合在10-20％之间变化。额外地，推荐的配制剂具有较高质量渗透摩尔浓度(约500mOsm/kg)但是仍完全在疫苗的范围以内。
实施例26：基于Al(OH)3的GBS6配制剂
如实施例22描述，具有Al(OH)3的GBS6配制剂具有优异再悬浮行为但具有与抗原的较高结合强度，其能对免疫应答具有不利影响。相应地，进行实验以表征Al(OH)3与GBS缀合物的结合和调节Al(OH)3的吸附强度。
制备高剂量(240mcg/mL的总缀合物)GBS6配制剂，包含20mM组氨酸，150mM NaCl，和0.02％PS80(pH 6.5)，使用变化浓度的Al(OH)3(0.7mg/mL，0.6mg/mL，0.5mg/mL，0.4mg/mL，0.3mg/mL，0.2mg/mL，0.15mg/mL，0.1mg/mL，和0.05mg/mL)。结合确定如下：通过散射测浑法测量总抗原性和上清液抗原性。如图47所示，对于全部六种血清型与Al(OH)3的结合于0.5mg/mL Al(OH)3平台化。吸附容量和吸附系数用Langmuir公式确定。数据示于表50，用AlPO4数据比较。
表50.结合至AlPO4和Al(OH)3的GBS缀合物的特征
为了调节Al(OH)3的结合强度，将配制剂中的缓冲剂变为磷酸钠以便将氢氧化铝上的表面羟基替换为磷酸和降低配体交换。制备包含150mM NaCl，0.02％PS80和0.15mg/MLAl(OH)3(pH 6.5)的GBS6配制剂，使用3种不同磷酸浓度(10mM，20mM，和30mM)和各种剂量(15mcg/mL，30mcg/mL，60mcg/mL，90mcg/mL，120mcg/mL，150mcg/mL，和210mcg/mL总缀合物)。通过总抗原性和上清液抗原性确定结合。吸附容量和系数用Langmuir公式确定。数据示于表51，用AlPO4配制剂数据比较。
表51.磷酸浓度对GBS缀合物结合至Al(OH)3的效果
表51.磷酸浓度对GBS缀合物结合至Al(OH)3的效果
*AlPO4配制剂含有～10mM从药物物质携带的组氨酸。
**AlPO4配制剂的结合是从3个批次平均。
*＊*萃取条件：0.1N NaOH，在RT旋转24hrs。
GBS6与Al(OH)3的结合容量和系数3-4倍高于与AlPO4的结合。然而，氢氧化铝与GBS6的吸附强度通过向配制剂引入磷酸来调节。磷酸浓度不利地影响吸附强度和容量。磷酸也影响百分比抗原结合，但仍高于AlPO4的水平。此外，GBS能够在磷酸存在下从铝完全萃取。基于这些结果确定20mM磷酸、150mM NaCl和0.2％PS80(pH6.5)对于氢氧化铝最佳。
本发明的各方面
下述段落描述本发明的额外实施方式。
C1.免疫原性多糖-蛋白质缀合物，包含B族链球菌(GBS)荚膜多糖和载体蛋白质，其中荚膜多糖具有大于约60％的唾液酸水平。
C2.C1的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖选自血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，和IX。
C3.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型Ia。
C4.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型Ib。
C5.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型II。
C6.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型III。
C7.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型IV。
C8.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型V。
C9.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型VI。
C10.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型VII。
C11.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型VIII。
C12.C2的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是血清型IX。
C13.C1-C12中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有大于约95％的唾液酸水平。
C14.C1-C13中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有约100％的唾液酸水平。
C15.C1-C14中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.6mM唾液酸每mM多糖。
C16.C1-C15中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.65mM唾液酸每mM多糖。
C17.C1-C16中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.7mM唾液酸每mM多糖。
C18.C1-C17中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.75mM唾液酸每mM多糖。
C19.C1-C18中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.8mM唾液酸每mM多糖。
C20.C1-C19中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.85mM唾液酸每mM多糖。
C21.C1-C20中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.9mM唾液酸每mM多糖。
C22.C1-C21中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有至少约0.95mM唾液酸每mM多糖。
C23.C1-C22中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有约5kDa至约1,000kDa的分子量。
C24.C1-C23中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有约25kDa至约750kDa的分子量。
C25.C1-C24中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有约25kDa至约400kDa的分子量。
C26.C1-C25中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有约25kDa至约200kDa的分子量。
C27.C1-C25中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖具有约100kDa至约400kDa的分子量。
C28.C1-C27中任一项的免疫原性缀合物，其中缀合物的分子量是约300kDa至约20,000kDa。
C29.C1-C28中任一项的免疫原性缀合物，其中缀合物的分子量是约1,000kDa至约15,000kDa。
C30.C1-C29中任一项的免疫原性缀合物，其中缀合物的分子量是约1,000kDa至约10,000kDa。
C31.C1-C30中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是约0％至约40％O-乙酰化的。
C32.C1-C31中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是小于约5％O-乙酰化的。
C33.C1-C32中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是小于约4％O-乙酰化的。
C34.C1-C33中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是小于约3％O-乙酰化的。
C35.C1-C34中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是小于约2％O-乙酰化的。
C36.C1-C35中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖是小于约1％O-乙酰化的。
C37.C1-C36中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含至少约0.1mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C38.C1-C37中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含至少约0.2mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C39.C1-C38中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含至少约0.3mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C40.C1-C39中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含至少约0.35mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C41.C1-C40中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含约0.4mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C42.C1-C41中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含小于约0.01mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C43.C1-C42中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含小于约0.05mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C44.C1-C43中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含小于约0.04mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C45.C1-C44中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含小于约0.03mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C46.C1-C45中任一项的免疫原性缀合物，其中荚膜多糖包含小于约0.02mM O-乙酸酯每mM糖类重复单元。
C47.C1-C46中任一项的免疫原性缀合物，其中多糖各自单独地缀合至载体蛋白质。
C48.C1-C47中任一项的免疫原性缀合物，其中载体蛋白质是CRM197或破伤风类毒素。
C49.C1-C48中任一项的免疫原性缀合物，其中载体蛋白质是CRM197。
C50.分离荚膜多糖的方法，包括将有机试剂与包含产荚膜多糖细菌的细胞肉汤反应。
C51.C50的方法，其中细菌是未裂解的。
C52.C50或C51的方法，其中细菌是热杀灭的。
C53.C50-C52中任一项的方法，其中所述方法还包括提供细胞糊的离心步骤。
C54.C50-C53中任一项的方法，其中所述方法还包括过滤步骤。
C55.C54的方法，其中所述过滤步骤是透析过滤。
C56.C50-C56中任一项的方法，其中荚膜多糖产生细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，伤寒杆菌(Salmonella typhi)，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)，肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
C57.C56的方法，其中细菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
C58.C50-C57中任一项的方法，其中所述有机试剂是衍生化的羟胺化合物。
C59.C50-58中任一项的方法，其中羟胺是列于实施例2表2的任何羟胺。
C60.C50-C59中任一项的方法，其中羟胺选自二苄基羟胺；二乙基羟胺；羟胺；乙二胺；三亚乙基四胺；1,1,4,7,10,10六甲基三亚乙基四胺；和2,6,10,三甲基2,6,10三氮杂十一烷。
C61.C50-C60中任一项的方法，其中羟胺浓度是约5mM至约200mM。
C62.C50-C61中任一项的方法，其中反应pH是约5.5至约9.5.
C63.C50-C62中任一项的方法，其中反应发生在约20℃至约85℃的温度。
C64.C50-C63中任一项的方法，其中反应时间是约10小时至约90小时。
C65.制备C1-C49中任一项的免疫原性多糖-蛋白质缀合物的方法，其中荚膜多糖是根据C50-C64中任一项的方法分离的。
C66免疫原性多糖-蛋白质缀合物，包含通过C50-C64中任一项的方法制备的荚膜多糖。
C67.免疫原性组合物，包含C1-C49或C66中任一项的免疫原性多糖-蛋白质缀合物。
C68.包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中缀合物包含来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖血清型IV和至少一种额外血清型选自Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII和IX。
C69.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是Ia。
C70.C69的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型Ib的荚膜多糖。
C71.C69或C70的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型II的荚膜多糖。
C72.C69-C71中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型III的荚膜多糖。
C73.C69-C72中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型V的荚膜多糖。
C74.C69-C73中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VI的荚膜多糖。
C75.C69-C74中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VII的荚膜多糖。
C76.C69-C75中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C77.C69-C76中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C78.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是Ib。
C79.C78的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型II的荚膜多糖。
C80.C78或C79的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型III的荚膜多糖。
C81.C78-C80中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型V的荚膜多糖。
C82.C78-C81中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VI的荚膜多糖。
C83.C78-C82中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VII的荚膜多糖。
C84.C78-C83中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C85.C78-C84中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C86.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是II。
C87.C86的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型III的荚膜多糖。
C88.C86或C87的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型V的荚膜多糖。
C89.C86-C88中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VI的荚膜多糖。
C90.C86-C89中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VII的荚膜多糖。
C91.C86-C90中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C92.C86-C91中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C93.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是III。
C94.C93的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型V的荚膜多糖。
C95.C93或C94的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VI的荚膜多糖。
C96.C93-C95中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VII的荚膜多糖。
C97.C93-C96中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C98.C93-C97中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C99.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是V。
C100.C99的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VI的荚膜多糖。
C101.C99或C100中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VII的荚膜多糖。
C102.C99-C101中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C103.C99-C102中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C104.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是VI。
C105.C104的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VII的荚膜多糖。
C106.C104或C105中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C107.C104-C106中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C108.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是VII。
C109.C108的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型VIII的荚膜多糖。
C110.C108或C109中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C111.C68的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是VIII。
C112.C111的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缀合物，所述缀合物包含来自GBS血清型IX的荚膜多糖。
C113.C112的免疫原性组合物，其中至少一种额外血清型是IX。
C114.包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述缀合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，和IV的荚膜多糖。
C115.包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述缀合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，和V的荚膜多糖。
C116.包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述缀合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV，和V的荚膜多糖。
C117.包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，包含至少四种选自Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，和IX的GBS荚膜多糖血清型。
C118.C117的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少五种GBS荚膜多糖血清型。
C119.C117或C118的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少六种GBS荚膜多糖血清型。
C120.C117-C119中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少七种GBS荚膜多糖血清型。
C121.C117-C120中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少八种GBS荚膜多糖血清型。
C122.C117-C121中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少九种GBS荚膜多糖血清型。
C123.C117-C122中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含GBS荚膜多糖血清型V。
C124.C117-C123中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物不具有免疫干扰。
C125.C67-C124中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂，缓冲剂，稳定剂，佐剂，冷冻保护剂，盐，二价阳离子，非离子洗涤剂，自由基氧化抑制剂，载体，或其混合物。
C126.C67-C125中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂。
C127.C126的免疫原性组合物，其中所述缓冲剂选自HEPES，PIPES，MES，三(三甲胺)，磷酸，乙酸，硼酸，柠檬酸，甘氨酸，组氨酸和琥珀酸。
C128.C127的免疫原性组合物，其中缓冲剂是组氨酸。
C129.C67-C128中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含表面活性剂。
C130.C129的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂选自聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚山梨醇-80，聚山梨醇-60，聚山梨醇-40，聚山梨醇-20，和聚氧乙烯烷基醚。
C131.C130的免疫原性组合物，其中表面活性剂是聚山梨醇-80.
C132.C67-C131中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含赋形剂。
C133.C132的免疫原性组合物，其中所述赋形剂选自淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇，异麦芽糖醇，明胶，麦芽，稻，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，氯化钠(NaCl)，干脱脂乳，甘油，丙二醇，水，乙醇。
C134.C133的免疫原性组合物，其中赋形剂是氯化钠。
C135.C67-C134中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
C136.C135中任一项的免疫原性组合物，其中佐剂是铝基佐剂或QS-21。
C137.C136中任一项的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂选自磷酸铝，羟基磷酸铝，和氢氧化铝。
C138.C137中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂是磷酸铝。
C139.C138中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂是羟基磷酸铝。
C140.C67-C139中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含缓冲剂，表面活性剂，赋形剂和任选的佐剂，其中所述组合物缓冲至pH约6.0至约7.0。
C141.C67-C140中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含组氨酸，聚山梨醇-80，氯化钠和任选的磷酸铝，其中所述组合物缓冲至pH约6.0至约7.0。
C142.C67-C141中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含约10mM至约25mM组氨酸，约0.01％至约0.03％(v/w)聚山梨醇-80，约10mM至约250mM氯化钠，和任选的约0.25mg/ml至约0.75mg/ml作为磷酸铝的铝。
C143.C67-C142中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含约5mcg/ml至约50mcg/ml的剂量。
C144.C67-C143中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物是冻干的，任选在至少一种赋形剂存在下。
C145.C144的免疫原性组合物，其中至少一种赋形剂选自淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇，异麦芽糖醇，明胶，麦芽，稻，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，氯化钠(NaCl)，干脱脂乳，甘油，丙二醇，水，和乙醇。
C146.C145的免疫原性组合物，其中至少一种赋形剂是蔗糖。
C147.C144-C146中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含约1％(w/v)至约10％(w/v)的至少一种赋形剂。
C148.C144-C147中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含额外的赋形剂。
C149.C148的免疫原性组合物，其中额外的赋形剂是甘露醇或甘氨酸。
C150.C148或C149的免疫原性组合物，其中所述组合物包含约1％(w/v)至约10％(w/v)的额外的赋形剂。
C151.C143-C150中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物是用水，注射用水(WFI)，佐剂悬浮液或盐水重构的。
C152.C67-C151中任一项的免疫原性组合物，用作药物。
C153.C67-C152中任一项的免疫原性组合物，用于在受试者中诱导对GBS的免疫应答的方法。
C154.C153的免疫原性组合物，其中所述受试者是计划怀孕的女性或怀孕的女性。
C155.C154的免疫原性组合物，其中女性处于怀孕的后半程。
C156.C155的免疫原性组合物，其中怀孕的女性至少处于20周妊娠。
C157.C156的免疫原性组合物，其中怀孕的女性处于27周至36周妊娠。
C158.C157的免疫原性组合物，其中所述受试者是50岁或更老的成人。
C159.C158的免疫原性组合物，其中所述受试者是65岁或更老的成人。
C160.C159的免疫原性组合物，其中所述受试者是85岁或更老的成人。
C161.C153-C160中任一项的免疫原性组合物，其中所述受试者是免疫受损的。
C162.C161的免疫原性组合物，其中所述受试者具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病，或肝病。
C163.C153-162中任一项的免疫原性组合物，其中B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
C164.诱导对B族链球菌的免疫应答的方法，包括向受试者给予有效量的C67-C150中任一项的免疫原性组合物。
C165.在受试者中预防或减少与B族链球菌有关的疾病或病况的方法，包括向受试者给予有效量的C67-C151中任一项的免疫原性组合物。
C166.C164或C165的方法，其中所述受试者是计划怀孕的女性或怀孕的女性。
C167.C166的方法，其中女性处于怀孕的后半程。
C168.C166或C167的方法，其中怀孕的女性至少处于20周妊娠。
C169.C166-C168中任一项的方法，其中怀孕的女性处于27周至36周妊娠。
C170.C164或C165的方法，其中所述受试者是50岁或更老的成人。
C171.C170的方法，其中所述受试者是65岁或更老的成人。
C172.C170或C171的方法，其中所述受试者是85岁或更老的成人。
C173.C164-C172中任一项的方法，其中所述受试者是免疫受损的。
C174.C173的方法，其中所述受试者具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病，或肝病。
C175.C164-C174中任一项的方法，其中B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。
C176.结合至C1-C49或C66中任一项的免疫原性缀合物中的荚膜多糖的抗体。
C177.包含C176的抗体的组合物。
C178.产生抗体的方法，包括将C67-C151中任一项的免疫原性组合物给予受试者。
C179.通过C178的方法产生的抗体。
C180.向受试者赋予被动免疫的方法，包括下述步骤：
(a)用C67-C151中任一项的免疫原性组合物产生抗体制剂；和
(b)将所述抗体制剂给予受试者从而赋予被动免疫。
C181.制备C1-C49或C66中任一项的免疫原性多糖-蛋白质缀合物的方法，包括下述步骤：
(a)将GBS荚膜多糖与氧化剂反应获得活化多糖；和
(b)将活化多糖与载体蛋白质反应获得多糖-蛋白质缀合物。
C182.C181的方法，其中步骤(b)在极性非质子溶剂中进行。
C183.C182的方法，其中所述溶剂选自二甲亚砜(DMSO)，环丁砜，二甲基甲酰胺(DMF)，和六甲基磷酰胺(HMPA)。
C184.C183的方法，其中所述溶剂是二甲亚砜(DMSO)。
C185.C181-C184中任一项的方法，其中多糖与0.01至10.0摩尔当量的氧化剂反应。
C186.C181-C185中任一项的方法，其中氧化剂是高碘酸盐。
C187.C186的方法，其中高碘酸盐是高碘酸钠。
C188.C181-C187中任一项的方法，其中步骤(a)的氧化反应进行1小时至50小时。
C189.C181-C188中任一项的方法，其中氧化反应的温度保持在约2℃至约25℃。
C190.C181-C189中任一项的方法，其中氧化反应在选自磷酸钠，磷酸钾，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，和Bis-Tris的缓冲剂中进行。
C191.C190的方法，其中缓冲剂具有约1mM至约500mM的浓度。
C192.C181-C191中任一项的方法，其中氧化反应在pH约4.0至约8.0进行。
C193.C181的方法，其中氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)。
C194.C193的方法，其中N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)是共氧化剂。
C195.C181-C194中任一项的方法，其中步骤(a)还包括加入猝灭剂猝灭氧化反应。
C196.C182-C195中任一项的方法，其中多糖浓度是约0.1mg/mL至约10.0mg/mL。
C197.C181-C196中任一项的方法，其中活化多糖的氧化度是5至25。
C198.C181-C197中任一项的方法，其中所述方法还包括冻干活化多糖的步骤。
C199.C188的方法，其中活化多糖在糖类存在下冻干，所述糖类选自蔗糖，海藻糖，棉子糖，水苏糖，松三糖，右旋糖酐，甘露醇，乳糖醇和异麦芽糖醇。
C200.C181-C199中任一项的方法，其中步骤(b)包括：
(1)将活化多糖与载体蛋白质混合，和
(2)将混合的活化多糖和载体蛋白质与还原剂反应以形成GBS荚膜多糖-载体蛋白质缀合物。
C201.C200的方法，其中步骤(2)中的活化多糖浓度是约0.1mg/mL至约10.0mg/mL。
C202.C200或C201的方法，其中活化多糖与载体蛋白质的初始比率(重量)是5:1至0.1:1。
C203.C200-C202中任一项的方法，其中还原剂选自氰基硼氢化钠，三乙酰氧基硼氢化钠，硼氢化钠或锌(在质子或路易斯酸存在下)，吡啶硼烷，2-皮考啉硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，叔-BuMeiPrN-BH3，苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。
C204.C203的方法，其中还原剂是氰基硼氢化钠。
C205.C200-C204中任一项的方法，其中还原剂的量是约0.1至约10.0摩尔当量。
C206.C200-C205中任一项的方法，其中步骤(2)还原反应的持续时间是1小时至60小时。
C207.C200-C206中任一项的方法，其中还原反应的温度保持在10℃至40℃。
C208.C181-C207中任一项的方法，其中所述方法还包括加入硼氢化物封端未反应醛的步骤(步骤(c))。
C209.C208的方法，其中硼氢化物的量是约0.1至约10.0摩尔当量。
C210.C208的方法，其中硼氢化物选自硼氢化钠(NaBH4)，氰基硼氢化钠，硼氢化锂，硼氢化钾，硼氢化四丁基铵，硼氢化钙，和硼氢化镁。
C211.C292的方法，其中硼氢化物是硼氢化钠(NaBH4)。
C212.C207-C211中任一项的方法，其中封端步骤的持续时间是0.1小时至10小时。
C213.C207-C212中任一项的方法，其中封端步骤的温度保持在约15℃至约45℃。
C214.C181-C213中任一项的方法，其中所述方法还包括纯化多糖-蛋白质缀合物的步骤。
C215.C181-C214中任一项的方法，其中多糖-蛋白质缀合物包含与多糖总量相比小于约40％的游离多糖。
C216.C181-C215中任一项的方法，其中在缀合物中多糖与载体蛋白质的比率(重量)是约0.5至约3.0。
C217.C181-C216中任一项的方法，其中缀合物的缀合度是2至15。
C218.制备多糖-蛋白质缀合物的方法，包括下述步骤：
(a)将分离的GBS荚膜多糖与氧化剂反应；
(b)加入猝灭剂猝灭步骤(a)的氧化反应获得活化的GBS荚膜多糖；
(c)将活化的GBS荚膜多糖与载体蛋白质混合,
(d)将混合的活化的GBS荚膜多糖和载体蛋白质与还原剂反应以形成GBS荚膜多糖-载体蛋白质缀合物，和
(e)加入硼氢化钠(NaBH4)封端未反应的醛,
其中步骤(c)和(d)在DMSO中进行。
C219.免疫原性组合物，包含缀合至载体蛋白质的来自B族链球菌(GBS)的荚膜多糖和铝基佐剂。
C220.C219的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂选自磷酸铝，羟基磷酸铝，和氢氧化铝。
C221.C219或C220的免疫原性组合物，其中所述佐剂是磷酸铝。
C222.C219或C220的免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
C223.C219-C222中任一项的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂的浓度是约0.25mg/ml至约0.75mg/ml。
C224.C223的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂的浓度是约0.5mg/ml。
C225.C219-C224中任一项的免疫原性组合物，其中荚膜多糖选自血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，和IX。
C226.C219-C225中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是六价GBS缀合物组合物。
C227.C225的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V的荚膜多糖。
C228.C219-C227中任一项的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物充入注射器。
C229.C228的免疫原性组合物，其中注射器是玻璃质的。
C230.C219-C229中任一项的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物充入具有约1mm至约15mm顶部空间的注射器。
C231.C230的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物充入具有约2mm至约6mm顶部空间的注射器。
C232.C219-C231中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在约50次或更少的振摇内再悬浮。
C233.C232的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在约10次或更少的振摇内再悬浮。
C234.C219-C233中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包含磷酸。
C235.C234的免疫原性组合物，其中所述磷酸的浓度是约15mM至约25mM。
C236.C235的免疫原性组合物，其中所述磷酸的浓度是约20mM。
C237.C219-C236中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含氯化钠。
C238.C219-C237的免疫原性组合物，其中所述氯化钠的浓度是约10mM至约350mM。
C239.C238的免疫原性组合物，其中所述氯化钠的浓度是约225mM至约265mM。
C240.C239的免疫原性组合物，其中所述氯化钠的浓度是约240mM。
C241.C219-C238的免疫原性组合物，其中所述氯化钠的浓度是约
C242.C241的免疫原性组合物，其中所述氯化钠的浓度是约150mM。
C243.C219-C242中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含约60mcg/ml至约360mcg/ml的总缀合物剂量。
C244.C243的免疫原性组合物，其中总缀合物剂量是约120mg/ml至约240mcg/ml。
C245.C219-C244中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
C246.C245的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有约7.0的pH。
C247.免疫原性组合物，包含约0.25mg/ml至约0.75mg/ml磷酸铝，约15mM至约25mM磷酸，约225mM至约265mM氯化钠，和约60mcg/ml至约360mcg/ml的总缀合物剂量，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
C248.免疫原性组合物，包含约0.25mg/ml至约0.75mg/ml氢氧化铝，约15mM至约25mM磷酸，约120mM至约170mM氯化钠，和约60mcg/ml至约360mcg/ml的总缀合物剂量，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
C249.C219-248中任一项的免疫原性组合物，用作药物。
C250.C219-249中任一项的免疫原性组合物，用于在受试者中诱导对GBS的免疫应答的方法。
C251.C250的免疫原性组合物，其中所述受试者是计划怀孕的女性或怀孕的女性。
C252.C251的免疫原性组合物，其中女性处于怀孕的后半程。
C253.C252的免疫原性组合物，其中怀孕的女性至少处于20周妊娠。
C254.C253的免疫原性组合物，其中怀孕的女性处于27周至36周妊娠。
C255.C250的免疫原性组合物，其中所述受试者是50岁或更老的成人。
C256.C255的免疫原性组合物，其中所述受试者是65岁或更老的成人。
C257.C256的免疫原性组合物，其中所述受试者是85岁或更老的成人。
C258.C250-C257中任一项的免疫原性组合物，其中所述受试者是免疫受损的。
C259.C258的免疫原性组合物，其中所述受试者具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病，或肝病。
C260.C250-259中任一项的免疫原性组合物，其中B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
C261.诱导对B族链球菌的免疫应答的方法，包括向受试者给予有效量的C219-C248中任一项的免疫原性组合物。
C262.在受试者中预防或减少与B族链球菌有关的疾病或病况的方法，包括向受试者给予有效量的C219-C248中任一项的免疫原性组合物。
C263.C261或C262的方法，其中所述受试者是计划怀孕的女性或怀孕的女性。
C264.C263的方法，其中女性处于怀孕的后半程。
C265.C263或C264的方法，其中怀孕的女性至少处于20周妊娠。
C266.C263-265中任一项的方法，其中怀孕的女性处于27周至36周妊娠。
C267.C261或C262的方法，其中所述受试者是50岁或更老的成人。
C268.C267的方法，其中所述受试者是65岁或更老的成人。
C269.C267或C268的方法，其中所述受试者是85岁或更老的成人。
C270.C261-C269中任一项的方法，其中所述受试者是免疫受损的。
C271.C270的方法，其中所述受试者具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病，或肝病。
C272.C261-C271中任一项的方法，其中B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。
C273.产生抗体的方法，包括将C219-C248中任一项的免疫原性组合物给予受试者。
C274.C273的方法产生的抗体。
C275.向受试者赋予被动免疫的方法包括下述步骤：
(a)用C219-C248中任一项的免疫原性组合物产生抗体制剂；和
(b)将所述抗体制剂给予受试者从而赋予被动免疫。

Claims (45)

1.包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中：
(i)所述缀合物包含来自B族链球菌(GBS)和选自血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII和IX的荚膜多糖；和
(ii)所述组合物还包含下述中的一种或多种：药学上可接受的赋形剂，缓冲剂，稳定剂，佐剂，冷冻保护剂，盐，二价阳离子，非离子洗涤剂，自由基氧化抑制剂，载体，或其混合物。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中荚膜多糖单独地缀合至相同的载体蛋白质。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是六价GBS缀合物组合物。
4.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia，Ib，II，III，IV和V的荚膜多糖。
5.权利要求1的免疫原性组合物，还包含铝基佐剂。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂选自磷酸铝，羟基磷酸铝和氢氧化铝。
7.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述佐剂是磷酸铝。
8.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
9.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂存在的浓度是约0.25mg/ml至约0.75mg/ml。
10.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述铝基佐剂存在的浓度是约0.5mg/ml。
11.权利要求1-10中任一项的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物充入注射器。
12.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述注射器是玻璃质的。
13.权利要求11或12的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物充入具有约1mm至约15mm顶部空间的注射器。
14.权利要求12的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物充入具有约2mm至约6mm顶部空间的注射器。
15.权利要求1-13中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在约50次或更少的振摇内再悬浮。
16.权利要求14的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在约10次或更少的振摇内再悬浮。
17.权利要求1-15中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包含磷酸盐/酯。
18.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述磷酸盐/酯存在的浓度是约15mM至约25mM。
19.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述磷酸盐/酯存在的浓度是约20mM。
20.权利要求1-18中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含氯化钠。
21.权利要求1-19的免疫原性组合物，其中所述氯化钠存在的浓度是约10mM至约350mM。
22.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述氯化钠的浓度是约225mM至约265mM。
23.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述氯化钠存在的浓度是约240mM。
24.权利要求1-22的免疫原性组合物，其中所述氯化钠存在的浓度是约200mM。
25.权利要求23的免疫原性组合物，其中所述氯化钠存在的浓度是约150mM。
26.权利要求1-24中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含的总缀合物剂量是约60mcg/ml至约360mcg/ml。
27.权利要求26的免疫原性组合物，其中所述总缀合物剂量是约120mg/ml至约240mcg/ml。
28.权利要求1-26中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
29.权利要求27的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有约7.0的pH。
30.包含约0.25mg/ml至约0.75mg/ml磷酸铝、约15mM至约25mM磷酸盐/酯、约225mM至约265mM氯化钠和总缀合物剂量约60mcg/ml至约360mcg/ml的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
31.包含约0.25mg/ml至约0.75mg/ml氢氧化铝、约15mM至约25mM磷酸盐/酯、约120mM至约170mM氯化钠和总缀合物剂量约60mcg/ml至约360mcg/ml的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有约6.5至约7.5的pH。
32.根据权利要求1-30中任一项的免疫原性组合物，用作药物。
33.权利要求1-31中任一项的免疫原性组合物，用于在受试者中诱导对GBS的免疫应答的方法。
34.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述受试者是50岁或更老的成人。
35.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述受试者是免疫受损的。
36.权利要求34的免疫原性组合物，其中所述受试者具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病或肝病。
37.权利要求32-35中任一项的免疫原性组合物，其中所述B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
38.诱导对B族链球菌的免疫应答的方法，包括向受试者给予有效量的权利要求1-30中任一项的免疫原性组合物。
39.在受试者中预防或减少与B族链球菌有关的疾病或病况的方法，包括向受试者给予有效量的权利要求1-30中任一项的免疫原性组合物。
40.权利要求37或38的方法，其中所述受试者是50岁或更老的成人。
41.权利要求37或38的方法，其中所述受试者是免疫受损的。
42.权利要求40的方法，其中所述受试者具有选自下述的医学病况：肥胖，糖尿病，HIV感染，癌症，心血管疾病或肝病。
43.权利要求38-41中任一项的方法，其中所述B族链球菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
44.产生抗体的方法，包括向受试者给予权利要求1-30中任一项的免疫原性组合物。
45.向受试者赋予被动免疫的方法，包括下述步骤：
(a)用权利要求1-30中任一项的免疫原性组合物产生抗体制剂；和
(b)将所述抗体制剂给予受试者以赋予被动免疫。
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