JP7295206B2 - 免疫原性組成物およびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている、一般にＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）と称されるストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来の莢膜多糖（ＣＰ）を含み、アルミニウムベースのアジュバントを包含していてもよい、免疫原性組成物に関する。本発明はさらに、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発するための、および／または本明細書において開示されている組成物を使用して、対象における侵襲性ＧＢＳ疾患を低減させるもしくは予防するための方法に関する。得られた抗体は、受動免疫療法を介してＧＢＳ感染を治療するまたは予防するために使用することができる。
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）としても公知の、グラム陽性多糖被包性生物である。これらは、ヒト胃腸および生殖管の一般的な片利共生生物であり、乳児および老齢者における重篤な疾患の原因でもある（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、３１（付録４）：Ｄ３～Ｄ６（２０１３））。乳児におけるＧＢＳ感染の主要リスク因子は、母体における定着である（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１１０（１）：３１～３６（１９８７））。４人に１人もの女性がＧＢＳを直腸膣で保菌し、これは、出産の前または最中に、羊水または新生児に感染して、敗血症、肺炎および髄膜炎を引き起こす可能性がある（Ｂａｋｅｒ ２０１３；Ｈｅａｔｈ，Ｐ．Ｔ．ら、ＢＭＪ Ｃｌｉｎ．Ｅｖｉｄ．（Ｏｎｌｉｎｅ）、ｐｉｉ：０３２３（２０１４））。ＧＢＳ髄膜炎を克服した乳児の２５パーセントが神経学的機能障害を患い、１９％が、認知遅延、脳性まひ、失明および難聴を経験する（Ｌｉｂｓｔｅｒ，Ｒ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３０（１）：ｅ８－１５２０１２（２０１２））。ＧＢＳは、流産および早産を引き起こすこともあり、死産とも関係がある（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｏｂｓｔｅｔｒ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．、８（５－６）：２２０～２２７（２０００）；Ｒａｎｄｉｓ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、２１０（２）：２６５～２７３（２０１４）：Ｋｅｓｓｏｕｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｍａｔｅｒｎ．Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ．、２５（１０）：１９８３～１９８６（２０１２））。極低出生体重児は、感染リスクがはるかに高く、最大３％が感染しており、直ちに抗生物質による治療を行っても、最大３０％の死亡率である（Ｈｅａｔｈ ２０１４）。
１９９０年代後半、米国におけるＧＢＳスクリーニングおよび分娩時抗生物質予防的投与（ＩＡＰ）の導入は、生後１週間以内に発生する新生児疾患（早期発症疾患［ＥＯＤ］）の率の低減を実証したが、その後に現れる生後３カ月以内の後期発症疾患（ＬＯＤ）の率に、測定可能な影響を及ぼさなかった。米国でのＥＯＤおよびＬＯＤ症例の率は、現在、出生１，０００人当たりそれぞれ０．２５および０．２７である（疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ；ＣＤＣ）、Ａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｒｅ（ＡＢＣ）Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ（２０１３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｂｃｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ－ｆｉｎｄｉｎｇｓ／ｓｕｒｖｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｂｓ１３．ｐｄｆにおいて利用可能）。菌血症および髄膜炎を包含する侵襲性肺炎球菌疾患の予防のための肺炎球菌コンジュゲートワクチンの導入に続いて、ならびにＧＢＳ疾患の予防のためのＩＡＰにもかかわらず、ＧＢＳは、米国にて、乳児における新生児敗血症（ＥＯＤ）および髄膜炎（２カ月未満）の単一の最も一般的な原因となった（Ｖｅｒａｎｉ，Ｊ．Ｒ．ら、ＭＭＷＲ、５９（ＲＲ１０）：１～３２（２０１０）；Ｔｈｉｇｐｅｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３６４（２１）：２０１６～２０２５（２０１１））。米国とは異なり、侵襲性ＧＢＳ疾患およびＩＡＰのための予防ガイドラインの導入は、オランダにおいても英国においてもＥＯＤの発病率を低減させなかった（Ｂｅｋｋｅｒ，Ｖ．ら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ．、１４（１１）：１０８３～１０８９（２０１４）；Ｌａｍａｇｎｉ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５７（５）：６８２～６８８（２０１３））。この効果の欠如は、普遍的スクリーニングの欠如および最高リスク群の母親（例えば、発熱、長期にわたって破裂した膜）へのＩＡＰを制限することによるものであり得る。ＥＯＤの率は、ＩＡＰを使用しない国において有意に高く、出生１，０００人当たり０．７５の平均発病率（９５％ＣＩ０．５８～０．８９）が報告された（Ｅｄｍｏｎｄ，Ｋ．Ｍら、Ｌａｎｃｅｔ、３７９（９８１５）：５４７～５５６（２０１２））。
ＧＢＳ疾患のリスクがあるもう１つの集団は、高齢者である。リスク因子は、真性糖尿病、がん、心不全、神経学的および泌尿器科学的状態等の慢性的な医学的問題を包含する。ＣＤＣ ＡＢＣサーベイランスデータによれば、２０１３年における侵襲性ＧＢＳの米国での年間発生率は、６５歳以上の成人において、０．２８／１，０００人または１２，４００症例／年であった。この率は、高齢者における侵襲性肺炎球菌疾患の発病率（対６５歳超について０．３０／１，０００）に近似している。これらの率は、米国および欧州の両方において増大し続けると予測されている（ＣＤＣ ２０１３；Ｌａｍａｇｎｉ ２０１３）。
乳児および高齢者の間でのＧＢＳ疾患を予防するための１つのアプローチは、多糖ベースのワクチンの使用である。母体のＧＢＳ予防ワクチンの実施は、ＩＡＰが使用されるか否かにかかわらず、米国において乳児の間でのＧＢＳ疾患を予防する可能性を有する。多糖は、それら自体が免疫原性であり得るが、多糖のタンパク質担体とのコンジュゲーションが、特に乳児および高齢者における免疫原性を改善するために使用されてきた。多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンは、タンパク質担体と関係がある、概して細菌の外皮由来の、多糖を使用して作製される。多糖－タンパク質コンジュゲートは、それらの表面上のワクチン内に含有される多糖を表示する細菌に対して免疫応答を誘発し、故に、疾患を予防する。したがって、病原性細菌由来の多糖コンジュゲートを使用するワクチン接種は、宿主免疫を上昇させるための潜在的な戦略である。
細菌を覆う多糖は、単一種の細菌内であっても大幅に異なっている。例えば、ＧＢＳでは、細菌多糖莢膜のバリエーションにより１０の異なる血清型がある。したがって、多糖ベースのワクチンは、異なる循環血清型を確実に幅広く網羅できるような多糖の一団からなることが望ましい。
担体タンパク質は、標的病原体由来の、その病原体に対する特異的免疫応答を上昇させる関連タンパク質抗原であってもよいし、アジュバントまたは全身的免疫応答刺激剤としてさらに役立つ、概して免疫原性のタンパク質であってもよい。
ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶの個々の一価多糖－タンパク質コンジュゲートは、非妊娠成人における第１および第２相臨床試験にて評価されてきた（Ｂｒｉｇｔｓｅｎ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１８５（９）：１２７７～１２８４（２００２）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８８（１）：６６～７３（２００３）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８９（６）：１１０３～１１１２（２００４）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（１）：５５～６３（２００７））。二価ＩＩ－ＴＴおよびＩＩＩ－ＴＴグリココンジュゲートワクチン、ならびにＩａ－ＣＲＭ１９７、Ｉｂ－ＣＲＭ１９７およびＩＩＩ－ＣＲＭ１９７グリココンジュゲートを含む三価ワクチンも研究されてきた（Ｂａｋｅｒ ２００３；Ｃｌｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１１９３９２０、ＮＣＴ０１４１２８０１およびＮＣＴ０１４４６２８９）。しかしながら、ＧＢＳワクチンは未だ承認されていない。
その上、三価ワクチンは、南アフリカにおいて新生児疾患を引き起こす侵襲性株の９０％超をカバーする（Ｍａｄｚｉｖｈａｎｄｉｌａ，Ｍ．ら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、６（３）：ｅ１７８６１（２０１１））が、これらの同じ血清型は、チゲサイクリン評価およびサーベイランス試験（Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｅｓｔｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．ｃｏｍ／）から２００４～２０１３年の間に収集された９０１の試料のグローバルコレクションからの最近の新生児分離株のサーベイランスに基づき、それぞれ北米および欧州における侵襲性分離株の６２％および６６％のみを表す。
Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．試料から取得された株の分析は、収集された株の９５％が５つの文書化された主要な血清型（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ）のうちの１つに属し、さらなる３％が血清型ＩＶであったことを示した。一連の刊行物は、過去１０年間でアメリカおよび欧州における血清型ＩＶの出現も確認した（Ｄｉｅｄｒｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４８（９）：３１００～３１０４（２０１０）；Ｔｅａｔｅｒｏ（２０１４）；Ｍｅｅｈａｎ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、３３（７）：１１５５～１１６２（２０１４）；Ｆｌｏｒｉｎｄｏ，Ｃ．ら、Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｓｕｒ ｌｅｓ Ｍａｌａｄｉｅｓ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｓ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１９（２３）（２０１４）；Ｐａｌｍｉｅｒｏ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４８（１２）：４３９７～４４０３（２０１０））。乳児へのＧＢＳの伝染のリスク因子である、成人における直腸／膣保菌を調査する研究は、分離株の９７％がこれらの６つの血清型のうちの１つに属し、血清型ＩＶは約４％の頻度を表すことを見出した。研究は、健康な米国成人において、ベータ溶血レンサ球菌（ＧＢＳを包含する）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の保菌をモニターするように設計された（Ｍａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ら、ＩＣＡＡＣ、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉ－３０６（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ｓｅｐ．５～９、２０１４）を参照）。
同様に、Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．試料の分析は、６５歳以上の老齢者由来の米国の血液分離株の９８％が、同じ６つの優勢な血清群に属することを示した。高齢者分離株と他の集団との間の最も顕著な差異は、血清群分布である。高齢者患者由来の分離株について、血清型Ｖ株は、最大の群を構成する（３４％対新生児について１８％または成人保菌者株について１８％）。
他の研究は、血清型有病率の地理的分散があることを見出した。例えば、血清型ＶＩおよびＶＩＩＩ分離株は、日本における健康な妊婦の優勢な外来種であることが示された（Ｌａｃｈｅｎａｕｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１７９（４）：１０３０～１０３３（１９９９）。
米国特許第４，７０８，８７１号 国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３５５１９号 国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０５３６１２号 国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３３１４８号 国際特許出願公開第ＷＯ００／５６３５７号 米国特許第５，６１４，３８２号 国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号 国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５７６０号 国際特許出願公開第ＷＯ９５／０８３４８号 国際特許出願公開第ＷＯ９６／２９０９４号 国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号 国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９７０９９号 国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０８２５２７号 国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０８２５３０号 米国特許第５，２５４，３３９号 米国特許第６，２９９，８８４号 米国特許第４，９１２，０９４号 米国特許第６，１１３，９１８号 米国特許第６，１６５，９９５号 米国特許第６，６１０，３１０号 米国特許第５，０５７，５４０号 米国特許第６，２０７，６４６号 欧州特許第１，２９６，７１３号 欧州特許第１，３２６，６３４号 米国特許第７，２８５，２８１号 米国特許第７，３３２，１７４号 米国特許第７，３６１，３５５号 米国特許第７，３８４，６４０号 米国特許第６，１４９，９１９号 米国特許第７，１１５，７３０号 米国特許第７，２９１，５８８号 米国特許第５，７２３，１２７号 米国特許第５，０７８，９９６号 米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号 米国特許出願公開第２００６／０２２８３８１号 米国特許出願公開第２００７／０１８４０７１号 米国特許出願公開第２００７／０１８４０７２号 米国特許出願公開第２００７／０２３１３４０号 米国特許出願公開第２００８／０１０２４９８号 国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１１８７５２号 米国特許第８，６５２，４８０号 米国特許第５，３６０，８９７号
Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、３１（付録４）：Ｄ３～Ｄ６（２０１３） Ｄｉｌｌｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１１０（１）：３１～３６（１９８７） Ｈｅａｔｈ，Ｐ．Ｔ．ら、ＢＭＪ Ｃｌｉｎ．Ｅｖｉｄ．（Ｏｎｌｉｎｅ）、ｐｉｉ：０３２３（２０１４） Ｌｉｂｓｔｅｒ，Ｒ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３０（１）：ｅ８－１５２０１２（２０１２） ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｏｂｓｔｅｔｒ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．、８（５－６）：２２０～２２７（２０００） Ｒａｎｄｉｓ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、２１０（２）：２６５～２７３（２０１４） Ｋｅｓｓｏｕｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｍａｔｅｒｎ．Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ．、２５（１０）：１９８３～１９８６（２０１２） 疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ；ＣＤＣ）、Ａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｒｅ（ＡＢＣ）Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ（２０１３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｂｃｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ－ｆｉｎｄｉｎｇｓ／ｓｕｒｖｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｂｓ１３．ｐｄｆ Ｖｅｒａｎｉ，Ｊ．Ｒ．ら、ＭＭＷＲ、５９（ＲＲ１０）：１～３２（２０１０） Ｔｈｉｇｐｅｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３６４（２１）：２０１６～２０２５（２０１１） Ｂｅｋｋｅｒ，Ｖ．ら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ．、１４（１１）：１０８３～１０８９（２０１４） Ｌａｍａｇｎｉ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５７（５）：６８２～６８８（２０１３） Ｅｄｍｏｎｄ，Ｋ．Ｍら、Ｌａｎｃｅｔ、３７９（９８１５）：５４７～５５６（２０１２） Ｂｒｉｇｔｓｅｎ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１８５（９）：１２７７～１２８４（２００２） Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８８（１）：６６～７３（２００３） Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８９（６）：１１０３～１１１２（２００４） Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（１）：５５～６３（２００７） Ｃｌｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１１９３９２０ Ｃｌｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１４１２８０１ Ｃｌｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１４４６２８９ Ｍａｄｚｉｖｈａｎｄｉｌａ，Ｍ．ら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、６（３）：ｅ１７８６１（２０１１） Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｅｓｔｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．ｃｏｍ／ Ｄｉｅｄｒｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４８（９）：３１００～３１０４（２０１０） Ｔｅａｔｅｒｏ（２０１４） Ｍｅｅｈａｎ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、３３（７）：１１５５～１１６２（２０１４） Ｆｌｏｒｉｎｄｏ，Ｃ．ら、Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｓｕｒ ｌｅｓ Ｍａｌａｄｉｅｓ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｓ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１９（２３）（２０１４） Ｐａｌｍｉｅｒｏ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４８（１２）：４３９７～４４０３（２０１０） Ｍａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ら、ＩＣＡＡＣ、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉ－３０６（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ｓｅｐ．５～９、２０１４） Ｌａｃｈｅｎａｕｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１７９（４）：１０３０～１０３３（１９９９） Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８～４００２（１９８４） Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（７）：７０９～７１５（１９８６） Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（１１）：２７７７～２７８１（１９９３） Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７（８）：３２４２～３２４９（１９９６） Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７５（４）：４０２～４０８（１９９７） Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、１０１（３０）：１１１２３～８（２００４） Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ，Ｘ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９６：８３～９６（１９９６） Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、３０：１２３３～１２４７（２００２） Ｈｅｓｔｒｉｎ，Ｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０：２４９～２６１（１９４９） Ｆｅｒｒｉｅｒｉ，Ｐ．ら、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］、１９（４）（２０１３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｎｃ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ／ａｒｔｉｃｌｅ／１９／４／１２－１５７２＿ａｒｔｉｃｌｅ ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６１９４）：１２７２～１２８０（１９９３） Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７７（１）：１～９（１９９５） Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１（１５）：８７８６～８７９０（１９９６） Ｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８９（３４）：２３４３７～２３４８（２０１４） Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．、９（９）：８９１～９０６（１９７２） Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０（４８５２）：６５６～６５９（１９８８） Ｂｅｔｈｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：２５７２～２５７４（１９７９） Ｈｅａｒｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、２１８：５０９～５１８（１９８１） Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１（８）：４１８９～４１９９（１９９３） Ｄｏｅ，Ｂ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１０）：２３６９～２３７６（１９９４） 「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著 ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８（４）：４５８～４６２（１９９３） Ｃｈａｆｆｉｎ，Ｄ．Ｏら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８７（１３）：４６１５～４６２６（２００５） Ｎａｎｒａ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９（３）：４８０～４８７（２０１３） Ｅｇａｎ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７：３１７５～３１８０（２００９）
したがって、世界中の幅広い集団間で、新たに出現した血清型ＩＶによって引き起こされるものを包含するＧＢＳ疾患を予防するまたは治療するための手段として受動免疫を付与するための、多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンまたはモノクローナル抗体が必要である。加えて、そのようなワクチンまたは免疫原性組成物は、当技術分野において公知である任意の容器内で安定かつ簡単に再懸濁可能であることが必要である。
本発明は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、アジュバントを包含していてもよい、新規免疫原性組成物に関する。下記の条項は、本発明の一部の態様および実施形態を記述するものである。
一態様において、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしているＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖を含み、アルミニウムベースのアジュバントを包含していてもよい、免疫原性組成物に関する。一実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスフェートおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される。１つのそのような実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
別の実施形態において、莢膜多糖は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される。別の実施形態において、免疫原性組成物は、六価ＧＢＳコンジュゲート組成物である。１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の莢膜多糖を含む。
また別の実施形態において、本発明は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物に関し、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖を含み、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択され、組成物は、薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、担体またはそれらの混合物のうちの１つまたは複数をさらに含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物に関し、莢膜多糖は、同じ担体タンパク質と個々にコンジュゲートしている。
本発明の別の態様において、免疫原性組成物は、シリンジに充填される。一実施形態において、シリンジは、ガラスである。別の実施形態において、免疫原性組成物は、約１ｍｍから約１５ｍｍのヘッドスペースを設けてシリンジに充填される。
本発明のさらなる態様において、免疫原性組成物は、約５０回以下の振とうで再懸濁される。
一実施形態において、免疫原性組成物は、リン酸塩をさらに含む。１つのそのような実施形態において、リン酸塩は、約１５ｍＭから約２５ｍＭの濃度である。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、塩化ナトリウムをさらに含む。１つのそのような実施形態において、塩化ナトリウムは、約１０ｍＭから約３５０ｍＭの濃度である。
さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含む。
追加の実施形態において、免疫原性組成物は、約６．５から約７．５のｐＨを有する。
本発明の一態様において、免疫原性組成物は、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸アルミニウム、約１５ｍＭから約２５ｍＭのリン酸塩、約２２５ｍＭから約２６５ｍＭの塩化ナトリウム、および約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含み、免疫原性組成物は、約６．５から約７．５のｐＨを有する。
本発明の別の態様において、免疫原性組成物は、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、約１５ｍＭから約２５ｍＭのリン酸塩、約１２０ｍＭから約１７０ｍＭの塩化ナトリウム、および約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含み、ここで、免疫原性組成物は、約６．５から約７．５のｐＨを有する。
本発明の別の態様は、ＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、有効量の、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含む方法に関する。一実施形態において、本発明は、対象においてＧＢＳに関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量の、本明細書において記述されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法に関する。特定の実施形態において、対象は、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である。１つのそのような実施形態において、妊娠中の女性は、少なくとも妊娠２０週または少なくとも２７週等、妊娠後半期である。好ましい実施形態において、妊娠中の女性は、妊娠２７週から３６週である。別の実施形態において、対象は、５０歳以上、６５歳以上、および８５歳以上の成人等の老齢者である。さらなる実施形態において、対象は、免疫不全である。一態様において、対象は、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有し得る。好ましい実施形態において、Ｂ群レンサ球菌は、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である。
本発明の追加の態様は、本発明の免疫原性組成物において、莢膜多糖と結合する抗体に関する。一部の実施形態において、抗体は、対象への免疫原性組成物の投与時に産生される。別の態様は、本発明の抗体を含む組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、対象に受動免疫を付与する方法であって、（ａ）本明細書において記述されている免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、（ｂ）抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップとを含む方法に関する。
ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７一価ワクチンにより免疫化されたマウス由来の血清および単離されたＩｇＧのオプソニン活性の比較を示す図である。 ５０℃における加速貯蔵（４週間）後の、ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７の安定性（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳを使用する分子量における変化％によって示される通り）を示す図である。 ５０℃における加速貯蔵（４週間）後の、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７の安定性（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳを使用する分子量における変化％によって示される通り）を示す図である。 ５０℃における加速貯蔵（４週間）後の、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７の安定性（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳを使用する分子量における変化％によって示される通り）を示す図である。 ５０℃における加速貯蔵（４週間）後の、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７の安定性（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳを使用する分子量における変化％によって示される通り）を示す図である。 ５０℃における加速貯蔵（４週間）後の、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７の安定性（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳを使用する分子量における変化％によって示される通り）を示す図である。 ５０℃における加速貯蔵（４週間）後の、ＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７の安定性（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳを使用する分子量における変化％によって示される通り）を示す図である。 ３７℃における貯蔵後の、ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７の安定性（遊離シアル酸によって示される通り）を示す図である。 コハク酸塩を緩衝剤として使用する六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）におけるｐＨの安定性を示す図である。 ヒスチジンを緩衝剤として使用する六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）におけるｐＨの安定性を示す図である。 １０ｍｃｇ／ｍｌの用量でのＧＢＳコンジュゲートのアルミニウムとの結合に対する、六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中におけるヒスチジン緩衝剤濃度の効果を示す図である。 ４０ｍｃｇ／ｍｌの用量でのＧＢＳコンジュゲートのアルミニウムとの結合に対する、六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中におけるヒスチジン緩衝剤濃度の効果を示す図である。 撹拌ストレス時の全抗原性の損失パーセントに対する、六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中におけるポリソルベート－８０濃度の効果を示す図である。 アルミニウムとのＧＢＳコンジュゲート結合に対する、六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中におけるアルミニウム濃度の効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、１０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における５．５％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、１０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における７．０％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、１０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における８．５％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、５０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における５．５％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、５０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における７．０％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、５０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における８．５％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、４０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における７．０％（ｗ／ｖ）スクロースの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、４０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における２．０％（ｗ／ｖ）スクロースおよび４．０％（ｗ／ｖ）マンニトールの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、４０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における３．０％（ｗ／ｖ）スクロースおよび３．０％（ｗ／ｖ）マンニトールの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、４０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における２．０％（ｗ／ｖ）スクロースおよび４．０％（ｗ／ｖ）グリシンの効果を示す図である。 各血清型についての抗原性回復に対する、４０ｍｃｇ／ｍｌ用量の凍結乾燥した六価ＧＢＳワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）中における３．０％（ｗ／ｖ）スクロースおよび３．０％（ｗ／ｖ）グリシンの効果を示す図である。 時間０、２週間および３カ月における、先端を下にした配向でＰＦＳ中に貯蔵した高および低用量への、ＧＢＳ６および一価製剤の再懸濁の比較を示す図である。 先端を下にしたおよび水平配向でＰＦＳ中に貯蔵した高および低用量への、ＧＢＳ６および一価製剤の再懸濁の比較を示す図である。 ｐＨの関数としての、ＡｌＰＯ４のゼータ電位を示す図である。 ｐＨの関数としての、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶのコンジュゲートのゼータ電位を示す図である。 時間０、２週間および３カ月における、先端を下にした配向でｐＦＳ中に貯蔵した高および低用量への、異なるＧＢＳ６および一価製剤の沈殿速度の比較を示す図である。 用量レベル（血清型当たりの濃度）の関数としての、ＧＢＳ６製剤の沈殿速度を示す図である。 低用量（６０ｍｃｇ／ｍＬ）および高用量（２４０ｍｃｇ／ｍＬ）におけるｐＨの関数としての、ＧＢＳ６製剤の沈殿速度を示す図である。 沈殿速度に対する用量およびＮａＣｌ濃度の効果を示す図である。 ４５分後の異なる抗原製剤の沈降挙動についての比較を示す図である。 異なる抗原製剤の詳細な粒径分布を示す図である。 １０μｍ以上または２５μｍ以上のいずれかとして分類される、異なる抗原製剤の粒径分布を示す図である。 様々なヘッドスペースを設けた、ＰＦＳ中のＧＢＳ６製剤を示す図である。 水平位置で２週間貯蔵後の、様々な濃度のＡｌＰＯ４を加えた高用量ＧＢＳ６製剤を再懸濁するために必要とされる振とう回数を示す図である。 水平位置で２週間貯蔵後の、様々な濃度のＡｌＰＯ４を加えたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶのコンジュゲートの結合を示す図である。 再懸濁に対する、異なる凝結剤およびアルミニウム塩の効果を示す図である。 沈降速度に対する、異なる凝結剤およびアルミニウム塩の効果を示す図である。 高用量ＧＢＳ６製剤の再懸濁時間に対する、ＮａＣｌ濃度の効果を示す図である。 再懸濁時間に対する、ＮａＣｌおよびリン酸イオンの組合せの効果を示す図である。 ２時間後の沈降に対する、ＮａＣｌおよびリン酸カリウム濃度の効果を示す図である。 ３０分後の沈降に対する、ＮａＣｌおよびリン酸カリウム濃度の効果を示す図である。 ２０ｍＭのリン酸塩および２４０ｍＭのＮａＣｌを含むＧＢＳ６製剤の結合抗原性パーセントを、対照ＧＢＳ６製剤と比較して示す図である。 より簡単な再懸濁（１０回以下の振とう）を容易にする最適かつ強固な製剤条件についての予測プロファイラーの推奨事項を示す図である。 予測プロファイラーの推奨事項に基づくＧＢＳ６製剤についての結合抗原性パーセントを示す図である。 様々な濃度のＡｌ（ＯＨ）３を加えた、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶの結合を示す図である。
本発明は、記述されている特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変更し得ることを理解されたい。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、限定を意図していないことも理解されたい。
本明細書において記述されているものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記述する。本明細書において言及されているすべての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書において使用される用語は、当業者に認識されており、公知である意味を有するが、利便性および完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を、以下でおよび明細書全体を通して説明する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の参照物を包含する。故に、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つまたは複数の方法、および／または本明細書において記述されているステップ、および／または本開示等を読めば当業者に明らかとなると予想されるものを包含する。
「約」または「およそ」という用語は、値の統計的に意味のある範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の、一桁以内、典型的には２０％以内、またさらに典型的には１０％以内、さらに一層典型的には５％以内であってよい。「約」または「およそ」という用語によって網羅される許容偏差は、研究中の特定の系によって決まり、当業者には容易に分かり得る。本出願内で範囲が記載されている場合にはいつでも、該範囲内のすべての整数も、本発明の実施形態として企図されている。
本開示において、「含む」、「含まれる」、「含むこと」、「含有する」、「含有すること」等の用語は、米国特許法におけるものに帰属する意味を有し得、例えば、「包含する」、「包含される」、「包含すること」等を意味し得る。そのような用語は、任意の他の要素を除外することなく、特定の原料または原料のセットの包含を指す。「から本質的になること」および「から本質的になる」等の用語は、米国特許法におけるものに帰属する意味を有し、例えば、本発明の新規または基本的な特徴から逸脱しない追加の原料またはステップの包含を可能にする、すなわち、本発明の新規または基本的な特徴から逸脱する追加の列挙されていない原料またはステップを除外し、本明細書において引用されているまたは参照により本明細書に組み込まれる当技術分野における文書、とりわけ、この文書の目標が、特許性のある、例えば、新規の、自明でない、発明的な、従来技術を上回る、例えば、本明細書において引用されているもしくは参照により本明細書に組み込まれる文書を上回る、実施形態を定義することである場合等、先行技術の原料またはステップを除外する。また、「からなる」および「からなること」という用語は、米国特許法におけるものに属する意味を有する、すなわち、これらの用語はクローズエンドである。したがって、これらの用語は、特定の原料または原料のセットの包含および他すべての原料の除外を指す。
「抗原」という用語は、概して、同族抗体が選択的に結合できる少なくとも１つのエピトープを含有する生体分子、通常はタンパク質、ペプチド、多糖、脂質もしくはコンジュゲート、または、一部の場合において、動物に注射もしくは吸収される組成物を包含する、動物において抗体もしくはＴ細胞応答または両方の生成を刺激することができる免疫原性物質を指す。免疫応答は、全分子に対して、または分子の１つもしくは複数の種々の部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して産生され得る。該用語は、個々の分子または抗原分子の均一もしくは不均一集団を指すために使用され得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または特異的な体液性および／もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」という用語は、すべての関連抗原エピトープを包含する。所与の抗原のエピトープは、当業者に周知であるいくつものエピトープマッピング技術を使用して同定することができる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪを参照）。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上の多数のペプチド、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを同時に合成し、ペプチドが支持体に付着しているままで、ペプチドを抗体と反応させることによって、決定することができる。そのような技術は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８～４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（７）：７０９～７１５（１９８６）において記述されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、立体構造エピトープは、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴によって等、アミノ酸の空間的立体構造を決定することによって同定され得る（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照）。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を導出する能力を維持する限り、欠失、付加および置換等の天然配列への修飾を包含するタンパク質（概して保存的な性質であるが、非保存的であってよい）を指すためにも使用され得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を介して、もしくは特定の合成手順を介して、もしくは遺伝子工学的アプローチを介してのように意図的であってよく、または抗原を生成する宿主の突然変異を介して等、偶発的であってもよい。さらに、抗原は、微生物、例えば細菌から誘導、取得または単離されてもよいし、全生物であってもよい。同様に、核酸免疫化用途において等、抗原を発現しているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、定義に包含される。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成的に誘導された抗原も包含される（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（１１）：２７７７～２７８１（１９９３）；Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７（８）：３２４２～３２４９（１９９６）；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７５（４）：４０２～４０８（１９９７））。
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、交換可能に使用され、動物において免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性組成物を含む医薬組成物を指す。
莢膜多糖
本明細書において使用される場合、「糖」という用語は、単一砂糖部分または単糖単位、ならびに、共有結合して二糖、オリゴ糖および多糖を形成する２つ以上の単一砂糖部分または単糖単位の組合せを指す。「糖」という用語は、「炭水化物」という用語と交換可能に使用され得る。多糖は、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい。
「単糖」は、本明細書において使用される場合、オリゴ糖中における単一砂糖残基を指す。「二糖」という用語は、本明細書において使用される場合、グリコシド結合によって一緒に結合した２つの単糖単位または部分から構成される多糖を指す。
一実施形態において、多糖は、オリゴ糖（ＯＳ）である。「オリゴ糖」は、本明細書において使用される場合、２つ以上の単糖単位または部分を含有する化合物を指す。オリゴ糖の文脈内では、個々のモノマー単位または部分は、ヒドロキシル基を介して別の単糖単位または部分と結合しているまたはすることができる単糖である。オリゴ糖は、保護された単一残基砂糖からの化学合成によってまたは生物学的に生成された多糖の化学分解によってのいずれかで調製することができる。代替として、オリゴ糖は、インビトロ酵素法によって調製され得る。
好ましい実施形態において、多糖ＰＳは、少なくとも５つの単糖単位または部分の直鎖状または分枝鎖状ポリマーを指す。明瞭にするために、より多数の繰り返し単位（ここで、ｎは、約５超、例えば約１０超等である）を、本明細書において多糖と称する。
一実施形態において、多糖は、細胞表面多糖である。細胞表面多糖は、ペプチドグリカン層、細胞壁および莢膜を包含する最も外側の細菌細胞膜または細菌細胞表面上に位置する少なくとも一部を有する多糖を指す。典型的には、細胞表面多糖は、インビボで免疫応答を誘発することに関連する。細胞表面多糖は、「細胞壁多糖」または「莢膜多糖」であってよい。細胞壁多糖は、典型的には、細菌表面上に不連続層を形成する。
一実施形態において、多糖は、莢膜多糖である。莢膜多糖は、グリコシド結合によって接合した１つまたは複数の単糖の繰り返し単位を包含するグリコポリマーである。莢膜多糖は、典型的には、細菌細胞の周囲に莢膜様層を形成する。「莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」または「莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」は、レンサ球菌のほとんどの分離株の細胞壁の外部にある多糖莢膜を指す。例えば、すべてのＧＢＳ莢膜多糖は、細菌の菌力に必要とされる末端α２－３－結合シアル酸を持つ分枝鎖状繰り返し構造を有する。莢膜関連シアル酸（ＨＰＬＣアッセイによって定量化される）は、インビトロで培養したＴ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．由来の侵襲性新生児分離株の９４％超において検出された。
本発明者らは、ＧＢＳ莢膜多糖のシアル酸レベルが、免疫応答を生成するために重要な特徴であることを発見した。先行開示は、血清型Ｖについてのシアル酸レベルに関して矛盾する情報、脱シアル化血清型Ｖが好ましい（国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３５５１９号）、および血清型Ｖについて５０％超のシアル酸含有量が使用され得る（国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０５３６１２号）という所見のみを提供していた。しかしながら、これらの参考文献のうちのいずれも、ＧＢＳ多糖の少なくとも大部分についてのシアル酸レベルの、免疫原性に対する重要性について記述していない。本発明者らは、驚くべきことに、ＧＢＳ莢膜多糖が、天然シアル酸レベルを有する多糖に相当する免疫応答（すなわち、１００％または約９５％超）を提供するために、コンジュゲーションの前に約６０％以上のシアル酸を必要とすることを見出した。血清型Ｖについて開示されている先の範囲内である５８％のシアル酸レベルであっても、免疫原性に悪影響を及ぼした。
したがって、本発明の一実施形態において、莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、それらの自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、および最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてもよい。
１００％のシアル酸レベルは、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸に対応することに留意すべきである。したがって、莢膜多糖は、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
一部の莢膜多糖（ＣＰ）血清型の末端シアル残基は、部分的にＯ－アセチル化されている（ＯＡｃ）（Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、１０１（３０）：１１１２３～８（２００４））。血清型Ｉｂ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸは、部分的にＯ－アセチル化されている（最大約４０％）のに対し、血清型Ｉａ、ＩＩおよびＶＩＩは、Ｏ－アセチル化をほとんどまたは全く有さない（約５％未満）（Ｌｅｗｉｓ ２００４）。本発明の一実施形態において、莢膜多糖は、それらの自然なＯ－アセチル化レベル（約０％から約４０％）を含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、Ｏ－脱アセチル化されていてよい（約５％未満）。多糖またはオリゴ糖のＯ－アセチル化の程度は、当技術分野において公知である任意の方法によって、例えば、プロトンＮＭＲによって決定することができる（Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ，Ｘ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９６：８３～９６（１９９６）；Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、３０：１２３３～１２４７（２００２）；国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３３１４８号および同第ＷＯ００／５６３５７号）。別の一般に使用される方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ，Ｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０：２４９～２６１（１９４９）によって記述されている。
また、１００％のＯ－アセテートは、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのＯ－アセテートに対応する。したがって、部分的にＯ－アセチル化されている多糖は、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３５または約０．４ｍＭのＯ－アセテートを含む。Ｏ－脱アセチル化されている多糖は、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．０５ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む。
侵襲性疾患を引き起こすことができるレンサ球菌微生物は、概して、細菌を被包し、宿主の自然免疫系によるクリアランスに対するその抵抗を強化するＣＰを生成することもできる。ＣＰは、細菌を食作用および細胞内死滅に対して抵抗性にする保護莢膜内に細菌細胞を覆い隠すことに役立つ。莢膜を欠いている細菌は、食作用の影響をより受けやすい。莢膜多糖は、高頻度で、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を包含する多くの細菌病原体にとって重要な菌力因子である。
莢膜多糖を使用して、特定の種の細菌の血清型を決めることができる。莢膜多糖の特異的構造または独自のエピトープ特徴への型判定は、通常は、産生された特異抗血清またはモノクローナル抗体との反応によって遂行される。１０のＧＢＳ血清型：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩ～ＩＸがある（Ｆｅｒｒｉｅｒｉ，Ｐ．ら、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］、１９（４）（２０１３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｎｃ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ／ａｒｔｉｃｌｅ／１９／４／１２－１５７２＿ａｒｔｉｃｌｅにおいて利用可能）。
本発明の一実施形態において、多糖は、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）から単離される。多糖は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の任意の被包性株、例えば、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４、ＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７、ＰＦＥＧＢＳＴ０２６７、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１、ＰＦＥＧＢＳＴ０７０８、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）、ＰＦＥＧＢＳＴ０５６３、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６、ＰＦＥＧＢＳＴ０９６１、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１、ＰＦＥＧＢＳＴ０８３７、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４、ＣＺ－ＰＷ－１１９、７２７１、ＣＺ－ＰＷ－０４５、ＪＭ９１３００１３、ＪＭ９１３０６７２、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２およびＩＴ－ＰＷ－６４等から単離され得る。
本明細書において記述されている多糖は、例えば、本明細書において記述されている方法を包含する、当技術分野において公知の方法によって単離され得る。本明細書において使用される場合、「単離された」は、特定の起源から取得され、分離されることを指す。「単離された」という用語はさらに、そのそれぞれの自然発生形態、状況および／または環境にないことを指す。例えば、「レンサ球菌から単離された」は、レンサ球菌細胞から取得され、分離された物質を指す。単離された多糖は、自然発生のものではない。「単離された」という用語は、材料がその元の環境から取り出されていることを意味する（例えば、それが自然発生のものであれば自然環境、またはそれが組換え実体であればその宿主生物から、もしくは１つの環境から異なる環境へ運ばれる）。例えば、「単離された」莢膜多糖、タンパク質またはペプチドは、タンパク質が由来する細胞もしくは組織起源からの細胞材料もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または、化学的に合成される場合、もしくは化学反応の一部として混合物中に存在する場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。本発明において、タンパク質または多糖は、免疫原性組成物の製造において有用な形態で提供されるように、細菌細胞からまたは細胞残屑から単離され得る。「単離された」または「単離すること」という用語は、当技術分野において公知である単離された多糖を精製するための方法および／または本明細書において記述されている方法を包含する、精製することまたは精製を包含し得る。「細胞材料を実質的に含まない」という言葉は、ポリペプチド／タンパク質が、それを単離または組換えにより生成した細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチド／タンパク質の調製物を包含する。故に、細胞材料を実質的に含まない莢膜多糖、タンパク質またはペプチドは、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％または１％（乾重量で）未満の汚染タンパク質もしくは多糖または他の細胞材料を有する、莢膜多糖、タンパク質またはペプチドの調製物を包含する。ポリペプチド／タンパク質が組換えにより生成される場合、これは、好ましくは培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％または５％未満を表す。ポリペプチド／タンパク質または多糖が化学合成によって生成される場合、これは、好ましくは化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まない、すなわち、これは、タンパク質または多糖の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、ポリペプチド／タンパク質または多糖のそのような調製物は、目的のポリペプチド／タンパク質または多糖断片以外に、約３０％、２０％、１０％、５％（乾重量で）未満の化学的前駆体または化合物を有する。
本発明の一実施形態において、多糖は、細菌から単離される。本発明の別の実施形態において、多糖は、組換えにより生成される。さらなる実施形態において、多糖は、合成であるか、または従来の方法に従って化学的に合成される。本発明のまた別の実施形態において、多糖は、多糖を生成するための生合成経路をクローン化および発現した後の代理宿主における発現によって調製される。一実施形態において、多糖は、免疫原性である。例えば、本発明者らは、本明細書において記述されている各多糖が、免疫応答を誘発するまたは導出することができることを発見した。「免疫原性」という用語は、哺乳動物において、体液性および／または細胞媒介性免疫応答を開始する、トリガーする、引き起こす、強化する、改善する、および／または増強させる能力を指す。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、マウス等である。
莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用のための検討事項である。高分子量の莢膜多糖は、抗原表面上に存在する、より高い原子価のエピトープにより、ある特定の抗体免疫応答を誘発することができる。高分子量の莢膜多糖の単離および精製は、本発明のコンジュゲート、組成物および方法において使用するために企図されている。
しかしながら、一実施形態において、多糖は、担体タンパク質とのコンジュゲーション前に、天然莢膜多糖の分子量より低い分子量（ＭＷ）範囲にサイズ決定されていてよい。精製された莢膜多糖のサイズは、有利な濾過特性および／または収率を持つコンジュゲートを産生するために低減される。
１つのそのような実施形態において、精製された莢膜多糖のサイズは、高圧均質化によって低減される。高圧均質化は、十分に小さい寸法を持つ流路を介してプロセス流をポンプでくみ上げることにより、高せん断速度を実現する。せん断速度は、大きな印加均質化圧力を使用することによって増大され、曝露時間は、ホモジナイザーを介して送給流を再循環させることによって増大させることができる。
一実施形態において、本明細書において記述されている多糖は、オプソニン活性を誘発することができる。別の実施形態において、本明細書において記述されている多糖は、オプソニンおよび食作用活性（例えば、オプソニン食作用活性）を誘発することができる。
オプソニン活性またはオプソニン化は、オプソニン（例えば、抗体または補体因子）が抗原（例えば、本明細書において記述されている単離された多糖）と結合するプロセスを指し、これは、食細胞または食作用細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞および多形核白血球（ＰＭＮＬ））との抗原の結合を容易にする。一部の細菌、例えば、莢膜の存在により典型的には貪食されていない被包性細菌等は、オプソニン抗体でコーティングされると、食細胞によって認識されやすくなる。一実施形態において、多糖は、オプソニンである免疫応答、例えば抗体等を誘発する。一実施形態において、オプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくはレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に対する、より好ましくはＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の少なくとも１つの株に対するものである。
また別の実施形態において、本明細書において記述されている多糖は、殺菌免疫応答を誘発することができる。一実施形態において、殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくはレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に対する、より好ましくはＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の少なくとも１つの株に対するものである。
オプソニン化、食作用および／または殺菌活性を測定するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、細菌負荷の低減をインビボで計測することによるもの（例えば、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種を接種した哺乳動物における菌血症レベルを測定することによるもの）および／または細菌細胞死滅をインビトロで計測することによるもの（例えば、インビトロオプソニン食作用アッセイ）である。一実施形態において、多糖は、適切な対照と比較して、例えば、熱で死滅させたグラム陽性球菌に対して育てられた抗血清と比較して等、オプソニン、食作用および／または殺菌活性を誘発することができる。
血清型Ｉａ
一実施形態は、血清型Ｉａ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｉａの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000001
コンジュゲーション前の血清型Ｉａ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間である。別の好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
特定の実施形態において、多糖の構造的特色、例えばシアル酸等を保存しながら、天然ＧＢＳ莢膜多糖血清型Ｉａのサイズを低減させるために、高圧均質化プロセスが使用される。
本発明の一実施形態において、血清型Ｉａ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型Ｉａ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型Ｉａ莢膜多糖は、約５％未満Ｏ－アセチル化されている。本発明の血清型Ｉａ莢膜多糖の一部の例示的な株は、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４およびＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）を包含する。
血清型Ｉｂ
一実施形態は、血清型Ｉｂ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｉｂの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000002
コンジュゲーション前の血清型Ｉｂ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型Ｉｂ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型Ｉｂ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型Ｉｂ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型Ｉｂ莢膜多糖の一部の例示的な株は、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７およびＰＦＥＧＢＳＴ０２６７を包含する。
血清型ＩＩ
一実施形態は、血清型ＩＩ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＩの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000003
コンジュゲーション前の血清型ＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＩ莢膜多糖は、約５％未満Ｏ－アセチル化されている。本発明の血清型ＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１およびＰＦＥＧＢＳＴ０７０８を包含する。
血清型ＩＩＩ
一実施形態は、血清型ＩＩＩ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＩＩの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000004
コンジュゲーション前の血清型ＩＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間である。別の好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
特定の実施形態において、多糖の構造的特色、例えばシアル酸等を保存しながら、天然ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＩＩＩのサイズを低減させるために、高圧均質化プロセスが使用される。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＩＩ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＩＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）およびＰＦＥＧＢＳＴ０５６３を包含する。
血清型ＩＶ
一実施形態は、血清型ＩＶ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＶの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000005
コンジュゲーション前の血清型ＩＶ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＶ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＶ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＶ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＩＶ莢膜多糖の一部の例示的な株は、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６およびＰＦＥＧＢＳＴ０９６１を包含する。
血清型Ｖ
一実施形態は、血清型Ｖ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｖの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000006
コンジュゲーション前の血清型Ｖ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型Ｖ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型Ｖ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型Ｖ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型Ｖ莢膜多糖の一部の例示的な株は、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１およびＰＦＥＧＢＳＴ０８３７を包含する。
血清型ＶＩ
ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖は、ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６１９４）：１２７２～１２８０（１９９３）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000007
コンジュゲーション前の血清型ＶＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＶＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＶＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＶＩ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＶＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４およびＣＺ－ＰＷ－１１９を包含する。
血清型ＶＩＩ
ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７７（１）：１～９（１９９５）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩＩの繰り返し単位は、次の通りである：
Figure 0007295206000008
コンジュゲーション前の血清型ＶＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、約５％未満Ｏ－アセチル化されている。本発明の血清型ＶＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、７２７１およびＣＺ－ＰＷ－０４５を包含する。
血清型ＶＩＩＩ
ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１（１５）：８７８６～８７９０（１９９６）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩＩＩの繰り返し単位は、次の通りである：
Figure 0007295206000009
コンジュゲーション前の血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＪＭ９１３００１３およびＪＭ９１３０６７２を包含する。
血清型ＩＸ
ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖は、Ｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８９（３４）：２３４３７～２３４８（２０１４）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＩＸの構造は、次のように描写することができる：
Figure 0007295206000010
コンジュゲーション前の血清型ＩＸ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＸ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＸ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＸ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満、Ｏ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＩＸ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２およびＩＴ－ＰＷ－６４を包含する。
多糖－タンパク質コンジュゲート
本明細書において使用される場合、「コンジュゲート」は、通常は所望範囲の分子量の莢膜多糖および担体タンパク質を含み、莢膜多糖は、担体タンパク質とコンジュゲートしている。コンジュゲートは、若干量の遊離莢膜多糖を含有してもしなくてもよい。本明細書において使用される場合、「遊離莢膜多糖」は、コンジュゲートしている莢膜多糖－担体タンパク質と非共有結合的に会合している（すなわち、それと非共有結合している、それに吸着しているまたはその中にもしくはそれにより捕捉されている）莢膜多糖を指す。「遊離莢膜多糖」「遊離多糖」および「遊離糖」という用語は、交換可能に使用されてよく、同じ意味を伝えるように意図されている。担体分子の性質にかかわらず、担体分子は、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで、莢膜多糖とコンジュゲートすることができる。本明細書において使用される場合、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートしている」および「コンジュゲートすること」は、細菌莢膜多糖が担体分子と共有結合するプロセスを指す。コンジュゲーションは、細菌莢膜多糖の免疫原性を強化する。コンジュゲーションは、後述する方法に従って、または当技術分野において公知のプロセスによって、実行することができる。
「コンジュゲート免疫原性組成物」は、本明細書において使用される場合、免疫原性材料が、担体タンパク質と共有結合して多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する抗原性多糖を包含する、免疫原性組成物を指す。一実施形態において、本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートは、多価免疫原性組成物として製剤化され得る。
本明細書において使用される場合、多糖のまたは担体タンパク質－多糖コンジュゲートの「分子量」という用語は、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出された分子量を指す。
本明細書において使用される場合、「多糖－タンパク質コンジュゲート」は、１つまたは複数の共有結合を介してタンパク質担体分子とコンジュゲートしている多糖分子を指す。多糖を、標的宿主において免疫原性であることが公知の別の種由来のタンパク質とコンジュゲートすることが望ましい場合がある。したがって、一実施形態において、担体分子は、担体タンパク質である。本明細書において定義されている通り、そのような外来タンパク質を、「担体タンパク質」と称する。担体タンパク質は、多糖の抗原性および免疫原性を強化するために役立つ。本明細書において使用される場合、「担体効果」という用語は、弱免疫原性または非免疫原性分子の抗原性および免疫原性が、担体としてのより免疫原性の高い分子（例えば、異種タンパク質）と結合されることによって強化されるプロセスを指す。この場合、組み合わせた多糖－タンパク質コンジュゲート中の多糖は、単独で提示された場合よりも免疫原性が高くなる。担体タンパク質は、抗体応答を生成するのを助けるＴ細胞を刺激するために、Ｔ細胞エピトープを含有する。
「担体タンパク質」または「タンパク質担体」は、本明細書において使用される場合、免疫応答が所望される抗原（莢膜多糖等）とコンジュゲートされ得る任意のタンパク質分子を指す。多糖等の抗原の担体タンパク質とのコンジュゲーションは、抗原を免疫原性にすることができる。担体タンパク質は、好ましくは、非毒性および非反応源性であり、十分な量および純度で取得可能なタンパク質である。担体タンパク質の例は、毒素、トキソイド、または破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種およびレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の毒素の任意の突然変異体交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）である。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適していなくてはならない。本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、担体タンパク質として使用される。
交差反応材料またはＣＲＭは、本発明の一部の実施形態にとりわけ有用である。遺伝子改変されたタンパク質を生成することができ、これは、ある特定の細菌毒素と抗原的に同様であるが、非毒性である。これらは、「交差反応材料」またはＣＲＭと呼ばれる。ＣＲＭ１９７（Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）は、天然ジフテリア毒素由来の単一アミノ酸変化を有し、それと免疫学的に区別できないことから、注目に値する。Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．、９（９）：８９１～９０６（１９７２）；米国特許第５，６１４，３８２号を参照されたく、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸および酵母抽出物ベースの培地中で成長させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離されたジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーを介して精製される。ＣＲＭ１９７タンパク質を生成するジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）の培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ５３２８１が割り当てられた。他のジフテリアトキソイドも、担体タンパク質として使用するために好適である。ＣＲＭ３２０１は、百日咳毒素の遺伝子操作された変異体である。Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０（４８５２）：６５６～６５９（１９８８）を参照されたく、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７および百日咳トキソイドに加えて、担体タンパク質のさらなる例は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号において記述されている通り）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性トキソイド（ＬＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）耐熱性トキソイド（ＳＴ）、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来の肺炎球菌溶血素（野生型または毒性を低減した突然変異体）、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のＣ５ａペプチダーゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ａｕｒｅｕｓ）由来の溶血素、分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）タンパク質、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、ならびに呼吸器合胞体ウイルスＦおよびＧタンパク質、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素または組換えにより生成された非毒性突然変異体緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａを包含するその誘導体を包含する。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜タンパク質複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質等、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）エンテロトキシン（毒素Ａ）および細胞毒素（毒素Ｂ）を使用することもできる。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）等を、担体タンパク質として使用することもできる。好ましい実施形態において、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドである。より好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。本発明の別の実施形態において、担体タンパク質は、破傷風トキソイドである。
多価コンジュゲート免疫原性組成物の合成のために、多糖－タンパク質コンジュゲートは、２つの異なる種の細菌から精製された多糖の混合物を、担体タンパク質とコンジュゲートすることによって生成され得る。代替として、多価コンジュゲート免疫原性組成物は、同じ細菌の２つ以上の異なる血清型の細菌から精製された多糖を組み合わせ、それらを混合物として担体タンパク質とコンジュゲートすることによって生成され得る。代替として、単一種類の多糖を担体タンパク質と、異なる多糖を使用する別個の反応において反応させることによって生成された多糖－タンパク質コンジュゲートを、混合してよい。故に、多価免疫原性組成物は、結合した多糖の均一または不均一集団を担持している担体タンパク質を包含し得る。
莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーション後、多糖－タンパク質コンジュゲートは、様々な技術によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関しては富化される）。これらの技術は、例えば、濃縮／血液透析濾過作業、沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィーおよび深層濾過を包含する。
上述した通り、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ莢膜多糖を含むコンジュゲートに関する。本発明の一実施形態は、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＶ莢膜多糖を含むコンジュゲート、および、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖、または担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖を含む少なくとも１つの追加のコンジュゲートを提供する。本発明の一態様において、多糖は、約５ｋＤａから１，０００ｋＤａの間の分子量を有し、コンジュゲートは、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間の分子量を有し、コンジュゲートは、全多糖と比べて約４０％未満の遊離多糖を含む。一実施形態において、コンジュゲートは、全多糖と比べて、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離多糖を含む。
一実施形態において、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよび／またはＩＸ多糖は、コンジュゲーションの前、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等の分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
一実施形態において、コンジュゲートは、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、例えば、約３００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約４，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約３，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約２，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約４，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約３，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約２，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、または約３，０００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間等の分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＶ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９７または０．９８ｍＭのシアル酸を有する。好ましい実施形態において、コンジュゲートは、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９または０．９５ｍＭのシアル酸を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＶ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、本発明のコンジュゲートは、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．０５ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む。別の実施形態において、コンジュゲートは、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３５または約０．４ｍＭのＯ－アセテートを含む。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＶ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
さらなる実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離ＧＢＳ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して、約５％未満の未反応の遊離糖を含む。
また別の実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）は、約０．５から約３．０の間である。一態様において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．５から約２．０の間、約０．５から約１．５の間、約０．５から約１．０の間、約１．０から約１．５の間、または約１．０から約２．０の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．８から約１．０の間である。
別の実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から１５の間、２から１３の間、２から１０の間、２から８の間、２から６の間、２から５の間、２から４の間、３から１５の間、３から１３の間、３から１０の間、３から８の間、３から６の間、３から５の間、３から４の間、５から１５の間、５から１０の間、８から１５の間、８から１２の間、１０から１５の間、または１０から１２の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から５の間である。
コンジュゲーション
コンジュゲーションは、直接的であってよく、ここでは、多糖からの原子がタンパク質表面からの原子と共有結合している。代替として、コンジュゲーションは、リンカー分子を介するものであってよく、これが多糖およびタンパク質の両方と反応し、２つを接続して、炭水化物をタンパク質に繋ぐ。
担体および多糖等の１つまたは複数の抗原がコンジュゲートしている（すなわち、共有結合的に会合している）場合、コンジュゲーションは、当業者において公知である任意の化学的方法、プロセスまたは遺伝学的技術によるものであってよい。例えば、担体ポリペプチド、および、炭水化物、オリゴ糖、脂質、リポオリゴ糖、多糖、オリゴ糖－タンパク質コンジュゲート、多糖－タンパク質コンジュゲート、ペプチド－タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖－ペプチドコンジュゲート、多糖－ペプチドコンジュゲート、タンパク質－タンパク質コンジュゲート、リポオリゴ糖－タンパク質コンジュゲート、多糖－タンパク質コンジュゲート、またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される１つまたは複数の抗原は、（１）タンパク質官能基を介する直接的カップリング（例えば、チオール－チオール結合、アミン－カルボキシル結合、アミン－アルデヒド結合；酵素直接的カップリング）、（２）アミンのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス－アルデヒドを使用する）、（３）チオールのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス－マレイミドを使用する）、（４）光活性化試薬を介するホモ二官能性カップリング、（５）アミンのチオールとのヘテロ二官能性カップリング（例えば、マレイミドを使用する）、（６）光活性化試薬を介するヘテロ二官能性カップリング（例えば、β－カルボニルジアゾ（ｃａｒｂｏｎｙｉｄｉａｚｏ）ファミリー）、（７）臭化シアン活性化またはカルボキシメチル化を介してアミン－反応性基を多糖またはオリゴ糖に導入すること、（８）マレイミド－ヒドラジド等のヘテロ二官能性化合物を介してチオール－反応性基を多糖またはオリゴ糖に導入すること、（９）疎水性基をタンパク質に導入することを介するタンパク質－脂質コンジュゲーションおよび（１０）反応性基を脂質に組み込むことを介するタンパク質－脂質コンジュゲーションを包含するがこれらに限定されない技術によって、コンジュゲートしていてよい。また、ビオチン－アビジン相互作用等のヘテロ二官能性「非共有結合的カップリング」技術も企図されている。オリゴ糖および多糖の、免疫原性担体タンパク質とのコンジュゲーションを達成するための、当技術分野において周知である他の方法も、本発明の一部の実施形態の範囲内である。
ある実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、多糖を１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化させて、シアン酸エステルを形成することによって取得される。活性化多糖は、担体タンパク質上のアミノ基と、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用する）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡまたはＳＢＡＰを使用する）との反応後に取得されるチオエーテル結合を介して担体とカップリングされ得るチオール化多糖を得るために、シスタミンまたはシステアミンであってよい。
一態様において、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学によって作製されていてもよい）は、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングされており、アミノ誘導体化糖は、タンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を使用して、担体タンパク質とコンジュゲートしている。そのようなコンジュゲートは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５７６０号、同第ＷＯ９５／０８３４８号および同第ＷＯ９６／２９０９４号において記述されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣおよびＴＳＴＵを使用する。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号において記述されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基の、１，１カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）または１，１カルボニルジ１，２，４トリアゾール（ＣＤＴ）との反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：２５７２～２５７４（１９７９）；Ｈｅａｒｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、２１８：５０９～５１８（１９８１）を参照）、続いて、カルバメート結合を形成するためのタンパク質との反応によって形成され得るカルボニルリンカーを伴ってよい。これは、アノマー末端の第一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩ／ＣＤＴカルバメート中間体を形成するための第一級ヒドロキシル基のＣＤＩ／ＣＤＴとの反応、およびＣＤＩ／ＣＤＴカルバメート中間体をタンパク質上のアミノ基とカップリングすることを伴ってよい。
好ましい実施形態において、本発明のＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、還元的アミノ化を使用して調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ：（１）個々の六糖単位において隣接ジオールからアルデヒド官能基を産生するための多糖の酸化、ならびに（２）コンジュゲートを形成するための活性化多糖および担体タンパク質の還元を伴う。
ある実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖は、
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと
を含むプロセスによって活性化（酸化）される。
本発明のある態様において、単離された莢膜多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬから約５．０ｍｇ／ｍＬの間、約１．０ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬの間、または約２．０ｍｇ／ｍＬ等である。
特定の実施形態において、酸化剤は、過ヨウ素酸塩である。過ヨウ素酸塩は、隣接ヒドロキシル基を酸化してカルボニルまたはアルデヒド基を形成し、Ｃ－Ｃ結合の開裂を引き起こす。「過ヨウ素酸塩」という用語は、過ヨウ素酸塩および過ヨウ素酸の両方を包含する。この用語は、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）およびオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方も包含する。「過ヨウ素酸塩」という用語は、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムを包含する過ヨウ素酸塩の種々の塩も包含する。好ましい実施形態において、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである。好ましい実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖の酸化に使用される過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸塩である。好ましい実施形態において、血清型莢膜多糖の酸化に使用される過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
別の実施形態において、多糖を、０．０１から１０．０、０．０５から５．０、０．１から１．０、０．５から１．０、０．７から０．８、０．０５から０．５、または０．１から０．３モル当量の酸化剤と反応させる。特定の実施形態において、多糖を、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．６５、約０．７、約０．７５、約０．８、約０．８５、約０．９、または約０．９５モル当量の酸化剤と反応させる。さらなる実施形態において、多糖を、約０．１モル当量の酸化剤と反応させる。さらなる実施形態において、多糖を、約０．１５モル当量の酸化剤と反応させる。追加の実施形態において、多糖を、約０．２５モル当量の酸化剤と反応させる。また別の実施形態において、多糖を、約０．５モル当量の酸化剤と反応させる。代替的な実施形態において、多糖を、約０．６モル当量の酸化剤と反応させる。さらなる実施形態において、多糖を、約０．７モル当量の酸化剤と反応させる。
本発明の一態様において、酸化反応の持続時間は、約１時間から約５０時間の間、約１０時間から約３０時間の間、約１５時間から約２０時間の間、約１５時間から約１７時間の間、または約１６時間である。
本発明の別の態様において、酸化反応の温度は、約２℃から約２５℃の間、約２℃から約８℃の間、または約２０℃から約２５℃の間に維持される。１つの好ましい実施形態において、反応の温度は、約２３℃に維持される。別の好ましい実施形態において、反応の温度は、約５℃に維持される。
さらなる態様において、酸化反応は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびビス－トリスからなる群から選択される緩衝剤中で行われる。好ましい実施形態において、緩衝剤は、リン酸カリウムである。
追加の態様において、緩衝剤は、約１ｍＭから約５００ｍＭの間、約１ｍＭから約３００ｍＭの間、または約５０ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度を有する。好ましい実施形態において、緩衝剤は、約１００ｍＭの濃度を有する。
一態様において、酸化反応は、約４．０から約８．０の間、約５．０から約７．０の間、または約５．５から約６．５の間のｐＨで行われる。好ましい実施形態において、ｐＨは、約６．０である。
一実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５．０ｍｇ／ｍＬの単離された莢膜多糖を、約０．０５から約０．３モル当量の過ヨウ素酸塩と、約２０℃から２５℃の間の温度で反応させることによって取得される。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５．０ｍｇ／ｍＬの単離された莢膜多糖を、約０．０５から約０．３モル当量の過ヨウ素酸塩と、約２℃から約８℃の間の温度で反応させることによって取得される。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、当業者に公知の方法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析または限外濾過／血液透析濾過等に従って精製される。例えば、活性化莢膜多糖は、濃縮および限外濾過デバイスを使用する血液透析濾過によって精製される。
一実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖の酸化度は、５から２５の間、例えば、５から１５の間、５から１０の間、１０から２５の間、１０から２０の間、１０から１５の間等である。好ましい実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖の酸化度は、１０から２０の間、１１から１９の間、１２から１８の間、１３から１７の間、または１４から１６の間である。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間等の分子量を有する。好ましい実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する。
ある実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、場合により糖の存在下で、凍結乾燥される。好ましい実施形態において、糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態において、糖は、スクロースである。次いで、凍結乾燥された活性化莢膜多糖を、担体タンパク質を含む溶液と配合することができる。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、担体タンパク質と配合され、場合により糖の存在下で、凍結乾燥される。一態様において、糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態において、糖は、スクロースである。次いで、共凍結乾燥した多糖および担体タンパク質を、溶液に再懸濁し、還元剤と反応させることができる。
活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、
（ａ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｂ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含むプロセスによって、担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。
極性非プロトン性溶媒中における還元的アミノ化による活性化ＧＢＳ莢膜多糖のタンパク質担体とのコンジュゲーションは、例えば、未反応の（遊離）多糖のレベルが有意に上昇する水溶液中における還元的アミノ化と比較して、低レベルの遊離多糖を維持するために好適である。好ましい実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、極性非プロトン性溶媒中で行われる。
一実施形態において、ステップ（ａ）は、凍結乾燥したＧＢＳ莢膜多糖を、担体タンパク質および極性非プロトン性溶媒を含む溶液に溶解することを含む。別の実施形態において、ステップ（ａ）は、共凍結乾燥したＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、極性非プロトン性溶媒に溶解することを含む。
一実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯである。
ステップ（ａ）および（ｂ）が水溶液中で行われる場合、ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくは、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ビス－トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される、約６．０から約８．５の間、約７．０から約８．０の間、または約７．０から約７．５の間のｐＨの水性媒体中の緩衝剤中で行われる。好ましい実施形態において、緩衝剤は、ＰＢＳである。好ましい実施形態において、ｐＨは、約７．３である。
一実施形態において、ステップ（ｂ）における活性化ＧＢＳ莢膜多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間、約０．５ｍｇ／ｍＬから約５．０ｍｇ／ｍＬの間、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約２．０ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）における活性化血清型ＧＢＳ莢膜多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．７ｍｇ／ｍＬ、約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．９ｍｇ／ｍＬ、約２．０ｍｇ／ｍＬ、約２．１ｍｇ／ｍＬ、約２．２ｍｇ／ｍＬ、約２．３ｍｇ／ｍＬ、約２．４ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約２．６ｍｇ／ｍＬ、約２．７ｍｇ／ｍＬ、約２．８ｍｇ／ｍＬ、約２．９ｍｇ／ｍＬ、または約３．０ｍｇ／ｍＬである。
好ましい実施形態において、活性化血清型ＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の初期比（重量／重量）は、５：１から０．１：１、２：１から０．１：１、２：１から１：１、１．５：１から１：１、０．１：１から１：１、０．３：１から１：１、０．６：１から１：１の間である。好ましい実施形態において、活性化血清型ＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の初期比は、約０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１である。
ある実施形態において、還元剤は、ブレンステッドもしくはルイス酸、アミンボラン、例えば、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）等の存在下、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは亜鉛である。好ましい実施形態において、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
別の実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される還元剤の分量は、約０．１から約１０．０モル当量の間、約０．５から約５．０モル当量の間、または約１．０から約２．０モル当量の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される還元剤の分量は、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０モル当量である。
好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）の持続時間は、１時間から６０時間の間、１０時間から５０時間の間、４０時間から５０時間の間、または４２時間から４６時間の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）の持続時間は、約４４時間である。
さらなる実施形態において、ステップ（ｂ）における反応の温度は、１０℃から４０℃の間、１５℃から３０℃の間、または２０℃から２６℃の間に維持される。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）における反応の温度は、約２３℃に維持される。
追加の実施形態において、担体タンパク質と共有結合しているＧＢＳ莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートの調製のためのプロセスは、水素化ホウ素の添加により、未反応のアルデヒドをキャップする（クエンチする）ステップ（ステップ（ｃ））をさらに含む。
一実施形態において、キャッピング試薬は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素テトラブチルアンモニウム、水素化ホウ素カルシウムおよび水素化ホウ素マグネシウムからなる群から選択される水素化ホウ素である。好ましい実施形態において、キャッピング試薬は、水素化ホウ素ナトリウムである。
また別の実施形態において、ステップ（ｃ）において使用される水素化ホウ素の分量は、約０．１から約１０．０モル当量の間、約０．５から約５．０モル当量の間、または約１．０から３．０モル当量の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）において使用される水素化ホウ素の分量は、約２．０モル当量である。
１つの好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）において使用される水素化ホウ素は、約２．０モル当量の濃度のＮａＢＨ４である。
一実施形態において、ステップ（ｃ）の持続時間は、０．１時間から１０時間の間、０．５時間から５時間の間、２から４時間の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）の持続時間は、約３時間である。
別の実施形態において、ステップ（ｃ）における反応の温度は、約１５℃から約４５℃の間、約１５℃から約３０℃の間、または約２０℃から約２６℃の間に維持される。好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）における反応の温度は、約２３℃に維持される。
ＧＢＳ莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーションおよびキャッピング後、多糖－タンパク質コンジュゲートは、当業者に公知である様々な技術によって精製され得る（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関しては富化される）。これらの技術は、透析、濃縮／血液透析濾過作業、タンジェント流濾過、沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）および深層濾過を包含する。
さらなる実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離ＧＢＳ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して約５％未満の未反応の遊離糖を含む。
好ましい実施形態において、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲートは、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、例えば、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間または約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間等の分子量を有する。
また別の実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）は、約０．５から約３．０の間である。一態様において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．５から約２．０の間、約０．５から約１．５の間、約０．５から約１．０の間、約１．０から約１．５の間、または約１．０から約２．０の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．８から約１．０の間である。
別の実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から１５の間、２から１３の間、２から１０の間、２から８の間、２から６の間、２から５の間、２から４の間、３から１５の間、３から１３の間、３から１０の間、３から８の間、３から６の間、３から５の間、３から４の間、５から１５の間、５から１０の間、８から１５の間、８から１２の間、１０から１５の間、または１０から１２の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から５の間である。
本発明の一態様において、ＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、上述した還元的アミノ化方法によって取得される。例えば、一態様において、本開示は、
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、
（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、場合により
（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により未反応のアルデヒドをキャップするステップと
を含む方法によって生成されるまたは取得可能な、担体タンパク質とコンジュゲートしている多糖を含むＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。
好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）および（ｄ）は、ＤＭＳＯ中で行われる。
本発明の別の態様において、本発明のＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、活性化／酸化ステップにおいて２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を共酸化剤として用いたことを除き、上述した通りの還元的アミノ化を使用して調製される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９７０９９号を参照されたい。そのような実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖由来のグリココンジュゲートは、実施例７および国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９７０９９号において記述されているように、共酸化剤としてＮＣＳを使用して糖の第一級アルコールをアルデヒドに酸化させる（以後、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化」）ためにＴＥＭＰＯフリーラジカルを使用して調製される。したがって、一態様において、ＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲートは、ａ）ＧＢＳ莢膜多糖を、溶媒中でＴＥＭＰＯおよびＮＣＳと反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップ（以後、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化」）とを含む方法によって取得可能である。一実施形態において、溶媒は、水性溶媒またはＤＭＳＯであってもよい。
一態様において、ＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、前記方法によって取得される。例えば、一態様において、本開示は、ａ）糖を、溶媒中で２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法によって生成されるまたは取得可能な、担体タンパク質とコンジュゲートしている多糖を含むＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。一実施形態において、溶媒は、水性溶媒またはＤＭＳＯであってもよい。
免疫原性組成物
個々のコンジュゲートを精製した後、これらを組み合わせて、例えばワクチンにおいて使用され得る本発明の免疫原性組成物を製剤化することができる。本発明の免疫原性組成物の製剤化は、当技術分野において認められている方法を使用して遂行することができる。
免疫原性組成物に対する「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する分子（例えば、タンパク質または多糖等の抗原）に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の対象における発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体媒介性免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物中に存在する抗原に対する親和性を持つ抗体の産生を伴い、一方、「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔ－リンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子と会合している抗原エピトープの提示によって導出される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球細胞（ＣＴＬ）を活性化させる。ＣＴＬは、ＭＨＣまたはＣＤ１によってコードされ、細胞の表面上に発現されるタンパク質と会合して提示されているペプチドまたは脂質抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染している細胞の溶菌を、誘発し促進するのを助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激し、それらの表面上の古典的なまたは非古典的なＭＨＣ分子と会合しているペプチド抗原を表示している細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に集中するのを助けるように作用する。「細胞媒介性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを包含する他の白血球によって生成された他のそのような分子の生成も指す。細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、若干数のアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイによって、感作された対象における抗原に対して特異的なＴ－リンパ球についてアッセイすることによって、または抗原による再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン生成の測定によって等、決定され得る。そのようなアッセイは、当技術分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１（８）：４１８９～４１９９（１９９３）；Ｄｏｅ，Ｂ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１０）：２３６９～２３７６（１９９４）を参照されたい。
「免疫原性」という用語は、体液性もしくは細胞媒介性のいずれかまたは両方の免疫応答を導出する抗原またはワクチンの能力を指す。
「免疫原性量」または「免疫学的有効量」または「用量」は、それらのそれぞれが本明細書において交換可能に使用され、概して、当業者に公知の標準的なアッセイによって測定される通りの、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞または抗体）応答のいずれかまたは両方の免疫応答を導出するのに十分な、抗原または免疫原性組成物の量を指す。
「免疫干渉」または「有意な免疫干渉」は、本明細書において使用される場合、一価ワクチンで投与される場合の同じ抗原に対する免疫応答と比較した、多価または多成分ワクチンにおける個々の抗原に対する免疫応答の統計的に有意な減少を指す。
「保護的」免疫応答は、対象を感染から保護するために役立つ、体液性または細胞媒介性いずれかの免疫応答を導出する免疫原性組成物の能力を指す。提供される保護は絶対的である必要はない、すなわち、対象の対照集団、例えば、ワクチンも免疫原性組成物も投与されていない感染動物と比較して統計的に有意な改善があるならば、感染を完全に予防するまたは根絶する必要はない。保護は、感染の症状の発症の重症度または速さを緩和することに限定され得る。免疫応答が「保護的免疫応答」を示すものであるか否かを決定するためのいくつかのアッセイが、当技術分野において公知である。例えば、抗体レベルの増大は、さらに後述する全細胞ＥＬＩＳＡアッセイ等の結合アッセイによって測定され得る。他のアッセイは、後述する通りのオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）で試験することができる、細菌死滅の容易化等の機能的抗体応答を測定することを包含する。特定の状況において、「保護的免疫応答」は、対象の少なくとも５０％において、特定の抗原に対して特異的な、抗体レベルの２倍の増大または抗体レベルの４倍の増大の誘発を包含し得る。別の状況において、「保護的免疫応答」は、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の細菌カウントにおける減少を包含し得る。
組成物中における特定のコンジュゲートの量は、概して、そのコンジュゲートについて、コンジュゲートしているおよびコンジュゲートしていない全多糖に基づいて算出される。例えば、２０％の遊離多糖を持つＧＢＳ莢膜多糖コンジュゲートは、１００ｍｃｇ／ｍｌのＧＢＳ莢膜多糖用量中に、約８０ｍｃｇ／ｍｌのコンジュゲートしているＧＢＳ莢膜多糖および約２０ｍｃｇ／ｍｌのコンジュゲートしていないＧＢＳ莢膜多糖を有すると予想される。コンジュゲートへのタンパク質担体の寄与は、通常、コンジュゲートの用量を算出する際には考慮されない。コンジュゲートの量は、レンサ球菌の血清型に応じて変動し得る。概して、各用量は、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｃｇ／ｍｌ、特に約１ｍｃｇ／ｍｌから約７０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌの各多糖を含むことになる。免疫原性組成物中における異なる多糖成分の「免疫原性量」は、相違していてよく、それぞれが、約０．０１ｍｃｇ／ｍｌ、約０．１ｍｃｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｃｇ／ｍｌ、約０．５ｍｃｇ／ｍｌ、約１ｍｃｇ／ｍｌ、約２ｍｃｇ／ｍｌ、約３ｍｃｇ／ｍｌ、約４ｍｃｇ／ｍｌ、約５ｍｃｇ／ｍｌ、約６ｍｃｇ／ｍｌ、約７ｍｃｇ／ｍｌ、約８ｍｃｇ／ｍｌ、約９ｍｃｇ／ｍｌ、約１０ｍｃｇ／ｍｌ、約１５ｍｃｇ／ｍｌ、約２０ｍｃｇ／ｍｌ、約２５ｍｃｇ／ｍｌ、約３０ｍｃｇ／ｍｌ、約４０ｍｃｇ／ｍｌ、約５０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌ、約７０ｍｃｇ／ｍｌ、約８０ｍｃｇ／ｍｌ、約９０ｍｃｇ／ｍｌ、または約１００ｍｃｇ／ｍｌの任意の特定の多糖抗原を含み得る。多価免疫原性組成物の用量または免疫原性量は、別段の指示がない限り、各多糖の用量を示すと予想される。例えば、１０ｍｃｇ／ｍｌ用量の六価免疫原性組成物は、６０ｍｃｇ／ｍｌの総抗原またはコンジュゲート用量に対し、１０ｍｃｇ／ｍｌの６つのそれぞれの多糖を含有すると予想される。
本発明の一態様において、総コンジュゲート用量は、少なくとも約６０ｍｃｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１２０ｍｃｇ／ｍｌまたは少なくとも約２４０ｍｃｇ／ｌ等である。一実施形態において、総コンジュゲート用量は、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約６００ｍｃｇ／ｍｌ、例えば、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約５４０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約４８０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約４２０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３００ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約２４０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約１８０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約１２０ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約６００ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約５４０ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約４８０ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約４２０ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約３００ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約２４０ｍｃｇ／ｍｌ、約１２０ｍｃｇ／ｍｌから約１８０ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約６００ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約５４０ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約４８０ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約４２０ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約３００ｍｃｇ／ｍｌ、約１８０ｍｃｇ／ｍｌから約２４０ｍｃｇ／ｍｌ、約２４０ｍｃｇ／ｍｌから約６００ｍｃｇ／ｍｌ、約２４０ｍｃｇ／ｍｌから約５４０ｍｃｇ／ｍｌ、約２４０ｍｃｇ／ｍｌから約４８０ｍｃｇ／ｍｌ、約２４０ｍｃｇ／ｍｌから約４２０ｍｃｇ／ｍｌ、約２４０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌ、または約２４０ｍｃｇ／ｍｌから約３００ｍｃｇ／ｍｌ等である。好ましい実施形態において、総コンジュゲート用量は、約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約１２０ｍｇ／ｍｌから約２４０ｍｃｇ／ｍｌである。
免疫原としての抗原の有効性は、イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、機能的抗体アッセイ、例えば、インビトロオプソニンアッセイ等、および当技術分野において公知である多くの他のアッセイを使用して、血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することにより、Ｂ細胞活性のレベルを測定することによって測定することができる。Ｔ細胞免疫原としての抗原の有効性の別の測定は、増殖アッセイによって、細胞溶菌アッセイ、例えば、その特異的標的細胞を溶菌するＴ細胞の能力を測定するためのクロム放出アッセイ等によってのいずれかで測定することができる。さらに、本発明において、「免疫原性量」は、抗原の投与後に誘発された抗原特異的抗体の血清中レベルを測定することによって、または、そのようにして誘発された抗体の、本明細書において記述されている通りの特定の白血球のオプソニン食作用能力を強化する能力を測定することによって、定義されてもよい。免疫応答の保護のレベルは、免疫化された宿主に、注射された抗原を接種することによって測定され得る。例えば、免疫応答が所望される抗原が細菌である場合、「免疫原性量」の抗原によって誘発される保護のレベルは、動物への細菌細胞の接種後の生存パーセントまたは死亡パーセントを検出することによって測定することができる。一実施形態において、保護の量は、細菌感染に関連する少なくとも１つの症状、例えば、感染に関連する発熱を測定することによって測定され得る。多抗原もしくは多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中における抗原のそれぞれの量は、他の成分のそれぞれに関して変動することになり、当業者に公知の方法によって決定することができる。そのような方法は、例えば、免疫原性および／またはインビボ効力を測定するための手順を包含すると予想される。
「免疫原性組成物」という用語は、抗原、例えば微生物、またはその成分を含有し、対象において免疫応答を導出するために使用することができる任意の医薬組成物に関する。本発明の免疫原性組成物は、全身経皮または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与することを利用して、ＧＢＳ感染の影響を受けやすいヒトを治療するために使用することができる。これらの投与は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮内（ｉ．ｄ．）もしくは皮下経路を介する注射、パッチもしくは他の経皮送達デバイスによる適用、または経口／消化、呼吸もしくは尿生殖路への粘膜投与を介するものを含有し得る。一実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンの製造において、または動物を受動的に保護するもしくは治療するために使用され得るポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の導出において使用され得る。
一態様において、本発明は、本明細書において記述されている通りの、有効量の少なくとも１つの多糖、オリゴ糖、多糖－タンパク質コンジュゲート、またはそれらの生物学的同等物を包含する免疫原性組成物に関する。例えば、一実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを包含し、莢膜多糖は、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択され、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。別の例において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを包含し、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも２つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。また別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも３つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも４つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ由来の莢膜多糖を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ由来の莢膜多糖を含む。また別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも５つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、６つの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の莢膜多糖を含む。
ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の２から１０までの異なる血清型を含む。したがって、ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、５価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。別の実施形態において、免疫原性組成物は、６価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。また別の実施形態において、免疫原性組成物は、７価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、８価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。
組成物中において６つ未満、５つ未満、または４つ未満のＧＢＳ抗原を使用するという先の教示（国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０８２５２７号および同第ＷＯ２００６／０８２５３０号を参照）および特に多価組成物中における血清型Ｖの使用に関する免疫干渉の経験（国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３５５１９号を参照）にもかかわらず、本発明は、多価組成物中における４つ以上のＧＢＳ抗原の使用または血清型Ｖの使用によるいかなる有意な免疫干渉も示さない。したがって、本発明は、少なくとも４つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、例えば、少なくとも５つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、少なくとも６つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、少なくとも７つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、少なくとも８つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、または少なくとも９つのＧＢＳ莢膜多糖血清型等を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物に関し、組成物は、有意な免疫干渉を有さない。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型Ｖを含む。
多糖－タンパク質コンジュゲートは、同じまたは異なるタンパク質担体を含み得る。一実施形態において、コンジュゲートは、同じタンパク質担体を含み、糖は、タンパク質担体の同じ分子（それとコンジュゲートしている２つ以上の異なる多糖を有する担体分子）とコンジュゲートしている［例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号を参照］。別の実施形態において、多糖は、タンパク質担体の異なる分子（それとコンジュゲートしている１種類の多糖のみを有するタンパク質担体の各分子）とそれぞれ独立してコンジュゲートしている。前記実施形態において、莢膜糖は、担体タンパク質と独立してコンジュゲートしていると言われている。
特定の免疫原性組成物に最適な量の成分は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって解明することができる。初回ワクチン接種の後、対象は、１回または数回のブースター免疫化を、適度に間隔をおいて受けることができる。
本発明の免疫原性組成物は、複数の莢膜多糖タンパク質コンジュゲートに加えて、１つまたは複数の保存剤をさらに含んでよい。ＦＤＡは、複数回用量（多回用量）バイアル中の生物学的製品が、わずかな例外を除いて、保存剤を含有することを求めている。本発明は、そのような多回用量バイアルの使用を企図している。保存剤を含有するワクチン製品は、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２－フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））およびフェノール（肺炎、腸チフス（非経口））を含有するワクチンを包含する。注射薬において使用することが承認された保存剤は、例えば、クロロブタノール、ｍクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノールおよび硝酸フェニル水銀を包含する。
別の態様において、本発明は、本明細書において記述されている任意の多糖のうちの少なくとも１つ、および薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、希釈剤もしくは担体、またはそれらの混合物を包含する組成物に関する。
免疫原性組成物は、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩から選択されるがこれらに限定されない１つまたは複数の生理学的に許容できる緩衝剤を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、緩衝剤は、ヒスチジンまたはリン酸塩である。
一実施形態において、免疫原性組成物は、緩衝剤を、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約５ｍＭから約４０ｍＭ、約５ｍＭから約３０ｍＭ、約５ｍＭから約２０ｍＭ、約５ｍＭから約１０ｍＭ、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約４０ｍＭ、約１０ｍＭから約３５ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約２５ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、約１０ｍＭから約１５ｍＭ、約１５ｍＭから約５０ｍＭ、約１５ｍＭから約４０ｍＭ、約１５ｍＭから約３５ｍＭ、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約１５ｍＭから約２５ｍＭ、または約１５ｍＭから約２０ｍＭまでの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、緩衝剤を、約１０ｍＭから約２５ｍＭ、例えば、約１５ｍＭから約２５ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度で含む。
１つの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ヒスチジンを、約２０ｍＭの濃度で含む。別の好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、リン酸塩を、約２０ｍＭの濃度で含む。
ある特定の実施形態において、製剤は、約５．０から約７．５、例えば、５．３から約７．５、約５．５から約７．５、約６．０から約７．５、約６．５から約７．５、約５．３から約７．１、約５．５から約７．０、約６．０から約７．０、約６．０から約６．５、約６．３から約７．０、または約６．５から約７．０等のｐＨ範囲内に緩衝されている。別の実施形態において、製剤は、約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５のｐＨに緩衝されている。好ましい実施形態において、製剤は、約６．０から約７．５までのｐＨ範囲、例えば、約６．５から約７．５等、最も好ましくは約６．５または約７．０に緩衝されている。
免疫原性組成物は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０（ツイーン８０）、ポリソルベート－６０（ツイーン６０）、ポリソルベート－４０（ツイーン４０）、ポリソルベート－２０（ツイーン２０）を包含するがこれらに限定されない１つまたは複数の非イオン性界面活性剤、および、ＢＲＩＪ５８、ＢＲＩＪ３５を包含するがこれらに限定されないポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびにその他、例えば、トリトンＸ－１００、トリトンＸ－１１４、ＮＰ４０、スパン８５およびプルロニックシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック１２１）等を含んでいてもよい。一実施形態において、免疫原性組成物は、ポリソルベート－８０またはポリソルベート－４０、好ましくはポリソルベート－８０（ＰＳ８０）を含む。
一実施形態において、免疫原性組成物は、界面活性剤を、約０．００１％から約２％（ｖ／ｗ）、約０．００１％から約１％、約０．００１％から約０．５％、約０．００１％から約０．１％、約０．００１％から約０．０５％、約０．００１％から約０．０１％、約０．００１％から０．００５％、約０．００５％から約２％、約０．００５％から約１％、約０．００５％から約０．５％、約０．００５％から約０．１％、約０．００５％から約０．０５％、約０．００５％から約０．０１％、約０．０１％から約２％、約０．０１％から約１％、約０．０１％から約０．５％、約０．０１％から約０．１％、約０．０１％から約０．０５％、約０．０１％から約０．０４％、約０．０１％から約０．０３％、約０．０１５％から約２％、約０．０１５％から約１％、約０．０１５％から約０．５％、約０．０１５％から約０．１％、約０．０１５％から約０．０５％、約０．０１５％から約０．０４％、約０．０１５％から約０．０３％、約０．０２％から約２％、約０．０２％から約１％、約０．０２％から約０．５％、約０．０２％から約０．１％、約０．０２％から約０．０５％、約０．０２％から約０．０４％、約０．０２％から約０．０３％、約０．０５％から約２％、約０．０５％から約１％、約０．０５％から約０．５％、約０．０５％から約０．１％、約０．１％から約２％、約０．１％から約１％、約０．１％から約０．５％または約０．１％から０．２５％までの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、界面活性剤を、約０．０１％から０．０３％、最も好ましくは約０．０２％の濃度で含む。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、約０．００１％から約２％まで（最大約０．２５％が好ましい）の濃度のポリソルベート－８０または約０．００１％から１％まで（最大約０．５％が好ましい）の濃度のポリソルベート－４０を含む。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ＰＳ８０を、約０．０２％の濃度で含む。
薬学的に許容できる担体は、本発明の炭水化物をタンパク質に結合する際に使用され、その炭水化物に対する免疫応答を修飾する「担体タンパク質」と混同されるべきではない。本明細書において記述されているタンパク質担体との混同を回避するために、薬学的に許容できる希釈剤という用語を、薬学的に許容できる担体よりも好ましいとするが、これらの用語は、時折、交換可能に使用され得る。「薬学的に許容できる担体」という用語は、連邦規制機関、州政府もしくは他の規制機関によって承認されている、または、米国薬局方もしくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する動物において使用するための他の一般に認められている薬局方に収載された担体を意味する。「担体」という用語は、医薬組成物がともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。好適な薬学的に許容できる希釈剤は、ありとあらゆる従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を包含する。そのような薬学的に許容できる希釈剤は、滅菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを包含する油等であってよい。水、注射用水（ＷＦＩ）、滅菌等張生理食塩水、リン酸緩衝溶液、アジュバント懸濁液、水性デキストロースおよびグリセロール溶液、ならびにそれらの組合せを、特に注射用溶液用の液体担体として用いることができる。薬学的に許容できる希釈剤は、体内における貯蔵寿命または有効性を強化する、少量の補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤等をさらに含んでよい。薬学的に許容できる希釈剤の調製および使用は、当技術分野において周知である。好適な医薬担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著において記述されている。一実施形態において、希釈剤は、水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水である。特定の実施形態において、希釈剤は、本明細書において記述されている任意のアジュバントの懸濁液である。好ましい実施形態において、希釈剤は、リン酸アルミニウム懸濁液等のアルミニウムベースのアジュバント懸濁液である。
好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を包含する。好ましい実施形態において、賦形剤は、ＮａＣｌである。
一実施形態において、免疫原性組成物は、賦形剤を、約１０ｍＭから約５００ｍＭ、約１０ｍＭから約４５０ｍＭ、約１０ｍＭから約４００ｍＭ、約１０ｍＭから約３５０ｍＭ、約１０ｍＭから約３００ｍＭ、約１０ｍＭから約２５０ｍＭ、約１０ｍＭから約２００ｍＭ、約１０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、２０ｍＭから約５００ｍＭ、約２０ｍＭから約４５０ｍＭ、約２０ｍＭから約４００ｍＭ、約２０ｍＭから約３５０ｍＭ、約２０ｍＭから約３００ｍＭ、約２０ｍＭから約２５０ｍＭ、約２０ｍＭから約２００ｍＭ、約２０ｍＭから約１５０ｍＭ、約２０ｍＭから約１００ｍＭ、約２０ｍＭから約５０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、５０ｍＭから約５００ｍＭ、約５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約５０ｍＭから約４００ｍＭ、約５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約５０ｍＭから約３００ｍＭ、約５０ｍＭから約２５０ｍＭ、約５０ｍＭから約２００ｍＭ、約５０ｍＭから約１５０ｍＭ、約５０ｍＭから約１００ｍＭ、約１００ｍＭから約５００ｍＭ、約１００ｍＭから約４５０ｍＭ、約１００ｍＭから約４００ｍＭ、約１００ｍＭから約３５０ｍＭ、約１００ｍＭから約３００ｍＭ、約１００ｍＭから約２５０ｍＭ、約１００ｍＭから約２００ｍＭ、約１００ｍＭから約１５０ｍＭ、約１２０ｍＭから約４７０ｍＭ、約１２０ｍＭから約４２０ｍＭ、約１２０ｍＭから約３７０ｍＭ、約１２０ｍＭから約３２０ｍＭ、約１２０ｍＭから約２７０ｍＭ、約１２０ｍＭから約２２０ｍＭ、約１２０ｍＭから約１７０ｍＭ、約１５０ｍＭから約５００ｍＭ、約１５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約４００ｍＭ、約１５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約３００ｍＭ、約１５０ｍＭから約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約２００ｍＭ、約２００ｍＭから約５００ｍＭ、約２００ｍＭから約４５０ｍＭ、約２００ｍＭから約４００ｍＭ、約２００ｍＭから約３５０ｍＭ、約２００ｍＭから約３００ｍＭ、約２００ｍＭから約２５０ｍＭ、約２２５ｍＭから約４６５ｍＭ、約２２５ｍＭから約４２５ｍＭ、約２２５ｍＭから約３６５ｍＭ、約２２５ｍＭから約３２５ｍＭ、約２２５ｍＭから約２６５ｍＭ、約２５０ｍＭから約５００ｍＭ、約２５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約２５０ｍＭから約４００ｍＭ、約２５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約２５０ｍＭから約３００ｍＭ、約３００ｍＭから約５００ｍＭ、約３００ｍＭから約４５０ｍＭ、約３００ｍＭから約４００ｍＭ、約３００ｍＭから約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭから約５００ｍＭ、約３５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約３５０ｍＭから約４００ｍＭ、約４００ｍＭから約５００ｍＭ、約４００ｍＭから約４５０ｍＭまたは約４５０ｍＭから約５００ｍＭまでの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、賦形剤を、約１０ｍＭから約３５０ｍＭ、例えば、約１３０ｍＭから約１７０ｍＭ、約２２５ｍＭから約２６５ｍＭまで、最も好ましくは約１５０ｍＭまたは約２４５ｍＭの濃度で含む。
１つの好ましい実施形態において、賦形剤は、約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌである。別の好ましい実施形態において、賦形剤は、約２４５ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
組成物は、所望ならば、少量の湿潤、増量、乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、凍結乾燥粉末またはケーキ等の形態をとることができる。製剤は、投与モードに適合すべきである。任意の従来の媒体または作用物質が有効成分と不適合である場合を除いて、本発明の免疫原性組成物におけるそれらの使用が企図されている。
ある実施形態において、免疫原性組成物は、場合により少なくとも１つの賦形剤の存在下で、凍結乾燥される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、スクロース、マンニトールおよびグリシンからなる群から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、スクロースである。別の実施形態において、凍結乾燥した組成物は、追加の賦形剤を含む。１つのそのような実施形態において、追加の賦形剤は、マンニトールまたはグリシンである。
別の実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、約１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０．０％等の少なくとも１つの糖を含む。好ましい実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約５．５％（ｗ／ｖ）超、例えば、約７．０％（ｗ／ｖ）超等の少なくとも１つの賦形剤を含む。さらなる実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、約１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０．０％等の追加の賦形剤を含む。好ましい実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の少なくとも１つの賦形剤および約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の追加の賦形剤を含む。
また別の実施形態において、凍結乾燥した組成物は、水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水で再溶解される。好ましい実施形態において、希釈剤は、リン酸アルミニウム懸濁液等のアルミニウムベースのアジュバント懸濁液である。
一実施形態において、組成物は、本明細書において記述されている単離された多糖および担体分子を包含する。好適な担体分子は、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴またはリポソーム等）および不活性ウイルス粒子を包含し得る。粒子状担体の例は、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもの、ならびに、ポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）に由来する微粒子を包含する。
本発明の免疫原性組成物は、免疫系を混乱させるまたは改変する作用物質である、１つまたは複数の追加の「免疫調節剤」をさらに含むことができ、そのため、体液性および／または細胞媒介性免疫の上方調節または下方調節のいずれかが観察される。１つの特定の実施形態において、免疫系の体液性および／または細胞媒介性アームの上方調節が好ましい。ある特定の免疫調節剤の例は、例えば、中でも、米国特許第５，２５４，３３９号において記述されている、アジュバントもしくはサイトカイン、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を包含する。「アジュバント」という用語は、本明細書においてさらに記述されている通り、抗原に対する免疫応答を強化する化合物または混合物を指す。
本発明の組成物において使用することができるアジュバントの非限定的な例は、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウムゲル等；油中水型エマルション、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント等；ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）；ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）；ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａまたは他のサポニン画分；モノホスホリル脂質Ａ；およびアブリジン脂質－アミンアジュバントを包含する。本発明のワクチンにおいてアジュバントとして有用な水中油型エマルションの非限定的な例は、ＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）等のマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．５％スパン８５（種々の量のＭＴＰ－ＰＥを含有していてもよい）を含有する）、およびＳＡＦ（サブミクロンエマルションに微小流動化したか、より大きい粒径のエマルションを産生するためにボルテックスしたかいずれかの、１０％スクアレン、０．４％ポリソルベート８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有する）；修飾されたＳＥＡＭ６２（５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性物質（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０界面活性物質（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００ｍｃｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００ｍｃｇ／ｍｌのコレステロールおよび０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する）；ならびに修飾されたＳＥＡＭ １／２（５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性物質、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０界面活性物質、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００ｍｃｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａおよび５０ｍｃｇ／ｍｌのコレステロールを含有する）を包含する。
免疫応答を強化するために使用される好適なアジュバントは、限定されないが、米国特許第４，９１２，０９４号において記述されている、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）をさらに包含する。アジュバントとして使用するために、Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号において記述されている、合成脂質Ａ類似体もしくはアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくは類似体も好適である。１つのそのようなＡＧＰは、２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル（ｔｅｔｒａ－ｄｅｃａｎｏｙｏｘｙ－ｔｅｔｒａｄｅ－ｃａｎｏｙｌ）］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル－アミノ］－ｂ－Ｄ－グルコピラノシドであり、これは、５２９としても公知である（以前はＲＣ５２９として公知であった）。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）としてまたは安定なエマルション（ＳＥ）として製剤化される。
また他のアジュバントは、シクロデキストリン誘導体（米国特許第６，１６５，９９５号）；ポリアニオン性ポリマー（米国特許第６，６１０，３１０号）；ムラミルペプチド、例えば、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）およびＮ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）等；Ａｍｐｈｉｇｅｎ；アブリジン；Ｌ１２１／スクアレン；Ｄ－ラクチド－ポリラクチド／グリコシド；プルロニックポリオール；死滅ボルデテラ属；サポニン、例えば、米国特許第５，０５７，５４０号において記述されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ．）等；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；細菌リポ多糖；合成ポリヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号）等；欧州特許第１，２９６，７１３号および同第１，３２６，６３４号において記述されているＩＣ－３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）；百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（例えば、米国特許第７，２８５，２８１号、同第７，３３２，１７４号、同第７，３６１，３５５号および同第７，３８４，６４０号）；または、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特にＬＴ－Ｋ６３、ＬＴ－Ｒ７２（例えば、米国特許第６，１４９，９１９号、同第７，１１５，７３０号および同第７，２９１，５８８号）を包含する。
ワクチンに包含され得る他の「免疫調節剤」は、例えば、インターロイキン１－α、１－β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその突然変異体型）；インターフェロン－α、βおよびγ；顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００を参照）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；または腫瘍壊死因子αおよびβのうちの１つまたは複数を包含する。本明細書において記述されている免疫原性組成物で有用なまた他のアジュバントは、限定されないが、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βおよびＲＡＮＴＥＳを包含するケモカイン；接着分子、例えば、セレクチン、例えば、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチンおよびＥ－セレクチン等；ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１およびＭａｄＣＡＭ－１；インテグリンファミリーのメンバー、例えば、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１およびｐ１５０．９５等；免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭｓ、例えば、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２およびＩＣＡＭ－３、ＣＤ２ならびにＬＦＡ－３等；共刺激分子、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ等；血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ－１および血管内皮成長因子を包含する成長因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を包含する受容体分子；ならびにカスパーゼ（ＩＣＥ）を包含する。
免疫調節剤および／もしくはアジュバントを使用するか否かの決断、またはいずれの免疫調節剤および／もしくはアジュバントを使用するかの選択は、ワクチンまたは免疫原性組成物が投与される対象、注射経路、および与えられる予定の注射の数によって決まると予想されることを理解されたい。例えば、対象が病原体に自然に曝露されてきた場合、ワクチン抗原が記憶応答を有効に誘発することができるため、アジュバントは必要とされない場合がある。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントを包含することになる。一実施形態において、免疫原性組成物は、アルミニウムベースのアジュバントを含む。１つのそのような実施形態において、アルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムヒドロキシルホスフェートである。特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。本発明の別の実施形態において、免疫原性組成物は、ＱＳ－２１をアジュバントとして含む。
一実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントを、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．７ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．３ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．８５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．６５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．７ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．６５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから約０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、および０．７５ｍｇ／ｍｌから約０．８５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントを、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。
好ましい実施形態において、アジュバントは、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のアルミニウムベースのものである。１つのそのような実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムヒドロキシルホスフェートである。別の実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムである。
アルミニウムベースのアジュバントを含む免疫原性組成物は、時間の関数として相分離する傾向があり、アルミニウム粒子は、貯蔵中に沈殿物が沈降するにつれて液体から分離するであろうことに留意すべきである。投与成功を確実にするために、免疫原性組成物は、視覚的に均一でなくてはならず、投与前に再懸濁されなくてはならない。したがって、組成物は、均一に再懸濁しやすいことが重要である。本発明の一態様において、免疫原性組成物は、約５０回以下の振とう、例えば、約４０回以下の振とう、約３０回以下の振とう、約２５回以下の振とう、約２０回以下の振とう、約１５回以下の振とう、約１０回以下の振とう、または約５回以下の振とう等で再懸濁される。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１０回以下の振とうで再懸濁される。本発明の別の態様において、免疫原性組成物は、約１から約５０回の振とう、例えば、約１から約４０回の振とう、約１から約３０回の振とう、約１から約２５回の振とう、約１から約２０回の振とう、約１から約１５回の振とう、約１から約１０回の振とう、または約１から約５回の振とう等で再懸濁される。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１から約１０回の振とうで再懸濁される。
本発明の一態様において、免疫原性組成物は、容器に充填される。一実施形態において、容器は、バイアル、フラスコ、バッグおよびシリンジからなる群から選択される。一実施形態において、容器は、ガラス、金属（鋼、ステンレス鋼およびアルミニウム等）、およびポリマー（熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性エラストマー等）製である。一実施形態において、容器は、シリコン処理されている。好ましい実施形態において、容器は、シリンジ、最も好ましくはガラスシリンジである。
１つの特定の実施形態において、免疫原性組成物は、約１ｍｍから約１５ｍｍ、例えば、約１ｍｍから約１１ｍｍ、約１ｍｍから約１０ｍｍ、約１ｍｍから約９ｍｍ、約１ｍｍから約８ｍｍ、約１ｍｍから約７ｍｍ、約１ｍｍから約６ｍｍ、約１ｍｍから約５ｍｍ、約１ｍｍから約４ｍｍ、約１ｍｍから約３ｍｍ、約２ｍｍから約１５ｍｍ、約２ｍｍから約１１ｍｍ、約２ｍｍから約１０ｍｍ、約２ｍｍから約９ｍｍ、約２ｍｍから約８ｍｍ、約２ｍｍから約７ｍｍ、約２ｍｍから約６ｍｍ、約２ｍｍから約５ｍｍ、約２ｍｍから約４ｍｍ、約３ｍｍから約１５ｍｍ、約３ｍｍから約１１ｍｍ、約３ｍｍから約１０ｍｍ、約３ｍｍから約９ｍｍ、約３ｍｍから約８ｍｍ、約３ｍｍから約７ｍｍ、約３ｍｍから約６ｍｍ、約３ｍｍから約５ｍｍ、約４ｍｍから約１５ｍｍ、約４ｍｍから約１１ｍｍ、約４ｍｍから約１０ｍｍ、約４ｍｍから約９ｍｍ、約４ｍｍから約８ｍｍ、約４ｍｍから約７ｍｍ、約４ｍｍから約６ｍｍ、約５ｍｍから約１５ｍｍ、約５ｍｍから約１１ｍｍ、約５ｍｍから約１０ｍｍ、約５ｍｍから約９ｍｍ、約５ｍｍから約８ｍｍ、または約５ｍｍから約７ｍｍ等のヘッドスペースを設けてシリンジに充填される。好ましい実施形態において、ヘッドスペースは、約２ｍｍから約６ｍｍ、最も好ましくは約４ｍｍである。
一実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７．５のｐＨに緩衝されている。
１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７．５のｐＨに緩衝されており、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
一実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている。
１つの特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されており、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含み、ここで、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、リン酸塩、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、およびリン酸アルミニウム含み、ここで、組成物は、約６．０から約７．５のｐＨに緩衝されている。
追加の実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、リン酸塩、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、およびリン酸アルミニウムを含み、ここで、組成物は、約６．０から約７．５のｐＨに緩衝されており、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、約１０ｍＭから約２５ｍＭのリン酸塩、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約３５０ｍＭの塩化ナトリウム、および約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含み、ここで、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７．５のｐＨに緩衝されており、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＶならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
１つの特定の実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されており、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＶならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌずつの少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＶならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、リン酸塩、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、およびリン酸アルミニウムを含み、組成物は、約６．０から約７．５のｐＨに緩衝されており、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＶならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
１つの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌずつの少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、約１０ｍＭから約２５ｍＭのリン酸塩、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約３５０ｍＭの塩化ナトリウム、および約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含み、ここで、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＶならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
免疫原性組成物の評価
種々のインビトロ試験を使用して、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を評定する。例えば、インビトロオプソニンアッセイは、レンサ球菌細胞、問題の抗原に対する特異的抗体を含有する熱不活性化血清、および外因性補体源の混合物を一緒にインキュベートすることによって行われる。オプソニン食作用は、新たに単離された多形核細胞（ＰＭＮ）またはＨＬ６０等の分化したエフェクター細胞および抗体／補体／レンサ球菌細胞混合物のインキュベーション中に進行する。抗体および補体でコーティングされた細菌細胞は、オプソニン食作用時に死滅する。オプソニン食作用から回収される生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物を平板培養することによって決定される。力価は、アッセイ対照との比較によって決定された際に、５０％細菌死滅を与える最高希釈の逆数として報告される。
全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗原のインビトロ免疫原性および表面露出を評定してもよく、目的の細菌株（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））を、９６ウェルプレート等のプレート上にコーティングし、免疫化された動物由来の試験血清を、細菌細胞と反応させる。試験抗原に特異的な抗体が抗原の表面露出エピトープと反応性であれば、当業者に公知の標準的な方法によって検出することができる。代替として、フローサイトメトリーを使用して、莢膜多糖抗原の表面露出およびモノクローナル抗体を包含する抗体の特異性を測定してもよい。
次いで、所望のインビトロ活性を実証している抗原を、インビボ動物接種モデルにおいて試験してもよい。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、当業者に公知である免疫化の方法および経路（例えば、鼻腔内、非経口、経口、経直腸、膣内、経皮、腹腔内、静脈内、皮下等）により、動物（例えば、マウス）の免疫化において使用される。ＧＢＳ免疫原性組成物による動物の免疫化の後、動物に、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株を接種し、レンサ球菌感染に対する抵抗についてアッセイする。
一実施形態において、病原体フリーのマウスを免疫化し、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を接種する。例えば、マウスを、免疫原性組成物中の１または複数回用量の所望の抗原で免疫化する。その後、マウスにＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を接種し、接種後、経時的に生存をモニターする。
使用方法
「免疫不全である」は、本明細書において使用される場合、免疫系の細胞性および／または体液性アームに関して欠損を患っている対象を指す。したがって、免疫プロセスにおけるわずかな機能障害から完全な免疫抑制まで変動する、免疫機能における欠損の程度が企図されている。
「対象」という用語は、哺乳動物、鳥、魚、爬虫類、または任意の他の動物を指す。「対象」という用語は、ヒトも包含する。「対象」という用語は、家庭用ペットも包含する。家庭用ペットの非限定的な例は、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメおよびカエルを包含する。「対象」という用語は、家畜動物も包含する。家畜動物の非限定的な例は、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウおよびシチメンチョウを包含する。
本明細書において使用される場合、「治療」（その変化形、例えば、「治療する」または「治療される」を包含する）は、下記のうちのいずれか１つまたは複数を指す：（ｉ）伝統的なワクチンのような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の重症度低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的なまたは完全な排除。それ故、治療は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）達成され得る。本発明において、予防的または治療的治療を使用することができる。本発明の特定の実施形態によれば、微生物感染（例えば、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）等の細菌）に対して宿主動物を、予防的にかつ／または治療的に免疫化することを包含し、治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は、予防的および／または治療的免疫を対象に付与するために有用である。本発明の方法は、生物医学研究用途のために対象において実施することもできる。
別の態様において、本発明は、対象に、有効量の本明細書において記述されている免疫原性組成物を投与することにより、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法に関する。一実施形態において、本発明は、対象に、有効量の本明細書において記述されている免疫原性組成物を投与することにより、対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法に関する。ある態様において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物に関する。ある態様において、本発明は、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物に関する。特定の実施形態において、対象は、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である。１つのそのような実施形態において、妊娠中の女性は、少なくとも妊娠２０週または少なくとも２７週等、妊娠後半期である。好ましい実施形態において、妊娠中の女性は、妊娠２７週から３６週である。別の実施形態において、対象は、５０歳以上、６５歳以上、および８５歳以上の成人等の老齢者である。さらなる実施形態において、対象は、免疫不全である。一態様において、対象は、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有し得る。好ましい実施形態において、Ｂ群レンサ球菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である。
一実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む。別の実施形態において、コンジュゲートは、ＧＢＳ血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも２つの追加の血清型を含む。追加の実施形態において、コンジュゲートは、ＧＢＳ血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも３つの追加の血清型を含む。また別の実施形態において、コンジュゲートは、ＧＢＳ血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも４つの追加の血清型を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含む。さらなる実施形態において、コンジュゲートは、ＧＢＳ血清型ＩＶならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも５つの追加の血清型を含む。さらなる実施形態において、組成物は、ＧＢＳ血清型Ｖを含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶを含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の６つの多糖－タンパク質コンジュゲートを含む。本発明の一態様は、免疫干渉を有さない免疫原性組成物に関する。
免疫原性組成物の免疫原性または有効量は、対象を漸増量の免疫原性組成物で免疫化し、免疫応答を分析して最適投薬量を決定する、用量応答研究を行うことにより、決定することができる。研究の出発点は、動物モデルにおける免疫化データから推測することができる。投薬量は、個体の具体的な条件に応じて変動し得る。量は、当業者に公知の手段により、日常的検査で決定することができる。
適切な用量数の、免疫学的有効量の免疫原性組成物を対象に投与して、免疫応答を導出する。投薬量は、年齢および体重等、個体の具体的な条件に応じて変動し得る。この量は、当業者に公知の手段により、日常的検査で決定することができる。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物が投与された患者は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）保菌率の低減を示す。免疫原性組成物の投与後の、そのような保菌の低減または非保菌者として過ごした時間間隔の延長は、医療ニーズの視点から有意である。例えば、保菌者におけるＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）保菌全体の低減は、本発明の免疫原性組成物の１回用量後に評定され得る。例えば、免疫原性組成物の投与１日前に、１８～５０歳の成人の群を、鼻、喉、腋窩、直腸、会陰および膣スワブによって保菌についてスクリーニングし、続いて、培養して、保菌状態を決定することができる。次に、その群に本発明の免疫原性組成物を投与し、ある群には対照を受けさせることができる。免疫原性組成物の投与後、鼻、喉、腋窩、直腸、会陰および膣スワブを１２週間にわたって毎週および最大６カ月間毎月実行し、プラシーボと比較する。１つのプライマリーエンドポイントは、免疫原性組成物の投与後の患者における保菌率を、免疫化後３カ月の間隔でプラシーボと比較することである。
抗体
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等と特異的結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、文脈上別段の指示がない限り、該用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、操作された抗体（例えば、エフェクター機能、安定性および他の生物学的活性を改変するために、キメラ、ヒト化および／または誘導体化されたもの）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ＳｃＦｖ）ならびにサメおよびラクダ抗体を包含するドメイン抗体）、および抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体）および本明細書において記述されている通りの抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置を網羅することも意図されている。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ等（またはそれらのサブクラス）の抗体を包含し、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられてよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部分のみを含み、該部分は、好ましくは、無傷の抗体中に存在する場合、その部分に通例関連する機能のうちの少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべてを保持している。
抗体の「機能的活性」または「機能的抗体」は、本明細書において使用される場合、最低でも抗原と特異的に結合することができる抗体を指す。追加の機能は当技術分野において公知であり、オプソニン化、ＡＤＣＣまたは補体媒介性細胞毒性を介するもの等、病原体のクリアランスまたは死滅を達成する免疫系の追加の成分を包含し得る。抗原結合後、その後のあらゆる抗体機能は、抗体のＦｃ領域を介して媒介され得る。抗体オプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）は、エフェクター細胞（白血球）による細菌のインビトロＩｇ補体補助死滅を測定するように設計されたインビトロアッセイであり、故に、生物学的プロセスを模倣している。抗体結合は、それが結合している抗原の生物学的機能を直接的に阻害する場合もある。一部の実施形態において、「機能的抗体」は、動物効力モデルにおける細菌の死滅または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン食作用死滅アッセイによって測定した場合に機能的である抗体を指す。
一態様において、本発明は、本明細書において記述されている多糖と特異的に結合する単離された抗体またはその断片に関する。「単離された」抗体は、本明細書において使用される場合、その自然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体を指す。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用に干渉し、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を包含し得る材料である。例示的な実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって決定された際に、９５重量％の抗体、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ－末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を取得するのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均質まで、精製されることになる。単離された抗体は、抗体の自然環境のうちの少なくとも１つの成分が存在しないと予想されることから、組換え細胞内にインサイチュで抗体を包含する。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
特定の多糖また特定の多糖上のエピトープ「と特異的に結合している」または「に特異的な」抗体は、いかなる他の多糖または多糖エピトープとも特異的に結合することなく、特定の多糖または特定の多糖上のエピトープと結合しているものである。
「標識」という語は、本明細書において使用される場合、「標識」抗体を産生するように抗体と直接的にまたは間接的にコンジュゲートしている、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であってもよいし（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学的改変を触媒していてもよい。
本発明は、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原と特異的にかつ選択的に結合している抗体および抗体組成物をさらに提供する。一部の実施形態において、抗体は、本発明の免疫原性組成物の対象への投与時に産生される。一部の実施形態において、本発明は、本発明の免疫原性組成物の抗原のうちの１つまたは複数に向けられた精製または単離された抗体を提供する。一部の実施形態において、本発明の抗体は、いずれかの動物効力モデルにおいて細菌を死滅させることによってまたはオプソニン食作用死滅アッセイを介して測定した場合、機能的である。一部の実施形態において、本発明の抗体は、対象に受動免疫を付与する。本発明はさらに、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、ならびに、当業者に周知の技術を使用して本発明の抗体または抗体組成物を生成する細胞または細胞株（ハイブリドーマ細胞または抗体の組換え生成のための他の操作された細胞株等）およびトランスジェニック動物を提供する。
本発明の抗体または抗体組成物は、対象においてＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）に関連するレンサ球菌感染、疾患または状態を治療するまたは予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を産生するステップと、前記抗体または抗体組成物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む方法において使用され得る。本発明の抗体は、診断方法、例えば、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原の存在を検出することまたはそのレベルを定量化することにも有用となり得る。
本発明の多糖等の繰り返し構造に対する抗体応答は、いくつかの独自の特色を呈し得る。例えば、繰り返し単位の規則性は、非常に様々な分子量の抗原分子が、多糖に対して特異的な抗体と結合できることを意味し得る。より長い多糖の第二の繰り返し構造は、Ｔ細胞非依存性抗体応答を誘発することができる。したがって、Ｔ細胞ヘルパーエピトープを有するタンパク質担体とコンジュゲートしている多糖を使用する場合、Ｔ細胞非依存性およびＴ細胞依存性抗体応答の両方を刺激することができる。したがって、免疫応答は、多糖サイズの適切な選択によって、担体タンパク質が使用されるか否かにかかわらず、修飾することができる。
ポリクローナル抗体
ある特定の実施形態において、抗多糖抗体は、ポリクローナル抗体である。本明細書において定義されている通りのポリクローナル抗体は、血清の調製物に由来し、かつ異なるＢ細胞クローンを起源とする異なる特異性を有する抗体の混合物を指す。ポリクローナル抗体の調製および特徴付けは、当技術分野において公知である。
ポリクローナル抗体は、免疫原または本明細書において記述されている免疫原性組成物の１または複数回の注射、ならびに、所望ならば、アジュバント、緩衝剤および／または希釈剤を投与することによって、対象において、例えば哺乳動物において育てられる。ある範囲の動物種が、特異的抗血清の生成に有用となり得る。典型的には、抗糖ポリクローナル抗血清の生成に使用される動物は、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。典型的には、免疫原または免疫原性組成物は、アジュバントを加えてまたは加えずに、複数回の注射によって哺乳動物に注射される。免疫原性材料は、多糖、オリゴ糖、多糖、本明細書において記述されている多糖－タンパク質コンジュゲート、または免疫原のより大きい集合体を包含し得る。典型的には、初回免疫化後初めの２～６週間、免疫化された動物から血液を収集し、凝固させ、血清を採取する。血清は、免疫化された動物由来の抗糖ポリクローナル抗体を含有し、多くの場合、抗血清と称される。
モノクローナル抗体
抗糖モノクローナル抗体は、公知のハイブリドーマ技術の使用を介して調製され得る。典型的には、モノクローナル抗体を調製することは、多糖、オリゴ糖、多糖または本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートを含む選択された免疫原で、好適な標的動物宿主を最初に免疫化することを伴う。所望ならば、アジュバント、緩衝剤および／または希釈剤が包含されてもよい。免疫化は、多糖またはそのコンジュゲートと特異的に結合している抗体を生成するまたは発現するようにＢリンパ球を導くために十分な様式で行われる。代替として、リンパ球はインビトロで免疫化される。
次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。リンパ球の起源は、モノクローナル抗体がヒトまたは動物起源のいずれであるかを決定する。概して、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）は、ヒト起源の抗体および細胞が所望される場合に使用され、脾臓細胞またはリンパ節細胞は、非ヒト哺乳動物起源が所望される場合に使用される。
不死化細胞株は、典型的には、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地中で培養される。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を包含することになり、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
不死化細胞株は、起源、融合および成長特徴の種等の実施上の配慮点で選択される。例えば、好適な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞によって抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性であるものである。不死化細胞株の例は、ネズミ骨髄腫株を包含する。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の生成について記述されている。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって培養培地中に分泌される。次いで、培養培地を、多糖を認識し結合するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって生成される特定のモノクローナル抗体の抗多糖結合特異性は、当業者に周知である多数の手順のうちの１つによって決定される。例えば、抗体結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴（例えば、ビアコア）によって決定され得る。モノクローナル抗体によって認識された正確なエピトープは、エピトープマッピングによって決定される。そのような技術およびアッセイは、当技術分野において周知である。
所望の特異性を持つハイブリドーマ細胞生成抗体が同定された後、クローンを限界希釈によってサブクローン化し、標準的な方法を使用して培養する。この目的に好適な培養培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ－１６４０培地を包含する。代替として、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水のようにインビボで成長する。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィー等によって、培養培地または腹水液から単離し、精製する。
代替として、所望の特異性を有する、所望の種の起源由来の抗体は、ファージディスプレイライブラリーの使用を介して取得することができる。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを産生しスクリーニングする際に使用するのに特に適している方法および試薬の例は、当技術分野において見ることができる。
抗体の使用
一態様において、本発明は、ＧＢＳ抗体および／または抗体断片を生成するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物の使用に関する。本明細書において記述されている多糖－タンパク質コンジュゲートおよび／またはそれから産生された抗体は、ＥＬＩＳＡおよびマイクロアレイ関連技術を包含する当業者に公知の様々な免疫診断技術において使用され得る。加えて、これらの試薬は、例えば、免疫原性多糖コンジュゲートに対する血清抗体レベルを含む抗体応答を評価するために使用され得る。本発明のアッセイ方法論は、蛍光、化学発光、放射性、酵素標識もしくは染料分子等の標識、ならびに／または生物学的試料中の抗原もしくは抗体および固体支持体と結合している対応する抗体もしくは抗原の間の複合体の直接的または間接的検出のための二次免疫学的試薬の使用を伴い得る。
生成された抗体または抗体断片は、受動免疫療法において、またはレンサ球菌感染に対する予防のためにも有用であり得る。
多糖を生成する方法
また別の態様において、本発明は、本明細書において記述されている多糖を生成するための方法に関する。方法は、ＧＢＳを培養するステップと、細菌によって生成された多糖を収集するステップとを包含する。一実施形態において、ＧＢＳは、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を包含する。細菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の任意の株であってもよい。好ましい実施形態において、細菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の被包性株である。本発明において使用するためのＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株は、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４、ＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７、ＰＦＥＧＢＳＴ０２６７、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１、ＰＦＥＧＢＳＴ０７０８、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）、ＰＦＥＧＢＳＴ０５６３、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６、ＰＦＥＧＢＳＴ０９６１、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１、ＰＦＥＧＢＳＴ０８３７、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４、ＣＺ－ＰＷ－１１９、７２７１、ＣＺ－ＰＷ－０４５、ＪＭ９１３００１３、ＪＭ９１３０６７２、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２、およびＩＴ－ＰＷ－６４を包含する。
本明細書において記述されている多糖は、ＧＢＳを適切な培地中で培養することによって生成され得る。適切な培地は、コロンビアブロスを包含し得る。培地は、デキストロース、ヘミンおよび／またはグルコースを包含し得る。好ましくは、培地は、コロンビアブロスおよびデキストロースを包含する。Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）がコロンビアブロスおよびデキストロースを使用して培養される場合、好ましくは、培養のための温度は、２０から４０℃、好ましくは３７℃である。好ましい実施形態において、細菌は、好気条件下で培養される。別の好ましい実施形態において、細菌は、１２から６０時間にわたって培養される。
多糖は、培養物から標的物質を収集するための当業者において公知の方法、例えば、加熱、酵素処理、遠心分離、沈殿、活性炭による処理、および／または濾過等を使用することにより、取得された培養物から収集され得る（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、同第２００６／０２２８３８１号、同第２００７／０１８４０７１号、同第２００７／０１８４０７２号、同第２００７／０２３１３４０号および同第２００８／０１０２４９８号；国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１１８７５２号を参照）。一実施形態において、細菌および多糖を含有する培養物を遠心分離し、酵素、例えば、リゾチーム、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ムタノリシン、およびそれらの混合物等で処理する。例えば、一実施形態において、取得された上清に適切な有機溶媒を添加して、タンパク質を沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって除去する。次いで、上清に適切な有機溶媒をさらに添加することによって多糖を沈殿させてよく、遠心分離によって多糖を収集してよい。より具体的には、本明細書において記述されている多糖は、エタノールを、約２５体積％の最終濃度で、細菌が除去された上清に添加し、タンパク質を含有する沈殿を遠心分離によって除去し、それにエタノールを約７５体積％の最終濃度までさらに添加し、次いで、遠心分離によって沈殿物を収集することによって取得され得る。得られた沈殿物を、窒素で乾燥させてよい。得られた沈殿物を、トリスおよび０．０５％アジ化Ｎａに再懸濁してよい。
本発明のさらなる態様は、Ｎ－およびＯ－アセチル基を保存しながら、ほぼ無傷の高分子量ＣＰの単離のために誘導体化ヒドロキシルアミン化合物等の有機試薬を使用する新規方法を提供する。この方法は、細胞を溶菌しないため、遠心分離によって単離されたＣＰは、細胞内成分による汚染が最小限であり、より高い全収率につながり得る。その上、これらの試薬は、その複数のホスホジエステル結合により、Ｂ群抗原不純物を非常に小さい断片に開裂し、これは、血液透析濾過によって簡単に除去することができる。
一実施形態において、ＣＰは、ヒドロキシルアミンを、莢膜多糖生産菌を含む細胞ペーストと反応させることによって単離される。特定の実施形態において、方法は、遠心分離するステップをさらに含む。別の実施形態において、方法は、濾過するステップをさらに含む。また別の実施形態において、莢膜多糖生産菌は、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）および大便レンサ球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される。
本発明のある態様において、ヒドロキシルアミンは、実施例２の表２に収載されたものであってもよい。好ましい実施形態において、ヒドロキシルアミンは、ジベンジルヒドロキシルアミン、ジエチルヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミン、エチレンジアミン、トリエチレンテトラミン、１，１，４，７，１０，１０ヘキサメチルトリエチレンテトラミンおよび２，６，１０，トリメチル２，６，１０トリアザウンデカンからなる群から選択される。
本発明の一態様において、ヒドロキシルアミンの濃度は、約５ｍＭから約２００ｍＭ、例えば、約５ｍＭから約１５０ｍＭ、約５ｍＭから約１００ｍＭ、約５ｍＭから約７５ｍＭ、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約５ｍＭから約２５ｍＭ、約５ｍＭから約１０ｍＭ、１０ｍＭから約２００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約７５ｍＭ、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約２５ｍＭ、約２５ｍＭから約２００ｍＭ、約２５ｍＭから約１５０ｍＭ、約２５ｍＭから約１００ｍＭ、約２５ｍＭから約７５ｍＭ、約２５ｍＭから約５０ｍＭ、約５０ｍＭから約２００ｍＭ、約５０ｍＭから約１５０ｍＭ、５０ｍＭから約１００ｍＭおよび約５０ｍＭから約７５ｍＭ等である。
別の態様において、反応のｐＨは、約５．５から約９．５、例えば、約５．５から約９．０、約５．５から約８．５、約５．５から約８．０、約５．５から約７．５、約５．５から約７．０、約５．５から約６．５、約６．０から約９．５、約６．０から約９．０、約６．０から約８．５、約６．０から約８．０、約６．０から約７．５、約６．０から約７．０、約６．５から約９．５、約６．５から約８．５、約６．５から約８．０、約６．５から約７．５、約７．０から約９．５、約７．０から約９．０、７．０から約８．５および約７．０から約８．０等に維持される。
本発明のさらなる態様において、反応は、約２０℃から約８５℃、例えば、約２０℃から約８０℃、約２０℃から約７５℃、約２０℃から約７０℃、約２０℃から約６５℃、約２０℃から約６０℃、約２０℃から約５５℃、約２０℃から約５０℃、約２５℃から約８５℃、約２５℃から約８０℃、約２５℃から約７５℃、約２５℃から約７０℃、約２５℃から約６５℃、約２５℃から約６０℃、約２５℃から約５５℃、約２５℃から約５０℃、約３０℃から約８５℃、約３０℃から約８０℃、約３０℃から約７５℃、約３０℃から約７０℃、約３０℃から約６５℃、約３０℃から約６０℃、約３０℃から約５５℃、約３０℃から約５０℃、約３５℃から約８５℃、約３５℃から約８０℃、約３５℃から約７５℃、約３５℃から約７０℃、約３５℃から約６５℃、約３５℃から約６０℃、約３５℃から約５５℃、約４０℃から約８５℃、約４０℃から約８０℃、約４０℃から約７５℃、約４０℃から約７０℃、約４０℃から約６５℃、約４０℃から約６０℃、約４５℃から約８５℃、約４５℃から約８０℃、約４５℃から約７５℃、約４５℃から約７０℃、約４５℃から約６５℃、約５０℃から約８５℃、約５０℃から約８０℃、約５０℃から約７５℃、約５０℃から約７０℃、約５５℃から約８５℃、約５５℃から約８０℃、約５５℃から約７５℃、約６０℃から約８５℃および約６５℃から約８５℃等の温度で起こる。
また別の態様において、反応時間は、約１０時間から約９０時間、例えば、約１０時間から約８５時間、約１０時間から約８０時間、約１０時間から約７５時間、約１０時間から約７０時間、約１０時間から約６０時間、約１０時間から約５０時間、約１０時間から約４０時間、約１０時間から約３０時間、約１０時間から約２５時間、約１０時間から約２０時間、約１０時間から約１５時間、約１５時間から約９０時間、約１５時間から約８５時間、約１５時間から約８０時間、約１５時間から約７５時間、約１５時間から約７０時間、約１５時間から約６０時間、約１５時間から約５０時間、約１５時間から約４０時間、約１５時間から約３０時間、１５時間から約２０時間、例えば、約２０時間から約９０時間、約２０時間から約８５時間、約２０時間から約８０時間、約２０時間から約７５時間、約２０時間から約７０時間、約２０時間から約６０時間、約２０時間から約５０時間、約２０時間から約４０時間、約２０時間から約３０時間および約２０時間から約２５時間等である。
代替として、本発明の別の実施形態において、多糖は、化学的に合成される。多糖は、従来の方法に従って、化学的に合成され得る。
本発明のまた別の実施形態において、多糖は、多糖を生成するための生合成経路をクローン化し発現した後、代理宿主における発現によって調製される。例えば、宿主細胞は、本明細書において記述されている多糖と構造的類似性を有する多糖を生成するように修飾されてよく、宿主細胞において生成された多糖の繰り返し単位は、本明細書において記述されている多糖の繰り返し単位と部分的に同一である。多糖は、本明細書において記述されている多糖と構造的に同様であり、例えば、多糖の繰り返し単位が不明の分枝を有するならば、本明細書において記述されている多糖の繰り返し単位と比較した場合に、サイズが不均一であり、かつ／または分枝配置が不均一である。好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。
下記の例は、本発明の一部の実施形態を実証するものである。しかしながら、これらの例は、例証のみのためのものであり、本発明の条件および範囲について完全に決定的であることを主張するものではないことを理解されたい。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が与えられている場合、概してあまり好都合ではないが、指定された範囲の上下両方の条件も使用できることを理解すべきである。本明細書において言及されるすべての部およびパーセントは、重量ベースであり、すべての温度は、別段の定めがない限り、摂氏度で表現される。
さらに、下記の例は、別途詳細に記述されている場合を除き、当業者に周知かつ日常的である標準的な技術を使用して行った。上記で注記した通り、下記の例は、例証を目的として提示されるものであり、本発明の範囲をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
（実施例１）
Ｏ－脱アセチル化されている多糖を用いる多糖－タンパク質コンジュゲートの調製
それぞれの血清型についてのＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株を、限定培地中、ｐＨ制御した深部培養において発酵させた。使用した手順および培地は、実験を介して最適化したものであり、ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８（４）：４５８～４６２（１９９３）において以前に記述された基本技術の拡張であった。莢膜多糖を、ＮａＯＨ処理によって細胞から除去した。浄化後、一連のＵＦ／ＤＦ、沈殿および炭素濾過ステップにより、精製された多糖を生じさせた。例えば、米国特許第８，６５２，４８０号を参照されたい。還元的アミノ化化学を使用して、活性化多糖をＣＲＭ１９７とコンジュゲートさせた。例えば、米国特許第５，３６０，８９７号を参照されたい。
（実施例２）
Ｏ－アセチル化されている多糖の単離
発酵ブロス（１．２Ｌ）の熱での死滅および遠心分離後に取得されたＧＢＳ莢膜多糖（ＣＰ）血清型Ｉａ由来の細胞ペーストを、１７５ｍＬの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ６．９）に再懸濁した。懸濁液を、１０ｍＭの最終濃度まで、ヒドロキシルアミンＯ－スルホン酸水溶液と混合した。懸濁液のｐＨは、約５．８であると決定された。懸濁液を、５５℃で７２時間にわたって撹拌した。その後、懸濁液を１０，０００ｒｐｍ前後で遠心分離し、上清を収集した。粗製開裂ＣＰを含有する上清を、分子量および収率について分析した。残りの部分を、注射用水（ＷＦＩ）を使用する３０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、血液透析濾過による精製に供した。精製された多糖を、多角度光散乱検出器と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって、分子量についてさらに分析した（表１）。
Figure 0007295206000011
いくつかのヒドロキシルアミン、窒素および酸素置換両方の化合物を、上述した方法を使用してそれらの活性についてスクリーニングした。収率は、屈折率（ＲＩ）応答および０．１３５の具体的な屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）の二乗値を使用する粗製上清の多角度光散乱検出と組み合わせたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ）によって算出した。収率は、ヒドロキシルアミンの種類、ならびに濃度、温度および反応時間等の条件の最適化によって決まった（表２を参照）。概して、ヒドロキシルアミン濃度の増大、より高い温度およびより長い反応時間は、より高収率につながる。
Figure 0007295206000012
Figure 0007295206000013
Figure 0007295206000014
Figure 0007295206000015
置換および非置換ヒドロキシルアミンは、細胞壁からＧＢＳ莢膜多糖を放出する際に非常に有効であることが分かった。このアプローチは、高分子量ＣＰＳの単離をＮ－およびＯ－アセチル基の保存とともにもたらす。スクリーニングしたいくつかの化合物の中でも、ジベンジルヒドロキシルアミンが最も有効であることが分かった。データを表３に示す（［ジベンジルヒドロキシルアミン］－ ５０ｍＭ；ｐｈ－ ７～８；温度－ ５０℃；時間－ ２４時間）。
Figure 0007295206000016
ジベンジルヒドロキシルアミンは水への溶解度が不十分であるため、ジベンジルヒドロキシルアミンよりも自由に水溶性であり、同様のまたはより高い活性を有する、ヒドロキシルアミンの代替的な誘導体が所望される。少数の化合物をスクリーニングした後、ジエチルヒドロキシルアミンが良好な代替物であることが分かった。データを表４に示す（［ジエチルヒドロキシルアミン］－ １００ｍＭ；ｐＨ－ ７～８；温度－ ６０℃；時間－ １９時間）。
Figure 0007295206000017
ヒドロキシルアミン（ＮＨ２－ＯＨ）も、細胞壁からのＣＰＳ開裂において有効であることが分かった。データを表５に示す（［ヒドロキシルアミン］－ １００ｍＭ；ｐＨ－ ７～７．５；温度－ ６５℃；時間－ １７時間）。血清型ＩＩＩについて、収率は、１７時間後には５４％であったが、収率は、３日半後には最大７０％まで増大した。
Figure 0007295206000018
細胞からのＧＢＳ莢膜多糖の放出についてのオリゴアミンのスクリーニング
ヒドロキシルアミンおよびその置換化合物は、ＧＢＳ細胞壁からの莢膜多糖の開裂に非常に効率的であることが分かった。しかしながら、これらは、血清型ＩＩおよびＶについてはあまり効率的でないことが分かった。したがって、オリゴアミンを、複数のアミン官能基によってより活性になり得るという確信により試験した。
エチレンジアミンは、すべての血清型から莢膜多糖を放出する際に有効であることが分かった。データを表６に示す（［エチレンジアミン］－ ５０または１００ｍＭ；ｐＨ８．０；１６時間；８０℃；２５ｍＭ ＥＤＴＡ）。
Figure 0007295206000019
他の代表的なオリゴアミンを、血清型ＩａおよびＶ細胞ペーストを使用してそれらの活性について試験したが、同じく血清型Ｖについてはあまり効率的でないことが分かった。データを表７（［トリエチレンテトラミン］－ １００ｍＭ；ｐＨ－ ８．９；温度－ ６０℃；時間－ １５時間）、８（［１，１，４，７，１０，１０ヘキサメチルトリエチレンテトラミン］－ １０ｍＭ；ｐＨ－ ６．３；温度－ ６０℃；時間－ ２０時間）、および９（［２，６，１０，トリメチル２，６，１０トリアザウンデカン］－ １０ｍＭ；ｐＨ－ ７～８；温度－ ６０℃；時間－ １９時間）に示す。
Figure 0007295206000020
Figure 0007295206000021
Figure 0007295206000022
（実施例３）
還元的アミノ化によるＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲーション
多糖を活性化する
多糖酸化は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６．０±０．５）中、計算量の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）の順次添加によって行い、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要ならば、反応ｐＨを、およそｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を２３℃に調整した。酸化は、およそ０．２５モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加によって開始した。酸化反応は、およそ１６時間の間、５±３℃で実行した。
活性化多糖の濃縮および血液透析濾過は、５Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過カセットを使用して行った。血液透析濾過は、２０倍ダイアボリュームのＷＦＩに対して実行した。次いで、精製された活性化多糖を、５±３℃で貯蔵した。精製された活性化糖を、とりわけ、（ｉ）比色アッセイによる糖濃度、（ｉｉ）比色アッセイによるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、および（ｉｖ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量によって、特徴付ける。
活性化多糖の酸化度（ＤＯ＝砂糖繰り返し単位のモル数／アルデヒドのモル数）は、次のように決定された：
砂糖繰り返し単位のモル数は、種々の比色法によって、例えば、アンスロン法を使用することによって決定される。アンスロン法（ｍｔｈｏｄ）により、多糖は、硫酸および熱の作用によって最初に単糖に解体される。アンスロン試薬は、ヘキソースと反応して、黄緑色の複合体を形成し、その吸光度を６２５ｎｍにおいて分光光度的に読み取る。アッセイの範囲内で、吸光度は、存在するヘキソースの量に正比例している。
アルデヒドのモル数も、ＭＢＴＨ比色法を使用して同時に決定される。ＭＢＴＨアッセイは、アルデヒド基（所与の試料由来）を３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨアッセイ試薬）と反応させることによる、アジン化合物の形成を伴う。過剰な３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾンが酸化して、反応性カチオンを形成する。反応性カチオンおよびアジンが反応して、青色発色団を形成する。次いで、形成された発色団を、６５０ｎｍにて分光的に読み取る。
活性化多糖をスクロース賦形剤と配合し、凍結乾燥する
活性化多糖をスクロースと、活性化多糖１グラム当たり２５グラムのスクロースの比まで配合した。次いで、配合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥した活性化多糖を含有するボトルを、－２０±５℃で貯蔵した。計算量のＣＲＭ１９７タンパク質をシェル冷凍し、別個に凍結乾燥した。凍結乾燥したＣＲＭ１９７を、－２０±５℃で貯蔵した。
凍結乾燥した活性化多糖および担体タンパク質を再溶解する
凍結乾燥した活性化多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再溶解した。多糖が完全溶解したら、等量の無水ＤＭＳＯを、凍結乾燥したＣＲＭ１９７に、再溶解のために添加した。
コンジュゲートし、キャップする
再溶解された活性化多糖を、再溶解されたＣＲＭ１９７と反応容器中で合わせ、続いて、徹底的に混合して、透明溶液を取得した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとのコンジュゲーションを開始した。反応溶液中における最終多糖濃度は、およそ１ｇ／Ｌであった。コンジュゲーションは、１．０～１．５ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加し、２３±２℃で２０～４８時間にわたってインキュベートすることによって開始した。コンジュゲーション反応は、２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して、未反応のアルデヒドをキャップすることにより、終了させた。このキャッピング反応を、２３±２℃で３±１時間にわたって続けた。
コンジュゲートを精製する
コンジュゲート溶液を、１００～３００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過による精製のために、調製物中、冷やした５ｍＭコハク酸塩－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）で１：１０に希釈した。
希釈したコンジュゲート溶液を、５μｍのフィルターに通過させ、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）を媒体として使用して、血液透析濾過を実行した。血液透析濾過が完了した後、コンジュゲート濃縮液を、０．２２μｍのフィルターを介して移した。コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水（ｐＨ６）でさらに希釈して、およそ０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖濃度とした。代替として、コンジュゲートを、１００～３００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過により、２０ｍＭヒスチジン－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．５）を使用して精製した。最終０．２２μｍ濾過ステップを完了させて、免疫原性コンジュゲートを取得した。
（実施例４）
ＧＢＳ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに対する様々なコンジュゲーション条件の効果
ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶコンジュゲートは、試薬のための溶媒（水性媒体対ＤＭＳＯ）、初期多糖中における様々なレベルのシアル酸、および酸化度／糖エピトープ修飾を包含する、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学（ＰＯ／ＲＡＣ）条件を故意に変動させることによって産生された。概して、ＤＭＳＯを溶媒として使用して生成されたコンジュゲートは、水性媒体を使用して生成されたコンジュゲートよりも、低レベルの未反応の（遊離）多糖、より高いコンジュゲート分子量およびより高い糖／タンパク質比を有することが分かった。
低レベルの未反応の（遊離）多糖を持つコンジュゲートを生成するコンジュゲーションプロセスは、有利であり、好ましい。高レベルの未反応の（遊離）多糖は、多糖－タンパク質コンジュゲートによって産生されたＴ細胞依存性応答を希釈する可能性を有する過度のＴ細胞非依存性免疫応答を引き起こし得、それにより、コンジュゲートによって産生される免疫原性応答を低下させることが周知である。
選択されたＧＢＳ多糖を、当技術分野において公知の方法によって化学的に脱シアルし（Ｃｈａｆｆｉｎ，Ｄ．Ｏら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８７（１３）：４６１５～４６２６（２００５）を参照）、コンジュゲート変異体を産生して、免疫原性に対する脱シアル化％の影響を決定した。約４０％超の脱シアル化（すなわち、シアル酸レベル約６０％未満）は、免疫原性に対して悪影響を及ぼした。
同様に、ほとんどの場合において、約５未満の酸化度、または約２０％超の糖エピトープ修飾は、免疫原性に対して悪影響を及ぼした。酸化は莢膜多糖上のシアル酸を介して発生するため、結果は、約２０％超の糖エピトープ修飾がシアル酸含有量を低減させ、これが免疫原性の低減をもたらすことを示しているように見える。
逆に、様々な糖／タンパク質比または多糖分子量を有するコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性応答を生成し、これらの属性に関して比較的広範囲の受容基準を示した。
追加のコンジュゲート変異体は、代替的な化学経路を使用しても産生された。１つの代替的な化学は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることによりコンジュゲートを産生すること、およびＤＭＳＯ中でコンジュゲーション反応を行うことを包含していた。別の代替的な化学において、コンジュゲートは、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ［（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イル）オキシル］試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学（ＴＥＭＰＯ／ＲＡＣ）を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。これらの代替的な化学によって産生されたすべてのコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であることが実証され、ＰＯ／ＲＡＣ以外の代替的な化学経路の適合性を示していた。しかしながら、一部のコンジュゲーション化学は、他のものよりも、一部の血清型を用いて、より良好に実行された。
ＯＰＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）分離株をＢ群レンサ球菌分離株で代用し、前オプソニン化ステップを省略して、Ｎａｎｒａ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９（３）：４８０～４８７（２０１３）のように実行した。用量３後（ＰＤ３）のＯＰＡ力価は、それぞれのコンジュゲートの各用量において１ｍｃｇ／ｍｌにより免疫化された１０～２０匹のマウスの群からの幾何平均として提供される。
ＧＢＳ血清型Ｉａ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート
ＰＯ／ＲＡＣおよび１６～１７のＤＯ（およそ６％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、免疫原性であると実証された（コンジュゲート１および３）。しかしながら、５．４のＤＯ（およそ１９％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用することは、免疫原性に対して悪影響を及ぼした（コンジュゲート２）。同様に、５０％のシアル酸レベルは、免疫原性応答をほとんど生成しなかった（コンジュゲート４）。結果を表１０に示す。
Figure 0007295206000023
追加のコンジュゲート変異体は、代替的なコンジュゲーション化学およびコンジュゲート分子属性を使用して産生した（結果を表１１に示す）。コンジュゲート５は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることにより産生され、コンジュゲーション反応は、ＤＭＳＯ中で行った。コンジュゲート６は、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。コンジュゲート７は、ＰＯ／ＲＡＣおよびコンジュゲーションパラメーターを故意に変動させて高い糖／タンパク質比（ＳＰＲ）を持つコンジュゲートを生成することにより、産生された。コンジュゲート８は、低ＭＷ（４０ｋＤａ）を有する多糖を使用するＰＯ／ＲＡＣによって産生された。これらすべてのコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であることが実証され、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学以外の代替的なコンジュゲーション化学の適合性、ならびに初期多糖のＳＰＲおよび低ＭＷ等の代替的なコンジュゲート属性を示していた。
Figure 0007295206000024
ＧＢＳ血清型Ｉｂ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート
ＤＭＳＯ中においてＰＯ／ＲＡＣおよび１５．８のＤＯ（およそ６％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証された（コンジュゲート９および１１）。ＤＭＳＯ中のＰＯ／ＲＡＣによって産生されたコンジュゲートは、他のすべてのコンジュゲート分子属性が同じである場合、水性媒体中のＰＯ／ＲＡＣによって産生されたコンジュゲートよりもわずかに免疫原性であった（それぞれ、コンジュゲート９および１１）。しかしながら、４．７のＤＯ（およそ２１％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用することは、免疫原性に悪影響を及ぼした（コンジュゲート１０）。免疫原性は、ほぼ完全に消失し、ＰＯ／ＲＡＣおよび９５％脱シアル化（５％のシアル酸レベル）多糖を使用して産生されたコンジュゲートにおいて、応答するものは非常に少数であった（コンジュゲート１２）。結果を表１２に示す。
Figure 0007295206000025
追加のコンジュゲート変異体は、代替的なコンジュゲーション化学およびコンジュゲート分子属性を使用して産生した（結果を表１３に示す）。コンジュゲート１３は、初期多糖において低シアル化（６５％）を有する多糖を使用するＰＯ／ＲＡＣによって産生された。コンジュゲート１４は、ＰＯ／ＲＡＣおよびコンジュゲーションパラメーターを故意に変動させて高い糖／タンパク質比（ＳＰＲ）を持つコンジュゲートを生成することにより、産生された。コンジュゲート１５は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることにより産生され、コンジュゲーション反応は、ＤＭＳＯ中で行った。コンジュゲート１６は、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。これらすべてのコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証され、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学以外の代替的なコンジュゲーション化学の適合性、ならびに初期多糖のＳＰＲおよび低ＭＷ等の代替的なコンジュゲート属性を示していた。
Figure 0007295206000026
ＧＢＳ血清型ＩＩ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート
ＰＯ／ＲＡＣおよび４～１５のＤＯ（およそ７～２３％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証された（コンジュゲート１７～２０）。ＰＯ／ＲＡＣおよび７４％のシアル化レベル（２６％脱シアル化）を持つ多糖を使用して産生されたコンジュゲートも、免疫原性であると実証された（コンジュゲート２０）。結果を表１４に示す。
Figure 0007295206000027
追加のコンジュゲート変異体は、代替的なコンジュゲーション化学およびコンジュゲート分子属性を使用して産生した（結果を表１５に示す）。コンジュゲート２１および２２は、ＰＯ／ＲＡＣならびにコンジュゲーションパラメーターを故意に変動させてそれぞれ低いおよび高い糖／タンパク質比（ＳＰＲ）を持つコンジュゲートを生成することにより、産生された。コンジュゲート２３は、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。コンジュゲート２４は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることにより産生され、コンジュゲーション反応は、ＤＭＳＯ中で行った。これらすべてのコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であることが実証され、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学以外の代替的なコンジュゲーション化学の適合性、およびＳＰＲ等の代替的なコンジュゲート属性を示していた。
Figure 0007295206000028
ＧＢＳ血清型ＩＩＩ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート
ＤＭＳＯ中においてＰＯ／ＲＡＣおよび１０～１７のＤＯ（およそ６～１０％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証された（コンジュゲート２５および３０）。２．９のＤＯ（およそ３４％の糖エピトープ修飾）または高い糖／タンパク質比（２．１）を有するコンジュゲート（それぞれ、コンジュゲート２６および２７）は、免疫原性が比較的低いと実証された。ＰＯ／ＲＡＣおよび８１％のシアル化レベル（１９％脱シアル化）を持つ多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、免疫原性であると実証された（コンジュゲート３０）。しかしながら、５８％のシアル化レベル（４２％脱シアル化）を持つ多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、免疫原性が乏しいと実証された（コンジュゲート２９）。ＤＭＳＯ中のＰＯ／ＲＡＣによって産生されたコンジュゲートは、他のすべてのコンジュゲート分子属性が同じである場合、水性媒体中のＰＯ／ＲＡＣによって産生されたコンジュゲートよりもわずかに免疫原性であった（それぞれ、コンジュゲート２５および２８）。結果を表１６に示す。
Figure 0007295206000029
追加のコンジュゲート変異体は、代替的なコンジュゲーション化学およびコンジュゲート分子属性を使用して産生した（結果を表１７に示す）。コンジュゲート３１～３５は、ＰＯ／ＲＡＣおよびコンジュゲーションパラメーターを故意に変動させて様々なＭＷを持つコンジュゲートを生成することにより、産生された。コンジュゲート３６は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることにより産生され、コンジュゲーション反応は、ＤＭＳＯ中で行った。コンジュゲート３７は、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。これらすべてのコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証され、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学以外の代替的なコンジュゲーション化学の適合性、およびＭＷ等の代替的なコンジュゲート属性を示していた。５の低さのＤＯ（およそ２０％の糖エピトープ修飾）で産生されたコンジュゲートは、２．９のＤＯ（およそ３４％の糖エピトープ修飾）で産生されたコンジュゲート（上記の表１６中のコンジュゲート２６）と比較して、マウスにおいて依然として免疫原性であった（表１７中のコンジュゲート３２）。
Figure 0007295206000030
ＧＢＳ血清型ＩＶ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート
ＰＯ／ＲＡＣおよび６．９～１４．２のＤＯ（およそ７～１４％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証された（コンジュゲート３８～４１）。ＰＯ／ＲＡＣおよび６０％のシアル化レベル（４０％脱シアル化）を持つ多糖を使用して産生されたコンジュゲートも、免疫原性であると実証された（コンジュゲート４１）。結果を表１８に示す。
Figure 0007295206000031
追加のコンジュゲート変異体は、代替的なコンジュゲーション化学およびコンジュゲート分子属性を使用して産生された。結果を表１９に示す。コンジュゲート４２および４５は、ＰＯ／ＲＡＣおよびコンジュゲーションパラメーターを故意に変動させて高いＤＯ（より低い酸化レベル）および高いＳＰＲをそれぞれ持つコンジュゲートを生成することにより、産生された。コンジュゲート４３は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることにより産生され、コンジュゲーション反応は、ＤＭＳＯ中で行った。コンジュゲート４４は、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。すべての血清型ＩＶコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であることが実証され、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学以外の代替的なコンジュゲーション化学の適合性、およびＳＰＲ等のコンジュゲート属性を示していた。最大少なくとも２０のＤＯ（より低い酸化）（およそ５％の糖エピトープ修飾）で産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて依然として免疫原性であった。
Figure 0007295206000032
ＧＢＳ血清型Ｖ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート
ＰＯ／ＲＡＣおよび４．４～１４．６のＤＯ（およそ７～２３％の糖エピトープ修飾）を有する活性化多糖を使用して産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であると実証された（コンジュゲート４６および４７）。脱シアル化（５％のシアル化レベル）コンジュゲートは免疫原性ではなく（コンジュゲート４９）、水性溶媒を使用するＰＯ／ＲＡＣプロセスを使用して産生されたコンジュゲートは、低い免疫応答を生成した（コンジュゲート４８）。結果を表２０に示す。
Figure 0007295206000033
追加のコンジュゲート変異体は、代替的なコンジュゲーション化学およびコンジュゲート分子属性を使用して産生した。結果を表２１に示す。コンジュゲート５０および５３は、ＰＯ／ＲＡＣおよびコンジュゲーションパラメーターを故意に変動させてそれぞれより低いシアル化レベル（８１％シアル化）および低ＭＷを持つコンジュゲートを生成することにより、産生された。コンジュゲート５１は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることにより産生され、コンジュゲーション反応は、ＤＭＳＯ中で行った。コンジュゲート５２は、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例３において詳述した通りに産生された。ＣＤＴ化学を使用して産生されたコンジュゲートを除き、すべての血清型Ｖコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であることが実証され、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学以外の代替的なコンジュゲーション化学の適合性、およびＭＷ等のコンジュゲート属性を示していた。ＣＤＴ化学を使用して産生されたコンジュゲートは、ＲＡＣによって産生された他のコンジュゲートと比較して、有意に免疫原性が低いことが示された。８１％のシアル化を持つコンジュゲート（コンジュゲート５０）は、９５％超のシアル化を持つコンジュゲート（コンジュゲート５３）と比較して低いが５％のシアル化を持つコンジュゲート（上記の表２０中のコンジュゲート４９）よりも高い免疫応答を提供した。
Figure 0007295206000034
（実施例５）
ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンはマウスにおいてＯＰＡ応答を生成した
雌ＣＤ－１マウスを、１ｍｃｇ、０．１ｍｃｇまたは０．０１ｍｃｇのＣＲＭ１９７とコンジュゲートしているＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＩＩ（ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７）またはＣＲＭ１９７とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｖ（ＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）により、０、３および６週目に３回、皮下的に免疫化した。用量３後（ＰＤ３）の血清を、オプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）によって評価した。ＯＰＡは、実施例４において記述されている通りに実行した。両方のコンジュゲートが、マウスにおいてＯＰＡ応答を誘発した（表２２）。検出可能なＯＰＡ応答のない試料に、５０の値を割り当てた。
Figure 0007295206000035
（実施例６）
ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンはマウスにおいてＯＰＡ応答を生成した
６セットの雌ＣＤ－１マウスを、１ｍｃｇのＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている個々のＧＢＳ莢膜多糖（ＣＰ）を含有するワクチンにより、０、３および６週目に３回、皮下的に免疫化した。初期の研究は、マウスが、試験された６つの血清型のいずれに対しても既存のＯＰＡ力価を有さないことを示していた。ＰＤ３からの血清を、ワクチン中に含有される同族ＧＢＳ血清型に対するＯＰＡにより、分析した。ＯＰＡは、実施例４において記述されている通りに実行した。結果を以下の表２３および２４に示す。
Figure 0007295206000036
Figure 0007295206000037
（実施例７）
ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンにより免疫化されたマウスから単離されたＩｇＧと比較した血清のオプソニン活性
雌ＣＤ－１またはＢＡＬＢ／ｃマウスを、１ｍｃｇのＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている個々のＧＢＳ ＣＰにより、０、３および６週目に３回、皮下的に免疫化した。ＡｌＰＯ４またはＱＳ－２１のいずれかを、アジュバントとして使用した。ＰＤ３血清を血清型特異的ＯＰＡによって試験し、次いで、免疫グロブリンＧ画分を単離し、ＯＰＡ活性について試験した。精製されたＩｇＧ ＯＰＡ活性を５ｍｇ／ｍｌに対して（正常マウス血清中におけるＩｇＧの量の範囲内で）正規化した。６つすべてのＧＢＳ ＣＰＳコンジュゲートが、オプソニン活性を持つＩｇＧ抗体を誘発した（図１）。
（実施例８）
ＧＢＳ Ｉａ－ＴＴ、ＧＢＳ Ｉｂ－ＴＴ、ＧＢＳ ＩＩ－ＴＴ、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＴＴ、ＧＢＳ ＩＶ－ＴＴおよびＧＢＳ Ｖ－ＴＴ、一価コンジュゲートワクチンはウサギにおいてＯＰＡ応答を生成した
ウサギを、５０ｍｃｇ／ｍｌの破傷風トキソイドとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉａ多糖、１０ｍｃｇ／ｍｌの破傷風トキソイドとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉｂ多糖、５０ｍｃｇ／ｍｌの破傷風トキソイドとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＩ多糖、５０ｍｃｇ／ｍｌの破傷風トキソイドとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＩＩ多糖、５０ｍｃｇ／ｍｌの破傷風トキソイドとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＶ多糖、または５０ｍｃｇ／ｍｌの破傷風トキソイドとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｖ多糖により、初回用量においては完全フロイントアジュバントならびに第２および３回用量においては不完全フロイントアジュバントでアジュバント添加して、３回免疫化した。コンジュゲートは、９５％超のシアル酸レベルを有する多糖およびＣＤＡＰ（１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）化学を使用して生成された。ＰＤ３免疫応答は、ＯＰＡにより、実施例４において記述されている通りに測定した。血清力価を表２５に示し、一方、精製されたＩｇＧ力価を以下の表２６に示す。ＴＴとコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ多糖は、ウサギにおいて高度に免疫原性であった。
Figure 0007295206000038
Figure 0007295206000039
（実施例９）
六価ＧＢＳコンジュゲートワクチンは非ヒト霊長類においてＯＰＡ応答を生成した
アカゲザルの３つの群を、六価Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ６）ワクチンにより、０、４および８週目に３回、筋肉内的に免疫化した。ＧＢＳ６ワクチンは、ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７を含んでいた。２つの群は、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）をアジュバントとして包含しており、５ｍｃｇの各コンジュゲートまたは５０ｍｃｇの各コンジュゲートのいずれかを投薬した。第３の群に、５ｍｃｇの各コンジュゲートを投薬し、アジュバントを含有していなかった。以下の表２７は、免疫化スケジュールを記述している。
Figure 0007295206000040
免疫前血清およびＰＤ３からの血清を、ワクチン中に含有される６つすべてのＧＢＳ血清型についてＯＰＡにより分析した。ＯＰＡは、実施例４において記述されている通りに実行した。結果を以下の表２８および２９に示す。６つすべての血清型について、ＡｌＰＯ４でアジュバント添加した処方は、検出可能なＯＰＡ応答（ＰＤ３の前からの力価における増大、または１超の倍率上昇前／ＰＤ３）を導出した。アジュバント添加していない５ｍｃｇ／コンジュゲート用量は、６つの血清型のうちの５つについて検出可能なＯＰＡ応答を導出した。
Figure 0007295206000041
Figure 0007295206000042
（実施例１０）
六価ＧＢＳコンジュゲートワクチンはラットにおいてＯＰＡ応答を生成した
雌スプラーグ・ドーリー系ラットを、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）を加えてまたは加えずにのいずれかで製剤化された実施例９において記述されている通りのＧＢＳ６多糖コンジュゲートワクチン中の５ｍｃｇ／ｍｌの各コンジュゲートで２回、皮下的に免疫化した。免疫前（ベースライン）および用量２後の血清を、６つすべての同族ＧＢＳ血清型に対するＯＰＡアッセイ力価について評価した。ＯＰＡ力価を、ＧＢＳ３８４ウェルアッセイフォーマットにおいて各血清型について測定し、倍率上昇を算出した。ＧＢＳ６ワクチンを投与したラットは、第２回用量後、各血清型に対して強固な機能的抗体応答を有し、ＡｌＰＯ４の非存在下では、血清型の間で７から２０５倍の増大が見られたのに対し、その存在下では、これは１１から２９４倍までの範囲になった（表３０）。
Figure 0007295206000043
（実施例１１）
一価または六価ＧＢＳグリココンジュゲートワクチンによる妊娠中の雌親の免疫化は出生後にその子においてＧＢＳ ＩＩＩまたはＶ感染からの保護効果を示した
雌ＣＤ－１マウスを、５ｍｃｇ／ｍｌの各コンジュゲートおよび１００ｍｃｇ／ｍｌのＡｌＰＯ４を含有する実施例９において記述されている通りのＧＢＳ６ワクチン、ＧＢＳ ＩＩＩもしくはＶ一価グリココンジュゲートワクチン（それぞれ１０ｍｃｇ／ｍｌのコンジュゲートおよび１００ｍｃｇ／ｍｌのＡｌＰＯ４を含有する）、またはビヒクル対照単独で３回、皮下的に免疫化した。マウスは、第３回免疫化の前に出産した。免疫化されたマウスの子に、致死用量のＧＢＳ血清型ＩＩＩまたはＧＢＳ血清型Ｖ細菌のいずれかを、受けたワクチンに従って接種し、生存を９０時間にわたってモニターした。ＧＢＳ６＋ＡｌＰＯ４またはＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７＋ＡｌＰＯ４による雌親の免疫化は、致死ＧＢＳ血清型ＩＩＩ接種に対する有意な保護（ｐ＜０．０００１）を新生仔に提供した。同様に、ＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７＋ＡｌＰＯ４による雌親の免疫化は、致死ＧＢＳ血清型Ｖ接種に対する有意な保護（ｐ＜０．０００１）を新生仔に提供した。結果を表３１に示す。
Figure 0007295206000044
（実施例１２）
乳児ラットにおけるＧＢＳ ＩＩＩモノクローナル抗体の受動免疫化は保護効果を示した
Ｂ群レンサ球菌血清型ＩＩＩ（ＧＢＳ ＩＩＩ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウスを、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶを含む五価ワクチンで免疫化することによって産生された。ＧＢＳ ＩＩＩ特異的ｍＡｂクローンを選択し、標準的な手順を使用して、ＧＢＳ ＩＩＩのＣＰを認識するｍＡｂを産生した。ＧＢＳ血清型ＩＩＩ ｍＡｂを、臨床ＧＢＳ ＩＩＩ分離株の接種１６時間前に、乳児ラット（ｎ＝１群当たり１０匹；２つの独立した実験を示す）に受動的に投与した。接種４時間後、血液を採取し、残りのＣＦＵを数えた。ＧＢＳ ＩＩＩ ｍＡｂによる処理は、乳児ラットにおける回収ＣＦＵを、４ログ以上低減させた（表３２）。
Figure 0007295206000045
（実施例１３）
妊娠中のマウスにおけるＧＢＳ Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶモノクローナル抗体の受動免疫化は、出生後にその子において保護効果を示した
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、五価ワクチン（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）により免疫化されたマウスから、標準的な手順を使用して産生された。次いで、ｍＡｂｓは、５つの血清型のそれぞれの莢膜多糖を特異的に認識するものとして同定された。５００ｍｃｇ／ｍｌ用量のＧＢＳ血清型Ｉｂ（ＧＢＳ Ｉｂ）ｍＡｂ、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ（ＧＢＳ ＩＩＩ）ｍＡｂ、ＧＢＳ血清型Ｖ（ＧＢＳ Ｖ）ｍＡｂまたはアイソタイプ適合対照ｍＡｂを、出産のおよそ２４から４８時間前に、妊娠中のマウスに受動的に投与した。出生２４から４８時間後、免疫化されたネズミ雌親の子に、致死用量のＧＢＳ Ｉｂ、ＧＢＳ ＩＩＩまたはＧＢＳ Ｖ細菌を接種した。生存を９６時間にわたってモニターした。ＧＢＳ Ｉｂ ｍＡｂ、ＧＢＳ ＩＩＩ ｍＡｂまたはＧＢＳ Ｖ ｍＡｂにより免疫化された雌親のもとに生まれた新生仔においては、ＧＢＳ接種後の対照ｍＡｂと比較して、有意に高い生存が見られた（表３３）。
Figure 0007295206000046
（実施例１４）
ＧＢＳコンジュゲートの安定性
ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭコハク酸塩－リン酸塩および１５５ｍＭ ＮａＣｌ中、様々なｐＨレベルで独立して製剤化して、加速貯蔵条件においてコンジュゲートの安定性を試験した。ＳＥＣ ＭＡＬＬＳによって決定された際の分子量における変化パーセントを、５０℃で４週間の貯蔵後に測定した。結果を図２～７に示す。
ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、表３４に示す種々の緩衝剤条件下、シアル化の安定性について試験した。遊離シアル酸（Ｎアセチルノイラミン酸；ＮＡＮＡ）を、３７℃で１カ月の貯蔵後に、ＨＰＬＣを使用して測定した。結果を図８に示す。
両方の研究は、コンジュゲートが、６．０を上回るｐＨ、最適には約ｐＨ６．５で良好な性能を発揮したことを示唆していた。
Figure 0007295206000047
（実施例１５）
ＧＢＳ６製剤
緩衝剤の選択を決定するために、ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７（ＧＢＳ６）を、上記の表３３に示されているのと同じ緩衝剤条件を使用して、一緒に製剤化した。製剤の実際のｐＨを、下記の時点において試験した：０（製剤が作製されたとき）、５℃で１カ月後、２５℃で１カ月後、および３７℃で１カ月後。コハク酸塩を緩衝剤として使用した製剤においてはｐＨのシフトが見られたのに対し、ヒスチジンを緩衝剤として使用した製剤においてはシフトが見られなかった。結果を図９～１０に示す。
ＧＢＳコンジュゲートのアルミニウムとの結合に対するヒスチジン緩衝剤濃度の効果も試験した。１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％ポリソルベート－８０、および０．５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをＡｌＰＯ４として含むｐＨ６．５の製剤を、２つの異なる濃度のコンジュゲート（１０ｍｃｇ／ｍｌおよび４０ｍｇ／ｍｌの各血清型）およびいくつかの異なる濃度のヒスチジンにより試験した。アルミニウムと結合しているコンジュゲートのパーセントは、ワクチン中のコンジュゲートのそれぞれの総量およびアルミニウムと結合しているコンジュゲートのそれぞれの量を測定することによって決定した。結合しているコンジュゲートは、ワクチン製剤を遠心分離し、アルミニウムペレットを再懸濁し、アルミニウムを可溶化し、血清型のそれぞれに対する血清型特異的ポリクローナル（ｐｏｌｙｃｏｌｏｎａｌ）抗体を用いる比濁法を使用して、結合しているコンジュゲートを測定することによって測定した。結果を図１１～１２に示す。ヒスチジン緩衝剤の濃度は、アルミニウムと結合している各血清型のパーセントに影響を与え、影響は、高用量よりも低用量において、より顕著であることが分かった。
望ましいと予想されるポリソルベート－８０（ＰＳ８０）の量を決定するために、撹拌研究を行った。２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍｌのＡｌＰＯ４（存在する場合）を含み、ＰＳ８０を含まないか、０．０１％ＰＳ８０、０．０２％ＰＳ８０または０．０３％ＰＳ８０のいずれかを含むｐＨ６．５のＧＢＳ６製剤を、撹拌ストレス時の全抗原性損失のパーセンテージについて試験した。製剤を予め充填したシリンジを、５００ＲＰＭにて７２時間にわたって室温で撹拌した。対照試料（撹拌されていない）を、室温で７２時間にわたって貯蔵した。結果を図１３に示す。
ＧＢＳ６製剤中におけるアルミニウムの濃度も研究して、アルミニウムとのＧＢＳコンジュゲート結合に対する効果を決定した。１０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ８０、および０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌまたは１．０ｍｇ／ｍｌいずれかのアルミニウムをリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）として含むｐＨ６．５のＧＢＳ６製剤を、アルミニウムと結合しているコンジュゲートのパーセントについて試験した。ＡｌＰＯ４との結合のパーセンテージは、ＡｌＰＯ４濃度が増大するにつれて増大する。結果を図１４に示す。
（実施例１６）
ＧＢＳ６凍結乾燥製剤
ＧＢＳ６の様々な凍結乾燥製剤（ＧＢＳ Ｉａ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ Ｉｂ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＩＩ－ＣＲＭ１９７、ＧＢＳ ＩＶ－ＣＲＭ１９７およびＧＢＳ Ｖ－ＣＲＭ１９７）を、安定性について試験した。２０ｍＭのｐＨ６．５のヒスチジン、０．０２％ＰＳ８０、約２８ｍＭのＮａＣｌ、および５．５％、７．０％または８．５％（ｗ／ｖ）いずれかのスクロースを含む低（１０ｍｃｇ／ｍｌ）および高（５０ｍｃｇ／ｍｌ）用量製剤を、凍結乾燥した。凍結乾燥製剤の安定性は、５℃で４カ月、３７℃で４カ月、および５０℃で１カ月後に、ｐＨおよび水分を測定することによって試験した。すべての製剤が、ｐＨおよび水分に基づき、安定であった（データは示されていない）。加えて、各血清型について抗原性回復のパーセンテージを、５℃および３７℃の両方で１、４および９カ月後、ならびに５０℃で１、２および４週間後に、すべての製剤について試験した。結果を図１５～２０に示す。
賦形剤における下記の変化形も調製し、４０ｍｃｇ／ｍｌ用量のＧＢＳ６製剤について評価した：１）７％（ｗ／ｖ）スクロース、２）２％（ｗ／ｖ）スクロースおよび４％（ｗ／ｖ）マンニトール、３）３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび３％（ｗ／ｖ）マンニトール、４）２％（ｗ／ｖ）スクロースおよび４％（ｗ／ｖ）グリシン、または５）３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび３％（ｗ／ｖ）グリシン。５つすべての製剤について、５℃で３カ月、２５℃で３カ月、３７℃で３カ月、および５０℃で１カ月後、ｐＨおよび水分は安定であった（データは示されていない）。加えて、各血清型について抗原性回復のパーセンテージを、５２～８℃、２５℃および３７℃で１、３および７カ月後、ならびに５０℃で１、２および４週間後に、すべての製剤について試験した。結果を図２１～２５に示す。
再溶解された凍結乾燥製剤および液体製剤中のＧＢＳ６ワクチンについて、リン酸アルミニウムアジュバントと結合している抗原のパーセントは、比濁法を使用して試験した。２０ｍＭのヒスチジン、０．０２％ＰＳ８０、７．０％（ｗ／ｖ）スクロース、および５００ｍｃｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含有する、凍結乾燥製剤と液体製剤の両方を、低（１０ｍｃｇ／ｍｌ）および高（５０ｍｃｇ／ｍｌ）用量で調製した。様々な濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）も試験して、抗原結合に対する効果を決定した。凍結乾燥製剤および液体製剤の結果を、それぞれ表３５および３６に示す。低用量製剤は、凍結乾燥組成物と液体組成物の両方について、約１５０ｍＭ以上のＮａＣｌ濃度を使用した場合に相当する結果を有していた。
Figure 0007295206000048
Figure 0007295206000049
（実施例１７）
ＧＢＳ６製剤の再懸濁特性
２４０ｍｃｇ／ｍＬ（高）または６０ｍｃｇ／ｍＬ（低）の総用量の多糖－タンパク質コンジュゲート、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０、および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含む、ｐＨ６．５のＧＢＳ６製剤を調製した。各血清型の同様の一価製剤も、２４０ｍｃｇ／ｍＬ（高）または６０ｍｃｇ／ｍＬ（低）用量で調製した。試料を、１）２ｍＬのガラスバイアルにバイアル当たり０．７３ｍＬの充填体積でまたは２）ＢＤ ＨＹＰＡＫ ＳＣＦ（商標）ＰＲＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の１ｍＬの短いガラス充填済みシリンジ（ＰＦＳ）に０．５８ｍＬの充填体積でのいずれかにて充填し、４４３２／５０ストッパー（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でキャップし、約５±１ｍｍのヘッドスペースを保った。バイアル中の製剤を立てて貯蔵し、一方、ＰＦＳ中のものを、２つの異なる配向、すなわち先端を下にしておよび水平で、５℃にて保持した。
再懸濁は、２週間および３カ月の貯蔵後、製剤を完全に再懸濁するために必要とされる振とう回数によって測定した。２週間および３カ月の貯蔵後、バイアルに充填されたすべての製剤を再懸濁するために要した振とうは５回未満であった。水平に貯蔵した場合、ＰＦＳ中のＧＢＳ６低用量製剤も、３カ月の貯蔵後、３回の振とうしか必要としなかった。しかしながら、低用量製剤は、２週間または３カ月いずれの貯蔵でも、先端を下にして貯蔵されたＰＦＳ中で再懸濁するために、約１５回の振とうを必要とした。比較すると、ＰＦＳ中の高用量製剤は、貯蔵のための配向に関わりなく、再懸濁することが困難であった。ＧＢＳ６高用量製剤は、水平貯蔵であっても、５０回超の振とうを必要とした。加えて、高用量製剤を再懸濁するために必要とされる振とう回数は、経時的に増大した。充填（Ｔ０）後最大１６時間にわたって先端を下にして貯蔵されたＰＦＳ中でＧＢＳ６高用量製剤を完全に再懸濁するためには、１００回前後の振とうが必要とされ、３カ月の貯蔵では２００回超の振とうまで増大した。最後に、血清型Ｉａ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の多糖コンジュゲートを使用して調製された一部の一価製剤は、両方の配向で貯蔵されたＰＦＳ中で再懸濁することが困難であり、経時的に再懸濁するためにさらなる振とうを必要とし、一価製剤の再懸濁挙動が血清型特異的であることを示唆していた。Ｔ０、２週間および３カ月における、先端を下にした配向でＰＦＳ中に貯蔵した高および低用量のＧＢＳ６および一価製剤の再懸濁を比較するデータを、図２６に示す。先端を下にしたおよび水平配向でＰＦＳ中に貯蔵した高および低用量のＧＢＳ６および一価製剤の再懸濁を比較するデータを、図２７に示す。
バイアル、先端を下にした配向のＰＦＳおよび水平配向のＰＦＳ中での貯蔵延長によって再懸濁が影響を受けるか否かを決定するために、高および低用量のＧＢＳ６製剤をさらに試験した。加えて、低および高用量製剤と比較するために、中用量（１２０ｍｃｇ／ｍＬの総用量の多糖－タンパク質コンジュゲート）製剤も試験した。低用量製剤は、先端を下にした配向のＰＦＳ中での６カ月の貯蔵後、再懸濁することがより困難になり、５０回超の振とうを必要とすることが発見された。中用量製剤は、先端を下にした配向のＰＦＳ中でわずか１カ月の貯蔵後、再懸濁することが困難であり、水平配向のＰＦＳ中で１カ月後、再懸濁するために３０回の振とうを必要とした。結果を表３７に示す。
Figure 0007295206000050
これらの研究から、再懸濁に関連する困難は、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含むｐＨ６．５の製剤を、バイアルまたはＰＦＳ中、水平様式で貯蔵することによって緩和できることが決定された。しかしながら、再懸濁は、製剤が６０ｍｃｇ／ｍｌ以下の多糖－タンパク質コンジュゲートの総用量を有するならば、水平配向のＰＦＳ中で貯蔵された製剤については、許容限界内（すなわち、１０回未満の振とう）に留まるであろう。
再懸濁に対する３つの物理的特性の効果を試験するために、追加の研究を実行した：（１）ゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して表面電荷またはゼータ電位、（２）マスターサイザー３０００レーザー回折粒径分析器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して粒径、および（３）ＬＵＭＩＳＩＺＥＲ（登録商標）分散分析器（Ｌ．Ｕ．Ｍ．ＧｍｂＨ）を使用して沈殿または沈降速度。ｐＨの関数としての、ＡｌＰＯ４ならびにＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来のコンジュゲートのゼータ電位を、それぞれ図２８および２９に示す。種々のＧＢＳ６および一価ＧＢＳ製剤のゼータ電位および粒径を、表３８にまとめる。１５の製剤のゼータ電位値は、約－７から－１０ｍＶであった。これらの試料について、表面電荷と再懸濁との間に相関関係は認められなかった。他方では、再懸濁は粒径によって影響を受けた。低用量製剤の粒径は、ＧＢＳ６および一価調製物における高用量製剤のものよりも大きく、概して、粒径が小さくなればなるほど、製剤を均一に再懸濁することがより困難になった。
Figure 0007295206000051
時間０、２週間および３カ月における、製剤中のアルミニウム粒子について、沈殿速度を測定した。高用量製剤は、低用量製剤よりも低い沈殿速度を示した。沈殿速度は、５℃で３カ月の貯蔵後、変化しなかった。再懸濁と沈殿速度との間には直接的な相関関係が認められ、沈殿速度が速くなればなるほど、製剤は再懸濁することが簡単になった。その上、高用量製剤より大きい粒径を有する低用量製剤は、より速い沈殿速度およびより簡単な再懸濁を実証した。データを図３０に示す。
（実施例１８）
沈殿速度に対するＧＢＳ６製剤因子の効果
再懸濁特徴に対する、抗原濃度、ｐＨおよび塩濃度等の製剤因子の影響を研究した。最初に、ｐＨ６．５のヒスチジン緩衝剤中、種々の抗原濃度のＧＢＳ６製剤を調査した。この研究からのデータは、より高い抗原濃度がより短い沈降速度につながることを実証し（図３１を参照、各血清型について投薬量を示す）、これは再懸濁において困難を引き起こすと予想される。低濃度では、粒子は、衝突および／またはブラウン運動によって互いに干渉することなく、自由に沈降することができる。
第二に、ｐＨ６．０、６．５および７．０のヒスチジン緩衝剤中、６０ｍｃｇ／ｍＬおよび３００ｍｃｇ／ｍＬの総抗原濃度のＧＢＳ６製剤の沈殿挙動を調査した。６０ｍｃｇ／ｍＬのＧＢＳ６製剤の沈殿挙動は、ｐＨが沈殿速度に対して有意な効果を有することを示した。しかしながら、ｐＨは、３００ｍｃｇ／ｍＬのＧＢＳ６製剤の沈殿速度に対しては有意な効果を有さなかった。データを図３２に示す。ｐＨを７．０からｐＨ６．０に減少させると、ＡｌＰＯ４の表面電荷は－１０．３ｍＶから－７．９ｍＶに減少した（データは示されていない）。典型的には、高いゼータ電位は、粒子間に存在する支配的な斥力により、粒子が媒体中に完全に分散していることを示すと予想される。この場合、粒子は懸濁液中に別個の実体として存在し、沈殿速度は、粒径の広範な分布により、多くの場合遅く、粒子を異なる速度で沈降させる。
最後に、ＡｌＰＯ４の物理化学的特性に対するイオン強度の効果および懸濁液特性に対するその後の影響も検査した。ＧＢＳ６製剤は、３つの異なる用量レベル（６０ｍｃｇ／ｍＬ、１５０ｍｃｇ／ｍＬおよび２０ｍｃｇ／ｍＬの総抗原）および２つの異なるＮａＣｌ濃度（２２ｍＭおよび１５０ｍＭ）で調製した。塩濃度が低くなると、ゼータ電位値はより負になった。最小塩濃度（２２ｍＭ）を持つ３つの用量のＧＢＳ６製剤は、いずれも負に帯電していた。ゼータ電位値は、約－１６から約－１７ｍＶであった。比較すると、１５０ｍＭのＮａＣｌを加えた高および低用量ＧＢＳ６製剤は、約－８ｍＶである。より高い塩濃度は、表面電荷を低減させ、沈降速度を加速させており、これは、再懸濁を改善し得る。データを図３３および表３９に示す。
Figure 0007295206000052
（実施例１９）
異なる抗原およびアルミニウム塩の再懸濁挙動
抗原濃度と製剤を再懸濁する際の困難との間の相関関係が、ＧＢＳ、またはタンパク質、多糖および非ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート等の他の抗原の一般的な属性に特異的であるのかをさらに調査するために、研究を行った。ＣＲＭ１９７を含む製剤；ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の多糖の組合せ；ＢＳＡ；または２０の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲート（２０ｖＰｎＣ）の組合せを、実施例１７および１８において試験したＧＢＳ製剤と同じ緩衝剤マトリックスおよび０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４アジュバント中、同じ高用量（２４０ｍｃｇ／ｍＬの総抗原）で製剤化した。ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ／Ｓ）を用いて製剤化したＧＢＳ６も、コンパレーターとして包含されていた。試料を、下記の属性について試験した：１）再懸濁時間（２００ｒｐｍで３０～４５分遠心分離後、手動シェイカーを使用して、１．５ｍＬの遠心管中でペレットを再懸濁するために必要とされる時間）、２）目視観察によるシリンダー中での沈降（異なる時間間隔での沈殿床高さ）、３）粒径、４）表面電荷、および５）ＭＩＣＲＯ－ＦＬＯＷ ＩＭＡＧＩＮＧ（登録商標）（ＭＦＩ）フローＤＰＡ４２００顕微鏡（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用する粒径分布。
異なる抗原は、多様な沈降および再懸濁挙動を実証した（データをそれぞれ図３４および表４０に示す）。より早く沈降した製剤は、先に認められた通り、再懸濁することがより簡単であった。再懸濁と平均粒径または粒径分布との間に相関関係は認められなかった。粒径分布データを図３５Ａおよび３５Ｂに示す。しかしながら、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５を含むＧＢＳ６製剤は、再懸濁することが最も簡単であり、有意に大きい粒径、より速い沈降速度および低い表面電荷を示し、粒径および表面電荷が再懸濁と相関することを示唆していた。水酸化アルミニウムはｐＨ６．５で正に帯電しており、一方、コンジュゲートは負に帯電しており、強い静電相互作用および電荷のより高い中和につながることに留意すべきである。それに反して、ＡｌＰＯ４は、ｐＨ６．５で負に帯電している。
Figure 0007295206000053
（実施例２０）
デバイス配置の修正
研究は、製剤が、バイアル中で簡単に再懸濁するがＰＦＳ中ではせず、それらはいずれも１型ガラスから作製されており、ゴムストッパーを使用することを示した。しかしながら、２つの系の間の主な差異は、製剤の自由混合を可能にする、利用可能なヘッドスペースであり、これは、より均一に再懸濁された生成物につながる。したがって、ＰＦＳ中のより高いヘッドスペースがさらなる混合を可能にするか否かを理解するために、ＰＦＳ中での再懸濁に影響を及ぼす因子として、ヘッドスペースの効果を調査した。シリンジに高用量ＧＢＳ６製剤を（ＡｌＰＯ４とともに）充填し、様々なヘッドスペース（２ｍｍ、６ｍｍおよび１０ｍｍ；図３６に示す）を設けてストッパーをし、水平配向で２～８℃にて貯蔵した。２週間の貯蔵時間後、再懸濁挙動（振とう回数）を試験した。データは、ヘッドスペースを増大させることにより、再懸濁に必要とされる振とう回数が減少することを示した。データを表４１に示す。再懸濁の簡単さは、より簡単な混合を可能にするより高いヘッドスペースによる、乱流の増大に起因していた。この挙動は、バイアル中でも明白であり、（より大きいヘッドスペースによる）いかなる再懸濁の課題も示さない。
Figure 0007295206000054
（実施例２１）
アルミニウム濃度の影響
製剤を再懸濁する能力に対するアルミニウム濃度の影響を決定するために、研究を行った。これは、ＡｌＰＯ４濃度の減少とともにＧＢＳ６製剤を評価することによって為された。ＧＢＳ６製剤は、０．５～０．０５ｍｇ／ｍＬの範囲のアルミニウムレベルの濃度を持つ同じ緩衝剤マトリックス中、高用量（２４０ｍｃｇ／ｍＬの総抗原）で調製した。試料を、ＢＤ ＨＹＰＡＫ ＳＣＦ（商標）ＰＲＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の１ｍＬの短いガラスＰＦＳに０．５８ｍＬの充填体積で充填し、４４３２／５０ストッパー（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でキャップし、約０．４ｍｍのヘッドスペースを保ち、水平に貯蔵した。再懸濁を、５℃にて０、１、２および４週間で試験した。個々の製剤における血清型のそれぞれについての全および結合抗原性を、血清型特異的ポリクローナル抗体を使用する比濁法によって分析した。
アルミニウムレベルの減少は再懸濁に対してプラスの効果を有していたが、０．３ｍｇ／ｍＬのアルミニウムを加えた製剤は、Ｔ０では２０回超の振とう、２週間では５０回超の振とうを依然として必要とした。０．０５ｍｇ／ｍＬのアルミニウムを含有する製剤は、２週間の水平貯蔵後、約２０回の振とうを必要とした。データを図３７に示す。
アルミニウムと結合している抗原の量の減少も認められた。データを図３８に示す。
（実施例２２）
異なる凝結剤のスクリーニング
微粒子を伴う懸濁液は、遅い沈降速度を示し、再懸濁することを困難または不可能にすると予想される、低体積高密度の沈降をもたらすことになる。再懸濁特性は、懸濁粒子上の表面電荷を中和するために凝結剤を添加する等の薬学的操作によって制御することができ、より大きい粒子綿状団粒、またはクラスターの形成を可能にし、それ故、沈殿速度を増大させ、再懸濁を改善する。非凝結および凝結懸濁液間の沈殿挙動における差異を、表４２に例証する。
Figure 0007295206000055
ＧＢＳ６製剤への凝結剤の組み込みを、再懸濁特性を改善するためのアプローチとして採用した。下記の凝結剤およびアルミニウムベースの塩を、高用量ＧＢＳ６製剤の沈殿速度および再懸濁に対するそれらの効果について評価した：
凝結剤：
１． ＧＢＳ６対照（２０ｍＭのＨｉｓ緩衝剤、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含むｐＨ６．５のＧＢＳ６）
２． 硫酸アンモニウム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）
３． 硫酸アンモニウムおよびＫＣｌ（０．２５ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍＭ）
４． ＣａＣｌ２（０．２５ｍｇ／ｍＬ）
５． ＳＤＳ（１％）
６． リン酸カリウム（５０ｍＭ）
７． ＮａＣｌ（１Ｍ）
アルミニウムベースの塩：
１． ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ／Ｓ）［Ａｌ（ＯＨ）３；０．２５ｍｇ／ｍＬ］
２． ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ／Ｓ）（０．５ｍｇ／ｍＬ）
３． ＡｌＰＯ４およびＡｌ（ＯＨ）３（０．２５ｍｇ／ｍＬずつの１：１混合物）
２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を、上記に挙げた凝結剤の１つまたは上記に挙げたアルミニウムベースの塩の１つのいずれかとともに含む、ｐＨ６．５の高用量（２４０μｇ／ｍＬ）のＧＢＳ６製剤を調製した。試料を、加速再懸濁時間（試料を、１．５ｍＬの遠心管中、２００ｒｐｍで４５分間にわたって回転させた後）、沈降速度、粒径、表面電荷、ならびに全および結合コンジュゲートについて試験した。
試験したすべての凝結剤の中でも、ＮａＣｌおよびリン酸カリウムは、ＧＢＳ６対照の１８０秒と比較して、再懸濁時間を２０秒未満まで大きく低減させることができた。データを図３９および表４２に示す。これらの２つの試料の沈降速度も、カルシウムもしくはアンモニウム塩またはＳＤＳを加えた他の製剤よりも速かった。データを図４０に示す。１Ｍ ＮａＣｌを含有する製剤は、凝結の理論に基づいて予測された通り、大きい粒径および低い表面電荷を有していた。しかしながら、５０ｍＭのリン酸塩を含有する試料では同じことが認められず、リン酸塩がＮａＣｌとは異なる機構を介して再懸濁を容易にしたことを示唆していた。データを表４２に示す。
試験した２つのアルミニウム塩の中でも、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５は、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）よりも優れた再懸濁挙動を実証した。ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５を含有する製剤についての主要な懸案事項は、抗原との、ＡｌＰＯ４と比較して高い結合強度によって示される通り、抗原と密接に結合することである。データを表４３に示す。この現象は、ワクチンの免疫応答に対して不利な影響を有することが報告されている。Ｅｇａｎ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７：３１７５～３１８０（２００９）。
Figure 0007295206000056
（実施例２３）
ＮａＣｌおよびリン酸塩レベルの最適化
ＮａＣｌおよびリン酸カリウムの濃度を、所望の再懸濁特徴だけでなく、ワクチンの反応源性および効能に関連する２つの重要な側面である、オスモル濃度およびアルミニウムとの抗原結合等の他の属性も満たすと予想されるレベルに最適化するために、研究を行った。
様々な濃度のＮａＣｌ（１５０～６９０ｍＭ）、２０ｍＭのヒスチジン、０．０２％のＰＳ８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含む、ｐＨ６．５の高用量（２４０ｍｃｇ／ｍＬの総抗原）のＧＢＳ６製剤を調製した。２つの塩の組合せ効果を調査するために、様々なリン酸カリウム濃度（１０～５０ｍＭ）および２つの異なるＮａＣｌ濃度（１５０ｍＭおよび２４０ｍＭ）を含む製剤も調製した。製剤化されたバルク試料を、沈降速度、遠心分離後の再懸濁時間、粒径および表面電荷について試験した。
ＮａＣｌ濃度を増大させることにより、再懸濁時間が有意に低減した。データを図４１に示す。３００ｍＭのＮａＣｌで再懸濁時間の急激な減少があり、製剤が脱凝結から凝結状態になり、３００ｍＭのＮａＣｌ濃度がこの遷移のための臨界凝集濃度（ＣＣＣ）であることを示唆していた。ＣＣＣは、１０ｍＭ以上のリン酸塩の存在下では２４０ｍＭに低減し、ＮａＣｌおよびリン酸塩との相乗効果があったことを示唆していた。データを図４２に示す。図４３Ａおよび４３Ｂに示す通り、１０～３０ｍＭのリン酸塩を２４０ｍＭのＮａＣｌとともに含有する試料を用いて、速い沈降および凝結沈殿物が認められた。ゼータ電位および粒径データは、ＮａＣｌ濃度の増大が、表面電荷の低減および粒径の増大につながることを明らかにし、これは、凝結理論を裏付けるものであった。この傾向は、リン酸塩では明らかでなかった。データを表４４に示す。この研究からの結果に基づき、２４０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのリン酸塩を最適な標的濃度とみなした。
Figure 0007295206000057
４０ｍｃｇ／ｍＬの多糖濃度の各血清型（２４０ｍｃｇ／ｍＬの総抗原）、２０ｍＭのリン酸塩、２４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含む、ｐＨ６．５の３つのバッチのＧＢＳ６製剤を、さらに特徴付けた。２０ｍＭのＨｉｓ緩衝剤、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含むｐＨ６．５のＧＢＳ６の製剤を、対照として包含した。追加のＮａＣｌおよびリン酸塩を加えたｐＨ６．５の３つの製剤はすべて、１６秒の平均再懸濁時間（対照の１２０秒と比較して）および５００ｍＯｓｍを上回るオスモル濃度で簡単な再懸濁を実証した。結合抗原性は、血清型のそれぞれについて、対照より約２０％低かった。データを表４５に示す。
Figure 0007295206000058
（実施例２４）
２４０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのリン酸塩を含有するＧＢＳ６製剤の短期安定性
２０ｍＭのリン酸塩、２４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のポリソルベート８０および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含む、ｐＨ６．５の３つの用量（６０ｍｃｇ／ｍＬ、１２０ｍｃｇ／ｍＬおよび２４０ｍｃｇ／ｍＬの総抗原）のＧＢＳ６製剤を、ＢＤ ＨＹＰＡＫ ＳＣＦ（商標）ＰＲＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の１ｍＬの短いガラスＰＦＳに０．５８ｍＬの充填体積で充填し、４４３２／５０ストッパー（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でキャップし、約０．４ｍｍのヘッドスペースを保った。先端を下にしたおよび水平配向両方の再懸濁を、室温で１カ月間および５℃で３カ月間にわたって、安定性についてモニターした。
１カ月のデータは、水平に貯蔵されたＰＦＳが、３つの用量レベルすべてについて、１０回以下の振とうで再懸濁され得ることを示した。しかしながら、先端を下にして貯蔵されたＰＦＳは、４０回以上の振とうを依然として必要とした。データを表４６に示す。各血清型の全抗原性およびＡｌＰＯ４との結合は、室温で１カ月間にわたって安定であった。データを表４７に示す。
Figure 0007295206000059
Figure 0007295206000060
（実施例２５）
ＰＦＳ中の凝結剤を加えたＧＢＳ製剤のための実験計画法（ＤｏＥ）およびクオリティ・バイ・デザイン（ＱｂＤ）概念の適用
ＰＦＳに最適なＧＢＳ６製剤を決定するために、実験計画法（ＤｏＥ）を実施した。応答曲面法（ボックスベーンケン計画）を使用して、３つの因子を評価した：１）ｐＨ（６．０、６．５および７．０）、２）ＮａＣｌ濃度（２２０ｍＭ、２４０ｍＭおよび２６０ｍＭ）、および３）リン酸塩濃度（１５ｍＭ、２０ｍＭおよび２５ｍＭ）。すべての製剤は、他には、２４０ｍｇ／ｍＬ用量（６０ｕｇ／ｍＬの各血清型、０．０２％のＰＳ８０、原薬から持ち越された約１０ｍＭのヒスチジン、および０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌＰＯ４）を含んでいた。合計１５の製剤を、再懸濁の簡単さについて調査した（表４８を参照）。
Figure 0007295206000061
あらゆる関連変動を説明するために、研究は、３連でおよび２名のオペレーターによって実行した。試料を、ＢＤ ＨＹＰＡＫ ＳＣＦ（商標）ＰＲＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の１ｍＬの短いガラスＰＦＳに０．５８ｍＬの充填体積で充填し、４４３２／５０ストッパー（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でキャップし、約０．４ｍｍのヘッドスペースを保った。充填したシリンジを、２～８℃および２５℃で３カ月間にわたって水平に貯蔵した。再懸濁を５℃でのみモニターし、比濁法による強度を、５℃および２５℃でモニターした。再懸濁結果を表４９に示す。
Figure 0007295206000062
ＪＭＰ統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、データを分析し、再懸濁するために１０回以下の振とうを必要と予想される最適かつ最も強固な製剤を予測した。オペレーターのうちの１名についての再懸濁データに基づくＪＭＰからの予測プロファイラーを、図４５に示す。ｐＨおよび塩は、振とう回数に影響を及ぼした有意な個々の要因であった。加えて、リン酸塩とｐＨとの間の相互作用が有意であった。望ましさ指数に基づき、下記の条件が、より簡単な再懸濁（振とう回数１０回以下）を可能にした：ｐＨ７．０±０．５、２４５±２０ｍＭのＮａＣｌおよび２０±５ｍＭのリン酸塩。第２のオペレーターからのデータを分析した際にも、同様の結果を取得した。
しかしながら、推奨される製剤パラメーターによれば、結合の程度は低かった。図４６に示す通り、ＧＢＳ血清型のそれぞれについて、コンジュゲートの結合は、１０～２０％の間で変動した。加えて、推奨される製剤は、より高いオスモル濃度（約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有していたが、依然として十分にワクチンの範囲内であった。
（実施例２６）
Ａｌ（ＯＨ）３ベースのＧＢＳ６製剤
実施例２２において記述されている通り、Ａｌ（ＯＨ）３を加えたＧＢＳ６製剤は、優れた再懸濁挙動を有していたが、抗原とのより高い結合強度を有しており、これは、免疫応答に対して不利な影響を有し得る。したがって、ＧＢＳコンジュゲートとのＡｌ（ＯＨ）３の結合を特徴付け、Ａｌ（ＯＨ）３の吸着強度を変調するために、実験を行った。
２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のＰＳ８０を含むｐＨ６．５の高用量（２４０ｍｃｇ／ｍＬの総コンジュゲート）のＧＢＳ６製剤を、様々な濃度のＡｌ（ＯＨ）３（０．７ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製した。比濁法により全および上清抗原性を測定することによって、結合を決定した。図４７に示す通り、Ａｌ（ＯＨ）３との結合は、６つすべての血清型について、０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌ（ＯＨ）３で横ばいになった。吸着容量および吸着係数は、ラングミュア式によって決定した。データを、コンパレーターとしてのＡｌＰＯ４についてのデータとともに、表５０に示す。
Figure 0007295206000063
Ａｌ（ＯＨ）３の結合強度を変調するために、製剤中の緩衝剤を、リン酸ナトリウムに変更して、水酸化アルミニウム上の表面ヒドロキシルをリン酸塩で置き換え、配位子交換を低減させた。１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰＳ８０および０．１５ｍｇ／ＭＬのＡｌ（ＯＨ）３を含むｐＨ６．５のＧＢＳ６製剤を、３つの異なるリン酸塩濃度（１０ｍＭ、２０ｍＭおよび３０ｍＭ）および種々の用量（１５ｍｃｇ／ｍＬ、３０ｍｃｇ／ｍＬ、６０ｍｃｇ／ｍＬ、９０ｍｃｇ／ｍＬ、１２０ｍｃｇ／ｍＬ、１５０ｍｃｇ／ｍＬおよび２１０ｍｃｇ／ｍＬの総コンジュゲート）で調製した。全および上清抗原性によって、結合を決定した。吸着容量および係数は、ラングミュア式によって決定した。データを、コンパレーターとしてのＡｌＰＯ４製剤についてのデータとともに、表５１に示す。
Figure 0007295206000064
Ａｌ（ＯＨ）３とのＧＢＳ６の結合容量および係数は、ＡｌＰＯ４とのものよりも３～４倍高かった。しかしながら、ＧＢＳ６との水酸化アルミニウムの吸着強度は、製剤にリン酸塩を導入することによって変調した。リン酸塩濃度は、吸着強度および容量に不利な影響を与えた。リン酸塩は、抗原結合パーセントにも影響を及ぼしたが、ＡｌＰＯ４のレベルを依然として上回っていた。加えて、ＧＢＳは、リン酸塩の存在下で、アルミニウムから完全に抽出することができた。結果に基づき、水酸化アルミニウムでは、２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．２％のＰＳ８０、ｐＨ６．５が最適であることが決定された。
本発明の態様
下記の条項は、本発明の追加の実施形態を記述するものである。
Ｃ１． Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）莢膜多糖と担体タンパク質とを含む免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートであって、前記莢膜多糖が、約６０％超のシアル酸レベルを有する、免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲート。
Ｃ２． 莢膜多糖が、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される、Ｃ１の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３． 莢膜多糖が血清型Ｉａである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４． 莢膜多糖が血清型Ｉｂである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ５． 莢膜多糖が血清型ＩＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ６． 莢膜多糖が血清型ＩＩＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ７． 莢膜多糖が血清型ＩＶである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ８． 莢膜多糖が血清型Ｖである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ９． 莢膜多糖が血清型ＶＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１０． 莢膜多糖が血清型ＶＩＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１１． 莢膜多糖が血清型ＶＩＩＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１２． 莢膜多糖が血清型ＩＸである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１３． 莢膜多糖が、約９５％超のシアル酸レベルを有する、Ｃ１～Ｃ１２のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１４． 莢膜多糖が、約１００％のシアル酸レベルを有する、Ｃ１～Ｃ１３のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１５． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１４のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１６． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１５のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１７． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１８． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１９． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１８のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２０． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１９のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２１． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ２０のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２２． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ２１のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２３． 莢膜多糖が、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ２２のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２４． 莢膜多糖が、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ２３のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２５． 莢膜多糖が、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ２４のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２６． 莢膜多糖が、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ２５のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２７． 莢膜多糖が、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ２６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２８． コンジュゲートの分子量が、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間である、Ｃ１～２７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２９． コンジュゲートの分子量が、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間である、Ｃ１～Ｃ２８のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３０． コンジュゲートの分子量が、約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間である、Ｃ１～Ｃ２９のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３１． 莢膜多糖が、約０％から約４０％の間、Ｏ－アセチル化されている、Ｃ１～Ｃ３０のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３２． 莢膜多糖が、約５％未満Ｏ－アセチル化されている、Ｃ１～Ｃ３１のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３３． 莢膜多糖が、約４％未満Ｏ－アセチル化されている、Ｃ１～Ｃ３２のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３４． 莢膜多糖が、約３％未満Ｏ－アセチル化されている、Ｃ１～Ｃ３３のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３５． 莢膜多糖が、約２％未満Ｏ－アセチル化されている、Ｃ１～Ｃ３４のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３６． 莢膜多糖が、約１％未満Ｏ－アセチル化されている、Ｃ１～Ｃ３５のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３７． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．１ｍＭのＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ３６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３８． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．２ｍＭのＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ３７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３９． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．３ｍＭのＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ３８のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４０． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．３５ｍＭのＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ３９のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４１． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．４ｍＭのＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ４０のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４２． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０１ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ４１のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４３． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０５ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ４２のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４４． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０４ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ４３のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４５． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０３ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ４４のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４６． 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０２ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む、Ｃ１～Ｃ４５のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４７． 多糖が、それぞれ独立して担体タンパク質とコンジュゲートしている、Ｃ１～Ｃ４６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４８． 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドである、Ｃ１～Ｃ４７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４９． 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、Ｃ１～Ｃ４８のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ５０． 莢膜多糖を単離する方法であって、有機試薬を、莢膜多糖生産菌を含む細胞ブロスと反応させるステップを含む方法。
Ｃ５１． 細菌を溶菌しない、Ｃ５０の方法。
Ｃ５２． 細菌を熱で死滅させる、Ｃ５０またはＣ５１の方法。
Ｃ５３． 遠心分離して細胞ペーストを提供するステップをさらに含む、Ｃ５０～Ｃ５２のいずれか一項の方法。
Ｃ５４． 濾過するステップをさらに含む、Ｃ５０～Ｃ５３のいずれか一項の方法。
Ｃ５５． 前記濾過するステップが、血液透析濾過である、Ｃ５４の方法。
Ｃ５６． 莢膜多糖生産菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）および大便レンサ球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される、Ｃ５０～Ｃ５５のいずれか一項の方法。
Ｃ５７． 細菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ５６の方法。
Ｃ５８． 前記有機試薬が、誘導体化ヒドロキシルアミン化合物である、Ｃ５０～Ｃ５７のいずれか一項の方法。
Ｃ５９． ヒドロキシルアミンが、実施例２の表２に収載された任意のヒドロキシルアミンである、Ｃ５０～５８のいずれか一項の方法。
Ｃ６０． ヒドロキシルアミンが、ジベンジルヒドロキシルアミン、ジエチルヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミン、エチレンジアミン、トリエチレンテトラミン、１，１，４，７，１０，１０ヘキサメチルトリエチレンテトラミンおよび２，６，１０，トリメチル２，６，１０トリアザウンデカンからなる群から選択される、Ｃ５０～Ｃ５９のいずれか一項の方法。
Ｃ６１． ヒドロキシルアミンの濃度が、約５ｍＭから約２００ｍＭである、Ｃ５０～Ｃ６０のいずれか一項の方法。
Ｃ６２． 反応のｐＨが、約５．５から約９．５である、Ｃ５０～Ｃ６１のいずれか一項の方法。
Ｃ６３． 反応が、約２０℃から約８５℃の温度で起こる、Ｃ５０～Ｃ６２のいずれか一項の方法。
Ｃ６４． 反応反応時間が、約１０時間から約９０時間である、Ｃ５０～Ｃ６３のいずれか一項の方法。
Ｃ６５． Ｃ１～Ｃ４９のいずれか一項の免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、莢膜多糖が、Ｃ５０～Ｃ６４のいずれか一項の方法に従って単離される方法。
Ｃ６６． Ｃ５０～Ｃ６４のいずれか一項の方法によって調製された莢膜多糖を含む、免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲート。
Ｃ６７． Ｃ１～Ｃ４９またはＣ６６のいずれか一項の免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
Ｃ６８． 多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＶならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む、免疫原性組成物。
Ｃ６９． 少なくとも１つの追加の血清型が、Ｉａである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ７０． ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９の免疫原性組成物。
Ｃ７１． ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９またはＣ７０の免疫原性組成物。
Ｃ７２． ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９～Ｃ７１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７３． ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９～Ｃ７２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７４． ＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９～Ｃ７３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７５． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９～７４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７６． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９～Ｃ７５のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７７． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ６９～Ｃ７６のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７８． 少なくとも１つの追加の血清型が、Ｉｂである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ７９． ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８の免疫原性組成物。
Ｃ８０． ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８またはＣ７９の免疫原性組成物。
Ｃ８１． ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８～Ｃ８０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８２． ＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８～Ｃ８１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８３． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８～Ｃ８２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８４． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８～Ｃ８３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８５． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ７８～Ｃ８４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８６． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＩＩである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ８７． ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ８６の免疫原性組成物。
Ｃ８８． ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ８６またはＣ８７の免疫原性組成物。
Ｃ８９． ＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ８６～Ｃ８８のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９０． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ８６～Ｃ８９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９１． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ８６～Ｃ９０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９２． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ８６～Ｃ９１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９３． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＩＩＩである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ９４． ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９３の免疫原性組成物。
Ｃ９５． ＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９３またはＣ９４の免疫原性組成物。
Ｃ９６． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９３～Ｃ９５のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９７． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９３～Ｃ９６のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９８． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９３～Ｃ９７のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９９． 少なくとも１つの追加の血清型が、Ｖである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ１００． ＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９９の免疫原性組成物。
Ｃ１０１． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９９またはＣ１００の免疫原性組成物。
Ｃ１０２． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９９～Ｃ１０１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１０３． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ９９～Ｃ１０２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１０４． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＶＩである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ１０５． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ１０４の免疫原性組成物。
Ｃ１０６． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ１０４またはＣ１０５の免疫原性組成物。
Ｃ１０７． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ１０４～Ｃ１０６のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１０８． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＶＩＩである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ１０９． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ１０８の免疫原性組成物。
Ｃ１１０． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ１０８またはＣ１０９の免疫原性組成物。
Ｃ１１１． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＶＩＩＩである、Ｃ６８の免疫原性組成物。
Ｃ１１２． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ１１１の免疫原性組成物。
Ｃ１１３． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＩＸである、Ｃ１１２の免疫原性組成物。
Ｃ１１４． 多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ由来の莢膜多糖を含む、免疫原性組成物。
Ｃ１１５． 多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ由来の莢膜多糖を含む、免疫原性組成物。
Ｃ１１６． 多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の莢膜多糖を含む、免疫原性組成物。
Ｃ１１７． Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも４つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
Ｃ１１８． 少なくとも５つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ１１７の免疫原性組成物。
Ｃ１１９． 少なくとも６つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ１１７またはＣ１１８の免疫原性組成物。
Ｃ１２０． 少なくとも７つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ１１７～Ｃ１１９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２１． 少なくとも８つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ１１７～Ｃ１２０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２２． 少なくとも９つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ１１７～Ｃ１２１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２３． ＧＢＳ莢膜多糖血清型Ｖを含む、Ｃ１１７～Ｃ１２２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２４． 免疫干渉を有さない、Ｃ１１７～Ｃ１２３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２５． 薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、担体、またはそれらの混合物をさらに含む、Ｃ６７～Ｃ１２４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２６． 緩衝剤をさらに含む、Ｃ６７～Ｃ１２５のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１２７． 緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩からなる群から選択される、Ｃ１２６の免疫原性組成物。
Ｃ１２８． 緩衝剤が、ヒスチジンである、Ｃ１２７の免疫原性組成物。
Ｃ１２９． 界面活性剤をさらに含む、Ｃ６７～Ｃ１２８のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１３０． 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－２０およびポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される、Ｃ１２９の免疫原性組成物。
Ｃ１３１． 界面活性剤が、ポリソルベート－８０である、Ｃ１３０の免疫原性組成物。
Ｃ１３２． 賦形剤をさらに含む、Ｃ６７～Ｃ１３１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１３３． 賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される、Ｃ１３２の免疫原性組成物。
Ｃ１３４． 賦形剤が、塩化ナトリウムである、Ｃ１３３の免疫原性組成物。
Ｃ１３５． アジュバントをさらに含む、Ｃ６７～Ｃ１３４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１３６． アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントまたはＱＳ－２１である、Ｃ１３５の免疫原性組成物。
Ｃ１３７． アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシルホスフェートおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、Ｃ１３６の免疫原性組成物。
Ｃ１３８． アジュバントが、リン酸アルミニウムである、Ｃ１３７の免疫原性組成物。
Ｃ１３９． アジュバントが、アルミニウムヒドロキシルホスフェートである、Ｃ１３８の免疫原性組成物。
Ｃ１４０． 緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている、Ｃ６７～Ｃ１３９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４１． ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている、Ｃ６７～Ｃ１４０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４２． 約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含む、Ｃ６７～Ｃ１４１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４３． 約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌの用量を含む、Ｃ６７～Ｃ１４２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４４． 場合により少なくとも１つの賦形剤の存在下で、凍結乾燥される、Ｃ６７～Ｃ１４３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４５． 少なくとも１つの賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される、Ｃ１４４の免疫原性組成物。
Ｃ１４６． 少なくとも１つの賦形剤が、スクロースである、Ｃ１４５の免疫原性組成物。
Ｃ１４７． 約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の少なくとも１つの賦形剤を含む、Ｃ１４４～Ｃ１４６のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４８． 追加の賦形剤を含む、Ｃ１４４～Ｃ１４７のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１４９． 追加の賦形剤が、マンニトールまたはグリシンである、Ｃ１４８の免疫原性組成物。
Ｃ１５０． 約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の追加の賦形剤を含む、Ｃ１４８またはＣ１４９の免疫原性組成物。
Ｃ１５１． 水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水で再溶解される、Ｃ１４３～Ｃ１５０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１５２． 医薬として使用するための、Ｃ６７～Ｃ１５１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１５３． 対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、Ｃ６７～Ｃ１５２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１５４． 対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である、Ｃ１５３の免疫原性組成物。
Ｃ１５５． 女性が、妊娠後半期である、Ｃ１５４の免疫原性組成物。
Ｃ１５６． 妊娠中の女性が、少なくとも妊娠２０週である、Ｃ１５５の免疫原性組成物。
Ｃ１５７． 妊娠中の女性が、妊娠２７週から３６週である、Ｃ１５６の免疫原性組成物。
Ｃ１５８． 対象が、５０歳以上の成人である、Ｃ１５７の免疫原性組成物。
Ｃ１５９． 対象が、６５歳以上の成人である、Ｃ１５８の免疫原性組成物。
Ｃ１６０． 対象が、８５歳以上の成人である、Ｃ１５９の免疫原性組成物。
Ｃ１６１． 対象が、免疫不全である、Ｃ１５３～Ｃ１６０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１６２． 対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、Ｃ１６１の免疫原性組成物。
Ｃ１６３． Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ１５３～Ｃ１６２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１６４． Ｂ群レンサ球菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、有効量のＣ６７～Ｃ１５０のいずれか一項の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
Ｃ１６５． 対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量のＣ６７～Ｃ１５１のいずれか一項の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
Ｃ１６６． 対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である、Ｃ１６４またはＣ１６５の方法。
Ｃ１６７． 女性が、妊娠後半期である、Ｃ１６６の方法。
Ｃ１６８． 妊娠中の女性が、少なくとも妊娠２０週である、Ｃ１６６またはＣ１６７の方法。
Ｃ１６９． 妊娠中の女性が、妊娠２７週から３６週である、Ｃ１６６～Ｃ１６８のいずれか一項の方法。
Ｃ１７０． 対象が、５０歳以上の成人である、Ｃ１６４またはＣ１６５の方法。
Ｃ１７１． 対象が、６５歳以上の成人である、Ｃ１７０の方法。
Ｃ１７２． 対象が、８５歳以上の成人である、Ｃ１７０またはＣ１７１の方法。
Ｃ１７３． 対象が、免疫不全である、Ｃ１６４～Ｃ１７２のいずれか一項の方法。
Ｃ１７４． 対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、Ｃ１７３の方法。
Ｃ１７５． Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ１６４～Ｃ１７４のいずれか一項の方法。
Ｃ１７６． Ｃ１～Ｃ４９またはＣ６６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲートにおいて、莢膜多糖と結合する抗体。
Ｃ１７７． Ｃ１７６の抗体を含む組成物。
Ｃ１７８． 抗体を生成する方法であって、Ｃ６７～Ｃ１５１のいずれか一項の免疫原性組成物を、対象に投与するステップを含む方法。
Ｃ１７９． Ｃ１７８の方法によって生成された抗体。
Ｃ１８０． 対象に受動免疫を付与する方法であって、
（ａ）Ｃ６７～Ｃ１５１のいずれか一項の免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、
（ｂ）抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップと
を含む方法。
Ｃ１８１． Ｃ１～Ｃ４９またはＣ６６のいずれか一項の免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）ＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させて、活性化多糖をもたらすステップと、
（ｂ）活性化多糖を担体タンパク質と反応させて、多糖－タンパク質コンジュゲートをもたらすステップと
を含む方法。
Ｃ１８２． ステップ（ｂ）が、極性非プロトン性溶媒中で行われる、Ｃ１８１の方法。
Ｃ１８３． 溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される、Ｃ１８２の方法。
Ｃ１８４． 溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、Ｃ１８３の方法。
Ｃ１８５． 多糖を、０．０１から１０．０モル当量の酸化剤と反応させる、Ｃ１８１～Ｃ１８４のいずれか一項の方法。
Ｃ１８６． 酸化剤が、過ヨウ素酸塩である、Ｃ１８１～Ｃ１８５のいずれか一項の方法。
Ｃ１８７． 過ヨウ素酸塩が、過ヨウ素酸ナトリウムである、Ｃ１８６の方法。
Ｃ１８８． ステップ（ａ）の酸化反応が、１時間から５０時間の間である、Ｃ１８１～Ｃ１８７のいずれか一項の方法。
Ｃ１８９． 酸化反応の温度が、約２℃から約２５℃の間に維持される、Ｃ１８１～Ｃ１８８のいずれか一項の方法。
Ｃ１９０． 酸化反応が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびビス－トリスからなる群から選択される緩衝剤中で行われる、Ｃ１８１～Ｃ１８９のいずれか一項の方法。
Ｃ１９１． 緩衝剤が、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度を有する、Ｃ１９０の方法。
Ｃ１９２． 酸化反応が、約４．０から約８．０の間のｐＨで行われる、Ｃ１８１～Ｃ１９１のいずれか一項の方法。
Ｃ１９３． 酸化剤が、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）である、Ｃ１８１の方法。
Ｃ１９４． Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）が、共酸化剤である、Ｃ１９３の方法。
Ｃ１９５． ステップ（ａ）が、クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチするステップをさらに含む、Ｃ１８１～Ｃ１９４のいずれか一項の方法。
Ｃ１９６． 多糖の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間である、Ｃ１８２～Ｃ１９５のいずれか一項の方法。
Ｃ１９７． 活性化多糖の酸化度が、５から２５の間である、Ｃ１８１～Ｃ１９６のいずれか一項の方法。
Ｃ１９８． 活性化多糖を凍結乾燥するステップをさらに含む、Ｃ１８１～Ｃ１９７のいずれか一項の方法。
Ｃ１９９． 活性化多糖が、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットからなる群から選択される糖の存在下で凍結乾燥される、Ｃ１８８の方法。
Ｃ２００． ステップ（ｂ）が、
（１）活性化多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（２）配合された活性化多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含む、Ｃ１８１～Ｃ１９９のいずれか一項の方法。
Ｃ２０１． ステップ（２）における活性化多糖の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間である、Ｃ２００の方法。
Ｃ２０２． 活性化多糖対担体タンパク質の初期比（重量／重量）が、５：１から０．１：１の間である、Ｃ２００またはＣ２０１の方法。
Ｃ２０３． 還元剤が、ブレンステッドもしくはルイス酸、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）の存在下、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは亜鉛からなる群から選択される、Ｃ２００～Ｃ２０２のいずれか一項の方法。
Ｃ２０４． 還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである、Ｃ２０３の方法。
Ｃ２０５． 還元剤の分量が、約０．１から約１０．０モル当量の間である、Ｃ２００～Ｃ２０４のいずれか一項の方法。
Ｃ２０６． ステップ（２）の還元反応の持続時間が、１時間から６０時間の間である、Ｃ２００～Ｃ２０５のいずれか一項の方法。
Ｃ２０７． 還元反応の温度が、１０℃から４０℃の間に維持される、Ｃ２００～Ｃ２０６のいずれか一項の方法。
Ｃ２０８． 水素化ホウ素の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップ（ステップ（ｃ））をさらに含む、Ｃ１８１～Ｃ２０７のいずれか一項の方法。
Ｃ２０９． 水素化ホウ素の分量が、約０．１から約１０．０モル当量の間である、Ｃ２０８の方法。
Ｃ２１０． 水素化ホウ素が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素テトラブチルアンモニウム、水素化ホウ素カルシウムおよび水素化ホウ素マグネシウムからなる群から選択される、Ｃ２０８の方法。
Ｃ２１１． 水素化ホウ素が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である、Ｃ２０８の方法。
Ｃ２１２． キャップするステップの持続時間が、０．１時間から１０時間の間である、Ｃ２０７～Ｃ２１１のいずれか一項の方法。
Ｃ２１３． キャップするステップの温度が、約１５℃から約４５℃の間に維持される、Ｃ２０７～Ｃ２１２のいずれか一項の方法。
Ｃ２１４． 多糖－タンパク質コンジュゲートを精製するステップをさらに含む、Ｃ１８１～Ｃ２１３のいずれか一項の方法。
Ｃ２１５． 多糖－タンパク質コンジュゲートが、多糖の総量と比較して約４０％未満の遊離多糖を含む、Ｃ１８１～Ｃ２１４のいずれか一項の方法。
Ｃ２１６． コンジュゲート中における多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）が、約０．５から約３．０の間である、Ｃ１８１～Ｃ２１５のいずれか一項の方法。
Ｃ２１７． コンジュゲートのコンジュゲーションの程度が、２から１５の間である、Ｃ１８１～Ｃ２１６のいずれか一項の方法。
Ｃ２１８． 多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加によりステップ（ａ）の酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、
（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、
（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップと
を含み、
ここで、ステップ（ｃ）および（ｄ）はＤＭＳＯ中で行われる方法。
Ｃ２１９． 担体タンパク質とコンジュゲートしているＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖と、アルミニウムベースのアジュバントとを含む、免疫原性組成物。
Ｃ２２０． アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシルホスフェートおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、Ｃ２１９の免疫原性組成物。
Ｃ２２１． アジュバントが、リン酸アルミニウムである、Ｃ２１９またはＣ２２０の免疫原性組成物。
Ｃ２２２． アジュバントが、水酸化アルミニウムである、Ｃ２１９またはＣ２２０の免疫原性組成物。
Ｃ２２３． アルミニウムベースのアジュバントが、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度である、Ｃ２１９～Ｃ２２２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２２４． アルミニウムベースのアジュバントが、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度である、Ｃ２２３の免疫原性組成物。
Ｃ２２５． 莢膜多糖が、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される、Ｃ２１９～Ｃ２２４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２２６． 六価ＧＢＳコンジュゲート組成物である、Ｃ２１９～Ｃ２２５のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２２７． ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の莢膜多糖を含む、Ｃ２２５の免疫原性組成物。
Ｃ２２８． シリンジに充填される、Ｃ２１９～Ｃ２２７のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２２９． シリンジが、ガラスである、Ｃ２２８の免疫原性組成物。
Ｃ２３０． 約１ｍｍから約１５ｍｍのヘッドスペースを設けてシリンジに充填される、Ｃ２１９～Ｃ２２９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２３１． 約２ｍｍから約６ｍｍのヘッドスペースを設けてシリンジに充填される、Ｃ２３０の免疫原性組成物。
Ｃ２３２． 約５０回以下の振とうで再懸濁される、Ｃ２１９～Ｃ２３１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２３３． 約１０回以下の振とうで再懸濁される、Ｃ２３２の免疫原性組成物。
Ｃ２３４． リン酸塩をさらに含む、Ｃ２１９～Ｃ２３３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２３５． リン酸塩が、約１５ｍＭから約２５ｍＭの濃度である、Ｃ２３４の免疫原性組成物。
Ｃ２３６． リン酸塩が、約２０ｍＭの濃度である、Ｃ２３５の免疫原性組成物。
Ｃ２３７． 塩化ナトリウムをさらに含む、Ｃ２１９～Ｃ２３６のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２３８． 塩化ナトリウムが、約１０ｍＭから約３５０ｍＭの濃度である、Ｃ２１９～Ｃ２３７の免疫原性組成物。
Ｃ２３９． 塩化ナトリウムが、約２２５ｍＭから約２６５ｍＭの濃度である、Ｃ２３８の免疫原性組成物。
Ｃ２４０． 塩化ナトリウムが、約２４０ｍＭの濃度である、Ｃ２３９の免疫原性組成物。
Ｃ２４１． 塩化ナトリウムが、約２００ｍＭの濃度である、Ｃ２１９～Ｃ２３８の免疫原性組成物。
Ｃ２４２． 塩化ナトリウムが、約１５０ｍＭの濃度である、Ｃ２４１の免疫原性組成物。
Ｃ２４３． 約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含む、Ｃ２１９～Ｃ２４２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２４４． 総コンジュゲート用量が、約１２０ｍｇ／ｍｌから約２４０ｍｃｇ／ｍｌである、Ｃ２４３の免疫原性組成物。
Ｃ２４５． 約６．５から約７．５のｐＨを有する、Ｃ２１９～Ｃ２４４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２４６． 約７．０のｐＨを有する、Ｃ２４５の免疫原性組成物。
Ｃ２４７． 約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸アルミニウム、約１５ｍＭから約２５ｍＭのリン酸塩、約２２５ｍＭから約２６５ｍＭの塩化ナトリウム、および約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含む免疫原性組成物であって、約６．５から約７．５のｐＨを有する、免疫原性組成物。
Ｃ２４８． 約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、約１５ｍＭから約２５ｍＭのリン酸塩、約１２０ｍＭから約１７０ｍＭの塩化ナトリウム、および約６０ｍｃｇ／ｍｌから約３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含む免疫原性組成物であって、約６．５から約７．５のｐＨを有する、免疫原性組成物。
Ｃ２４９． 医薬として使用するための、Ｃ２１９～２４８のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２５０． 対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、Ｃ２１９～２４９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２５１． 対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である、Ｃ２５０の免疫原性組成物。
Ｃ２５２． 女性が、妊娠後半期である、Ｃ２５１の免疫原性組成物。
Ｃ２５３． 妊娠中の女性が、少なくとも妊娠２０週である、Ｃ２５２の免疫原性組成物。
Ｃ２５４． 妊娠中の女性が、妊娠２７週から３６週である、Ｃ２５３の免疫原性組成物。
Ｃ２５５． 対象が、５０歳以上の成人である、Ｃ２５０の免疫原性組成物。
Ｃ２５６． 対象が、６５歳以上の成人である、Ｃ２５５の免疫原性組成物。
Ｃ２５７． 対象が、８５歳以上の成人である、Ｃ２５６の免疫原性組成物。
Ｃ２５８． 対象が、免疫不全である、Ｃ２５０～Ｃ２５７のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２５９． 対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、Ｃ２５８の免疫原性組成物。
Ｃ２６０． Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ２５０～２５９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ２６１． Ｂ群レンサ球菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、有効量のＣ２１９～Ｃ２４８のいずれか一項の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
Ｃ２６２． 対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量のＣ２１９～Ｃ２４８のいずれか一項の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
Ｃ２６３． 対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である、Ｃ２６１またはＣ２６２の方法。
Ｃ２６４． 女性が、妊娠後半期である、Ｃ２６３の方法。
Ｃ２６５． 妊娠中の女性が、少なくとも妊娠２０週である、Ｃ２６３またはＣ２６４の方法。
Ｃ２６６． 妊娠中の女性が、妊娠２７週から３６週である、Ｃ２６３～２６５のいずれか一項の方法。
Ｃ２６７． 対象が、５０歳以上の成人である、Ｃ２６１またはＣ２６２の方法。
Ｃ２６８． 対象が、６５歳以上の成人である、Ｃ２６７の方法。
Ｃ２６９． 対象が、８５歳以上の成人である、Ｃ２６７またはＣ２６８の方法。
Ｃ２７０． 対象が、免疫不全である、Ｃ２６１～Ｃ２６９の方法。
Ｃ２７１． 対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、Ｃ２７０の方法。
Ｃ２７２． Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ２６１～Ｃ２７１のいずれか一項の方法。
Ｃ２７３． 抗体を生成する方法であって、Ｃ２１９～Ｃ２４８のいずれか一項の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法。
Ｃ２７４． Ｃ２７３の方法によって生成される抗体。
Ｃ２７５． 対象に受動免疫を付与する方法であって、
（ａ）Ｃ２１９～Ｃ２４８のいずれか一項の免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、
（ｂ）抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップと
を含む方法。

Claims (32)

  1. 多糖－担体タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、
    （ｉ）前記コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ由来の莢膜多糖を含み、
    （ｉｉ）前記組成物が、薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤および界面活性剤をさらに含み、
    緩衝剤がリン酸塩およびヒスチジンからなる群から選択される、免疫原性組成物。
  2. 莢膜多糖が、同じ担体タンパク質と個々にコンジュゲートしている、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. 六価ＧＢＳコンジュゲート組成物である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  4. 賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  5. 賦形剤が塩化ナトリウムである、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  6. 塩化ナトリウムが１０ｍＭから３５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の免疫原性組成物。
  7. 塩化ナトリウムが２２５ｍＭから２６５ｍＭの濃度である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
  8. 塩化ナトリウムが２４０ｍＭの濃度で存在する、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  9. 塩化ナトリウムが２００ｍＭの濃度で存在する、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  10. 塩化ナトリウムが１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  11. 緩衝剤がヒスチジンである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  12. 緩衝剤が１５ｍＭから２５ｍＭの濃度で存在するリン酸塩である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  13. 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－２０およびポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  14. 界面活性剤がポリソルベート－８０である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
  15. さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  16. アジュバントがアルミニウムベースのアジュバントである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
  17. アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシルホスフェートおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
  18. アジュバントが、リン酸アルミニウムである、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
  19. アジュバントが、水酸化アルミニウムである、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
  20. アルミニウムベースのアジュバントが、０．２５ｍｇ／ｍｌから０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
  21. アルミニウムベースのアジュバントが、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
  22. 組成物がヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含む、請求項１～１１、１５～１８、２０および２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  23. 組成物が１０ｍＭから２５ｍＭのヒスチジン、０．０１％から０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、１０ｍＭから２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により０．２５ｍｇ／ｍｌから０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含む、請求項１～６および１５～１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  24. シリンジに充填されている、請求項１から２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  25. シリンジが、ガラスである、請求項２４に記載の免疫原性組成物。
  26. １ｍｍから１５ｍｍのヘッドスペースを設けてシリンジに充填される、請求項２４または２５に記載の免疫原性組成物。
  27. ２ｍｍから６ｍｍのヘッドスペースを設けてシリンジに充填される、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
  28. ５０回以下の振とうで再懸濁される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  29. １０回以下の振とうで再懸濁される、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
  30. ６０ｍｃｇ／ｍｌから３６０ｍｃｇ／ｍｌの総コンジュゲート用量を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  31. 総コンジュゲート用量が、１２０ｍｃｇ／ｍｌから２４０ｍｃｇ／ｍｌである、請求項３０に記載の免疫原性組成物。
  32. ６．５から７．５のｐＨを有する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
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