KR102545029B1

KR102545029B1 - 맑고 밝게된 무-코아굴로겐 리물루스 아메바세포 용해물

Info

Publication number: KR102545029B1
Application number: KR1020197023341A
Authority: KR
Inventors: 캔디스 스텀보흐; 레벤 타데쎄; 카렌 린
Original assignee: 론자 워커스빌 아이엔씨.
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2023-06-19
Also published as: JP7507560B2; CN110192110B; EP3552021A1; WO2018132562A1; CN110192110A; IL267593A; US20220267824A1; US11352656B2; US20180208964A1; KR20190104387A; JP2020505007A; EP3552021B1; JP2023002669A

Abstract

본 발명은 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)(여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다)을 포함하는 조성물, 및 상기와 같은 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 발색 분석을 사용하여 샘플 중 내독소를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 맑고 밝게된 LAL 및 발색성 기질을 포함하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 중 내독소 존재하에서의 상기 발색성 기질의 변화로부터 생성되는 발색 효과를 측정하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다. 본 발명은 또한 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 키트, 및 상기와 같은 키트의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

맑고 밝게된 무-코아굴로겐 리물루스 아메바세포 용해물

본 발명은 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(limulus amebocyte lysate, LAL)(여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다)을 포함하는 조성물, 및 상기 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 발색 분석(chromogenic assay)을 사용하여 샘플 중 내독소를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 맑고 밝게된(clarified) LAL 및 발색성 기질(chromogenic substrate)을 포함하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 중 내독소 존재하에서의 상기 발색성 기질의 변화로부터 생성되는 발색 효과를 측정하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다. 본 발명은 또한 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 키트, 및 상기와 같은 키트의 제조 방법에 관한 것이다.

그람 음성 세균 내독소는 정맥내로 도입시 열을 발생시키는 생물학적 발열원이다. 상기 내독소(또한 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)로서 공지됨)는 그람-음성 세균, 예를 들어 살모넬라, 에스케리키아 콜라이, 시겔라 및 네이세리아 등의 외막에서 볼 수 있다. 상기 내독소가 촉발하는 독성 기전은 상기 리포폴리사카라이드의 지질 분획에 의해 야기되는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 유기체내에서 상기 세균의 용해가 발생할 때, 혈류내로 도입된 상기 지질에 대한 반응은 보체계의 활성화를 통해서 있을 수 있다. 상기 지질 분획은 상이한 사이토킨, 예를 들어 인터류킨 1 및 8의 방출을 유도한다. 종양 괴사 인자의 생산이 또한 활성화될 수 있다. 상기 생성된 감염은 염증 과정과 관련되며, 상기 감염된 유기체에 큰 위험을 제기할 수 있다. 인터류킨 1은 상기 유기체가 면역 반응으로서 상기 염증에 대해 방출하는 사이토킨의 한 과이다. 상기 반응은 상기 감염이 발생한 곳을 향해 호중구의 이동을 유도하여, 주화성을 생성한다. 이는 식세포작용의 발생을 촉진시키지만; 일부의 경우 개인 면역계의 상태 및 감염 수준에 따라, 상기 내독소는 전신 패혈증에 의해 발생되는 위험들과 함께 상기 패혈증을 유도할 수 있다. 그람-음성 세균이 고등 포유동물들에서 전신 감염에 의해 다발성 장기 부전 및 심지어 사망을 일으킨 다수의 사례들이 보고되었다. 내독소와 관련된 부작용들로 인해, 내독소의 조기 및 민감성 검출이 약학 산업 및 건강관리 집단에서는 중요하다.

리물루스 아메바세포 용해물(LAL) 시험은 1970년대에 내독소의 검출을 위해 상업적으로 도입되었다. LAL은 투구게, 리물루스 폴리페무스(Limulus polyphemus)의 혈액 세포, 또는 아메바세포로부터 유래된다. 최초의 LAL 시험은, 미량 수준의 내독소에 의해 촉발되고, 반응의 끝에서 겔 응고로 끝이 나는 세린 프로테아제들의 캐스케이드를 구성하였다. 통상적으로 자이모겐으로서 존재하는 인자 C는 이러한 응고 캐스케이드의 프라이머이다. 생체내에서, 인자 C는 완벽한 바이오센서이며, 그람-음성 침입자의 존재를 투구게에게 알린다. 지혈성 종점은 상기 침입자를 포집하여, 상기 침입자를 죽이고 추가적인 감염을 제한한다.

상기 LAL 시험을, 상기 내독소에 대한 아메바세포의 반응을 측정하는 상이한 방법들을 사용하기 위해 변형시킬 수 있다. 이들 방법은 소위 겔-응고 방법, 비탁법 및 발색법을 포함한다. 이들 LAL 시험은 약품 생산에 사용되는 원료 물질 및 최종 제품 모두에서 세균 독소를 검출하기 위한 방법으로서 국제 약전에서 권장하고 있다. 이들 시험은 또한, 발열원의 검출을 위해 FDA(식품의약품 안전청)에서 권장하는 방법이므로 화장품 산업 및 식품 생산에 유용하다.

본원은 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없다. 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 조성물은 완충제 및 세제를 추가로 포함한다. 실시태양에서, 상기 조성물은 50%의 맑고 밝게된 LAL을 포함한다.

실시태양에서, 본 발명은 (a) 맑고 밝게된 LAL(여기에서 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없다) 및 (b) 발색성 기질을 포함하는 조성물을 제공한다.

본원의 실시태양은 추가로 상기 맑고 밝게된 LAL, 완충제, 세제, 및 발색성 기질을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조성물은 30% 내지 50%의 LAL(v/v) 및 10% 내지 30%(v/v)의 발색성 기질을 포함한다.

실시태양에서, 본 발명은 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 여기에서 상기 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 (a) 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 4℃에서 8분 동안 2,000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 생성하는 단계; (b) 상기 (a)로부터의 상등액을 완충제와 합하는 단계; (c) 상기 (b)로부터의 조합에 30 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 접선 유동 여과를 가하여 여과잔류물(retentate)을 생성하는 단계; (d) 상기 (c)로부터의 여과잔류물을 4℃에서 5분 동안 5,000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL이다.

실시태양에서, 본 발명은 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 여기에서 상기 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 (a) 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a)로부터의 상등액을 완충제와 합하는 단계; (c) 상기 (b)로부터의 조합에 20 kDa 내지 50 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 연속적인 접선 유동 여과를 가하여 여과잔류물을 생성하는 단계; (d) 상기 (c)로부터의 여과잔류물을 25분을 초과하여 20,000 x g 초과에서 원심분리시켜 상등액을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL이다. 일부 실시태양에서, 상기 (c)의 연속적인 TFF는 적어도 4 정용여과 부피(diafiltration volumes)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (c)의 연속적인 TFF는 적어도 6 정용여과 부피를 포함한다.

본원의 실시태양은 발색 분석을 사용하여 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL) 및 발색성 기질을 포함하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 중 내독소 존재하에서의 상기 발색성 기질의 변화로부터 생성되는 발색 효과를 측정하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다.

일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 3개 초과의 아미노산에 공유 결합된 p-니트로아닐린이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질의 변화는 효소 반응으로 인해 발생한다. 일부 실시태양에서, 상기 효소 반응은 폴리펩티드로부터 발색단의 절단이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 효과는 380 ㎚ 내지 420 ㎚에서 흡광도를 검출함으로써 측정된다. 일부 실시태양에서, 발색 효과는 405 ㎚에서 흡광도를 검출함으로써 측정된다.

일부 실시태양에서, 상기 시약은 액체이다. 일부 실시태양에서, 상기 시약은 수성 액체이다. 일부 실시태양에서, 상기 시약은 동결건조되며 이어서 샘플과 접촉 전에 수성 액체 중에서 재조성된다.

일부 실시태양에서, 상기 LAL은 동결건조되며, 이어서 샘플과 접촉 전에 재조성된다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL은 동결되며, 이어서 샘플과 접촉 전에 해동된다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 동결건조되며, 이어서 샘플과 접촉 전에 재조성된다.

일부 실시태양에서, 상기 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플은 비경구 투여형, 백신, 항생제, 치료학적 단백질, 치료학적 핵산, 치료학적 항체, 및 생물학적 생성물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL은 SDS-PAGE에 의해 측정되고 웨스턴 블럿에 의해 확인된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL은 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 2%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL은 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 0.5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는다.

일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL은 5 ㎍/㎕ 미만의 코아굴로겐 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL은 3 ㎍/㎕ 미만의 코아굴로겐 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL은 2 ㎍/㎕ 미만의 코아굴로겐 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 분석을 단일 큐벳 분광학, 다중 큐벳 분광학, 또는 미세플레이트 판독기를 사용하여 수행한다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 발색 효과를 표준과 비교하여 샘플 중 내독소의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 발색 분석을 사용하여 생물학적 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 상기 생물학적 샘플을 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL) 및 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA를 포함하는 수성 시약과 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 중 내독소의 존재하에서 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA로부터 pNA의 효소적 절단으로부터 생성되는 405 ㎚에서의 흡광도의 변화를 측정하는 단계를 포함하고; 여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 증가된 감도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 <0.001 EU/㎖ 내독소의 감도를 갖는다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 (a) 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)(여기에서 상기 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다); (b) 발색성 기질; 및 (c) 상기 LAL 및 발색성 기질을 사용하여 내독소를 검출하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL은 동결건조된다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL은 수용액이다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL 및 발색성 기질은 단일 용기 중에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 상기 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 멸균 용기를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 멸균 용기는 멸균 바이알이다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 대조용 표준 내독소를 추가로 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 2 내지 10℃에서 2 내지 15분 동안 1000 내지 3000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 생성하고; 상기 (a)로부터의 상등액을 완충제와 합하는 단계; 상기 (b)로부터의 조합을 20 kDa 내지 50 kDa 필터를 사용해서 여과하여 여과잔류물을 생성하는 단계; 상기 (c)로부터의 여과잔류물을 2 내지 10℃에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 생성하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 필터는 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)이다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF 필터는 변형된 폴리에테르설폰(modified polyethersulfone, mPES) 멤브레인 필터이다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF는 350 ㎖/분 내지 500 ㎖/분의 유량으로 수행된다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 트리스 완충제 또는 MES 완충제이다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 약 7.0 내지 8.0의 pH를 갖는다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a)로부터의 용액을 완충제와 합하는 단계; (c) 상기 (b)로부터의 조합에 20 kDa 내지 50 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 연속적인 접선 유동 여과(TFF)를 가하여 여과잔류물을 생성하는 단계; (d) 상기 (c)로부터의 여과잔류물을 25분을 초과하여 20,000 x g 초과에서 원심분리시켜 상등액을 생성하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL이다. 일부 실시태양에서, 상기 (a)에서의 용액은 2 내지 10℃에서 2 내지 15분 동안 1000 내지 3000 rpm으로 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포를 원심분리시킴으로써 수득된 상등액을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (a)에서의 원심분리는 2000 rpm에서의 원심분리를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (a)에서의 원심분리는 8분 동안의 원심분리를 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 원심분리는 2 내지 10℃, 예를 들어 4℃에서의 원심분리를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (c)의 연속적인 TFF는 적어도 4 정용여과 부피를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (c)의 연속적인 TFF는 적어도 6 정용여과 부피를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (d)의 원심분리는 40,000 x g에서의 원심분리를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 (d)의 원심분리는 30분 동안의 원심분리를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 트리스 완충제 또는 MES 완충제이다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 약 7.0 내지 8.0의 pH를 갖는다.

본 기술의 상기 및 다른 특징 및 태양들을 하기 실시태양의 기재로부터 보다 잘 이해할 수 있으며 이들은 첨부된 도면에 예시된 바와 같다. 본원에 인용되고 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부된 도면은 본 기술의 원리를 예시하기 위해 추가로 제공한다.
도 1은 50/50/50 제형 또는 50/80/20 제형에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL("LAL-co")(샘플 1 내지 6) 및 맑고 밝게되지 않은 LAL-co(샘플 7 내지 12)를 포함하는 제형들의 반응 프로파일이다. 실시예 1을 참조한다.
도 2는 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL("LAL-co") 대, LAL-co를 4℃에서 5분 동안 5000 rpm으로 원심분리시킴으로써 제조된 맑고 밝게된 LAL-co의 실시태양의 시각적 비교를 나타낸다.
도 3은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL의 제조 방법의 실시태양의 개략도이다. 다수의 리물루스 폴리페무스 용해된 아메바세포 배치들을 함께 모으고("LAL 데이풀") 원심분리시키고, 생성되는 상등액을 접선 유동 여과를 사용해서 여과하여, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 함유하는 여과잔류물을 생성시킨 다음, 상기 여과잔류물을 원심분리시켜 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL인 상등액을 생성한다.
도 4는 개선된 분석 수행성능, 예를 들어 평탄한 반응 프로파일 및 0 EU/㎖ 대조용으로부터의 큰 분리를 나타내는, 발색 분석을 사용하여 내독소를 검출하는 방법의 실시태양이다.
도 5는 40%(v/v) 맑고 밝게된 무-코아굴로겐 LAL 및 20% 발색성 기질을 함유하는 제형들(50/80/20 제형)에서 1년된, 2년된 및 3년된 LAL 공급원에 대한 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL에 대한 시간 함수로서 광학 밀도의 변화를 나타낸다.
도 6은 40%(v/v) 맑고 밝게된 무-코아굴로겐 LAL 및 20% 발색성 기질을 함유하는 제형들(50/80/20 제형)에서 1년된, 2년된 및 3년된 LAL 공급원에 대한 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL에 대한 반응 매개변수들의 표이다.
도 7은 0.005 EU/㎖ 표준(오른쪽 컬럼) 또는 블랭크 표준(왼쪽 컬럼)과 함께 맑고 밝게된 LAL-co(1년, 2년 또는 3년)의 공급원의 나이의 함수로서 본 발명의 발색 분석에서 상기 50/80/20 제형이 50 mOD, 30 mOD 및 20 mOD에 도달하는 시간(초)을 도시하는 막대 그래프이다.
도 8은 40%(v/v) 맑고 밝게된 무-코아굴로겐 LAL 및 20% 발색성 기질을 함유하는 제형들(50/80/20 제형)에서 1년된, 2년된 및 3년된 LAL 공급원에 대한 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL에 대한 0.005 EU/㎖ 표준에 대한 반응 시간의 박스 플롯이다. 40%(v/v) LAL 및 20% 발색성 기질을 함유하는 제형들(50/80/20 제형)에서 1년된, 2년된 및 3년된 LAL 공급원에 대한 LAL에 대한 0.005 EU/㎖ 표준에 대한 반응 시간의 박스 플롯이다.
도 9는 40%(v/v) 맑고 밝게된 무-코아굴로겐 LAL 및 20% 발색성 기질을 함유하는 제형들(50/80/20 제형)에서 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL에 대한 시간의 함수로서 광학 밀도의 변화를 나타낸다. 40%(v/v) LAL 및 20% 발색성 기질을 함유하는 제형들(50/80/20 제형)에서 LAL에 대한 시간의 함수로서 광학 밀도의 변화를 나타낸다. 표는 0.005 EU/㎖ 표준에 대한 반응 시간 및 0.005 EU/㎖ 및 0 EU/㎖ 블랭크에 대한 반응 시간들 간의 분리를 비교한다.
도 10은 30 kDa 필터를 사용하는 연속적인 접선 유동 여과의 각 정용여과 부피(diafiltration volume, DV) 후 0 EU/㎖ 블랭크 또는 0.005 EU/㎖ 여과잔류물에 대한 반응시간의 비교를 나타낸다. 상기 0.005 EU/㎖ 여과잔류물에 대한 표적 반응 시간은 점선으로 나타낸 1200초이다. 각 막대 세트 아래의 숫자들은 블랭크의 반응시간과 상기 0.005 EU/㎖의 반응시간 간의 절대("Sepa.(sec)") 및 백분율("% Sepa.") 차이를 나타낸다. 양의 차이는 상기 블랭크가 상기 0.005 EU/㎖보다 더 느리게 반응하였음을 가리킨다. 음의 차이는 상기 블랭크가 상기 0.005 EU/㎖보다 더 빠르게 반응하였음을 가리킨다.
도 11은 각 정용여과 부피 후 연속적인 접선 유동 여과로부터의 여과잔류물의 SDS-PAGE이다. 대략적으로 20 kDa에서의 밴드는 코아굴로겐을 가리킨다.
도 12는 도 11에 묘사된 SDS-PAGE 겔 중 20 kDa에서의 단백질 밴드의 정량분석을 나타낸다. 표(왼쪽)는 지시된 수의 정용여과 부피 후 수득된 각각의 여과잔류물에 대해 계산된, 각 여과잔류물의 총 단백질 농도(㎍/㎕), 및 상기 겔의 전체 레인 중 20 kDa에서의 밴드의 백분율을 나타낸다.
도 13은 연속적인 접선 유동 여과의 각 정용여과 부피 후 코아굴로겐의 추정 농도(㎍/㎕)를 나타낸다.
도 14는 LAL 중에 존재하는 공지된 단백질 및 펩티드를 나타내는 표이다. 강조된 단백질 및 펩티드는 30 kDa 미만의 분자량을 가지며 30 kDa 분자량 컷-오프 필터로 제거될 수 있다. 문헌[Iwanga and Kawabata, Frontiers in Bioscience 3: d973-984 (1998)]으로부터 재현됨.
도 15는 SDS-PAGE 겔에 의해 묘사된, 30 kDa 필터(왼쪽) 대 10 kDa 필터(오른쪽)를 사용하는 연속적인 접선 유동 여과로부터의 여과잔류물의 비교를 나타낸다. 각각의 겔 상 아래의 표들은 상기 겔 중 밴드 강도에 의해 추정되는 바와 같은, 코아굴로겐 제거의 백분율을 가리킨다.
도 16은 원래의 제형과 분석 포맷(왼쪽) 및 변형된 제형과 분석 포맷(오른쪽)을 사용하여 제조된 여과되지 않은 LAL, 30 kDa 여과잔류물, 및 10 kDa 여과잔류물을 사용하는 분석 반응시간의 비교를 나타낸다. 라인은 0.005 EU/㎖(실선)과 비교된 블랭크(비-실선)의 반응시간의 차이를 가리킨다.
도 17은 블랭크와 0.005 EU/㎖ 간의 반응시간 차이에 대한 원심분리 속도의 영향의 비교를 나타낸다. 각 막대 위의 숫자들은 반응시간을 가리킨다.
도 18A는 300 내지 500 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정된, 40,000 x g, 30,000 x g, 및 20,000 x g에서의 원심분리에 의해 맑고 밝게된 30 kDa 여과잔류물과 맑고 밝게되지 않은 30 kDa 여과잔류물의 광학 밀도의 비교를 나타낸다. 도 18B는 도 17에 묘사된 바와 같은, 원심분리 속도와, 블랭크 및 0.005 EU/㎖ 간의 반응시간의 차이("% Sepa.")의 상관성을 나타낸다.
도 19는 동결되지 않은(왼쪽) 잔류여과물 또는 동결되고, 이어서 분석 전에 해동된 여과잔류물을 사용하는, 블랭크 또는 0.005 EU/㎖에 대한 반응시간의 비교를 나타낸다. 상기 0.005 EU/㎖ 여과잔류물에 대한 표적 반응 시간은 점선으로 나타낸 1200초이다. 각 막대 세트 아래의 숫자들은 블랭크의 반응시간과 상기 여과잔류물에 대한 0.005 EU/㎖의 반응시간 간의 절대("Sepa.(sec)") 및 백분율("% Sepa.") 차이를 나타낸다. 양의 차이는 상기 블랭크가 상기 0.005 EU/㎖보다 더 느리게 반응하였음을 가리킨다. 음의 차이는 상기 블랭크가 상기 0.005 EU/㎖보다 더 빠르게 반응하였음을 가리킨다.

본원에서 도시하고 설명한 실행들은 예이며 본 출원의 범위를 임의의 방식으로 달리 제한하고자 하지 않음을 알아야 한다.

본원에 언급된 공개된 특허, 특허 출원, 웹사이트, 회사명 및 과학문헌들은 각각이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 바와 동일한 정도로 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다. 본원에 인용된 임의의 참고문헌과 본 명세서의 구체적인 교시 간의 임의의 대립은 후자에 찬성하여 해결될 것이다. 마찬가지로, 단어 또는 어구의 당해분야-이해된 정의와 명세서에서 구체적으로 교시된 바와 같은 단어 또는 어구의 정의 간의 임의의 대립도 후자에 찬성하여 해결될 것이다.

명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나의" 및 "상기"는 구체적으로, 문맥상 달리 분명히 지시하지 않는 한, 상기가 언급하는 용어들의 복수형을 또한 포함한다. "약"이란 용어는 본원에서 대략적으로, 부근으로, 대충, 또는 대략을 의미하는데 사용된다. 상기 "약"이란 용어가 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 상기는 제시된 수치들의 위 및 아래 경계를 연장시킴으로써 그 범위를 변형시킨다. 일반적으로, "약"이란 용어는 본원에서 서술된 값의 위 및 아래의 수치를 20%의 변량까지 변형시키는데 사용된다.

본원에 사용된 과학기술 용어들은 달리 정의하지 않는 한, 본 출원이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에서 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다양한 방법 및 물질을 참조한다. 본원에서 인용된 임의의 문서의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 내독소의 검출 방법에 관한 것이다. "내독소"란 용어는 일반적으로 그람-음성 세균의 외막과 결합된 리포폴리사카라이드 복합체를 지칭한다. "내독소"란 용어는 때때로 임의의 세포-결합된 세균 독소를 지칭하는데 사용된다. 내독소가 세포 결합된 리포폴리사카라이드를 지칭하는 반면, 외독소는 세균에 의해 분비되고 사실상 우세하게는 폴리펩티드인 독소를 지칭한다.

내독소의 생물학적 활성은 리포폴리사카라이드(LPS)와 관련된다. 리포폴리사카라이드는 그람-음성 세균의 세포벽의 외막 부분이다. 리포폴리사카라이드는 유기체가 병원성이든 아니든 항상 그람-음성 세균과 관련된다. 독성은 지질 성분(지질 A)과 관련되며 면역원성은 폴리사카라이드 성분과 관련된다. 그람-음성 세균의 세포벽 항원(O 항원)은 LPS의 폴리사카라이드 성분이다. 또한, LPS는 동물에서 다양한 염증 반응을 이끌어낼 수 있다.

그람-음성 세균은 동물내에서 성장하는 동안 미세한 양의 내독소를 방출할 수 있다. 이는 자연 면역의 자극을 생성할 수 있다. 소량의 내독소는 실험실에서 증식된 어린 배양물에 의해 용해성 형태로 방출될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 하지만, 대부분의 경우, 내독소는 유기체의 붕해시까지 세포벽과 결합된 채로 있는다. 상기 세균성 유기체의 붕해는 자가분해, 보체 및 라이소자임에 의해 매개된 외부 용해, 및 세균성 세포의 식세포작용성 소화로부터 발생할 수 있다. 세균성 내독소는 인간의 장 속에 풍부하다. 내독소의 상승된 농도는 일부 대사 증후군 질병을 포함한 다수의 상태들과 관련된다. 대사 증후군 질병은, 예를 들어 죽상동맥경화증, 인슐린 내성, 진성 당뇨병, 및 비만증을 포함한다. 증가된 내독소 수준은 또한 지방간 질병 및 크론병과 관련되어 있다. 내독소는 또한 상승된 수준으로 존재할 때, GI관 밖으로 누출될 수 있다. 내독소는 강력한 염증성 항원이며 상기 내독소의 누출은 전신 염증 반응을 생성할 수 있다.

세균의 전형적인 외독소에 비해, 내독소는 효소에 의해 작용하지 않으므로, 그의 작용이 덜 강력하고 덜 특이적이다. 내독소는 열 안정성이나 (30분간 끓여도 내독소는 불안정화되지 않는다), 몇몇 강력한 산화제, 예를 들어 초산화물, 과산화물 및 차아염소산염이 상기를 중화시키는 것으로 보고되었다. 상기는 강력한 산화제이므로, 내독소를 중화시키기 위한 치료학적 조성물을 그다지 받아들이지 않는다.

본 발명의 내독소는 그람-음성 세균으로부터 기원할 수 있다. 예시적인 그람-음성 세균은 비제한적으로 에스케리키아 스페시즈, 시겔라 스페시즈, 살모넬라 스페시즈, 캄필로박터 스페시즈, 네이세리아 스페시즈, 하에모필루스 스페시즈, 아에로모나스 스페시즈, 프란시셀라 스페시즈, 예르시니아 스페시즈, 클렙시엘라 스페시즈, 보르데텔라 스페시즈, 레지오넬라 스페시즈, 코리네박테리아 스페시즈, 시트로박터 스페시즈, 클라미디아 스페시즈, 브루셀라 스페시즈, 슈도모나스 스페시즈, 헬리코박터 스페시즈, 및 비브리오 스페시즈를 포함한다. 그람 음성 세균은 또한 엔테로박테리아세아에, 슈도모나다세아에, 네이세리아세아에, 베일로넬라세아에, 박테로이다세아에, 비브리오나세아에, 파스테렐라세아에, 및 푸소박테리아세아에 과에 속하는 것들일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 내독소는 살모넬라 또는 에스케리키아 스페시즈로부터 유래한다.

본원에 사용된 바와 같이, "내독소 활성"이란 용어는 발열원성 및 패혈성 쇼크를 포함하여, 독성을 야기할 수 있는 그람-음성 세균의 부분을 지칭한다. 내독소로 인한 독성효과는 그람-음성 세균의 외막 중에 존재하거나 상기로부터 유래하는 리포폴리사카라이드 분자의 글리코실화된 지질 A 부분과 관련있는 것으로 밝혀졌다.

"리포폴리사카라이드"(LPS)란 용어는 공유 결합에 의해 결합된 지질 및 폴리사카라이드(글리코인지질)로 이루어지는 큰 분자를 지칭한다. LPS는 3개의 부분: 1) O 항원; 2) 코어 올리고사카라이드, 및 3) 지질 A를 포함한다. 상기 O-항원은 코어 올리고사카라이드에 부착된 반복적인 글리칸 중합체이며, 상기 LPS 분자의 가장 바깥쪽 도메인을 포함한다. 코어 올리고사카라이드는 지질 A에 직접 부착되며 통상적으로 당, 예를 들어 헵토스 및 3-데옥시-D-만노옥툴로손산(또한 KDO, 케토-데옥시옥툴로소네이트로서 공지됨)을 함유한다. 지질 A는 다수의 지질산에 연결된 인산화된 글루코스아민 디사카라이드이다. 상기 지방산은 상기 LPS를 세균막에 고정시키고 상기 LPS의 나머지는 세포 표면으로부터 돌출된다. LPS가 돌연변이되거나 제거되는 경우 세균사가 발생할 수 있다.

내독소 활성은 LPS의 지질 A 도메인 부분에 있다. 세균 세포가 면역계에 의해 용해되는 경우, 지질 A를 함유하는 막의 단편이 순환내로 방출되어, 열(발열원성), 설사, 및 잠재적으로 치명적인 쇼크(내독성 또는 패혈성 쇼크)를 야기한다. LPS의 독성은, 숙주에 대해 치명적인 결과를 가질 수 있는 염증전 사이토킨, 주로 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF)의 분비에 이르는 과정인, 포유동물 면역계의 B-세포 및 대식세포와의 상호작용을 통해 지질 A에 의해 발현된다. 지질 A는 또한 숙주의 면역계가 LPS의 가변-크기의 탄수화물 쇄에 대해 특이적인, 기왕성 IgG 항체 반응을 시작하게 하는 성질로, "시험관내에서" 인간 T-림프구(Th-1)뿐만 아니라 "생체내에서" 쥐 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 활성화시킨다. 이들에 기초하여, LPS는 최근에 "생체내에서" T-세포 의존성 항원으로서 인식되었다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 지질 A를 검출하는 것에 관한 것이다.

일부 실시태양에서, 상기 내독소를 발색 분석을 사용하여 검출한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 발색 분석은 내독소의 존재하에서 발색성 기질(즉, 발색체)의 흡광도 변화를 측정하거나 검출한다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질의 흡광도 변화는 효소 활성에 기인한다. 일부 실시태양에서, 상기 "발색성 기질"이란 용어는 효소 활성 전후의 기질을 지칭한다. 예를 들어, 상기 발색성 기질이, 펩티드 및 발색단을 생성하는 효소에 의해 절단되는 펩티드-발색단인 경우, 상기 "발색성 기질"이란 용어는 펩티드-발색단, 절단된 펩티드, 및 방출 발색단을 지칭할 것이다. 일부 실시태양에서, 합성 발색체를 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 자연적으로 생성된 발색체를 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 합성 펩티드이다. 일부 실시태양에서, 상기 기질은 매우 민감성이며, 즉 상기 기질은 매우 낮은 효소 활성을 검출할 수 있다.

낮은 효소 농도를 검출하는 발색성 기질을 포함하는 시약의 능력은 상기 시약을, 예를 들어 연구 또는 품질 조절 과정에서 내독소와 관련된 몇몇 효소 활성의 존재에 대한 연구에 유용하게 한다. 때때로 몇몇 효소 제제에 대한 반응에 있어서 천연(즉, 상기 효소에 대한 천연 기질)과 합성 발색성 기질 간에 관련성이 없다. 일부 실시태양에서, 발색성 기질은 덜 선택성이며, 즉 천연 기질에 비해 관련된 효소에 대한 그의 반응성에 있어서 차별이 적다.

"발색성 기질"이란 용어는 분석시 내독소의 존재하에서 흡수 스펙트럼이 변하는, 즉 색상이 변하는 기질, 예를 들어 화합물 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 발색성 기질은 소정의 파장을 (i) 흡수하고/하거나 (ii) 흡수하지 않는 기질을 모두 지칭한다. 따라서, 예를 들어 본 발명에 따라, 발색성 기질은 처음에는 소정의 파장을 흡수하지 않고(가령, 가시 파장에서 비-흡수성이고), 이어서 내독소의 존재하에서 소정의 파장(가령, 가시 파장)을 흡수하기 시작할 수 있다. 한편으로, 예를 들어 발색성 기질은 처음에는 소정의 파장을 흡수하고(가령, 가시 파장을 흡수하고), 이어서 내독소의 존재하에서 소정의 파장을 흡수하지 않을 수 있다(가령, 가시 파장을 흡수하지 않는다). 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 내독소의 부재하에서 주어진 파장을 흡수하고, 이어서 내독소의 존재하에서 상이한 파장을 흡수할 수 있다. 하나 이상의 소정의 파장에서 흡광도 특징, 즉 발색 효과의 변화는 내독소의 존재와 상관될 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 발색성 펩티드 기질이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 펩티드 기질은 처음에 무색이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 펩티드 기질은 처음에 색상, 예를 들어 가시 스펙트럼(대략적으로 390 내지 700 ㎚)의 색상을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 펩티드 기질이 효소에 의해 절단되는 경우, 색상 변화가 일어날 수 있는데, 예를 들어 발색단이 유리되어, 생성되는 생성물에서 색상 변화가 일어난다. 일부 실시태양에서, 절단은 생성물의 광학 성질을 변화시키며, 상기 성질은 절단되지 않은 기질의 성질과 상이하고, 이를 분광광도측정에 의해 측정할 수 있다. 펩티드 기질에 결합될 수 있는 발색성 그룹의 비제한적인 예는 파라-니트로아닐린(pNA), 5-아미노-2-니트로벤조산(ANBA), 7-아미노-4-메톡시쿠마린(ANC), 퀴노닐아미드(QUA), 디메틸 5-아미노이소프탈레이트(DPA) 및 이들의 유도체이다. 형광원성 기질은 비제한적으로 Z-Gly-Pro-Arg-AMC [Z=벤질옥시카보닐; AMC=7-아미노-4-메틸쿠마린], 호모바닐산, 4-하이드록시-3-메톡시페닐아세트산, 환원된 페녹사진, 환원된 벤조티아진, 암플렉스(Amplex)(등록상표), 레소루핀 β-D-갈락토피라노시드, 플루오레세인 디갈락토시드(fluorescein digalactoside, FDG), 플루오레세인 디글루쿠로니드 및 이들의 구조 변체(참고로 인용된 미국특허 제 5,208,148; 5,242,805; 5,362,628; 5,576,424 및 5,773,236 호), 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드, 카복시움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드 및 플루오르화된 쿠마린 β-D-갈락토피라노시드(참고로 인용된 미국특허 제 5,830,912 호)를 포함한다.

비제한적인 발색 분석은 인자 C/인자 B 캐스케이드를 기본으로 하는 효소 활성 분석이다. 상기 캐스케이드 중의 첫 번째 성분인 인자 C는 내독소 결합에 의해 활성화되는 프로테아제 자이모겐이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 분석은 인자 C의 재조합 형태(rFC)를 사용한다. 상기 경로에서, 인자 B는 인자 C에 의해 활성화된다. 인자 B는 응고 전구효소를 응고 효소로 활성화시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 응고 전구효소는 발색성 기질에서 발색 변화를 가져온다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 분석은 LAL 분석, 예를 들어 론자(Lonza)로부터의 종점 발색 LAL 분석이다.

일부 실시태양에서, 상기 발색 분석은 LAL 분석이며, 여기에서 상기 LAL 내독소 반응의 초기 부분은 응고 전구효소를 활성화시키고, 이는 차례로 합성 기질로부터 p-니트로아닐린(p-nitroaniline, pNA)을 효소적으로 절단하여 황색 색상을 생성한다.

전구효소 + 내독소 → 효소

기질 + H₂O + 효소 → 펩티드 + pNA(황색)

일부 실시태양에서, 그람-음성 세균 내독소는 LAL에서 전구효소의 활성화를 간접적으로 촉진시킬 수 있다. 상기 활성화의 초기 속도는 존재하는 내독소의 농도에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질의 변화는 효소 반응에 기인하여 발생한다. 일부 실시태양에서, 상기 효소 반응은 펩티드 결합의 절단을 생성하며, 이에 의해 폴리펩티드로부터 발색단 치환체(가령, p-NA)가 절단된다. 예를 들어, 활성화된 효소는 무색 펩티드 기질, 예를 들어 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA로부터 pNA의 유리를 촉진할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 펩티드 기질은 3개 초과의 아미노산에 공유 결합된 p-니트로아닐린이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질은 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA이다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 분석은 유리 pNA를 측정한다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 분석은 380 ㎚ 내지 410 ㎚, 예를 들어 400 ㎚ 내지 410 ㎚, 또는 405 ㎚의 흡광도에서 유리 pNA를 광도측정에 의해 측정한다. 흡광도의 측정 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다. 일부 실시태양에서, 상기 발색 분석을 단일 큐벳 분광학, 다중 큐벳 분광학, 또는 미세플레이트 판독기를 사용해서 수행하여 흡광도를 측정한다.

상기 유리 pNA를, 정지 시약으로 반응을 정지시킨 후에 380 ㎚ 내지 410 ㎚, 예를 들어 405 ㎚에서 광도측정에 의해 측정할 수 있다. 샘플 중 내독소의 농도는 기지량의 내독소 표준을 함유하는 용액의 흡광도 값의 표준 곡선으로부터 계산한다.

내독소를 검출하기 위한 하나의 표준 발색 분석은 샘플을 시약과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 상기 시약은 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 시약은 액체, 예를 들어 수성 액체이다. 한편으로, 상기 시약을 동결건조시키고, 이어서 상기 샘플과 접촉 전에 수성 액체, 예를 들어 멸균수 또는 완충 용액 중에서 재조성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 시약은 액체이다. 일부 실시태양에서, 상기 시약은 수성 액체이다. 일부 실시태양에서, 상기 시약을 동결건조시키고, 이어서 상기 샘플과 접촉 전에 수성 액체 중에서 재조성한다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 동결건조시키고, 이어서 상기 샘플과 접촉 전에 수성 액체 중에서 재조성한다. 일부 실시태양에서, 상기 발색성 기질을 동결건조시키고, 이어서 상기 샘플과 접촉 전에 수성 액체 중에서 재조성한다. 일부 실시태양에서, 동결건조는 상기 발색 분석에서 상기 시약, LAL 및 또는 발색성 기질의 보다 오랜 및/또는 보다 확고한 보관을 허용한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 동결건조된 시약, LAL 및/또는 발색성 기질은 상기 발색 분석에서 동결건조되지 않은 시약, LAL 및 또는 발색성 기질에 비해 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 또는 100% 초과의 안정성 시간의 증가를 허용한다. 이와 관련하여 사용되는 바와 같은 "안정성"은 동일한 속도 및 감도에서 그의 의도된 목적을 위한, 즉 내독소를 검출하기 위한 분석 기능을 지칭한다. 예를 들어, 동결건조되지 않은 시약이 3주 동안 안정한 경우, 6주 동안 안정한 동결건조된 시약은 안정성 시간에서 "100% 증가"를 갖게 된다.

일부 실시태양에서, 상기 LAL을 동결시키고, 이어서 샘플과 접촉 전에 해동시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL의 동결은 LAL의 보다 오랜 및/또는 보다 확고한 보관을 허용한다. 일부 실시태양에서, 동결되고, 이어서 해동된 LAL은 동결되지 않은 LAL과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 분석 수행성능을 갖는다. 이와 관련하여 "동일하거나 또는 실질적으로 동일한" 분석 수행성능은 블랭크 반응과 LAL을 사용하는 반응의 비교시 반응 시간의 유사한 감소를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 동결되지 않은 LAL과 동결되고, 이어서 해동된 LAL간의 반응시간 감소의 차이는 20% 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 반응시간 감소의 차이는 10% 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 반응시간 감소의 차이는 5% 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 반응시간 감소의 차이는 1% 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 동결시키고 약 -20℃에서 보관한다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 동결시키고 약 -30, 약 -40, 약 -50, 약 -60, 약 -70, 또는 약 -80℃에서 보관한다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 급속 동결시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하여 급속 동결시킨다.

일부 실시태양에서, 상기 LAL을 1주일을 초과하여, 1개월을 초과하여, 3개월을 초과하여, 6개월을 초과하여, 9개월을 초과하여, 12개월을 초과하여, 15개월을 초과하여, 18개월을 초과하여, 또는 24개월을 초과하여 동결시키고, 그 후에 상기 동결된 LAL을 해동시키며, 상기는 동결되지 않은 LAL과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 분석 수행성능을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 1주일 내지 5년, 1개월 내지 4년, 3개월 내지 3년, 또는 6개월 내지 2년 동안 동결시키고, 그 후에 상기 동결된 LAL을 해동시키며, 상기는 동결되지 않은 LAL과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 분석 수행성능을 갖는다.

본 발명은 샘플 중 내독소의 개선된 검출 방법을 제공한다. "샘플"이란 용어는 임의의 물질, 화합물, 도구 또는 장비를 포함할 수 있다. 그러나, 실용적인 목적을 위해서, 상기 샘플은 생물학적 유기체, 예를 들어 포유동물, 인간, 가축 또는 동물원 동물과 접촉하는 물질, 화합물, 도구 또는 장비를 포함할 수 있다. "샘플"이란 용어는 임의의 의료 장치, 약학 및 생물공학 생성물을 지칭할 수 있으며 여기에서 내독소의 공급원(원료 물질 수령으로부터 제조 공정의 끝까지)은 상기 샘플을 뇌척수액 또는 심혈관계와의 접촉에 부적합하게 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플이란 용어는 생체내 뇌척수액 또는 심혈관계와, 예를 들어 인간과 접촉하게 되는 의료 장치를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플이란 용어는 생물학적 샘플을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플은 비경구 투여형, 백신, 항생제, 치료학적 단백질, 치료학적 핵산, 치료학적 항체, 및 생물학적 생성물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

"리물루스 아메바세포 용해물"(LAL)이란 용어는 투구게, 리물루스 폴리페무스로부터의 혈액세포(아메바세포)의 수성 추출물을 지칭한다. 상기 투구게로부터의 혈액세포의 수성 추출물은 고정화에 의해 침입자의 확산을 저해하는 혈액림프의 겔-형성 단백질인 코아굴로겐을 포함한다. 예를 들어 문헌[Iwanaga S, et al., J. Biochem. 98:305-318 (1985)] 및 문헌[Iwanaga S, et al., J. Biochem. 95 (6): 1793-1801 (1984)]을 참조한다.

상기 투구게(리물루스)의 응고 캐스케이드 시스템은 지혈 및 숙주 방어 모두에 관련된다. 상기 캐스케이드는 용해성 단백질인 코아굴로겐의 불용성 코아굴린 겔로의 전환을 생성한다. 상기 응고 효소는 코아굴로겐으로부터 단편 펩티드 C를 절제하여 단량체의 응집을 생성한다.

"코아굴로겐"이란 용어는 문헌[Iwanaga (1984)] 및 문헌[Iwanaga (1985)]에서 발견되는 바와 같은 폴리펩티드 쇄를 지칭하며, 상기는 Arg-18 및 Arg-46 뒤에서, 혈액세포 중에 함유되고 세균 내독소(리포폴리사카라이드)에 의해 활성화되는 응고 효소에 의해 절단되는 단일의 175-잔기 폴리펩티드 쇄이다. 절단은, 펩티드 C와 함께, 2개의 디설파이드 결합에 의해 연결되는 2개의 코아굴린 쇄, A 및 B를 유리시킨다. 겔 형성은 코아굴린 분자들의 상호연결로부터 생성된다. 2차 구조 예측은 상기 C 펩티드가, 코아굴로겐의 코아굴린 겔로의 단백질 분해적 전환 중에 유리되는 알파-나선을 형성하는 것을 암시한다. 상기 분자에서 발견되는 베타-시트 구조 및 16 절반-시스틴은 산 및 열에 안정한 치밀한 단백질을 생성하는 것으로 보인다.

코아굴로겐이 겔 형성(가령, 응고 분석)에 중요하지만, 본 발명은 상기가 발색 분석에는 필수적이지 않음을 발견하였다. 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게한 LAL을 포함하는 발색 분석이, 천연량의 코아굴로겐을 갖고 맑고 밝게되지 않은 LAL을 포함하는 발색 분석에 비해 증가된 수준의 속도, 감도 및 분리를 달성하는 것을 발견하였다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 발색 분석에 관한 것이다.

일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다. 편의상, 일부 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 또한 "LAL-co"라 칭한다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 판독시, 다양한 양의 코아굴로겐의 감소가 발색 분석, 예를 들어 LAL 분석에서 증가하는 수준의 속도, 감도 및/또는 분리를 생성하는 것을 알 것이다. 일부 실시태양에서, "실질적으로 없는"이란 용어는 단백질 염색과 함께 SDS-PAGE에 의해 측정되고 웨스턴 블럿에 의해 확인된 바와 같이 LAL 중의 총 단백질에 비해 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "실질적으로 없는"이란 용어는 단백질 염색과 함께 SDS-PAGE에 의해 측정되고 웨스턴 블럿에 의해 확인된 바와 같이 LAL 중의 총 단백질에 비해 10% 미만 또는 5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "실질적으로 없는"이란 용어는 약 20 ㎍/㎕ 미만, 약 15 ㎍/㎕ 미만, 약 10 ㎍/㎕ 미만, 약 5 ㎍/㎕ 미만, 약 4 ㎍/㎕ 미만, 약 3 ㎍/㎕ 미만, 약 2 ㎍/㎕ 미만, 또는 약 1 ㎍/㎕ 미만의 코아굴로겐의 농도를 갖는 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "실질적으로 없는"이란 용어는 20 ㎍/㎕ 내지 0.001 ㎍/㎕, 15 ㎍/㎕ 내지 0.01 ㎍/㎕, 10 ㎍/㎕ 내지 0.1 ㎍/㎕, 5 ㎍/㎕ 내지 0.5 ㎍/㎕, 4 ㎍/㎕ 내지 0.5 ㎍/㎕, 3 ㎍/㎕ 내지 0.5 ㎍/㎕, 2 ㎍/㎕ 내지 0.5 ㎍/㎕, 또는 1 ㎍/㎕ 미만의 코아굴로겐의 농도를 갖는 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "실질적으로 없는"이란 용어는 10 ㎍/㎕ 내지 1 ㎍/㎕, 5 ㎍/㎕ 내지 1 ㎍/㎕, 4 ㎍/㎕ 내지 1 ㎍/㎕, 3 ㎍/㎕ 내지 1 ㎍/㎕, 2 ㎍/㎕ 내지 1 ㎍/㎕, 또는 1 ㎍/㎕ 미만의 코아굴로겐의 농도를 갖는 LAL을 지칭한다. 상기 코아굴로겐의 농도는, 예를 들어 흡광도 분광학, SDS-PAGE 겔 밴드 또는 웨스턴 블럿 밴드의 정량분석, 또는 코아굴로겐 농도의 측정에 대해 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 "코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL"에서 측정된 코아굴로겐의 농도는 통상적인 검출 방법을 사용하여 최소 검출량의 오차 범위내에 있으므로 정확하게 측정될 수 없다.

일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL이란 용어는 상기 코아굴로겐이 제거되지 않은 LAL 중의 코아굴로겐의 양에 비해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%(중량/중량)의 코아굴로겐이 제거된 LAL을 지칭한다.

당해 분야의 숙련가는 상이한 방법들을 사용하여 상기 LAL로부터 코아굴로겐을 제거할 수 있음을 알 수 있다. 각각의 이들 방법은 효율, 정제율, 비용 및 노력이 상이할 수 있지만, 이들은 숙련가의 지식내에 있다. 본 발명은 접선 유동 여과를 사용하여 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 제조하는 방법을 포함한다. 접선 유동 여과(TFF)는 공급물 흐름의 대부분이 필터내라기 보다는 필터의 표면을 가로질러 접선으로 이동하는 직교류 여과를 지칭한다. TFF를 사용함으로써, LAL 단백질의 대부분을 포함하는 여과잔류물(필터를 오염시킬 수 있다)이 여과 공정 동안 실질적으로 씻겨지며, 코아굴로겐이 투과물 내로 여과된다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF는 배치식 전량 여과(batch-wise dead-end filtration)와 달리, 연속적인 공정, 즉 연속적인 접선 유동 여과 또는 연속적인 TFF이다. 일부 실시태양에서, 연속적인 TFF는 샘플에 정용여과 용액, 즉 수 또는 완충제를 투과물이 생성되는 속도와 동일한 속도로 가하는 것을 포함하며, 따라서 상기 샘플 부피는 상기 필터를 자유롭게 투과할 수 있는 성분들이 씻기는 동안 일정하게 남아있는다. 일부 실시태양에서, 정용여과는 접선 유동 여과의 한 유형이다. 정용여과는 멤브레인 또는 필터를 통해 보다 작은 분자를 세척하고 최종적으로 부피 변화 없이 여과잔류물 중에 보다 큰 분자를 남기는 분별 공정을 지칭한다. 정용여과 부피, 또는 DV는 상기 정용여과 용액이 첨가되기 전의 샘플의 부피이다. 실시태양에서, 접선 유동 여과에 보다 많은 정용여과 부피를 사용하면 보다 많은 투과물의 제거를 가져온다.

코아굴로겐이 실질적으로 없는 "맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물"(또는 "맑고 밝게된 LAL")이란 용어는 상기 LAL의 탁한 외관을 생성하는 성분들을 제거하기 위해 추가로 처리된, 상기 논의된 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 지칭한다. 실시태양에서, 맑고 밝게된 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 원심분리시킴으로써 생성된다. 일부 실시태양에서, "맑고 밝게된 LAL"이란 용어는 효소의 손상없이 상기 LAL을 충분히 시각적으로 맑고 밝게하는 시간 동안 1800 g(즉, 1800 x 중력) 초과, 2200 g 초과, 2600 g 초과, 3000 g 초과, 3400 g 초과, 3800 g 초과, 4200 g 초과, 4600 g 초과, 5000 g 초과, 5400 g 초과, 5800 g 초과, 6000 g 초과, 6100 g 초과, 또는 6200 g 초과에서 원심분리시킨 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 "맑고 밝게된 LAL"이란 용어는 효소의 손상없이 상기 LAL을 충분히 시각적으로 맑고 밝게하는 시간 동안 1800 내지 8000 g, 2200 g 내지 7600 g, 2600 g 내지 7200 g, 3000 g 내지 7200 g, 3400 g 내지 7200 g, 3800 g 내지 7200 g, 4200 g 내지 7200 g, 4600 g 내지 7200 g, 5000 g 내지 7200 g, 5400 g 내지 7200 g, 5800 g 내지 7200 g, 또는 6100 g 내지 7200 g에서 원심분리시킨 LAL을 지칭한다.

일부 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 "맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물"(또는 "맑고 밝게된 LAL")이란 용어는 20,000 x g 초과, 22,000 x g 초과, 24,000 x g 초과, 25,000 x g 초과, 26,000 x g 초과, 28,000 x g 초과, 30,000 x g 초과, 35,000 x g 초과, 40,000 x g 초과, 45,000 x g 초과, 또는 50,000 x g 초과에서 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 원심분리시킴으로써 상기 LAL의 탁한 외관을 생성하는 성분들을 제거하도록 추가로 처리된, 상기 논의된 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 20,000 내지 50,000 x g, 20,000 내지 40,000 x g, 25,000 내지 50,000 x g, 25,000 내지 40,000 x g, 또는 30,000 내지 40,000 x g 초과에서 원심분리시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 20분 초과, 30분 초과, 40분 초과 또는 60분 초과 동안 원심분리시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 20 내지 120분, 20 내지 90분, 20 내지 60분, 20 내지 40분 또는 약 30분 동안 원심분리시킨다.

일부 실시태양에서, "맑고 밝게된 LAL"이란 용어는 3분 초과, 4분 초과, 5분 초과, 6분 초과, 7분 초과, 8분 초과, 9분 초과, 또는 10분 초과 동안 원심분리된 LAL을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "맑고 밝게된 LAL"이란 용어는 3분 내지 30분, 4분 내지 25분, 4분 내지 20분, 5분 내지 15분 또는 5분 내지 10분 동안 원심분리된 LAL을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가는, 보다 느린 속도의 원심분리는 보다 오랜 원심분리 시간을 요할 수 있으며, 상기 LAL의 시각적인 흐림을 감소시키기 위해 상기 시간 및/또는 속도를 상응하게 조절하게 되는 것을 알 수 있다. 일부 실시태양에서, "맑고 밝게된 LAL"이란 용어는 약 5000 g 내지 약 7000 g에서 약 3분 내지 약 10분 동안, 또는 약 6120 g에서 5분 동안 원심분리된 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을 지칭한다. 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL을, 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 4℃에서 8분 동안 2,000 rpm(980 g)에서 원심분리시킴으로써 제조한다. 상기 맑고 밝게된 LAL은 원심분리 후 상등액 중에서 볼 수 있다. 이어서 일부 실시태양에서 상기 생성된 상등액을 완충제와 합하고; 이어서 상기 생성된 상등액과 완충제의 조합에 30 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 접선 유동 여과를 수행하여 여과잔류물을 생성하고; 상기 여과잔류물을 4℃에서 5분 동안 5,000 rpm(6120 g)에서 원심분리시켜 상등액을 생성하며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL이다. 실시태양에서, 상기 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액은 다수의 리물루스 폴리페무스 용해된 아메바세포의 풀(pool)이다.

일부 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을, 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 수득함으로써 제조한다. 이어서 일부 실시태양에서 상기 용액을 완충제와 합하고; 이어서 상기 생성된 용액과 완충제의 조합에 20 kDa 내지 50 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 연속적인 접선 유동 여과(TFF)를 수행하여 여과잔류물을 생성하고; 상기 여과잔류물을 4℃에서 25분을 초과하는 동안 20,000 x g 초과에서 원심분리시켜 상등액을 생성하며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL이다. 실시태양에서, 상기 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액은 다수의 리물루스 폴리페무스 용해된 아메바세포의 풀이다. 일부 실시태양에서, 상기 연속적인 TFF는 적어도 4 정용여과 부피(DV)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 연속적인 TFF는 적어도 5 정용여과 부피를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 연속적인 TFF는 적어도 6 정용여과 부피를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 연속적인 TFF는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 또는 적어도 15 정용여과 부피를 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을, 본원에 기재된 기술적 특징들의 임의의 조합을 사용하는 방법에 의해 생성한다. 따라서, 당해 분야의 숙련가는 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL의 제조에 충분한 상기 나열된 필터, 필터 크기, 필터 유량, 완충제, 원심분리 속도, 원심분리 온도, 원심분리 시간 등 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 (i) 20,000 x g 초과, 22,000 x g 초과, 24,000 x g 초과, 25,000 x g 초과, 26,000 x g 초과, 28,000 x g 초과, 30,000 x g 초과, 35,000 x g 초과, 40,000 x g 초과, 45,000 x g 초과, 또는 50,000 x g 초과에서 원심분리시키고, (ii) 2℃ 내지 10℃, 2℃ 내지 8℃, 또는 4℃의 온도에서 원심분리시키고, (iii) 20 내지 120분, 20 내지 90분, 20 내지 60분, 20 내지 40분 또는 약 30분 동안 원심분리시키고, (iv) 500 ㎖/분 초과, 예를 들어 500 ㎖/분 내지 2000 ㎖/분, 800 ㎖/분 내지 1500 ㎖/분, 또는 1000 ㎖/분 내지 1200 ㎖/분의 유량으로 TFF를 수행하고, (v) 50 kDa 필터, 45 kDa 필터, 40 kDa 필터, 35 kDa 필터, 30 kDa 필터, 25 kDa 필터, 또는 20 kDa 필터를 사용하여 TFF를 수행하고, (vii) 적어도 4 DV, 적어도 5 DV, 적어도 6 DV, 적어도 7 DV, 또는 적어도 8 DV 등을 사용하여 TFF를 수행한다.

일부 실시태양에서, 상기 발색 분석은 샘플 중 내독소의 존재 또는 부재를 결정한다. 다른 실시태양에서, 상기 발색 분석은 샘플 중 내독소의 양을 정량화 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 샘플 중 내독소의 발색 효과를 공지된 내독소 표준과 비교하여 상기 샘플 중 내독소의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다.

실시태양에서, 본 발명은 발색 분석을 사용하여 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 30% 내지 60%(v/v)의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 제 1 용액을 발색성 기질을 포함하는 제 2 용액과 합하여 제 3 용액을 생성하고, 여기에서 상기 제 3 용액의 75% 내지 85%(v/v)는 제 1 용액이고, 상기 제 3 용액의 15% 내지 25%(v/v)는 제 2 용액이며; (b) 상기 제 3 용액을 내독소를 함유하는 샘플과 합하는 단계; (c) 상기 발색성 기질의 흡광도의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 발색 분석을 사용하여 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 50%(v/v)의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 제 1 용액을 발색성 기질을 포함하는 제 2 용액과 합하여 제 3 용액을 생성하고, 여기에서 상기 제 3 용액의 80%(v/v)는 제 1 용액이고, 상기 제 3 용액의 20%(v/v)는 제 2 용액이며; (b) 상기 제 3 용액을 내독소를 함유하는 샘플과 합하는 단계; (c) 상기 발색성 기질의 흡광도의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 실시태양에서, 상기 제 1 용액은 완충제 및 세제를 또한 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 발색 분석을 사용하여 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 35% 내지 45%(v/v)의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL 및 15% 내지 25%(v/v)의 발색성 기질을 포함하는 용액을 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계, (b) 상기 발색성 기질의 흡광도의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 발색 분석을 사용하여 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 40%(v/v)의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL 및 20%(v/v)의 발색성 기질을 포함하는 용액을 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계, (b) 상기 발색성 기질의 흡광도의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 실시태양에서, 상기 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 용액은 완충제 및 세제를 또한 포함한다.

실시태양에서, 상기 LAL로부터 코아굴로겐을 제거하고 상기 코아굴로겐이 없는 LAL을 맑고 밝게함으로써, 상기 발색 분석은 놀랍게도 증가된 감도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 0.0001 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소의 감도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 0.0005 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소, 0.008 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소, 0.001 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소, 0.005 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소, 0.01 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소, 0.02 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소, 0.03 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖, 또는 0.05 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소의 감도를 갖는다. 실시태양에서, 이는 0.05 EU/㎖ 미만, 0.03 EU/㎖ 미만, 0.01 EU/㎖ 미만, 0.008 EU/㎖ 미만, 0.006 EU/㎖ 미만, 0.005 EU/㎖ 미만, 0.004 EU/㎖ 미만, 0.003 EU/㎖ 미만, 0.002 EU/㎖ 미만, 또는 0.001 EU/㎖ 미만이다.

일부 실시태양에서, 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 더 평탄한 반응 프로파일을 생성한다. 일부 실시태양에서, 분리된 배치들 간의 반응 프로파일은 상기 반응 프로파일이 보다 평탄하므로 보다 일관된다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co의 반응 프로파일은 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 더 양호하게 곡선에 정합된다.

일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 지정된 광학 밀도에 보다 빠르게 도달한다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 30 mOD에 더 빠르게 도달한다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 30 mOD에 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 더 빠르게 도달한다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 50 mOD에 더 빠르게 도달한다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 50 mOD에 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 더 빠르게 도달한다.

일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 0 EU/㎖ 표준(블랭크 표준)과 0.005 EU/㎖ 표준 간에 보다 큰 분리(시간)를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 0 EU/㎖ 표준(블랭크 표준)과 0.005 EU/㎖ 표준 간에 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 더 큰 분리(시간)를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 0 EU/㎖ 표준(블랭크 표준)과 0.0005 EU/㎖ 표준 간에 보다 큰 분리(시간)를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 맑고 밝게되지 않은 LAL-co에 비해 0 EU/㎖ 표준(블랭크 표준)과 0.0005 EU/㎖ 표준 간에 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 더 큰 분리(시간)를 갖는다. 본 발명은 (a) 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL("LAL-co") 및 (b) 완충제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 실시태양에서, 상기와 같은 조성물은 30% 내지 60%(v/v)의 맑고 밝게된 LAL-co, 및 실시태양에서 40% 내지 60%(v/v), 및 실시태양에서, 50%(v/v)의 맑고 밝게된 LAL-co를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 (a) 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, (b) 완충제 및 (c) 세제를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시태양에서, 상기와 같은 조성물은 30% 내지 60%의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 및 실시태양에서 40% 내지 60%(v/v), 및 실시태양에서, 50%의 맑고 밝게된 LAL-co를 포함한다. 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 본 발명의 조성물은 7.4 내지 7.5의 pH에서 트리스 완충제를 포함한다. 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 본 발명의 조성물은 트리스 완충제, 염화 나트륨, 트레할로스 및 염화 마그네슘을 포함한다. 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 약 25 mM 내지 약 50 mM 트리스 완충제, 약 80 mM 염화 나트륨, 약 70 mM 트레할로스 및 약 10 mM 염화 마그네슘을 포함한다. 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 약 50%의 LAL-co, 약 50 mM 트리스 완충제, 약 75 mM 트레할로스, 약 77 mM 염화 나트륨, 및 약 10 mM 염화 마그네슘을 포함하고, pH가 7.4 내지 7.5이다. 실시태양에서, 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 완충제, 및 넓은 pH 범위에 걸쳐 쯔비터이온(zwitterionic) 특성을 유지하는 쯔비터이온성 세제를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시태양에서, 상기 완충제는 분자식 C19H41NO3S를 갖는 n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(쯔비터전트(ZWITTERGENT)(등록상표) 3-14 세제)이다. 실시태양에서, 상기 세제는 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 조성물 중에 약 0.2 mM 내지 0.5 mM, 약 0.3 mM 내지 0.4 mM 또는 약 0.44 mM로 존재한다. 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 약 25 mM 내지 약 50 mM 트리스 완충제, 약 20 mM 내지 약 90 mM 트레할로스, 약 80 mM 염화 나트륨, 및 약 10 mM 염화 마그네슘을 포함한다. 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 약 50%의 LAL-co, 약 50 mM 트리스 완충제, 약 75 mM 트레할로스, 약 77 mM 염화 나트륨, 약 10 mM 염화 마그네슘, 및 약 0.44 mM의, 분자식 C19H41NO3S를 갖는 n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(쯔비터전트(등록상표) 3-14 세제)를 포함하고, pH가 약 7.4 내지 7.5이다.

본 발명은 또한 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조성물은 코아굴로겐이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 4℃에서 8분 동안 2,000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 생성하고; 상기 (a)로부터의 상등액을 완충제와 합하고; 상기 (b)로부터의 조합에 30 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 접선 유동 여과를 가하여 여과잔류물을 생성하고; 상기 (c)로부터의 여과잔류물을 4℃에서 5분 동안 5,000 rpm(가령, 6120 g)에서 원심분리시켜 상등액을 생성하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기에서 상기 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL이다.

본 발명은 추가로 (1) 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 완충제 및 세제, 및 (2) 발색성 기질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물 중의 발색성 기질은 pNA를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물 중의 발색성 기질은 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA이다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 30% 내지 50%의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 및 10% 내지 30%의 발색성 기질(v/v)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 약 35% 내지 약 45%의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 및 15% 내지 25%의 발색성 기질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 40%의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 및 20%의 발색성 기질(중량/중량)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 약 40%의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 및 20%의 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(중량/중량)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 단일 용기, 예를 들어 단일 바이알 중에 있다. 일부 실시태양에서, 본원에 기재된 조성물은 동결건조된다. 예를 들어, 본 발명은 구체적으로 40%의 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL, 및 30%의 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(중량/중량)를 포함하는 동결건조된 조성물을 기재한다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 발색 분석 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 맑고 밝게된 LAL 및 발색성 기질을 포함하는 시약을 포함하여, LAL 발색 분석과 통상적으로 관련되는 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 (a) 맑고 밝게된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL)(여기에서 LAL은 코아굴로겐이 실질적으로 없다); (b) 발색성 기질; 및 (c) 상기 LAL 및 발색성 기질을 사용하여 내독소를 검출하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 다양한 시약을 포함하며, 각각의 시약은 상이한 양의 제거된 코아굴로겐을 갖는 맑고 밝게된 LAL을 함유한다.

상기 키트는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL 및 발색성 기질은 단일의 용기 중에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 맑고 밝게된 LAL 및 발색성 기질은 2개의 별도의 용기 중에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 상기 맑고 밝게된 LAL을 포함하는 멸균 용기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 상기 분석에 사용하기 위한 상기 맑고 밝게된 LAL 및/또는 발색성 기질을 재조성할 수 있는 재조성 완충제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 멸균 용기는 멸균 바이알이다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 양성 내독소 대조용으로서 사용할 수 있는 대조용 표준 내독소를 포함하거나, 또는 표준에서 내독소의 양을 정량분석하는데 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 하나 이상의 농도의, 하나 초과의 대조용 표준 내독소를 포함한다.

당해 분야의 숙련가는 상기 LAL로부터 코아굴로겐을 제거하는데 상이한 방법들을 사용할 수 있음을 알 수 있다. 각각의 이들 방법은 효율, 정제율, 비용 및 노력이 상이할 수 있지만, 이들은 숙련가의 지식내에 있다. 본 발명은 접선 유동 여과를 사용하여 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 제조하는 방법을 포함한다. 접선 유동 여과(TFF)는 공급물 흐름의 대부분이 필터내라기 보다는 필터의 표면을 가로질러 접선으로 이동하는 직교류 여과를 지칭한다. TFF를 사용함으로써, LAL 단백질의 대부분을 포함하는 여과잔류물(필터를 오염시킬 수 있다)이 여과 공정 동안 실질적으로 씻겨지며, 코아굴로겐이 투과물 내로 여과된다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF는 배치식 전량 여과와 달리, 연속적인 공정이다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 2 내지 10℃에서 2 내지 15분 동안 1000 내지 3000 rpm으로 원심분리시켜 제 1 상등액을 생성하고("제 1 원심분리"); 상기 상등액을 완충제와 합하고; 상기 조합을 20 kDa 내지 50 kDa 필터를 사용해서 여과하여 여과잔류물을 생성하고; 상기 여과잔류물을 2 내지 10℃에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000 rpm으로 원심분리시켜 제 2 상등액을 생성하는 것("제 2 원심분리")을 포함하며, 여기에서 상기 제 2 상등액은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 포함한다. 실시태양에서, 상기 여과는 상기 LAL에 TFF를 가하는 것이다. 이어서 일부 실시태양에서, 상기 LAL을 TFF 전에 완충제 중에 넣는다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 트리스 완충제 또는 MES 완충제이다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 약 6.0 내지 약 9.0, 또는 약 7.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다. 실시태양에서, 상기 제 1 원심분리는 2000 rpm에서의 원심분리를 포함한다. 실시태양에서, 상기 제 1 원심분리는 8분 동안의 원심분리를 포함한다. 실시태양에서, 상기 제 1 원심분리는 4℃에서의 원심분리를 포함한다. 실시태양에서, 상기 제 2 원심분리는 5000 rpm에서의 원심분리를 포함한다. 실시태양에서, 상기 제 2 원심분리는 5분 동안의 원심분리를 포함한다. 실시태양에서, 상기 제 2 원심분리는 4℃에서의 원심분리를 포함한다.

다양한 멤브레인을 상기 TFF에 사용할 수 있다. 생성되는 여과잔류물 중에서 감소시키고자 하는 목적하는 단백질의 크기에 따라 다양한 기공 크기의 필터를 TFF에 사용할 수 있다. 본 발명에서, 인자 C, 인자 B, 인자 G 및 응고 전구효소는, 코아굴로겐을 불용성 코아굴린 겔로 전환시키는 LAL의 응고 캐스케이드 시스템에 관련되는 것으로 공지되어 있다. 본원에 제공된 발명의 목적을 위해서, 코아굴로겐이 감소되고, 인자 C, 인자 B, 인자 G 및 응고 전구효소가 유지되는 임의의 TFF 과정(및 동반되는 필터 기공 크기, 기공 유형 및 완충제 시스템)을 사용할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 TFF 과정은 50 kDa 필터, 45 kDa 필터, 40 kDa 필터, 35 kDa 필터, 30 kDa 필터, 25 kDa 필터, 또는 20 kDa 필터를 사용한다. 일부 실시태양에서, 40 kDa 내지 25 kDa 필터가 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 멤브레인은 10 내지 80 kDa 필터, 또는 20 내지 50 kDa 필터이다. 일부 실시태양에서, 상기 필터는 30 kDa 필터이다.

본원에 개시된 방법에서 사용되는 멤브레인은 비제한적으로 변형된 폴리에테르설폰(mPES), 폴리설폰(polysulfone, PS) 및 폴리에테르설폰(polyethersulphone, PES)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL의 제조 방법은 변형된 폴리에테르설폰(mPES) 멤브레인 필터를 사용하는 TFF를 사용하여 수행한다. 상기 멤브레인을 가로지르는 상기 LAL의 유량을, 상기 LAL로부터 코아굴로겐의 제거를 최적화하기 위해 조절할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF를 200 ㎖/분 내지 800 ㎖/분, 300 ㎖/분 내지 600 ㎖/분, 또는 350 ㎖/분 내지 500 ㎖/분의 유량으로 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF를 500 ㎖/분 초과, 예를 들어 500 ㎖/분 내지 2000 ㎖/분, 800 ㎖/분 내지 1500 ㎖/분, 또는 1000 ㎖/분 내지 1200 ㎖/분의 유량으로 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF를 1000 ㎖/분, 1100 ㎖/분, 1200 ㎖/분, 1300 ㎖/분 또는 1400 ㎖/분으로 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 TFF를 1100 ㎖/분으로 수행한다.

실시태양에서, 본 발명은 코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL의 원심분리를 통해 코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 생성하는 방법을 제공한다.

실시예

실시예 1

맑고 밝게된 LAL-co에 의한 내독소의 개선된 검출

코아굴로겐이 실질적으로 없는 LAL(LAL-co) 및 맑고 밝게된 LAL-co를 함유하는 샘플들의 발색성 내독소 분석의 반응 속도 및 감도를 도 1에 도시된 바와 같이 96-웰 플레이트 상에서 시험하였다. A 내지 F열은 증가하는 양의 내독소 표준을 포함한다. 50% LAL-co 또는 맑고 밝게된 LAL-co를 함유하는 제 1 용액을 발색성 기질을 함유하는 제 2 용액과 합하여 제 3 및 최종 용액을 형성하고, 이어서 상기를 내독소를 함유하는 샘플과 접촉시켰다. 도 1의 컬럼 1 내지 3에서, 제 3 용액은 50%의 맑고 밝게된 LAL-co 제 1 용액, 및 50%의 제 2 용액을 함유하였다(즉, 상기 최종 제 3 용액의 25%는 맑고 밝게된 LAL-co를 함유한다)(50/50/50 용액). 도 1의 컬럼 4 내지 6에서, 상기 제 3 용액은 80%의 맑고 밝게된 LAL-co 용액, 및 20%의 제 2 용액을 함유하였다(즉, 상기 최종 제 3 용액의 40%는 맑고 밝게된 LAL-co를 함유한다)(50/80/20 용액). 도 1의 컬럼 7 내지 9에서, 상기 제 3 용액은 50%의 전체 LAL-co 용액, 및 50%의 제 2 용액을 함유하였다(즉, 상기 최종 용액의 25%는 전체 LAL-co를 함유한다). 도 1의 컬럼 10 내지 12에서, 상기 제 3 용액은 80%의 전체 LAL-co 용액, 및 20%의 제 2 용액을 함유하였다(즉, 상기 최종 용액의 40%는 전체 LAL-co를 함유한다).

도 1은 맑고 밝게된 LAL-co 및 보다 많은 LAL-co와 보다 적은 기질을 갖는 제형의 사용이 놀랍게도, 평탄한 반응 프로파일과 함께 속도 및 블랭크 분리 간의 증가된 분리를 제공하는 것을 나타낸다. 도 4는 상기 관찰을 추가로 예시한다. 3개의 상이한 50/80/20 용액을 제조하고 0.0005 EU/㎖ 및 0.005 EU/㎖의 표준을 가지고 시험하였다. 이들 맑고 밝게된 LAL-co 용액은 각각 31분 및 17분의 평균 30 mOD 시간을 가졌다. 상기 반응 곡선은 보다 평탄하고 보다 일관되었다. 추가로, 0 EU/㎖ 샘플과 0.0005 EU/㎖ 샘플(940초) 및 0 EU/㎖ 샘플과 0.005 EU/㎖ 샘플(1755초) 간에 보다 큰 분리(시간)가 존재하였다. 따라서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co는 개선된 분석 수행성능(가령, 증가된 반응 속도, 0 EU/㎖ 대조용과 보다 큰 차별), 보다 낮은 기질의 양을 생성하며, 보다 평탄한 반응 곡선은 보다 큰 일관성을 가져온다.

실시예 2

맑고 밝게된 LAL-co의 제조

도 3은 맑고 밝게된 LAL-co의 제조 방법을 나타내는 개략도이다. 먼저, 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포의 다수의 배치를 모아 LAL 데이풀을 형성하였다. 상기 LAL 데이풀을 4℃에서 8분 동안 2000 rpm으로 원심분리시켰다. 상기 상등액을 조심스럽게 제거하고 완충제와 합하였다. 상기 생성 용액을 30 kDa mPES 멤브레인 필터를 사용하여 접선 유동 여과(TFF)에 의해 여과하였다. 상기 여과잔류물은 LAL-co를 함유하였다. 이어서 상기 여과잔류물을 4℃에서 5분 동안 5000 rpm으로 원심분리시키고(도 2 참조), 상등액을 보관 용기로 옮겨 4℃에서 보관하였다.

실시예 3

코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL의 형성에 사용되는 LAL 데이풀의 안정성

맑고 밝게된 LAL-co의 형성에 사용되는 LAL 데이풀의 안정성을 0.0005 EU/㎖ 및 0.005 EU/㎖의 표준을 사용하여 조사하였다. LAL 데이풀을 1년, 2년 및 3년 동안 보관하고 맑고 밝게된 LAL-co의 형성에 사용하였다. 상기 지시된 기간의 끝에서, 상기 맑고 밝게된 LAL-co 샘플을 사용하여 50%의 맑고 밝게된 LAL-co를 함유하는 용액을 형성하고, 이어서 상기를 LAL 발색성 시약과 80:20의 비율로 혼합하고, 96-웰 플레이트에 넣고, 이어서 405 ㎚에서 흡광도를 측정하는 배양 플레이트 판독기에 놓았다. 상기 반응을 황색 색상의 출현에 대해 시간에 걸쳐 자동으로 모니터하였다.

내독소의 존재하에서, 상기 용해물은 상기 발색성 기질을 절단하게 되며, 이는 상기 용액을 황색으로 만들게 된다. 상기 변화에 필요한 시간은 존재하는 내독소의 양에 반비례한다. 각각의 샘플에 대한 반응 및 분리 시간은 도 5, 도 6, 도 7, 도 8 및 도 9에서 볼 수 있다. 도 5, 6 및 7은 동일한 샘플 및 실험들로부터 유래한다. 도 8 및 9는 동일한 실시예 및 실험들로부터 유래한다. 도 5의 x축은 시간(초)이고, y축은 mOD의 변화이다. 도 7의 y축은 시간(초)이다. 상기 데이터는 맑고 밝게된 LAL-co의 형성에 사용된 LAL 데이풀이 적어도 3년 동안 안정하며, 그의 증가된 반응 시간, 평탄한 반응 곡선, 및 블랭크 표준(0 EU/㎖)과 내독소 대조용(0.005 EU/㎖ 및 0.0005 EU/㎖) 간의 보다 큰 분리를 유지하는 것을 암시한다. 도 8의 y축은 0.005 EU/㎖ 반응시간(초)이고, x축은 상이한 나이의 LAL 공급원을 나타낸다. 왼쪽의 플롯은 맑고 밝게된 LAL-co로부터의 데이터이고, 오른쪽은 처리되지 않은 LAL로부터의 데이터이다. 상기 데이터는 시간에 걸친 LAL의 수행성능의 차이가, 상기 LAL을 TFF 및 생성되는 LAL-co의 원심분리를 사용하여 처리함으로써 극복할 수 있음을 암시한다. 도 9에서 그래프의 y축은 mOD의 변화를 나타내고, x 축은 시간(초)이다. 상기 표는 0.005 EU/㎖ 표준에 대해 상기 그래프로부터 검색된 반응 시간 및 상기 시간과 0 EU/㎖ 블랭크 간의 분리를 포함한다. 상기 데이터는 맑고 밝게된 LAL-co가, 그의 처리되지 않은 LAL 대응물보다 표준에 대해 더 빠른 반응 시간, 및 블랭크와 낮은 표준 간에 더 큰 분리를 갖는 것을 암시한다.

실시예 4

연속적인 접선 유동 여과의 다양한 정용여과 부피(DV)를 조사하여 어느 부피가 1200 초의 반응 시간을 달성하면서 최상의 감도를 생성하는지(블랭크를 0.005 EU/㎖ 표준과 비교하여)를 조사하였다. 도 10을 참조한다. 4 초과의 DV가 코아굴로겐을 제거하여 1200초 미만의 반응 시간을 달성하는 것으로 밝혀졌다. 5, 6 및 7 DV는 최고의 감도를 생성하고 상기 정용여과 부피를 최소화하면서, 목적하는 반응 시간을 생성하였다.

각각의 상기 DV로부터의 여과잔류물의 SDS-PAGE 분석은 20 kD 밴드(코아굴로겐의 대략적인 MW)의 밴드 밀도가, 보다 많은 정용여과 부피가 LAL의 세척에 사용되기 때문에 감소하는 것을 입증하였다. 예를 들어 도 11을 참조한다. SDS-PAGE로부터의 밴드 밀도의 사용은 코아굴로겐이 여과되지 않은 LAL 중의 전체 염색된 단백질의 약 37%를 구성하고, 각 정용여과 부피가 상기 20 kDa 단백질 밴드를 감소시키는 것을 암시한다. 각 정용여과 부피 후에 수집된 각각의 여과잔류물 중의 총 단백질의 농도를 280 ㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 예를 들어 도 12를 참조한다. 상기 SDS-PAGE로부터의 데이터를 사용하여 코아굴로겐을 구성하는 각각의 여과잔류물 샘플의 백분율에 단백질의 전체 농도를 곱하여, 각각의 여과잔류물 중의 코아굴로겐 농도의 추정값을 계산할 수 있었다. 각각의 DV 후의 코아굴로겐의 농도를 도 13에 나타낸다.

실시예 5

여과되지 않은 LAL 조성물 중에 다수의 단백질들이 존재하는 것이 공지되어 있다. 이들 공지된 단백질의 목록을 도 14에 나타낸다. 문헌[Iwanaga S, et al., Frontiers in Bioscience 3. 973:973-984 (1998)]. 30 kDa 미만의 분자량을 갖는 단백질들은 색상 차이가 있다. 다른 소분자의 제거가 증대된 수행성능에 기여하는 지의 여부를 측정하기 위한 조사를 수행하였다. LAL 조성물에 30 kDa 필터, 또는 10 kDa 필터를 사용하여 연속적인 접선 유동 여과를 수행하였다. 예상한 바와 같이, SDS-PAGE는 코아굴로겐(대략적으로 20 kDa)이 상기 30 kDa 필터를 사용하여 제거되었으나, 10 kDa 필터로는 제거되지 않는 것을 입증하였다. 도 15를 참조한다. 30 kDa 필터를 사용하는 연속적인 접선 유동 여과는 여과되지 않은 LAL뿐만 아니라 10 kDa 필터를 사용하는 연속적인 접선 유동 여과 모두에 비해 반응시간을 감소시키는 것으로 나타났다. 30 kDa 필터를 사용하는 연속적인 접선 유동 여과는 또한 여과되지 않은 LAL뿐만 아니라 10 kDa 필터를 사용하는 연속적인 접선 유동 여과 모두에 비해 블랭크와 0.005 EU/㎖ 샘플 간의 분리를 개선시켰다.

실시예 6

반응 속도 및 분리에 대한 원심분리 속도의 영향을 평가하였다. LAL 조성물을 제조하고, 이어서 30분 동안 10,000 x g, 20,000 x g, 30,000 x g 또는 40,000 x g에서 원심분리시켰다. 이어서 여과잔류물을 블랭크 및 0.005 EU/㎖ 표준 모두를 사용하여 반응 시간 및 분리에 대해 시험하였다. 각각의 상기 여과잔류물의 광학 밀도를 또한 측정하였다. 결과는 도 17 및 도 18에서 볼 수 있다. 맑고 밝게되지 않은 물질은 원심분리된 여과잔류물보다 더 높은 광학 밀도를 갖는다. 원심분리의 속도와 분리 간에 상관성이 또한 관찰되며, 여기에서 상기 원심분리 속도의 증가는 블랭크와 0.005 EU/㎖ 표준 간에 보다 큰 분리를 생성한다. 405 nM(델타 t(초): 30, 델타 mOD: 50)에서 흡광도 플레이트 판독기를 사용하여 상기 맑고 밝게된 여과잔류물의 수행성능을 평가하기 위해 수행된 동역학적 발색 분석은 원심분리가, 내독소와 독립적으로 절단되는 기질에 기여하는 어떤 것을 제거하는 것을 암시하며, 이는 상기 맑고 밝게하는 단계에 대한 추가적인 이득을 암시한다.

실시예 7

코아굴로겐이 실질적으로 없는 맑고 밝게된 LAL을 동결 및 해동시킴으로써 야기되는 수행성능에 대한 영향을 조사하였다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된(30 kDa 연속적인 TFF, 30,000 x g에서 원심분리된) 여과잔류물의 활성을 동결 전에 측정하고, 이어서 그 후에 상기 여과잔류물을 동결시키고 실온에서 해동시켰다. 결과를 도 19에 나타낸다. 상기 조사는 동결/해동 전후에 필적하는 수행성능을 제시하였다.

본원에 기재된 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 적응을 실시태양들 중 어느 하나의 범위로부터 이탈하지 않고 수행할 수 있음은 관련 분야의 통상적인 숙련가에게 명백할 것이다. 이와 함께 선행 실시예들을 단지 예시의 목적으로 포함시키며 이들 실시예는 제한하려는 것은 아니다.

몇몇 실시태양을 본원에 나타내고 설명하였지만, 설명하고 도시한 특정 형태 또는 부분들의 배열로 청구항들을 제한해서는 안되는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서, 예시적인 실시태양들을 개시하였으며, 특정한 용어를 사용하였지만, 이들 용어는 단지 일반적이고 기술적인 의미로 사용되며 제한하려는 목적은 아니다. 상기 실시태양들의 변형 및 변화가 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 상기 실시태양들을 구체적으로 설명한 바와 달리 실행할 수도 있음을 이해해야 한다.

다양한 실시태양을 전술하였지만, 이들은 단지 본 기술의 예시 및 예로서 제공하였으며 제한하려고 제공한 것은 아니다. 다양한 형태 및 세부사항의 변화를 본 기술의 진의 및 범위로부터 이탈하지 않고 상기 중에서 수행할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 따라서, 본 기술의 폭 및 범위는 상술한 실시태양들 중 어느 하나에 의해 제한되어서는 안 되며, 단지 첨부된 청구항들과 그의 균등물에 따라서만 제한되어야 한다. 또한, 본원에서 논의한 각각의 실시태양, 및 본원에 인용된 각각의 참고문헌의 각각의 특징을 임의의 다른 실시태양의 특징들과 함께 사용할 수 있는 것도 이해할 것이다. 본원에 논의된 모든 특허 및 공보는 그들의 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다.

Claims

(a) 리물루스 아메바세포 용해물(LAL) 및 (b) 완충제를 포함하는 조성물로, 상기 조성물은 30% 내지 60%(v/v)의 LAL을 포함하고, 상기 LAL은 (i) 20kDa 내지 50kDa 필터를 사용한 접선유동여과(TFF)로 걸러내어 코아굴로겐의 적어도 일부가 제거된 후, (ii) 2 내지 10°C에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000rpm에서 원심분리된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 세제, 발색성 기질, 또는 둘 다를 더 포함하는 조성물.
발색 분석을 사용하여 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법으로서,
상기 방법은
a. 상기 샘플을 리물루스 아메바세포 용해물(LAL) 및 발색성 기질을 포함하는 시약과 접촉시키는 단계;
b. 상기 샘플 중 내독소 존재하에서의 상기 발색성 기질의 변화로부터 생성되는 발색 효과를 측정하는 단계를 포함하며,
상기 LAL은 (i) 20kDa 내지 50kDa 필터를 사용한 접선유동여과(TFF)로 걸러내어 코아굴로겐의 적어도 일부가 제거된 후, (ii) 2 내지 10°C에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000rpm에서 원심분리된 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 발색성 기질은 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 발색 효과의 측정은 405 ㎚에서 흡광도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 시약은 수성 액체인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 시약을 동결건조시키고, 이어서 상기 샘플과 접촉 전에 수성 액체 중에서 재조성하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 샘플은 비경구 투여형, 백신, 항생제, 치료학적 단백질, 치료학적 핵산, 치료학적 항체, 및 생물학적 생성물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 LAL은 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 측정된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 LAL은 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 측정된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 2%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 LAL은 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 측정된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 0.5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 방법.
발색 분석을 사용하여 생물학적 샘플 중의 내독소를 검출하는 방법으로서,
상기 방법은
(a). 상기 생물학적 샘플을 LAL 및 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계; 및
(b). 상기 샘플 중 내독소의 존재하에서 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA로부터 pNA의 효소적 절단으로부터 생성되는 405 ㎚에서의 흡광도의 변화를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 LAL은 (i) 20kDa 내지 50kDa 필터를 사용한 접선유동여과(TFF)로 걸러내어 코아굴로겐의 적어도 일부가 제거된 후, (ii) 2 내지 10°C에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000rpm에서 원심분리된 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 (a) 전에, 완충제, 세제 및 45% 내지 55%의 LAL을 포함하는 용액을 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA를 포함하는 용액과 혼합하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 시약은 15% 내지 25%의 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA를 포함하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 0.0001 EU/㎖ 내지 1.0 EU/㎖ 내독소의 감도를 갖는 방법.
a. (i) 20kDa 내지 50kDa 필터를 사용한 접선유동여과(TFF)로 걸러내어 코아굴로겐의 적어도 일부가 제거된 후, (ii) 2 내지 10°C에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000rpm에서 원심분리된 리물루스 아메바세포 용해물(LAL);
b. 발색성 기질; 및
c. 상기 LAL 및 발색성 기질을 사용하여 내독소를 검출하기 위한 설명서
를 포함하는 키트.
리물루스 아메바세포 용해물(LAL)의 제조 방법으로,
상기 방법은
(a). 리물루스 폴리페무스로부터 용해된 아메바세포로부터 유래된 용액을 완충제와 합하는 단계;
(b). 상기 (a)로부터의 조합에 20 kDa 내지 50 kDa 멤브레인 필터를 사용하여 연속적인 접선 유동 여과(TFF)를 수행하여 여과잔류물을 생성하는 단계; 및
(c). 상기 (b)로부터의 여과잔류물을 2 내지 10°C에서 2 내지 10분 동안 3000 내지 7000rpm에서 원심분리시켜 상등액을 생성하는 단계를 포함하며, 상기 상등액은 LAL인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 LAL은 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 측정된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 LAL은 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 측정된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 2%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 LAL은 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 측정된 바와 같이 상기 LAL 중의 총 단백질에 비해 0.5%(중량/중량) 미만의 코아굴로겐을 갖는 조성물.
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