KR102526175B1 - 발효 흑삼 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 Aspergillus niger KHNT-1 균주를 이용한 발효흑삼 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법에 따른 제조 방법은, 7회 내지 9회 증숙 및 건조를 통한 제조 시간 단축으로 경제적이고, 벤조피렌이 검출되지 않아 안전하며, 균주를 처리하거나/처리하지 않는 두 방법을 융합함으로써 고함량의 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1 및 CK를 모두 함유하고 있음을 확인하였다. 또한, 상기 진세노사이드를 포함하는 발효흑삼의 폐암의 예방, 치료 또는 개선에 효과가 있음을 확인하였다.

Description

발효 흑삼 제조 방법 {A method for preparation fermented black ginseng}
본 발명은 발효흑삼의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고함량의 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1, F2 및 CK를 함유하는 발효흑삼 및 상기 발효흑삼을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오갈피나무과(Araliaceae) 인삼속(Panax)에 속하는 다년생 초본류로서, 한방에서는 그 뿌리를 인삼(Ginseng radix)이라 하며 약용으로 사용하고 있다. 인삼은 생물학적 전환에 따라 다른 활성을 가지고 있으며, 이러한 생물학적 전환은 인삼의 활성 성분, 즉 프로토파낙사트리올(PPT)과 프로토파낙사디올(PPD)에 따라 크게 두 가지 분류로 이어질 수 있다. PPT와 PPD의 생물학적 활성은 아글리콘(aglycone)에 연결된 당 부분의 수와 위치에 따라 다르며, 상기 당의 탈당화율은 인간의 신진대사에 대한 진세노사이드의 영향을 결정한다.
진세노사이드는 고분자 구성성분과 연결되어 있어서 섭취 후 사람의 장내에 서식하는 특유의 미생물에 의해 분해되지 않고서는 체내 흡수가 되지 않아 약리 효과가 없다. 따라서 반드시 장내에 서식하는 미생물에 의해 분해가 되어야 저분자의 형태로 인체에 흡수될 수 있다. 이들 진세노사이드 중 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd는 장내세균에 의해 대사되어 항암효과가 가장 큰 화합물 K(compound K, IH-901)로 생물 전환되어 이용된다. 우리 인체의 약물대사는 개인의 생활환경 또는 식습관에 따라 다양하게 나타나기 때문에 동일한 양의 인삼을 복용하여도 지표성분인 진세노사이드가 나타내는 약리효과의 양상은 매우 다양하게 나타나며, 인체 대사에서 이러한 생물학적 전환을 중화하기 위해서는 인체에 투여하기 전에 필요한 진세노사이드로 전환하는 것이 필수적이다.
진세노사이드 전환을 위한 방식으로는, 찜, 황 훈증 및 마이크로파 처리와 같은 물리적 방법이 채택되었으나, 이러한 처리는 찜 방식을 제외하고는 산업화에서의 응용이 어렵다. 산 또는 알칼리 가수분해와 같은 화학적 방법은 공정이 보다 간단하고 다루기도 용이하나, 진세노사이드의 선택적 농죽을 위해 부반응을 조절하고 글리코실화의 가수분해를 실행하는 것을 매우 어렵다. 또 다른 방식인 효소를 사용한 생물학적 변형은 진세노사이드의 중요 활성을 유지하면서 안전하고, 상업적으로 이용가능하며 식용 가능한 메커니즘이다.
인삼 종류에 따라 침투에 필요한 에너지는 다르며, 수삼보다는 홍삼, 홍삼보다는 발효 흑삼의 침투력이 가장 높다. 이는 각 인삼에 존재하는 진세노사이드의 선택성과 생물 활성이 그 원인이다. 인삼의 생물전환은 미량 진세노사이드의 수와 생물학적 활성을 0.30%에서 35%까지 크게 증가시킬 수 있으며, CK(화합물 K)는 가장 중요한 진세노사이드 중 하나로서 생체기능 활성도가 높다.
Aspergillus usamii KCTC 6954 유래의 β-글루코시다아제(β-Glucosidase)는 진세노사이드 Rb1을 화합물 K로 생체 전환시켰고, Aspergillus niger 유래 글리코시다제(glycosidase)는 매우 독특한 진세노사이드 Rf를 20-protopanaxatriol (PPT(S))로 생체 전환시켰다(Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010, 74, 96-100.).
아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)는 Aspergillus 종에 속하며 거의 3세기 전에 처음 보고되었으며, 많은 의약 및 식품 재료의 생물 전환에 매우 중요한 곰팡이이다.
생물전환(Bioconversion) 또는 생물변환(biotransformation)은 식물 및 동물 폐기물과 같은 생물학적 또는 유기 물질 및 물질을 녹색 에너지, 식품, 의약 재료, 효소 및 미생물을 포함하는 유용하고 유익한 제품으로 전환하는 과정이며, Aspergillus niger는 GRAS(일반적으로 안전한 것으로 인정됨) 균으로 선언되었으며, 다양한 생체 형질전환의 수율을 높이는 데 활용된다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 생물 전환된 고함량의 화합물 K(compound K)를 함유하는 발효흑삼을 제조하기 위한 노력을 계속한 결과, 발효대두에서 분리한 신규한 Aspergillus niger KHNT-1 균주를 처리하거나/처리하지 않는 두 방법을 융합하여 제조한 발효흑삼이 진세노사이드의 생물 전환으로 고함량의 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1, F2 및 CK를 함유하고 있음을 확인하였으며, 상기 고함량의 진세노사이드를 포함하는 발효흑삼이 폐암에 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 a) 수삼을 전처리하는 단계; b) 상기 전처리된 수삼을 증숙하여 홍삼을 제조하는 단계; c) 상기 홍삼을 발효시키는 단계; d) 상기 발효한 홍삼을 건조시키는 단계; 및 e) 상기 c) 단계 및 d) 단계를 7회 내지 9회 반복하는 단계를 포함하는 발효흑삼 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2를 포함하는 발효흑삼을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발효흑삼을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발효흑삼을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는,a) 수삼을 전처리하는 단계; b) 상기 전처리된 수삼을 증숙하여 홍삼을 제조하는 단계; c) 상기 홍삼을 발효시키는 단계; d) 상기 발효한 홍삼을 건조시키는 단계; 및 e) 상기 c) 단계 및 d) 단계를 7회 내지 9회 반복하는 단계를 포함하는 발효흑삼 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발효흑삼 제조 방법은 균주를 처리 하지 않거나/처리한 방법을 융합한 것에 특징이 있다.
구체적인 제조 방법으로, 상기 a) 전처리 단계는, 수삼의 수분을 제거하기 위해 45℃ 내지 55℃에서 건조시키는 과정을 의미할 수 있으며,이때 제조된 건조후 무게는 건조 전에 비해 약 1/3 내지 1/5 수준으로 감소한 것을 의미할 수 있다. 이 과정에서 색상의 변화는 관찰되지 않는다. 상기 b) 증숙 단계는, 건조된 수삼을 5 내지 7시간 동안 75℃ 내지 95℃에서 증숙하고, 45℃ 내지 55℃에서 건조하는 과정을 3번 반복하여 홍삼을 제조하는 단계를 의미할 수 있고, 상기 c) 발효 단계는, Aspergillus niger KHNT-1 균주를 배양한 배양액에 침지하여 발효시키는 과정을 의미할 수 있으며, 상기 d) 건조 단계는 25℃ 내지 55℃의 온도에서 건조시키는 과정을 의미할 수 있으며, 상기 c) 발효 및 d) 건조는 7회 내지 9회 반복하여 총 21일동안 수행한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 수삼은 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 발효흑삼을 제조할 수 있는 어떠한 균도 이용할 수 있으며, 구체적으로, 황국균과 백국균과 같은 누룩곰팡이균, 사카로마이세스 세레비지에와 같은 효모균 또는 락토바실러스와 비피도박테리움과 같은 유산균 등을 이용할 수 있으나, 본 발명의 목적상 Aspergillus niger를 의미할 수 있으며, 보다 구체적으로, Aspergillus niger KHNT-1를 의미할 수 있다.
상기 본 발명에서 이용한 Aspergillus niger KHNT-1 균주는 진세노사이드의 생물 전환을 목적으로 본 연구자들에 의해 발효대두로부터 분리 동정한 신규한 균주이며, 이를 부다페스트 조약하의 국제미생물기탁 기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC14739BP을 부여받았다.
본 발명의 용어, "흑삼"은 수삼을 증기 등의 방법으로 찌고 익혀서 말리는 증숙과 증포 과정을 9번 반복하는 과정(구증구포(九蒸九曝))을 거치면 담흑갈색 또는 흑다갈색의 흑삼이 된다. 상기 증숙 및 증포 과정을 거치면서 인삼의 사포닌 성분인 Rb1, Rg1 등의 고분자가 Rg3 등의 새로운 효능을 가지는 저분자 형태로 변형되어 몸에 흡수가 쉬워지게 되며, 구증구포로 가공된 흑삼에서는 이와 같은 유효성분이 더욱 증가할 수 있다. 상기 "발효흑삼"은 상기 흑삼을 제조하는 과정에서 누룩 곰팡이 균 등을 투입하여 발효하는 단계를 포함하여 제조된 것을 의미하며, 본 발명에 있어서, 상기 발효흑삼은 흑삼을 제조하는 과정에서 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger KHNT-1) 균주를 이용하여 발효시킨 것으로, 상기 발효균주의 대사작용에 의해 진세노사이드가 생물전환되어 CK(화합물 K)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 발효흑삼은 상기 CK외에도 다른 진세노사이드, 구체적으로, 고함량의 Rg3, Rg5, RK1 및 F2를 포함할 수 있다.
상기 발효흑삼은, 발효 및 건조를 7회 내지 9회 반복한 발효흑삼의 추출물을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 용어, "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
본 발명의 발효흑삼 추출물에 있어서, 이의 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
또한, 추출에 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 용어, "진세노사이드(ginsenoside)"는 인삼속(Panax)에 특이적으로 존재하는 테로이드 사포닌(steroid saponin)과 트리테르펜 사포닌(triterpene saponin)을 통칭한다. 본 발명의 제조 방법에 따른 발효흑삼은 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 건조된 발효흑삼을 80%(v/v) 메탄올로 추출물을 분리하는 과정을 2회 실시하여 조생성물을 수득한 후, 잔류물에 수포화 n-부탄올을 사용하여 추가 추출하였다. 상기 부탄올층으로부터 진세노사이드가 풍부한 분획을 수득하여 개별 진세노사이드 함량을 특성화 하였으며, 이때 TLC, HPLC 및 LC-MS/MS를 사용하였다(도 3 내지 도 5).
또한, 본 발명의 발효흑삼은 벤조피렌이 검출되지 않는 것을 특징으로 한다.
상기 용어, "벤조피렌"은 다환방향족탄화수소(PAHs, polycyclic aromatic hydrocarbons) 그룹에 속하는 황색의 결정성 고체로서, 식품에 있어 탄수화물, 단백질, 지질 등이 300 내지 600℃ 사이 온도에서 분해 시 불완전연소로 인하여 생성되는 것으로 알려져 있으며, 1급 인체 발암 물질로 분류하고 있다. 최근의 홍삼 및 흑삼 제조 방법에 있어서 벤조피렌의 최소화에 대한 연구가 지속적으로 보고되고 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 발효흑삼 중에 벤조피렌은 포함하고 있지 않음을 확인하였다(도 8)).
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2을 포함하는 발효흑삼을 제공한다.
상기 용어, "진세노사이드" 및 "발효흑삼"은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "Rg5"는 찐 인삼(steamed ginseng)인 홍삼 및 흑삼에 포함된 주요 진세노사이드 구성성분으로, 폐염증, 신경염증 억제 효과 및 피부 염증 반응에도 효능이 보고되었다. 또한, "Rg3"는 Rg5와 같이 홍삼 및 흑삼에 포함된 주요 진세노사이드로, 염증성 신경독성 및 소염제 활성을 억제함으로써 신경 퇴행성 증상을 억제하는 효과 및 항암 항당뇨에 대한 효과가 보고되었으며, "Rk1"은 흑삼에 포함되는 진세노사이드 중에서도 Compound K와 더불어 가장 저분자 구조의 하나인 진세노사이드로 항암, 기억력 개선, 혈소판 응집 억제 등에 효능이 있음이 보고되었고, "Compound K(CK)"는 면역증강작용, 종양혈관신생억제작용 및 암세포 침윤 억제작용이 있는 것으로 알려져 있는 생리활성 물질로, 홍삼 및 흑삼의 인체 내 흡수율과 관련이 깊다. 추가로, "F2"는 진세노사이드 중에서 분자량은 작은편에 속해 CK 및 RK1과 같이 흡수율과 기능성이 높은 특이 진세노사이드이며 아토피 피부염, 미백 및 여드름 개선에 효능이 있음이 보고된 바 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 발효흑삼을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 용어, "발효흑삼"은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "예방"은 상기 고함량의 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2를 포함하는 발효흑삼 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 폐암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 고함량의 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2를 포함하는 발효흑삼 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 폐암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 발효흑삼 추출물을 0.001 내지 80, 구체적으로 0.001 내지 70, 더욱 구체적으로 0.001 내지 60 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 또는 좌제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 폐암 세포주인 A549에 발효흑삼을 처리한 결과, 세포내 산화스트레스를 유도하고, 세포사멸을 유도함을 확인하였다(도 9 내지 도 11).
따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 고함량의 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2을 포함하는 발효흑삼은 폐암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 발효흑삼을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 용어, "발효흑삼"및 "예방"은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
본 발명의 발효흑삼은 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 염증의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 발효흑삼을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 용어, "발효흑삼", "예방" 및 "개선"은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "사료"란, 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물 성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에 포함되는 본 발명의 발효흑삼을 포함하는 추출물은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 가축 사료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 구체적으로는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 Aspergillus niger KHNT-1 균주를 이용한 발효 흑삼 제조 방법은, 제조 시간을 단축하여 경제적이고, 벤조피렌이 검출되지 않는 안전한 흑삼 제조 방법으로써, 고함량의 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1, F2 및 CK가 함유되어 있어, 건강기능식품 및 의약 응용 분야에 대해 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 발효대두로부터 분리 동정한 신규한 Aspergillus niger KHNT-1를 이용한 발효흑삼 제조 공정을 나타낸 개략도이다.
도 2a는 발효흑삼으로서 변해가는 과정의 사진을 나타낸 것이고(① 예비건조, ②~⑩: 2증2포~9증9포), 도 2b는 제조된 발효흑삼의 측근 및 주근의 생체변환 전환율을 육안으로 확인한 것이다.
도 3은 발효흑삼 중에 함유된 유효성분을 TLC를 통해 확인한 것이다(S1: 부탄올 분획의 발효흑삼 추출물).
도 4는 발효흑삼 중에 함유된 유효성분을 HPLC를 통해 확인한 것이다.
도 5는 발효흑삼 중에 함유된 각각의 유효성분을 LC-MS/MS를 통해 명확한 함량을 확인한 것이다.
도 6은 B16BL6 세포주에 대한 발효흑삼의 측근(ginseng lateral root; GLR) 및 주근 (ginseng main root; GMR)의 농도별, 시간별 세포독성을 분석한 그래프이다.
도 7은 HaCaT 세포주에 대한 발효흑삼의 측근(ginseng lateral root; GLR) 및 주근 (ginseng main root; GMR)의 농도별, 시간별 세포독성을 분석한 그래프이다.
도 8은 본원발명의 제조방법에 따른 발효흑삼 중에 벤조피렌이 검출되지 않음을 확인한 그래프이다.
도 9는 암세포에 대한 발효흑삼의 산화스트레스 유도를 확인한 것이다.
도 10은 암세포에 대한 발효흑삼의 세포 사멸 유도를 확인한 것이다.
도 11은 암세포에 대한 발효흑삼의 세포 사멸 유도를 확인한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 신규한 균주 분리 및 동정
본 발명에 사용한 균주는 발효대두(메주) 분말로부터 분리하였다.
구체적으로, 10 ml 물을 이용하여 건조된 발효대두로부터 물 추출물을 취한 다음, 연속희석법으로 희석한 100 μl의 추출물을 Potato Dextrose Agar(PDA) 플레이트를 사용하여 30℃에서 2일 동안 조심스럽게 배양하였다. 이 후 상이한 콜로니 형태를 선택하고, 단일 콜로니를 형성하는 균주를 선발하여 동일한 조건으로 새로운 PDA에서 추가로 계대배양하였다. 상기 배양한 균주는 30% 글리세롤을 포함하는 PDB에 저장하고, -70℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
상기 선발된 균주는 시퀀싱 및 계통수 분석을 통해 신규한 균주임을 확인하여 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger) KHNT-1로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관에 기탁하여 기탁번호 KCTC14739BP를 부여 받았다.
실험예 2. 세포 배양
세포생존율은 MTT 분석을 통하여 측정하였으며, 세포생존율 분석에 사용된 각 세포주 HaCaT 및 B16BL6에 대한 씨딩 농도는 1 Х 104 cells/well로 하였다. 상기 두 세포주에 총 6가지 농도(대조군, 100, 200, 250, 300, 350, 400 μg/mL)의 시료를 처리하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 상기 농도로 처리한 후, 세포주를 MTT (5 mg/mL, PBS)와 함께 37℃조건에서 약 4시간 동안 추가 배양하였다.
실시예 1. 발효흑삼 제조방법
먼저 수삼의 전처리 과정으로 수분 제거를 위해 45℃~55℃에서 건조하였고, 건조 후 무게는 원래의 1/3~1/5로 감소하였다. 상기 건조시킨 수삼을 발효흑삼으로 전환시키기 위해 증숙 과정 후 발효 과정을 실시하였다.
구체적으로, 건조된 수삼을 5~7시간 동안 3회 증숙/건조한 다음, PDB 배지를 함유한 상기 실험예 1에서 분리 동정한 신규한 Aspergillus niger KHNT-1 배양액에 1분간 침지하는 발효 및 25℃ 내지 55℃에서 건조하는 과정을 21일 동안 같은 간격으로 7회 실시하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 발효하는 과정에서 시간이 지날수록 건조된 수삼이 서서히 검게 변하였으며, 이 과정에서는 어떠한 가혹한 조건을 가하지 않고 자연스럽게 흑삼으로 변하는 과정을 확인할 수 있었다(도 2A). 또한, 검은색으로 변한 발효흑삼의 측근(lateral root) 및 주근(main root)에서의 전환율을 색깔로서 육안으로 추가로 확인한 결과, 시료 전체에 걸쳐 전환율이 균일하게 나타남을 확인하였다(도 2B).
실시예 2. 진세노사이드 추출
상기에서 제조된 발효흑삼의 건조된 부분 총 1.0 g을 각각 처리하여 발효흑삼에 존재하는 유효성분의 생물활성을 비교하였다.
구체적으로, 건조된 물질을 70℃의 물에 용해된 80％（v/v）메탄올에 1시간 동안 담근 후, 여과 및 추가적인 원심분리를 통해 추출물을 분리하였다. 이 과정을 두 번 반복한 다음, 추출된 용매를 합치고 거의 건조될 때까지 증발시켜, 약 300 mg의 조생성물을 수득하였다. 잔류물을 증류수에 추가로 용해시키고, 수포화 n-부탄올을 사용하여 추출하였다. 그런 다음 상기 부탄올층을 별도로 수집하고 증발시켜서 사포닌이 풍부한 분획을 수득하였다. 수득한 사포닌 분획은 추가적인 식별을 위해 개별 진세노사이드 함량을 TLC, HPLC 및 LC-MS/MS에 의해 특성화하였다.
실시예 2-1. TLC(Thin-Layer Chromatography)에 의한 유효성분의 식별
TLC를 사용하여 부탄올 분획의 발효흑삼 추출물을 추가로 확인하였다. TLC는 CHCl3-MeOH-H2O(65:35:10 v/v/v, 저 위상)를 이동상으로 사용하여 실리카 겔 60에서 수행하였다. 용출된 플레이트는 10% H2SO4를 분무하여 감지하고, 스팟이 시각화될 때까지 승온하여 건조하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 용출된 분획을 통해 발효흑삼의 유효성분인 진세노사이드의 존재를 확인하였다.
실시예 2-2. HPLC에 의한 유효성분 식별
유효성분을 추가로 정량화 하고 확인하기 위해 HPLC를 수행하였으며, 상기 추출된 부탄올 잔류물을 표준 조건 및 방법으로 특성화하였다.
각 샘플을 표준 진세노사이드와 비교하기 위해, 각 샘플을 HPLC 등급 메탄올(1g/5mL)에 용해시키고, 0.45 μm 필터로 여과한 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 사용하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 측근(lateral root) 및 주근(main root) 분획의 구성요소가 매우 유사함을 확인하였으며, 이는 신규로 분리동정한 Aspergillus niger KHNT-1 균주를 사용한 발효흑삼 생체변환의 균일성을 시사한 것이다.
실시예 2-3. LC-MS/MS에 의한 성분 식별
진세노사이드의 실제 함량을 이해하기 위해, 잔류물에 대한 LC-MS/MS를 실시하여 생체 변환 후 존재하는 정확한 유효성분을 확인하고, 생체 변환 과정 후에 분리된 유효성분을 정량화하였다.
상기 분리된 샘플은 TLC에 의해 스팟이 검출되었고, 표준적 방법을 사용한 HPLC에 의해 추가로 확인되었다. 그러나, 본원 발명에서는 동일한 RT(retention time)에서 Rg5 및 CK가 동시 용출되었다. 각각의 유효성분의 중요성을 평가하기 위해, LC-MS/MS를 수행하였다. 구체적인 조건은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
Figure 112021131497215-pat00001
도 5에 나타난 바와 같이, 표준 질량 및 RT 계수에 의해 Rg5, Rg3, Rk1, CK 및 F2의 각 분획이 명확해졌으며, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 상기 유효성분에 대한 개별 질량을 확인하였다. 이를 통해, 본원발명의 A. niger KHNT-1 균주를 이용하여 제조한 발효흑삼에 존재하는 유효성분으로서 다량의 Rg3, RG5, RK1, F2 및 CK를 확인하였다(표 3).
Figure 112021131497215-pat00002
Figure 112021131497215-pat00003
실시예 3. 세포독성분석
발효흑삼이 세포에 미치는 독성을 평가하기 위해, 측근 (lateral root) 및 주근(main root)에서 분리한 시료를 정상세포 (HaCaT) 및 쥐 흑색종 세포(B16BL6)에 농도별(대조군, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 μg/mL)로, 24시간 및 48시간 동안 처리하여, 이들 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 MTT assay로 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, GMR(Ginseng Main root) 및 GLR(Ginseng Llateral root)에 존재하는 유사한 진세노사이드 성분에 의해 B16BL6 세포주에서 동일한 세포 독성 효과를 보였다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 정상 HaCaT 세포주에 대해 GMR(Ginseng Main root)의 경우 350 μg/mL 농도에서48시간까지 세포생존율이 80% 이상을 나타냈으며, GLR(Ginseng Llateral root)의 경우 150 μg/mL 농도에서 48시간까지 약 90%의 세포생존율을 나타내었다.
상기 결과는 GMR(Ginseng Main root) 및 GLR(Ginseng Llateral root)의 세포 침투 능력 및 표적화 가능성으로 인해 세포 독성을 유의하게 유도한 것을 의미하며, 상이한 부위에 대한 진세노사이드의 존재와 관련하여 생체 변환이 균일하게 이루어 졌음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 벤조피렌 불검출 확인
상기 실시예 1에서 제조한 발효흑삼 중의 벤조피렌 함량 분석은 식품의약품안전청(2007) 건강기능식품(소위 흑삼) 중 benzo(a)pyrene 시험법 지침(식약청공문 건강기능성 식품규격팀-5454, 2007. 12. 31)에 근거하여 분석하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 ppb 농도별 Benzopyrene calibration을 작성하였으며(도 8a), 발효흑삼 중의 벤조피렌은 존재하지 않음을 확인하였다(도 8b). 상기 벤조피렌 검출 여부 확인을 위한 분석 조건은 표 4에 나타난 바와 같다.
Figure 112021131497215-pat00004
실시예 5. 발효흑삼의 항폐암 효능
고함량의 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2를 포함하는 상기 실시예 1에서 제조된 발효흑삼의 항폐암 효능을 조사하였다.
실시예 5-1: 세포 내 ROS 생성
먼저, 인간 폐암 세포주인 A549를 이용하여 상기 세포주에 대한 발효흑삼(FBCG), 흑삼(BG) 및 백(수)삼(WG)의 산화 효과를 확인하였다.
구체적으로, 세포 내 ROS를 검출하기 위해 A549 세포를 FBCG, BG 및 WG로 24시간 동안 처리하였다. 이때, ROS 증가는 dichlorodihydro-fluorescein diacetate(DCFH-DA) 프로브를 이용하여 평가하였으며, 세포 내 ROS 수준은 분광 형광계를 이용하여 정량화하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 발효흑삼(FBCG) 처리가 흑삼(BG) 및 백(수)삼(WG)에 비해 A549 세포주에서 산화 스트레스를 유도하는 것을 확인하였다.
실시예 5-2: 발효흑삼 처리에 의한 세포 사멸 유도
세포의 형태학적 변화 및 BAX/Bcl2 비율을 통해, 발효흑삼(FBCG)이 암세포의 세포 사멸을 유도하는지 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 상기 시료가 처리되지 않은 세포의 세포막은 손상되지 않아 Hoechst 염료 염색이 되지 않았으나, FBCG를 처리한 세포의 경우, 염료가 세포 내로 침투하여 암세포의 세포막이 손상되었다. 이는 발효흑삼이 암세포의 분리 및 변경된 형태에 관여함을 나타낸 것이다 (도 9A). 또한, 암세포의 내인성 아폽토시스 경로에서 중요 역할을 하는 BAX/Bcl2 비율이 유의하게 증가했음을 확인하였다(도 10B 및 도 10c).
실시예 5-3: 발효흑삼 처리에 의한 세포 사멸 유도
A549에 대한 발효흑삼(FBCG) 처리가 세포 자멸사 과정에서 중요 역할을 하는 것으로 알려진 카스파제 3 (CASP3) 및 p53 발현 변화에 영향을 미치는지 확인하였다.
카스파제 3 (CASP3) 및 p53의 발현은 웨스턴 블롯팅 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, p53 유전자의 발현은 백(수)삼(WG), 흑삼(BG), 발효흑삼(FBCG)순으로 농도가 높아짐에 따라 증가하였으며, CASP3 유전자 발현 역시 백(수)삼(WG), 흑삼(BG), 발효흑삼(FBCG) 처리에 의해 모두 상향 조절되었다.
이를 종합하면, 인간 폐암 세포주에 대해 발효흑삼을 처리한 결과, 발효흑삼이 암세포의 산화 스트레스를 유도하고, 암세포의 세포자멸사 비율을 증가시킴으로써 암세포 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC14739BP 20211021

Claims (14)

  1. a) 수삼을 전처리하는 단계;
    b) 상기 전처리된 수삼을 증숙하여 홍삼을 제조하는 단계;
    c) 상기 홍삼을 기탁번호 KCTC14739BP로 수탁된 Aspergillus niger KHNT-1 균주의 배양액에 침지하여 발효시키는 단계;
    d) 상기 발효한 홍삼을 건조시키는 단계; 및
    e) 상기 c) 단계 및 d) 단계를 7회 내지 9회 반복하는 단계를 포함하는 발효흑삼 제조 방법으로서,
    상기 발효흑삼은 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2을 포함하고, 벤조피렌이 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 발효흑삼 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 수삼의 수분 제거를 위해 45℃ 내지 55℃에서 건조시키는 것인, 발효흑삼 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 전처리된 수삼을 5 내지 7시간, 75℃ 내지 95℃에서 증숙하고, 45℃ 내지 55℃에서 건조하는 과정을 3번 반복하여 홍삼을 제조하는 것인, 발효흑삼 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계는 25℃ 내지 55℃에서 건조시키는 것인, 발효흑삼 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 e) 단계는 21일 동안 수행하는 것인, 발효흑삼 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, f) 발효흑삼으로부터 발효흑삼 추출물을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 발효흑삼 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종으로 추출한 것인, 발효흑삼 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 진세노사이드 Rg5, Rg3, Rk1, CK(Compound K) 및 F2을 포함하고 벤조피렌이 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 발효흑삼.
  13. 삭제
  14. 삭제
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