KR102522691B1 - 개선된 핵산 분자 분석용 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 분자(M)들을 분석하는 장치를 제안하며, 이 장치는 - 비드(2)로, 상기 비드에 하나의 분자의 일 단부가 고정될 수 있는, 비드(20), - 표면(520)으로, 상기 표면에 상기 분자의 타 단부가 고정될 수 있는, 표면(520), - 비드가 상기 표면에 대해 한 방향으로 이동하도록 만들기에 적합한 액추에이터(30), - 비드와 표면 사이의 거리를 측정하기에 적합한 센서(50)를 포함한다. 이 장치는, 비드의 운동 방향을 따라 연장하는 축(X-X)과 상기 표면에 의해 형성되는 바닥부(110)를 구비하는 웰(11)을 추가적으로 포함하고, 상기 웰은 전기 전도성 용액(40)으로 채워지고 비드를 수용하며, 센서는 비드와 표면 사이의 거리를 결정하기 위해, 비드와 표면 사이의 거리에 따라 달라지는 웰의 임피던스를 측정하기에 적합하다.

Description

핵산 분자 분석용 개선된 장치
본 발명은 분자를 분석하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 예컨대 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자의 분석에 적용된다.
핵산 분자가 마이크로-크기의 비드(bead)에 부착되면, 비드를 조작하고 고해상도로 비드의 위치를 추적함으로써 핵산 구조에 대한 정보를 추정할 수 있다. 특정 실험 조건에서, 실시간으로 비드의 위치를 추적하여, 비드에 부착된 DNA 또는 RNA 분자의 구조에 대한 유용한 정보를 생성할 수 있다.
이는 결국, 분자의 총 조직, 염기 배열, 핵산 염기에 대한 생화학적 변형의 존재, 그리고 분자와 예컨대 폴리메라아제, 헬리카아제, 토포이소머라아제 등과 같은 단백질과의 상호 작용을 결정하는 데 사용될 수 있다.
핵산 분자의 이러한 분석을 수행하기 위한 장치가 특허문헌 US2003/0027187호에 기재되어 있다. 이 장치는 분자에 부착된 비드의 위치를 결정하는 광학 수단을 포함한다.
보다 구체적으로는, 비드가 위에서부터 조명되고, HD 비디오 카메라에서 캡처된 이미지를 통해 현미경 대물렌즈를 통해 관찰된다. 비드의 위치는 비드 이미지로부터 x 및 y 좌표를 측정하는 추적 알고리즘에 의해 실시간으로 추적되며, z축 상의 위치, 즉 분자가 부착된 표면을 기준으로 한 비드의 높이에 대한 결정은 비드의 이미지를 둘러싼 광 회절 패턴에 의해 결정된다.
사실, 비드를 비추는 광은 비드로부터 산란되어 직접 조명 광과 간섭함으로써 회절 패턴을 생성한다. 이 회절 패턴을 사용하여 비드의 z축 상의 위치를 추측하기 위해, 비드를 고정된 위치에 유지하면서 정확한 단계에서 대물렌즈를 이동시킴으로써, 대물렌즈의 초점으로부터 다양한 거리에서 회절 패턴의 이미지들의 세트가 획득된다. 이 이미지들은 각 비드에 대해 독립적으로 시스템을 교정하는 데 사용된다.
그 다음, 대물렌즈는 고정된 위치에 매우 정확하게 유지되어, 링 패턴을 사용하여 교정 세트에 대한 상호 참조를 통해, 광학적 z-축을 따라 초점으로부터 비드의 거리를 추적할 수 있다.
비드의 위치 결정에 대한 이러한 광학적 접근법은 효과적이다. 그러나 이러한 접근법은 그 비용 및 확장성에 영향을 미치는 다수의 단점을 갖는다.
사실, 핵산 분자의 분석을 수행하기 위해서는, 비드 움직임이 1 나노미터 범위에 있는 거의 단일의 염기 해상도(single base resolution)에 도달해야 할 필요가 있다. 이때, 1 나노미터는 하나의 dsDNA 염기쌍이 언지핑(unzipping) 구성으로 개방될 때마다 증가하는 거리와 동일하다. 이 거리는 개방된 두 상보적인 염기들의 ssDNA 단일 뉴클레오티드의 연장의 합이다. 이러한 상황은 RNA 분자와 유사하다.
이러한 해상도 수준은 전술된 광학적 접근법으로 달성할 수 있다. 그러나, 그러한 시스템은 상당히 복잡한 기계-광학 장치를 필요로 하며, 비교적 작은 시야를 가지기 때문에 시스템이 동시에 분석할 수 있는 비드의 수가 제한된다. 예를 들어, 30x 대물렌즈는 약 300x300 미크론의 시야를 가질 수 있으며, 이는 약 1000개의 비드만을 분석할 수 있게 한다.
반면에, 특정한 적용에 대해서는 예컨대 109개의 분자와 같이 더 많은 수의 분자에 대한 분석을 동시에 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 광학적 접근법으로 약 1000개의 비드를 동시에 분석할 수는 있지만, 각 비드 당 하나의 교정 이미지 세트를 생성해야 하므로 시간이 많이 소요되고 계산 집약적이다. 따라서, 동일한 광학적 접근법으로 높은 처리량을 만드는 것은 매우 복잡하다.
본 발명의 한 목적은 종래 기술보다 많은 수의 분자들을 동시에 분석할 수 있도록 하는 핵산 분자 분석 시스템 및 방법을 제공함으로써, 전술된 종래 기술의 단점을 극복하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분자의 정확한 분석을 수행하기 위해 종래 기술과 적어도 동일한 해상도를 유지하는 것이다.
이를 위해서, 핵산 분자 분석을 수행하는 장치가 개시되며, 장치는,
- 하나의 분자가 일 단부에서 고정될 수 있는 비드,
- 분자가 타 단부에서 고정될 수 있는 표면,
- 비드가 표면에 대해 한 방향 운동으로 이동하도록 만들기에 적합한 액추에이터, 및
- 비드와 표면 사이의 거리를 측정하기에 적합한 센서를 포함하며,
이 장치는, 비드의 운동 방향에 따라 연장하는 축과 상기 표면에 의해 형성되는 바닥부를 구비하는 웰(well)을 추가적으로 포함하고, 상기 웰은 전기 전도성 용액으로 채워지며, 비드는 웰 안에 수용되고, 센서는 비드와 표면 사이의 거리에 따라 달라지는 웰의 임피던스를 측정하고 측정된 임피던스로부터 비드와 표면 사이의 거리를 결정하기에 적합한 것을 특징으로 한다.
일부 실시예들에서, 장치는 다음의 특징들 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
- 센서는,
- 웰의 상부에 배치되는 메인 전극으로 전기 전도성 용액과 접촉하고, 이 전극에는 값을 아는 전위차가 걸려지며,
- 분자가 고정되는 표면을 구비하는, 웰의 바닥에 있는 제2 전극,
- 전극들 사이에서 흐르는 전류를 측정하기에 적합한 전자 회로를 포함할 수 있다.
- 전자 회로는,
- 제2 전극에 연결되는 전류-전압 증폭기,
- 전류-전압 증폭기의 출력 전압을 측정하기에 적합한 전압계, 및
- 측정된 전압으로부터 웰의 임피던스를 연산하기에 적합한 연산 회로를 포함할 수 있다.
- 웰의 축에 대한 웰의 단면적은 웰의 바닥부로부터 상부까지 순증가할 수 있다.
- 웰의 바닥부에서의 단면적은 비드의 최대 단면적보다 클 수 있다.
- 웰은 원뿔대 형상을 가질 수 있다.
- 웰의 단면적은 웰의 바닥부로부터의 거리에 따라 선형 증가할 수 있다.
- 웰의 단면은 예를 들어 웰의 바닥부에서는 원형이고, 웰이 바닥부로부터의 거리에 따라 웰의 축에 직각인 방향으로 선형 증가할 수 있다.
- 액추에이터는 웰의 축 방향을 따라 변위 가능하게 장착되는 적어도 하나의 자석을 포함할 수 있고, 비드는 상자성 재료로 제조되어 웰의 바닥부와 자석 사이에 삽입된다.
- 장치는 복수의 동일한 비드와 각각이 하나의 비드를 수용하는 복수의 동일한 웰을 포함할 수 있다. 또한, 센서가 메인 전극, 제2 전극 및 전자 회로를 포함하여 센서가 전극들 사이에서 흐르는 전류를 측정하기에 적합한 일 실시예에서, 상기 센서는 복수의 제2 전극을 포함할 수 있고, 각각의 제2 전극은 각각의 웰의 바닥부에 배치되어 각각의 비드가 고정되는 표면을 형성하며, 전자 회로는 각각의 제2 전극에 연결되는 복수의 전류-전압 증폭기와, 전류-전압 증폭기들의 출력 전압들을 동시에 측정하여 각각의 웰의 임피던스를 연산하기에 적합한 연산 회로를 포함하는 것을 특징으로 한다.
- 장치는 그 안에 웰들이 형성되는, 전기 절연성 재료로 된 플레이트를 포함하고, 모든 웰은 플레이트의 상부면에서 개방되며, 액추에이터는 자성 재료로 제조되는 복수의 막대를 추가적으로 포함하고, 각각의 막대는 상부면에 배치되어 인접한 두 웰 사이에서 연장할 수 있다.
- 각각의 막대는 길이가 10㎛ 미만일 수 있고, 각각의 비드는 직경이 1㎛ 이사일 수 있다.
핵산 분자의 분석 방법도 개시되며, 상기 방법은 위의 설명에 따른 장치에 의해 구현되며, 상기 방법은 비드와 웰의 바닥부 사이의 거리를 측정하는 단계를 적어도 하나 포함하고, 각각의 측정 단계는 웰 내 비드의 위치를 결정하는 것을 고려하여 웰의 임피던스를 측정하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 분석 방법은 또한 적어도 하나의 분자를 비드와 웰 바닥부에 고정시키는 예비 단계를 포함할 수 있으며, 상기 단계는,
- 적어도 하나의 비드로, 상기 비드 상에 분자가 고정될 수 있는, 비드를 웰을 채우고 있는 용액 내에 위치시키는 단계,
- 센서의 메인 전극과 제2 전극 사이에 제1 전위차를 인가하여, 비드를 웰 바닥부에 접촉시키는 단계, 및
- 전극들 사이에 전위차를 역전하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 장치는 일 단부가 마이크로-비드에 부착되고 타 단부가 웰의 바닥부에 부착되는 분자를 분석할 수 있도록 한다. 웰 내 비드의 위치에 따른 웰의 임피던스 변화를 모니터링 함으로써, 비드의 위치를 매우 정확하게 측정할 수 있다.
사실, 웰의 전체 전도도는 웰을 채우고 있는 용액의 전도도에 대응된다. 비드가 웰 내에서 이동하여 웰의 일 부분을 차지하면, 전기 전도성 용액으로 채워진 웰의 단면이 감소되고, 웰의 전도도가 변한다.
따라서, 웰의 정확한 형상을 결정함으로써, 그리고 특히 웰의 단면이 웰의 바닥부로부터의 거리에 따라 증가할 때, 웰 내 비드의 위치는 용이하게 결정될 수 있다.
이 장치는 다중화되어, 해상도를 저하시키지 않고도 많은 양의 핵산 분자들을 동시에 분석할 수 있도록 한다. 실제로, 장치는 복수의 웰과 각각의 비드를 포함하고, 모든 비드는, 각각의 웰에 대해 제2 전극과 각 웰 내에서의 비드의 위치를 정확하게 모니터링할 수 있도록 하는 전류-전압 증폭기를 포함하는 센서에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 특정 실시예들에 대한 아래의 보다 상세한 설명과 첨부된 도면에 도시된 바와 같이 명백해질 것이다.
도 1a는 핵산 분자를 분석하기 위한 장치의 예시적인 실시예를 도시한다.
도 1b 및 도 1c 각각은 장치의 웰의 가능한 형상들에 대한 단면도 및 사시도이다.
도 2는 도 1a의 실시예에서 비드의 위치에 따른 웰의 저항을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 장치의 전기 등가 회로를 개략적으로 나타낸다.
도 4a 및 4b는 두 실시예에 따른 분석 장치의 개략도이다.
도 5a 및 도 5b는 예시적인 분석 장치에서 비드에 가해지는 자기장의 기울기를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 프로세스의 주요 단계를 나타낸다.
분자 분석용 장치
장치의 전반적인 설명
도 1a를 참조하면, 핵산 분자를 분석하기 위한 장치(1)가 도시되어 있다. 이들 분자는, 특히 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 바람직하게는, 도면에 도시된 바와 같이, 분자는 헤어핀 유형의 이중-가닥 분자일 수 있다.
헤어핀이란, 한 가닥의 5' 엔드가 짝지어지지 않은 루프를 사이에 두고 다른 가닥의 3' 엔드에 물리적으로 연결되어 있는 이중 나선을 의미한다. 이러한 물리적 연결은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있으나, 공유 결합인 것이 바람직하다.
따라서, 헤어핀은 이중-가닥 스템과 짝지어지지 않은 단일-가닥의 루프로 구성된다.
장치(1)는 전기적으로 절연성인 재료로 된 플레이트(10)를 포함한다. 예를 들어, 플레이트는 실리콘, 유리, 비-전도성 폴리머 또는 수지로 제조될 수 있다.
플레이트 내에는 적어도 하나의 웰(11)이 형성되고, 각각의 웰은 플레이트가 연장하는 평면에 직각인 주축(X-X)을 따라 연장한다. 각각의 웰은 플레이트의 상부면(101)에서 개방된다.
또한, 각각의 웰(11)은 상기 축(X-X)에 직각으로 연장하는 바닥부(110)를 구비한다.
웰은 소위 마이크로 웰이라고 불리는데, 이는 웰의 치수(깊이, 최대 단면 길이)에 대한 크기 정도가 약 1㎛ 또는 약 0.1㎛이기 때문이다. 예를 들어, 웰은 축(X-X)을 따라 수 마이크로미터의 깊이를 가질 수 있으며, 이는 예를 들어 1 내지 10 마이크로 미터에 포함되거나, 예를 들어 8㎛와 같다.
축(X-X)에 대해 직각인 평면에서 웰의 단면의 최대 길이는 수백 나노미터에서 수 마이크로미터 범위일 수 있으며, 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이 웰의 최대 길이는 약 4 또는 5㎛일 수 있다.
기존의 기술들, 예를 들어 강하게(heavy) 이온을 방사하여 잠재적인 트랙을 형성하는 단계와 화학적 에칭 단계를 포함하는 예컨대 트랙 에칭 기술이라고 불리는 기술과 같은 것으로 웰을 생성할 수 있다. 이런 웰을 생산하는 기술에 대한 더 자세한 내용에 대해서는, Siwy Research Lab(웹 사이트: http://www.physics.uci.edu/~zsiwy/fab.html)의 연구 또는 2012년 ACSNANO지 Vol. 6 No. 9 8633-8380쪽에 개재된 M. Davenport, K. Healy, M. Pevarnik, N. Teslich, S. Cabrini, A. P. Morrison, Z. S. Siwy 및 S. E. Letant의 "단일 나노 입자 검출에서 공기하학의 역할(The Role of Pore Geometry in Single Nanoparticle Detection)"을 참조할 수 있다.
장치는 적어도 하나의 비드(20)를 더 포함한다. 바람직하게는, 장치는 복수의 웰의 개수와 동일한 개수의 비드(20)를 포함한다.
웰 및 비드의 수는 바람직하게는 1000개보다 많거나, 예를 들어 10000개보다 많거나, 또는 예를 들어 약 100000 또는 1000000일 수 있다.
각 비드는 구형이고, 직경은 5㎛ 이하이다. 예를 들어, 비드(20)는 직경이 약 1.5㎛ 또는 1㎛일 수 있다. 바람직하게는, 비드는 더 작을 수 있으며, 직경이 1㎛ 미만이거나, 예를 들어 0.3㎛일 수 있다.
비-제한적인 예시로, 이하의 비드가 참조로서 사용될 수 있다.
- Invitrogen사에서 제조되는 직경이 1.04㎛인 MyOne,
- Invitrogen사에서 제조되는 직경이 2.8 ㎛인 M270,
- Invitrogen사에서 제조되는 직경이 5.5 ㎛인 M450,
- Ademtech사에서 제조되는 직경이 0.5㎛인 Ademtech 500,
- Ademtech사에서 제조되는 직경이 3㎛인 Ademtech 300.
핵산 분자의 분석을 수행하기 위해, 하나의 분자(M)가 그 분자의 일 단부는 비드(20)에 고정되고 타 단부는 웰(11)의 바닥부(110)의 표면에 고정된다.
분자를 비드와 웰의 바닥 표면에 고정하는 것을 달성하기 위해, 비드와 바닥 표면은 분자의 단부과 결합하기에 적절한 특정 재료로 코팅될 수 있다.
예를 들어, DNA 또는 RNA 분자는 일 단부가 바이오틴으로 라벨링되고, 또 다른 단부는 디곡시게닌으로 라벨링될 수 있으며, 비드는 스트렙타아비딘으로 코팅되어 DNA/RNA 헤어핀 분자의(예를 들어, 바이오틴으로) 라벨링된 단부와 결합될 수 있고, 웰(110)의 바닥부는 항-Dig 항체로 코팅되어 DNA/RNA 분자의 Dig-라벨링된 단부와 결합할 수 있다. 예를 들어, 1982년 8월 발행된 Vol. 129 3호 1165-1172 쪽에 있는 Hunter MM, Margolies MN, Ju A, Haber E의 "심장 배당체, 디곡신에 대한 고친화성 단일 클론 항체(High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin)"을 참조 바란다.
따라서, 비드는 분자를 사이에 두고 웰(11)의 바닥부(110)에 부착된다.
또한, 비드(20)는 웰(11)의 바닥부(110)에 대해 자유롭게 움직일 수 있다. 특히, 비드(20)는 축(X-X)의 방향을 따라 이동할 수 있다. 이 축을 따른 비드(20)의 움직임을 제어하기 위해, 장치(1)는 상기 축을 따라 비드(20)를 병진 운동시키는 액추에이터(30)를 추가적으로 포함한다.
바람직한 실시예에 따르면, 비드의 운동 제어는 액추에이터(30)에 의해 비드(20)에 가해지는 자기력에 따라 달라질 수 있다. 이 경우, 비드는 예컨대 초상자성 재료와 같은 상자성 재료로 제조된다. 예를 들어, 비드는 페라이트가 포함된 라텍스로 제조되고, 분자(M)를 고정시키기 위해 스트렙타비딘으로 코팅될 수 있다.
액추에이터(30)는 축(X-X)을 따라 병진 운동하도록 제어될 수 있는 적어도 하나의 영구 자석(31)을 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 액추에이터(30)는, 축(X-X)으로부터 등거리에 위치되고 한 자석의 N극이 다른 자성의 S극과 마주보도록 축(X-X)에 수직으로 정렬되는 자극을 갖는 2개의 영구 자석(31)을 포함할 수 있다.
비드(20)는 웰(11)의 바닥부(110)와 자석(31)들 사이에 위치된다.
이 자석들로 비드에 힘을 가할 수 있고, 결과적으로 비드에 고정되어있는 분자에도 힘을 가할 수 있다. 자석을 비드(20)에 더 가깝게 이동시킴으로써 또는 비드(20)로부터 더 멀리 축(X-X) 방향으로 이동시킴으로써 자기장을 변화시키고, 이로 인해 비드에 가해지는 힘의 크기를 제어함으로써 축(X-X)으로의 샘플의 신장을 제어한다.
액추에이터(30)의 또 다른 실시예는 영구 자석과 웰(11)에 대해 약 수 마이크로미터 정도의 고정된 거리에 위치되는 자화 가능한 재료로 덮인 스트립을 포함할 수 있다. 영구 자석을 자화 가능한 재료로 덮인 스트립에 더 가깝게 가져오거나 더 멀리 가져감으로써, 상기 스트립에 의해 비드에 가해지는 장이 변화될 수 있다(아래의 '복수의 웰의 배열' 섹션 참조).
예컨대 광학 트위저 또는 비드에 음파를 가하는 것을 의미하는 어쿠스틱 트위저와 같이, 비드(20)의 운동을 제어하는 다른 방법들이 사용될 수 있다(예를 들어, 2015년 1월에 Nature Methods Vol. 12, No.1에 기재된 G. Sitters, D. Kamsma, G. Thalhammer, M. Ritsch-Marte, E. J. G. Peterman 및 G. L. J. Wuite의 "음향력 분광학(Acoustic Force spectroscopy)" 또는 2012년 7월 10일 PNAS Vo. 109, No.28 11105-11109쪽에 기재된 X. Ding, Z. S. Lin, B. Kiraly, H. Yue, S. Li, I. Chiang, J. Shi, S. J. Benkovic 및 T. J. Huang의 " 표면 음파를 사용한 단일 미립자, 세포 및 유기체의 온칩 조작(On-Chip Manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves)" 참조)
비드 위치에 따른 웰 임피던스의 변화
마지막으로, 장치(1)는 임피던스, 특히 각각의 웰의 저항(또는 컨덕턴스)을 모니터링함으로써, 비드와 웰의 바닥부(110)에 고정되는 분자의 길이에 대응되는, 비드(20)와 웰(11)의 바닥부(110) 사이의 거리를 결정할 수 있도록 한다.
이를 위해, 각각의 웰(10)은 전기 전도성 용액(40)으로 채워진다.
전기 전도성 용액(40)은 바람직하게는 10-7S/cm 내지 101 사이의 전도도, 바람직하게는 10-3 내지 10-2S/cm의 전도도를 갖는다.
예를 들어, 용액(40)은 농도가 100mmol/m3(100mM)인 염화나트륨 수용액일 수 있다. 대안적으로, 용액(40)은, 예컨대 10mM의 Tris HCl 및 0.1mM의 EDTA 그리고 100mM의 염화나트륨을 함유하는 완충 수용액과 같은, DNA 분자의 보존과 양립 가능한 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 예컨대 10mM의 MgCl2와 같은 효소 활성과 양립 가능한 2가 양이온을 함유할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 완충액(예를 들어, Tris Borate EDTA 완충액)은 전기영동을 지지해야 한다.
도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 전기 전도성 용액(40)은 각각의 웰(11)을 완전히 채우고 플레이트의 상부면(101)을 덮고 있다.
비드(20)는 용액의 전도도와는 다른 전도도를 가져야 한다. 비드는 바람직하게는 전기 절연성이다.
더욱이, 웰(11)은 z에 따라 단면이 변하는데, z는 웰의 바닥부로부터 축(X-X)을 따른 거리이다. 이 거리는 비드의 웰 바닥부로부터 가장 가까운 지점으로부터 또는 비드의 중심으로부터 측정될 수 있다.
바람직하게는, 축(X-X)을 가로지르는 웰(11)의 단면적은 웰의 바닥부로부터의 거리인 z와 함께 순증가한다(z축은 도 1a 내지 도 1c에 도시되어 있으며, z축의 원점은 웰 바닥부의 중심에 있다).
따라서, 비드(20)는 크기가 일정하므로, 비드는 웰의 내부 용적을 다양한 비율로 차지한다.
예를 들어, 비드가 웰의 바닥부에 매우 가까우면, 비드는 웰 중 비드 주위로 연장하는 부분(P)의 큰 비율을 차지한다. 부분(P)은 웰의 체적 중 비드의 가장 낮은 점과 가장 높은 점에 의해 차지되는 단면들 사이에서 연장하는 체적으로 정의된다. 따라서, 전도성 용액을 위한 공간이 매우 적게 남아있기 때문에 이 부분의 저항은 극적으로 증가한다. 웰 전체 저항은 웰의 전체 깊이를 따라서(X-X축을 따라) 저항을 적분한 것이므로, 전체 저항도 극적으로 증가한다.
반대로, 비드가 플레이트의 상부면에 가까우면, 비드는 비드 주위로 연장하는 부분(P)의 작은 비율을 차지한다. 따라서, 이 부분의 저항은 이전의 예시에서 보다 적게 증가하며, 웰의 전체 저항은 이전 예시의 것보다 작다.
따라서, 예를 들어 도 2에 도시된 바와 같이, 웰의 바닥부로부터 비드의 거리에 따른 웰의 저항의 함수를 나타내는 곡선이 생성될 수 있으며, 여기서 각 저항 값은 비드와 웰 바닥부 사이의 단일 거리 값에 대응한다. 웰의 저항 값을 측정함으로써, 대응하는 웰의 바닥으로부터의 비드의 거리를 양호한 정밀도로 추론하는 것이 가능하다.
웰(11) 내의 비드(20)의 위치를 결정할 때 양호한 정밀도를 얻기 위해, 웰의 가장 작은 단면은 비드의 최대 단면보다 큰 것이 바람직하다. 특히, 축을 가로지르는 웰의 단면적이 바닥부로부터의 거리에 따라 순증가하는 바람직한 경우에, 가장 작은 단면은 웰의 바닥부(110)에 위치한다. 이 단면이 비드보다 크다는 사실은, 비드가 웰의 바닥에 도달할 수 있도록 하고, 따라서 비드와 웰 사이의 거리가 0인 위치를 포함하여 웰 내 비드의 모든 위치를 측정할 수 있도록 한다.
웰은 다양한 형상을 가질 수 있다. 첫 번째로, 웰은 축(X-X)을 중심으로 회전 대칭일 수 있다.
예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 웰은 원뿔대 형상일 수 있으며, 이 원뿔대의 가장 작은 부분은 웰의 바닥부(110)에 해당한다.
대안적으로, 도 1a에서, 웰 벽의 반경(r)은 아래의 방정식에 의해 바닥부로부터의 거리(z)에 따라 정의된다.
Figure 112018002242867-pct00001
이때, I0는 웰의 높이, r0는 웰 바닥부의 반경이다. 이러한 웰의 형상은 도 2의 저항 곡선을 제공한다.
또 다른 실시예에 따르면, 웰은 웰의 바닥부로부터의 거리에 따라 단면적이 선형 증가하는 단면을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 웰의 단면적과 비드의 단면적의 차이는 비드의 웰 바닥부까지의 거리에 비례한다.
따라서, 웰의 저항은 비드와 웰 바닥부 사이의 거리가 증가함에 따라 선형으로 감소한다.
예를 들어, 도 1c에 도시된 바와 같이, 웰은, 웰의 바닥부(110)에서 웰의 축(X-X)에 직각인 방향을 따라서 z에 따라 선형으로 증가하는 원형 단면에 의해 형성되는 장타원형(oblong) 단면을 가질 수 있다.
따라서, 웰의 저항 측정으로부터 비드의 위치를 추론하는 것이 더 쉽다. 특히, 도 1a에 도시된 기하학 구조의 웰에 대한 비드의 위치에 따른 웰의 저항을 도시하는 도 2에 도시된 곡선은 직선이 된다.
임피던스 센서
도 3을 참조하면, 장치(1)는, 웰(11)의 임피던스를 측정하고 이 측정값으로부터 비드(20)와 웰(11)의 바닥부(110) 사이의 거리(z)를 추정하기에 적합한 센서(50)를 추가적으로 포함한다.
센서(50)는 전기 전도성 용액(40)을 기준 전압(V0)으로 설정할 수 있는 메인 전극(51)을 포함한다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 메인 전극(51)은 전기 전도성 용액(40)과 접촉한다. 바람직하게는, 메인 전극(51)이 플레이트(10)의 상부면 위에 위치할 수 있다. 전도성 용액이 상기 상부면 위에서 연장하기 때문에, 전도성 용액은 메인 전극(51)과 접촉한다. 물론 메인 전극(51)은 전압원(도시되지 않음), 바람직하게는 DC 전압원에 연결된다.
전압(V0)은 정전압인 것이 바람직하다. 이는 웰 내의 전기 분해 현상을 피하기 위해 0.5V 미만인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 전압 V0는 10 내지 500mV에 포함되며, 보다 바람직하게는 50 내지 300mV에 포함된다. 예를 들어, 전압 V0는 0.25V일 수 있다.
또한, 센서(50)는 적어도 하나의 제2 전극(52)을 포함한다. 보다 구체적으로, 센서(50)는 웰(11)의 개수 그리고 비드(20)의 개수와도 동일한 개수의 제2 전극(52)을 포함한다. 각각의 제2 전극(52)은 금 또는 백금 전극일 수 있다.
제2 전극(52)은 웰의 바닥부(110)를 형성하고, 분자가 고정되는 표면을 형성하는 표면(520)을 구비한다.
도 3에서, 각각의 비드의 가변 위치에 따라 도전성 용액(40)의 칼럼들은 저항들을 형성하며, 이들은 저항기(R1, R2, R3)와 동등하다. 각 저항기는 하나의 극이 메인 전극(51)과 접촉하고 나머지 극은 웰의 바닥부에 있는 제2 전극(52)과 접촉한다.
센서(50)는 웰을 통해 흐르는 전류를 측정함으로써 웰의 저항을 측정하는 전자 회로(53)를 추가적으로 포함한다. 일 실시예에 따르면, 이를 위해, 전자 회로는 제2 임피던스와 직렬로 연결되는 결정된 저항을 포함할 수 있다. 저항의 양극에서의 전위차를 측정하여, 저항을 통해 흐르는 전류를 추정할 수 있다.
그러나, 이 실시예는 각 웰에 흐르는 전류가 매우 낮기 때문에 정확하지 않을 수 있다. 따라서, 전자 회로(53)는 웰에 흐르는 전류의 증폭을 포함하는 것이 바람직하다.
이를 위해, 전자 회로(53)는 각각의 제2 전극에 대해 하나의 전류-전압 증폭기(current to voltage amplifier)(530)를 포함하는 것이 바람직하다.
전류-전압 증폭기는 반전 입력이 제2 전극(52)에 연결되고, 비 반전 입력은 접지되며, 출력은 값을 아는 피드백 저항을 사이에 두고 반전 입력에 연결되는 연산 증폭기를 포함한다.
메인 전극(51)과 하나의 제2 전극(52) 사이에 흐르는 전류 i1은 다음 식으로 주어진다.
Figure 112018002242867-pct00002
여기서 V-는 연산 증폭기의 반전 입력의 전위이고, Ri는 i번째 웰의 저항값이다.
두 입력은 이론적으로 동일한 전위(V-=0V)이므로,
Figure 112018002242867-pct00003
게다가, 피드백 루프에서 전류 il는 다음 식으로 표현될 수 있다.
Figure 112018002242867-pct00004
여기서, Rl은 피드백 루프의 저항값이고, Vi는 전류-전압 증폭기(530)의 출력 전위이다.
따라서, 전위 Vi를 측정함으로써, 다음 식에 의해 i번째 웰 내부에 흐르는 전류 ii의 값을 구할 수 있다.
Figure 112018002242867-pct00005
또한, 웰의 저항값도 구할 수 있다.
Figure 112018002242867-pct00006
따라서, 전자 회로(53)는, 예를 들어 전압계와 같이 전위 Vi를 측정하기에 적합한 장치(531)와, 장치(531)에 의해 획득되는 측정값들을 제어하고 측정된 전위로부터 저항값을 추정하는 예를 들어 프로세서를 포함하는 연산 회로(532)를 포함한다. 프로세서는, 센서(특히, 측정 장치(531))를 제어하고 각 웰의 저항값을 추정하여 그에 대응하는 각각의 웰 바닥부로부터 각 비드의 거리를 추정하기 위한 일련의 명령어를 포함하는 전용 프로그램을 실행하도록 구성되는 것이 적합하다.
바람직하게는, 측정은 약 50Hz의 측정 샘플링 속도로 전체 장치에 걸쳐 측정이 이루어진다(측정은 장치의 모든 웰에 걸쳐 이 샘플링 속도로 병렬로 수행된다). 측정된 전위는 노이즈를 감소시키고 기생 신호를 억제하기 위해 두 측정값 사이에 적분되거나 평균되어야 한다. 이러한 관점에서 샘플링 속도는 주 전원 주파수의 배수가 될 수 있다.
상세한 구현예
구현예는 첨부된 도면들을 참조하여 상세하게 설명된다. 도 1a는 측면도가 다음의 식으로 묘사되는 단일 마이크로웰(11)의 경우를 도시한다.
Figure 112018002242867-pct00007
I0 = 8㎛은 웰의 높이이고, r0 = 2㎛은 웰 바닥부의 반경이다. 웰은 직경이 d = 1.5㎛인 비드에 의해 부분적으로 차단된다.
이 웰은 전도도 σ= 10-2S/cm에 대응하는, 농도가 100mol/m3인 염화나트륨 수용액으로 채워진다.
웰을 가로지르는 전압 V에 대해서 웰 내의 전류는 I = V/R이며, 여기서 R은 용액(40)으로 채워지고 비드에 의해 부분적으로 차단된 웰의 등가 저항이다. 상기 저항은 웰 바닥부로부터 비드의 중심까지의 거리에 대한 함수로 도 2에 도시된다. 웰의 저항을 측정함으로써, 이 곡선에서 저항값을 보고 대응하는 거리를 결정함으로써 비드의 위치를 추정할 수 있다는 것을 이해할 수 있다.
대역폭 Δf에 걸쳐 측정된 전자 전류 노이즈는 두 가지 원인으로 인해 발생할 수 있다.
- 전자들의 열 운동에 의해 발생되는 전자 노이즈인 존슨 노이즈로, 열 노이즈라고도 한다. 이 노이즈는 다음 식으로 표현된다.
Figure 112018002242867-pct00008
여기서, T는 주위 온도이고, kB는 볼츠만 상수이다.
- 근본적인 전자 전하들의 확률적 흐름과 관련된 쇼트-노이즈로, 다음 식으로 표현된다.
Figure 112018002242867-pct00009
여기서, I는 웰 내 신호 전류이고, e는 전자에 의해 운반되는 기본 전하(절대 값)이다.
전압 V가 2kbT/e보다 큰 경우, 즉 주위 온도가 약 293K일 때 약 50mV보다 큰 경우, 신호 전류와 관련된 산탄 노이즈에 의해 존슨 노이즈가 지배된다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 산탄 잡음은 웰의 저항에 따라 증가한다. 그러므로, 신호 대 잡음을 가능한 한 높게 유지하기 위해서는 웰의 크기가 너무 작아질 수 없다. 예를 들어, 1nm의 정도의 크기를 갖는 웰("나노웰")은 활용하기에는 노이즈가 너무 많은 결과를 제공할 것이다.
이 예시로 다시 돌아가서, 메인 전극(51)에 의해 인가되는 전압은 0.25V이다. 도 2에 따르면, 이 예의 전해질 용액에 대한 웰의 최대 저항은 약 2500kΩ이다. 이러한 전압의 경우, 전류는 I = V/R = 100nA이고 전류 노이즈는 inS ≒ 2pA (대역폭 Δf = 100Hz)이다.
δI = 5㎛인 거리에 걸친 임피던스의 변화 ΔR은 약 300kΩ이며, 이는 약 1nm의 거리 변화(이는 2500개의 염기쌍을 갖는 이중-가닥 DNA 분자에서 하나의 염기쌍에 해당함)를 해결하기 위해서는 δR = 0.06kΩ의 임피던스 변화를 해결할 수 있어야 한다. 이는 전류 변화가 δI=I 이고, δR/R = 2.5pA인 것에 해당하며, 이는 신호/노이즈 비율이 약 1인 것에 해당한다.
Δf=1Hz에 걸쳐 평균을 내면 편안한 신호/노이즈 비율이 10인 단일 염기쌍 검출이 가능하다.
복수의 웰의 배열
전술된 바와 같이, 전술된 장치(1)는 복수의 웰(11) 및 동일한 수의 비드(20)를 포함하는 것이 바람직하며, 웰들은 칩 상에 고밀도로 채워진다. 예를 들어 105 내지 108 개/cm2 에 포함되는 밀도, 또는 예를 들어 각각의 마이크로웰 장치가 최대 5x5사이의 밀도로 칩 상에 고밀도로 충전된다. 예를 들어, 각 마이크로 웰 장치의(플레이트의 상부면에서) 최대 단면이 5x5 미크론인 경우, 제곱 센티미터 당 약 4·106 개의 웰이 획득되어야 한다.
이 경우에, 센서(50)는, 복수의 픽셀을 포함하여 각 픽셀의 광전류를 측정하는 CMOS 카메라와 유사한 방식으로, 웰들의 병렬 전도도 측정을 가능하게 하기 위해 동일한 개수의 제2 전극(52)과 전류-전압 증폭기(530)를 제공함으로써 용이하게 다중화 된다.
그러나, 연산 유닛(532)은 모든 웰(11)에 공통이다.
연산 유닛(532)의 연산 요건을 가능한 낮게 유지하기 위해, 모든 비드 및 모든 웰은 동일한 것이 바람직하며, 제조 공정에 의해 주어지는 허용 오차를 갖는다. 또한, 단일의 메인 전극(51)은 모든 웰(11)에 공통이며, 메인 전극(51)은 모든 웰들을 채우고 있는 전기 전도성 용액(40)과 접촉하고 플레이트(10)의 상부면(101)에 상에서 연장하기 때문에 모든 웰에 동일한 전압(V0)을 인가한다.
또한, 공통 플레이트(10)에 배열되는 다수의 웰(11)의 경우, 액추에이터(30)는 바람직하게는, 축(X-X)을 따라 병진 이동 가능하고 균질의 자기장을 생성하기 위해 실질적으로 플레이트(10)의 모든 표면을 덮는 육안으로 보이는 한 쌍의 주 영구 자석(31)을 포함할 수 있다.
액추에이터(30)는 플레이트(10)의 위에 고정되는, 예를 들어 Permalloy®라는 상표명으로 알려진 철과 니켈의 합금과 같은 자성 재료로 제조되는 복수의 막대(32)를 추가적으로 포함한다.
4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, 각각의 막대(32)는 플레이트(10) 위에, 플레이트(10)의 상부면(101) 위에 위치된다. 각각의 막대(32)는 막대(32)의 극성 단부(polar end)(320)가 웰의 에지와 동일한 높이가 되도록 두 개의 인접한 웰 사이에서 연장한다. 따라서, 막대(32)는 비드(20)에 매우 가깝다. 웰들이 플레이트(10)에 고밀도로 채워질 때, 두 개의 인접한 웰 사이의 거리는 수 ㎛ 또는 수십 ㎛ 정도의 크기이다. 따라서, 자성 막대(32)는 이와 동일한 정도의 길이를 갖는다.
도 5a에 도시된 예시에 따르면, 자성 막대(32)는 예를 들어 길이가 8㎛, 폭이 1㎛이며, 2㎛의 간격으로 이격되어 있다.
자성 재료로 된 막대(32)는 각각 주 자석(31)에 의해 생성되는 자기장의 영향 하에서 자화된다. 따라서 주 자석(31)들을 플레이트(10)에 더 가깝게 또는 더 멀게 변위시키는 것은 막대들 사이의 자기장 밀도를 증가 또는 감소시키며, 이로 인해 비드에 가해지는 힘이 증가 또는 감소된다.
자화된 막대(32)들이 주 자석(31)보다 작고 비드(20)에 더 가깝기 때문에, 이 실시예는 특히 바람직하다. 자석들의 크기를 감소시킴으로써, 비드(20) 근방의 자기장 기울기가 증가하고, 이로 인해 비드에 가해지는 자기력이 증가한다.
실제로, 도 5a 및 도 5b에서 재현된 시뮬레이션은, 자성 재료의 막대(32)들이 주 자석(31)에 의해 생성된 균질의 자기장(0.088T)에 노출될 때, 자기장은 막대(32)들 사이에서 강화되어, 축(X-X)을 따라 상당한 자기장 기울기를 생성한다. 그림 5b에서 볼 수 있듯이, 이 자기장 기울기의 최대값은 약 0.09T/㎛, 즉 90·103T/m이다.
비드에 가해지는 자기력은 이 자기장 기울기에 따라 달라진다. 특히, 비드에 가해질 수 있는 최대 자기력(단위: N)은 다음과 같이 표현될 수 있다.
Figure 112018002242867-pct00010
여기서, ms는 비드의 자기 모멘트의 포화 값(단위: Am2)이고, dB/dz는 자기장의 기울기(단위: T/m)이다.
다음은 위에 주어진 예시에 따른 비드들의 자기 모멘트 포화 값이다.-
- Invitrogen사의 MyOne: 13.2·10-15 A·m2
- Invitrogen사의 M270: 57.5·10-15 A·m2
- Invitrogen사의 M450: 238.5·10-15 A·m2
- Ademtech 500: 4.7·10-15 A·m2
- Ademtech 300: 1.017·10-15 A.m2
따라서, 비드에 가해지는 자기력은, 예를 들어 도 5에 도시된 구성을 갖는 MyOne 유형의 비드에 가해지는 자기력은 1000pN을 초과할 수 있다.
반면, 플레이트(10)와 주 자석(31) 사이에 삽입되는 자화된 막대(32)들이 없다면, 자석들에 의해 생성되는 최대 자기장 기울기는 약 1.66·103T/m이다. 이 최대 자기장 기울기는 비드에 가해지는 최대의 자기력을 제공하며, 이는 MyOne 유형 비드에 대해 약 22pN이다. 따라서, 자화된 막대의 존재는 비드에 가해지는 자기력이 자화된 막대(32)가 없을 때보다 약 55배 커질 수 있도록 한다.
비드(20)에 가해지는 자기력의 이러한 증가는, 도 1a에 도시된 자석들에 의해 비드에 가해지는 힘을 적어도 동일하게 유지하거나 그보다 크게 유지하면서, 들의 크기를 감소시킬 수 있도록 한다.
비드 크기의 감소는 웰의 크기를 감소시키고, 이로 인해 웰의 밀도와 장치의 처리량을 증가시킨다. 따라서, 동시에 분석될 수 있는 분자의 수는 5x107개/cm2에 도달할 수 있다(비드의 직경을 300나노미터로 가정).
도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, 웰은 다양한 구성에 따라 플레이트(10)에 채워져 다양한 밀도를 달성할 수 있다. 예를 들어, 도 4a에서의 웰의 밀도는 도 4b에서보다 낮다. 도 4b에서, 웰(11)들은 축(X-X)에 직각인 일차원으로 연장하며, 이는 웰의 단면이 오직 한 방향으로만 성장하기 때문에 비드의 위치에 따라서 보다 선형인 전도도를 가능하게 하고, 전체 유닛 크기를 감소시킨다.
핵산 분자 분석 방법
도 6을 참조하면, 예컨대 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산 분자를 분석하는 방법의 주요 단계가 도시되어 있다. 예를 들어, 이 분석은 핵산 서열의 결정, 즉 핵산 내 염기들의 실제 연쇄에 대한 해독과, 예컨대 핵산 분자 내 특정 서열의 검출, 상이한 두 핵산 분자의 서열 간 차이의 검출, 또는 특정 서열에 대한 단백질의 결합과 같이, 핵산 서열에 대한 다양한 정보들의 결정을 포함한다. 예를 들어, WO2011/147931, WO2011/147929, WO2013/093005 및 WO2014/114687을 참고 바란다.
전술된 바와 같이, 분석되는 분자(M)는 헤어핀 유형이다. 헤어핀 분자에서, 루프에 참여하지 않는 두 가닥의 양 단부는 각각 비드와 웰의 바닥부에 부착되어, 비드의 움직임에 따라 당겨질 수 있다. 결정된 힘으로 분자의 양 단부를 당김으로써 머리핀 이중 가닥 핵산 분자를 완전히 개방할 수도 있다.
이 방법은 하나의 웰 내의 하나의 비드에 대해 기술될 것이지만, 임의의 수의 웰들에 적용될 수 있다.
이 방법은, 핵산 분자(M)를 사이에 두고 웰의 바닥부에 비드를 고정시키는 제1 단계(100), 즉 분자(M)의 제1 단부를 비드(20)에 고정시키고, 분자(M)의 제2 단부를 웰(11)의 바닥부에 고정시키는 단계를 포함한다.
전술된 장치의 구조는, 특히 장치가 플레이트 내에 다수의 웰을 고밀도로 포함할 때, 바람직한 실시예에 따라 이 단계를 수행할 수 있도록 한다. 이 실시예에 따르면, 이 단계(100)는 핵산 분자가 부착된 비드를 장치 내에, 웰(11)들 위 용액(40) 안에 위치시키는 제1 하위-단계(110)를 포함한다.
그 다음, 제2 하위-단계(120)는 메인 전극(51)과 제2 전극들 사이에 전위차를 인가하여, 전기영동에 의해 비드들이 웰의 바닥부에 있는 전극(52)을 향하도록 구동하는 것을 포함한다. 전극들 사이에 인가되는 전위차는 약 수 V/cm이다. 비드들의 전기 영동 이동도에 대한 더 자세한 정보는 2012년 4월 Analyticla. Methods지에 기재된 B. Xiong, A. Pallandre, I. Le Potier, P. Audebert, E. Fattal, N. Tsapis, G. Barratt 및 M. Taverna의 "레이저 도플러 유속계 및 마이크로미터의 형광 폴리스티렌 비드의 모세관 전기영동에 의한 전기영동 이동도 측정(Electrophoretic mobility measurement by laser Doppler velocimetry and capillary electrophoresis of micrometric fluorescent polystyrene beads)"를 참고바란다.
웰의 바닥부와 접촉할 때, 적어도 하나의 비드가 웰의 바닥부와 결합한다. 바람직하게는, 각각의 웰은 단지 하나의 비드만이 그 바닥부와 결합할 수 있도록 설계된다. 즉, 웰 바닥부의 단면은 비드의 단면의 두 배보다 작다.
그 다음, 고정 단계(100)는 전극들 사이의 전압을 역전시키는 제3 하위-단계(130)를 포함한다. 이로 인해, 모든 결합되지 않은 비드가 웰 밖으로 빠져나온다.
이들 하위-단계(120, 130)는 웰의 전체 로딩 효율을 최대화하기 위해 반복적으로 수행될 수 있다.
마지막으로, 웰 내에 결합된 비드의 존재 여부를 결정하기 위해, 적어도 하나의 웰의 전도도를 측정하는 하위-단계(140)가 수행될 수 있다.
그 다음, 이 방법은 액추에이터(30)로 비드(20)를 작동시켜 비드(20)와 웰(11)의 바닥(110)부 사이의 거리를 변화시키고, 이로 인해 분자들의 양 단부에 장력을 가하는 적어도 하나의 단계(200)와, 비드와 웰 바닥부 사이의 거리를 측정하는 적어도 하나의 단계(300)를 포함한다. 이 거리는 웰(11)의 저항을 측정함으로써 측정된다. 도 3을 참조하여 이미 상세하게 설명된 바와 같이, 이 측정 자체는 전류-전압 증폭기(530)의 출력 전압을 측정함으로써 수행된다.
이 방법은 수많은 다양한 방식으로 구현될 수 있지만, 웰의 바닥부로부터 다양한 거리에 있는 비드를 작동시키는 단계(200)를 복수로 포함하는 시퀀스를 포함하는 것이 바람직하다.
도 6에 도시된 바와 같이, 이 경우에 비드(20)와 웰(11)의 바닥부(110) 사이의 거리를 측정하는 단계(300)는 작동 단계(200)의 모든 시퀀스 동안 연속적으로 구현되는 것이 바람직하다.
대안적으로, 측정 단계(300)는 각각의 작동 단계와 동시에 수행될 수 있다.
비-제한적인 예시로서, 방법은 예를 들어, 시퀀스 구현예에 대해 보다 상세하게 참고할 수 있는 특허문헌 EP2390351에 개시된 시퀀스에 따라서 수행될 수 있다. 이 시퀀스는 아래의 단계들을 포함한다.
- 분자에 약 15pN 이상의 장력, 예를 들어 18pN의 장력을 가함으로써, 비드가 헤어핀 분자(M)의 두 가닥을 분리 시키도록 작동되는 단계들(200, 300)의 제1 쌍. 비드와 웰(11)의 바닥부(110) 사이의 거리가 측정되며, 이는 개방된 헤어핀 분자의 전체 길이에 대응한다.
- 단일-가닥 핵산 단편을 분자 M의 가닥 중 하나와 혼성화(hybridization)하는 단계(400)
- 단계들(200, 300)의 제2 쌍으로, 비드를 작동시켜 분자에 가해지는 장력을 해제하는 단계. 그 다음 핵산 분자(M)는 헤어핀을 재형성하기 위해 리지핑(rezip)한다.
하지만, 단계(400)에서 핵산 가닥들 중 하나에 혼성화된 단일-가닥 핵산 분자의 존재는 헤어핀의 재혼성화(또는 리지핑)에서 정지를 초래한다. 이러한 정지의 검출은 단일-가닥 핵산 분자가 헤어핀 분자(M)의 일부분에 상보적인 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 헤어핀 분자가 부분적으로 재-혼성화될 때 정지되는 동안 분자 길이의 측정을 포함하여, 헤어핀 분자의 재-혼성화 동안 분자의 길이의 연속 측정은, 분자에서 상기 서열의 위치를 결정할 수 있도록 한다. 실제로, 정지 시의 분자 길이와 분자의 총 길이 사이의 비교는 혼성화된 핵산 분자의 정확한 위치를 추측할 수 있도록 하며, 이로부터 상기 위치에서의 분자(M)의 서열을 추론할 수 있다.
또 다른 비-한정적인 실시예에 따르면, 방법은 예를 들어, 구현에 대한 세부사항을 참고할 수 있는 특허문헌 EP2390350에 개시된 시퀀스에 따라서 수행될 수 있다.
전술된 장치 및 방법은 종래 기술의 공지된 광학 검출 시스템에 관한 주요 개선점을 나타낸다.
첫째, 각 비드의 위치는 단순한 웰 구조의 임피던스 변화로부터 직접 추론된다. 이는 복잡한 광학 구성 요소에 대한 필요성을 제거한다.
두 번째로, 전술된 바와 같이, 웰뿐만 아니라 비드의 크기도 줄일 수 있다. 따라서, 단일 칩에 고밀도로 웰들을 채운 다음, 웰들의 임피던스를 병렬로 판독할 수 있다.
전술된 장치는 또한, 웰 내의 전류와 비드의 위치 사이의 관계는 계산을 위한 연산이 거의 필요하지 않기 때문에, 연산 요구사항이 감소된다.
마지막으로, 도 4a 및 도 4b를 참조하여 도시된 바와 같이, 비드의 작동을 가능하게 하는 자성 재료를 플레이트 상에 직접적으로 결합시키는 것이 가능해졌다. 이로 인해, 비드에 가해지는 힘이 훨씬 커지므로, 비드와 웰의 크기를 줄일 수 있다.

Claims (15)

  1. 핵산 분자(M)들을 분석하기 위한 장치(1)로,
    - 비드(20)로, 상기 비드 상에 하나의 분자의 일 단부가 고정될 수 있는, 비드(20),
    - 표면(520)으로, 상기 표면 상에 상기 분자의 타 단부가 고정될 수 있는, 표면(520),
    - 비드(20)가 상기 표면에 대해 한 방향 운동으로 이동하도록 만들기에 적합한 액추에이터(30),
    - 비드와 표면 사이의 거리를 측정하기에 적합한 센서(50)를 포함하는 핵산 분자 분석 장치에 있어서,
    상기 장치는, 비드의 운동 방향을 따라 연장하는 축(X-X)과 상기 표면에 의해 형성되는 바닥부(110)를 구비하는 웰(well)(11)을 추가적으로 포함하고, 상기 웰(11)은 전기 전도성 용액(40)으로 채워지고, 비드(20)는 웰 내에 수용되며, 센서(50)는 비드(20)와 표면(520) 사이의 거리에 따라 달라지는 웰(11)의 임피던스를 측정하고 측정된 임피던스로부터 비드와 표면 사이의 거리를 결정하기에 적합한 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    센서(50)는,
    - 웰의 상부에 전기 전도성 용액(40)과 접촉하도록 배치되는 메인 전극(51)으로, 상기 전극에는 알려진 전위가 걸려지고,
    - 웰(11)의 바닥부(110)에 있는 제2 전극(52)으로, 분자가 고정될 수 있는 표면(520)을 구비하는 제2 전극(52), 및
    - 전극들 사이에 흐르는 전류를 측정하기에 적합한 전자 회로(53)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    전자 회로(53)는,
    - 제2 전극(52)에 연결되는 전류-전압 증폭기(530),
    - 전류-전압 증폭기(530)의 출력 전압을 측정하기에 적합한 전압계(531), 및
    - 측정된 전압으로부터 웰의 임피던스를 연산하기에 적합한 연산 회로(532)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    웰(11)의 축(X-X)을 가로지르는 단면의 면적은 웰의 바닥부(110)로부터 상부까지 순증가(strictly increasing)하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    웰(11)의 바닥부에서의 단면적은 비드(20)의 최대 단면적보다 큰 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    웰(11)은 원뿔대 형상을 갖는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    웰(11)의 단면적은 웰의 바닥부(110)로부터의 거리에 따라 선형 증가하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  8. 제7항에 있어서,
    웰(11)의 단면은 웰의 바닥부(110)에서는 원형이고, 웰의 바닥부로부터의 거리에 따라 웰(11)의 축(X-X)에 직각인 방향으로 선형으로 성장하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    액추에이터는 웰의 축(X-X) 방향을 따라 변위 가능하게 장착되는 적어도 하나의 자석(31)을 포함하며, 비드(20)는 상자성 재료(paramagnetic material)로 제조되어, 웰의 바닥부(110)와 자석(31) 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  10. 제2항에 있어서,
    복수의 동일한 비드(20)와, 각각이 하나의 비드를 수용하기에 적합한 복수의 동일한 웰(11)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 장치는 복수의 제2 전극(52)들을 포함하고, 각각의 제2 전극은 각각의 웰 바닥부에 배치되어, 각각의 비드가 고정되는 표면을 형성하며,
    전자 회로는 복수의 전류-전압 증폭기(530)를 포함하고, 각각의 전류-전압 증폭기(530)는 각각의 제2 전극에 연결되며, 연산 회로(532)는 동시에 전류-전압 증폭기들의 출력 전압들을 측정하여 각각의 웰의 임피던스를 연산하기에 적합한 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 장치(1)는 전기 절연성 재료로 된 플레이트(10)를 포함하고, 플레이트(10) 내에 웰들이 형성되고, 모든 웰들은 플레이트(10)의 상부면(101)에서 개방되며, 액추에이터(30)는 자성 재료로 제조되는 복수의 막대(32)를 추가적으로 포함하고, 각각의 막대는 상부면(101)에 배치되어 인접한 두 웰(11)들 사이에서 연장하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    각각의 막대(32)는 길이가 10㎛ 미만이고, 각각의 비드(20)는 직경이 1㎛ 이하인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 장치.
  14. 핵산 분자의 분석 방법으로,
    상기 방법은 제1항에 따른 장치에 의해 수행되고, 상기 방법은 비드와 웰의 바닥부 사이의 거리를 측정하는 단계(300)를 적어도 하나 포함하며, 각각의 측정 단계는 웰 내 비드의 위치를 결정하는 것을 고려하여 웰의 임피던스를 측정하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 방법은 웰의 상부에 전기 전도성 용액(40)과 접촉하도록 배치되는 메인 전극(51)으로, 상기 전극에는 알려진 전위가 걸려지는, 메인 전극(51); 웰(11)의 바닥부(110)에 있는 제2 전극(52)으로, 분자가 고정될 수 있는 표면(520)을 구비하는 제2 전극(52); 및 전극들 사이에 흐르는 전류를 측정하기에 적합한 전자 회로(53)를 포함하는 장치에 의해 수행되고,
    상기 방법은 적어도 하나의 분자를 비드와 웰의 바닥부에 고정시키는 예비 단계(100)를 포함하며, 상기 예비 단계는,
    - 분자가 고정되는 적어도 하나의 비드를 용액(40) 내에 배치하는 단계(110),
    - 적어도 하나의 비드가 웰의 바닥부에 접촉하도록 하기 위해 메인 전극(51)과 제2 전극(52) 사이에 제1 전위차를 가하는 단계(120), 및
    - 웰의 바닥부와 결합하지 않은 비드들이 웰 밖으로 빠져 나오게 하기 위해, 전극들 간에 전위차를 수정하는 단계(130)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자 분석 방법.
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