KR102522521B1 - 나노입자를 제조하는 장치에 의해 제조된 활성산소종(ros)-반응성 약물 전달 나노입자 - Google Patents

나노입자를 제조하는 장치에 의해 제조된 활성산소종(ros)-반응성 약물 전달 나노입자 Download PDF

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Abstract

본 발명의 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 제 1 공급튜브피팅부재(111), 제 2 공급튜브피팅부재(112), 및 제 1 배출튜브피팅부재(114)를 포함하는 제 1 연결장치(110); 상기 제 1 공급튜브피팅부재(111)에 한 쪽이 연결된 제 1 튜브(121); 상기 제 2 공급튜브피팅부재(112)에 한 쪽이 연결된 제 2 튜브(122); 상기 제 1 배출튜브피팅부재(114)에 한 쪽이 연결된 제 1 도관(130); 상기 제 1 튜브(121)의 나머지 한쪽에 연결되어 제 1 물질을 상기 제 1 도관(130)에 공급하는 제 1 공급부(141); 및 상기 제 2 튜브(122)의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 2 물질을 상기 제 1 도관(130)에 공급하는 제 2 공급부(142);를 포함하는 나노입자 제조장치에 의해 제조된다.

Description

나노입자를 제조하는 장치에 의해 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 {ROS-responsive drug delivery nanoparticles produced by a device for producing nanoparticles}
본 발명은 나노입자를 제조하는 장치에 의해 제조된 ROS-반응성 약물 전달 나노입자 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
활성산소종(ROS)의 과발현은 암과 염증과 같은 질병을 야기시킨다. 따라서, 활성산소종(ROS) 생성으로 인한 부작용을 국부적으로 조절할 수 있는 물질의 개발은 매우 중요하다. 활성산소종(ROS)이 증가하면, 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 시스템(ROS-responsive drug delivery system)을 통해 표적 부위에서 약물 방출이 제어될 수 있다. 이 약물전달시스템으로서, ROS-민감성 고분자 나노입자의 개발은 중요하다.
그 중에서도 페로센은 우수한 생체 적합성을 포함하는 다양한 장점으로 인해 ROS-반응성 약물 전달 물질로서 유망한 물질이다. 그러나, 이러한 페로센을 포함하는 나노입자를 기존의 제조방법에 의해 대량으로 생산하는 것은 어려운 실정이다.
기존의 고분자 나노입자를 제조 방법으로서 emulsion polymerization, dispersion polymerization과 같은 회분식 공정 (Batch process)이 있다. 회분식 공정에서는 순수한 모노머로부터 고분자 중합 과정을 거쳐 고분자 나노 입자를 합성한다. 그러나, 회분식 공정에서 사용하는 고분자 중합은 매우 순수한 화학물질 (monomer, 개시제 등)을 사용하여 복잡하고 정교한 반응 공정 조절을 통해 긴 시간 동안 반응을 하여야 하고, 기존의 회분식 공정을 대량생산을 위해 scale-up 하는 경우, 조업조건을 다시 최적화하는데 많은 시간과 비용이 필요하다.
기존의 고분자 나노입자를 제조 방법으로서, 고분자를 비용매에 떨어뜨려서 고분자의 자기조립에 의해 나노 입자를 생성하는 나노침전법이 있다. 나노침전법에서는 나노입자의 전구체로 모노머가 아닌 고분자를 사용하기 때문에 공정이 비교적 간단하고, 순도가 낮고 저렴한 화학물질로도 비교적 균일한 나노 입자의 합성이 가능하다. 그러나, 혼합공정에서 정교한 조절이 어려워서 나노 입자의 균일도가 낮다. 또한, 기존의 회분식 공정으로 나노입자를 대량으로 만들 경우, 안정성이 좋지 못하여 시간이 지남에 따라 나노 입자의 크기분포를 유지할 수 없어서 대량으로 제조할 할 수 없다. 또한, batch 간의 재현성에 한계가 있고, 대량생산을 위해 scale-up 하는 경우, 조업조건을 다시 최적화하는데 많은 시간과 비용이 필요하다.
기존의 고분자 나노입자를 제조 방법으로서, 상기 회분식 공정의 한계점을 극복하기 위해서 미세 유체 장치(Microfluidic Device)를 이용하여 균일한 나노 입자를 연속 제조하는 방법이 개발되었다. Photolithography와 Replica molding 방법을 이용하여 미세유체(Microfluidic) 소자를 제조하고, 미세유체 소자 내에서 용액의 정교한 제어를 통해 나노 입자를 자기조립해서 만든다(Nanoletters 2008, 8, 2906, Adv. Mater 2011, 23, H79). 이는 미세유체소자를 이용한 나노침전법으로 회분식 벌크 나노침전법보다 더 균일한 나노입자를 제조할 수 있으며, 나노입자의 크기를 유량 등 조업 조건을 변경하여서 제어할 수 있다. 그러나 미세유체(Microfluidic) 채널의 크기가 매우 작아서 시간당 나노 입자의 생산량이 매우 작아서 산업적 응용에 적용하기 어려웠다.
기존의 고분자 나노입자를 제조 방법으로서, 상기 회분식 공정의 한계점을 극복하기 위해서 플래쉬 나노침전법(Flash nanoprecipitation)을 이용한 균일한 나노 입자 제조 방법이 개발되었다. 이는 모노머로부터 고분자 중합을 통해 균일한 나노 입자를 만드는 기존의 회분식 공정과 달리 고분자를 용매에 녹여서 전구체 용액을 만들고, 이를 비용매와 빠르게 혼합하여 균일한 나노 입자를 자기조립한다. 본 발명자는 기존에 T자 모양의 튜브 피팅에 구멍을 뚫고 주사바늘을 넣어서 접착제로 고정하는 방식으로 균일한 나노 입자를 생산할 수 있었다(ACS Nano 2014, 8, 6056). 그러나 coaxial tube의 정렬이 어렵고, 접착 부분의 물리/화학적 손상에 의해 전구체 용액이 새고, 전구체 물질과 비용매가 반응하여 합성된 입자가 디바이스 벽에 침전되어 디바이스가 오염되는 문제가 있었다. 또한, 실린지 펌프를 이용하였으므로 연속생산이 어렵고 유량을 조절할 수 없었다. 또한, 생산 직후에는 나노입자의 균일한 크기분포를 가지지만, 수용액에서 분산 안정성이 좋지 않아서 장시간 보관하거나 원심분리를 하면 응집이 형성되는 문제가 있었다
한국공개특허 KR 10-2013-0109736 미국공개특허 US 2013/0122058 A1
Nanoletters 2008, 8, 2906, Adv. Mater 2011, 23, H79 ACS Nano 2014, 8, 6, pp. 6056-6065
본 발명은 반응물을 혼합기에 주입시 용액이 새는 문제가 발생되지 않으며, 연속적으로 반응물을 혼합기에 주입할 수 있고, 독성이 강한 물질에도 안전하며, 난류 상태에서 혼합되므로 재현성이 높고 입자의 균일성이 증대된 나노입자 제조 장치를 제공하고자 한다.
또한, 이러한 나노입자 제조 장치를 이용하여 크기가 제어되고, 분산 안정성 및 활성산소종(ROS)에 대한 민감성이 현저히 개선된 ROS-반응성 약물 전달 나노입자를 제공하고자 한다.
본 발명의 실시예에 의한 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 하기의 나노입자 제조장치를 이용하여 제조된다.
상기 나노입자 제조장치는 제 1 공급튜브피팅부재, 제 2 공급튜브피팅부재, 및 제 1 배출튜브피팅부재를 포함하는 제 1 연결장치; 상기 제 1 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 1 튜브; 상기 제 2 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 2 튜브; 상기 제 1 배출튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 1 도관; 상기 제 1 튜브의 나머지 한쪽에 연결되어 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 도관에 공급하는 제 1 공급부; 및 상기 제 2 튜브의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 2 물질로서 비용매를 상기 제 1 도관에 공급하는 제 2 공급부;를 포함하고, 상기 제 1 튜브 또는 제 2 튜브는 적어도 일부가 상기 제 1 연결장치 내부 및 상기 제 1 도관 내에 배치되고, 상기 제 1 튜브 또는 제 2 튜브 중 상기 제 1 도관 내에 배치된 부분의 외경은 상기 제 1 도관의 내경 보다 작고, 상기 제 1 튜브 또는 제 2 튜브 중 상기 제 1 도관 내에 배치된 부분의 길이는 상기 제 1 도관의 길이보다 짧으며, 상기 제 1 연결장치, 제 1 튜브, 제 2 튜브, 및 제 1 도관의 재질은 불소계 고분자를 포함한다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치에서 상기 제 1 공급부 또는 제 2 공급부는 다이어프램 펌프일 수 있다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치에서 상기 제 1 연결장치는 제 3 공급튜브피팅부재를 더 포함하고, 상기 제 3 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 3 튜브; 및 상기 제 3 튜브의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 3 물질을 상기 제 1 도관에 공급하는 제 3 공급부를 더 포함할 수 있다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치는 연결튜브피팅부재, 제 4 공급튜브피팅부재, 및 제 2 배출튜브피팅부재를 포함하는 제 2 연결장치; 상기 연결튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 상기 제 1 도관; 상기 제 4 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 4 튜브; 상기 제 2 배출튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 2 도관; 상기 제 4 튜브의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 4 물질을 상기 제 2 도관에 공급하는 제 4 공급부;를 더 포함할 수 있고, 상기 제 2 연결장치, 제 4 튜브, 및 제 2 도관의 재질은 불소계 고분자를 포함할 수 있다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치에서 상기 제 1 튜브 및 제 2 튜브는 상기 제 1 연결장치에 수직으로 연결될 수 있다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치에서 상기 제 1 튜브 및 제 2 튜브는 상기 제 1 연결장치에 일렬로 연결될 수 있다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치에서 상기 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 도관에 공급하여, 상기 제 1 도관 내에 적어도 일부가 배치된 제 1 튜브의 제 1 도관 내의 끝부분에서 난류를 형성시키거나, 상기 제 2 공급부는 상기 제 2 물질로서 비용매를 상기 제 1 도관에 공급하여, 상기 제 1 도관 내에 적어도 일부가 배치된 제 2 튜브의 제 1 도관 내의 끝부분에서 난류를 형성시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치를 이용하여 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조하는 방법은 활성산소종(ROS)-반응성 작용기를 포함하는 고분자를 제조하는 단계; 상기 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 작용기를 포함하는 고분자를 용매에 용해시켜 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 제조하는 단계; 상기 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하고, 동시에 비용매를 제 2 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하는 단계; 상기 제 1 도관에 공급되는 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 및 상기 제 2 도관에 공급되는 비용매를 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계; 및 상기 제 1 도관 내에서 혼합된 물질로부터 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자를 형성하는 단계;를 포함한다.
또한, 상기 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 제조하는 단계에서, 제조되는 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액의 농도는 3 내지 15mg/mL일 수 있다.
또한, 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하는 단계에서, 동시에 상기 제 3 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 제3물질을 연속적으로 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계는 난류를 형성하면서 혼합될 수 있다.
또한, 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계에서 상기 제 1 도관 내에서 혼합된 용액 흐름의 레이놀즈 수(Reynolds number)가 1000 내지 4000일 수 있다.
또한, 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 생산 속도는 500 내지 1000mg/min일 수 있다.
또한, 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자를 형성하는 단계 이후 동결방지제 없이 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예를 따르는 나노입자를 제조하는 장치(100) 및 이를 이용하여 나노입자를 제조하는 방법은, 반응물을 혼합기에 주입시 용액이 새는 문제가 발생되지 않으며, 연속적으로 반응물을 혼합기에 주입할 수 있고, 독성이 강한 물질에도 안전하며, 난류 상태에서 혼합되므로 재현성이 높고 입자의 균일성이 증대된 나노입자를 제조할 수 있다.
또한, 이러한 나노입자 제조 장치를 이용하여 크기가 제어되고, 분산 안정성 및 활성산소종(ROS)에 대한 민감성이 현저히 개선된 ROS-반응성 약물 전달 나노입자가 제조될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)를 도시한 것이다.
도 2은 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)의 단면도이다.
도 3은 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)의 단면도이다.
도 4는 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치를 이용하여 페로센 나노입자를 제조하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 5은 일 실시예에 의한 페로센 고분자의 (a) 1H-NMR 분석결과 및 (b) GPC 분석 결과이다.
도 6은 일 실시예에 의한 페로센 나노입자의 (a)유체역학적 직경(hydrodynamic diameter), (b)다분산 지수(PDI) 및 (c) 표면 전하의 분석 결과이다. 또한, (d) D-FNP1, (e) D-FNP2의 TEM 분석 결과이다.
도 7는 일 실시예에 의한 페로센 나노입자의 장시간 안정성에 관한 (a) 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter) 및 (b)다분산 지수(PDI) 분석 결과이다. 또한, 동결건조 후 재분산 후 안정성에 관한 (c) 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter) 및 (d) 표면 전하의 분석 결과이다.
도 8은 일 실시예에 의한 페로센 나노입자의 활성산소종(ROS) 민감성에 관한 (a)유체역학적 직경(hydrodynamic diameter), 및 (b) 표면 전하의 분석 결과이다. 또한, (c) H2O2 처리를 통한 산화 전후의 D-FNP2의 TEM 분석 결과이다.
도 9는 일 실시예에 의한 페로센 나노입자의 세포 독성 분석 결과이다.
도 10은 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)에서 제 1 도관(130) 내부에서의 유체 흐름을 비교한 것이다.
도 11는 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)를 이용하여 제조된 폴리스티렌 나노입자의 직경에 따른 부피율을 나타낸 그래프이다.
도 12은 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)를 이용하여 제조된 폴리스티렌 나노입자의 직경에 다른 부피율을 비교예와 비교한 그래프이다.
도 13은 일 실시예에 의한 나노입자를 제조하는 장치(100)를 이용하여 제조된 폴리스티렌 나노입자의 직경에 따른 부피율을 비교예와 비교한 그래프이다.
도 14는 일 실시예에 의한 벌크 합성법에서 PS 대 PS-b-PEO의 중량비 (a) 0 wt%, (b) 12.5 wt%, (c) 25 wt%, and (d) 37.5 wt%에 따른 폴리스티렌 나노입자의 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 15는 일 실시예에 의한 나노입자 제조장치를 이용한 나노입자 제조방법에서 PS 대 PS-b-PEO의 중량비를 (a) 0 wt%, (b) 37.5 wt%에 따른 폴리스티렌 나노입자의 크기 분포 및 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "포함하는"과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "바람직한" 및 "바람직하게"는 소정 환경 하에서 소정의 이점을 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 지칭한다. 그러나, 동일한 환경 또는 다른 환경 하에서, 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 바람직한 실시 형태의 언급은 다른 실시 형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시 형태를 배제하고자 하는 것은 아니다.
각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 용어들 및 과학적 용어들은, 다르게 정의되어 있지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명을 보다 명확히 설명하기 위한 목적으로 선택된 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위해 선택된 것이 아니다.
본 발명의 실시예에 의한 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 하기의 나노입자 제조장치를 이용하여 제조된다.
또한, 일 실시예에 의한 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 페로센 작용기를 포함할 수 있다.
또한, 일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 카르복실산 작용기를 더 포함할 수 있다.
상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)는 제 1 연결장치(110); 제 1 튜브(121); 제 2 튜브(122); 제 1 도관(130); 제 1 공급부(141); 및 제 2 공급부(142);를 포함한다(도 1 및 도 2).
상기 제 1 연결장치(110)는 제 1 튜브(121), 제 2 튜브(122) 및 제 1 도관(130)이 연결될 수 있다면 그 형태에 특별한 제한이 없다. 또한, 상기 제 1 연결장치(110)는 두 개 이상의 튜브가 더 연결될 수 있으므로, 세 개 이상의 튜브 및 제 1 도관(130)이 연결될 수 있다면 그 형태에 특별한 제한이 없다. 일 예로 x-y축 상에서 보았을 때, 직각 면을 가진 형태로서 T자 형태 또는 크로스(Cross) 형태일 수 있으며, 직각 면이 없는 둥근 원형일 수 있다.
상기 제 1 연결장치(110)는 제 1 공급튜브피팅부재(111), 제 2 공급튜브피팅부재(112), 및 제 1 배출튜브피팅부재(114)를 포함한다. 각각의 튜브피팅부재는 제 1 연결장치(110)와 튜브 및 제 1 도관(130)을 연결하게 된다. 종래에는 연결장치을 통하여 반응물을 도관에 공급할 때, 연결장치의 윗 부분을 드릴로 뚫어 바늘을 넣어 도관으로 공급하였다. 이 때문에, 접착제로 바늘을 고정을 하였음에도 용액이 새는 경우가 발생하였다. 그러나 본 발명의 실시예에 따르면, 튜브피팅부재를 이용하여 튜브 및 제 1 도관(130)을 제 1 연결장치(110)에 고정하므로, 반응물이 새지 않고, 제조 시 독성이 있는 반응물로부터 안전하다. 또한, 튜브와 피팅(Fitting)만으로 조립하여 나노입자를 제조하는 장치(100)를 제작하기 때문에 기존의 장치보다 더 빠르고 간편하게 제작할 수 있다.
상기 제 1 튜브(121) 및 제 2 튜브(122)는 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 또는 제 2 물질로서 비용매가 제 1 공급부(141) 및 제 2 공급부(142)로부터 제 1 연결장치(110)를 통해 제 1 도관(130)에 도달할 수 있도록 한다. 상기 튜브의 형태는 삼각기둥 또는 사각기둥과 같은 직각기둥이거나 원통형일 수 있다. 또한, 튜브의 두께는 튜브 전체 단면적의 5% 미만, 10% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 또는 90% 미만일 수 있다. 상기 튜브의 형태나 두께를 조절하여 형성되는 나노입자의 크기 및 균일성을 제어할 수 있다.
상기 제 1 튜브(121)는 제 1 공급튜브피팅부재(111)에 한 쪽이 연결되고, 상기 제 2 튜브(122)는 제 2 공급튜브피팅부재(112)에 한 쪽이 연결된다. 각각의 튜브의 양 끝단 중 한 쪽은 공급부로부터 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 및 비용매가 주입되는 주입부이다. 각각의 튜브의 양 끝단 중 또 다른 한 쪽은 상기 주입된 반응물이 이동하여 제 1 연결장치(110)로 배출되는 배출부이다. 이 때 상기 서술한 바와 같이 튜브와 제 1 연결장치(110)는 튜브피팅부재로 연결된다.
상기 제 1 도관(130)은 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 또는 제 2 물질로서 비용매가 제 1 튜브(121) 또는 제 2 튜브(122)를 통해 도달하는 장소이다. 이 도달하는 부분에서 각 반응물이 혼합되어 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자가 형성된다. 이 때, 이 도달하는 부분에서 난류를 형성시키면 형성되는 나노입자의 생산량은 증가하게 된다. 보다 구체적인 내용은 후술한다.
상기 제 1 도관(130)은 제 1 배출튜브피팅부재(114)에 한 쪽이 연결된다. 제 1 도관(130)의 양 끝단 중 한쪽은 공급부로부터 공급되어 제 1 튜브(121) 및 제 2 튜브(122)를 통해 제 1 연결장치(110)로 배출된 반응물이 공급되는 주입부이다. 제 1 도관(130)의 양 끝단 중 다른 한쪽은 상기 주입된 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 및 비용매가 혼합되면서 형성되는 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자가 배출되는 배출부이다. 이 때 상기 서술한 바와 같이 제 1 도관(130)과 제 1 연결장치(110)는 튜브피팅부재로 연결된다.
상기 제 1 공급부(141) 및 제 2 공급부(142)는 페로센 전구체 용액인 제 1 물질 또는 비용매인 제 2 물질을 각각 제 1 튜브(121) 또는 제 2 튜브(122)에 공급하여, 제 1 연결장치(110)를 통해 제 1 도관(130)에 도달할 수 있도록 한다. 제 1 공급부(141)는 제 1 튜브(121)의 나머지 한쪽에 연결되어 제 1 물질을 제 1 도관(130)에 공급하고, 제 2 공급부(142)는 제 2 튜브(122)의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 2 물질을 제 1 도관(130)에 공급한다. 제 1 도관(130)에 공급된 제 1 물질과 제 2 물질은 제 1 도관(130) 내에서 혼합되면서 나노입자를 형성하게 된다. 이로써 공급부를 통해 유체 흐름을 변화시킴에 따라 나노입자의 물리화학적 특성을 정밀하게 조절할 수 있다. 일 예로서 공급부를 통해 제 1 도관(130) 내에 흐르는 반응물의 유속을 다르게 하여 반응물을 제 1 도관(130)에 공급하면, 형성되는 나노입자의 크기 및 균일도가 달라지게 된다.
한편, 공급부로서 실린지 펌프(Syringe pump)를 사용하는 경우에는, 상기 서술한 주사기를 통해 용액을 주입하므로, 나노입자의 연속생산에 어려움이 있을 수 있다. 이는 주사기에 들어있는 용액을 모두 사용하게 되면 다시 주사기를 갈아줘야 하기 때문이다. 따라서, 반응물을 공급부로부터 연속적으로 튜브에 공급할 수 있는 펌프를 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다. 이러한 펌프의 일 예로서 다이어프램 펌프, 스무디 펌프, 플런저 펌프, 유압 바이패스 펌프, 솔레노이드 펌프, 드럼 펌프 또는 마그네트 펌프 등이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 다이어프램 펌프가 사용될 수 있다. 공급부로서 다이어프램 펌프를 사용하는 일 예에서, 다이어프램의 저장부에 용액을 계속 보충한다. 용액 주입 시 맥동을 줄이기 위하여 맥동 감쇠기 (pulsation damper)가 사용될 수 있다.
상기 제 1 튜브(121) 또는 제 2 튜브(122)는 적어도 일부가 상기 제 1 연결장치(110) 내부 및 상기 제 1 도관(130) 내에 배치된다. 반응물이 이동하는 튜브의 적어도 일부가 제 1 도관(130) 내에 배치되므로, 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액이 비용매와 만날 때, 디바이스의 벽면과 접촉하지 않는다. 종래 의 나노침전법(Nanoprecipitation)을 이용하는 경우에는, 나노 전구체 용액과 비용매가 만나서 나노입자가 디바이스 벽에 침전된다. 따라서 디바이스가 오염되고, 효율이 떨어지며, 장기적으로 사용하는 경우 디바이스를 교체해 주어야 하는 문제가 있었다. 그러나 본 발명의 실시예에 따르는 나노입자를 제조하는 장치(100)를 이용하는 경우에는 나노 전구체 용액과 비용매가 만날 때에 침전물이 장치에 유착되는 것을 방지한다.
또한, 반응물이 이동하는 튜브의 적어도 일부가 제 1 도관(130) 내에 배치되므로 반응물이 상기 제 1 도관(130) 내에 직접 공급될 수 있다. 그렇지 않은 경우에는 제 1 연결장치(110)에 반응물을 공급하여 이를 통해 제 1 도관(130)에 흐르도록 할 수 있다.
상기 제 1 튜브(121) 또는 제 2 튜브(122) 중 상기 제 1 도관(130) 내에 배치된 부분의 외경은 상기 제 1 도관(130)의 내경 보다 작다. 보다 구체적으로 튜브의 외경은 제 1 도관(130)의 내경의 90% 이하, 80%이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하일 수 있다. 또한, 상기 제 1 튜브(121) 또는 제 2 튜브(122) 중 상기 제 1 도관(130) 내에 배치된 부분의 길이는 상기 제 1 도관(130)의 길이보다 짧다. 이로써, 상기 제 1 도관(130) 내에서 반응물이 혼합되어 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 제 1 연결장치(110), 제 1 튜브(121), 제 2 튜브(122), 및 제 1 도관(130)의 재질은 불소계 고분자를 포함한다. 공급부로서 실린지 펌프를 사용하는 경우, 유리 주사기를 사용해야 하기 때문에 주사기가 깨질 수 있다. 또한, 실린지 펌프로부터 제 1 연결장치(110)까지 연결되는 모세관이 유리로 되어 있는 경우에는 보다 깨지기 쉬워, 반응물로 독성물질을 사용하는 경우에는 안전성에 문제가 있을 수 있다. 이에, 본 발명의 실시예에 따르는 나노입자를 제조하는 장치(100)는 공급부, 제 1 연결장치(110), 튜브, 제 1 도관(130) 등 용액이 닿는 모든 부분에 불활성의 불소계 고분자 재질을 사용하여 안전하다. 일 예로서 공급부로서 다이아프램 펌프를 사용할 경우에 다이아프램 펌프 중 용액이 닿는 부분은 모두 불소계 고분자 재질이 사용된다. 이러한 불소계 고분자의 일 예로서 Fluorinated ethylene propylene (FEP), Ethylene tetrafluoroethylene (ETFE), Polytetrafluoroethylene (PTFE), Polyvinylidene fluoride (PVDF), Polyvinylfluoride (PVF), Polychlorotrifluoroethylene (PCTFE), Perfluoroalkoxy polymer (PFA), Ethylenechlorotrifluoroethylene (ECTFE), 또는 Perfluoropolyether (PFPE) 등이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 ETFE와 FEP가 사용될 수 있다.
일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)에서 상기 제 1 공급부(141) 또는 제 2 공급부(142)는 다이어프램 펌프일 수 있다. 다이어프램 펌프는 펌프막의 상하 운동에 의해 액체를 퍼올리고 배출하는 형식의 펌프로서, 보통 가솔린 엔진의 연료 펌프 등에 사용된다. 전술한 바와 같이 나노입자를 제조하는 데에 실린지 펌프를 사용하는 것보다는, 다이어프램 펌프를 적용함으로서 보다 연속적으로 나노입자를 형성할 수 있다. 용액 주입 시 맥동을 줄이기 위하여 맥동 감쇠기 (pulsation damper)가 사용될 수 있다.
일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)에서 상기 제 1 연결장치(110)는 제 3 공급튜브피팅부재(113)를 더 포함하고, 상기 제 3 공급튜브피팅부재(113)에 한 쪽이 연결된 제 3 튜브(123); 및 상기 제 3 튜브(123)의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 3 물질을 상기 제 1 도관(130)에 공급하는 제 3 공급부(143)를 더 포함할 수 있다. 제 3 공급튜브피팅부재(113)는 제 1 연결장치(110)와 제 3 튜브(123)를 연결한다. 제 3 튜브(123)는 제 3 물질이 제 3 공급부(143)로부터 제 1 연결장치(110)를 통해 제 1 도관(130)에 도달할 수 있도록 한다. 일 실시예로서, 제 3 튜브(123)를 통해 반응물이 흐르게 되고, 제 3 튜브(123)는 튜브피팅부재에 연결되므로 반응물이 새지 않는다. 제 3 공급부(143)는 제 3 물질을 제 3 튜브(123)에 공급하여 제 1 연결장치(110)를 통해 제 1 도관(130)에 도달할 수 있도록 한다. 상기 제 3 공급부(143)는 제 3 튜브(123)의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 3 물질을 제 1 도관(130)에 공급한다. 제 3 공급부(143)는 연속적으로 제 3 물질을 제 1 도관(130)에 공급할 수 있는 펌프이면 제한이 없으며, 가장 바람직하게는 다이아프램 펌프일 수 있다. 또한, 제 3 물질은 제 1 물질과 동일하거나 상이한 나노 전구체, 제 2 물질과 동일하거나 상이한 비용매, 계면활성제 또는 ??칭(Quenching) 물질일 수 있으며, 그 외 반응시킬 수 있는 물질이면 모두 가능하다. 본 발명의 실시예에 따르는 나노입자를 제조하는 장치(100)는 튜브피팅부재를 이용하므로 추가적으로 튜브를 연결하는 것이 가능하게 되어 상기 서술한 제 3 물질을 투입시키는 것이 가능하다(도 4).
일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)에서 연결튜브피팅부재(211), 제 4 공급튜브피팅부재(212), 및 제 2 배출튜브피팅부재(213)를 포함하는 제 2 연결장치(210); 상기 연결튜브피팅부재(211)에 한 쪽이 연결된 상기 제 1 도관(130); 상기 제 4 공급튜브피팅부재(212)에 한 쪽이 연결된 제 4 튜브(222); 상기 제 2 배출튜브피팅부재(213)에 한 쪽이 연결된 제 2 도관(230); 상기 제 4 튜브(222)의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 4 물질을 상기 제 2 도관(230)에 공급하는 제 4 공급부(242);를 더 포함하고, 상기 제 2 연결장치(210), 제 4 튜브(222), 및 제 2 도관(230)의 재질은 불소계 고분자를 더 포함할 수 있다(도 3).
일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)는 튜브피팅부재를 이용하므로 추가적으로 튜브를 연결하는 것이 가능하게 되어 제 4 물질을 투입시키는 것이 가능하다. 상기 구성들이 더 추가됨으로서 제 1 물질 및 제 2 물질이 혼합 또는 반응한 물질, 또는 제 1 물질, 제 2 물질, 및 제 3 물질이 혼합 또는 반응한 물질에 제 4 물질을 더 반응시킬 수 있게 된다. 제 4 물질은 나노 전구체 또는 비용매와 같은 물질일 수 있으며, 제 1 물질과 동일하거나 상이한 나노 전구체, 제 2 물질과 동일하거나 상이한 비용매, 계면활성제 또는 ??칭(Quenching) 물질일 수 있으며, 그 외 반응시킬 수 있는 모든 물질이 될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제 4 튜브(222)를 통해 반응물이 흐르게 되고, 제 4 튜브(222)는 튜브피팅부재에 연결되므로 반응물이 새지 않는다. 제 4 공급부(242)는 나노 전구체 또는 비용매 등의 반응물이 되는 제 4 물질을 제 4 튜브(222)에 공급하여 제 2 연결장치(210)를 통해 제 2 도관(230)에 도달할 수 있도록 한다. 상기 제 4 공급부(242)는 제 4 튜브(222)의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 4 물질을 제 2 도관(230)에 공급한다. 제 4 공급부(242)는 연속적으로 제 4 물질을 제 2 도관(230)에 공급할 수 있는 펌프이면 제한이 없으며, 가장 바람직하게는 다이아프램 펌프일 수 있다.
그 외 제 2 연결장치와 이와 연결된 각종 피팅부재, 튜브, 도관, 및 공급부에 관한 내용은 제 1 연결장치(110)에 연결된 각종 피팅부재, 튜브, 도관, 및 공급부에 관한 모든 설명을 포함한다.
또한, 제 5 물질, 제 6 물질 등이 상기 제 1 물질 내지 제 4 물질이 공급되는 것과 동일한 방식으로 공급될 수 있으며, 공급되는 물질의 수에는 제한이 없다.
일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)에서 상기 제 1 튜브(121) 및 제 2 튜브(122)는 상기 제 1 연결장치(110)에 수직으로 연결될 수 있다(도 1). 또는, 10°, 20°, 30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 80° 의 각도 등 그 연결 각도에 제한이 없다. 또한, 본 발명의 실시예를 따르는 나노입자를 제조하는 장치(100)에서 상기 제 1 튜브(121) 및 제 2 튜브(122)는 상기 제 1 연결장치(110)에 일렬로 연결될 수 있다(도 3). 또는, 100°, 110°, 120°, 130°, 140°, 150°, 160°, 170°, 180°의 각도 등 그 연결 각도에 제한이 없다. 일렬로 연결되는 경우에는 제 1 튜브(121)의 일부가 제 1 연결장치(110) 및 제 1 도관(130) 내에 배치될 뿐만 아니라, 제 2 튜브(121)의 일부도 제 1 연결장치(110) 및 제 1 도관(130) 내에 배치될 수 있다.
일 실시예에 의한 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조장치(100)에서 상기 제 1 공급부(141)는 상기 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 도관(130)에 공급하여, 상기 제 1 도관(130) 내에 적어도 일부가 배치된 제 1 튜브(121)의 제 1 도관(130) 내의 끝부분에서 난류를 형성시키거나, 상기 제 2 공급부(142)는 상기 제 2 물질로서 비용매를 상기 제 1 도관(130)에 공급하여, 상기 제 1 도관(130) 내에 적어도 일부가 배치된 제 2 튜브(122)의 제 1 도관(130) 내의 끝부분에서 난류를 형성시킬 수 있다. 난류란 불규칙한 유체의 흐름을 의미하며, 규칙적으로 흐르는 흐름인 층류와 대비되는 개념이다. 와류, 제트류 등이 이에 해당된다. 종래에는 제 1 도관(130) 내에서 확산에 의하여 혼합되므로, 유량이 느리고 생산량이 적었다. 또한 반응시간이 길어 생산된 입자의 크기가 크고, 입자가 균일하지 못하였다. 그러나 본 발명의 실시예에 따른 나노입자를 제조하는 장치(100)에서는 제트류와 같은 난류 상태에서 혼합되므로, 나노입자의 생산량이 많고, 나노입자의 크기가 작으며, 균일하다.
본 발명의 실시예에 의한 상기 나노입자 제조장치를 이용하여 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조하는 방법은 활성산소종(ROS)-반응성 작용기를 포함하는 고분자를 제조하는 단계; 상기 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 작용기를 포함하는 고분자를 용매에 용해시켜 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 제조하는 단계; 상기 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하고, 동시에 비용매를 제 2 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하는 단계; 상기 제 1 도관에 공급되는 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 및 상기 제 2 도관에 공급되는 비용매를 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계; 및 상기 제 1 도관 내에서 혼합된 물질로부터 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자를 형성하는 단계;를 포함한다.
일 실시예로서, 상기 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 제조하는 단계에서 제조되는 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액의 농도는 3 내지 15mg/mL, 5 내지 13 mg/mL, 또는 8 내지 11 mg/mL 일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하는 단계에서, 동시에 상기 제 3 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 비용매를 연속적으로 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계는 난류를 형성하면서 혼합될 수 있다.
또한, 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계에서 상기 제 1 도관 내에서 혼합된 용액 흐름의 레이놀즈 수(Reynolds number)가 1000 내지 4000, 1000 내지 3000, 또는 1500 내지 2500일 수 있다.
또한, 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 생산 속도는 500 내지 1000mg/min일 수 있다.
또한, 상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자를 형성하는 단계 이후 동결방지제 없이 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
<실시예 I> 페로센을 포함하는 나노입자의 제조
<나노입자 제조 장치의 제조>
ETFE로 만든 제 1 연결장치에 ETFE로 만든 튜브피팅부재(를 이용하여, 3 개의 FEP 튜브(OD = 3.175mm 및 ID = 1.55mm)를 연결한 나노입자 제조장치를 제조하였다. 유속을 조절하기 위해, 다이어그램 펌프 및 맥동 댐퍼가 연결되었다(도 4).
<라디칼 중합 반응에 의한 페로센 고분자의 합성>
2mmol 페로세닐메틸 메타 아크릴레이트(Ferrocenylmethyl methacrylate, FMMA), 10mmol 메타크릴산(mrthacrylic acid, MA, 99%) 및 라디컬 개시제인 AIBN 0.12mmol을 10ml의 무수 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 후 70℃에서 24시간동안 교반하여 중합반응이 수행되었다. 페로센 고분자의 순도를 1H NMR 로 측정하였다. 중합체의 분자량(Mw) 및 다분산지수(polydispersity index, PDI) 35℃ 에서 1.0mL/min의 유속에서 THF를 용리액으로하여 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 분석하였다.
<실시예 I-1>
상기 나노입자 제조장치를 이용한 페로센 나노입자(D-FNP)의 제조
상기 라디칼 중합 반응에 의해 제조된 페로센 폴리머를 THF에 용해시켜 페로센 전구체 용액을 준비하였다.
실시예 1(D-FNP1)은 페로센 전구체 용액의 농도 5mg/mL 인 경우, 실시예 2(D-FNP2)는 10 mg/mL 인 경우이다.
다음으로 상기 실시예에 의한 나노입자 제조장치를 이용하여 페로센 나노입자(D-FNP1, 2)를 제조하였다(도 4).
도 4는 페로산 전구체 용액과 물 또는 탈이온수가 각각 투입되는 것을 보여준다. 평균 레이놀즈 수는 식 Re = QD/vA 에 의해 계산되었으며, 여기서 Q, v, D 및 A는 각각 유체 혼합물의 총유량, 동점도, 외부 튜브 직경 및 단면적을 의미한다. Re 값을 계산하기 위해, 물-THF 혼합물의 동점도 v는 물-THF 혼합물에서 이미 보고된 μ 및 ρ값에 의해 계산되었다. Re는 2,000으로 조절되고, 내부 흐름 대 외부 흐름의 체적 유속비는 1:5로 조절되었다. 나노입자 현탁액을 진공 오븐에 진공 게이지 -0.08 MPa, 25℃에서 2 시간 동안 두어 잔류 유기 용매를 제거하였다.
<비교예 I-1>
벌크 합성법에 의한 페로센 나노입자(B-FNP)의 제조
상기 라디칼 중합 반응에 의해 제조된 페로센 폴리머를 THF에 용해시켜 페로센 전구체 용액을 준비하였다.
5mL의 탈이온수에 1mL의 전구체 용액을 적가하고 교반기에서 5분동안 교반하여 페로센 나노입자(B-FNP)를 제조하였다.
<분석방법>
페로센 나노입자의 형태(morphology) 및 안정성 분석
전기 영동 광산란 분광 광도법 (electrophoretic light scattering spectrophotometry, ELS-Z2)를 이용한 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해, 상기 실시예 및 비교예에 의한 페로산 나노입자의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter), 다분산 지수(PDI) 및 표면 전하를 분석하였다. 페로산 나노입자의 형태는 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 분석하였다. 페로산 나노입자의 장기 안정성(long-term stability)은 1, 2, 4 및 7일, 1 및 2개월의 선택된 시점에서 유체 역학적 직경 및 PDI를 모니터링하여 분석하였다. 다음으로, 동결 건조된 페로센 나노입자의 재분산성을 DLS를 이용하여 평가하였다. 동결 건조된 페로센 나노입자를 생물학적 완충액(PBS, pH 7.4)에 1mg/mL 농도로 재현탁한 다음, 입자 크기 변화를 분석하였다.
페로센 나노입자의 활성산소종(ROS)에 대한 특성 분석
산화제로서100mM의 과산화수소 (H2O2)를 상기 실시예에 의한 페로센 나노입자 2mg/mL가 포함된 수용액에 투입하면서 부드럽게 저어주었다. 이후, DLS를 사용하여 상기 선택된 시점에서 페로센 나노입자의 크기 및 표면 전하의 산화에 의해 유발된 변화를 분석하였다. 또한, 산화된 페로센 나노입자의 형태학적 변화는 TEM을 사용하여 (0, 2 및 4) h의 각 선택된 시점에서 모니터링하였다.
체외 세포 독성
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법으로, 페로센 나노입자의 세포 독성을 평가하였다. 마우스 배아 섬유 아세포 (NIH 3T3)를 10 % 소 태아 혈청(FBS) 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신이 보충된 DMEM에서 배양하고, 5% CO2, 37 ℃의 가습 분위기에서 유지하였다. 세포를 하나의 웰(well)당 10,000개 세포의 밀도로 96- 웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 이후, 각각 (10, 20, 50, 100)μg/mL 농도의 페로센 나노입자를 세포에 처리하고 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 MTT 용액(1mg/mL)으로 교체하고, 세포를 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 마지막으로 배지를 DMSO로 대체하여 포르 마잔(formazan) 결정을 용해시켰다. 생존 세포에 의해 생성된 포르마잔의 흡광도는 570nm에서 마이크로플레이트 리더에 의해 검출되었다. 세포 생존율은 다음 방정식을 사용하여 백분율로 계산했다.
식 : (샘플-처리 된 세포의 A570 / 처리되지 않은 세포의 A570) Х 100.
상기 모든 실험은 세 번 수행되었다.
<분석결과>
페로센 폴리머 및 페로센 나노입자의 특성 분석 결과
상기 라디칼 중합 반응에 의해 합성된 페로센 고분자는 소수성 페로센 부분을 가진 FMMA와 친수성 COOH 그룹을 가진 MA로 구성된다. 페로센 고분자의 1H NMR분석 결과를 도5(a)에 기재하였다. 이는, δ = 12.4 (br, 1H, COOH of MA), 4.8 (br, 2H, CO2-CH2 of FMMA), 4.2 (br, 9H of FMMA), (3.7 - 3.3) (br, 20H), (2.7 - 2.5) (br, 18H), (2.0 - 1.7) (br, 15H), and (1.1 - 0.8) (br, 17H) ppm 로 분석되었다.
메타크릴레이트 양성자의 전형적인 모노머 피크는 각각 5.56 및 6.08 ppm에서 나타나며, 피크는 일반적으로 날카롭다. 중합 후, 모노머 피크는 완전히 사라지고, 0.8-2.0ppm에서 폴리머의 넓은 알킬 사슬 피크가 명확하게 확인되었다. 이는 페로센 폴리머가 성공적으로 합성되었음을 의미한다. 흥미롭게도, 12.4, 4.8 및 4.2 ppm에서 새로운 피크가 확인되었는데, 이는 페로센 폴리머의 패로센 및 카르복실 그룹의 양성자에 의한 것이다.
도 5(b)의 페로센 폴리머의 GPC분석 결과에 따르면, 분자량(Mw)과 다분산지수 (PDI)는 Mw = 6,304, Mw/Mn = 1.895이며, 폴리머 수율은 99 %이다.
Re가 2,000으로 조절되는 경우, 페로센 폴리머 전구체 용액은 난류 흐름에 의해 비용매인 탈이온수와 빠르게 혼합됨으로서, 소수성 페로센 폴리머가 안정적인 페로센 나노입자로 자기 조립되었다.
도 6(a)-(c)를 참조하면, B-FNP에 비해 D-FNP가 평균 직경이 작고 PDI가 더 낮음을 확인할 수 있다. 또한, 나노입자의 평균 크기가 감소함에 따라 단위 부피당 표면적이 증가하기 때문에 D-FNP의 제타 전위가 더 작다는 것을 확인할 수 있다. 비교예에 의한 경우, 페로센 나노입자를 제조하는 시간이 오래 걸리고, 균일한 크기 분포를 생성하기 어렵고 특정 합성 조건에 크게 의존한다. 나노입자를 대량 생산하기 위해 스케일-업을 하는 경우, 제조되는 나노입자의 평균 직경이 더 크고 PDI가 더 높으며 부분 응집이 발생하는 것을 확인할 수 있다. 반면 도 6(d)-(e)를 참조하면, D-FNP는 평균 크기가 작고 균일한 크기 분포를 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 일 실시예에 의한 나노입자 제조장치를 이용한 제조방법에 의해 D-FNP가 완전히 연속적인 방식으로 합성됨을 의미한다.
결과적으로 D-FNP의 대량 생산은 단순히 더 많은 전구체 용액과 비용매를 각 저장소에 붓는 것만으로도 쉽게 달성할 수 있었다. 일 실시결과로서, 10mg/mL 전구체 용액을 사용하고 Re를 2,000으로 고정했을 때 D-FNP의 생산 속도는 633mg/min, 즉 332.7kg/yr를 생산할 수 있음을 확인하였다.
페로센 나노입자의 분산 안정성 분석 결과
DLS를 이용하여, 하기 두 가지 다른 조건에서 분산 안정성을 평가하였다.
첫 번째 조건으로, B-FNP와 D-FNP의 유체 역학적 직경과 PDI를 실온의 수성 매체에서 2 개월 동안 분석한 결과를 도 7(a)(b)에 기재하였다. 5 mg/mL 전구체 용액에 의해 제조된 B-FNP는 1 일 직후 응집되어 직경이 크게 증가하였다. 이것은 B-FNP가 시간이 지남에 따라 안정성이 크게 제한된다는 것을 의미한다. 이에 반해, 5mg/mL 전구체 용액을 사용하여 제조한 D-FNP1의 경우 유체 역학적 직경과 PDI는 2 개월 동안 유의한 변화가 없었다. 전구체 용액의 농도가 증가하면 나노입자의 생산 속도가 증가하지만, 나노입자 분산 안정성을 유지하기 어렵다. 그러나, 10mg/mL 전구체 용액을 사용한 D-FNP2의 경우에도 유체 역학적 직경과 PDI는 2 개월 동안 변하지 않고, 수성 매질에서 2개월 동안 안정된 분산 안정성을 확인할 수 있었다.
두 번째 조건으로, D-FNP를 동결 건조하고 생물학적 완충액(PBS, pH 7.4)에 재 분산한 결과를 도 7(c)(d)에 기재하였다. 일 실시예는, sucrose, trehalose, 또는 glucose와 같은 동결 방지제 없이 제조되었지만, 큰 변화없이 쉽게 재분산되었음을 확인할 수 있다. B-FNP의 경우 제조 초기에 부분 응집이 관찰되었기 때문에 동결 건조 후 재분산이 이루어지지 않았다. 이러한 결과는 D-FNP가 약물 전달을 위한 다양한 플랫폼을 제공할 수 있음을 의미한다.
페로센 나노입자의 활성산소종(ROS) 민감성 분석 결과
D-FNP2의 ROS 민감도를 평가하기 위해, 수용성 산화제로서 100mM H2O2가 크기, 표면 전하 및 형태에 미치는 영향을 분석하였다. H2O2에 노출된 후 D-FNP2의 직경이 크게 증가했으며 그 효과는 시간에 의존하였다. 이는 일 실시예에 의한 페로센 나노입자 내에 함유되어 있던 기능성 물질(약물 등)을 외부환경에 선택적으로 방출할 수 있음을 의미한다.
도 8(a)는 H2O2 처리 후 1 내지 3 시간이 지난 후 D-FNP2의 크기가 각각 378 nm에서 약 1 μm정도 증가했음을 보여준다. H2O2는 나노입자의 카르복실 껍질을 통해 빠르게 확산될 수 있으며, 페로센 코어를 페로세늄(ferrocenium)으로 산화시킨다. 이의 높은 친수성으로 인해 미셀이 부풀어 오르고 심지어 페로세늄 이온 사이의 정전기에 의해 ð-ð 스태킹 효과가 즉시 사라져 깨질 수 있다. 또한, D-FNP2의 표면 전하가 극적으로 감소하여 D-FNP2의 페로센 그룹에서 양으로 하전 된 페로세늄(Fe3+)이 형성되면 음의 표면 전하가 감소할 수 있다(도8(b)). D-FNP2의 산화환원에 대한 민감성을 시각화하기 위해, H2O2 처리를 통한 산화 전후의 D-FNP2의 TEM 이미지를 비교하였다. 도 8(c)를 참조하면, 산화가 2 시간 진행된 이후, 팽창된 D-FNP2의 확대된 모양이 관찰된다. 산화 후 4 시간 째에 D-FNP2의 부서진 단편이 명확히 확인된다.
페로센 나노입자의 세포 독성 분석 결과
D-FNP2의 생체 적합성을 확인하기 위해, NIH 3T3 섬유 아세포를 사용하여 D-FNP2의 세포 독성을 평가하였다(도 9). 나노입자 처리 후 MTT 분석에 의해 세포 생존력을 분석하였다.
도 9를 참조하면, 0 내지 100μg/mL 범위의 농도에서 D-FNP2에 의해 세포 생존력이 크게 영향을 받지 않음을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 ROS 민감성 D-FNP2가 우수한 생체 적합성을 가지고 있으며, 다양한 생체 의학 응용에 적합하다는 것을 의미한다.
결론적으로, 기존의 페로센 나노입자 제조방법의 한계를 극복하기 위해 일 실시예에 의한 나노입자 제조장치를 이용하여, 높은 생산 속도로 페로센 나노입자를 연속적으로 제조할 수 있었다. 비교예에 의한 B-FNP에 비해 실시예에 의한 D-FNP는 유체 역학적 직경, PDI 및 제타 전위가 더 작다. 또한, B-FNP는 분산 안정성이 제한적이기 때문에 장기 안정성이 떨어지지만, D-FNP2가 10mg/mL 전구체 용액을 사용하여 제조되었음에도 불구하고 2개월 동안 매우 안정적인 분산 안정성을 보여준 것은 주목할 만하다. 또한, 동결 방지제 없이 동결 건조한 후 D-FNPs는 재분산시 높은 안정성을 보였다. 또한, D-FNP는 ROS에 대한 높은 민감도와 우수한 생체 적합성을 나타냈다. ROS 반응성, 균일한 크기 조절, 매우 안정적인 D-FNP는 다양한 질병에 대한 효과적이고 조절 가능한 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 의한 나노입자 제조장치의 나노입자 성능을 확인하기 위하여, 폴리스티렌 나노입자 제조에 관한 하기의 실험을 진행하였다.
<실시예 II> 폴리스티렌 나노입자(PS NP)의 제조
<실시예 II-1 및 실험에 II-1>
본 발명의 실시예에 따른 나노입자 제조장치(100)를 제작하였다. 폴리스티렌(MW: 350,000)을 테트라하이드로퓨란(THF)에 1mg/ml의 농도로 용해시킨 후, 다이아프램 펌프를 이용하여 하나의 튜브를 통하여 도관 내에 흐르게 하였다. 다음으로 물을 주입하여 두 개의 튜브를 통하여 도관에 흐르게 하였다. 두 유량 총합의 유속을 이용하여 레이놀즈 수를 계산하고, 이에 따른 나노입자의 형성 속도를 계산한 결과를 하기 표 1 에 나타내었다.
<표 1>
Figure 112021000902121-pat00001
상기 실험결과에 따르면, 레이놀즈 수에 따른 유속이 증가할수록, 제조되는 폴리스티렌 나노입자의 형성 속도도 같은 배속으로 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 1 중 레이놀즈 수가 3000인 경우에 의해 형성되는 폴리스티렌 나노입자의 직경에 따른 부피율을 나타낸 그래프를 도 11에 나타내었다. 폴리스티렌(MW: 350,000)을 테트라하이드로퓨란(THF)에 1mg/ml의 농도로 용해시킨 후, 다이아프램 펌프를 이용하여 하나의 튜브를 통하여 33mL/min의 유속으로 도관에 흐르게 하였다. 다음으로 물을 주입하여 두 개의 튜브를 통하여 330mL/min의 유속으로 도관에 흐르게 하였다. 전체 유량 총합의 레이놀즈 수는 3000 이다.
이로써 동일 조건에서 여러 번 폴리스티렌 나노입자를 제조한 경우, 나노입자의 평균 크기와 크기 분포는 매우 유사함을 확인할 수 있다. 즉, 제조시마다 연속적으로 균질성이 좋은 폴리스티렌 나노입자가 제조됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 II-2>
본 발명의 실시예에 따른 나노입자 제조장치(100)를 제작하였다. 폴리스티렌(MW: 35,000)을 테트라하이드로퓨란(THF)에 1mg/ml의 농도로 용해시킨 후, 다이아프램 펌프를 이용하여 하나의 튜브를 통하여 27.5mL/min의 유속으로 도관에 흐르게 하였다. 다음으로 물을 주입하여 두 개의 튜브를 통하여 275mL/min의 유속으로 도관에 흐르게 하였다. 전체 유량 총합의 레이놀즈 수는 2500 이다.
<실시예 II-3>
본 발명의 실시예에 따른 나노입자 제조장치(100)를 제작하였다. 폴리스티렌(MW: 35,000)을 테트라하이드로퓨란(THF)에 1mg/ml의 농도로 용해시킨 후, 다이아프램 펌프를 이용하여 하나의 튜브를 통하여 33mL/min의 유속으로 도관에 흐르게 하였다. 다음으로 물을 주입하여 두 개의 튜브를 통하여 330mL/min의 유속으로 도관에 흐르게 하였다. 전체 유량 총합의 레이놀즈 수는 3000 이다.
<비교예 II-1 및 II-2>
먼저 폴리테트라플루오로에틸렌 (Polytetrafluoroethylene)으로 이루어진 T형 연결장치의 평편한 부분에 드릴을 사용하여 구멍을 낸 후, 주사바늘을 삽입하고 광학 접착제로 고정시켜 나노입자를 제조하는 장치를 제조하였다. 다음으로, 실린지 펌프를 이용하여 실시예 II-2와 동일한 폴리스티렌 전구체 용액을 주사바늘을 통해 도관에 흐르게 하였다. 다음으로 실린지 펌프를 이용하여 물을 도관에 흐르게 하였다. 전체 유량 총합의 레이놀즈 수는 실시예 II-2와 동일하다. 이를 통하여 제조된 입자를 비교예 II-1로 한다.
뱅스 랩(Bangs labs)에서 판매하는 유화중합법(Emulsion polymeration)으로 합성된 폴리스티렌 미립자(Polystyrene microsphere)를 비교예 II-2로 한다. 상기 미립자는 폴리스티렌 단량체에 가교제(Divinylbenzene 등) 및 개시제를 넣고 70 내지 90℃에서 6 내지 20시간 동안 회분식반응조(Bach reactor)에서 반응을 시킨 것이다.
<실험예 II-2>
각각 실시예 II-2, 비교예 II-1 및 II-2에 대하여, 입자의 직경에 따른 부피율을 나타낸 그래프를 도 12에 나타내었다. 이로써 실시예 II-2에서 제조된 나노입자는 비교예 II-1 및 II-2의 나노입자보다 크기 분포가 더 균일함을 확인할 수 있다.
또한, 각각 실시예 II-3, 비교예 II-1 및 II-2에 대하여, 입자의 직경에 따른 부피율을 나타낸 그래프를 도 13에 나타내었다. 이로써 실시예 II-3에서 제조된 나노입자는 비교예 II-1 및 II-2보다 크기분포가 더 균일함을 확인할 수 있다.
또한, 실시예 II-2와 비교하여 유속을 빠르게 하여 유량 총합의 레이놀즈 수를 크게 하면 평균 직경이 더 작은 나노입자를 제조할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 다이어프램 펌프를 사용하여 완전히 연속적으로 작동할 수 있으므로, 폴리스티렌 나노입자의 생산 속도는 전구체 용액의 총 유량과 폴리머 농도에서 계산될 수 있다. 전구체 용액의 폴리스티렌 농도가 1mg/mL인 경우, Re = 3047로서, 폴리스티렌 나노입자의 생산속도는 33mg/min이고, 생산량은 17.34kg이다. Re를 증가시키거나 동시에 여러 개의 나노입자 제조장치를 작동시키면 생산속도를 쉽게 향상시킬 수 있다.
<실시예 III> 분산 안정성을 향상시키기 위한 PS 및 PS-b-PEO 블록 공중합체 형성 및 PS 대 PS-b-PEO의 중량비 최적화
벌크 합성법에 의한 폴리스티렌 나노입자(PS NP) 제조
폴리머 현탁액의 원심분리 및 재분산 공정에서 나노입자의 분산 안정성을 개선하기 위하여, PS-b-PEO(Polystyrene-Poly(ethylene oxide)) 블록 공중합체(block copolymer)를 폴리스티렌(PS) 전구체 용액에 첨가하였다.
PS 대 PS-b-PEO의 중량비를 최적화하기 위하여, 폴리머에서 PS-b-PEO의 중량비를 증가시키면서, 원심분리 전과 4번의 원심분리 및 재분산 공정 이후에 나노입자 크기 분포를 분석하였다.
도 14를 참조하면, 수성 매체에서 합성된 PS NP 입자는 원심 분리 공정 전에 PS-b-PEO의 첨가에 관계없이 균일한 크기 분포와 유사한 평균 크기를 가지는 것을 확인할 수 있다. 그러나 수성 매체에 PS-b-PEO를 첨가하지 않은 PS NP의 경우(a), 4회 반복된 원심분리 및 재분산 공정 후에 다분산(polydisperse)되었다. PS-b-PEO의 중량비가 12.5 wt%(b) 및 25wt%(c)인 경우, 나노입자 크기 분포는 4회 반복된 원심분리 및 재분산 이후, 입자 크기 분포가 PS-b-PEO를 첨가하지 않은 경우에 비해서 보다 향상되었지만, 미세하게 비가우시안이 되었다. 또한, NP의 평균 크기는 4회 반복된 원심분리 및 재분산 공정 후에 감소했다. PS-b-PEO의 함량이 적기 때문에 원심분리에 대해 분산 안정성을 향상시키기에는 입체 장애가 불충분하였다. PS-b-PEO의 중량비가 37.5 wt%(d)인 경우, 4회 반복된 원심분리 및 재분산 이후 NP의 크기 분포가 균일하였다. 또한, NP의 평균 크기는 크게 변하지 않았다.
PS-b-PEO의 첨가 및 함량의 최적화에 의해, 입체 장애에 의하여 원심분리 및 재분산 공정에서의 분산 안정성의 문제를 해소할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 벌크 합성법에서는 PS-b-PEO를 25중량% 이상의 농도로 첨가하면, 원심분리 및 재분산 공정 전후 모두 NP크기 분포가 넓어졌다.
상기 나노입자 제조장치를 이용한 PS나노입자 제조
도 15(a)를 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 나노입자 제조장치를 이용하는 경우, PS-b-PEO의 첨가에 상관없이 평균 NP 크기가 더 작고, NP크기분포가 더 좁아졌다(a). PS-b-PEO를 첨가하지 않았음에도 불구하고, PS NP의 크기분포는 수성 매체에서 몇 주 동안 크게 변하지 않았다.
입체 장애에 의한 분산 안정성을 향상시키기 위해, PS-b-PEO가 37.5 wt% 함량인 나노입자를 제조하였다. 상기 중량비에서 PS NP의 분산 안정성이 가장 향상되었다. 도 15(b)를 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 나노입자 제조장치를 사용하는 경우, 원심분리 및 재분산 공정을 4회 반복한 이후에도 수용 매체에서 분산 안정성이 향상되고, 특히 벌크 합성법에 의해 제조된 NP보다 평균 크기가 작고 크기 분포가 좁은 것을 확인할 수 있다.
결론적으로, 폴리스티렌-폴리에틸렌옥사이드 블록 공중합체를 도입하고, 중량비를 최적화함으로서 원심분리와 재분산을 4회 반복하여도 나노입자의 분산 안정성이 유지되는 것을 확인할 수 있다.
100 : 나노입자를 제조하는 장치 110 : 제 1 연결장치
111 : 제 1 공급튜브피팅부재 112 : 제 2 공급튜브피팅부재
113 : 제 3 공급튜브피팅부재 114 : 제 1 배출튜브피팅부재
115 : 고정피팅부재 121 : 제 1 튜브
122 : 제 2 튜브 123 : 제 3 튜브 130: 제 1 도관 141 : 제 1 공급부
142 : 제 2 공급부 143 : 제 3 공급부
210 : 제 2 연결장치 211 : 연결튜브피팅부재
212 : 제 4 공급튜브피팅부재 213 : 제 2 배출튜브피팅부재
222 : 제 4 튜브 230 : 제 2 도관
242 : 제 4 공급부

Claims (16)

  1. 제 1 연결장치와 제 1 튜브를 연결하는 제 1 공급튜브피팅부재, 제 1 연결장치와 제 2 튜브를 연결하는 제 2 공급튜브피팅부재, 및 제 1 연결장치와 제 1 도관을 연결하는 제 1 배출튜브피팅부재를 포함하는 제 1 연결장치; 상기 제 1 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 1 튜브; 상기 제 2 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 2 튜브; 상기 제 1 배출튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 1 도관; 상기 제 1 튜브의 나머지 한쪽에 연결되어 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 도관에 공급하는 제 1 공급부; 및 상기 제 2 튜브의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 2 물질로서 비용매를 상기 제 1 도관에 공급하는 제 2 공급부;를 포함하고,
    상기 제 1 튜브 또는 제 2 튜브는 적어도 일부가 상기 제 1 연결장치 내부 및 상기 제 1 도관 내에 배치되고,
    상기 제 1 튜브 또는 제 2 튜브 중 상기 제 1 도관 내에 배치된 부분의 외경은 상기 제 1 도관의 내경 보다 작고, 상기 제 1 튜브 또는 제 2 튜브 중 상기 제 1 도관 내에 배치된 부분의 길이는 상기 제 1 도관의 길이보다 짧으며,
    상기 제 1 연결장치, 제 1 튜브, 제 2 튜브, 및 제 1 도관의 재질은 불소계 고분자를 포함하는, 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조를 위한 나노입자 제조장치를 이용한 나노입자의 제조 방법으로, 상기 방법은:
    활성산소종(ROS)-반응성 작용기를 포함하는 고분자를 제조하는 단계;
    상기 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 작용기를 포함하는 고분자를 용매에 용해시켜 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 제조하는 단계;
    상기 제조된 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하고, 동시에 비용매를 제 2 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하는 단계;
    상기 제 1 도관에 공급되는 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액 및 상기 제 2 도관에 공급되는 비용매를 상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계;
    상기 제 1 도관 내에서 혼합된 물질로부터 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자를 동결방지제 없이 동결 건조하는 단계를 포함하는 것인,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.

  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 페로센 작용기를 포함하는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자는 카르복실산 작용기를 더 포함하는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 제조장치의 상기 제 1 공급부 또는 제 2 공급부는 다이어프램 펌프인,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 제조장치의 상기 제 1 연결장치는 제 3 공급튜브피팅부재를 더 포함하고,
    상기 제 3 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 3 튜브; 및
    상기 제 3 튜브의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 3 물질을 상기 제 1 도관에 공급하는 제 3 공급부를 더 포함하는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 제조장치는 연결튜브피팅부재, 제 4 공급튜브피팅부재, 및 제 2 배출튜브피팅부재를 포함하는 제 2 연결장치; 상기 연결튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 상기 제 1 도관; 상기 제 4 공급튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 4 튜브; 상기 제 2 배출튜브피팅부재에 한 쪽이 연결된 제 2 도관; 상기 제 4 튜브의 나머지 한 쪽에 연결되어 제 4 물질을 상기 제 2 도관에 공급하는 제 4 공급부;를 더 포함하고,
    상기 제 2 연결장치, 제 4 튜브, 및 제 2 도관의 재질은 불소계 고분자를 포함하는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 제조장치에서 상기 제 1 튜브 및 제 2 튜브는 상기 제 1 연결장치에 수직으로 연결되는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 제조장치의 상기 제 1 튜브 및 제 2 튜브는 상기 제 1 연결장치에 일렬로 연결되는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 제조장치의 상기 제 1 공급부는 상기 제 1 물질로서 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 상기 제 1 도관에 공급하여, 상기 제 1 도관 내에 적어도 일부가 배치된 제 1 튜브의 제 1 도관 내의 끝부분에서 난류를 형성시키거나,
    상기 제 2 공급부는 상기 제 2 물질로서 비용매를 상기 제 1 도관에 공급하여, 상기 제 1 도관 내에 적어도 일부가 배치된 제 2 튜브의 제 1 도관 내의 끝부분에서 난류를 형성시키는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 제조방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액을 제조하는 단계에서 제조되는 활성산소종(ROS)-반응성 전구체 용액의 농도는 3 내지 15mg/mL인,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조방법.
  11. 제 5 항에서 있어서,
    상기 제 1 도관에 연속적으로 공급하는 단계에서, 동시에 상기 제 3 공급부를 이용하여 상기 제 1 도관에 비용매를 연속적으로 공급하는 단계를 더 포함하는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조방법.
  12. 제 1 항에서 있어서,
    상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계는 난류를 형성하면서 혼합되는,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조방법.
  13. 제 1 항에서 있어서,
    상기 제 1 도관 내에서 혼합하는 단계에서 상기 제 1 도관 내에서 혼합된 용액 흐름의 레이놀즈 수(Reynolds number)가 1000 내지 4000인,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자의 생산 속도는 500 내지 1000mg/min인,
    활성산소종(ROS)-반응성 약물 전달 나노입자 제조방법.

  15. 삭제
  16. 삭제
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