KR102522515B1 - 안트라닐레이트를 통한 아닐린의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, a) 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계, b) 촉매의 존재 또는 부재 하에 열적 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온을 아닐린으로 전환시키는 단계, c) 단계 b)에서 생성된 아닐린을 유기 용매 중에서 1회 이상 추출하는 단계, 및 d) 단계 b) 및 c)에서 생성된 아닐린을 증류에 의해 정제하며, 여기서 상기 증류는 아닐린 및 수상을 생성하는 것인 단계를 포함하는, 아닐린의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

안트라닐레이트를 통한 아닐린의 제조 {PRODUCTION OF ANILINE VIA ANTHRANILATE}
본 발명은, 적합한 미생물 호스트를 통한, 그 후 중간체 생성물의 아닐린으로의 화학적 전환을 통한, 예를 들어 바이오매스와 같은 재생가능한 자원의 원료로부터의 아닐린의 제조 분야에 관한 것이다.
아닐린은 현재, 예를 들어, 폴리우레탄 제조를 위해, 화석 연료로부터 연간 수백만 톤으로 제조되고 있다. 화석 자원으로부터 독립적으로 되기 위해 화학 산업에서는 재생가능한 자원을 기재로 하는 아닐린 공급원 (또한 "바이오아닐린"이라 불림)이 강하게 요망된다. 보다 중요하게는, 원료에서의 재생가능한 자원의 사용을 증가시키는 것에 의해서 뿐만 아니라 화학적 과정에서도 이산화탄소 (CO2) 방출을 감소시키려는 강한 요망이 있다. 바이오아닐린은 CO2 방출을 줄이는 높은 가능성을 갖는다.
본 발명은 추가로, 미생물의 엔지니어링 및 그로부터의 방향족 화합물의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 적합한 재조합 미생물 호스트에서의 예를 들어 바이오매스와 같은 재생가능한 공급원으로부터의 o-아미노벤조에이트 (oAB)의 제조 분야에 관한 것이다. 전형적으로 상당한 비율의 발효성 당을 함유하는 공급원이 사용된다. 이들 당은 폴리사카라이드, 예컨대 디사카라이드, 예를 들어 수크로스, 또는 트리사카라이드, 예를 들어 케스토스, 뿐만 아니라 C-6 모노사카라이드, 예컨대 글루코스, 프룩토스 또는 만노스 및 C-5 모노사카라이드, 예컨대 크실로스 및 아라비노스를 포함할 수 있다. 당을 o-아미노벤조에이트 (2-아미노벤조에이트, 오르토-아미노벤조에이트, o-아미노벤조에이트, oAB)로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 균주는 사탕무 및 사탕수수, 전분-함유 식물, 예컨대 옥수수, 밀 및 호밀, 뿐만 아니라 리그노셀룰로스 (예를 들어 짚, 목재 및 바가스(bagasse)로부터의 것)를 포함한 폭넓은 범위의 재생가능한 자원으로부터의 o-아미노벤조에이트의 제조를 가능하게 한다.
현재로서는, 상업적으로 입수가능한 o-아미노벤조에이트 또는 상응하는 산의 재생가능한 또는 생물 유래의 공급원이 존재하지 않고, o-아미노벤조에이트의 대규모 생물학적 제조에 대한 공지된 예도 기재된 바 없다. o-아미노벤조에이트는 시키메이트 산 경로의 천연 중간체이고, 방향족 아미노 산 L-트립토판의 생합성에 대한 전구체이다. o-아미노벤조에이트로의 생합성 경로는 원핵생물 및 진핵생물 둘 다에서 비교적 잘 이해된다. o-아미노벤조에이트애서 아닐린으로의 화학적 전환이 달성될 수 있다. 현재의 아닐린 제조 방법은 석유-유래의 원료로부터의 화학적 합성에 의존한다. 이러한 석유-유래의 원료는 재생가능한 자원 "바이오매스"와 같은 재생가능한 원료와 달리 재생가능하지 않다. 화학적 합성에 관여되는 여러 화학적 단계는 화학물질의 높은 제조 비용을 초래한다. 종래의 아닐린의 화학적 합성은, 환경에 상당한 영향을 줄 수 있는 유해한 중간체, 용매, 및 폐기물과 관련될 수 있다. 방향족-고리에 대한 비-특이적 부반응은 제조 수율의 감소를 초래한다. 석유-유래의 원료는 세계적인 석유 가격으로 인한 비용 변동에 의해 영향받는다.
WO 2013/103894 A1에는, 생물-유래의 p-아미노벤조산 (4-아미노벤조에이트)을 통한 방향족 아민의 제조 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이 문헌에는, 이. 콜라이(E. coli) 또는 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)에서의 p-아미노벤조산의 제조가 개시되어 있고, 호스트로서의 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 이점은 인식하지 못하고 있다. 추가로, 이 문헌에는 또한, 발효 과정을 생물-유래의 p-아미노벤조산을 방향족 아민, 예를 들어 아닐린으로 전환시키는 하류 화학적 과정과 성공적으로 조합하는 방법은 개시되어 있지 않다. 화학적으로 제조되거나 생물학적으로 생성된 p-아미노벤조산을 전환시키는 방법에 대한 하류 화학적 과정 기술에 대하여, 이 문헌은 단지, 이 부분을 연속 방법 형태로 p-아미노벤조산을 제공하는 상류 부분과 조합하는 것의 유리한 기술적 이점에 대한 인식없이 증류 방법을 언급하고 있다.
1-단계 전환으로서의 당에서 아닐린으로의 직접적 발효는, 최종 반응 단계로서의 안트라닐레이트에서 아닐린으로의 효소적 생체내 탈카르복실화를 포함한 생합성 경로에 기초하는 경우에 가장 비용 효율적인 것으로 여겨진다. 아미노벤조에이트 데카르복실라제는 단백질 엔지니어링을 통해 성공적으로 규명되거나 개발될 수 없기 때문에, 안트라닐레이트에서 아닐린으로의 탈카르복실화 반응은 순수한 효소적 수단에 의해서는 수행될 수 없다. 이러한 1-단계 공정이 기술적으로 실현가능하지 않았기 때문에, 최종 반응 단계로서 안트라닐레이트를 아닐린으로 탈카르복실화시키는 최종 반응 단계를 수행하기 위한, 예를 들어 효소적 단계와 달리 화학적 단계에 의한 대안적 방법이 고려되었다.
따라서, 본 발명의 기술적 과제는, 기존의 화학 및 발효 방법에 비해 우수하고 이산화탄소 방출의 큰 감소, 화석 자원으로부터의 독립, 및 확립된 석유-기재의 제조 방법에 비해 유사한 또는 그보다 낮은 제조 비용을 달성하는, 화학적 출발 생성물을 기재로 하는 또는 재생가능한 자원을 기재로 하는 아닐린의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 추가로,
a) 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계,
b) 촉매의 존재 또는 부재 하에 열적 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온을 아닐린으로 전환시키는 단계,
c) 단계 b)에서 생성된 아닐린을 유기 용매 중에서 1회 이상 추출하는 단계, 및
d) 단계 b) 및 c)에서 생성된 아닐린을 증류에 의해 정제하며, 여기서 상기 증류는 아닐린 및 수상을 생성하는 것인 단계
를 포함하는, 아닐린의 제조 방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결하였다.
재생가능한 자원, 예를 들어 바이오매스 또는 발효성 탄소 공급원을 기재로 하는 아닐린 제조에 대한 변화는, CO2 방출을 현저히 감소시키는 이점을 제공하고, 화석 자원으로부터의 독립을 가능하게 하고, 제조 비용의 가능한 감소를 가능하게 한다. 본 발명의 추가의 이점은, 유해 화학물질의 사용 및 생성되는 폐기물이 최소로 유지된다는 점이다. 또한, 환경에 대한 훨씬 적은 전체적 영향을 갖는 방법으로 생물 유래의 o-아미노벤조에이트가 생성되어 아닐린으로 전환될 수 있다.
하기에서, 본 발명을 설명하기 위해 사용된 몇몇 용어를 정의한다.
본 발명에 따른 용어 "바이오아닐린"은 재생가능한 자원, 예컨대 사탕무, 사탕수수, 전분-함유 식물, 바람직하게는 옥수수, 밀 및 호밀, 및 리그노셀룰로스, 바람직하게는 짚, 목재 및 바가스, 글리세롤 및 C1-화합물, 바람직하게는 CO, 또는 예컨대 발효성 당, 바람직하게는 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드 및 트리사카라이드 (여기서, C-5 모노사카라이드는 바람직하게는 크실로스 및 아라비노스이고, C-6 모노사카라이드는 바람직하게는 글루코스, 프룩토스 또는 만노스이고, 디사카라이드는 바람직하게는 사카로스이고, 트리사카라이드는 바람직하게는 케스토스임)로부터의 원료를 기재로 하는 아닐린을 지칭한다.
본 발명에 따른 "o-아미노벤조에이트"는 오르토-아미노벤조에이트 (o-아미노벤조에이트, "oAB", "2-AB")를 지칭한다. o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온, C6H4COO-, 및 적합한 양이온, 예컨대 NH4 + 또는 Na+를 포함하는 안트라닐레이트 염 형태로, 또는 쯔비터 이온 C6H4COO- NH3 + 및 C6H4COO- NH2인 안트라닐 산으로서 존재할 수 있다. "o-아미노벤조에이트" ("oAB", "2-AB")는, 아미노 기가 o-아미노벤조에이트 ("oAB")의 경우에는 C2-위치 (오르토)인 것에 반해 C4-위치 (파라)에서 벤젠 고리에 결합되는 "4-아미노벤조에이트" ("파라-AB", "p-AB")와 상이하다. 본 발명에 따른 "o-아미노벤조에이트"는 종래의 화학적 방법에 의해 또는 상업적으로 입수되는 화학물질로서 제공될 수 있거나, 또는 이는 발효에 의해 o-아미노벤조에이트를 생성할 수 있는 재조합 미생물 호스트에 의해 생물학적으로 제공될 수 있다. 상업적으로 입수되는 화학적 o-아미노벤조에이트의 일례는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 구입되는 oAB (카탈로그 번호 A89855)이다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "호스트"는, 변형에 따라, 안트라닐 산으로서 또는 안트라닐레이트 음이온 형태로, 자연적으로, 또는 단지 변형 후에 "재조합 미생물 호스트"로서, 또는 자연적으로 존재하는 o-아미노벤조에이트에 추가로, 발효에 의해 o-아미노벤조에이트를 생성할 수 있는 임의의 호스트를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 "미생물 호스트"는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 호스트는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 상기 박테리아는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주, 코리네박테리움(Corynebacterium) 균주 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 균주이고, 여기서 상기 코리네박테리움 균주는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이고, 상기 슈도모나스 균주는 바람직하게는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)이다. 바람직하게는, 상기 미생물 호스트는 재조합 미생물 호스트일 수 있다. 이러한 재조합 미생물 호스트는 이. 콜라이 W3110 trpD9923 (실시예 1에 나타낸 바와 같음)일 수 있거나, 또는 이는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032일 수 있거나, 또는 이는 또한 슈도모나스 푸티다 KT2440일 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "유전자 변형"은, 야생형 서열에 비해 미생물 호스트의 주어진 유전자의 핵산 서열에 있어서의 변화를 지칭한다. 이러한 유전자 변형은 하나 이상의 데옥시리보 핵산의 결손 뿐만 아니라 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 유전자 변형은 미생물 호스트의 게놈으로 변형에 의해 도입되는 삽입 뿐만 아니라 부분적 또는 완전한 결손을 포함할 수 있다. 이러한 유전자 변형은 재조합 미생물 호스트를 생성할 수 있고, 상기 유전자 변형은 각각의 미생물 호스트의 야생형 서열에 비해 1, 2, 3, 4개 이상의 단일 뉴클레오티드의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형은 1, 2, 3, 4개 이상의 단일 뉴클레오티드의 결손 또는 삽입 또는 1, 2, 3, 4개 이상의 단일 뉴클레오티드의 변형일 수 있다. 본 발명에 따른 유전자 변형은, 예를 들어 각각의 유전자의 감소된 발현 또는 예를 들어 각각의 유전자의 향상된 발현의 효과를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 유전자 변형의 일례에서, 재조합 미생물 호스트, 예를 들어 에스케리키아 콜라이는, 효소 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 trpD 유전자의 유전자 변형을 포함할 수 있고, 여기서 상기 유전자 변형은 변형된 trpD 유전자의 감소된 발현의 효과를 가질 수 있다. 이러한 재조합 미생물 호스트는 실시예 1에 나타낸 바와 같이 이. 콜라이 W3110 trpD9923일 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "배치 발효"는, 한정된 출발점 및 한정된 종점을 갖는 단일 발효 반응을 지칭한다. 배치 발효는, 미생물의 생성 속도가 연속 발효 방식에서 높은 속도로 유지될 수 없는 경우에 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "공급-배치 발효"는, 배양 동안 생물반응기에 하나 이상의 영양소 (기질)가 공급되는 (보급되는), 또한 생성물(들)이 진행 종료까지 생물반응기에서 유지되는 생명공학적 과정에서의 작업 기술로서 정의된다. "공급-배치 발효"는, 미생물의 생성 속도가 연속 발효 방식에서 높은 속도로 유지될 수 없는 경우에 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "연속 발효"는, 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서 발효 동안 기질을 첨가하고 생성물 (즉, o-아미노벤조에이트, oAB)을 연속적으로 제거하는 발효 방법을 지칭한다.
하기에서, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은,
a) 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계,
b) 촉매의 존재 또는 부재 하에 열적 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온을 아닐린으로 전환시키는 단계,
c) 단계 b)에서 생성된 아닐린을 유기 용매 중에서 1회 이상 추출하는 단계, 및
d) 단계 b) 및 c)에서 생성된 아닐린을 증류에 의해 정제하며, 여기서 상기 증류는 아닐린 및 수상을 생성하는 것인 단계
를 포함하는, 아닐린의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계 a)에서 o-아미노벤조에이트는 화학적으로 제공되거나 생물학적으로 생성되고, 바람직하게는 이는 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료의 발효에 의해, 발효성 탄소 기질을 포함하는 상기 원료를 발효에 의해 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 호스트 세포를 이용하여 생물학적으로 생성되고, 여기서 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함한다. 단계 a)의 이러한 적합한 양이온은, 예를 들어 NH4OH 용액 중에, 또한 NaCl 용액 중에 포함되는 것과 같은 NH4 + 또는 Na+일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에서, o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계 a)의 발효는 배치 발효, 공급-배치 발효 또는 연속 발효일 수 있다. 이러한 발효는, 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효에 의해 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 호스트 세포가 배양되는 발효 반응기에서 수행될 수 있다. 이러한 배양은 적합한 탄소 공급원, 예를 들어 옥수수 시럽, 사탕수수 쥬스, 당밀 등의 존재 하에 수행될 수 있다. 이러한 배양은 또한, 재조합 미생물 호스트 세포의 생존에 필요한 미량영양소의 존재 하에, 적합한 질소 공급원, 예를 들어 암모니아 기체, 수산화암모늄 용액, 황산암모늄, 질산암모늄, 옥수수 침지액 등의 존재 하에 수행될 수 있다. 이러한 발효에서 pH는, 염기, 예를 들어 암모니아 기체, 수산화암모늄, 수산화나트륨 등의 첨가에 의해 6.5 내지 7.5의 값에서 유지될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 a)에서 생물학적으로 o-아미노벤조에이트를 생성하는 것은 연속 발효에 의해, 바람직하게는 연속적으로 작업되는 발효조에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 연속 발효에서, 발효 브로쓰(broth)는 발효조로부터 연속적으로 취출되어 바이오매스를 예를 들어 여과, 원심분리, 및 멤브레인 등에 의해 분리하기 위한 장치를 통해 처리된다.
단계 a)에서 사용되는 발효 반응기에는 충분한 산소가, 순수 상태로, 공기로서, 또는 풍부 공기로서 첨가될 수 있다. 세포 무함유 발효 브로쓰는 본질적으로 안트라닐레이트 음이온 및 반대 양이온을 갖는 o-아미노벤조에이트 (oAB) 염의 용액이다. oAB 용액은 5 g/리터 내지 500 g/리터, 바람직하게는 20 g/리터 내지 200 g/리터, 또한 가장 바람직하게는 50 g/리터 내지 150 g/리터의 oAB 염의 농도를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 a) 내지 단계 d)는 연속적으로 진행될 수 있다.
o-아미노벤조에이트를 생성하는 단계 a)의 적합한 양이온은 NH4 + 또는 Na+일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, o-아미노벤조에이트를 생성하는 단계 a)의 재조합 미생물 호스트는, 후속되는 단계 b)에서의 열적 탈카르복실화에 의한 상기 안트라닐레이트 음이온에서 아닐린으로의 전환 전에 제거될 수 있다. 이러한 제거된 재조합 미생물 호스트는 바람직하게는 o-아미노벤조에이트를 생성하는 단계 a)의 발효에 재-공급될 수 있다. 이는, 재조합 미생물 호스트를 포함하는 바이오매스가, 재조합 미생물 호스트를 포함하는 바이오매스의 소량 부분의 퍼징 후 단계 a)의 발효조 및 발효로 재순환될 수 있음을 의미한다. 바이오매스로부터의 이러한 퍼지 스트림은 바이오매스 축적을 피하기 위해 유용할 수 있다. 따라서, 발효조에서 증식되는 일부 미생물 호스트 세포 및 죽은 세포는, 발효 단계 a)의 반응기 내의 살아있는 호스트 세포의 농도를 한정된 한계 내에서, 가장 바람직하게는 일정하게 유지하기 위해 제거될 수 있다. 이는, 재조합 호스트 세포 및 발효 생성물(들)이 진행 종료까지 생물반응기에서 유지되는 (따라서 이는 연속 발효가 아니라 공급-배치 발효임) 공급-배치 발효의 경우에는 상이할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서 촉매의 존재 또는 부재 하에 열적 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온에서 아닐린으로의 전환을 수행하는 경우, 촉매는, 사용되는 경우, 불균질 산 촉매, 바람직하게는 제올라이트, 가장 바람직하게는 제올라이트 H-Y, 제올라이트 H-Y (GO257), 예를 들어 제올리스트 인터내쇼날(Zeolyst International)로부터 입수되는 것 (카탈로그 번호 CBV600)일 수 있다. 산 촉매 제올라이트 H-Y (GO257, SiO2/Al2O3 = 5.5)는 특히 높은 산 특성을 갖고, 예를 들어 또한 산 특성을 갖지만 보다 작은 기공 크기 (0.5 nm)를 가져서 AA 분자가 침투할 수 없고 그 결과 산 촉매의 활성 자리에 접근하지 못하는 ZSM5-27에 비해 더 넓은 기공 크기 (0.7 내지 0.8 nm)를 갖는다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서 촉매의 존재 또는 부재 하에 열적 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온에서 아닐린으로의 전환을 수행하는 경우, 촉매는, 사용되는 경우, 불균질 염기 촉매, 바람직하게는 층상 이중 수산화물, 가장 바람직하게는 염기 특성을 갖는 Mg-Al 히드로탈사이트 (HTC, Mg6Al2(CO3)(OH)16. 4H2O)일 수도 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 b)의 열적 탈카르복실화를 수행하는 경우, 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함하는 단계 a)의 o-아미노벤조에이트 용액을 150℃ 내지 250℃, 바람직하게는 160℃ 내지 220℃, 가장 바람직하게는 180℃ 내지 200℃의 온도에서 작업될 수 있는 화학 반응기에 공급할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 b)의 열적 탈카르복실화를 수행하는 반응 시간은, 고수율의 아닐린으로의 반응에 충분하여야 한다. 보다 구체적으로, 단계 a)의 열적 탈카르복실화를 수행하기 위해 필요한 시간은 대략 0.5시간 내지 3시간일 수 있다.
열적 탈카르복실화 단계 b)가 수행될 수 있는 반응기 내의 압력은, 반응 동안 증발되고, 또한 열적 탈카르복실화 반응 동안 생성된 CO2와 반응기로부터 배출될 수 있는 물 및 아닐린의 양에 대한 함수로서 선택될 수 있다. 열적 탈카르복실화 단계 b)의 생성물, 즉 반응기 유출물은 본질적으로 균질한 물-아닐린 혼합물일 수 있다.
단계 b)의 이 반응기 유출물은 직접 불균질 공비 증류 순서로 공급될 수 있고, 여기서 물 및 아닐린이 저부 생성물로서 회수된다. 이러한 옵션은, 단계 b)의 열적 탈카르복실화 후에 고함량, 통상적으로 120 g/리터 초과의 아닐린을 갖는 경우에 수행될 수 있다. 그러나, 열적 탈카르복실화 단계 b) 후에 저농도, 예를 들어 120 g/리터 이하의 아닐린에 대해서는, 단계 b) 후의 직접적 아닐린 분리가 증류 단독에 의해서는 실제로 실행 불가능한데, 이는 에너지 소비가 매우 커지기 때문이다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은, 단계 b)의 열적 탈카르복실화에서 생성된 아닐린을, 증류에 의해 아닐린을 정제하는 단계 d)를 진행시키기에 앞서, 유기 용매 중에서 1회 이상 추출하는 추가의 단계 c)를 포함한다. 이러한 방식으로, 추출 단계 c)는 단계 d)에서의 증류에 앞서 예비-농축 단계로서 사용된다. 단계 b)의 열적 탈카르복실화의 생성물인 아닐린-물 혼합물을, 추출 장치, 예를 들어 혼합 침강기, 펄스 컬럼 등에 공급할 수 있고, 여기서 이는 아닐린에 대해 높은 친화력을 갖는 비-극성 유기 용매, 바람직하게는 아닐린의 비점보다 더 높은 비점을 갖는 것, 예를 들어 1-도데칸올과 접촉할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 유기 용매는, 알콜, 페놀, 아미드, 에테르 및 방향족 탄화수소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유기 용매로서 사용되는 알콜은 바람직하게는 1-도데칸올이다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에서, 단계 c)에서 유기 용매 중에서의 아닐린의 추출은, 훨씬 더 높은 수율의 아닐린 생성을 얻기 위해 증류에 앞서 아닐린의 추가의 예비-농축을 위해 1회 초과로 수행될 수 있다.
단계 c)의 추출에 사용된 유기 용매는 바람직하게는 회수될 수 있다. 이러한 유기 용매의 회수는 바람직하게는 증류에 의해 수행될 수 있다. 회수된 유기 용매는 바람직하게는 방법의 단계 c)에 재-공급되어 단계 b)에서 생성된 아닐린의 추출을 위해 다시 재-사용될 수 있다. 이는, 아닐린-유기 용매 혼합물이 증류될 수 있고, 여기서 비말동반된 또는 그에 용해된 아닐린 및 임의의 물, 또한 비-극성 유기 용매가 오버헤드 생성물로서 회수될 수 있음을 의미한다. 이어서, 일정 농도 범위의 아닐린을 함유하는 오버헤드 스트림을, 불균질 공비 증류일 수 있는 단계 d)의 증류에 공급한다.
본 발명에 따른 방법의 또한 또 다른 실시양태에서, 방법은 단계 c)에서 수행된 추출의 수상을 단계 a)의 발효에 재-공급하는 추가의 단계 e)를 포함한다.
방법은 또한, 단계 d)에서 수행된 증류의 수상을 단계 a)의 발효에 재-공급하는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 생성 단계 a)에서 적합한 양이온으로서 사용될 수 있는 NH4 + 양이온은 단계 d)의 증류 후에 NH3으로서 회수되어 단계 a)의 발효에 재-공급될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 생성 단계 a)가 발효를 포함하는 경우, 단계 a)의 발효에 사용되는 원료는 사탕무, 사탕수수, 전분-함유 식물, 바람직하게는 옥수수, 밀 및 호밀, 및 리그노셀룰로스, 바람직하게는 짚, 목재 및 바가스, 글리세롤 및 C1-화합물, 바람직하게는 CO로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 생성 단계 a)가 발효를 포함하는 경우, 단계 a)의 발효에 사용되는 원료 중에 포함되는 하나 이상의 발효성 탄소 기질은 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드 및 트리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 C-5 모노사카라이드는 바람직하게는 크실로스 및 아라비노스이고, C-6 모노사카라이드는 바람직하게는 글루코스, 프룩토스 또는 만노스이고, 디사카라이드는 바람직하게는 사카로스이고, 트리사카라이드는 바람직하게는 케스토스일 수 있다.
o-아미노벤조에이트를 생성하는 발효 단계 a)에 사용될 수 있는 재조합 미생물 호스트는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 상기 박테리아는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 균주, 코리네박테리움 균주 또는 슈도모나스 균주일 수 있고, 상기 코리네박테리움 균주는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있고, 상기 슈도모나스 균주는 바람직하게는 슈도모나스 푸티다일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)의 발효에 사용될 수 있는 재조합 미생물 호스트는 에스케리키아 콜라이, 바람직하게는 이. 콜라이 W3110, 훨씬 더 바람직하게는 이. 콜라이 W3110 trpD9923 (미국 예일대학교의 이. 콜라이 유전자 자원 센터로부터 구입)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)의 발효에 사용될 수 있는 재조합 미생물 호스트는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 또는 이 균주를 기재로 하는 추가의 재조합 미생물 호스트일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)의 발효에 사용될 수 있는 재조합 미생물 호스트는 슈도모나스 푸티다 KT2440, 또는 이 균주를 기재로 하는 추가의 재조합 미생물 호스트일 수 있다.
본 발명은 추가로, 메틸렌디아닐린 (MDA)의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은, 또한 청구범위에서 청구된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 제조된 아닐린의 용도를 제공하며, 여기서 제조된 아닐린은 물 및 촉매의 존재 하에 포름알데히드에 의해 메틸렌디아닐린 (MDA)으로 추가로 전환될 수 있다. 제조된 MDA는 포스겐에 의해 메틸렌디이소시아네이트 (MDI)로 추가로 전환될 수 있다.
본 발명의 방법 및 재조합 호스트 균주에 대하여 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은, 이러한 변형 및 변화가 첨부된 청구범위 및 그의 등가물의 범주 내에 포함된다면, 이들을 포괄하는 것으로 의도된다.
도면 및 표의 설명
도 1은, 발효 단계에서의 원료에서 안트라닐레이트로의 전환, 그 후 하류 처리에서의 아닐린으로의 화학적 전환 및 정제를 포함하는 본 발명에 따른 방법의 전체적 개념도를 나타낸다.
도 2는, 본 발명에 따른 방법의 보다 상세한 개요를 나타낸다. 단계 a)의 적합한 양이온은 NH4 + 또는 Na+일 수 있고, 따라서 NH3 또는 NaOH가 발효조에서 완충제로서 사용될 수 있다.
도 3은, 연속 발효 동안 세포 보유에 대한 750 kDa의 임계값을 갖는 중공 섬유 여과 모듈의 통합을 나타낸다.
도 4는, 균주 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc+ (0.51 mM, 최선의 결과), 그 후 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 (38 h 후 Glc+보다 거의 0.2 mM 낮음)의 균주에서의 안트라닐 산 생성을 나타내고, 최저 생성 속도는 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc-에서 나타났다 (38 h 후 5x 낮은 농도의 안트라닐 산 생성).
도 5는, 160℃에서 수성 완충제 용액 중의 A) AA 0.5 wt% 및 B) NH4AA 3 wt%의 탈카르복실화의 반응속도론을 나타낸다.
도 6은, 실시예 3에 기재된 바와 같은, 상이한 촉매, 즉 제올라이트 H-Y, 제올라이트 H-ZSM5 및 황산화된 지르코니아를 사용한 NH4AA의 탈카르복실화의 반응속도론을 나타낸다.
표 1은, 실시예 2에 나타낸 160℃ 및 180℃에서의 완충제 용액 중의 안트라닐 산 (AA) 및 NH4AA의 탈카르복실화의 반응 차수 및 속도 계수를 나타낸다.
표 2는, 실시예 4에 나타낸 바와 같은, 금속-교환된 제올라이트 Y와 ZSM-5 및 히드록시아파타이트의 흡수 용량의 비교를 나타낸다.
실시예
실시예 1 - 이. 콜라이을 사용한 안트라닐 산의 생성에 대한 실험
미국 예일대학교의 이. 콜라이 유전자 자원 센터로부터 균주 이. 콜라이 W3110 trpD9923을 구입하였다. 균주는 랜덤 돌연변이생성에 의해 생성되었고, trpD9923이라 불리는 돌연변이 trpD 유전자를 함유하였다. trpD9923 유전자의 관련 절단 효소는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제의 반응을 촉매하는 그의 능력을 상실하였지만, 그의 안트라닐레이트 신타제 활성은 유지하였다. 따라서, 균주는 안트라닐레이트를 합성할 수 있으나, 이를 트립토판으로 추가로 대사시킬 수 없고, 따라서 트립토판 영양요구체(auxotroph)이다. 이는 안트라닐레이트의 오버플로우를 초래한다.
이 균주를 28℃ 및 140 rpm에서 10 ml 배양 부피를 갖는 50 ml 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 사용된 배지는 하기와 같이 한정된 트립토판을 갖는 미네랄 배지 M9였다: 10 g/l 글루코스, 6 g/l Na2HPO4, 0.5 g/l NaCl, 3 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 246.5 mg/l MgSO4, 14.7 mg/l CaCl2, 10 mg/l 티아민 (비타민 B1), 20 mg/l 트립토판. 균주는 HPLC로 측정시 25.5 h 후에 60 mg/l 안트라닐 산을 생성하였다. 비교된 균주는 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923; 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc+; 및 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc-였다.
트립토판 영양요구체는 trpD9923 균주에서 확인되었다. 트립토판을 함유하는 미네랄 배지 M9에서의 발효에서 균주는 60 mg/L 안트라닐 산을 생성하였다.
균주를 녹아웃(knock out) 결손을 사용하는 포스포트랜스퍼라제 시스템의 불활성화에 의해 추가로 최적화하였다. pts 결핍 균주를 글루코스 상에서의 성장에 적합화시키고, 10 ml의 배양 부피를 갖는 37℃ 및 150 rpm의 25 ml 진탕 플라스크 발효를 사용하여 안트라닐레이트 생성에 대해 시험하였다. pts 포지티브 균주에 대해 동일한 배지를 사용하였다. 이는 HPLC로 측정시 25시간 후 69 mg/L을 생성하였다. 3종의 균주 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923; 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc+; 및 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc-에 의한 안트라닐 산의 생성에서는 LB 배지에서의 이전 인큐베이션 후 상당한 향상을 보였다. 최선의 안트라닐 산 생성 균주는 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc+ (0.51 mM)였고, 그 후 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 (38 h 후 Glc+보다 거의 0.2 mM 낮음)이었으며, 최악의 것은 이. 콜라이 W3110 trpΔ9923 Δpts Glc- (38 h 후 5x 낮은 농도의 안트라닐 산 생성)였다 (도 4에서도 볼 수 있음).
실시예 2 - 촉매 부재 하에서의 A) AA 0.5 wt% 및 B) NH 4 AA의 탈카르복실화의 반응속도론
이 실험에서는, 본 발명에 따른 방법의 단계 b)의 열적 탈카르복실화의 반응속도론을 연구하였다. NH4OH 용액을 안트라닐 산 (AA) 완충제 용액에 첨가한 경우, AA는 점차 암모늄 안트라닐레이트로 변형되었고, 이는 AA 자체보다 훨씬 더 높은 용해도 (최대 10%)를 가졌다. 이 경우, 안트라닐레이트 이온을 아닐린 (ANL)으로 탈카르복실화시킬 수 있었다. AA, 또는 o-아미노벤조에이트는 각각, 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 미생물 호스트에 의해 생물학적으로 제공되거나, 또는 이는 화학적으로 제공되었고, 예를 들어 이는, 예를 들어 시그마 알드리치로부터 상업적으로 입수되었다 (카탈로그 번호 A89855).
증류수 중의 (NH4)2SO4 (20 g/L), Na2HPO4 (1 g/L) 및 KH2PO4 (1 g/L)를 함유하는 완충제 용액을 제조하였다. 이어서, AA 10 wt%를 이 용액 중에 현탁시켰다. NH4OH 용액 (28 내지 30% NH3)을, 투명한 황색 용액이 형성될 때까지 이 현탁액 중에 적가하였다. 이 암모늄 안트라닐레이트 (NH4AA) 용액의 pH는 약 7이었다. 또한 이 방법을 사용하여 암모늄 안트라닐레이트 (3 wt%) 용액을 제조하였다.
상기 용액 각각 80 mL를 오토클레이브 160 mL 내로 옮기고, 160℃ 또는 180℃로 가열하고, 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하여 아닐린 (ANL) 형성 속도를 분석하였다.
수성 완충제 용액 중의 AA 0.5 wt% 및 NH4AA 3 wt%의 탈카르복실화를 임의의 촉매를 사용하지 않고 160℃에서 수행하였다. 모델을 사용한 연구에서는 두 반응 모두에 대해 유사-1차 반응속도로 나타났다. 이들 반응의 프로파일을 도 5에 나타내었다. 하기와 같은 일반적 반응 속도식을 사용하고 실험 데이터를 고려하여 최적화된 k 및 n 파라미터 (이들은 각각 속도 계수 및 반응 차수임)를 계산하여 반응속도론 모델을 확립하였다.
Figure 112016079608090-pct00001
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 이들 반응의 차수 (n)는 1에 가깝다. 물 중의 AA 0.5 wt% 탈카르복실화의 속도 계수 (k)는 NH4AA 3 wt%의 값보다 6.8배 더 크다.
또한, 실험 데이터 및 모사 모델을 사용하여 160℃ 및 180℃에서의 NH4AA 10 wt% 탈카르복실화의 반응속도론을 연구하였다.
<표 1> 160℃ 및 180℃에서의 완충제 용액 중의 AA 및 NH4AA의 탈카르복실화의 반응 차수 및 속도 계수
Figure 112016079608090-pct00002
나타난 바와 같이 (표 1 및 도 5), 두 반응 모두 유사-1차 반응속도론에 따랐다. 추가로, 180℃에서의 반응의 속도 계수는 160℃에서의 값보다 36배 더 크다. 이 수치는 물 중에서의 AA 0.5 wt% 탈카르복실화의 값과 매우 경쟁적이다. 가장 중요하게는, NH4AA의 경우에 20배 더 높은 농도의 큰 이점이 존재한다. 실시예 2는, oAB 염이 1차 반응속도에 따르는 반응으로 수용액 중에서 탈카르복실화 될 수 있음을 보여준다. 따라서, 예를 들어 플러그 유동 반응기에서 또는 혼합 탱크의 캐스캐이드에서, 안트라닐레이트 이온에서 아닐린으로의 실질적으로 완전한 전환이 달성될 수 있다.
실시예 3 - 촉매를 사용한 NH 4 AA의 탈카르복실화의 반응속도론
본 실시예는, 1.6 g (2%)의 산 촉매의 용액 80 mL를 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 절차를 따른다. 사용된 촉매는 제올라이트 H-Y (제올리스트 인터내쇼날, 카탈로그 번호 CBV600), 제올라이트 H-ZSM5 (쉬드-케미/클라리언트(Sued-Chemie/Clariant) 카탈로그 번호 H-MFI-27) 및 황산화된 지르코니아 (멜 케미칼즈(Mel Chemicals) 카탈로그 번호 MELCat XZO 1720)였다. 도 6에서, 결과를 실시예 2에 기재된 바와 같은 촉매 부재 하에서의 실험 (블랭크)과 비교하였다. 블랭크 실험, 황산화된 지르코니아 및 ZSM-5의 세가지 모두 90 내지 92%의 유사한 AA 전환율에 도달하였다. 단지 촉매 ZSM-5만이 보다 높은 AA에서 아닐린으로의 전환율, 즉 최대 99%를 나타내었다.
실시예 4 - 미네랄 흡수제 상에서의 안트라닐 산의 흡수/탈착
실시예 3 및 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 제올라이트-Y 촉매는, 안트라닐 산을 거의 남기지 않으면서, 최고 촉매 활성 및 전환율을 가져도, 생성물로서 최고 수율의 아닐린을 제공하지 않았다. 고체의 분석에서는, 아닐린 생성물의 손실 부분이 촉매 자체에 강하게 흡수된 것으로 나타났다.
상이한 유형의 흡착제 상에서의 AA의 흡착 용량을 시험하였다. 제올라이트 Y (제올리스트 인터내쇼날, 카탈로그 번호 CBV600) 및 ZSM5 (쉬드-케미/클라리언트 카탈로그 번호 H-MFI-27)를 제올라이트로서 선택하였고, 이들은 상이한 분자에 대한 분자 체로서 기능한다. 히드록시아파타이트 (Ca10(PO4)6(OH)2) (시그마-알드리치 카탈로그 번호 289396)를 상이한 용매 중에서의 그의 AA 및 일부 다른 유사 화합물에서의 흡착능으로 인해 시험하였다.
흡착 시험: 흡착제를 300℃에서 3 h 동안 이미 소성시켜 임의의 남아있는 수분을 방출시켰다. 물 중의 AA의 용액 (0.5 wt%)을 제조하였다. 이 용액 20 mL를 0.2 g의 흡착제를 함유하는 50 mL 플라스크로 옮겼다. 교반 하에 일정 기간의 시간 후, 물 중의 AA의 농도를 HPLC로 분석하였다. 물 중의 AA 농도 감소는 흡착된 AA로서 고려되었다.
금속-교환된 제올라이트의 합성: Ca-혼입된 제올라이트의 주어진 향상된 흡착 용량에서, 이온 교환에 의해 Ca-교환된 제올라이트를 제조하여 AA의 흡착에서 시험하였다. 분말로서의 3 g의 제올라이트 H-Y를 Ca(NO3)2 .4H2O (0.5 M)의 용액에 첨가하였다. 슬러리를 4 h 동안 교반하고, 이어서 용액을 신선한 용액으로 대체하고, 이 절차를 2회 더 반복하였다. 마지막으로, 고체를 원심분리에 의해 분리하고, 80℃에서 건조시키고, 300℃에서 3 h 동안 소성시켰다. K, Na, Mg 및 Fe를 사용한 4종의 다른 금속-교환된 제올라이트 Y 샘플을 상기에 기재된 것과 동일한 방법으로 제조하였다. 이어서, 샘플을 K-Y, Na-Y, Ca-Y, Mg-Y 및 Fe-Y로 라벨링하였다.
흡수 연구 결과를 하기 표 2에 요약하였다.
<표 2> 금속-교환된 제올라이트 Y와 ZSM-5 및 히드록시아파타이트의 흡수 용량 비교
Figure 112016079608090-pct00003
제올라이트 Y의 흡수 용량은 ZSM-5 및 히드록시아파타이트에 비해 우수하다. 이는 아마도, 보다 큰 기공 크기 및 상이한 기공 구조에 기인하는 것이었다. 이는 또한, 양이온으로의 교환에 의해 더욱 증가할 수 있었다. 양이온의 전하 및 크기에 따른 경향성이 명백하였고, 따라서 흡수 과정은 흡수제의 표면 전하에 강하게 의존하였다.
로딩된 흡수제를 80 ml의 10% NaOH 물과 접촉시킴으로써, 흡수된 AA를 최대 80%의 수율로 다시 용액 내로 추출할 수 있었다. 이를 80 ml의 pH 7의 완충제 용액, 즉 흡수 과정에 사용된 것과 접촉시킴으로써, 탈착이 거의 나타나지 않았다 (<10%). 본 실시예는, 흡수 과정이 열역학적으로 평형화된 시스템이고 이는 표면 전하에 의존함을 보여준다.
실시예 5: 추출을 위한 용매 선택 및 수상 및 용매 (유기) 상 사이의 아닐린 분포 계수
COSMO 계산에 기초한 용매 스크리닝을 수행하였다. 하기 2개 단계를 갖는 COSMO 방법을 사용하였다:
a) 양자 화학 계산에 의한 우수한 전도성 매질로 둘러싸인 분자 상의 표면 전하 결정.
b) 전하 분포로부터 다양한 용매 중에서의 용질의 화학적 포텐셜 유도.
추가로, 하기의 추가적 제한을 고려해야 했다: 물 중에서의 낮은 용해도, 중간 정도의 점도, 밀도 및 계면 장력이 수월한 상 분리 (아닐린에 비해 보다 높은 비등점)를 가능하게 함. 그 결과, 장쇄 알콜 및 장쇄 아민 및 이들 둘의 혼합물이 나타났다 (7 < C-개수 < 17).
2종의 알콜에 대한 유니팩(Unifac) 계산을 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3>
Figure 112016079608090-pct00004
도데칸올 이성질체의 혼합물 사용은 낮은 상호 용해도 및 보다 낮은 융점의 이점을 제공할 수 있다.
실시예 6: 물로부터 아닐린의 추출에 대한 디자인 계산
본 실시예에서의 공급 스트림 조성은 93% 물, 7% 아닐린이었다. 사용된 컬럼은 펄스형 컬럼이었다. 500의 비표면적을 갖는 금속 구조화된 패킹 (높은 처리량에 기인함) (패킹의 예: 멜라팩(Mellapack) 500Y 또는 몬츠(Montz) B1-500)에 의해 패킹을 수행하였다. 물질은 스테인레스강이었다.
치수는 하기와 같았다: 수성 공급물의 60 t/h의 용량에 대하여 (도데칸올 유량은 F/S=2 wt/wt를 사용하여 계산됨):
· 컬럼 내부 활성 직경 = 1200 내지 1300 mm
· 활성 패킹 길이 = 11 내지 12 m
· 총 컬럼 길이 = 14 내지 15 m
200 t/h의 용량에 대하여 (도데칸올 유량은 F/S=2 wt/wt를 사용하여 계산됨):
· 컬럼 내부 활성 직경 = 2300 내지 2500 mm
· 패킹 길이 = 15 내지 16 m
· 총 컬럼 길이 = 18 내지 19 m

Claims (18)

  1. a) 안트라닐레이트 음이온 및 양이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계,
    b) 촉매의 존재 또는 부재 하에 열적 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온을 아닐린으로 전환시키는 단계,
    c) 단계 b)에서 생성된 아닐린을 유기 용매 중에서 1회 이상 추출하는 단계, 및
    d) 단계 b) 및 c)에서 생성된 아닐린을 증류에 의해 정제하며, 여기서 상기 증류는 아닐린 및 수상을 생성하는 것인 단계
    를 포함하는, 아닐린의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 a)에서 상기 o-아미노벤조에이트를 화학적으로 제공하거나 생물학적으로 생성하거나, 또는 이를, 재조합 미생물 호스트 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료의 발효에 의해 생물학적으로 생성하고, 여기서 상기 재조합 미생물 호스트 세포는 발효성 탄소 기질을 포함하는 상기 원료를 발효에 의해 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 것이고, 여기서 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온 및 양이온을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 a)의 상기 발효가 배치 발효, 공급-배치 발효 또는 연속 발효인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a) 내지 단계 d)를 연속적으로 진행하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 양이온이 NH4 + 또는 Na+인 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 a)의 상기 재조합 미생물 호스트를, 후속되는 단계 b)에서의 열적 탈카르복실화에 의한 상기 안트라닐레이트 음이온에서 아닐린으로의 전환 전에 제거하고, 여기서 상기 제거된 재조합 미생물 호스트를 단계 a)의 발효에 재-공급하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매가 불균질 산 촉매, 제올라이트, 또는 제올라이트 H-Y인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매가 불균질 염기 촉매, 층상 이중 수산화물, 또는 Mg-Al 히드로탈사이트인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 유기 용매 중에서의 아닐린의 추출을, 증류에 앞서 아닐린의 추가의 예비-농축을 위해 1회 초과로 수행하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 추출에 사용된 유기 용매를 회수하는 것을 포함하며, 여기서 상기 회수를 증류에 의해 수행하고, 상기 회수된 유기 용매를 단계 c)에 재-공급하여 단계 b)에서 생성된 아닐린의 추출을 위해 다시 재-사용하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 용매가 알콜, 페놀, 아미드, 에테르 및 방향족 탄화수소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 알콜은 1-도데칸올인 방법.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 a)의 발효에, 단계 c)에서 수행된 추출의 수상을 재-공급하고/거나 단계 d)에서 수행된 증류의 수상을 재-공급하는 추가의 단계 e)를 포함하는 방법.
  13. 제5항에 있어서, 단계 d)의 증류 후에 NH4 + 양이온을 NH3으로서 회수하여 단계 a)의 발효에 재-공급하는 것인 방법.
  14. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 a)의 원료가 사탕무, 사탕수수, 전분-함유 식물, 옥수수, 밀, 호밀, 리그노셀룰로스, 짚, 목재, 바가스, 글리세롤, C1-화합물, 및 CO로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효성 탄소 기질이 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드 및 트리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 C-5 모노사카라이드는 크실로스 및 아라비노스이고, C-6 모노사카라이드는 글루코스, 프룩토스 또는 만노스이고, 디사카라이드는 사카로스이고, 트리사카라이드는 케스토스인 방법.
  16. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 재조합 미생물 호스트가 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 박테리아는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주, 코리네박테리움(Corynebacterium) 균주 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 균주이고, 상기 코리네박테리움 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이고, 상기 슈도모나스 균주는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 또는 슈도모나스 푸티다 KT2440인 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
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