KR102519359B1 - 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법 - Google Patents

슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈도모나스 아조토포만스(Psuedomonas azotoformans, 기탁번호 KCTC14254BP)를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 슈도모나스 아조토포만스를 이용함으로써 공기조화설비에서 발생하는 악취를 저감시키는 효과를 기대할 수 있으며, 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법{Microbial Agent comprising Psuedomonas azotoformans and Manufacuring Method thereof}
본 발명은 슈도모나스 아조토포만스(Psuedomonas azotoformans, 기탁번호 KCTC14254BP)를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 슈도모나스 아조토포만스를 이용함으로써 공기조화설비에서 발생하는 악취를 저감시키는 효과를 기대할 수 있으며, 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 공조조화설비에서 발생되는 악취를 근본적으로 해결하기 위한 바이오 소재 선별방법을 비롯하여 그 과정을 통하여 얻은 슈도모나스 아조토포만스(Psuedomonas azotoformans, 기탁번호 KCTC14254BP)을 활용한 악취저감 효과를 기대할 수 있는 바이오 악취 저감용 미생물제제 및 이의 제조방법, 이의 처리방법을 제공하고자 한다.
공기조화(Air Conditioning)은 온도, 습도, 기류, 청정 및 환기 등의 제어가 필요한 열린 혹은 닫힌 공간에서 있는 사람 혹은 물품 등에 있어 알맞은 조건을 유지하는 것을 말한다.
그 중 온도는 계절 별 기온이나 여러 환경요건에 따라 가장 민감하게 느껴지는 요소로 이를 기준으로 냉방 혹은 난방이라 분류하고 있으나 습도, 기류, 청정 및 환기를 배제하고는 완전한 공기조화라고 부를 수 없다.
즉, 공기조화시설은 광범위하게 사람 혹은 물품에 대한 요구 조건에 대하여 온도를 비롯한 여러 요소에 대한 제어가 가능한 설비를 의미한다. 따라서 공기조화설비를 일컬어 HVAC(Heating, Ventilation and Air Conditioning)이라 표현한다.
공기조화를 구성하는 여러 요소 중 가장 크게 체감하는 온도는 특히, 기온과 습도가 높아지는 여름철에 냉방 시설을 의미하는 에어컨(Air Conditioner)을 통하여 온도를 제어함으로서 쾌적한 실내 환경을 조성한다.
에어컨(Air Conditioner)은 압축기, 응축기, 팽창기, 증발기로 이루어지는 냉매의 냉동사이클을 이용하여 실내를 냉난방 시키거나 공기를 정화시키는 설비이며, 상승된 실내 온도 및 습도를 낮추기 위하여 가동하게 된다.
과거 사회와 달리 미세먼지, 초미세먼지 등으로 대기의 질이 점점 나빠지고 있는 현재 사회에서 깨끗한 공기는 건강과 웰빙에 기본적인 요구사항으로 인식되고 있고, 최근 고객 감성품질 증대에 따라 냄새와 같은 항목에 대한 관심이 크게 증가하고 있으며, 에어컨을 비롯한 공조설비에서 발생하는 악취는 공조 분야 품질 지수에서 매년 발생하는 대표적이며 고질적인 소비자 불만사항으로 보고되고 있는 실정이다.
일반적으로 에어컨 냄새는 크게 2가지 이유로 발생하게 된다.
첫 번째는 저온의 냉매와 이보다 높은 공기가 서로 열 교환을 수행하게 됨에 따라 증발기 내부에 위치한 냉각핀 표면의 결로 현상으로 인해 물방울이 맺히게 되고, 외부로부터 유입되는 먼지를 비롯한 각종 세균이나 곰팡이가 증식하기 좋은 환경이 된다.
이러한 환경에서 증식한 세균이나 곰팡이의 증식과정에서 발생하는 휘발성유기화합물(VOCs, Volatile ornagin compounds)을 포함하는 공기가 실내로 송풍되어 사용자로 하여금 악취를 감지하게 된다. 냄새가 발생하는 두 번째 이유는 사용 환경에 따라 차이가 있으나, 증발기 표면으로 악취를 발생시킬 수 있는 물질의 고착에 기인한다.
이를 해결하기 위해서 제조사는 생산과정에서 악취 유발을 방지하기 위하여 안전문제가 발생하지 않는 범위에서 명확하게 규명이 되는 화학물질을 활용하여 선 도포를 시행하고 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 일반 소비자의 경우, 온/오프라인 매장을 통하여 곰팡이, 악취 제거제, 살균제 및 방향제를 사용하게 되는데 정확하게 악취가 발생하는 원인을 제거할 수 없는 한계점을 가지기에 완전한 해결책이라 보기 어렵다.
더불어 화학적 살생물질의 사용하는 제품은 잠재적으로 인체에 유해할 가능성이 높으며 과도한 사용은 항생제 내성균이나 슈퍼박테리아에 관한 문제를 야기할 수 있기 때문에 사용에 신중을 기해야하지만 이조차 일반소비자가 파악하기에는 어려움이 많은 실정이다.
나아가, 화학적 살생물질을 포함하는 제품사용으로 인해 발생한 인명피해로 국내/외에서 화학물질에 대한 법적 규제가 강화되는 동시에 소비자 역시 안전 문제에 대한 관심도가 높아졌기 때문에 이를 대체할 수 있는 기술개발 및 제품화가 필요한 실정이다.
이를 위해 천연물 혹은 미생물을 활용한 EM(Effective microorganism)발효액 등의 탈취제를 출시하였으나, 오히려 곰팡이가 발생하는 등의 문제점을 나타내고 있다.
미생물은 보호기작으로서 생물막(biofilm)을 형성하는데, 이는 하나 또는 여러 유형의 표면부착 미생물과 그들이 생성한 다량체 기질을 비롯한 다당류, 단백질, 지질 및 세포 외 고분자 물질(EPS, extracellular polymeric substances)로 구성된 점액질의 3차원적 구조물로 미생물군집에 의한 사회적 집단행동(social group behavior)으로 보고되고 있으며, 가장 대표적인 예로는 치아의 표면에 형성되는 치석(dental plaque)을 들 수 있다.
생물막을 생성하는 미생물의 종류로는 세균(bacteria), 곰팡이(fungi), 원생생물(protists)이 있으며, 이를 통한 이점은 영양분을 서로 공유하고 저 영양, 높고 낮은 온도, 항생제 등의 다양한 유해환경요인으로부터 보호를 받는 동시에 미생물이 자랄 수 있는 요건을 충족시킬 때 다시금 활성화되어 성장을 할 수 있다는 것이다.
실제로 미생물에 의한 생물막은 거의 모든 종류의 고체 표면에서 형성될 수 있기 때문에 종래에는 감염 과정에서 상피세포, 치아, 혈관내벽 등을 비롯해 카테터(catheter), 각종 삽입 보형물(implant) 같은 의료분야에 문제를 일으키기도 하며 수도관, 하수관, 정수기, 공기 정화시설 등 미생물이 접근할 수 있는 모든 종류의 인공 시설물에도 생물막이 형성된다고 보고되고 있다.
이렇게 형성된 생물막은 감염의 만성화와 여러 시설물들의 부식 및 기능저하를 유발하기 때문에 생물막은 미생물학뿐만 아니라 의학, 치의학, 약학 등을 비롯해 토목, 건축, 도시, 환경 공학 등 광범위한 분야에서 높은 관심을 받고 있으며 필수적으로 제거되어야 하는 대상으로 통용되고 있다.
더불어 우점(prevalent)은 주로 생물학 관련 분야에서 사용되며, 우선적으로 혹은 우위를 점하여 특정 환경에서 가장 많은 개체수를 이룬 군집이나 종의 상태를 말한다.
우점 상태의 대표적인 예로 발효식품의 경우, 식품 내에 유익균이 우점되도록 유도하여 인체에 무해한 혹은 더 나아가 유산균과 같이 유익한 미생물이 우위를 점하게 하여 부패를 일으키는 것과 같은 해로운 균종 발생 및 증식을 억제하여 원래의 상태보다 저장 기간이 늘어나며 섭취 시 장내 미생물 구성을 유익한 쪽으로 돕는 등의 효과를 얻을 수 있다.
이렇듯 공기조화설비에서 발생하는 악취를 저감시키기 위해 화학적 살생물질을 사용하지 않고, 미생물이 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 악취가 발생하는 근본적인 문제에 대한 해결방안 마련이 요구된다.
대한민국 등록특허공보 제10-2015472호(2019.08.22) 대한민국 등록특허공보 제10-2155264호(2019.08.22)
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 슈도모나스 아조토포만스를 이용함으로써 화학적 살생물질을 사용하지 않고, 미생물이 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 공기조화설비에서 악취가 발생하는 근본적인 문제를 해결할 수 있도록 하는 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 종래 화학적살생물질을 사용하는 제품이 가지는 짧은 지속성과 안전성 문제를 해결하여 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하여 가정용, 차량용, 산업용 등 공조설비를 활용하는 다양한 상업용 공기조화설비로 적용할 수 있는 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 지닌 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위해서, 슈도모나스 아조토포만스(Psuedomonas azotoformans, 기탁번호 KCTC14254BP)를 영양배지에서 배양하여 배양시드를 제조하는 배양시드제조단계; 상기 배양시드를 발효기로 접종하여 본배양을 통해 슈도모나스 아조토포만스 배양액을 대량으로 제조하는 대량생산단계; 원심분리기를 이용하여 상기 대량생산단계에서 수득한 상기 슈도모나스 아조토포만스 배양액에서 슈도모나스 아조토포만스 균체를 회수하는 균체회수단계; 상기 균체회수단계에서 회수된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 700mtorr 압력 조건에서 -65 내지 -70℃에서부터 5 내지 10℃ 간격으로 승온시키며 일정 시간동안 동결건조시키는 동결건조단계; 및 상기 동결건조단계를 통해 동결건조된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 1 내지 3mm의 입도를 갖도록 분쇄하여 미생물소재를 형성하며, 상기 미생물소재 95 내지 99 중량%와 갈락토사민 1 내지 5 중량%을 혼합하여 미생물 제제를 제조하는 동결원료화단계;를 포함하는 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법을 제공할 수 있다.
이때, 상기 슈도모나스 아조토포만스를 영양배지에 순수배양하여 생성한 배양액 시료에 대하여 관능 평가, 저영양 평가, 생물막 형성능 평가 및 생물막 분산도 평가를 통해 악취저감용 균주를 선별하는 악취저감용 균주선별단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 악취저감용 균주선별단계는, 상기 슈도모나스 아조토포만스의 순수배양과정에서 발생하는 상기 배양액 시료의 냄새 세기를 관능 평가하여 배양액 시료들 중 냄새 세기 정도가 상대적으로 약한 상기 배양액 시료를 선별하는 관능 평가 단계와, 상기 관능 평가 단계에서 선별된 상기 배양액 시료의 일부를 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후 1차 배양과정에서 이용된 상기 고체영양배지보다 20 내지 75% 감소된 고체영양배지에 1차 배양된 상기 배양액 시료를 획선도말(Streaking)하여 1차 배양과정과 동일한 조건으로 2차 배양하며 2차 배양된 상기 배양액 시료 내에서 집락(Colony)이 가장 크게 형성된 배양액 시료를 선별하는 저영양 생장성 평가 단계와, 순수배양된 상기 배양액 시료 중 상기 저영상 생장성 평가 단계에서 선별된 배양액 시료에 대응하는 상기 배양액 시료의 일부를 아미노글리코사이드계 항생제 및 베타-락탐계(β-lactam) 항생제를 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 배양한 후 배양된 상기 배양액 시료들 중 생물막의 형성정도를 관찰하여 생물막의 조직이 상대적으로 치밀하게 형성되어 생물막의 형성능이 높다고 판단되는 상기 배양액 시료를 선별하는 생물막 형성능 평가 단계와, 순수배양된 상기 배양액 시료 중 상기 생물막 형성능 평가 단계에서 선별된 배양액 시료에 대응하는 상기 배양액 시료의 일부를 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당을 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후 배양된 상기 배양액 시료들 중 생물막의 분산정도를 관찰하여 생물막의 분산도가 상대적으로 높은 상기 배양액 시료를 선별하는 생물막 분산도 평가 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이와 더불어 상기 동결건조단계 이전에 상기 균체회수단계에서 회수된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 -65 내지 -75℃에서 24시간 동안 예비동결시키는 예비동결단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 상기한 제조방법에 의해 제조된 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제를 제공할 수 있다.
이때, 미생물 제제 0.001 내지 5중량%를 칼슘 0.1 내지 1.5중량%가 첨가된 멸균증류수 93.5 내지 99.899 중량%와 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 슈도모나스 아조토포만스를 이용함으로써 화학적 살생물질을 사용하지 않고, 미생물이 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 공기조화설비에서 악취가 발생하는 근본적인 문제를 해결할 수 있다는 이점이 있다.
또한, 본 발명은 종래 화학적살생물질을 사용하는 제품이 가지는 짧은 지속성과 안전성 문제를 해결하여 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하여 가정용, 차량용, 산업용 등 공조설비를 활용하는 다양한 상업용 공기조화설비적용할 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법을 나타낸 공정순서도이다.
도 2는 도 1에 도시된 악취저감용 균주선별단계를 세부적으로 나타낸 공정순서도이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
본 발명의 공조설비 악취저감용 미생물 제제는 슈도모나스 아조토포만스(Psuedomonas azotoformans, 기탁번호 KCTC14254BP)를 포함하여 슈도모나스 아조토포만스가 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 공기조화설비에서 악취가 발생하는 근본적인 문제를 해결할 수 있는 것으로, 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법을 나타낸 공정순서도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 미생물 제제를 제조하기 위하여 악취저감용 균주선별단계(S10), 배양시드제조단계(S20), 대량생산단계(S30), 균체회수단계(S40), 동결건조단계(S50) 및 동결원료화단계(S60)를 순차적으로 실시한다.
우선, 상기 악취저감용 균주선별단계(S10)는 상기 미생물 제제 악취저감 효과를 보다 높이기 위해 상기 미생물 제제 제조에 이용되는 상기 슈도모나스 아조토포만스를 악취저감용 균주로 선별하는 단계로서, 상기 슈도모나스 아조토포만스를 영양배지에 순수배양하여 생성한 배양액 시료에 대하여 관능 평가, 저영양 생장성 평가, 생물막 형성능 평가 및 생물막 분산도 평가를 통해 악취저감용 균주를 선별한다.
상기 악취저감용 균주선별단계(S10)에서 악취저감용 균주로 선별된 슈도모나스 아조토포만스는 상기 배양시드제조단계(S20)에서 영양배지에서 배양되어 배양시드로 제조된다.
상기 배양시드제조단계(S20)는 상기 대량생산공정(S30)을 진행하기에 앞서 발효기를 이용한 미생물 배양에 기초가 되는 시드(Seed) 미생물 즉, 배양시드를 제조하는 단계로, 1,000L의 최종 부피(working volume)에 대해 0.25% 내지 1%에 해당하는 부피를 갖는 상기 배양시드를 제조하기 위하여 상기 악취저감용 균주로 선별된 슈도모나스 아조토포만스를 상기 영양배지에 1,500L 내지 5,000L plant scale 발효기로 접종하고자 한다.
구체적으로는, 우선, 상기 슈도모나스 아조토포만스의 호기성 대사를 감안하여 상기 악취저감용 균주선별단계(S10)에서 상기 악취저감용 균주로 선별된 슈도모나스 아조토포만스를 순수배양하여 생성한 상기 배양액 시료를 상기 배양시드의 최종배양용량(working volume) 1,000L를 기준으로 0.25 내지 0.5%의 부피를 갖는 것 1 내지 3개와 0.7 내지 1%의 부피를 갖는 것 3 내지 5개로 나누어 접종을 준비한다.
이때, 바람직하게는 0.5%의 배양시드 2개와 1%의 배양시드 4개로 나누어 접종을 준비한다.
또한, 5L 용량의 삼각 플라스크를 복수 개를 준비하고, 나누어진 상기 배양시드에 대응하는 상기 영양배지를 제조한 후, 멸균기(Autoclave)를 이용하여 120 내지 125℃의 온도조건으로 15 내지 25분간 멸균을 진행한다.
이때, 멸균조건은 121℃의 온도에서 20분간 유지되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 영양배지는 효모 추출물(Yeast extract) 1 내지 2중량부 , 글루코스(Glucose) 0.5 내지 1 중량부, 갈락토사민(galactosamine) 0.1 내지 0.5중량부), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.01 내지 0.1중량부, 황산제일철7수화물(Ferrous sulfate heptahydrate) 0.01 내지 0.1중량부, 포타슘하이드로겐포스페이트(Potassium hydrogen phosphate) 0.01 내지 0.1중량부, 포타슘디하이드로겐포스페이트(Potassium dihydrogen phosphate) 0.01 내지 0.1중량부 및 인산칼슘(Calcium phosphate) 0.01 내지 0.1중량부를 포함하는 것이며, 바람직하게는 효모 추출물(Yeast extract) 1.5중량부, 글루코스(Glucose) 0.5중량, 갈락토사민(galactosamine) 0.5중량, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.05중량부, 황산 제일철7수화물(Ferrous sulfate heptahydrate) 0.05중량부, 포타슘하이드로겐포스페이트(Potassium hydrogen phosphate) 0.05중량부, 포타슘디하이드로겐포스페이트(Potassium dihydrogen phosphate) 0.1중량부 및 인산칼슘(Calcium phosphate) 0.03 중량부를 포함할 수 있다.
또한, 상기 영양배지는 부피는 상기 배양시드 1.5 내지 3.0L를 기준으로 제조되어야 하며, 바람직하게는 상기 영양배지는 부피는 상기 배양시드 2.5L를 기준으로 제조되어야 한다.
상기 무균기 내에서 상기 배양시드의 부피를 기준으로 1%에 해당하는 상기 배양시드를 상기 영양배지에 접종하고, 진탕배양기(진탕배양기)에서 30 내지 32℃의 온도조건에서 100 내지 150rpm으로 3 내지 5일간, 바람직하게는 4일간 1차 시드배양을 실시한다.
소정의 시간동안 배양을 한 후, 600nm파장으로 흡광도를 측정하며, 측정값이 Lab. scale 실험을 통하여 도출한 배양종료 흡광도 기준치에 도달하면, 배양을 종료하여 1차 시드배양액을 수득한다.
이후, 1,500L 발효기를 통해 새로운 영양배지를 준비하고, 120 내지 125℃의 온도조건으로 15 내지 25분간 에어필터와 함께 멸균을 진행하며, 이때, 멸균조건은 121℃의 온도에서 20분간 유지되는 것이 바람직하다.
멸균과정 이후, 배양시드의 배양조건인 30 내지 32℃, 50mL/min, 50 내지 80rpm 및 0.5kg/cm2으로 제어하고 접종을 위해 상기 1차 시드배양액을 준비하며, 접종구에 화염링을 설치하고, 발효기 압력을 풀어준 후, 에어공급량을 25 내지 40L/min, 바람직하세는 25mL/min으로 조정하고, 상기 1차 시드배양액을 발효기로 접종하여 3 내지 5일간, 바람직하게는 4일간 2차 시드배양을 실시한다.
소정의 시간동안 배양을 한 후, 600nm파장으로 흡광도를 측정하며, 측정값이 Lab. scale 실험을 통하여 도출한 배양종료 흡광도 기준치에 도달하면, 배양을 종료하여 2차 시드배양액을 수득한다.
상기 2차 시드배양 종료 이후, 오염 발생 여부를 확인을 위하여 상기 2차 시드배양액을 샘플링을 진행하여 멸균기 내에서 상기 2차 시드배양액 10ul를 고체영양배지에 획선도말을 실시하고, 배양기(배양기)에서 30 내지 32℃으로 배양을 실시하여 시드배양액 이외에 균체가 관찰되는지 확인한다.
오염발생여부 확인 후, 원심분리 및 동결건조과정을 거쳐 시드배양액 내 균체의 수분활성도를 낮춰서 분말화 하고, 수율을 평가한 후, 최종적으로 분말화된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 배양시드로서 수득함으로써 상기 배양시드제조단계(S20)는 종료된다.
다음으로, 상기 배양시드제조단계(S20)이후에는 상기 대량생산단계(S30)을 통해 상기 배양시드를 발효기로 접종하여 본배양을 통해 슈도모나스 아조토포만스 배양액을 대량으로 제조한다.
구체적으로 살펴보면, 우선, 최종배양용량(working volume)을 기준으로 0.5%에 해당하는 상기 배양시드를 준비하고, 1,500L 발효기를 통하여 슈도모나스 아조토포만스를 배양하기 위하여 발효조에 증류수 1,000L와 최적화 영양배지를 넣고 에어필터 멸균을 실시한다.
이때, 120 내지 125℃의 온도조건으로 15 내지 25분간 멸균을 진행하며, 바람직하게는 멸균조건이 121℃의 온도에서 20분간 유지되어야 한다.
또한, 에어필터 멸균에 앞서, 상기 발효기의 스팀배관 내에 존재하는 응축수의 배수(Drain)를 10 내지 15분간 진행하며, 에어필터 멸균을 진행 후에는 30분 간 에어필터 건조를 실시한다.
여기서, 상기 응축수의 배수(Drain)는 에어필터 과정에서 오염 발생을 방지 하기 위한 것으로, 응축수가 있는 상태로 스팀이 에어필터로 넘어가게 되면 상기 스템배관에 포함된 철 성분을 비롯한 이물질이 필터를 오염 시키는 현상이 나타난다.
한편, 상기 에어필터 멸균시, 상기 스팀배관으로 들어오는 스팀압력이 너무 높을 경우, 상기 에어필터의 변형을 유발하기 때문에 적정압력으로 조절되어야 한다.
상기 에어필터 멸균을 통해 발효조 및 배지 멸균을 진행한 후, 배양 온도인 30 내지 32℃까지 냉각을 실시하고, 배양조건을 24 내지 28℃, 50L/min, 50 내지 80rpm, 0.5 내지 0.8kg/cm2으로 제어하고 접종을 위해 상기 1차 시드배양액을 준비하며, 접종구에 화염링을 설치하고, 발효기 압력을 풀어준 후, 에어공급량을 25 내지 40L/min으로 조정하고, 상기 배양시드를 발효기로 접종하여 상기 슈도모나스 아조토포만스 배양액의 대량생산을 위해 배양을 진행한다.
상기 대량생산단계(S30)가 완료되면 상기 균체회수단계(S40)를 진행하는데, 상기 균체회수단계(S40)에서는 원심분리기를 이용하여 상기 대량생산단계(S30)에서 수득된 상기 슈도모나스 아조토포만스 배양액에서 슈도모나스 아조토포만스 균체를 회수한다.
보다 상세하게는, 튜블러 타입 원심분리기를 이용하여 상기 슈도모나스 아조토포만스 배양액에서 균체를 회수하며, 이때, 원심분리기 RPM, 배양액 이송펌프 속도, 원심분리 필름 교체 횟수 등의 조건 변경을 통하여 균체 회수율을 높일 수 있다.
바람직하게는 원심분리기의 속도 11,000 내지 12,500rpm로 설정하고, 배양액 이송 펌프 속도 18 내지 28L/min으로 설정하며, 균체 회수 필름을 1 내지 3회 교체하여 상기 슈도모나스 아조토포만스 배양액에서 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 회수하여야 한다.
상기 균체회수단계(S40) 이후, 상기 동결건조단계(S50)를 실시하게 되는데, 이때, 상기 동결건조단계(S50)를 진행하기에 앞서, 상기 균체회수단계(S40)에서 회수된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 초저온냉동고(Deep-freezer)를 이용하여 -65 내지 -75℃의 온도조건에서, 바람직하게는 -70℃에서 24시간 동안 예비동결시키는 예비동결단계(미도시) 추가로 실시하여 후속될 상기 동결건조단계(S50)에서의 동결건조효율을 높일 수 있다.
한편, 상기 동결건조단계(S50)는 상기 균체회수단계(S40)에서 회수된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 700mtorr 압력 조건에서 -65 내지 -70℃에서부터 5 내지 10℃ 간격으로 승온시키며 일정 시간동안 동결건조시킨다.
구체적으로는, 동결건조기용 트레이(Tray)에 원심분리 필름을 제거하여 상기 균체회수단계(S40)에서 회수한 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 놓는다.
이때, 온도센서를 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체와 상기 트레이 사이에 놓게 되면 트레이별로 온도편차가 크게 나타나기 때문에 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체의 가장 두꺼운 부분에 설치하도록 해야하며, 바람직하게는 상기 예비동결단계(미도시) 이전에 상기 온도센서를 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체의 가장 두꺼운 부분에 설치하도록 해야한다.
이후, 상기 동결건조기의 선반온도를 -40℃로 설정하고, 설정온도에 도달하면 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체가 놓인 상기 트레이를 챔버(Chamber)내에 넣고 콜드트랩(Cold-trap)을 가동하여 챔버 내 온도가 -65 내지 70℃가 되면, 진공펌프(Vacuum pump)를 가동하여 진공을 걸어준다.
이후, 동결건조기 패널 상의 압력이 700 mtorr 이상으로 변하지 않는 선에서 선반온도를 5℃ 간격으로 증가시키고, 선반온도가 0℃ 이상으로 증가되면 동결건조기의 압력이 700 mtorr가 변하지 않는 선에서 10℃ 간격으로 온도를 증가시키고, 2시간 간격으로 추가적으로 선반온도를 증가시킨다.
상기 동결건조단계(S50)가 시작되고 대략 144시간이 경과한 후, 상기 동결건조단계(S50)를 종료하고 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체의 분말을 거두들이게 되는데, 이때, 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체 분말의 건조 정도에 따라 건조 시간 을 유동적으로 조절할 수 있다.
다음으로, 상기 동결원료화단계(S60)에서는 상기 동결건조단계(S50)를 통해 동결건조된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체는 외부와 차단된 청결 구역에서 1 내지 3mm의 입도를 갖도록 분쇄되어 미생물소재로 제조되며, 상기 미생물소재 95 내지 99 중량%와 EPS 구성 기반 아미노당인 갈락토사민 1 내지 5 중량%가 혼합되어 미생물 제제로 제조된다.
공조설비의 악취저감을 위하여 상기 미생물 제제는 0.001 내지 5중량%를 생물막을 견고하는데 도움을 주기 위해 0.1 내지 1.5중량%의 칼슘이 첨가된 멸균증류수 93.5 내지 99.899 중량%와 혼합하여 제조된 희석액을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 희석액을 압력 0.5 내지 1.3 kg/cm2, 유속 0.8 내지 1.9 L/min, 분사각도 30 내지 75도 조건으로 공조설비 증발기 표면으로 분사함으로써 공조설비의 악취저감 효과를 높일 수 있다.
도 2는 도 1에 도시된 악취저감용 균주선별단계를 세부적으로 나타낸 공정순서이다.
도 2에 상기 악취저감용 균주선별단계(S10)는 시료채취 및 순수배양단계(S11), 관능 평가 단계(S12), 저영양 생장성 평가 단계(S13), 생물막 형성능 평가 단계(S14) 및 생물막 분산도 평가 단계(S15)를 포함하는 세부단계들로 이루어진다.
상기 시료채취 및 순수배양단계(S11)는 멸균면봉을 이용하여 상기 공조설비 증발기 표면을 수 회 긁어서 시료를 채취한 후, 무균기 내에서 상기 시료를 채취한 멸균 면봉 튜브의 상단 부분과 PBS 10ml을 50ml 코니컬 튜브(conical tube)로 각각 넣고, 보텍스(Vortex)의 교반속도를 최대치로 하여 3 내지 4분간 탈리 과정 2 내지 3 회 진행하며, 1회 탈리 후에 아이스버켓(ICE bucket) 혹은 냉장고에서 1 내지 2분 간 방치하는 과정을 실시한다.
이후, 각각의 탈리 과정을 마친 상기 PBS 용액을 원액으로 하여 고상 배양 진행을 위해 상기 무균기 내에서 원액 10ul를 취하여 고체영양배지에 각각 획선도말을 실시하여 배양기에서 28℃조건으로 3 내지 5일 배양을 실시한다. 더불어 원액 1ml을 취하여 멸균된 R2A, NA 배지 9ml을 넣어 준비한 각각의 테스트 튜브(Test tube)에 접종하여 진탕배양기에서 24 내지 28℃, 100rpm 조건으로 2 내지 5일 배양을 실시한다.
탈리 원액을 접종한 각각의 테스트 튜브 배양이 종료되면 고체영양배지에 각각 배양액 10ul는 획선도말(Streaking)을 실시하고, 배양희석액(10-5 내지 10-8) 100ul는 평판배양(Spreading)을 실시하여 배양기에서 24 내지 28℃조건으로 2 내지 5일 동안 배양하며, 이러한 과정을 거쳐 고상/액상 배양을 실시하여 얻은 플레이트(plate)에서 집락(Colony)의 색깔/모양 등이 다른 것을 선별한 후, 단일 균주를 얻기 위하여 백금이로 집락(Colony)을 취하여 새로운 고체영양배지에 획선도말을 실시하여 순수배양을 수행한다.
순수배양과정을 통하여 획득한 배양액 시료의 단일균주에 대해서는 악취저감용 균주를 선별하기 위한 배양액 시료용 액상배지 제조에 활용할 수 있으며, 또한, 순수배양과정을 통하여 획득한 단일 균주에 대해서는 장기보존액 제조를 위한 액상배지 제조에 활용할 수 있다.
구체적으로는 멸균기를 활용하여 121℃, 15분 간 멸균을 실시하고 순수배양을 진행한 획선도말 플레이트(Streaking plate)에서 집락(Colony)을 취하여 R2A 배지(broth)로 접종하여 진탕배양기에서 28℃, 100rpm 조건으로 3 내지 5일 동안 배양을 실시한다. 이때, 상기 장기보존액은 20% 글리세롤(glycerol)을 증류수와 부피비(v/v)로 제조하여 멸균 과정을 거쳐 사용하며, 액상 배양을 위한 R2A 배지는 500ml 삼각 플라스크에 제조되되, 상기 장기보존액 제조를 위해 무균대 내에서 배양이 완료된 삼각 플라스크에서 멸균된 1.5ml 튜브(tube)로 배양액을 1ml씩 분취하여 10,000rpm에서 30초간 원심분리를 실시하며, 무균대 내에서 상등액을 버리고, 20% 글리세롤을 1ml씩 넣고 피펫(pipet)으로 현탁하여 초저온 냉동고(-70℃)에 보관한다.
다음으로, 상기 관능 평가 단계(S12)는 상기 슈도모나스 아조토포만스의 순수배양과정에서 발생하는 상기 배양액 시료의 냄새 세기를 관능 평가하여 상기 배양액 시료 내에서 악취저감용 균주를 우선적으로 선별하는 단계로, 단일 균주로 분리한 미생물의 배양과정에서 나타나는 냄새 세기 정도를 판단하기 위하여 관능 평가를 실시한다.
이때, 액상 배지에서 발생하는 냄새 세기를 최소화하기 위해 저영양 배지의 사용량을 30 내지 75% 줄여서 배지를 제조하여 멸균을 실시하고, 상기 장기보존액으로 제조된 상기 배양액 시료의 일부를 접종하여 진탕배양기에서 28℃의 온도조건에 100rpm으로, 3 내지 5일 동안 배양을 실시한 후, 1 내지 2차에 거쳐 10인 이상으로 구성된 관능평가단을 통하여 선별 미생물 소재가 배양과정에서 발생하는 냄새 세기를 기반으로 5점 평점법을 통하여 선별을 진행한다.
여기서, '5점 평점법'의 배점기준의 경우, 냄새 없음은 0점, 아주 약한 냄새(감지하기 어려운 냄새)는 1점, 약한 냄새(종류 구분이 어려운 냄새)는 2점, 냄새(종류 구분이 가능한 냄새)는 3점, 강한 냄새는 4점, 매우 강한 냄새는 5점으로 하여 진행하며, 배양액 시료들 중 상기 관능평가단의 평균점수가 가장 낮은 상기 배양액 시료 즉, 냄새 세기 정도가 상대적으로 약한 상기 배양액 시료를 악취저감용 균주로 우선 선별한다.
다음으로, 상기 저영양 생장성 평가 단계(S13)는 상기 관능 평가 단계(S12)에서 선별된 상기 배양액 시료의 일부를 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 1차 배양과정에서 이용된 상기 고체영양배지보다 20 내지 75% 감소된 고체영양배지에 1차 배양된 상기 배양액 시료를 획선도말하여 1차 배양과정과 동일한 조건으로 2차 배양하며, 2차 배양된 상기 배양액 시료 내에서 집락(Colony)이 가장 크게 형성된 배양액 시료를 선별하는 과정이다.
구체적으로는 상기 배양액 시료가 배양된 플레이트를 준비하고, 동일시간을 배양하였을 때 집락(Colony)이 큰 것을 선별하여 새로운 고체영양배지에 집락(Colony) 1개를 백금이로 취하여 획선도말을 실시하며, 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 1차 배양을 실시한 후, 영양 배지 사용량을 20 내지 75% 감소시켜서 고체영양배지를 제조하고, 상기 배양액 시료가 배양된 플레이트에서 집락(Colony)을 취하여 획선도말을 실시하여 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 2차 배양을 실시한다.
이후, 2차 분리한 플레이트에 대하여 동일 시간 배양하였을 때 집락(Colony)이 크게 형성된 상기 배양액 시료를 선별한다.
이때, 1 내지 2차 배양 과정의 2 내지 3회 반복을 통하여 향후 대량 생산으로 이어졌을 때 필요한 기초데이터를 확보함으로써, 이를 활용하여 생산성 향상을 위한 배양조건 최적화도 진행할 수 있다.
한편, 상기 저영양 생장성 평가 단계(S13)에서 배양되어 평가에 사용된 상기 배양액 시료는 저영양 생장성 평가를 위해서만 사용될 뿐, 해당 평가 단계가 종료되면, 즉시 배양액 시료 내 균주를 모두 사멸시킨 후 해당 배양액 시료를 전원 폐기한다.
다음으로, 상기 생물막 형성능 평가 단계(S14)는 순수배양된 상기 배양액 시료 중 상기 저영양 생장성 평가 단계(S13)에서 선별된 상기 배양액 시료에 대응하는 상기 배양액 시료의 일부를 아미노글리코사이드계 항생제 및 베타-락탐계(β-lactam) 항생제를 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 배양된 상기 배양액 시료들의 생물막 형성정도를 관찰하여 생물막의 조직이 상대적으로 치밀하게 형성되어 생물막의 형성능이 높다고 판단되는 상기 배양액 시료를 선별하는 단계이다.
주지된 바와 같이, 상기 항생제란 특정 미생물의 생장을 저해하거나 사멸시키는 제제로 정의되며, 이 중 아미노글리코사이드계(Aminoglycoside)계 항생제의 일종인 스트렙토마이신(Streptomycin), 토브라마이신(Tobramycin), 네오마이신(Neomycin), 젠타마이신(Gentamicin) 중 하나 또는 둘 이상의 일정 농도 조합에서 배양 시, 생물막 형성에 도움을 줄 수 있다. 또한 베타-락탐계(β-lactam) 항생제의 일정 농도 조건에서 배양 시, 다당류 기반의 알지네이트(alginate) 생물막이 형성된다.
따라서, 상기 생물막 형성능 평가 단계(S14)는 고체영양배지를 제조하는 과정에서 각각 아미노글리코사이드계 항생제 0.01 내지 400ug/ml과 베타-락탐계(β-lactam) 항생제 0.01 내지 400ug/m을 첨가하며, 준비된 각각의 항생제 기반 고체영양배지로 선별된 상기 배양액 시료 100ul를 도말하고, 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 배양을 실시한다.
이후, CFU counting, 건조 질량(dry mass), 염색(strain)을 활용하여 배양된 상기 배양액 시료들의 생물막 형성 정도를 1차적으로 판단하며, 선별된 미생물 소재에 대하여 형광염색을 실시하고, 공초점 레이저 주사현미경(CLSM, confocal laser scanning microscopoe)을 통하여 생물막의 영양 분석을 실시하거나 미세유체채널(microfluidic channel)을 이용한 매립 생물막 모델을 통하여 겔속의 생물막을 일반 현미경으로 육안 관찰을 통하여 생물막 형성 정도를 판별하여 배양액 시료들 중 상대적으로 치밀한 조직의 생물막이 형성된 즉, 생물막의 형성능이 높은 상기 배양액 시료를 선별하게 된다.
한편, 상기 생물막 형성능 평가 단계(S14)에서 배양되어 평가에 사용된 상기 배양액 시료는 생물막 형성능의 평가를 위해서만 사용될 뿐, 해당 평가 단계가 종료되면 즉시 배양액 시료 내 균주를 모두 사멸시킨 후 해당 배양액 시료를 전원 폐기한다.
다음으로, 상기 생물막 분산도 평가단계(S15)는 순수배양된 상기 배양액 시료 중 상기 생물막 형성능 평가 단계(S14)에서 선별된 상기 배양액 시료에 대응하는 상기 배양액 시료의 일부를 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당을 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 배양된 상기 배양액 시료들의 생물막 분산정도를 관찰하여 생물막의 분산도가 상대적으로 높은 상기 배양액 시료를 선별하는 단계이다.
숙신산염(succinate), 글루탐산염(glutamate) 및 포도당(glucose)과 같은 탄소기질의 갑작스러운 가용성 증가는 생물막 분산을 유도한다는 점은 주지되어 있으며 해당과정은 이를 활용하여 배양액 시료들 중 생물막의 분산도가 높은 상기 배양액 시료를 악취저감용 균주로 선별하는 단계인 것이다.
구체적으로는 고체영양배지를 제조하는 과정에서 각각 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당 1 내지 100mM 첨가하며, 준비된 각각의 항생제 기반 고체영양배지로 선별된 상기 배양액 시료 100ul를 도말하고, 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 배양을 실시한 후, CFU counting, 건조 질량(dry mass), 염색(strain)을 활용하여 생물막 분산 정도를 1차적으로 판단하며, 이에 형광염색을 실시하고, 공초점 레이저 주사현미경(CLSM, confocal laser scanning microscopoe)을 통하여 생물막의 영양 분석을 실시하거나 미세유체채널(microfluidic channel)을 이용한 매립 생물막 모델을 통하여 겔속의 생물막을 일반 현미경으로 관찰하도록 하여 생물막 분산 정도를 판별함으로써 배양액 시료들 중 생물막의 분산도가 상대적으로 높은 상기 배양액 시료를 악취저감용 균주로 최종 선별하게 되는 것이다.
한편, 상기 생물막 분산도 평가단계(S15)에서 배양되어 평가에 사용된 상기 배양액 시료는 생물막 분산도의 평가를 위해서만 사용될 뿐, 해당 평가 단계가 종료되면 즉시 배양액 시료 내 균주를 모두 사멸시킨 후 해당 배양액 시료를 전원 폐기한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법에 따른 제조예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제조예
본 발명에 따라 선별된 상기 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 미생물 제제 희석액을 제조하였다.
여기서, 상기 미생물 제제 희석액 상기 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 미생물 제제 98%(w/w), 갈락토사민 1%(w/w)와 칼슘 1%(w/w)의 배합비로 제조되었다.
실험예
시중에 공조설비 악치제거용 탈취제로 판매되고 있는 에탄올을 주성분으로 하는 제품 20ml과 본 발명에 따른 제조예로 제조된 상기 미생물 제제 희석액와 비교예로 준비된 시중의 악취제거용 탈취제를 공조설비 내 열교환이 일어나는 증발기(Evaporator)로 적용하였다.
경과시간과 공조설비를 냉방 모드로 설정한 후 발생되는 기체는 펌프(SIBATA, MP-30N)를 활용하여 5L 알루미늄 폴리에스터백으로 기체 시료를 채취하여 휴대용 휘발성 유기화합물검출기(TESTAUCTION, SKT1050)를 이용하여 측정한 후 비교한 결과는 표 1과 같다.
경과시간 미생물 개체 수(종) 악취 저감율(%)
제조예 비교예 제조예 비교예
처리직후 1
Figure 112020125196369-pat00001
 8 78 94
1 개월 1
Figure 112020125196369-pat00002
 11 84 73
2 개월 2
Figure 112020125196369-pat00003
 14 88 61
4 개월 3
Figure 112020125196369-pat00004
 13 92 34
6 개월 3
Figure 112020125196369-pat00005
 16 90 14
표 1과 같이 제조예와 비교예를 비교하였을 때, 처리 후 1개월이 경과함에 따라 제조예의 지속력이 비교예의 지속력보다 월등히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
특히 1개월이 지난 시점부터 비교예의 악취 저감 성능이 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 그에 반해 제조예예는 미생물 소재의 생물막(Biofilm) 형성을 통한 우점으로 악취 저감 효과를 기대하기에 처리 직후에는 비교예보다 낮은 악취 저감율을 보이나 1개월이 경과되는 시점부터 비교예보다 높은 악취 저감 효과를 보이는 동시에 6개월까지 꾸준히 유지되는 것을 확인하였다.
더불어 처리 시기 별로 공조설비 증발기 시편을 샘플링하고, 미생물 군집을 조사한 결과 비교예는 악취 저감율이 감소하는 동시에 미생물 개수 체가 증가하는 양상을 나타내는 반해 제조예는 처리한 미생물 소재 수를 유의미하게 상회하지 않는 선에서 미생물 개체 수가 유지되었으며 악취 저감율은 증가하는 양상을 나타내었다.
따라서, 이를 통해 본 발명에 따른 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제가 우점을 차지하여 악취를 유발하는 곰팡이나 세균의 증식을 저감시키고 결과적으로 악취를 저감시키는 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
이상과 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
S10 : 악취저감용 균종선별단계
S20 : 배양시드제조단계
S30 : 대량생산단계
S40 : 균체회수단계
S50 : 동결건조단계
S60 : 동결원료화단계

Claims (7)

  1. 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법에 있어서,
    슈도모나스 아조토포만스(Psuedomonas azotoformans, 기탁번호 KCTC14254BP)를 영양배지에서 배양하여 배양시드를 제조하는 배양시드제조단계;
    상기 배양시드를 발효기로 접종하여 본배양을 통해 슈도모나스 아조토포만스 배양액을 대량으로 제조하는 대량생산단계;
    원심분리기를 이용하여 상기 대량생산단계에서 수득한 상기 슈도모나스 아조토포만스 배양액에서 슈도모나스 아조토포만스 균체를 회수하는 균체회수단계;
    상기 균체회수단계에서 회수된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 700mtorr 압력 조건에서 -65 내지 -70℃에서부터 5 내지 10℃ 간격으로 승온시키며 일정 시간동안 동결건조시키는 동결건조단계; 및
    상기 동결건조단계를 통해 동결건조된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 1 내지 3mm의 입도를 갖도록 분쇄하여 미생물소재를 형성하며, 상기 미생물소재 95 내지 99 중량%와 갈락토사민 1 내지 5 중량%을 혼합하여 미생물 제제를 제조하는 동결원료화단계;를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 슈도모나스 아조토포만스를 영양배지에 순수배양하여 생성한 배양액 시료에 대하여 관능 평가, 저영양 생장성 평가, 생물막 형성능 평가 및 생물막 분산도 평가를 통해 악취저감용 균주를 선별하는 악취저감용 균주선별단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 악취저감용 균주선별단계는,
    상기 슈도모나스 아조토포만스의 순수배양과정에서 발생하는 상기 배양액 시료의 냄새 세기를 관능 평가하여 배양액 시료들 중 냄새 세기 정도가 상대적으로 약한 상기 배양액 시료를 선별하는 관능 평가 단계와,
    상기 관능 평가 단계에서 선별된 상기 배양액 시료의 일부를 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 1차 배양과정에서 이용된 상기 고체영양배지보다 20 내지 75% 감소된 고체영양배지에 1차 배양된 상기 배양액 시료를 획선도말(Streaking)하여 1차 배양과정과 동일한 조건으로 2차 배양하며, 2차 배양된 상기 배양액 시료 내에서 집락(Colony)이 가장 크게 형성된 배양액 시료를 선별하는 저영양 생장성 평가 단계와,
    순수배양된 상기 배양액 시료 중 상기 저영양 생장성 평가 단계에서 선별된 배양액 시료에 대응하는 상기 배양액 시료의 일부를 아미노글리코사이드계 항생제 및 베타-락탐계(β-lactam) 항생제를 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 배양한 후, 배양된 상기 배양액 시료들 중 생물막의 형성정도를 관찰하여 생물막의 조직이 상대적으로 치밀하게 형성되어 생물막의 형성능이 높다고 판단되는 상기 배양액 시료를 선별하는 생물막 형성능 평가 단계,를 포함하는 것을 특징으로 하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    순수배양된 상기 배양액 시료 중 상기 생물막 형성능 평가 단계에서 선별된 배양액 시료에 대응하는 상기 배양액 시료의 일부를 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당을 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 배양된 상기 배양액 시료들 중 생물막의 분산정도를 관찰하여 생물막의 분산도가 상대적으로 높은 상기 배양액 시료를 선별하는 생물막 분산도 평가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 동결건조단계 이전에 상기 균체회수단계에서 회수된 상기 슈도모나스 아조토포만스 균체를 -65 내지 -75℃에서 24시간 동안 예비동결시키는 예비동결단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 미생물 제제 0.001 내지 5중량%를 칼슘 0.1 내지 1.5중량%가 첨가된 멸균증류수 93.5 내지 99.899 중량%와 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제 슈도모나스 아조토포만스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제.
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