KR102511148B1

KR102511148B1 - E-빔을 이용한 봉독 멸균 공정 및 돼지 파보바이러스를 이용한 멸균 공정의 검증

Info

Publication number: KR102511148B1
Application number: KR1020210186238A
Authority: KR
Inventors: 한상미; 우순옥; 김세건; 김효영; 최홍민; 문효정
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-03-17
Also published as: KR20200144810A; KR20210158847A

Abstract

본 발명은 E-빔을 봉독에 조사하여, 봉독 내 바이러스를 멸균하고, 멸균 공정에 의한 바이러스의 멸균 여부를 돼지 파보바이러스를 이용하여 검증하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 E-빔(electron beam)을 봉독에 조사하는 단계;를 포함하는 봉독 내 바이러스를 멸균하는 방법을 이용하면, 봉독 내 존재하는 미생물을 멸균할 수 있으며, 이를 통해서 기존 멸균 공정과 달리 봉독의 유효성분을 변화시키지 않으며, 인체에 안전하고 멸균된 봉독을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 돼지 파보바이러스를 이용한 멸균 여부를 확인하는 공정을 이용하면, 봉독 내에 바이러스가 모두 멸균된 것을 효과적으로 확인하여, 멸균이 검증된 안전한 봉독을 제조할 수 있다.

Description

E-빔을 이용한 봉독 멸균 공정 및 돼지 파보바이러스를 이용한 멸균 공정의 검증{Bee venom sterilization process using E-beam and verification of sterilization process using porcine parvovirus}

본 발명은 E-빔을 봉독에 조사하여, 봉독 내 바이러스를 멸균하고, 멸균 공정에 의한 바이러스의 멸균 여부를 돼지 파보바이러스를 이용하여 검증하는 방법에 관한 것이다.

벌에 의해 생산되는 동물성 원료 중 하나인 봉독은 바이러스, 박테리아, 효모, 곰팡이, 마이코플라스마 및 기생충과 같은 원치않는 잠재적으로 위험한 오염물을 함유할 수 있다. 봉독은 인체에 투여되는 용도로 사용될 수 있는 바, 봉독 내 존재할 수 있는 오염물질의 제거는 매우 중요하다.

종래, 동물성 원료에 대한 멸균 공정으로 알려진 방법으로는 가열, 여과 및 화학적 불활성제 또는 증감제를 생성물에 첨가하는 것 등이 있다. 가열처리는 대략 60℃로 약 70시간동안 생성물을 가열하며, 오염 미생물의 활성의 약 50%까지 파괴시킬 수 있으나, 민감성 생성물에 손상을 일으킬 수 있다. 여과 공정은 물리적으로 오염물을 제거하기 위해 생성물을 여과하는 것이다. 그러나 이 방법은 고분자량을 가지는 봉독의 유효성분을 제거할 수 있으며, 어떤 경우, 크기가 작은 바이러스는 여과에 의해 잔존하는 문제점이 발생할 수 있다. 화학적 멸균 공정은 바이러스의 DNA/RNA에 결합되고, 바이러스가 더 이상 복제할 수 없도록 하는 방식으로 바이러스의 DNA/RNA 백본(backbone)에 화학결합을 깨뜨리는 자유 라디칼(free radicals)을 생산하도록 UV나 이온화 방사선에 의해 활성화되는 유해한 시약을 첨가하는 공정이다. 이러한 공정은 독성을 유발할 수 있으며, 사람에게 투여되었을 때 부작용 문제가 발생할 수 있고, 봉독의 유효 성분의 변형을 일으킬 수 있는 문제점들이 지적되어 왔다. 따라서, 봉독의 유효 성분의 변화를 초래하지 않으며, 의약품으로 사용될 수 있는 봉독의 안전성을 보장할 수 있는 봉독 내 바이러스 멸균 공정이 요구되어 왔다.

한편, 종래 봉독에 오염원이 존재하는지 확인하기 위한 검사 방법으로는 오염이 의심되는 세균, 바이러스, 곰팡이에 대해 해당 오염 미생물을 개별적으로 검출하여 개별적인 미생물에 의한 오염 여부를 각각 확인하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 공정은 예측하지 못한 오염원에 의한 오염을 확인할 수 없다는 문제점이 지적되어 왔으며, 이러한 문제점을 해소된 봉독 내 바이러스의 부존재를 확인할 수 있는 기술이 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 봉독 내 바이러스를 효과적으로 멸균하면서, 유효성분의 변화를 초래하지 않고, 안전한 멸균 공정을 연구하였으며, 멸균 공정에 의해 멸균 되었음을 효과적으로 확인할 수 있는 방법을 연구하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 E-빔을 봉독에 조사하는 단계를 포함하는 봉독 내 바이러스를 멸균하는 방법을 제공하고, E-빔을 봉독에 조사하는 단계 및 돼지 파보바이러스를 이용하여 멸균 여부를 확인하는 단계를 포함하는 봉독 제조방법 및 이에 의한 멸균된 봉독을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 E-빔(electron beam)을 봉독에 조사하는 단계를 포함하는 봉독 내 돼지 파보바이러스를 멸균하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 봉독에 E-빔을 조사하는 단계; 및 (b) 봉독 내 돼지 파보바이러스를 검출하는 단계;를 포함하는 멸균된 봉독을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 E-빔(electron beam)을 봉독에 조사하는 단계;를 포함하는 봉독 내 바이러스를 멸균하는 방법을 이용하면, 봉독 내 존재하는 미생물을 멸균할 수 있으며, 이를 통해서 기존 멸균 공정과 달리 봉독의 유효성분을 변화시키지 않으며, 인체에 안전하고 멸균된 봉독을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 돼지 파보바이러스를 이용한 멸균 여부를 확인하는 공정을 이용하면, 봉독 내에 바이러스가 모두 멸균된 것을 효과적으로 확인하여, 멸균이 검증된 안전한 봉독을 제조할 수 있다.

도 1은 봉독의 제조공정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 봉독 내 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 시료에 E-빔을 조사하여 A형 간염 바이러스가 모두 사멸된 것을 확인한 도이다.
도 3은 봉독 내 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 시료에 E-빔을 조사하여 돼지 파보바이러스가 모두 사멸된 것을 확인한 도이다.

본 발명은 E-빔(electron beam)을 봉독에 조사하는 단계를 포함하는 봉독 내 돼지 파보바이러스를 멸균하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 '봉독'은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액이다.

본 발명의 봉독은 생봉독, 건조봉독, 봉독추출물 또는 정제봉독일 수 있다. 생봉독은 건조 또는 정제과정을 거치지 않은 것으로서 비중이 1.1 내지 1.3이고, 산도(pH)가 5.2 내지 5.5 범위이며, 70~80중량%는 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 것일 수 있다. 봉독 추출물은 당 업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 이러한 저급알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜을 추출용매로 하여 얻은 것일 수 있다. 정제봉독은 상술한 추출용매에 의한 추출물 이외에 통상적인 정제 과정을 거쳐 얻거나, 여과 막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리, 정제방법에 의하여 정제된 봉독일 수 있다.

본 발명의 봉독은 생체의 증체율, 면역기능 및 통증치료 기능 향상 등을 위하여 개체에 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, '멸균'은 생물학적 오염물 또는 미생물의 감소일 수 있으며, 바람직하게는 레트로바이러스(retroviruses), 허피스 바이러스(herpes viruses), 파라믹소바이러스(paramyxoviruses), 시토메갈로바이러스 (cytomegaloviruses), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스(hepatitis viruses), 폭스 바이러스(pox viruses), 토가 바이러스(toga viruses), 엡스타인 바 바이러스(Ebstein-Barr virus) 및 파보바이러스(parvoviruses)와 같은 바이러스; 에스케리키아(Escherichia), 간균(Bacillus), 캄필로박터(Campylobacter), 포도구균(Streptococcus) 및 스텝파로코쿠스 (Staphalococcus) 등의 박테리아; 트리파노소마(Trypanosoma)와 같은 기생충; 말라리아원충 종(Plasmodium species)을 포함하는 말라리아 기생충; 효모; 곰팡이; 마이코플라스마; 및 프리온(prion)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 오염물의 감소일 수 있고, 더욱 바람직하게는 소 허피스 바이러스, A형 간염 바이러스 및 돼지 파보바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 바이러스의 감소일 수 있다.

본 발명에 있어서 '멸균하는 방법'은 봉독의 멸균을 위한 임의의 유효 방사선을 이용한 방법일 수 있다. 바람직하게 방사선은 E-빔 방사선을 포함하는 소립자일 수 있다.

본 발명의 'E-빔(electron beam)'은 20 내지 100kGy의 조사량으로 조사되는 E-빔일 수 있으며, 바람직하게는 25 내지 50kGy의 조사량으로 조사되는 E-빔일 수 있다. 상기 E-빔이 20kGy 이하의 조사량으로 조사되는 경우, 봉독 내 바이러스가 멸균되지 않을 수 있으며, 100kGy 이상의 조사량으로 조사되는 경우, 고출력에 의한 봉독 색상의 변질 우려가 있다.

본 발명의 'E-빔'은 봉독 내 유효성분의 변화를 유발하지 않으며, 바람직하게는 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin), 비만세포 과립감소 펩티드(MCD-Peptide, Mast Cell Degranulation Peptide, Op), 단백효소 억제제(Protease Inhibitor), 세카르핀(Secarpin), 터치아핀(Tertiapin), 프로카민(Procamine)의 변화를 유발하지 않고, 더욱 바람직하게는 멜리틴의 변화를 유발하지 않는다.

본 발명의 '봉독 내 돼지 파보바이러스를 멸균하는 방법'에 의하면, 봉독의 유효성분을 변화시키지 않으면서 봉독 내 존재하는 미생물을 멸균할 수 있다.

본 발명의 상기 (a) 단계의 E-빔은 20 내지 100kGy의 조사량으로 조사되는 E-빔일 수 있으며, 바람직하게는 25 내지 50kGy의 조사량으로 조사되는 E-빔일 수 있다. 상기 E-빔이 20kGy 이하의 조사량으로 조사되는 경우, 봉독 내 바이러스가 멸균되지 않을 수 있으며, 100kGy 이상의 조사량으로 조사되는 경우, 고출력에 의한 봉독 색상의 변질 우려가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 검출은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), Gap-LCR(Gap-ligase chain reaction), 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄반응(CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄반응 (AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(LAMP), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR), 이중 중합효소 연쇄반응(nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응(single tube nested-PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 역 중합효소 연쇄반응(inverse PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사(RQ-PCR), 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)방법 및 겔 전기영동을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 멸균된 봉독을 제조하는 방법은 상기 (a) 단계 이전에, 봉독에 상기 (b) 단계의 돼지 파보바이러스를 스파이킹하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 (b) 단계의 돼지 파보바이러스를 스파이킹하는 단계를 더 포함하여 실시하면, 상기 (b) 단계에서 스파이킹한 돼지 파보바이러스를 검출하여 돼지 파보바이러스가 검출되지 않는 경우, 상기 (a) 단계에 의해 봉독 내 바이러스가 멸균된 것으로 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 모델 바이러스는 미지의 또는 동정되지 않은 바이러스의 멸균을 보장할 수 있는 바이러스로써, 봉독에 오염 가능성이 있는 바이러스 그 자체 또는 이와 가장 유사한 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 소 허피스 바이러스, A형 간염 바이러스 및 돼지 파보바이러스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 바이러스일 수 있다.

본 발명의 '멸균된 봉독을 제조하는 방법'에 의하면, 봉독 내 유효성분의 변화 없이 봉독 내 바이러스가 멸균된 것으로 검증된 봉독을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 멸균된 봉독을 제조하는 방법에 의해 제조된 멸균된 봉독을 제공한다.

본 발명의 상기 멸균된 봉독은 봉독 내 바이러스가 멸균된 것으로 검증된 봉독이며, 멸균 공정 후에도 봉독의 유효성분이 변화없이 유지되는 것을 특징으로 한다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

실시예 1. 바이러스 멸균 효과를 검증하기 위한 모델 바이러스의 선정 및 배양

1.1 바이러스 멸균 효과를 검증하기 위한 모델 바이러스의 선정

봉독 내 바이러스 멸균 공정의 바이러스 멸균 효과를 검증하기 위한 모델바이러스를 선별하기 위해 다음과 같은 기준을 고려하였다.

(i) 봉독 내 바이러스 오염 여부의 검증을 위해 사용할 바이러스는 봉독에 오염 가능성이 있는 바이러스 그 자체 또는 이와 가장 유사한 바이러스여야 한다. 또한 다양한 물리 화학적 성질의 바이러스를 선택함으로써, 검증하고자 하는 바이러스 멸균 공정이 일반적으로 모든 종류의 바이러스를 멸균할 수 있다는 것을 나타낼 수 있어야 한다.

(ii) 선택된 바이러스는 되도록이면 물리 화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정 되지 않은 바이러스의 멸균 여부를 보장할 수 있어야 한다.

(iii) 바이러스는 되도록 쉽게 분석 가능하며 고농도로 배양할 수 있어야 함

(iv) 선택된 바이러스는 검증하는 실험 기간 동안 실험자에게 감염의 위험이 적어야 한다.

이러한 사항을 고려하였을 때, 소 허피스 바이러스(bovine herpes virus, BHV), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 및 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus, PPV)가 봉독 내 바이러스를 검증할 모델 바이러스로서 가장 적합하여, 봉독 내 바이러스 멸균 여부를 확인할 모델바이러스로 선정하였다.

1.2 소 허피스 바이러스의 배양

MDBK NBL-1 (ATCC CCL-22) 세포를 세포 배양 배지(10% 우태아 혈청 및 L-글루타민이 포함된 DMEM 배지)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단일층 MDBK NBL-1 (ATCC CCL-22) 세포에 소 허피스 바이러스(ATCC VR-188)를 감염시킨 후, 바이러스 배양 배지(2% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지)를 넣어주고 35℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하면서 주기적으로 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 세포변성효과가 명백하게 관찰될 때 배양액과 세포 잔해물(cell debris)을 수거한 다음 동결과 해빙과정을 3번 거쳐 세포를 파쇄하고 원심분리로 세포 잔해물을 제거하였다. 원심 상층액을 0.45μm filter로 여과한 후 소분하여 -70℃에 보관하였다.

1.3 A형 간염 바이러스의 배양

FRhK-4 (ATCC CRL-1688) 세포를 세포 배양 배지(10% 우태아 혈청 및 L-글루타민이 포함된 DMEM 배지)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단일층 FRhK-4 (ATCC CRL-1688) 세포에 A형 간염 바이러스(ATCC VR-1402)를 감염시킨 후, 바이러스 배양 배지(2% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지)를 넣어주고 35℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하면서 주기적으로 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 세포변성효과가 명백하게 관찰될 때 배양액과 세포 잔해물(cell debris)을 수거한 다음 동결과 해빙과정을 3번 거쳐 세포를 파쇄하고 원심분리로 세포 잔해물을 제거하였다. 원심 상층액을 0.45μm filter로 여과한 후 소분하여 -70℃에 보관하였다.

1.4 돼지 파보바이러스의 배양

MPK (ATCC CCL-166) 세포를 세포 배양 배지(10% 우태아 혈청 및 L-글루타민이 포함된 DMEM 배지)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단일층 MPK (ATCC CCL-166) 세포에 돼지 파보 바이러스(ATCC VR-742)를 감염시킨 후, 바이러스 배양 배지(2% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지)를 넣어주고 35℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하면서 주기적으로 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 세포변성효과가 명백하게 관찰될 때 배양액과 세포 잔해물(cell debris)을 수거한 다음 동결과 해빙과정을 3번 거쳐 세포를 파쇄하고 원심분리로 세포 잔해물을 제거하였다. 원심 상층액을 0.45μm filter로 여과한 후 소분하여 -70℃에 보관하였다.

실시예 2. 봉독 내 바이러스 불활화 공정을 위한 E-빔 조사량의 결정

2.1 봉독 내 소 허피스 바이러스를 스파이킹한 시료에 대한 E-빔 조사량에 따른 멸균 효과의 확인

봉독 제조 공정 중 E-빔 조사 공정은 동결건조 시킨 봉독 가루에 25 kGy의 E-beam을 조사하는 멸균 공정으로 감염성 위해 인자를 불활화 시키는 최종 공정이다. E-빔은 thermal사의 E-빔을 준비하였으며, 봉독은 국내 시판중인 정제 봉독을 구매하여 사용하였다. E-빔 조사 공정에서 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위한 E-빔 조사 공정의 축소 규모공정을 설계하였다. 봉독 상기 축소 규모 공정에서 바이러스 불활화를 나타낼 수 있는 최적의 E-빔 조사량을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 대조군으로 아무 처리도 하지 않은 정제 봉독 시료와 실시예 1.2에서 배양한 소 허피스 바이러스를 준비하였다. 실험군으로 실시예 1.2에서 배양한 모델 바이러스인 소 허피스 바이러스를 1 x 10⁷cfu/ml의 농도로 스파이킹(spiking)한 정제 봉독을 동결 건조한 시료를 준비하였고, 상기 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독을 동결 건조하고 1kGy, 5kGy, 10kGy, 25kGy의 조사량의 E-빔을 이용하여 멸균 공정을 거친 시료를 각각 준비하였다. 시료 내 소 허피스 바이러스의 존재는 Bovine herpesvirus 1 putative fibronectin binding protein genesig® Advanced Kit(Primerdesign T M Ltd)를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 확인하였다. 상기 설계한 축소 규모 공정에서의 축소 비율을 표 1에 나타내었으며, 각 실험군과 대조군의 소 허피스 바이러스 검출 여부에 대한 결과를 표 2에 나타내었다.

lane	처리 조건	소 허피스 바이러스 검출여부
1	소 허피스 바이러스 시료	검출
2	E-빔 멸균 공정을 거치지 않은 소 허피스 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
3	1kGy E-빔 멸균 공정을 거친 소 허피스 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
4	5kGy E-빔 멸균 공정을 거친 소 허피스 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 독 동결 건조 시료	검출
5	10kGy E-빔 멸균 공정을 거친 소 허피스 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
6	25kGy E-빔 멸균 공정을 거친 소 허피스 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	불검출
7	미처리 정제 봉독 동결 건조 시료	불검출

2.2 봉독 내 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 시료에 대한 E-빔 조사량에 따른 멸균 효과의 확인

상기 축소 규모 공정에서 바이러스 불활화를 나타낼 수 있는 최적의 E-빔 조사량을 확인하기 위해 추가적으로 A형 간염 바이러스를 대상으로 한 실험을 수행하였다. 대조군으로 아무 처리도 하지 않은 정제 봉독 시료와 실시예 1.3에서 배양한 A형 간염 바이러스를 준비하였다. 실험군으로 실시예 1.3에서 배양한 모델 바이러스인 A형 간염 바이러스를 1 x 10⁷cfu/ml의 농도로 스파이킹(spiking)한 정제 봉독을 동결 건조한 시료를 준비하였고, 상기 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독을 동결 건조하고 1kGy, 5kGy, 10kGy, 25kGy의 조사량의 E-빔을 이용하여 멸균 공정을 거친 시료를 각각 준비하였다. 시료 내 A형 간염 바이러스의 검출을 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

RNA 분리를 위해 무처리 정제 봉독 시료 1g, E-빔 멸균 공정을 거치지 않은 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료 0.5mg, E-빔 멸균 공정을 거친 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료 0.5mg를 각각 5mL, 1mL, 1mL의 TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)에 넣고 균질화하여 15분 이상 상온에 반응시킨 후 상등액 800μL에 클로로포름(Sigma-aldrich, MI, USA) 200μL를 혼합하여 상온에서 5분간 반응시켜 원심분리(12000 g, 15분, 4℃)하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 500μL의 이소프로파놀(Sigma-aldrich)과 상온에서 10분간 반응시켜 RNA를 침전시킨 뒤 원심분리(12000 g, 10분, 4℃)하였으며, 상등액 제거 후 80% 에탄올을 이용하여 워싱하였고 원심분리(12000 g, 5분, 4℃)한 침전물(pellet)을 DEPC treated water(WelGENE, 한국)에 녹여 약 1μg/μL의 농도로 하여 실험에 사용하였다. AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, 한국)를 사용하여 분리한 RNA의 1μg을 cDNA로 합성한 후, Bioneer사(한국)의 AccuPower PCR Premix를 이용하여 20μL 반응에서 cDNA 2μL와 10 pmole의 프라이머가 첨가되도록 RT-PCR(TP3300, Takara, Japan)을 진행하여 A형 간염 바이러스의 RNA를 검출하였다. 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 뒤, 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분씩 40 cycle 수행하였고 72℃에서 5분간 처리하여 증폭시켰다. 증폭산물은 0.5 × TAE 용액을 이용한 1.2% Agarose gel에 100V로 전기영동 하였으며 Safe-Pinky DNA Gel Staining solution(GenDEPOT)를 사용하여 발현을 확인하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머 세트를 표 3에 나타내었고, 검출 결과를 도 2 및 표 4에 나타내었다.

lane	처리 조건	A형 간염 바이러스 검출여부
1	A형 간염 바이러스 시료	검출
2	E-빔 멸균 공정을 거치지 않은 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
3	1kGy E-빔 멸균 공정을 거친 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
4	5kGy E-빔 멸균 공정을 거친 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
5	10kGy E-빔 멸균 공정을 거친 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
6	25kGy E-빔 멸균 공정을 거친 A형 간염 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	불검출
7	미처리 정제 봉독 동결 건조 시료	불검출

2.3 봉독 내 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 시료에 대한 E-빔 조사량에 따른 멸균 효과의 확인

상기 축소 규모 공정에서 바이러스 불활화를 나타낼 수 있는 최적의 E-빔 조사량을 확인하기 위해 추가적으로 돼지 파보바이러스를 대상으로 한 실험을 수행하였다. 대조군으로 아무 처리도 하지 않은 정제 봉독 시료와 실시예 1.4에서 배양한 돼지 파보바이러스를 준비하였다. 실험군으로 실시예 1.4에서 배양한 모델 바이러스인 돼지 파보바이러스를 1 x 10⁷cfu/ml의 농도로 스파이킹(spiking)한 정제 봉독을 동결 건조한 시료를 준비하였고, 상기 바이러스를 스파이킹한 정제 봉독을 동결 건조하고 1kGy, 5kGy, 10kGy, 25kGy의 조사량의 E-빔을 이용하여 멸균 공정을 거친 시료를 각각 준비하였다. 시료 내 돼지 파보바이러스의 검출을 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

RNA 분리를 위해 무처리 정제 봉독 시료 1g, E-빔 멸균 공정을 거치지 않은 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료 0.5mg, E-빔 멸균 공정을 거친 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료 0.5mg 를 각각 5mL, 1mL, 1mL의 TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)에 넣고 균질화하여 15분 이상 상온에 반응시킨 후 상등액 800μL에 클로로포름(Sigma-aldrich, MI, USA) 200μL를 혼합하여 상온에서 5분간 반응시켜 원심분리(12000 g, 15분, 4℃)하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 500μL의 이소프로파놀(Sigma-aldrich)과 상온에서 10분간 반응시켜 RNA를 침전시킨 뒤 원심분리(12000 g, 10분, 4℃)하였으며, 상등액 제거 후 80% 에탄올을 이용하여 워싱하였고 원심분리(12000 g, 5분, 4℃) 한 침전물(pellet)을 DEPC treated water(WelGENE, 한국)에 녹여 약 1μg/μL의 농도로 하여 실험에 사용하였다. AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, 한국)를 사용하여 분리한 RNA의 1μg을 cDNA로 합성한 후, Bioneer사(한국)의 AccuPower PCR Premix를 이용하여 20μL 반응에서 cDNA 2μL와 10 pmole의 프라이머가 첨가되도록 RT-PCR(TP3300, Takara, Japan)을 진행하였다. 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 뒤, 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분씩 40 cycle 수행하였고 72℃에서 5분간 처리하여 증폭시켰다. 증폭산물은 0.5 × TAE 용액을 이용한 1.2% Agarose gel에 100 V로 전기영동 하였으며 Safe-Pinky DNA Gel Staining solution(GenDEPOT)를 사용하여 돼지 파보바이러스의 검출을 확인하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머 세트를 표 5에 나타내었고, 검출 결과를 도 3 및 표 6에 나타내었다.

Lane	처리 조건	돼지 파보바이러스 검출여부
1	돼지 파보바이러스 시료	검출
2	E-빔 멸균 공정을 거치지 않은 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
3	1kGy E-빔 멸균 공정을 거친 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
4	5kGy E-빔 멸균 공정을 거친 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
5	10kGy E-빔 멸균 공정을 거친 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	검출
6	25kGy E-빔 멸균 공정을 거친 돼지 파보바이러스를 스파이킹한 정제 봉독 동결 건조 시료	불검출
7	미처리 정제 봉독 동결 건조 시료	불검출

표 2, 표 4, 표 6에 나타난 바와 같이, 25kGy의 조사량으로 E-빔 멸균 공정을 진행한 정제 봉독에서 스파이킹한 소 허피스 바이러스, A형 간염 바이러스 또는 돼지 파보바이러스가 모두 검출되지 않는 것을 확인하였다.

따라서, 봉독에 E-빔 멸균 공정을 거치면 소 허피스 바이러스, A형 간염 바이러스 및 돼지 파보바이러스로 대표되는 봉독에 오염 가능한 바이러스들이 모두 멸균되는 효과를 확인하였다.

실시예 3. 봉독 내 바이러스 불활화 공정에 따른 봉독 내 멜리틴 함량 변화

본 발명의 멸균 공정은 다른 바이러스 불활화 공정과 달리 봉독 내 주요 유효성분의 변성을 일으키지 않으며, 이를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 주요 유효성분으로는 멜리틴을 선정하였으며, 비교를 위한 바이러스 불활화 공정으로 고압 멸균 방법과 알코올에 의한 멸균 방법을 선정하였다.

3.1 고압 멸균 공정에 의한 봉독 내 멜리틴 함량 변화의 측정

대조군으로 멸균 공정을 거치지 않은 국내 시판 중인 정제 봉독을 무처리하여 준비하였다. 실험군으로 정제 봉독을 100% 증류수에 녹여 1mg/mL로 만든 후 멸균기를 이용하여 121℃에서 5분, 10분, 15분, 20분간 가열한 시료를 각각 실험군으로 설정하였다. 각각 실험군에 대한 멜리틴 함량 분석은 Waters(Minneapolis, MN, USA)사의 diode array detector가 장착된 UPLC I class 모델을 사용하여 측정하였으며, 컬럼은 Advanced Material Technology(Wilmington, DE, USA)사의 Halo ES-C18(2.1×100 mm, 2.7 μm,)을 사용하였다. UPLC 분석조건은 유속 0.8 mL/min, 주입량 2μL, 검출파장 220nm, 컬럼온도 50℃이었으며, 이동상은 (A) 20mM TFA/MeCN, (B)20mM TFA/H2O의 용매를 사용하여 (A)10-31%; 0-3분, (A)31-40%; 3-5분, (A)40-45%; 5-10분으로 설정하였다. 각 실험군 및 대조군의 멜리틴 함량을 측정한 표를 표 7에 나타내었다.

처리 조건	멜리틴 함량 (%(w/w))
무처리 정제 봉독 시료	64.1
121℃에서 5분 멸균한 정제 봉독 시료	51.8
121℃에서 10분 멸균한 정제 봉독 시료	51.0
121℃에서 15분 멸균한 정제 봉독 시료	50.7
121℃에서 20분 멸균한 정제 봉독 시료	46.0

표 7에 나타난 바와 같이, 고압 멸균 공정으로 정제 봉독 시료를 멸균하는 경우, 봉독의 주요 유효성분인 멜리틴의 함량이 고압 멸균 공정을 5분만 거쳐도 12% 이상 크게 감소하는 것을 확인하였다.

3.2 알코올 멸균 공정에 의한 봉독 내 멜리틴 함량 변화의 측정

정제 봉독 시료를 100% 증류수, 20% 에탄올, 40% 에탄올, 60% 에탄올, 80% 에탄올, 100% 에탄올에 각각 넣어 1 mg/mL로 만들고 1분간 vortex한 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 대조군 및 실험군으로 설정하였으며, 멜리틴 함량 분석을 실시예 3.1과 동일하게 실시하였다. 각 대조군 및 실험군의 멜리틴 함량을 표 8에 나타내었다.

처리 조건	멜리틴 함량 (%(w/w))
100% 증류수 처리 정제 봉독 시료	60.7
20% 에탄올 처리 정제 봉독 시료	63.7
40% 에탄올 처리 정제 봉독 시료	61.8
60% 에탄올 처리 정제 봉독 시료	57.4
80% 에탄올 처리 정제 봉독 시료	3.1
100% 에탄올 처리 정제 봉독 시료	0

표 8에 나타난 바와 같이, 20% 내지 40%의 알코올 멸균 공정을 거치는 경우, 멜리틴 함량이 미량 상승하는 것으로 나타났으나, 이는 봉독 내 다른 성분이 용출되어 상대적으로 멜리틴이 상승한 것을 의미하며, 알코올 멸균과정은 봉독의 성분을 변화시킴을 보여주는 결과이다. 또한, 60% 이상의 알코올 멸균 공정으로 멸균하는 경우, 봉독의 주요 유효성분인 멜리틴의 함량이 감소하는 것을 확인하였다.

3.3 E-빔 멸균 공정에 의한 봉독 내 멜리틴 함량 변화의 측정

25kGy E-빔 멸균 공정을 거친 정제 봉독 시료와 무처리 정제 봉독 시료를 준비하여, 각각의 멜리틴 함량을 실시예 3.1과 동일한 방법으로 측정하여 비교하였다. 각 시료의 멜리틴 함량 측정치를 표 9에 나타내었다.

처리 조건	멜리틴 함량 (%(w/w))
무처리 정제 봉독 시료	62.1
25kGy E-빔 멸균 공정을 거친 정제 봉독 시료	62.2

표 9에 나타난 바와 같이, 25kGy E-빔 멸균 공정으로 멸균하는 경우, 봉독의 주요 유효성분인 멜리틴의 함량이 멸균 전, 후 일정한 것을 확인하였다. 따라서, 알코올 멸균 공정 또는 고압 멸균 공정에 비해 E-빔을 이용한 멸균 공정은 봉독의 유효성분 함량 변화를 유발하지 않음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 봉독을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아니고 단지 이를 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

본 발명의 봉독 추출물 100 ㎎

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

본 발명의 봉독 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

본 발명의 봉독 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4. 환의 제조

본 발명의 봉독 추출물 100 ㎎

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

제제예 5. 과립의 제조

본 발명의 봉독 추출물 100 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

Claims

25 kGy 조사량의 E-빔(electron beam)을 봉독에 조사하는 단계;를 포함하며, 봉독 내 멜리틴의 변화를 유발하지 않고 돼지 파보바이러스를 멸균하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 봉독은 생봉독, 건조봉독, 봉독추출물 또는 정제봉독인 것을 특징으로 하는, 봉독 내 멜리틴의 변화를 유발하지 않고 돼지 파보 바이러스를 멸균하는 방법.
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(a) 봉독에 25kGy 조사량의 E-빔을 조사하는 단계; 및
(b) 봉독 내 돼지 파보바이러스를 검출하는 단계;를 포함하는, 멜리틴의 변화가 유발되지 않은 돼지 파보바이러스가 멸균된 봉독을 제조하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 봉독에 돼지 파보바이러스를 스파이킹하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멜리틴의 변화가 유발되지 않은 돼지 파보바이러스가 멸균된 봉독을 제조하는 방법.
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