KR102507609B1

KR102507609B1 - CPTH2, TAK-242 및 GCN5의 siRNA를 이용한 염증성 질환의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102507609B1
Application number: KR1020200154969A
Authority: KR
Inventors: 최동국; 조덕연; 김인수
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2023-03-09
Also published as: KR20210060362A

Abstract

본 발명은 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, GCN5 단백질의 siRNA를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]

[화학식 2]

Description

CPTH2, TAK-242 및 GCN5의 siRNA를 이용한 염증성 질환의 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES USING CPTH2, TAK-242 AND GCN5 siRNA}

본 발명은 GCN5 억제제를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TK242, CPTH2화합물 또는 GCN5 단백질의 siRNA를 포함하여 뇌 신경 질환에 특이적인 치료 조성물을 제공한다.

신경소교세포 (microglial)는 중추신경계 (CNS)와 뇌에 존재하며 일차적인 신경세포들의 보호 및 회복에 관여한다. 하지만 활성화된 신경소교세포는 신경염증반응을 유도하고, 신경염증반응이 다양한 신경변성질환의 원인으로 이끈다는 많은 연구가 보고되고 있다. 활성화된 신경소교세포는 아질산염 (NO), 활성산소종 (ROS), 염증효소인 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 그리고 전염증성 사이토카인인 IL-1b, IL-6, TNF-a 등의 활성을 유도한다 (Graeberand Streit, 2010).

이러한 물질들은 패혈증, 염증성대장질환, 뇌염, 아토피 등과 같은 염증성 질환에 관여하고, 다발성경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병과 같은 신경퇴행성질환의 병리기전에 관여한다는 것이 보고되어 있다 (Kim and Joh, 2006; Koning et al., 2007; Krause and Muller, 2010; Moller,2010). 그러므로 이러한 신경염증의 조절이 신경퇴행성질환의 예방에 중요한 역할을 할 수 있으며, 염증성 질환 예방에도 중요하다.

한편, GCN5는 히스톤 아세틸전달효소(Histone acetyltransferase, HAT)로 주로 전사 활성인자로 작용한다. GCN5는 또한 HAT-비의존 방식으로 NF-kappa-B 서브유닛 RELA의 유비퀴틴화를 촉진함으로써 NF-kappa-B의 리프레서(repressor)로 작용한다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 염증성 질환 및 신경퇴행성질환을 진단할 수 있는 신규 바이오마커를 탐색하던 중 리포폴리사카라이드 (LPS)로 자극된 BV-2 신경소교세포에서 GCN5가 억제되면 신경염증 매개인자들의 유전자 발현이 감소되는 것을 확인하고 BV-2 신경소교세포에서 LPS에 의한 GCN5의 변화 양상을 분석하였고, 이를 통해 신경퇴행성질환을 진단할 수 있는 신규 바이오마커로서 GCN5의 가능성을 확인하였다.

그러나 GCN5의 억제제에 관한 연구는 미흡한 실정인바, GCN5 억제제를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환, 신경염증질환 및 신경퇴행성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및/또는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 대한 연구가 요구된다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 한계와 문제점을 극복하기 위하여 개발된 것으로서, 구체적으로 GCN5를 이용하여 염증성 질환을 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 GCN5 단백질의 siRNA을 이용하여 GCN5를 억제하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 GCN5 단백질의 siRNA을 이용하여 GCN5를 억제하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1] CPTH2

[화학식 2] TAK-242

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 GCN5 단백질을 포함하는 염증성 질환 진단용 바이오마커 및 상기 바이오마커 또는 이를 암호화하는 유전자의 핵산서열에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 염증성 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, GCN5 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 염증성 질환 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 염증성 질환 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 염증성 질환 진단 또는 예후 예측용 키트을 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 GCN5 단백질의 siRNA(small interfering RNA)를 포함하는 염증성 질환, 신경퇴행성질환의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능 식품 조성물은 GCN5 단백질의 티로신 잔기를 인산화를 억제하여 염증을 완화시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GCN5 단백질을 포함하는 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계, (b) 상기 (a) 단계의 바이오 마커 발현수준을 정상 대조군의 발현수준과 비교하여 정상 대조군의 발현수준보다 높은 경우 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자로 진단하는 단계 및 (c) 상기 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물을 각각 처리하여 GCN5의 유전자 발현 저해도가 높은 조성물을 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명에 있어서 신경퇴행성질환은, 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병 (parkinson's disease), 알츠하이머병 (alzheimer's disease), 루게릭병 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매 (fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증 (cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 염증성 질환은 패혈증, 염증성대장질환, 뇌 신경 염증, 아토피 피부염을 포함하며, 바람직하게는 뇌 신경 염증에 의한 것을 의미한다. 상기 뇌 신경 염증은, 해마(Hippocampus), 선조체(striatum) 또는 흑질 치밀층(substantia nigra compacta)의 뇌 조직에서 발생한 염증을 포함한다.

본 발명에 의하면 GCN5를 포함하는 바이오마커 이용하여 염증성 질환을 진단할 수 있다.

또한, GCN5를 포함하는 바이오 마커를 이용한 진단용 키트로 염증성 질환을 간단히 진단할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물인 CPTH2 또는 화학식 2로 표시되는 화합물인 TAK-242 및 GCN5의 siRNA를 유효성분으로 포함하는바, GCN5 또는 TLR4 receptor의 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 GCN5 또는 TLR4 receptor를 억제하여 신경퇴행성질환을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하여 염증성 질환의 치료 효과를 높일 수 있는 이점이 있다.

도 1은 LPS로 자극된 마우스 BV-2 신경소교세포에서 CPTH-2가 세포생존율에 미치는 영향 및 산화질소 (NO) 방출량의 감소 효능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 LPS로 자극된 마우스 BV-2 신경소교세포에서 CPTH2 농도에 따른 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 억제 효능을 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 확인한 것이다.
도 3은 LPS로 자극된 마우스 BV-2 신경소교세포에서 신경염증 자극에 의한 GCN5와 RelA의 상호결합을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 4는 LPS로 자극된 마우스의 뇌 조직에서 iNOS의 단백질 발현양상과 NF-kappaB pathway 관련 단백질 발현양상 그리고 GCN5의 단백질 발현양상을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 5는 자극된 마우스의 뇌 조직에서 TAK-242에 의한 iNOS와 GCN5의 유전자 발현이 저해되는 효능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 LPS를 처리한 C57BL/6 마우스에서 조직별 GCN5 mRNA 발현량을 나타낸 이미지이다.
도 7은 LPS를 처리한 C57BL/6 마우스에서 신경염증에 의한 뇌조직 부위별 GCN5와 iNOS mRNA 발현량 변화 확인한 이미지이다.
도 8은 신경교세포 (microglia)와 성상교세포 (astrocyte)에서 신경염증에 의한 GCN5 및 전염증성매개인자 (iNOS, TNF-a 그리고 IL-6) mRNA 발현량 변화를 비교한 이미지이다.
도 9는 신경교세포 (microglia)와 성상교세포 (astrocyte)에서 신경염증에 의한 GCN5 및 ac-p65, p-p65 단백질 발현량 변화를 비교한 이미지이다.
도 10은 GCN5를 과발현시킨 BV-2 신경교세포에서의 p65의 인산화와 아세틸화의 변화 확인한 이미지이다.
도 11은 GCN5를 과발현시킨 BV-2 신경교세포에서의 염증성 매개인자 발현의 변화를 나타낸 이미지이다.
도 12는 GCN5를 과발현시킨 HEK293(TLR4)세포에서의 p65의 인산화와 아세틸화의 변화를 확인한 이미지이다.
도 13은 GCN5의 발현이 억제된 HEK293(TLR4)세포에서의 p65의 인산화와 아세틸화의 변화를 확인한 이미지이다.
도 14는 GCN5를 과발현시킨 HEK293(TLR4)세포의 염증성 매개인자 발현 결과를 비교한 이미지이다.
도 15는 GCN5의 발현을 억제시킨 HEK293(TLR4)세포의 염증성 매개인자 발현 결과를 나타낸 이미지이다.
도 16은 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 GCN5의 PTM 변화를 확인한 이미지이다.

본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 본 명세서에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는, 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.

본 명세서에서, “GCN5”란, General control non-derepressible 5를 의미한다. 본 발명의 GCN5는, 하기 서열번호 1의 유전자 서열 또는 이의 일부 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 GCN5는, NCBI Accession No. NP_066564.2를 의미할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용된 GCN5 과발현 벡터는 다음과 같다.

GCN5 Lentiviral vector (human, BC032743) (CMV)(pLenti-GIII-CMV-C-term-HA)　: ABMGOOD, CAT. NO 2529406

GCN5 Lentivral vector (Moues, NM020004) (CMV)(pLenti-GIII-CMV-C-term-HA)　; ABMGOOD, CAT. NO 2529406

본 명세서에서 “GCN5의 siRNA”란, 상기 GCN5의 유전자 서열 또는 이의 일부 서열과 상보적인 유전자 서열을 갖는 RNA를 의미하며, 이는 통상적인 의미의 small interfering RNA이다. 본 발명에 따른 GCN5의 siRNA는, 서열번호 3 내지 6의 유전자 서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자 서열 정보

서열번호	유전자 서열/ 아미노산 서열
서열번호 1 (Homo sapiens K(lysine) acetyltransferase 2A, mRNA (cDNA clone MGC:45022 IMAGE:5575574), complete CDs (BC032743) 3100 bp 중 2514)	MAEPSQAPTPAPAAQPRPLQSPAPAPTPTPAPSPASAPIPTPTPAPAPAPAAAPAGSTGTGGPGVGSGGAGSGGDPARPGLSQQQRASQRKAQVRGLPRAKKLEKLGVFSACKANETCKCNGWKNPKPPTAPRMDLQQPAANLSELCRSCEHPLADHVSHLENVSEDEINRLLGMVVDVENLFMSVHKEEDTDTKQVYFYLFKLLRKCILQMTRPVVEGSLGSPPFEKPNIEQGVLNFVQYKFSHLAPRERQTMFELSKMFLLCLNYWKLETPAQFRQRSQAEDVATYKVNYTRWLCYCHVPQSCDSLPRYETTHVFGRSLLRSIFTVTRRQLLEKFRVEKDKLVPEKRTLILTHFPKFLSMLEEEIYGANSPIWESGFTMPPSEGTQLVPRPASVSAAVVPSTPIFSPSMGGGSNSSLSLDSAGAEPMPGEKRTLPENLTLEDAKRLRVMGDIPMELVNEVMLTITDPAAMLGPETSLLSANAARDETARLEERRGIIEFHVIGNSLTPKANRRVLLWLVGLQNVFSHQLPRMPKEYIARLVFDPKHKTLALIKDGRVIGGICFRMFPTQGFTEIVFCAVTSNEQVKGYGTHLMNHLKEYHIKHNILYFLTYADEYAIGYFKKQGFSKDIKVPKSRYLGYIKDYEGATLMECELNPRIPYTELSHIIKKQKEIIKKLIERKQAQIRKVYPGLSCFKEGVRQIPVESVPGIRETGWKPLGKEKGKELKDPDQLYTTLKNLLAQIKSHPSAWPFMEPVKKSEAPDYYEVIRFPIDLKTMTERLRSRYYVTRKLFVADLQRVIANCREYNPPDSEYCRCASALEKFFYFKLKEGGLIDK
서열번호 2 (Mus musculus K(lysine) acetyltransferase 2A (Kat2a), transcript variant 1, mRNA (NM_020004) 3048 bp 중 2493)	MAEPSQAPNPVPAAQPRPLHSPAPAPTSTPAPSPASASTPAPTPAPAPAPAAAPAGSTGSGGAGVGSGGDPARPGLSQQQRASQRKAQVRGLPRAKKLEKLGVFSACKANETCKCNGWKNPKPPTAPRMDLQQPAANLSELCRSCEHPLADHVSHLENVSEDEINRLLGMVVDVENLFMSVHKEEDTDTKQVYFYLFKLLRKCILQMTRPVVEGSLGSPPFEKPNIEQGVLNFVQYKFSHLAPRERQTMFELSKMFLLCLNYWKLETPAQFRQRSQSEDVATYKVNYTRWLCYCHVPQSCDSLPRYETTHVFGRSLLRSIFTVTRRQLLEKFRVEKDKLVPEKRTLILTHFPKFLSMLEEEIYGANSPIWESGFTMPPSEGTQLVPRPATVSATVVPSFSPSMGGGSNSSLSLDSAGTEPMPAGEKRKLPENLTLEDAKRLRVMGDIPMELVNEVMLTITDPAAMLGPETSLLSANAARDETARLEERRGIIEFHVIGNSLTPKANRRVLLWLVGLQNVFSHQLPRMPKEYIARLVFDPKHKTLALIKDGRVIGGICFRMFPTQGFTEIVFCAVTSNEQVKGYGTHLMNHLKEYHIKHSILYFLTYADEYAIGYFKKQGFSKDIKVPKSRYLGYIKDYEGATLMECELNPRIPYTELSHIIKKQKEIIKKLIERKQAQIRKVYPGLSCFKEGVRQIPVESVPGIRETGWKPLGKEKGKELKDPDQLYTTLKNLLAQIKSHPSAWPFMEPVKKSEAPDYYEVIRFPIDLKTMTERLRSRYYVTRKLFVADLQRVIANCREYNPPDSEYCRCASALEKFFYFKLKEGGLIDK
서열번호 3 (ON-TARGETplus Human KAT2A (2648) siRNA - SMARTpool siRNA : Dharmacon, L-009722-02-0010: J-009722-17　)	UCCUGUUUAACCACGGGCU (Target sequence : GUUCCUGGCAUUCGAGAGA)
서열번호 4 (ON-TARGETplus Human KAT2A (2648) siRNA - SMARTpool siRNA : Dharmacon, L-009722-02-0010: J-009722-18)	CAAGGACCGUAAGCUCUCU (Target sequence : GUUCCUGGCAUUCGAGAGA)
서열번호 5 (ON-TARGETplus Human KAT2A (2648) siRNA - SMARTpool siRNA : Dharmacon, L-009722-02-0010: J-009722-19 )	CGAUGAUGCACUGGGCCUU (Target sequence : GCUACUACGUGACCCGGAA)
서열번호 6 (ON-TARGETplus Human KAT2A (2648) siRNA - SMARTpool siRNA : Dharmacon, L-009722-02-0010: J-009722-20 )	UGAGUACAGAAACCCGCUU (Target sequence : ACUCAUGUCUUUGGGCGAA)

본 명세서에서 용어, "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 명세서에서 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 예후 예측은 질환 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 예후란 총생존율(overall survival) 또는 무병생존율 (disease free survival rate)를 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커(biomarker)"란 염증 발생 여부 또는 염증 진행 정도를 구 분하여 판정할 수 있는 물질로, 염증이 발생되지 않은 세포 또는 조직에 비하여 염증이 발생한 세포 또는 조직에서 발현이 증가 또는 감소하여 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA를 포함한다. 본 발명의 목적상, 염증 진단 또는 예후 예측용 바이오마커는 시료에서 GCN 5단백질, 또는 이를 암호화하는 유전자로서, 이들 바이오마커가 하나 또는 둘 이상 포함된 세트를 이용하여 진단 효율을 높일 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명 GCN5를 포함하는 염증성 질환 진단용 바이오마커, 염증성 질환 치료용 조성물 및 염증성 질환 진단 또는 예후 예측용 조성물을 상세하게 설명한다.

이러한 물질들은 다발성경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병과 같은 신경퇴행성질환의 병리기전에 관여한다는 것이 보고되어 있다 (Kim and Joh, 2006; Koning et al., 2007; Krause and Muller, 2010; Moller,2010). 그러므로 이러한 신경염증의 조절이 신경퇴행성질환의 예방에 중요한 역할을 할 수 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신경퇴행성질환을 진단할 수 있는 신규 바이오마커를 탐색하던 중 리포폴리사카라이드 (LPS)로 자극된 BV-2 신경소교세포에서 GCN5가 억제되면 신경염증 매개인자들의 유전자 발현이 감소되는 것을 확인하고 BV-2 신경소교세포에서 LPS에 의한 GCN5의 변화 양상을 분석하였고, 이를 통해 염증성 질환, 신경퇴행성질환을 진단할 수 있는 신규 바이오마커로서 GCN5의 가능성을 확인하였다.

본 발명은 GCN5 단백질을 포함하는 염증성 질환 진단용 바이오마커를 제공한다. 본 발명에 따른 마커는 핵산 또는 단백질 수준 (농도)을 검출하여 염증성 질환의 진단에 사용될 수 있다.

또한, GCN5를 포함하는 본 발명에서의 바이오 마커는 신경퇴행성질환의 진단에도 사용될 수 있으며, 상기 신경퇴행성질환은 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알츠하이머병 (alzheimer's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매(fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증(cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 특히 바람직하게는 파킨슨병일 수 있으나, GCN5 핵산 또는 단백질 수준의 검출을 통해 진단할 수 있는 신경퇴행성질환이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 이와 더불어 상기 염증성 질환은, 패혈증, 염증성대장질환(크론병 등), 뇌 신경 염증, 아토피로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 뇌 신경 염증은, 해마(Hippocampus), 선조체(STRIATUM) 또는 흑질 치밀층(substantia nigra compacta) 뇌 조직에서 발생한 염증을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 바이오마커 또는 이를 암호화하는 유전자의 핵산서열에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 염증성 질환 진단용 키트로 제공될 수 있다.

상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약은 항체, 항체 단편 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 상기 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산서열에 특이적으로 결합하는 검출시약은 프라이머(primer), 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 바이오마커 또는 이를 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.

또 다른 실시예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

기타 다른 면역 반응 기반의 방법의 사용될 수 있으며 다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

본원의 각 마커는 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 정량적 및/또는 정성적 검출을 통해 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 진단에 사용될 수 있다. 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던 블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수 행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직 내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 양의 시료 검출에 유용하다.

상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. “프라이머”또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다.

상기와 같이 Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 BV-2 신경교세포에서 GCN5가 억제되면 신경염증 매개인자들의 유전자 및 단백질 발현이 감소된다. BV-2 신경교세포에서 GCN5가 염증신호전달기전 중 하나인 NF-kappaB 소단위체인 p65와의 결합이 조절되는 것을 확인하였으며 C57BL/6J 마우스에서 LPS에 의한 GCN5 변화 양상을 분석하였고, 이를 통해 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환을 진단할 수 있는 바이오마커로서 GCN5가 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 GCN5 억제제는 하기 화학식 1의 CPTH2일 수 있다. 따라서 본 발명의 GCN5 억제제, 구체적으로 CPTH2 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환을 예방, 치료 또는 개선하는데 효과적임을 알 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물을 이용할 수 있으며, 이하, 하기 화학식 1의 화합물은 CPTH2, 하기 화학식 2의 화합물은 TAK-242로 지칭하도록 한다.

[화학식 1] CPTH2

[화학식 2] TAK-242

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 LPS가 결합하는 TLR4 receptor 억제제 또는 GCN5의 억제제로 TAK-242가 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 TAK-242 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환을 예방, 치료 또는 개선하는데 효과적임을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 CPTH2, TAK-242 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물은 기억력 개선효과를 나타낸다.

[실험예 1]

세포 배양 (Cell culture)

불활성화 상태의 5% FBS와 100 units/ml 1% penicilline/streptomycin을 첨가한 DMEM에서 습도가 유지되는 5% CO₂, 95% O₂ incubator에서 배양하였다.

모든 실험에서 세포수는 1.25 x 10 cell/ml을 사용하였다. LPS는 BV-2 신경소교세포에서 200 ng/ml으로 각각 처리하였고, CPTH2를 배지에 희석하여 BV-2 신경소교세포에 1, 5 및 15 μM 농도로 1시간 전처리하였다.

[실험예 2]

실험 동물

수컷 C57BL/6J 마우스 (22-25 g, 8주령)는 대한바이오링크에서 구입하였다. 이들을 3개의 그룹으로 나누어 표준조건 하에서 1주 순화하였으며 이후 실험에 사용되었다 (온도 22±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 h-명/암 사이클, 음식/물 자유식).

모든 실험은 실험동물관리기준(NIH publication No. 85-23, revised 1985)의 가이드라인과 건국대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행하였다.

[실험예 3]

실험에 사용한 동물 그룹과 약물 투여 방식

마우스는 5마리씩 3개의 그룹 (1. vehicle, 2. LPS 5 mg/kg, 3. LPS+TAK 242 3mg/kg)으로 나누어진 후 실험에 투입되었고, TAK-242와 LPS는 생리적 식염수에 녹여 사용하였다. TAK-242는 LPS 처리 전 3시간 전 경구투여를 통하여 마우스에 투여하였으며, LPS는 5 mg/kg를 복강주사를 통하여 투여하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 CPTH2 및 TAK-242으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.

또한, 상기 신경퇴행성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 상기 신경퇴행성질환은, 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병 (parkinson's disease), 알츠하이머병 (alzheimer's disease), 루게릭병 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매 (fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증 (cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy)을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 신경퇴행성질환의 종류는 앞서 설명한 바와 같으며, 본 발명의 약학적 조성물 및/또는 건강기능식품 조성물은, 특히 파킨슨병의 예방, 개선 또는 치료에 유용한다.

본원에서의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 GCN5 억제제 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말하며, 본원에서의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, CPTH2 및 TAK-242로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 상기 신경퇴행성질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서 상기 신경퇴행성질환은, 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병 (parkinson's disease), 알츠하이머병 (alzheimer's disease), 루게릭병 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매 (fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증 (cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy)을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 더불어 상기 염증성 질환은, 패혈증, 염증성대장질환(크론병 등), 뇌염, 아토피로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 이하의 실시예는 이 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명이 충분히 이해되도록 제공되는 것으로서 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 다음에 기술되는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GCN5 단백질을 포함하는 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계, (b) 상기 (a) 단계의 바이오 마커 발현수준을 정상 대조군의 발현수준과 비교하여 정상 대조군의 발현수준보다 높은 경우 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자로 진단하는 단계 및 (c) 상기 염증성 질환 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물을 각각 처리하여 GCN5의 유전자 발현 저해도가 높은 조성물을 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법이 제공 될 수 있으며, 이에 따라 환자별로 유리한 치료 방법을 선택할 수 있다.

상기 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보 제공하는 방법에서 상기 염증성 질환은, 패혈증, 염증성대장질환(크론병 등), 뇌염, 아토피로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명은 GCN5 단백질을 포함하는 염증성 질환, 신경퇴행성질환 진단용 바이오마커를 이용할 수 있으며 상기 바이오마커 또는 이를 암호화하는 유전자의 핵산서열에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 진단용 키트를 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약은 항체, 항체 단편 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 상기 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산서열에 특이적으로 결합하는 검출시약은 프라이머(primer), 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 제1항의 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 바이오마커 발현수준을 정상 대조군의 발현수준과 비교하여 정상 대조군의 발현수준보다 높은 경우 신경퇴행성질환 환자로 진단하는 단계; (c) 상기 신경퇴행성질환 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 CPTH2 및 TAK-242을 포함하는 조성물을 각각 처리하여 GCN5의 유전자 발현 저해도가 높은 조성물을 선택하는 단계;를 포함하는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서 생물학적 시료란, 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로(in vitro)에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 신경퇴행성질환 마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

이러한 본원의 발명 중 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 진단용 마커는 이의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것이다. 이에 따르면 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질 수준(level)에서 특이적으로 상호작용하는 제제를 사용하여 검출될 수 있다.

1-1 산화질소 어세이 (NO assay)

CPTHH2의 염증성 질환(특히 신경염증) 억제 효능을 확인하기 위하여 BV-2 신경소교세포에서의 산화질소(NO)의 방출량 억제 효능을 NO 어세이를 통해 확인하였다. BV-2 신경소교세포를 24 well plate에 1.25 X 10⁵cell/well이 되도록 배양한 후, CPTH2를 농도별(1, 5 또는 15 μM)로 1시간 전처리 하였다. 그리고 LPS (200 ng/㎖)로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 세포 상층액을 96웰(well)에 100㎕씩 덜어 Griess reagent (1% 설파닐아미드, 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디하이드로클로라이드, 2.5% H3PO4)와 반응시킨 후, 파장이 550nm인 Vmax 96-well microplate spectrophotometer를 사용하여 값을 측정하였다. 그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 BV-2 신경교세포에서 GCN5의 억제제인 CPTH2의 농도 의존적으로 산화질소 억제 효능이 나타남을 확인하였다.

1-2 MTT 어세이

BV-2 신경소교세포를 24웰 플레이트에 1.25 X 10⁵cell/well이 되도록 배양한 후, CPTH2를 농도별(1, 5 또는 15 μM)로 1시간 전처리하였다. 그리고 LPS (200 ng/㎖)로 세포를 자극하였다. 상층액에 MTT 시약을 넣은 후, 생존한 세포들을 측정하여 나온 값을 백분율로 표시하였다. 그 결과 도 1B에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 볼 때, LPS 및 CPTH2 농도별 처리에 의한 세포독성은 나타나지 않음을 확인하였다.

이와 같은 결과를 통해 GCN5의 억제제인 CPTHH2가 염증반응, 특히 신경염증반응을 억제하여 염증질환 및 신경퇴행성질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.

CPTH2 처리에 따른 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 저해 효과

염증생성에 관여하는 효소인 iNOS 및 COX-2(cyclooxygenase type 2)의 단백질발현 양상의 변화를 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 BV-2 신경소교세포에 LPS 및 CPTH2를 농도별 (1, 5 또는 15 μM)로 처리하고 배양하였다. 20시간 후 단백질을 동정하여 웨스턴 블랏을 시행하여 iNOS 및 COX-2 단밸질의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, BV-2 신경소교세포에서 단백질의 동정은 세포를 Sample buffer [Glycerol, 10% SDS, β-mercaptomethanol, bromo-phenol blue, 0.5M Tris-Hcl]를 이용하여 동정하였다. 동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, 0.45 ㎛ polyvinylidene fluoride (PVDF, Millipore)를 사용하여 gel에서 membrane에 옮겼다. 1차 항체로 anti-β-actin, anti-COX-2 (1:2000; Santa Cruz), anti-iNOS (1:2000; Cell Signaling)를 희석하여 4℃에서 O/N(over-night)하고 2차 항체로 HRP (Horseradish peroxidase)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 키트(pierce, CA)로 반응시키고, Davinch Cas-400SM (Davinch-K, Korea)를 사용하여 결과를 확인하였다. β-actin은 단백질 발현 분석의 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 LPS만 처리한 군에서의 iNOS 및 COX-2 발현량은 대조군에 비해 증가하였으나, CPTH2를 농도별로 처리한 군에서의 발현량은 LPS만 처리한 군에 비하여 CPTH2 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

LPS로 자극된 BV-2 미세교세포에서 GCN5와 RelA의 상호결합 확인

신경소교세포는 외부의 자극을 받아 NF-κB 기전이 활성화되어 염증성 유전자를 발현시켜 TNF-α, IL-1β, IL-6 등의 염증성 사이토카인을 발현한다. 본 발명자들은 GCN5의 NF-κB 기전에서의 역할 및 기전 분석을 확인하고자 하였다.

본 실시예에서는 BV-2 신경소교세포에 LPS를 처리하고 시간별로 배양하였다. 30분 후 단백질을 동정하여 GCN5 antibody 혹은 p65 antibody를 넣어 특정 결합단백질을 얻어내었고 웨스턴 블랏을 시행하여 GCN5, ac-p65, 및 p65 단밸질의 상호결합에 따른 발현 양상을 확인하였다.

동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, 0.45 ㎛ polyvinylidene fluoride (PVDF, Millipore)를 사용하여 gel에서 membrane에 옮겼다. 1차 항체로 anti-GCN5 (1;1000, Sigma Aldrich), anti-β-actin (1:5000; Sigma Aldrich), anti-ac-p65, anti-p65 (1:2000; Cell Signaling)를 희석하여 4℃에서 O/N(over-night)하고 2차 항체로 HRP (Horseradish peroxidase)를 가지고 있는항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 키트(pierce, CA)로 반응시키고, Davinch Cas-400SM (Davinch-K, Korea)를 사용하여 결과를 확인하였다. β-actin은 단백질 발현 분석의 대조군으로 사용하였다.

본 실시예에서는 LPS 처리로 인하여 GCN5와 RelA가 상호결합을 통해 NF-κB 기전의 진행 확인할 수 있었다. NF-κB의 활성화를 확인하기 위하여 p-p65, ac-p65의 변화량을 BV-2 신경소교세포를 통하여 확인하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 BV-2 신경소교세포에서 LPS 처리시, GCN5와 RelA의 결합의 따른 단백질의 양이 증가함을 확인할 수 있었다.

LPS로 자극된 C57BL/6J 마우스에서 신경염증에 의한 iNOS, p-p65, ac-p65와 GCN5의 단백질 발현기전 확인

염증생성에 관여하는 효소인 iNOS 및 COX-2(cyclooxygenase type 2)의 단백질발현 양상의 변화를 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 C57BL/5J 마우스에 LPS 5 mg/kg로 처리하였다. 6시간 후 뇌 조직을 얻어 단백질을 동정하여 웨스턴 블랏을 시행하여 iNOS 단밸질 및 GCN5의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, C57BL/6J 마우스 뇌 조직에서 단백질의 동정은 세포를 Sample buffer [Glycerol, 10% SDS, β-mercaptomethanol, bromo-phenol blue, 0.5M Tris-Hcl]를 이용하여 동정하였다. 동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, 0.45 ㎛ polyvinylidene fluoride (PVDF, Millipore)를 사용하여 gel에서 membrane에 옮겼다. 1차 항체로 anti-β-actin(1:5000, Sigma Aldrich), anti-iNOS, anti-p65, anti-p-p65, anti-ac-p65 (1:2000; Cell Signaling) anti-GCN5 (1:1000; Sigma Aldrich)를 희석하여 4℃에서 O/N(over-night)하고 2차 항체로 HRP (Horseradish peroxidase)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 키트(pierce, CA)로 반응시키고, Davinch Cas-400SM (Davinch-K, Korea)를 사용하여 결과를 확인하였다. β-actin은 단백질 발현 분석의 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 LPS만 처리한 군에서의 iNOS와 p-p65, ac-p65 및 GCN5 발현량은 대조군에 비해 증가하였음을 확인할 수 있었다.

TAK-242 처리에 따른 iNOS 및 GCN5의 유전자 발현 저해 효과

대표적인 염증 매개인자인 iNOS와 GCN5 유전자의 발현 양상의 변화를 확인하기 위하여 본 실시예에서는 상기 염증 매개인자 유전자의 발현 양상을 C57BL/6J 마우스에 LPS 5 mg/kg 및 TAK-242를 3 mg/kg로 투여하고 6시간 후, 뇌 조직 부위별 RNA를 동정하고 RT-PCR을 시행하여 상기 유전자의 발현양상을 정량적인 방법을 통하여 분석하였다.

모든 RNA의 분리 및 RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다. C57BL/6J 마우스 뇌 조직의 모든 RNA 동정은 Trizaol reagent를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 분리하였다. C57BL/6J 뇌 조직에 Trizol reagent를 200㎕를 넣어주고 chloroform을 50㎕ 넣어준 후 잘 섞어주고 실온에서 5분 동안 반응시킨 다음 원심분리(4℃, 13,000rpm, 15분)한다. 상층액에서 200㎕를 새 튜브에 옮긴다. 동일 양의 isopropanol 200㎕을 넣어주고 실온에서 10분간 반응시킨 후 원심분리(4℃, 16000rpm, 15분)한다. 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회 세척을 하고 펠릿을 잘 건조시키고 DEPC-처리 증류수로 잘 녹여준다. RT(real-time) qPCR은 준비된 RNA의 2.5 ㎍/㎕ 농도로 맞추어 최종 부피는 10㎕로 동일하게 맞추었으며, Oligo(dT) 15 primer 1 ㎕, Random primers 1㎕ 로 pre-heat한 후, 5 X Reaction Buffer 4㎕, MgCl₂ 2㎕, dNTP 1㎕를 반응 조건 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분, 4℃ 5분이상 총 20 ㎕을 합성하여 사용되는 template의 농도는 0.5 ㎍/㎕가 되도록 희석하여 사용하였으며, 반응 조성은 Dyne qPCR 2X premix (DyneBio, Korea)를 사용했으며, 주형(template) 2㎕, PreMix 10㎕, primer-F 1㎕, primer-R 1㎕, DEPC 6㎕ 를 반응조건 94℃ 5분, 94℃ 30초 - 58℃ 1분 - 72℃ 1분 70회 반복, 72℃ 5분, 4℃ 보관으로 하여 총 20㎕를 반응시켰다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 염증 매개인자인 iNOS 유전자 발현과 GCN5 유전자 발현은 TAK-242 투여 시 저해되는 것을 확인하였다.

이와 같은 결과를 통해 GCN5의 억제제인 TAK-242가 염증반응, 특히 신경염증반응을 억제하여 염증질환 및 신경퇴행성질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.

LPS를 처리한 C57BL/6 마우스에서 조직별 GCN5 mRNA 발현량 변화 확인

8주령의 C57BL/6 마우스(평균 23~25g)를 대한바이오링크에서 수령하고 SPF 룸에서 일주일간 안정화를 진행하였다. 그후 LPS(lipopolysaccharide)를 5mg/kg 농도로 복강 내에 주입하고 6시간 후 뇌(Brain), 간(Liver) 그리고 심장(Heart)를 얻었다. 얻은 조직을 Chloroform-phenol 방법을 이용하여 RNA 시료를 얻어 Reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였고 DNA polymerase를 이용한 RT-PCR 방법을 통해 GCN5 mRNA의 발현을 비교하였다.

모든 RNA의 분리 및 RT-PCR은 다음의 방법을 사용하였다. 모든 RNA 동정은 Trizol reagent를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 분리하였다. C57BL/6 마우스의 뇌, 간 그리고 심장 조직에 Trizol reagent를 500 ul를 넣어 조직을 으깨고 chloroform을 100 ul를 너허준 후 잘 섞어주고 실온에서 5분동안 반응시킨 다음 원심분리 (4도, 12,000 rpm, 10분)한다. 상층액에서 250 ul를 새 튜브에 옮긴다. 동일 양의 isopropanol을 넣어주고 실온에서 15분간 반응시킨 후 원심분리 (4도, 12,000 rpm, 15분)한다. 상층액을 제거하고 75% 에탄올을 이용하여 2회 세척하고 펠릿을 잘 건조시킨 후 DEPC-처리 증류수로 잘 녹여준다. 얻은 RNA의 농도를 2.5 ug/ul로 맞추어 최종 부피는 10 ul로 동일하게 맞추었으며 Oligo(dT) 15 primer 1 ul, Random primers 1 ul로 pre-heat한 후, 5X reaction buffer 4ul, MgC12 2 ul, dNTP 1 ul를 반응조건 25도 5분, 42도 60분, 70도 15분, 4도 5분 이상 총 20 ul을 합성하여 사용되는 template의 농도는 0.5 ug/ul가 되도록 희석하여 사용하였다.

그 결과, 도 6을 참조하면 LPS를 C57BL/6 마우스에 주입할 경우 뇌, 간 그리고 심장에서 GCN5 mRNA의 발현은 LPS를 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 증가하는 것을 확인하였고, 특히 뇌 조직에서 GCN5 mRNA의 발현이 더 증가됨을 확인하였다. 즉, GCN5가 다른 조직보다 뇌 조직에서 신경염증에서 GCN5가 관여한다는 것을 알 수 있다.

LPS를 처리한 C57BL/6 마우스에서 신경염증에 의한 뇌조직 부위별 GCN5와 iNOS mRNA 발현량 변화 확인

8주령의 C57BL/6 마우스(평균 23~25g)를 대한바이오링크에서 수령하고 SPF 룸에서 일주일간 안정화를 진행하였다. 그후 LPS(lipopolysaccharide)를 5mg/kg 농도로 복강내 주입하고 6시간 후 뇌 조직을 부위별로 분리하여 얻었다. 얻은 조직을 Chloroform-phenol 방법을 이용하여 RNA 시료를 얻어 Reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였고 DNA polymerase를 이용한 RT-PCR 방법을 통해 GCN5 mRNA의 발현을 비교하였다.

그 결과, 도 7을 참조하면 PS를 C57BL/6 마우스에 주입할 경우 뇌의 SNpc, Hippocampus, Cortex에서 GCN5 mRNA의 발현은 LPS를 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 증가하는 것을 확인하였고, 증가된 GCN5 mRNA의 발현이 TLR4 특이적 억제제인 TAK-242를 LPS와 처리하였을 때, 억제됨을 확인하였다. 즉, 뇌 조직 중 특히 해마(Hippocampus)와 선조체(striatum), SNpc에서 GCN5가 신경염증에서 중요한 역할을 할 수 있음을 알 수 있다.

신경교세포 (microglia)와 성상교세포 (astrocyte)에서 신경염증에 의한 GCN5 및 전염증성매개인자 (iNOS, TNF-a 그리고 IL-6) mRNA 발현량 변화 확인

생후 2일의 C57BL/6 마우스)를 대한바이오링크에서 수령하고 뇌 조직을 얻어 멸균된 여과지를 이용해 혈액을 제거하고 균질화한다. nylone mesh를 통해 균질화를 이용한 뇌 조직을 걸러내고 배지를 넣어 5분동안 원심불리를 진행하고 상층액을 제거한다. 배지를 넣어 파종하여 세포배양기에서 1일간 배양하여 신선한 배지로 교체하여 세포파편을 제거한 다음 5일마다 배지를 교체해준다. 3주동안 배양한 세포를 Serum Free 배지를 이용해 세척하고 mild trypsinization을 위해 0.05% TE를 이용해 15분동안 배양하여 살짝 흔들어 성상교세포를 얻고 부착되있는 세포에 0.25% TE를 이용해 10분동안 배양하여 신경교세포를 얻는다. 얻은 신경교세포와 성상교세포를 Seeding하여 하루동안 세포배양기에서 보관한다. 그 후 LPS(lipopolysaccharide)를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 6시간 후 세포를 얻었다 얻은 세포를 Chloroform-phenol 방법을 이용하여 RNA 시료를 얻어 Reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였고 DNA polymerase를 이용한 RT-PCR 방법을 통해 GCN5 mRNA의 발현을 비교하였다.

모든 RNA의 분리 및 RT-PCR은 다음의 방법을 사용하였다. 모든 RNA 동정은 Trizol reagent를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 분리하였다. C57BL/6 마우스의 뇌, 간 그리고 심장 조직에 Trizol reagent를 500 ul를 넣어 조직을 으깨고 chloroform을 100 ul를 너허준 후 잘 섞어주고 실온에서 5분동안 반응시킨 다음 원심분리 (4도, 12,000 rpm, 10분)한다. 상층액에서 250 ul를 새 튜브에 옮긴다. 동일 양의 isopropanol을 넣어주고 실온에서 15분간 반응시킨 후 원심분리 (4도, 12,000 rpm, 15분)한다. 상층액을 제거하고 75% 에탄올을 이용하여 2회 세척하고 펠릿을 잘 건조시킨 후 DEPC-처리 증류수로 잘 녹여준다. 얻은 RNA의 농도를 2.5 ug/ul로 맞추어 최종 부피는 10 ul로 동일하게 맞추었으며 Oligo(dT) 15 primer 1 ul, Random primers 1 ul로 pre-heat한 후, 5X reaction buffer 4ul, MgC1₂ 2 ul, dNTP 1 ul를 반응조건 25도 5분, 42도 60분, 70도 15분, 4도 5분 이상 총 20 ul을 합성하여 사용되는 template의 농도는 0.5 ug/ul가 되도록 희석하여 사용하였다.

그 결과, 도 8을 참조하면 LPS를 처리한 신경교세포에서 GCN5를 비롯한 염증성매개인자인 iNOS, TNF-a 그리고 IL-6의 mRNA의 발현은 증가하였지만 성상교세포에서는 GCN5 mRNA의 발현은 증가되지 않았지만 다른 염증성 매개인자의 mRNA의 발현은 증가됨을 확인하였다.

신경교세포 (microglia)와 성상교세포 (astrocyte)에서 신경염증에 의한 GCN5 및 ac-p65, p-p65 단백질 발현량 변화 확인

생후 2일의 C57BL/6 마우스)를 대한바이오링크에서 수령하고 뇌 조직을 얻어 멸균된 여과지를 이용해 혈액을 제거하고 균질화한다. nylone mesh를 통해 균질화를 이용한 뇌 조직을 걸러내고 배지를 넣어 5분동안 원심불리를 진행하고 상층액을 제거한다. 배지를 넣어 파종하여 세포배양기에서 1일간 배양하여 신선한 배지로 교체하여 세포파편을 제거한 다음 5일마다 배지를 교체해준다. 3주동안 배양한 세포를 Serum Free 배지를 이용해 세척하고 mild trypsinization을 위해 0.05% TE를 이용해 15분동안 배양하여 살짝 흔들어 성상교세포를 얻고 부착되있는 세포에 0.25% TE를 이용해 10분동안 배양하여 신경교세포를 얻는다. 얻은 신경교세포와 성상교세포를 Seeding하여 하루동안 세포배양기에서 보관한다. 그 후 LPS를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 30분 후 세포를 얻었다. 얻은 세포에서 단백질을 동정하였고 웨스턴 블랏을 이용하여 GCN5와 ac-p65, p-p65 단백질 발현을 확인하였다.

구체적으로 세포를 Sample buffer [Glycerol, 10% SDS, beta-mercaptomethanil, bromo-phenol blue, 0.5M Tris-HCL]을 이용하여 동정하였다. 동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후 0.45 um polyvinylidene fluoride (PVDF, Millipore)를 사용하여 gel에서 membraine에 옮겼다. 각 항체를 희석하여 4도에서 Over-night하고 2차항체로 HRP를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 키트로 반응시키고 Davinch Cas-400SM (Davinch-K, Korea)를 사용하여 결과를 확인하였다. beta-actin은 단백질발현분석의 대조군으로 사용하였다. 그 결과, LPS를 처리한 신경교세포에서 GCN5를 비롯한 ac-p65와 p-p65 단백질의 발현은 증가하였지만 성상교세포에서는 GCN5 단백질의 발현은 증가되지 않았지만 ac-p65와 p-p65의 단백질의 발현은 증가됨을 확인하였다. 위 결과를 볼 때, 뇌 세포 중에 신경교세포가 신경염증에서 GCN5에 의한 조절에 관여한다는 것을 알 수 있다(도 9참조).

GCN5를 과발현시킨 BV-2 신경교세포에서의 p65의 인산화와 아세틸화의 변화 확인

GCN5의 발현증가를 위해 BV-2 신경교세포에 Lipofectamine LTX (Thermo Fisher)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 처리하였다. GCN5 Lentivirus vector는 abmgood을 통해 구매하였고 구매한 lentivirus vector를 transformation을 진행하여 배양시킨 후 DNA isolation을 진행하였다. DNA 동정은 PureLink Hipure Plasmid Midiprep Kit (Thermo, K210004)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 제공한 방법을 통해 분리한다. 분리한 DNA isolation을 BV-2 신경교세포에 주입을 시키고 4시간 뒤에 성장배지로 교체한다. 세포에 주입하는 방법은 Lipofectamine LTX (Thermo)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 권장한 제공 방법을 통해 주입한다. 주입한 세포를 1일간 증식시키고 LPS를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 30분 후 세포를 얻었다. 얻은 세포에서 단백질을 동정하였고 웨스턴 블랏을 이용하여 GCN5와 ac-p65, p-p65 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과 GCN5가 과발현된 BV-2 신경교세포는 과발현시키지 않은 대조군에 비해 ac-p65와 p-p65 단백질의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 LPS를 처리하였을 경우, 처리하지 않았을 때보다 더 증가됨을 확인하였다 (도 10참조).

GCN5를 과발현 시킨 BV-2 신경교세포에서의 염증성 매개인자 발현의 변화 확인

GCN5의 발현증가를 위해 BV-2 신경교세포에 Lipofectamine LTX (Thermo Fisher)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 처리하였다. GCN5 Lentivirus vector는 abmgood을 통해 구매하였고 구매한 lentivirus vector를 transformation을 진행하여 배양시킨 후 DNA isolation을 진행하였다. DNA 동정은 PureLink Hipure Plasmid Midiprep Kit (Thermo, K210004)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 제공한 방법을 통해 분리한다. 분리한 DNA isolation을 BV-2 신경교세포에 주입을 시키고 4시간 뒤에 성장배지로 교체한다. 세포에 주입하는 방법은 Lipofectamine LTX (Thermo)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 권장한 제공 방법을 통해 주입한다. 주입한 세포를 1일간 증식시키고 LPS를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 6시간 후 세포를 얻었다. 얻은 세포에서 RNA를 동정하였고 RT-PCR을 이용하여 GCN5와 iNOS, TNA-a 그리고 IL-6 mRNA 발현을 확인하였다.

그 결과 도 11을 참조하면, GCN5가 과발현된 BV-2 신경교세포는 과발현시키지 않은 대조군에 비해 염증성 매개인자 mRNA의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 LPS를 처리하였을 때, 더욱 염증성 매개인자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

GCN5를 과발현 시킨 HEK293(TLR4)세포에서의 p65의 인산화와 아세틸화의 변화 확인

GCN5의 발현증가를 위해 HEK293(TLR4)세포에 Lipofectamine LTX (Thermo Fisher)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 처리하였다. GCN5 Lentivirus vector는 abmgood을 통해 구매하였고 구매한 lentivirus vector를 transformation을 진행하여 배양시킨 후 DNA isolation을 진행하였다. DNA 동정은 PureLink Hipure Plasmid Midiprep Kit (Thermo, K210004)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 제공한 방법을 통해 분리한다. 분리한 DNA isolation을 HEK293(TLR4)세포에 주입을 시키고 6시간 뒤에 성장배지로 교체한다. 세포에 주입하는 방법은 Lipofectamine LTX (Thermo)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 권장한 제공 방법을 통해 주입한다. 주입한 세포를 1일간 증식시키고 LPS를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 30분 후 세포를 얻었다. 얻은 세포에서 단백질을 동정하였고 웨스턴 블랏을 이용하여 GCN5와 ac-p65, p-p65 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과 도 12를 참조하면, GCN5가 과발현된 HEK293(TLR4)세포는 과발현시키지 않은 대조군에 비해 ac-p65와 p-p65 단백질의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 LPS를 처리하였을 경우, 처리하지 않았을 때보다 더 증가됨을 확인하였다.

GCN5의 발현이 억제된 HEK293(TLR4)세포에서의 p65의 인산화와 아세틸화의 변화 확인

GCN5의 발현억제를 위해 HEK293(TLR4)세포에 Lipofectamine LTX (Thermo Fisher)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 처리하였다. GCN5 siRNA는 Dharmacon을 통해 구매하였고 농도를 설정하여 분리 보관하여 사용하였다. 분리 보관한 siRNA를 HEK293(TLR4)세포에 주입을 시키고 6시간 뒤에 성장배지로 교체한다. 세포에 주입하는 방법은 Lipofectamine LTX (Thermo)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 권장한 제공 방법을 통해 주입한다. 주입한 세포를 1일간 증식시키고 LPS를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 30분 후 세포를 얻었다. 얻은 세포에서 단백질을 동정하였고 웨스턴 블랏을 이용하여 GCN5와 ac-p65, p-p65 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과 도 13을 참조하면, GCN5가 과발현된 HEK293(TLR4)세포는 과발현시키지 않은 대조군에 비해 ac-p65와 p-p65 단백질의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 LPS를 처리하였을 경우, 처리하지 않았을 때보다 더 증가됨을 확인하였다. 반면에 GCN5의 발현이 억제된 실험군에서는 LPS를 처리하여도 증가되지 않음을 확인하였다.

GCN5를 과발현시킨 HEK293(TLR4)세포의 염증성 매개인자 발현의 변화 확인

GCN5의 발현억제를 위해 HEK293(TLR4)세포에 Lipofectamine LTX (Thermo Fisher)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 처리하였다. GCN5 siRNA는 Dharmacon을 통해 구매하였고 농도를 설정하여 분리 보관하여 사용하였다. 분리 보관한 siRNA를 HEK293(TLR4)세포에 주입을 시키고 6시간 뒤에 성장배지로 교체한다. 세포에 주입하는 방법은 Lipofectamine LTX (Thermo)를 이용하고 사용방법은 제조회사가 권장한 제공 방법을 통해 주입한다. 주입한 세포를 1일간 증식시키고 LPS를 200 ng/ml의 농도로 처리하고 6시간 후 세포를 얻었다. 얻은 세포에서 RNA를 동정하였고 RT-PCR을 이용하여 GCN5와 iNOS, TNA-a 그리고 IL-6 mRNA 발현을 확인하였다.

그 결과 도 14를 참조하면, GCN5가 과발현된 HEK293(TLR4)세포는 과발현시키지 않은 대조군에 비해 염증성 매개인자 mRNA의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 LPS를 처리하였을 때, 더욱 염증성 매개인자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

GCN5의 발현을 억제시킨 HEK293(TLR4)세포의 염증성 매개인자 발현의 변화 확인

그 결과 도 15를 참조하면, GCN5가 과발현된 HEK293(TLR4)세포는 과발현시키지 않은 대조군에 비해 염증성 매개인자 mRNA의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 LPS를 처리하였을 때, 더욱 염증성 매개인자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 반면에 GCN5의 발현이 억제된 실험군에서는 LPS를 처리하여도 증가되지 않음을 확인하였다. 위 결과를 볼 때, GCN5의 발현 조절이 신경염증 혹은 염증을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 알 수 있다.

LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 GCN5의 PTM 변화 확인

BV-2 신경교세포에 LPS를 처리하고 30분 후 단백질을 동정하여 p65 antibody를 넣어 특정 결합 단백질을 얻어내 웨스턴블랏을 시행하여 GCN5의 PTM 변화로 알려진 phospho-tyrosine(티로신), phospho-thereonine, phospho-serine, acetyl-lysine과 상호결합에 따른 발현 양상을 확인하였다. 그 결과 LPS 처리로 인하여 GCN5의 위치로 확인되는 부위에서 phsophso-tyrosine이 증가됨을 확인하였지만 phospho-thereonine, phosphoe-serine, acetyl-lysine이 변화되지 않음을 확인하였다. 위 결과를 볼 때, GCN5의 신경염증 조절에 있어서 티로신(tyrosine) 잔기의 인산화가 일어남으로써 작용함을 알 수 있다(도 16 참조).

통계분석

실험 결과의 재현성 확인을 위하여 본 발명의 실시예의 모든 실험 데이터는 평균값 ±표준편차로 표기하였으며, 각 실험은 3회 실시하였다. 실험 결과의 통계분석은 Graphpad Prism V5.01. software를 사용하여 Tukey method에 따라 One-way ANOVA를 하였다.

<110> GLOCAL Industry-Academic Cooperation Foundation Konkuk University <120> COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES USING CPTH2, TAK-242 AND GCN5 siRNA <130> 1068485 <150> KR 10-2019-0147540 <151> 2019-11-18 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 837 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens K(lysine) acetyltransferase 2A, mRNA (cDNA clone MGC:45022 IMAGE:5575574), complete CDs (BC032743) <400> 1 Met Ala Glu Pro Ser Gln Ala Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu Gln Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ala Pro 20 25 30 Ser Pro Ala Ser Ala Pro Ile Pro Thr Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Gly Ser Thr Gly Thr Gly Gly Pro Gly 50 55 60 Val Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Asp Pro Ala Arg Pro Gly 65 70 75 80 Leu Ser Gln Gln Gln Arg Ala Ser Gln Arg Lys Ala Gln Val Arg Gly 85 90 95 Leu Pro Arg Ala Lys Lys Leu Glu Lys Leu Gly Val Phe Ser Ala Cys 100 105 110 Lys Ala Asn Glu Thr Cys Lys Cys Asn Gly Trp Lys Asn Pro Lys Pro 115 120 125 Pro Thr Ala Pro Arg Met Asp Leu Gln Gln Pro Ala Ala Asn Leu Ser 130 135 140 Glu Leu Cys Arg Ser Cys Glu His Pro Leu Ala Asp His Val Ser His 145 150 155 160 Leu Glu Asn Val Ser Glu Asp Glu Ile Asn Arg Leu Leu Gly Met Val 165 170 175 Val Asp Val Glu Asn Leu Phe Met Ser Val His Lys Glu Glu Asp Thr 180 185 190 Asp Thr Lys Gln Val Tyr Phe Tyr Leu Phe Lys Leu Leu Arg Lys Cys 195 200 205 Ile Leu Gln Met Thr Arg Pro Val Val Glu Gly Ser Leu Gly Ser Pro 210 215 220 Pro Phe Glu Lys Pro Asn Ile Glu Gln Gly Val Leu Asn Phe Val Gln 225 230 235 240 Tyr Lys Phe Ser His Leu Ala Pro Arg Glu Arg Gln Thr Met Phe Glu 245 250 255 Leu Ser Lys Met Phe Leu Leu Cys Leu Asn Tyr Trp Lys Leu Glu Thr 260 265 270 Pro Ala Gln Phe Arg Gln Arg Ser Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr 275 280 285 Lys Val Asn Tyr Thr Arg Trp Leu Cys Tyr Cys His Val Pro Gln Ser 290 295 300 Cys Asp Ser Leu Pro Arg Tyr Glu Thr Thr His Val Phe Gly Arg Ser 305 310 315 320 Leu Leu Arg Ser Ile Phe Thr Val Thr Arg Arg Gln Leu Leu Glu Lys 325 330 335 Phe Arg Val Glu Lys Asp Lys Leu Val Pro Glu Lys Arg Thr Leu Ile 340 345 350 Leu Thr His Phe Pro Lys Phe Leu Ser Met Leu Glu Glu Glu Ile Tyr 355 360 365 Gly Ala Asn Ser Pro Ile Trp Glu Ser Gly Phe Thr Met Pro Pro Ser 370 375 380 Glu Gly Thr Gln Leu Val Pro Arg Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 385 390 395 400 Val Pro Ser Thr Pro Ile Phe Ser Pro Ser Met Gly Gly Gly Ser Asn 405 410 415 Ser Ser Leu Ser Leu Asp Ser Ala Gly Ala Glu Pro Met Pro Gly Glu 420 425 430 Lys Arg Thr Leu Pro Glu Asn Leu Thr Leu Glu Asp Ala Lys Arg Leu 435 440 445 Arg Val Met Gly Asp Ile Pro Met Glu Leu Val Asn Glu Val Met Leu 450 455 460 Thr Ile Thr Asp Pro Ala Ala Met Leu Gly Pro Glu Thr Ser Leu Leu 465 470 475 480 Ser Ala Asn Ala Ala Arg Asp Glu Thr Ala Arg Leu Glu Glu Arg Arg 485 490 495 Gly Ile Ile Glu Phe His Val Ile Gly Asn Ser Leu Thr Pro Lys Ala 500 505 510 Asn Arg Arg Val Leu Leu Trp Leu Val Gly Leu Gln Asn Val Phe Ser 515 520 525 His Gln Leu Pro Arg Met Pro Lys Glu Tyr Ile Ala Arg Leu Val Phe 530 535 540 Asp Pro Lys His Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Asp Gly Arg Val Ile 545 550 555 560 Gly Gly Ile Cys Phe Arg Met Phe Pro Thr Gln Gly Phe Thr Glu Ile 565 570 575 Val Phe Cys Ala Val Thr Ser Asn Glu Gln Val Lys Gly Tyr Gly Thr 580 585 590 His Leu Met Asn His Leu Lys Glu Tyr His Ile Lys His Asn Ile Leu 595 600 605 Tyr Phe Leu Thr Tyr Ala Asp Glu Tyr Ala Ile Gly Tyr Phe Lys Lys 610 615 620 Gln Gly Phe Ser Lys Asp Ile Lys Val Pro Lys Ser Arg Tyr Leu Gly 625 630 635 640 Tyr Ile Lys Asp Tyr Glu Gly Ala Thr Leu Met Glu Cys Glu Leu Asn 645 650 655 Pro Arg Ile Pro Tyr Thr Glu Leu Ser His Ile Ile Lys Lys Gln Lys 660 665 670 Glu Ile Ile Lys Lys Leu Ile Glu Arg Lys Gln Ala Gln Ile Arg Lys 675 680 685 Val Tyr Pro Gly Leu Ser Cys Phe Lys Glu Gly Val Arg Gln Ile Pro 690 695 700 Val Glu Ser Val Pro Gly Ile Arg Glu Thr Gly Trp Lys Pro Leu Gly 705 710 715 720 Lys Glu Lys Gly Lys Glu Leu Lys Asp Pro Asp Gln Leu Tyr Thr Thr 725 730 735 Leu Lys Asn Leu Leu Ala Gln Ile Lys Ser His Pro Ser Ala Trp Pro 740 745 750 Phe Met Glu Pro Val Lys Lys Ser Glu Ala Pro Asp Tyr Tyr Glu Val 755 760 765 Ile Arg Phe Pro Ile Asp Leu Lys Thr Met Thr Glu Arg Leu Arg Ser 770 775 780 Arg Tyr Tyr Val Thr Arg Lys Leu Phe Val Ala Asp Leu Gln Arg Val 785 790 795 800 Ile Ala Asn Cys Arg Glu Tyr Asn Pro Pro Asp Ser Glu Tyr Cys Arg 805 810 815 Cys Ala Ser Ala Leu Glu Lys Phe Phe Tyr Phe Lys Leu Lys Glu Gly 820 825 830 Gly Leu Ile Asp Lys 835 <210> 2 <211> 830 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus musculus K(lysine) acetyltransferase 2A (Kat2a), transcript variant 1, mRNA (NM_020004) <400> 2 Met Ala Glu Pro Ser Gln Ala Pro Asn Pro Val Pro Ala Ala Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu His Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Thr Pro Ala Pro 20 25 30 Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Gly Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ala Gly 50 55 60 Val Gly Ser Gly Gly Asp Pro Ala Arg Pro Gly Leu Ser Gln Gln Gln 65 70 75 80 Arg Ala Ser Gln Arg Lys Ala Gln Val Arg Gly Leu Pro Arg Ala Lys 85 90 95 Lys Leu Glu Lys Leu Gly Val Phe Ser Ala Cys Lys Ala Asn Glu Thr 100 105 110 Cys Lys Cys Asn Gly Trp Lys Asn Pro Lys Pro Pro Thr Ala Pro Arg 115 120 125 Met Asp Leu Gln Gln Pro Ala Ala Asn Leu Ser Glu Leu Cys Arg Ser 130 135 140 Cys Glu His Pro Leu Ala Asp His Val Ser His Leu Glu Asn Val Ser 145 150 155 160 Glu Asp Glu Ile Asn Arg Leu Leu Gly Met Val Val Asp Val Glu Asn 165 170 175 Leu Phe Met Ser Val His Lys Glu Glu Asp Thr Asp Thr Lys Gln Val 180 185 190 Tyr Phe Tyr Leu Phe Lys Leu Leu Arg Lys Cys Ile Leu Gln Met Thr 195 200 205 Arg Pro Val Val Glu Gly Ser Leu Gly Ser Pro Pro Phe Glu Lys Pro 210 215 220 Asn Ile Glu Gln Gly Val Leu Asn Phe Val Gln Tyr Lys Phe Ser His 225 230 235 240 Leu Ala Pro Arg Glu Arg Gln Thr Met Phe Glu Leu Ser Lys Met Phe 245 250 255 Leu Leu Cys Leu Asn Tyr Trp Lys Leu Glu Thr Pro Ala Gln Phe Arg 260 265 270 Gln Arg Ser Gln Ser Glu Asp Val Ala Thr Tyr Lys Val Asn Tyr Thr 275 280 285 Arg Trp Leu Cys Tyr Cys His Val Pro Gln Ser Cys Asp Ser Leu Pro 290 295 300 Arg Tyr Glu Thr Thr His Val Phe Gly Arg Ser Leu Leu Arg Ser Ile 305 310 315 320 Phe Thr Val Thr Arg Arg Gln Leu Leu Glu Lys Phe Arg Val Glu Lys 325 330 335 Asp Lys Leu Val Pro Glu Lys Arg Thr Leu Ile Leu Thr His Phe Pro 340 345 350 Lys Phe Leu Ser Met Leu Glu Glu Glu Ile Tyr Gly Ala Asn Ser Pro 355 360 365 Ile Trp Glu Ser Gly Phe Thr Met Pro Pro Ser Glu Gly Thr Gln Leu 370 375 380 Val Pro Arg Pro Ala Thr Val Ser Ala Thr Val Val Pro Ser Phe Ser 385 390 395 400 Pro Ser Met Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Asp Ser Ala 405 410 415 Gly Thr Glu Pro Met Pro Ala Gly Glu Lys Arg Lys Leu Pro Glu Asn 420 425 430 Leu Thr Leu Glu Asp Ala Lys Arg Leu Arg Val Met Gly Asp Ile Pro 435 440 445 Met Glu Leu Val Asn Glu Val Met Leu Thr Ile Thr Asp Pro Ala Ala 450 455 460 Met Leu Gly Pro Glu Thr Ser Leu Leu Ser Ala Asn Ala Ala Arg Asp 465 470 475 480 Glu Thr Ala Arg Leu Glu Glu Arg Arg Gly Ile Ile Glu Phe His Val 485 490 495 Ile Gly Asn Ser Leu Thr Pro Lys Ala Asn Arg Arg Val Leu Leu Trp 500 505 510 Leu Val Gly Leu Gln Asn Val Phe Ser His Gln Leu Pro Arg Met Pro 515 520 525 Lys Glu Tyr Ile Ala Arg Leu Val Phe Asp Pro Lys His Lys Thr Leu 530 535 540 Ala Leu Ile Lys Asp Gly Arg Val Ile Gly Gly Ile Cys Phe Arg Met 545 550 555 560 Phe Pro Thr Gln Gly Phe Thr Glu Ile Val Phe Cys Ala Val Thr Ser 565 570 575 Asn Glu Gln Val Lys Gly Tyr Gly Thr His Leu Met Asn His Leu Lys 580 585 590 Glu Tyr His Ile Lys His Ser Ile Leu Tyr Phe Leu Thr Tyr Ala Asp 595 600 605 Glu Tyr Ala Ile Gly Tyr Phe Lys Lys Gln Gly Phe Ser Lys Asp Ile 610 615 620 Lys Val Pro Lys Ser Arg Tyr Leu Gly Tyr Ile Lys Asp Tyr Glu Gly 625 630 635 640 Ala Thr Leu Met Glu Cys Glu Leu Asn Pro Arg Ile Pro Tyr Thr Glu 645 650 655 Leu Ser His Ile Ile Lys Lys Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Leu Ile 660 665 670 Glu Arg Lys Gln Ala Gln Ile Arg Lys Val Tyr Pro Gly Leu Ser Cys 675 680 685 Phe Lys Glu Gly Val Arg Gln Ile Pro Val Glu Ser Val Pro Gly Ile 690 695 700 Arg Glu Thr Gly Trp Lys Pro Leu Gly Lys Glu Lys Gly Lys Glu Leu 705 710 715 720 Lys Asp Pro Asp Gln Leu Tyr Thr Thr Leu Lys Asn Leu Leu Ala Gln 725 730 735 Ile Lys Ser His Pro Ser Ala Trp Pro Phe Met Glu Pro Val Lys Lys 740 745 750 Ser Glu Ala Pro Asp Tyr Tyr Glu Val Ile Arg Phe Pro Ile Asp Leu 755 760 765 Lys Thr Met Thr Glu Arg Leu Arg Ser Arg Tyr Tyr Val Thr Arg Lys 770 775 780 Leu Phe Val Ala Asp Leu Gln Arg Val Ile Ala Asn Cys Arg Glu Tyr 785 790 795 800 Asn Pro Pro Asp Ser Glu Tyr Cys Arg Cys Ala Ser Ala Leu Glu Lys 805 810 815 Phe Phe Tyr Phe Lys Leu Lys Glu Gly Gly Leu Ile Asp Lys 820 825 830 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ON-TARGETplus Human KAT2A (2648) siRNA - SMARTpool siRNA : Dharmacon, L-009722-02-0010: J-009722-17 <400> 3 uccuguuuaa ccacgggcu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ON-TARGETplus Human KAT2A (2648) siRNA - SMARTpool siRNA : Dharmacon, L-009722-02-0010: J-009722-18 <400> 4 caaggaccgu aagcucucu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> 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하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
제8 항에 있어서, 상기 염증성 질환은,
패혈증, 염증성대장질환, 뇌 신경 염증, 아토피로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9 항에 있어서,
상기 뇌 신경 염증은, 해마(Hippocampus), 선조체(striatum) 및 흑질 치밀층(substantia nigra compacta)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 뇌 조직에서 발생한 염증인, 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8 항에 있어서,
상기 조성물은 GCN5 단백질 내 티로신 잔기의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
[화학식 1]
제12 항에 있어서, 상기 염증성 질환은,
패혈증, 염증성대장질환, 뇌 신경 염증, 아토피로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제13 항에 있어서,
상기 뇌 신경 염증은, 해마(Hippocampus), 선조체(striatum) 및 흑질 치밀층(substantia nigra compacta)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 뇌 조직에서 발생한 염증인, 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GCN5 단백질을 포함하는 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 바이오 마커 발현수준을 정상 대조군의 발현수준과 비교하여 정상 대조군의 발현수준보다 높은 개체를 분류하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에 따라 분류된 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리하여 GCN5의 유전자 발현 저해도가 높은 조성물을 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법:
[화학식 1]
제15 항에 있어서, 상기 신경퇴행성질환은,
다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병 (parkinson's disease), 알츠하이머병 (alzheimer's disease), 루게릭병 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매 (fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증 (cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법.
제16 항에 있어서, 상기 염증성 질환은,
패혈증, 염증성대장질환, 뇌 신경 염증, 아토피로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법.
제17 항에 있어서,
상기 뇌 신경 염증은, 해마(Hippocampus), 선조체(striatum) 및 흑질 치밀층(substantia nigra compacta)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 뇌 조직에서 발생한 염증인, 염증성 질환 또는 신경퇴행성질환 환자별 맞춤 치료 정보를 제공하는 방법.