KR102494174B1 - 정지 세포 표적화 및 egfr 억제제를 이용하는 신생물 치료를 위한 조합 - Google Patents

정지 세포 표적화 및 egfr 억제제를 이용하는 신생물 치료를 위한 조합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신생물을 치료하기 위한 조성물 및 방법, 특히, 특정한 신생물 병태에 대해 효과적인 다른 치료, 특히, EGFR 억제제 항암 치료와 조합된 치료제에 의해 정지 암 세포를 표적으로 함으로써 신생물을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

정지 세포 표적화 및 EGFR 억제제를 이용하는 신생물 치료를 위한 조합
암 세포의 정지, 실질적으로는 세포의 수면 상태는 암 세포가 치료에 저항하는 주요 메커니즘으로서 및 질병 재발을 위한 경로를 제공하는 것으로 최근에 인식되어 왔다. 세포 휴면으로 불리는 이러한 정지는 세포 주기 중 G0기에서의 정지에 기인한다. 전형적으로, 세포는 도 1에 나타낸 바와 같이 갭기 (gap phase) 1 (G1)에서부터 세포 주기로 진입한다. 합성기 (S) 및 짧은 유사분열전 (pre-mitotic) 간격 (G2) 후, 세포는 유사분열 (M)에 의해 분열된 후 G1로 복귀한다. 그러나, G1 대신에, 세포는 G0기로서 지정된 세포 휴면 또는 정지로 진입할 수 있다. 암 세포는, 정지 섬유아세포와 같이, 주기 진입을 재개할 수 있는 가역적인 진정한 정지 G0 상태로 진입하거나, 노화로 불리는 최종 분화를 거치기 전에 비가역적 상태로 진입할 수 있다 (문헌 [Coller HA, Sang L, and Roberts JM (2006) A new description of cellular quiescence, PLoS Biology 4, e83] 참조).
세포의 집단은 자연적으로 임의의 소정의 시간에 정지 상태로 있을 수 있으며, 세포 분열 주기로 진입하기 위한 신호를 수신할 때까지 불확정 기간 동안 정지 상태를 유지할 수 있다. 하나의 예에서, 종양의 집단 내의 정지 상태의 암 세포의 비율은 영양의 결핍, 저산소증, 고농도의 반응성 산소 종 등과 같은 환경 요인에 의해 증가할 수 있다. 세포는 또한 약리학적 정지에서와 같이 약물의 작용에 의해 정지 상태로 유도될 수 있다.
정지 세포의 에너지 및 영양 요구는 분열 세포에 비해 감소한다. 현재의 암 요법은 도 2에 도시된 바와 같이 분열 세포를 표적으로 하기 때문에, 암 세포는 이에 영향을 미치는 이러한 치료를 위해 세포 분열 주기 내에 있어야 한다. 따라서, 정지 암 세포는 노출된 DNA의 손상, DNA 복제 또는 복구의 방해, 유사분열의 방해 또는 다른 메커니즘에 의해 더 많은 세포 증식 과정 중 하나에 영향을 미치는 치료에 내성이 있다.
항암 요법과 방사선 치료 둘 다는 역효과를 일으킨다. 결과적으로, 투여량 및 치료 기간은 독성에 의해 제한되며, 보다 낮은 유효 투여량 및/또는 보다 짧은 치료 기간이 매우 바람직하다. 그러나, 투여량을 감소시키거나 치료를 중단하면, 생존한 정지 암 세포는 세포 주기로 재진입할 때 암 재발을 일으킬 수 있으며, 그 시기는 예측할 수 없다. 또한, 혈류 중의 전이암 세포는 이들의 새로운 미소 환경에 적응하면서 정지 기간을 경험할 수 있다 (문헌 [Chaffer CL and Weinberg RA (2011) A perspective on cancer cell metastasis, Science 331, 1559-1564] 참조). 정지 암 세포는 이들의 폴리리보솜을 분해함으로써, 번역을 차단하고 전체 RNA 및 단백질 함량을 감소시킨다. 이러한 수축 암 세포는 모세 혈관의 구멍 (직경 대략 8 μm)에 진입할 수 있는 반면, 주기 진입 암 세포는 통상 훨씬 더 크다 (20~30 μm).
따라서, 신생물 내의 정지 암 세포의 집단의 존재는 성공적이고 지속적인 치료의 장애물로서 인식된다 (문헌 [Jackson RC (1989) The problem of the quiescent cancer cell, Advances in Enzyme Regulation 29, 27-46] 참조). 각종 암 유형으로부터 유래된 정지 암 세포 및 각종 항암 치료의 내성에 대한 증거가 보고되어 왔다.
그러나, 암세포 정지의 중요성에 대한 인식이 점차 커지고 있음에도 불구하고, 이러한 문제는 임상적으로 다루어지지 않고 있다.
본 발명은 신생물을 치료하기 위한 조성물 및 방법, 특히, 특정 신생물 병태에 대해 효과적인 다른 치료, 특히, EGFR 억제제 항암 치료와 조합된 치료제에 의해 정지 암 세포를 표적으로 함으로써 신생물을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명은 치료학적 유효량의 (a) 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제; 및 (b) EGFR 억제제인 제2 치료제를 필요로 하는 대상체에게 이를 투여하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 두 치료제는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있는 신생물의 치료 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 신생물은 시험관내 또는 생체내 암 또는 암 세포의 집단이다. 일부 실시형태에서, 치료 중인 대상체는 암 (예를 들어, 전이성 또는 전-전이성)으로 진단된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암에 대한 일차 요법으로 이전에 치료받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 2종 이상의 EGFR 억제제로 순차적으로 또는 동시에 치료받거나 치료받았다.
일부 실시형태에서, 조합 치료는 생존율 증가, 중증도 감소, 재발의 지연 또는 제거, 또는 일차 치료 (즉, EGFR 억제제)의 부작용 감소와 같은 개선된 결과를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 치료제 단독 치료와 비교하여 조합의 일부로서 투여될 때 보다 낮은 투여량 및/또는 보다 짧은 기간 동안 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, EGFR 억제제의 EC50 값은, 예를 들어, 세포 기반 검정법으로 측정될 때, 단일 치료제로서의 EGFR 억제제에 의한 동일 치료와 비교하여, 조합 치료에서 적어도 20% 더 낮다. 일부 실시형태에서, 조합 요법은 FACS 검정법에 의해, 예를 들어, 서브-G0기 세포의 분율로 측정될 때, 어느 하나의 치료제 단독과 비교하여, 치료된 집단에서 세포 사멸 세포의 분율을 적어도 2배 증가시킨다.
하나의 실시형태에서, 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 DYRK1 억제제이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 DYRK1 키나아제, 즉, DYRK1A 또는 DYRK1B (시험관내 또는 생체내)의 활성을, 예를 들어, 생화학 검정법에서 100 nM 이하의 IC50으로 억제하는 화합물이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 그렇지 않으면 이러한 억제제의 부재하에 발견되는 정지 암 세포 (시험관내 또는 생체내)의 분율을, 예를 들어, 적어도 10% 감소시킨다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 DYRK1A와 DYRK1B 둘 다를 억제한다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 DYRK1A 또는 DYRK1B에 대해 선택적이다.
하나의 실시형태에서, 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 DYRK1 억제제이다. 하나의 실시형태에서, DYRK1 억제제는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
Figure 112018113353212-pct00001
상기 화학식 I에서,
R1은 치환되거나 비치환된 C1-8 알킬, 치환되거나 비치환된 페닐, 또는 치환되거나 비치환된 벤질이고;
R2는 할로, CN, NO2, NHC(O)C1-4 알킬, C1-4 알킬, OH 및 OC1-4 알킬로부터 독립적으로 선택된 4개 이하의 그룹에 의해 임의로 치환된 페닐이며, 여기서, 2개의 인접 그룹 및 이들의 개입 탄소 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하는 5원 및 6원 고리를 형성할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 하기로부터 선택된다:
Figure 112018113353212-pct00002
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 (c) 대상체에게 또 다른 항암 요법, 예를 들어, 방사선 요법 또는 다른 암 치료를 투여하는 것을 추가로 제공한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 치료학적 유효량의 (a) 화학식 I의 치료제; (b) EGFR 억제제; 및 (c) 방사선 요법을 이의 투여가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 각각의 요법은 순차적으로 또는 동시에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체는 먼저 방사선 요법으로 치료받으며, 대상체는 화학식 I의 치료제 단독 또는 EGFR 억제제와 조합하여 투여받는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 (a) 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제, (b) EGFR 억제제 및 임의로 (c) 방사선 요법을 함께 투여받는다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 야생형 또는 변이체 또는 절두된 EGFR 타이로신 키나아제 (시험관내 또는 생체내)의 활성을, 예를 들어, 생화학 검정법에서 100 nM 이하의 IC50으로 억제하는 화합물이다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 암 치료에 승인된 모든 이러한 화합물들 및 그렇지 않으면 포유동물 대상체 (예를 들어, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 사람)에서 암을 치료하는데 효능을 입증하는 화합물들, 및 시험관내에서 신생 세포에 대해 효능을 입증하는 화합물들을 포함하지만 이들에 제한되지 않는, 신생물을 치료하거나 예방하는데 효과적인 EGFR 억제제이다. 다수의 이러한 화합물들은 공지되어 있다.
EGFR 억제제는, 예를 들어, 소형 분자 또는 항-EGFR 항체일 수 있다.
하나의 실시형태에서, EGFR 억제제는 가역적 EGFR 타이로신 키나아제 억제제 (EGFR TKI)이다. 추가의 실시형태에서, 가역적 EGFR TKI는, 예를 들어, 브리가티닙, CUDC-101, 엘로티닙, 제피티닙, 아이코티닙, 라파티닙, 사피티닙, 반데타닙, 바리티닙, 테세바티닙 및 티르포스틴 AG 1478이다. 또 다른 실시형태에서, 가역적 EGFR TKI는 AZD3759 또는 MTKi-327 (JNJ-26483327)이다. 일부 실시형태에서, EGFR TKI의 가역적 억제제는 엘로티닙 또는 라파티닙이 아니다.
또 다른 실시형태에서, EGFR 억제제는 비가역적 EGFR TKI이다. 추가의 실시형태에서, 비가역적 EGFR 억제제는, 예를 들어, 아파티닙, 올무티닙 (HM61713), 카네르티닙, CL-387785 (EKI-785), CNX-2006, 다코미티닙, 나쿠오티닙 (ASP8273), 네라티닙, 오시메르티닙, PD168393, 펠리티닙, 포지오티닙, 로실레티닙, TAK285 및 WZ4002이다. 또 다른 실시형태에서, 비가역적 EGFR TKI는, 예를 들어, 알리티닙 (ALS-1306; AST-1306), AV-412 (MP-412), 나자르티닙 (EGF816) 및 피로티닙이다.
또 다른 실시형태에서, EGFR 억제제는 EGFR에 대한 항체, 예를 들어, 세툭시맙 (Erbitux®) 및 파니투무맙 (Vectibix®)이다.
또 다른 실시형태에서, 치료되는 신생물은 암, 예를 들어, 담관암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 신장암, 두경부암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암 및 자궁암이다. 추가의 실시형태에서, 암은 비-소세포 폐암이다. 추가의 실시형태에서, 암은 원발성 또는 전이성이다. 추가의 실시형태에서, 암은 실시예에서 나타낸 세포주 유형에 의해 제시되는 유형의 암이다. 일부 실시형태에서, 암을 앓고 있는 대상체는 암 및/또는 특정 EGFR TKI에 대한 내성의 위험 증가와 관련된 EGFR 유전자에서의 돌연변이를 보유한다.
본 명세서에 기재된 실시형태는 예시적인 것이며, 추가의 조합 성분, 투여 경로 및 순서, 환자 유형 (이전에 치료되지 않았거나 이전에 치료되었는지 여부, 동반 병태의 부재 또는 존재, 연령 등) 또는 환자의 질병의 단계, EGFR 억제제의 유형 등에 관해서 제한하려는 것은 아니다.
도 1은 진핵 세포의 유사분열 주기의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 이용가능한 항암 치료제가 작용하는 것으로 믿어지는 세포 주기의 단계를 나타내기 위해 표기된 진핵 암 세포의 유사분열 주기의 개략도를 도시한 것이다.
도 3은 HCC827 세포의 성장에 대한 엘로티닙과 화합물 I-5 (0, 2.5 및 5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 4는 PC9 세포의 성장에 대한 엘로티닙과 화합물 I-5 (0, 2.5 및 5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 5는 A549 세포의 성장에 대한 엘로티닙과 화합물 I-7 (0, 3 및 6 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 6은 PANC1 세포의 성장에 대한 엘로티닙과 화합물 I-5 (0, 2.5 및 5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 7은 MiaPaCa-2 세포의 성장에 대한 엘로티닙과 화합물 I-5 (0, 2.5 및 5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 8은 H1975 세포의 성장에 대한 아파티닙과 화합물 I-7 (0, 2 및 4 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 9는 HCC827 세포의 성장에 대한 아파티닙과 화합물 I-7 (0, 3 및 6 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 10은 PC9 세포의 성장에 대한 아파티닙과 화합물 I-7 (0, 3 및 6 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 11은 A549 세포의 성장에 대한 아파티닙과 화합물 I-7 (0, 3 및 6 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 12는 PANC1 세포의 성장에 대한 아파티닙과 화합물 I-7 (0, 3 및 6 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 13은 H1975 세포의 성장에 대한 오시메르티닙과 화합물 I-7 (0, 2 및 4 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 14는 PANC1 세포의 성장에 대한 오시메르티닙과 화합물 I-7 (0, 2 및 4 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 15는 패널 A: FBS- 배지; 패널 B: FBS+ 배지; 패널 C: 5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS+ 배지; 패널 D: 18 nM 오시메르티닙을 함유하는 FBS+ 배지; 패널 E: 5 μM 화합물 I-7 및 18 nM 오시메르티닙을 함유하는 FBS+ 배지에서 24시간 동안 항온처리된 H1975 세포의 세포 주기 분포에 대한 FACS 분석을 도시한 것이다.
도 16은 패널 A: FBS- 배지에서의 48시간; 패널 B: FBS- 배지에서의 24시간 후, 정규 FBS+ 배지에서의 24시간 동안 방출; 패널 C: FBS- 배지에서의 24시간 후, 5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간 동안 방출; 패널 D: FBS- 배지에서의 24시간 후, 18 nM 오시메르티닙을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간 동안 방출; 패널 E: FBS- 배지에서의 24시간 후, 18 nM 오시메르티닙 및 5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간 동안 방출에서 항온처리된 H1975 세포의 세포 주기 분포에 대한 FACS 분석을 도시한 것이다.
도 17은 H1975 세포의 성장에 대한 로실레티닙과 화합물 I-5 (0, 2.5 및 5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 18은 PANC1 세포의 성장에 대한 로실레티닙과 화합물 I-7 (0, 2 및 4 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 19는 패널 A: FBS- 배지에서의 24시간 후, FBS+ 배지에서의 24시간 동안 방출; 패널 B: FBS- 배지에서의 24시간 후, 5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS+ 배지에서의 24시간 동안 방출; 패널 C: FBS- 배지에서의 24시간 후, 80 nM 로실레티닙을 함유하는 FBS+ 배지에서의 24시간 동안 방출; 패널 D: FBS- 배지에서의 24시간 후, 80 nM 로실레티닙 및 5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS+ 배지에서의 24시간 동안 방출에서 항온처리된 H1975 세포의 세포 주기 분포에 대한 FACS 분석을 도시한 것이다.
도 20은 로실레티닙, 오시메르티닙, 다코미티닙 및 아파티닙으로 24시간 처리한 후, H1975 세포에서 DYRK1B, 인산화된 Y1068-EGFR, 전체 EGFR 및 β-액틴의 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다.
도 21은 H1975 세포의 성장에 대한 다코미티닙과 화합물 I-5 (0, 2.5 및 5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 22는 PANC1 세포의 성장에 대한 다코미티닙과 화합물 I-7 (0, 2 및 4 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 23은 SW620 세포의 세포 주기 분포의 DNA 함량에 의한 FACS 분석을 도시한 것이다. 세포들은 패널 A: FBS- 배지에서의 24시간; 패널 B: 2.5 μM AZ191을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간; 패널 C: 5 μM AZ191을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간; 패널 D: 10 μM AZ191을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간에서 항온처리하였다.
도 24는 SW620 세포의 세포 주기 분포의 DNA 함량에 의한 FACS 분석을 도시한 것이다. 세포들은 패널 A: DMSO 대조군을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간; 패널 B: 1.25 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간; 패널 C: 2.5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간; 패널 D: 5 μM 화합물 I-7을 함유하는 FBS- 배지에서의 24시간에서 항온처리하였다.
도 25는 H1975 세포의 3D 세포 배양 (타원체)에 대한 아파티닙과 화합물 I-7 (0 및 2.5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다.
도 26은 H1975 세포의 3D 세포 배양 (타원체)에 대한 오시메르티닙과 화합물 I-7 (0 및 2.5 μM)의 조합의 효과를 도시한 것이다. 타원체들은 패널 A: FBS+ 배지에서; 패널 B: FBS- 배지에서 다양한 농도의 오시메르티닙으로 처리하였다.
용어 해설
본 발명에서, "알킬" 그룹은 달리 명시되지 않는다면 1개 내지 8개의 탄소 원자 (C1-8 알킬 그룹), 특히, 1개 내지 6개, 또는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는, 포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 그룹이다. 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹의 예로는 메틸, 에틸, 프로필 (예를 들어, n-프로필, 이소-프로필), 부틸 (예를 들어, 3차-부틸, 2차-부틸, n-부틸), 펜틸 (예를 들어, 네오-펜틸), 헥실 (예를 들어, n-헥실), 2-메틸부틸, 2-메틸펜틸 및 이들의 다른 이성질체 형태가 포함된다. 알킬 그룹은 치환되지 않거나, 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 그룹으로 치환될 수 있다.
본 발명에서, "알케닐" 그룹은, (달리 명시되지 않는다면) 2개 내지 8개의 탄소 원자를 포함하는, 적어도 하나의 이중 탄소-탄소 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 그룹이다. 2개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알케닐의 예로는 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐 및 이들의 이성질체 형태가 있다. 알케닐 그룹은 치환되지 않거나, 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 그룹으로 치환될 수 있다.
본 발명에서, "알키닐" 그룹은 2개 내지 8개의 탄소 원자를 포함하는, 적어도 하나의 삼중 탄소-탄소 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 그룹이다. 알키닐 그룹은 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 그룹으로 치환될 수 있다.
본 발명에서, "아릴" 그룹은 5개 내지 14개의 탄소 원자를 포함하는 방향족 탄화수소 환이다. 가장 바람직한 아릴 그룹은 모노- 또는 바이-사이클릭이며, 6개 내지 14개의 탄소 원자, 예를 들어, 페닐, 알파-나프틸, 3-나프틸, 안트라세닐, 바람직하게는 페닐을 포함한다. "아릴" 그룹은 또한 적어도 또 다른 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹에 융합된 아릴 환을 포함하는 바이사이클 또는 트리사이클, 예를 들어, 벤조디옥솔란, 벤조디옥산, 디하이드로벤조푸란 또는 벤즈이미다졸을 포함한다. 아릴 그룹은 치환되지 않거나, 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)의 그룹으로 치환될 수 있다. 또한, 아릴 그룹은, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자(들)를 함유할 수 있는 5원 및 6원 고리를 형성할 수 있는 인접한 치환체로 치환될 수 있다.
본 발명에서, "할로겐 원자" 또는 "할로"는 Cl, Br, F 또는 I 원자이다.
본 발명에서, "알콕실" 그룹은 산소 원자를 통해 분자의 나머지에 연결된 알킬 그룹, 즉, 화학식 O-알킬이다.
본 발명에서, "아미노" 그룹은 NH2, NH-알킬 또는 N(알킬)2 그룹이다.
본 발명에서, "헤테로아릴" 그룹은, 환이 적어도 하나의 헤테로 원자, 예를 들어, N, O 또는 S 원자에 의해 중단되는 아릴 그룹, 예를 들어, 티오펜 또는 피리딘이다. 헤테로아릴 그룹은 치환되지 않거나, 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)의 그룹으로 치환될 수 있다. 또한, 헤테로아릴 그룹은, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자(들)를 함유할 수 있는 5원 및 6원 고리를 형성할 수 있는 인접한 치환체로 치환될 수 있다.
본 발명에서, "사이클로알킬"은 바람직하게는 3개 내지 14개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 하나의 환을 형성하는 포화 알킬 그룹, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 나타낸다. 사이클로알킬 그룹은 치환되지 않거나, 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)의 그룹으로 치환될 수 있다. 또한, 사이클로알킬 그룹은, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자(들)를 함유할 수 있는 5원 및 6원 고리를 형성할 수 있는 인접한 치환체로 치환될 수 있다.
본 발명에서, "헤테로사이클로알킬" 그룹은 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 사이클로알킬 그룹, 예를 들어, 피롤리딘, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로푸란, 피페리딘, 피란, 디옥신, 모르폴린 또는 피페라진이다. 헤테로사이클로알킬 그룹은 특히 4개 내지 14개의 탄소 원자, 예를 들어, 모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로피라닐, 디티올라닐을 포함할 수 있다. 헤테로사이클로알킬 그룹은 치환되지 않거나, 할로겐 원자, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕실, 알케닐, 알키닐, CN, 니트로 및 아미노 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 그룹으로 치환될 수 있다. 또한, 헤테로사이클로알킬 그룹은, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자(들)를 함유할 수 있는 5원 및 6원 고리를 형성할 수 있는 인접한 치환체로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "신생물"은 종양 형성으로부터 발생하는 비정상 조직 덩어리를 의미한다. "종양 형성"은 세포의 비정상 증식 과정을 의미한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 신생물은 고형암 또는 그렇지 않으면 조혈암이다. 종양 형성은 양성, 전암성 또는 악성일 수 있다. 신생물이라는 용어는 포유류 암, 일부 실시형태에서는 사람 암, 및 임의 조직의 암종, 육종, 모세포종 (예를 들어, 선암종, 편평 세포 암종, 골육종 등), 배아 세포 종양, 신경아교 세포 종양, 림프종, 백혈병, 예를 들어, 고형암 및 림프성 암, 신장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 방광암, 결장암, 난소암, 전립선암, 직장암, 췌장암, 위암, 뇌암, 두경부암, 피부암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 식도암, 갑상선암, 간암, 담관암, 골 및 연골 조직의 암, 예를 들어, 비-호지킨 림프종 (예를 들어, 버킷, 소세포 및 대세포 림프종) 및 호지킨 림프종, 백혈병, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군을 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다," "치료하는" 또는 "치료"란, 의학적 병태가 임상적으로 허용되는 표준에 따라 개선되는 정도까지 의학적 병태 (예를 들어, 암 )에 대응하는 것을 의미한다. 암의 개선은 다음을 포함할 수 있다: 1) 종양 성장의 속도 감소 (종양 성장 억제), 2) 종양 수축 (퇴행), 3) 관해 (부분 또는 전체와 무관함), 4) 전이의 감소 및 5) 무진행 생존율의 연장 또는 재발의 지연 또는 제거. 본 발명의 특정 실시형태에서, 치료는 다음 결과 중의 하나 이상을 부분적으로 또는 실질적으로 달성하는 것을 포함한다: 암 덩어리 또는 체적, 또는 악성 세포 총수를 부분적으로 또는 완전하게 감소시키는 것; 고형암 또는 조혈암과 관련된 지표 또는 임상 증상을 개선 또는 향상시키는 것; 고형암 또는 조혈암의 진행을 지연, 억제 또는 저지하는 것; 또는 고형암 또는 조혈암의 발병 또는 진행을 부분적으로 또는 완전하게 지연, 억제 또는 저지하는 것. "치료"는 또한 치료하지 않은 예상 생존과 비교하여 또는 케어 치료의 표준과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
치료는 예방학적 또는 예방 치료를 포함한다. "예방학적 치료"란, 표적 장애의 임상 증상의 출현 또는 재출현 전에 그 발생, 중증도 또는 진행을 예방, 억제 또는 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"이란, 표적 장애에서의 목적하는 향상에 영향을 미치기에 치료학적으로 또는 예방학적으로 충분한 치료제 또는 치료제의 조합의 양을 의미한다. 유효량의 예로는 전형적으로는 단일 투여 용량 당 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중의 범위가 있으며, 이러한 용량은 1회 또는 일정 기간에 걸쳐 투여된다. 예시적인 범위는 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중이다. 다른 예에서, 범위는 단일 투여 용량 당 약 0.0001 mg/kg 내지 약 5 mg/kg일 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량은 단일 투여 용량 당 약 0.01 mg/ kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 또는 단일 투여 용량 당 0.01 mg/kg 체중 내지 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg 또는 40 mg/kg 체중의 범위이다. 알려진 임상 용도의 작용제의 경우, 유효 용량의 예로는 징후의 치료에 대한 규제 기관의 승인을 받은 양이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"란, 포유 동물, 예를 들어, 사람을 의미하지만, 수의학적 치료가 필요한 동물, 예를 들어, 애완 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등 ), 가축 (예를 들어, 암소, 양, 돼지, 말 등 ) 및 실험 동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 기니피크 등 )을 또한 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료제"란, 작용 메커니즘과 무관하게 소형 분자, 펩타이드, 항체 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 세포독성제, 세포 증식 억제제 또는 표적화제를 비롯한, 암 치료에 사용되거나 암 치료에 사용하기 위해 고려되거나 조사되는 임의의 화학 분자를 의미한다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적" 또는 "치료제"란, 활성 약제 성분 (API) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 수화물 (용매화물), 또는 제형화되는 치료제를 함유하는 의약품을 지칭하고, API는 무정형 또는 결정질이며 다형체 형태이다. 제형은 투여가능한 제형 (의약품)을 제조하기 위해 부형제 및/또는 전달 비히클과 배합된 활성 약제 성분 (API, 약물) 또는 성분들 (API)의 조합을 의미한다.
생물학적 약물, 예를 들어, 세툭시맙에 대한 언급은 통상의 기술자 및 규제 기관에 의해 바이오시밀러로서 생산되고 특성화되고 정의되는 생물학적 약물 또는 이의 바이오시밀러를 함유하는 임의의 의약품을 의미한다.
본 발명의 치료제는 일반적으로 표준 약제학적 실무와 관련하여 약제 학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins]에 기재되어 있음). 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서에서 정의된 약제학적 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "억제제"는 효소의 활성을 감소시키는 임의의 조성물을 의미한다. 억제제의 예로는 화학 분자가 있다. 억제제의 효능의 척도는 이의 "50% 억제 농도" (IC50)이다. IC50 농도 또는 IC50 값은, 효소 활성의 50%가 억제제에 의해 억제되는 억제제의 농도이다. 예를 들어, 키나아제 억제제의 IC50 값의 측정 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, HotSpot™ 키나아제 검정 기술 (Reaction Biology Corporation, Malvern, PA, www.reactionbiology.com)과 같은 직접적 및 간접적 기능 검정법, 또는 KINOMEscan® (DiscoverX Corporation, Freemont, CA, www.discoverx.com)과 같은 경쟁 결합 검정법을 포함한다.
세포주에 대한 치료제의 효능의 측정은 이의 "50% 유효 농도" (EC50)이다. EC50 값은, 예를 들어, 50% 세포 성장 억제 또는 50% 세포 생존능 감소와 같은 최대 절반 반응 (half-maximal response)을 생성하는 약물의 농도이다. 예를 들어, 키나아제 억제제의 IC50 값의 측정 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정지" 또는 "정지 상태"란, 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 세포 주기의 G0 상태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제"란, 세포 집단 내의 정지 암 세포의 분율을 감소시키거나 그렇지 않으면 집단 내에서 정지 암 세포의 분율의 증가를 초래하는 조건하에 이러한 증가를 완전히 또는 실질적으로 방지하는 분자를 지칭한다.
"정지 신생 세포"는 "정지 암 세포"로서 교대로 지칭되며, 세포 주기의 정지 상태 또는 G0 상태로 존재하는 암 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "정지 신생 세포의 분율" 또는 "정지 암 세포의 분율"은 세포 주기 중 G0 상태로 존재하는 암 세포 집단의 부분을 의미한다. 정지 신생 세포의 분율을 결정하는 것은 세포 주기의 단계 내의 그 구성 세포의 분포에 의해 세포 집단을 특성화하는 것을 포함한다. G0 상태에 있는 세포 (즉, 정지 신생 세포)의 분율은 전체 세포 집단에 대해 정량화된다. 분율은 전체 세포 집단의 백분율 (즉, (세포 집단 내의 전체 세포로 나눈 정지 세포의 수)에 100을 곱한 값)로서 표현될 수 있다. 세포 주기의 단계 내의 그 구성 세포의 분포에 의한 세포 집단의 특성화는 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 기술에 의해 달성될 수 있으며, 유세포 측정 방법, 예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 주기 내의 DNA 및/또는 RNA 함량 분포에 의한 분석을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "EGFR 억제제", "EGFR 타이로신 키나아제 억제제" 및 "EGFR TK 억제제"는 동등하며, 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예시적인 EGFR 억제제는 가역적 및 비가역적 소분자 억제제를 모두 포함한다. 예를 들어, 가역적 EGFR 억제제는 브리가티닙, 엘로티닙, 제피티닙, 아이코티닙, 라파티닙, MTKi-327 (JNJ-26483327), 사피티닙, 반데타닙 및 바리티닙을 포함하며, 비가역적 EGFR 억제제는 아파티닙, 카네르티닙, 다코미티닙, 네라티닙, 오시메르티닙, 펠리티닙, TAK285, 로실레티닙 및 WZ4002를 포함한다.
본 발명은 신생물을 치료하기 위한 조성물 및 방법, 특히, 특정 신생물 병태에 대해 효과적인 다른 치료, 특히, EGFR 억제 치료제 항암 치료와 조합된 치료제에 의해 정지 암 세포를 표적으로 함으로써 신생물을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명은 치료학적 유효량의 (a) 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제; 및 (b) EGFR 억제제인 제2 치료제를 필요로 하는 대상체에게 이를 투여하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 두 치료제가 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있는 신생물의 치료 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 신생물은 시험관내 또는 생체내 암 또는 암 세포의 집단이다. 일부 실시형태에서, 치료 중인 대상체는 암 (예를 들어, 전이성 또는 전-전이성)으로 진단된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암에 대한 일차 요법으로 이전에 치료받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이차 요법 및/또는 다른 요법으로 이전에 치료받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 방사선 요법으로 치료받거나 치료받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는, 예를 들어, 종양을 절제하거나 제거하기 위해 수술 치료를 받았다. 다른 실시형태에서, 대상체의 신생물은 재발되었다. 일부 실시형태에서, 대상체는 2종 이상의 EGFR 억제제로 순차적으로 또는 동시에 치료받거나 치료받았다.
일부 실시형태에서, 조합 치료는 생존율 증가, 중증도 감소, 재발의 지연 또는 제거, 또는 일차 치료 (즉, EGFR 억제제)의 부작용 감소와 같은 개선된 결과를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 치료제 단독 치료와 비교하여 조합의 일부로서 투여될 때 보다 낮은 투여량 및/또는 보다 짧은 기간 동안 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, EGFR 억제제의 EC50 값은, 예를 들어, 세포 기반 검정법으로 측정될 때, 단일 치료제로서의 EGFR 억제제에 의한 동일 치료와 비교하여, 조합 치료에서 적어도 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 더 낮다. 일부 실시형태에서, 조합 요법은 FACS 검정법에 의해, 예를 들어, 서브-G0기 세포의 분율로 측정될 때, 어느 하나의 치료제 단독과 비교하여 치료된 집단에서 세포 사멸 세포의 분율을 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 정지 암 세포의 분율은, 예를 들어, 세포 기반 검정법으로 측정될 때, 단일 치료제로서의 EGFR 억제제에 의한 동일 치료와 비교하여, 조합 치료에서 적어도 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 이상 감소한다.
하나의 실시형태에서, 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 DYRK1 억제제이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 DYRK1 키나아제, 즉, DYRK1A 또는 DYRK1B (시험관내 또는 생체내)의 활성을, 예를 들어, 생화학 검정법에서 <100 nM, <90 nM, <80 nM, <70 nM, <60 nM, <50 nM, <40 nM, <30 nM, <20 nM, <10 nM, <5 nM 이하의 IC50으로 억제하는 화합물이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 그렇지 않으면 이러한 억제제의 부재하에 발견되는 종양 또는 집단 내의 정지 암 세포 (시험관내 또는 생체내)의 분율을, 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 이상 감소시킨다.
일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 DYRK1A와 DYRK1B 둘 다를 억제한다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 1000, 100, 50, 25, 10 내지 1의 DYRK1A IC50에 대한 DYRK1B IC50의 비율로 DYRK1A에 대해 선택적이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 1000, 100, 50, 25, 10 내지 1의 DYRK1B IC50에 대한 DYRK1A IC50의 비율로 DYRK1B에 대해 선택적이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 IC50 값의 비율로 측정될 때 DYRK2 및/또는 DYRK3 및/또는 DYRK4와 비교하여 DYRK1에 대해 적어도 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 선택적이다. 일부 실시형태에서, DYRK1 억제제는 IC50 값의 비율로 측정될 때, 예를 들어, CDK2와 같은 사이클린 의존성 키나아제 (CDK)와 비교하여, DYRK1에 대해 적어도 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배 선택적이다.
공지된 DYRK1 억제제의 예로는 AZ191, DYRKi, 하르민, ID-8, 류세틴 L41, NCGC00185981, INDY, ProINDY, TC-S 7004 및 TG003이 포함된다. 적어도 하나의 공지된 DYRK1 억제제인 TC-S 7004 (US 2012/0184562)는 시험관내에서 정지 암 세포에 대해 효과적인 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Ewton DZ, Hu J, Vilenchik M, Deng X, Luk KC, Polonskaia A, Hoffman AF, Zipf K, Boylan JF, and Friedman EA. (2011) Inactivation of MIRK/DYRK1B kinase targets quiescent pancreatic cancer cells. Molecular Cancer Therapeutics 10: 2104-2114] 참조).
Figure 112018113353212-pct00003
하나의 실시형태에서, DYRK1 억제제는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
Figure 112018113353212-pct00004
상기 화학식 I에서,
R1은 치환되거나 비치환된 C1-8 알킬, 치환되거나 비치환된 페닐, 또는 치환되거나 비치환된 벤질이고;
R2는 할로, CN, NO2, NHC(O)C1-4 알킬, C1-4 알킬, OH 및 OC1-4 알킬로부터 독립적으로 선택된 4개 이하의 그룹에 의해 임의로 치환된 페닐이며, 여기서, 2개의 인접 그룹 및 이들의 개입 탄소 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하는 5원 및 6원 고리를 형성할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 하기로부터 선택된다:
Figure 112018113353212-pct00005
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 (c) 대상체에게 또 다른 항암 요법, 예를 들어, 방사선 요법 또는 다른 암 치료를 투여하는 것을 추가로 제공한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 치료학적 유효량의 (a) 화학식 I의 치료제; (b) EGFR 억제제; 및 (c) 방사선 요법을 이의 투여가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 각각의 요법은 순차적으로 또는 동시에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체는 먼저 방사선 요법으로 치료받으며, 대상체는 화학식 I의 치료제 단독 또는 EGFR 억제제와 조합하여 투여받는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 (a) 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제, (b) EGFR 억제제 및 임의로 (c) 방사선 요법을 함께 투여받는다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 야생형 또는 변이체 또는 절두된 EGFR 타이로신 키나아제 (시험관내 또는 생체내)의 활성을, 예를 들어, 생화학 검정법에서 <100 nM, <90 nM, <80 nM, <70 nM, <60 nM, <50 nM, <40 nM, <30 nM, <20 nM, <10 nM, <5 nM 이하의 IC50으로 억제하는 화합물이다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 및 Her 4 (ErbB-4)와 비교하여 EGFR에 대해 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 1000배 선택적이다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 또한 HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 및 Her 4 (ErbB-4) 중 하나 이상을, 생화학 검정법에서 <100 nM, <90 nM, <80 nM, <70 nM, <60 nM, <50 nM, <40 nM, <30 nM, <20 nM, <10 nM, <5 nM 이하의 IC50 값으로 억제한다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 또한 히스톤 데아세틸라아제 (HDAC), 예를 들어, 클래스 I, 클래스 II, 클래스 III 및/또는 클래스 IV의 HDAC 중 하나 이상을, 생화학 검정법에서 <100 nM, <90 nM, <80 nM, <70 nM, <60 nM <50 nM, <40 nM, <30 nM, <20 nM, <10 nM, <5 nM 이하의 IC50 값으로 억제한다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 야생형 EGFR과 비교하여 돌연변이된 EGFR, 예를 들어, T790M 돌연변이를 갖는 EGFR에 대해 선택적이다. 일부 실시형태에서, EGFR 억제제는 암 치료에 승인된 모든 이러한 화합물들, 암 치료를 위해 임상 시험 중인 화합물들, 그렇지 않으면 포유동물 대상체 (예를 들어, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 사람)에서 암을 치료하는데 효능을 입증하는 화합물들, 및 시험관내에서 신생 세포에 대해 효능을 입증하는 화합물들을 포함하지만 이들에 제한되지 않는, 신생물을 치료하거나 예방하는데 효과적인 EGFR 억제제이다. 다수의 이러한 화합물들은 공지되어 있다.
EGFR 억제제는, 예를 들어, 소형 분자 또는 항-EGFR 항체일 수 있다.
하나의 실시형태에서, EGFR 억제제는 가역적 EGFR 타이로신 키나아제 억제제 (EGFR TKI)이다. 추가의 실시형태에서, 가역적 EGFR TKI는, 예를 들어, 브리가티닙, CUDC-101, 엘로티닙, 제피티닙, 아이코티닙, 라파티닙, 사피티닙, 반데타닙, 바리티닙, 테세바티닙 및 티르포스틴 AG 1478이다. 또 다른 실시형태에서, 가역적 EGFR TKI는 AZD3759 또는 MTKi-327 (JNJ-26483327)이다. 일부 실시형태에서, 가역적 EGFR TKI는 엘로티닙 또는 라파티닙이 아니다.
또 다른 실시형태에서, EGFR 억제제는 비가역적 EGFR TKI이다. 추가의 실시형태에서, 비가역적 EGFR 억제제는, 예를 들어, 아파티닙, 올무티닙 (HM61713), 카네르티닙, CL-387785 (EKI-785), CNX-2006, 다코미티닙, 나쿠오티닙 (ASP8273), 네라티닙, 오시메르티닙, PD168393, 펠리티닙, 포지오티닙, 로실레티닙, TAK285 및 WZ4002이다. 또 다른 실시형태에서, 비가역적 EGFR TKI는, 예를 들어, 알리티닙 (ALS-1306; AST-1306), AV-412 (MP-412), 나자르티닙 (EGF816) 및 피로티닙이다.
또 다른 실시형태에서, EGFR 억제제는 EGFR에 대한 항체, 예를 들어, 세툭시맙 (Erbitux®) 및 파니투무맙 (Vectibix®)이다.
또 다른 실시형태에서, 치료되는 신생물은 암, 예를 들어, 담관암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 신장암, 두경부암, 백혈병, 간암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암 (예를 들어, 흑색종), 고환암, 갑상선암 및 자궁암이다. 추가의 실시형태에서, 암은 비-소세포 폐암, 췌장암 및 두경부암이다. 추가의 실시형태에서, 암은 원발성 또는 전이성이다. 추가의 실시형태에서, 암은 실시예에서 나타낸 세포주 유형에 의해 제시되는 유형의 암이다. 일부 실시형태에서, 암을 앓고 있는 대상체는 암 및/또는 특정 EGFR TKI에 대한 내성의 위험 증가와 관련된 EGFR 유전자에서의 돌연변이를 보유한다.
본 명세서에 기재된 실시형태는 예시적인 것이며, 추가의 조합 성분, 투여 경로 및 순서, 환자 유형 (이전에 치료되지 않았거나 이전에 치료되었는지 여부, 동반 병태의 부재 또는 존재, 연령, 성별 등) 또는 환자의 질병의 단계, EGFR 억제제의 유형 등에 관해서 제한하려는 것은 아니다.
EGFR 억제제는 당해 분야에 공지되어 있다 (문헌 [Lee CC, et al. (2014) Small-molecule EGFR tyrosine kinase inhibitors for the treatment of cancer, Expert Opinion on Investigational Drugs 23, 1333-1348] 참조). 이들 약물은, 암이 EGFR 활성화 돌연변이 또는 다른 EGFR 이상 (과발현 등)을 갖는 환자, 가장 중요하게는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 뿐만 아니라 췌장암, 유방암 및 두경부암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용된다. 임상적으로 사용되는 EGFR 억제제는 특히 무진행 생존율의 관점에서 환자에게 상당한 이점을 제공한다. 그러나, 암이 EGFR 억제제의 초기 치료에 반응하는 대부분의 환자는 1~2년이라는 짧은 기간 내에 재발한다. 또한, 암은 초기에 효과적인 치료에 내성이 있게 된다. EGFR 단백질에서의 돌연변이는 이러한 내성의 일부를 설명하며, 돌연변이된 EGFR, 특히, T790M 돌연변이를 표적으로 하는 새로운 EGFR 억제제가 이용가능하게 되었다.
최근, 가역적 EGFR 억제제인 엘로티닙 또는 라파티닙에 대한 PC9 사람 비-소세포 폐암 세포의 노출은 약리학적 정지, 즉, G0에서 세포 분율의 유의한 증가를 유발하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Tyson DR, Garbett SP, Frick PL, et al. (2012) Fractional proliferation: a method to deconvolve cell population dynamics from single-cell data, Nature Methods 9, 923-928] 참조). 시험관내에서, EGFR TK 억제제에 과민성인 PC9 세포의 엘로티닙 치료에 대한 항-증식성 반응은 주로 세포의 정지 상태로의 진입에 의한 것이며, 세포 사멸에 의한 것이 아니다.
아닐리노-퀴나졸린 또는 아닐리노-피리미딘 스캐폴드에 기초한 비가역적 억제제를 비롯한, 2세대 및 3세대 EGFR TKI에 대한 상이한 암 세포주의 노출은 G0 분율에서 큰 증가를 초래하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, G0 (정지 세포)에서 세포의 증가는 EGFR 타이로신 키나아제 억제제의 일반적인 특성이며, 기대하지 않고 예기치 않은 이전에 보고된 소수의 구체적인 예에 제한되지 않는다. EGFR TKI에 대한 노출시 G0에서 세포 집단의 증가는 예기치 않은 관찰로 혈청 기아에 의해 유도된 것보다 더 두드러졌다. 결과적으로, EGFR TKI는 약리학적 정지를 유도한다. 이러한 세포 증식 억제 효과는 EGFR 억제제의 일시적인 암 관해 후 재발에 대한 임상적 관찰을 적어도 부분적으로 설명할 수 있다.
G0 상태는 유전자 발현의 특정 프로그램에 의해 유지된다. DYRK1A 및 DYRK1B와 같은 DYRK1 키나아제가 암 세포의 G0 상태 (정지 상태)에서 암 세포의 유지에 중요할 수 있다는 증거가 출현하고 있다.
DYRK1B/Mirk는 특정 정상 조직에서 생존과 분화를 매개하는 키나아제들의 Minibrain/DYRK 계열의 구성원이다. (문헌 [Kentrup H, Becker W, Heukelbach J, Wilmes A, Schurmann A, Huppertz C, Kainulainen H, and Joost HG (1996) Dyrk, a dual specificity protein kinase with unique structural features whose activity is dependent on tyrosine residues between subdomains VII and VIII, Journal of Biological Chemistry 271, 3488-3495] 및 [Becker W, Weber Y, Wetzel K, Eirmbter K, Tejedor FJ, and Joost HG (1998) Sequence characteristics, subcellular localization, and substrate specificity of DYRK-related kinases, a novel family of dual specificity protein kinases, Journal of Biological Chemistry 273, 25893-25902] 참조). DYRK1B는 골격근 세포 및 고환에서 검출가능한 수준으로 발현된다. DYRK1B의 넉아웃 (knockout)은 심지어 발달 근육에서도 마우스에서 명백한 비정상적인 표현형을 나타내지 않으므로, DYRK1B는 정상적인 발달을 위한 필수 유전자가 아닌 것을 시사한다. 정상 섬유아세포가 DYRK1B 키나아제 수준의 20배 고갈 후에도 생존에 변화를 나타내지 않았다는 것은 이러한 해석을 뒷받침한다. 따라서, DYRK1B는 정상 세포의 생존을 위한 필수 유전자인 것으로 보이지는 않지만, 암 세포를 정지 상태로 유지함으로써 DYRK1B가 생존을 매개하는 것으로 여겨지는 특정 악성 암 세포에서 상향조절된다는 증거가 있다. 이러한 특이한 특징은 DYRK1B가 치료적 개입, 특히, 정지 암 세포에 대한 직접적인 항암 요법을 위한 매력적인 표적일 수 있다는 것을 시사한다.
개시된 조합 및 방법은 각각의 개별 성분 또는 기존의 단일 및 조합 치료의 사용에 비해 용어 해설에서 정의된 개선 중 하나 이상을 제공 할 수 있다. 또한, 개시된 조합 및 방법은 치료제 및 방사선의 투여량 및/또는 투여 빈도의 감소를 허용하여 개별 성분 또는 기존의 단일 및 조합 치료를 사용하여 가능한 것에 비해 치료 결과와 동일한 개선을 달성할 수 있다.
개시된 조합은 상승적일 필요가 없거나, 심지어 EC50 값의 현저한 감소를 초래하여 EGFR 억제제의 단일 요법에 비해 치료의 유효성에서 현저한 개선을 가져올 필요도 없다. 상기에서 논의한 바와 같이, 정지 암 세포는 본질적으로 EGFR 억제제를 비롯한 항암 치료법에 덜 민감하고, 심지어 치료 후에 생존하는 작은 분율의 정지 세포도 재발을 초래할 수 있다. 결과적으로, 신생물 중의 내성 정지 세포 집단의 박멸은 EC50 값의 상승적 감소를 가져올 수 있거나 그렇지 않을 수도 있지만, 암 재발율 및 전이성 신생물의 출현에서 현저한 개선을 가져올 수 있다.
개시된 조합의 투여 경로 및 요법은 치료되는 신생물 상태, 신생물의 진행 정도, 대상체의 연령 및 신체 상태, 선택되는 정확한 조합 및 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여 요법은 시간 당 복수의 용량을 포함할 수 있으며, 치료는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 EGFR 억제제 전에 투여될 수 있다. 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 EGFR 억제제의 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 전에 투여될 수 있다. 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 EGFR 억제제와 동시에 (이에 수반하여) 투여될 수 있다. 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 EGFR 억제제의 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 후에 투여될 수 있다. 정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제 및/또는 EGFR 억제제는 방사선 또는 다른 요법 전에, 후에 또는 이에 수반하여 투여될 수 있다.
정지 암 세포에 대해 효과적인 치료제는 경구 (PO), 정맥내 (IV), 복강내 (IP), 피하 (SC), 종양내 (IT), 척수강내 또는 다른 투여 경로에 의해 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 매주 2회 (1주당 2회), 매주 1회, 격주 1회, 1개월당 1회 투여될 수 있다.
조합은 치료받은 적이 없는 (치료받지 않은) 대상체, 또는 일차, 이차, 삼차 또는 다른 요법, 방사선 치료에 의해 이전에 치료받거나 고형 종양의 수술적 절제 또는 축소를 겪은 대상체, 또는 암이 재발한 대상체, 또는 암이 비-전이성 또는 전이성인 대상체에게 투여될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 제한하고자 의도된 것이 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 본 개시 내용에 비추어, 개시되는 특정 재료에서 다수의 변화가 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1. 집단 내의 정지 암 세포 분율의 결정
다음 세포주를 ATCC로부터 입수하고 ATCC 권고에 따라 배양하였다: H1975 - L858R 및 T790M 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암 세포주; HCC827 - EGFR TK에서 E746-A750 결실을 갖는 비-소세포 폐암 세포주; PC9 - EGFR TK에서 E746-A750 결실을 갖는 비-소세포 폐암 세포주; A549 - 야생형 EGFR을 갖는 비-소세포 폐암 세포주; PANC1 - 췌장암 세포주; MiaPaCa-2 - 췌장암 세포주; 및 SW620 - 결장암 세포주. 이들 세포주의 세포 배양물을 96-웰 플레이트에 3×105 ~ 6×105 세포/웰로 씨딩하였으며, 플레이팅된 세포 수는 대략 50% 밀집도를 목표로 하는 세포 크기 및 증식 속도에 따라 달라진다. 씨딩 후, 가습 5% CO2 대기하에 37℃에서 세포를 항온처리하면서 24시간 동안 부착시키고, 이어서 동일한 조건하에 항온처리하는 목적하는 시간 (일반적으로 24시간) 동안 화합물로 처리하였다. 이어서, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 부유 세포와 함께 모으고, PBS로 세척하고, 70%의 빙냉 에탄올에서 밤새 고정시켰다. 아크리딘 오렌지 (AO) 염색을 위해, 고정된 세포를 빙냉 PBS로 1회 세척하고, PBS 100 μL 중에 재현탁시킨 후 투과성 용액 200 μL 및 AO 염색 용액 600 μL를 첨가하였다. 측정은 488 nm에서 여기를 위한 청색 레이저를 사용하는 Guava easyCyte HT 유세포 측정기 (EMD Millipore)로 수행하였으며, 526 nm에서의 AO-DNA 복합체 및 650 nm에서의 AO-RNA 복합체의 방출을 모니터링하였다. 버퍼의 완전한 프로토콜 및 구성은 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Darzynkiewicz Z,　Juan G,　and Srour EF (2004) Differential Staining of DNA and RNA (2004). Current Protocols in Cytometry, Chapter 7:Unit 7.3] 참조).
실시예 2. 2D 세포 배양에서 세포 생존능 검정을 위한 일반적인 절차
생존능 분석을 위해, 대략 50% 밀집도를 목표로 하는 세포 크기 및 증식 속도에 따라 세포를 96-웰 플레이트에 2×103 ~ 6×103 세포/웰로 씨딩하였다. 가습 5% CO2 대기하에 37℃에서 세포를 항온처리하면서 24시간 동안 부착시켰다. 처리는 적어도 6개의 상이한 농도의 화합물을 1:3 연속 희석법으로 사용하여 수행하였다. 결과를 판독하기 전에, 세포를 5% CO2 항온처리기에서 96시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 각각의 처리는 삼중으로 수행하였다. SpectraMAX Gemini 분광기 (Molecular Devices)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생존능 검정 (Promega, cat. # G7571)에 의해 결과를 분석하였다.
실시예 3. 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 엘로티닙의 조합
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, HCC827 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 엘로티닙의 최고 농도는 40 nM이었으며, 화합물 I-5의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. 엘로티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-5가 존재하지 않을 때 12.15 nM이었고, 화합물 I-5가 2 μM의 농도로 존재할 때 2.95 nM이었고, 화합물 I-5가 4 μM의 농도로 존재할 때 <0.1 nM이었다. 도 3을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PC9 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 엘로티닙의 최고 농도는 40 nM이었으며, 화합물 I-5의 농도는 각각 2 μM 및 4 μM이었다. 엘로티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-5가 존재하지 않을 때 17.3 nM이었고, 화합물 I-5가 2 μM의 농도로 존재할 때 9.3 nM이었고, 화합물 I-5가 4 μM의 농도로 존재할 때 3.7 nM이었다. 도 4를 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, A549 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 엘로티닙의 최고 농도는 10 μM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 각각 3 μM 및 6 μM이었다. 엘로티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 10.4 μM이었고, 화합물 I-7이 3 μM의 농도로 존재할 때 5.9 μM이었고, 화합물 I-7이 6 μM의 농도로 존재할 때 0.4 μM이었다. 도 5를 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PANC1 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 엘로티닙의 최고 농도는 30 μM이었으며, 화합물 I-5의 농도는 각각 2.5 μM 및 5 μM이었다. 엘로티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-5가 존재하지 않을 때 >30 μM이었고, 화합물 I-5가 2.5 μM의 농도로 존재할 때 >30 μM이었고, 화합물 I-5가 5 μM의 농도로 존재할 때 14 μM이었다. 도 6을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, MiaPaCa-2 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 엘로티닙의 최고 농도는 30 μM이었으며, 화합물 I-5의 농도는 각각 2.5 μM 및 5 μM이었다. 엘로티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-5가 존재하지 않을 때 >30 μM이었고, 화합물 I-5가 2.5 μM의 농도로 존재할 때 6.4 μM이었고, 화합물 I-5가 5 μM의 농도로 존재할 때 3.5 μM이었다. 도 7을 참조한다.
이들 실험에서, 가역적 EGFR 억제제 엘로티닙과 화합물 I-5의 조합은 HCC827, PC9 및 A549 비-소세포 폐암 세포주에 대한 엘로티닙의 현저한 세포독성 증가 (EC50 값의 감소)를 가져오는 것으로 입증되었다. 또한, PANC1 및 MiaPaCa-2 췌장암 세포주에 대한 세포독성의 현저한 증가 (보다 낮은 EC50 값)가 관찰되었다. 본 결과는 EGFR의 발현이 비교적으로 낮은 MiaPaCa-2 세포주에서 특히 예기치 않게 나타난다.
실시예 4. 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 아파티닙의 조합
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 아파티닙의 최고 농도는 500 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. 아파티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 89.4 nM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 25.2 nM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 8.2 nM이었다. 도 8을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, HCC827 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 아파티닙의 최고 농도는 50 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 3 μM 및 6 μM이었다. 아파티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 3.8 nM이었고, 화합물 I-7이 3 μM의 농도로 존재할 때 1.6 nM이었고, 화합물 I-7이 6 μM의 농도로 존재할 때 0.2 nM이었다. 도 9를 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PC9 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 아파티닙의 최고 농도는 5 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 4 μM 및 8 μM이었다. 아파티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 2.1 nM이었고, 화합물 I-7이 3 μM의 농도로 존재할 때 1.3 nM이었고, 화합물 I-7이 6 μM의 농도로 존재할 때 0.4 nM이었다. 도 10을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, A549 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 아파티닙의 최고 농도는 10 μM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 4 μM 및 8 μM이었다. 아파티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 4.7 μM이었고, 화합물 I-7이 3 μM의 농도로 존재할 때 2.6 μM이었고, 화합물 I-7이 6 μM의 농도로 존재할 때 1.0 μM이었다. 도 11을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PANC1 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 아파티닙의 최고 농도는 10 μM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. 아파티닙에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 1.9 μM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 1.8 μM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 1.5 μM이었다. 도 12를 참조한다.
본 실험에서, 비가역적 EGFR 억제제 아파티닙과 화합물 I-7의 조합은 H1975 세포 및 다른 비-소세포 폐암 세포 HCC827, PC9 및 A549에 대한 아파티닙의 현저한 세포독성 증가 (보다 낮은 EC50 값)를 가져오는 것으로 입증되었다. 또한, 아파티닙과 화합물 I-7의 조합은 PANC1 췌장암 세포에 대한 세포독성 증가를 가져오는 것으로 입증되었다. 본 최종 조합은 상승적일 수 없거나 EC50 값의 급격한 감소를 초래할 수 없지만, 그렇지 않으면 단일 요법 치료에서 살아남은 신생물에서 내성 정지 세포 집단을 근절시킴으로써 EGFR 억제제 단일 요법에 비해 치료의 유효성에서 현저한 개선을 가져올 수 있다.
실시예 5. 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 오시메르티닙의 조합
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 오시메르티닙의 최고 농도는 50 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 8.7 nM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 7.9 nM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 4.2 nM이었다. 도 13을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PANC1 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 오시메르티닙의 최고 농도는 20 μM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 5.3 μM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 4.6 μM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 4.5 μM이었다. 도 14를 참조한다.
본 실험에서, 비가역적 EGFR 억제제 오시메르티닙과 화합물 I-7의 조합은 H1975 세포에 대한 오시메르티닙의 현저한 세포독성 증가 (보다 낮은 EC50 값)를 가져오는 것으로 입증되었다. 또한, 오시메르티닙과 화합물 I-7의 조합은 PANC1 췌장암 세포에 대한 세포독성 증가를 가져오는 것으로 입증되었다. 본 최종 조합은 상승적일 수 없거나 EC50 값의 급격한 감소를 초래할 수 없지만, 그렇지 않으면 단일 요법 치료에서 살아남은 신생물에서 내성 정지 세포 집단을 근절시킴으로써 EGFR 억제제 단일 요법에 비해 치료의 유효성에서 현저한 개선을 가져올 수 있다.
실시예 6. 오시메르티닙 및 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 오시메르티닙의 조합의 세포독성 및 세포 주기 효과
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하고, 분석하였다. 상이한 농도의 오시메르티닙, 화합물 I-7, 또는 오시메르티닙과 화합물 I-7 둘 다가 존재할 때의 결과를 도 15 및 16에 나타낸다.
이들 실험에서, 오시메르티닙에 대한 H1975 세포의 노출이 세포 주기 분포에서 변화를 초래하여 오시메르티닙이 세포의 많은 분율을 정지 (G0) 상태로 유도할 때 혈청 기아 (FBS-)보다 훨씬 더 효과적인 것으로 입증되었다. 무혈청 배지 (FBS-) 및 정규 성장 배지 (FBS +)에서 항온처리된 정상 증식 H1975 세포의 세포 주기 분포는 비교를 위해 나타낸다. 오시메르티닙은, 오시메르티닙 처리 전에 G0에서 세포의 비율을 증가시키기 위해 세포를 정상 성장 배지 (FBS+)에서 예비 항온처리하거나 무혈청 (FBS-) 배지에서 예비 배양하였는지 여부와 무관하게, 세포 주기 분포의 변화를 초래하였다. 또한, 화합물 I-7과 오시메르티닙의 조합은 G0에서 세포의 분율을 감소시켰으며, 서브-G0 집단으로서 입증되고 생존능 검정에 의해 입증된 세포 사멸 세포의 현저한 증가로 기록된 바와 같이 이에 따른 세포독성을 강하게 증진시켰다. 이러한 효과는 세포가 성장 배지에서 또는 혈청 기아 조건하에서 예비 항온처리되었는지 여부와 무관하게 관찰되었다.
실시예 7. 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 로실레티닙의 조합
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 로실레티닙의 최고 농도는 500 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. 로실레티닙 억제에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 351 nM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 22.5 nM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 14.9 nM이었다. 도 17을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PANC1 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 로실레티닙의 최고 농도는 20 μM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 11.4 μM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 9.9 μM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 7.1 μM이었다. 도 18을 참조한다.
본 실험에서, 비가역적 EGFR 억제제 로실레티닙과 화합물 I-7의 조합은 H1975 세포에 대한 로실레티닙의 현저한 세포독성 증가를 초래하는 것으로 입증되었다. 또한, 오시메르티닙과 화합물 I-7의 조합은 PANC1 췌장암 세포에 대한 세포독성 증가 (보다 낮은 EC50 값)를 가져오는 것으로 입증되었다. 본 최종 조합은 상승적일 수 없거나 EC50 값의 급격한 감소를 초래할 수 없지만, 그렇지 않으면 단일 요법 치료에서 살아남은 신생물에서 내성 정지 세포 집단을 근절시킴으로써 EGFR 억제제 단일 요법에 비해 치료의 유효성에서 현저한 개선을 가져올 수 있다.
실시예 8. 로실레티닙 및 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 로실레티닙의 조합의 세포독성 및 세포 주기 효과
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하고, 분석하였다. 상이한 농도의 로실레티닙, 화합물 I-7, 또는 로실레티닙과 화합물 I-7 둘 다가 존재할 때의 결과를 도 19에 나타낸다.
본 실시예에서, H1975 세포를 혈청 기아 (FBS-) 조건 하에서 24시간 동안 항온처리하고, 이어서 처리하거나 처리하지 않고 정상 성장 배지 (FBS+)에 "방출"시켰다. 이들 조건하에서, 로실레티닙에 대한 노출은 정지 상태 (G0)에서 세포 분율의 현저한 증가를 초래하였다. 세포를 로실레티닙과 화합물 I-7의 조합으로 함께 처리할 때, 정지된 세포의 이러한 비율 증가는 관찰되지 않았으며, 로실레티닙의 세포독성에서의 큰 증가가 관찰되었는데, 이는 서브-G0 분율로 결정되는 세포 사멸 세포에서의 큰 증가로 판단된다.
실시예 9. H1975 세포의 EGFR 억제제 처리에 따른 DYRK1B의 유도
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포를 96-웰 플레이트에 5×105 ~ 9×105 세포/웰 (세포 크기 및 증식 속도에 따라 달라짐)로 씨딩하여 24시간 동안 부착시킨 후, 24시간 동안 화합물로 처리하고 수확하였다. 세포 신호전달 기술 웨스턴 블롯팅 프로토콜 (www.cellsignal.com)에 기재된 바와 같이, 통상의 기술을 사용하여 면역블로팅법을 수행하였다.
블롯팅에 사용된 항체는 세포 신호전달 기술 (CST)이다: DYRK1B (D40D1) 래빗 mAb #5672; EGF 수용체 (D38B1) XP® 래빗 mAb #4267; 포스포-EGF 수용체 (Tyr1068) (D7A5) XP® 래빗 mAb #3777; β-액틴 (13E5) 래빗 mAb #4970; 항-래빗 IgG, HRP-결합된 항체 #7074. 일차 항체 희석 버퍼 1X TBST (5% BSA (CST #9998) 함유)를 사용하였다. 검출을 위해, SignalFire™ ECL 시약 (CST #6883)을 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰되는 바와 같은, 로실레티닙, 오시메르티닙, 다코미티닙 및 아파티닙으로 24시간 처리한 후, H1975 세포에서 DYRK1B, ph-Y1068 EGFR, 전체 EGFR 및 β-액틴의 발현 수준을 도 20에 도시한다. DYRK1B 단백질의 발현은 FBS를 함유하는 정규 성장 배지 (FBS+) 또는 무혈청 배지 (FBS-)에서 항온처리된 미처리 세포에서의 발현과 비교하였다. EGFR 억제제 각각의 처리는 EGFR 인산화를 억제하고 또한 혈청 기아에 의해 생성된 것과 유사하거나 이보다 높은 DYRK1B 단백질의 발현을 유도하는 것으로 입증되었다.
실시예 10. 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 다코미티닙의 조합
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, H1975 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 다코미티닙의 최고 농도는 500 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. 다코미티닙 억제에 대한 EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 110.3 nM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 88.6 nM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 34.8 nM이었다. 도 21을 참조한다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, PANC1 세포를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에 사용된 다코미티닙의 최고 농도는 10 μM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2 μM 및 4 μM이었다. EC50 관측치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 11.4 μM이었고, 화합물 I-7이 2 μM의 농도로 존재할 때 9.9 μM이었고, 화합물 I-7이 4 μM의 농도로 존재할 때 7.1 μM이었다. 도 22를 참조한다.
본 실험에서, 비가역적 EGFR 억제제 다코미티닙과 화합물 I-7의 조합은 H1975 세포에 대한 다코미티닙의 현저한 세포독성 증가 (보다 낮은 EC50 값)를 가져오는 것으로 증명되었다. 또한, 오시메르티닙과 화합물 I-7의 조합은 PANC1 췌장암 세포에 대한 세포독성 증가를 가져오는 것으로 입증되었다. 본 최종 조합은 상승적일 수 없거나 EC50 값의 급격한 감소를 초래할 수 없지만, 그렇지 않으면 단일 요법 치료에서 살아남은 신생물에서 내성 정지 세포 집단을 근절시킴으로써 EGFR 억제제 단일 요법에 비해 치료의 유효성에서 현저한 개선을 가져올 수 있다.
실시예 11. AZ191의 세포 주기 효과 및 화합물 I-7과의 비교
실시예 1에 기재된 바와 같이, SW620 세포를 배양하고, 처리하였다. 프로피디움 요오드화물 (PI) 염색을 위해, 유세포 측정을 위한 Guava 세포 주기 시약 (EMD Millipore)과 함께 제공된 제조업자의 프로토콜을 따랐다. 측정은 535 nm에서 여기를 위한 녹색 레이저를 사용하는 Guava PCA-96 유세포 측정기 (EMD Millipore)로 수행하였으며, 617 nm에서 방출을 모니터링하였다.
상이한 농도의 AZ191이 존재할 때의 결과를 도 23에 나타낸다. 데이터는 이중 반복의 평균이다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, SW620 세포를 배양하고, 처리하고, 분석하였다. 프로피디움 요오드화물 (PI) 염색을 위해, 유세포 측정을 위한 Guava 세포 주기 시약 (EMD Millipore)과 함께 제공된 제조업자의 프로토콜을 따랐다. 측정은 535 nm에서 여기를 위한 녹색 레이저를 사용하는 Guava PCA-96 유세포 측정기 (EMD Millipore)로 수행하였으며, 617 nm에서 방출을 모니터링하였다.
상이한 농도의 화합물 I-7이 존재할 때의 결과를 도 24에 나타낸다. 데이터는 이중 반복의 평균이다.
이들 실험에서, SW620 세포는 상이한 농도의 AZ191 또는 화합물 I-7을 함유하는 FBS- 배지에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이들 조건하에서, AZ191에 대한 노출은, G0+G1기에서 관찰되지 않은 세포 분율의 변화에 근거하여, 정지 상태 (G0)에서 세포 분율의 감소를 초래하지 않았다. 동일한 조건하에서, 동일하거나 보다 낮은 농도의 화합물 I-7에 대한 노출은, G0+G1기에서 세포 분율의 현저한 감소에 근거하여, 정지 상태 (G0)에서 세포 분율의 현저한 감소를 초래하였다.
AZ191은 17 nM에서 DYRK1B를 억제한다 (문헌 [Ashford AL, Oxley D, Kettle J, Hudson K, Guichard S, Cook SJ, Lochhead PA (2014). A novel DYRK1B inhibitor AZ191 demonstrates that DYRK1B acts independently of GSK3beta to phosphorylate cyclin D1 at Thr(286), not Thr(288). Biochemical Journal 457, 43-56] 참조).
본 실험에서, 모든 DYRK1 억제제가 정지 암 세포에 대해 효과적이지는 않는 것으로 입증되었다.
실시예 12. 3D 세포 배양 (타원체)에서 세포 생존능 검정을 위한 일반적인 절차
3D 배양에서의 생존능 분석을 위해, 처리 시작시 400~600 μm 직경의 타원체 형성을 목표로 하는 세포 크기 및 증식 속도에 따라 세포를 96-웰 ULA (초저 부착) 플레이트 (Corning #4515)에 5×103 ~ 6×103 세포/웰로 씨딩하였다. 단단한 회전 타원체 형성을 가능하게 하는 가습 5% CO2 대기하에 37℃에서 세포를 2~3일 동안 (세포주에 따라 달라짐) 항온처리하였다. 처리를 위해, 각 웰로부터 50 μL의 배지를 제거하고, 화합물을 함유하는 새로운 배지로 대체하였다. 처리는 적어도 6개의 상이한 농도의 화합물을 1:3 연속 희석법으로 사용하여 수행하였다. 결과를 판독하기 전에, 세포를 5% CO2 항온처리기에서 4~10일의 기간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 처리 시간이 4일을 초과하면, 각 웰의 배지 70 μL를 4일 마다 시험 화합물을 함유하는 신선한 배지로 대체하였다. 각각의 처리는 이중으로 수행하였다. SpectraMAX Gemini 분광기 (Molecular Devices)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 CellTiter-Glo™ 3D 발광 세포 생존능 검정 (Promega, cat. # G9682)에 의해 결과를 분석하였다. 분석 전에, 타원체를 50Х배율로 촬영하였다.
실시예 13. 3D 세포 배양에서 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 아파티닙의 조합
실시예 1 및 12에 기재된 바와 같이, H1975 타원체를 배양하고, 처리하였다. 본 검정에서 사용된 아파티닙의 농도는 100 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2.5 μM이었다. 처리 기간은 7일이었다. 도 25를 참조한다.
본 실험에서, 비가역적 EGFR 억제제 아파티닙과 화합물 I-7의 조합 요법은 H1975 세포의 3D 배양 (타원체)에 대한 아파티닙의 현저한 세포독성 증가 (보다 낮은 EC50 값)를 초래하는 것으로 입증되었으며, 상기 조합은 타원체를 완전히 제거하는 반면, 타원체의 일부는 아파티닙 단독 처리에 생존하였다.
실시예 14. 3D 세포 배양에서 정지 암 세포에 대해 효과적인 분자와 오시메르티닙의 조합
실시예 1, 2 및 12에 기재된 바와 같이, H1975 타원체를 배양하고, 7일 동안 처리하였다. 본 검정에서 사용된 오시메르티닙의 최고 농도는 10 nM이었으며, 화합물 I-7의 농도는 2.5 μM이었다. 정규 성장 배지 (FBS+)에서, 오시메르티닙에 대한 EC50 측정치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 0.68 nM이었고, 화합물 I-7이 2.5 μM의 농도로 존재할 때 0.28 nM이었다. 혈청 기아 (FBS-)의 조건하에서, 오시메르티닙에 대한 EC50 측정치는, 화합물 I-7이 존재하지 않을 때 3.3 nM이었고, 화합물 I-7이 2.5 μM의 농도로 존재할 때 1.0 nM이었다. 도 26을 참조한다.
본 실험에서, 비가역적 EGFR 억제제 오시메르티닙과 화합물 I-7의 조합은, 타원체가 정규 배지 (FBS+)나 고갈 배지에서 배양되었는지 여부와 무관하게, H1975 세포의 3D 배양 (타원체)에 대한 오시메르티닙의 현저한 세포독성 증가 (EC50 감소)를 가져오는 것으로 입증되었다. 예기치 않게, EC50의 퍼센트 감소는 FBS+ 3D 배양에서보다 FBS-에서 더 컸다.
본 발명은 이의 예시적인 실시형태를 참조하여 구체적으로 도시되고 기재되었지만, 첨부된 특허청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서의 다양한 변경이 본 명세서에서 이루어질 수 있다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.

Claims (61)

  1. 신생물(neoplasm)을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, DYRK1 억제제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 방법이 DYRK1 억제제 및 EGFR 티로신 키나제 억제제(EFGR TKI)를 상기 대상체에게 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함하고,
    여기서, 상기 DYRK1 억제제는 하기 화학식 I-5 또는 화학식 I-7의 화합물이거나 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이고,
    상기 EGFR TKI는 엘로티닙, 아파티닙, 오시메르티닙, 로실레티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    상기 EGFR TKI의 EC50이 DYRK1 억제제가 부재인 경우와 비교하여 DYRK1 억제제의 존재 하에 세포-기반 검정법에서 20% 이상 감소되는, 약제학적 조성물.
    [화학식 I-5]
    Figure 112022110115681-pct00037

    [화학식 I-7]
    Figure 112022110115681-pct00038
  2. 제1항에 있어서, 유효량의 방사선 요법을 상기 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 치료되는 상기 신생물이 담관암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 신장암, 두경부암, 백혈병, 간암, 소세포 폐암, 림프종, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 방광암, 대장암, 폐암, 난소암 및 전립선암으로부터 선택된 원발암 또는 전이암인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 치료되는 상기 신생물이 원발성 또는 전이성 비-소세포 폐암인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 치료되는 상기 신생물이 원발성 또는 전이성 췌장암인, 약제학적 조성물.
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  18. 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, DYRK1 억제제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 방법이
    (a) DYRK1A 또는 DYRK1B 키나아제 활성을 생화학 검정법에서 100 nM 이하의 IC50으로 억제하는 DYRK1 억제제로서, 이러한 억제제의 부재하에 발견되는 정지(quiescent) 암 세포 (시험관내 또는 생체내)의 분율을 적어도 10% 감소시키는 DYRK1 억제제; 및
    (b) EGFR TKI
    를 상기 대상체에게 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함하고,
    상기 DYRK1 억제제가 하기 화학식 I-5 또는 화학식 I-7의 화합물이거나, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이고,
    상기 EGFR TKI는 엘로티닙, 아파티닙, 오시메르티닙, 로실레티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    상기 EGFR TKI의 EC50이 DYRK1 억제제가 부재인 경우와 비교하여 DYRK1 억제제의 존재 하에 세포-기반 검정법에서 20% 이상 감소되는, 약제학적 조성물.
    [화학식 I-5]
    Figure 112022110115681-pct00039

    [화학식 I-7]
    Figure 112022110115681-pct00040
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  20. 제18항에 있어서, 유효량의 방사선 요법을 상기 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
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