KR102491092B1 - microsatellite marker for identification of geographical origin of Seriola quinqueradiata and its use - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 방어(Seriola quinqueradiata) 국내산과 일본산 판별이 가능한 마이크로새틀라이트 마커(microsatellite marker) 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a microsatellite marker (microsatellite marker) capable of discriminating domestic and Japanese defense ( Seriola quinqueradiata ) and its use.
방어(Seriola quinqueradiata)는 전갱이목(Carangiformes) 전갱이과(Carangidae)에 속하는 온대성 어류로 우리나라 동해안, 일본, 대만, 하와이에 걸쳐 분포하며 수심 100m 이내에 서식하는 육식성 어종이다. 방어는 횟감, 선어회로서 겨울철 고급횟감으로 소비되는 경제적으로 중요한 어종이며 일본, 중국, 호주, 대만 등이 주생산국이다. 방어를 가장 많이 생산하는 국가는 일본이며 일본에서는 1960년대부터 자연에서 채집한 치어를 하여 중간양성하거나 또는 인공종묘생산을 통하여 꾸준히 양식되어 왔다. 국내에서는 1980년대부터 중간양성법을 통하여 방어를 생산하여 왔으며 2019년 어업을 통해 15,928톤(694억원)의 방어를 생산하였으며 양식생산량은 650톤(78억원)인 것으로 나타났다(대한민국 통계청). 현재 우리나라의 방어 수입량은 2015년 약 298톤(약 2,183,000달러)에서 2019년에는 약 2,240톤(약 20,278,000달러)으로 약 10배 증가하였으며, 국내에 유통되는 수입산 방어는 대부분 일본으로부터 수입되고 있다(대한민국 통계청). 하지만 국내산과 일본산 방어는 육안으로 식별이 어려워 이에 따른 일본산 어류에 대한 우려와 안전한 수산물 먹거리에 대한 수요가 증가하고 있는 실정이며 일부 부도덕한 유통업자들이 일본산을 국내산으로 둔갑시켜 유통하려는 사례가 발생하고 있기 때문에 부정 유통을 방지하기 위한 수입, 검역과정에서의 객관적인 방어 원산지 감식 기준과 기법이 필요하다.Yellowtail ( Seriola quinqueradiata ) is a temperate fish belonging to the Carangiformes family ( Carangidae ), distributed over the east coast of Korea, Japan, Taiwan, and Hawaii, and is a carnivorous fish species that lives within 100 m of water depth. Yellowtail is an economically important fish species consumed as high-quality sashimi in winter as sashimi and fresh fish, and Japan, China, Australia, and Taiwan are the main producers. The country that produces the most yellowtail is Japan, and in Japan, since the 1960s, it has been steadily cultivated through intermediate breeding or artificial seed production by using fry collected from nature. In Korea, yellowtail has been produced through the medium breeding method since the 1980s, and 15,928 tons (69.4 billion won) of yellowtail were produced through fisheries in 2019, and the aquaculture production was found to be 650 tons (7.8 billion won) (Korea National Statistical Office). Currently, Korea’s defense imports have increased about 10 times from about 298 tons (about $ 2,183,000) in 2015 to about 2,240 tons (about $ 20,278,000) in 2019, and most of the imported yellowtail distributed in Korea is imported from Japan (Korea Statistical Office). However, because domestic and Japanese yellowtail are difficult to distinguish with the naked eye, concerns over Japanese fish and demand for safe seafood food are increasing. Therefore, it is necessary to have objective defense country identification standards and techniques in the import and quarantine process to prevent illegal distribution.
DNA의 유전자 정보를 토대로 하여 수산물의 품종 판별 또는 집단 유전적 유연관계 분석에 쓰이는 대표적인 방법으로서 마이크로새틀라이트(Microsatellite, MS) 마커, restriction fragment length polymorphism(RFLP), allozyme, mitochondrial DNA, random amplified polymorphic DNA(RAPD), amplified fragment length polymorphism(AFLP), single nucleotide polymorphism(SNP)등이 개발되어 왔다.Microsatellite (MS) marker, restriction fragment length polymorphism (RFLP), allozyme, mitochondrial DNA, random amplified polymorphic DNA (RAPD), amplified fragment length polymorphism (AFLP), and single nucleotide polymorphism (SNP) have been developed.
본 연구에서는 마이크로새틀라이트 마커 분석 방법으로 국내산과 일본산 방어의 원산지를 구분하는 방법을 개발하였다. 마이크로새틀라이트 마커는 1990년대부터 유전학에서 유전적 유연관계 분석에 널리 사용되는 분자마커로서 1에서 6개의 짧은 염기쌍(base pair, bp) 서열이 여러 번 반복되어 나타나는 DNA상 좌위로서 simple sequence repeat(SSR)이라고도 한다. 마이크로새틀라이트 마커는 멘델의 유전법칙을 따르며 높은 다형성(polymorphism)과 재현성(reproductivity)을 가지기 때문에 1990년대부터 포유류, 식물 등을 포함하는 다양한 생물체를 대상으로 한 혈통, 집단 유전적 관계 분석, 친자확인, 개체식별을 위한 유전형(genotyping) 분석 기술로서 이용되고 있으며 2000년 이후부터 소, 돼지, 연어 등의 동물에서 품종식별, 원산지 판별에 적용되는 유용한 분자마커이다.In this study, a method for distinguishing the country of origin of domestic and Japanese yellowtail was developed using a microsatellite marker analysis method. Microsatellite markers are molecular markers that have been widely used for genetic relationship analysis in genetics since the 1990s. Simple sequence repeat (SSR) is a locus on DNA in which a short base pair (bp) sequence of 1 to 6 appears repeatedly. ) is also called Since microsatellite markers follow Mendel's laws of genetics and have high polymorphism and reproductivity, they have been used for lineage, group genetic relationship analysis, and paternity for various organisms including mammals and plants since the 1990s. , It is used as a genotyping analysis technique for individual identification, and since 2000, it is a useful molecular marker applied to breed identification and country of origin in animals such as cattle, pigs, and salmon.
본 발명자들은 국내산과 일본산 방어를 판별하기 위한 분자마커로서 GBS 정보를 활용하여 새로운 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 개발하였으며 이를 통해 일본산, 국내산 방어의 유전형을 분석하여 유전적 다양성, 유전적 거리를 비교하는 방법을 개발하였다. 또한 효율적으로 원산지를 판별하기 위한 방법으로서 8개의 마커 가운데 5개(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) 또는 3개(SqMS32, SqMS36, SqMS43)의 마이크로새틀라이트 조합을 통해 방어의 유전형을 분석하였을 경우에 원산지 판별이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors developed 8 new microsatellite markers using GBS information as molecular markers to discriminate between domestic and Japanese yellowtail, and analyzed the genotype of Japanese and domestic yellowtail to determine genetic diversity and genetic distance. A method for comparison was developed. In addition, as a method for efficiently determining the country of origin, the genotype of defense was analyzed through a microsatellite combination of 5 (SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) or 3 (SqMS32, SqMS36, SqMS43) of 8 markers. In this case, the present invention was completed by confirming that the country of origin can be determined.
본 발명은 국내에서 유통되는 국내산 방어와 일본산 방어를 식별하기 위한 새로운 마이크로새틀라이트 마커와 이를 활용한 유전형 분석을 통하여 원산지를 효과적으로 판별할 수 있는 방법을 제공한다.The present invention provides a new microsatellite marker for identifying domestic yellowtail and Japanese yellowtail distributed in Korea and a method for effectively determining the country of origin through genotype analysis using the same.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43 및 SqMS45로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방어 원산지 판별용 마이크로새틀라이트 마커.를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a microsatellite marker for discriminating one or more defense origins selected from the group consisting of SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43 and SqMS45.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “마이크로새틀라이트 마커”는 SqMS17은 서열번호 1로 표시되는 것이고, SqMS24는 서열번호 2로 표시되는 것이며, SqMS32는 서열번호 3으로 표시되는 것이고, SqMS33은 서열번호 4로 표시되는 것이며, SqMS35는 서열번호 5로 표시되는 것이고, SqMS36은 서열번호 6으로 표시되는 것이며, SqMS43은 서열번호 7로 표시되는 것이고, SqMS45는 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the “microsatellite marker” is SqMS17 represented by SEQ ID NO: 1, SqMS24 represented by SEQ ID NO: 2, SqMS32 represented by SEQ ID NO: 3, and SqMS33 represented by SEQ ID NO: 2 4, SqMS35 is represented by SEQ ID NO: 5, SqMS36 is represented by SEQ ID NO: 6, SqMS43 is represented by SEQ ID NO: 7, and SqMS45 is represented by SEQ ID NO: 8.
또한 본 발명은 SqMS17 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; SqMS24 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트; SqMS32 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 세트; SqMS33 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머 세트; SqMS35 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머 세트; SqMS36 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트; SqMS43 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머 세트; SqMS45 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 1쌍 이상의 방어 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a set of primers represented by SEQ ID NOs: 9 and 10 capable of specifically amplifying the SqMS17 microsatellite marker; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 11 and 12 capable of specifically amplifying the SqMS24 microsatellite marker; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 13 and 14 capable of specifically amplifying the SqMS32 microsatellite marker; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 capable of specifically amplifying the SqMS33 microsatellite marker; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 17 and 18 capable of specifically amplifying the SqMS35 microsatellite marker; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 19 and 20 capable of specifically amplifying the SqMS36 microsatellite marker; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 21 and 22 capable of specifically amplifying the SqMS43 microsatellite marker; Provided are at least one pair of primer sets for determining origin of defense selected from the group consisting of primer sets represented by SEQ ID NOs: 23 and 24 capable of specifically amplifying the SqMS45 microsatellite marker.
또한 본 발명은 상동의 프라이머 세트를 포함하는 방어 원산지 판별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for determining the origin of defense including the homologous primer set.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “방어 원산지 판별용 키트”는 완충용액 및 DNA 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the "kit for determining origin of defense" may be characterized in that it includes a buffer solution and a DNA polymerase, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 분석하고자 하는 방어의 핵산 시료를 상동의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분석하여 방어의 유전적 다양성을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방어 원산지 판별 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises PCR amplification of a nucleic acid sample of defense to be analyzed using a homologous primer set; It provides a defense origin discrimination method comprising the step of analyzing the genetic diversity of defense by analyzing the alleles of each locus of the product amplified in the above step.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “방어 원산지 판별 방법”은 유전적 다양성을 분석하는 단계에 있어서 방어 시료의 유전자좌당 대립유전자수, 관측이형접합률, 기대이형접합률, 다형정보지수, 대립유전자 풍부도 및 근친교배계수 중에서 선택된 하나 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the "defense country of origin determination method" is the number of alleles per locus of the defense sample, the observed heterozygosity rate, the expected heterozygosity rate, the polymorphism information index, and the allele in the step of analyzing genetic diversity. It may be characterized by analyzing one or more selected from among abundance and inbreeding coefficient, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 분석하고자 하는 방어의 핵산 시료를 상동의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분석하여 방어의 원산지별 유전적 유연관계를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방어 원산지 판별 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises PCR amplification of a nucleic acid sample of defense to be analyzed using a homologous primer set; It provides a defense origin discrimination method comprising the step of analyzing the alleles of each locus of the product amplified in the above step and comparing the genetic relationship by origin of defense.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “방어 원산지 판별 방법”은 방어의 원산지별 유전적 유연관계를 비교하는 단계에 있어서 Pairwise Fst 값, PCoA 결과 및 genotype likelihood matrix 분석결과 중에서 선택된 하나 이상을 비교하는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the “defense country of origin determination method” is to compare one or more selected from Pairwise Fst values, PCoA results, and genotype likelihood matrix analysis results in the step of comparing genetic relatedness by country of origin of defense. It may be characterized, but is not limited thereto.
본 발명에서 제공하는 마이크로새틀라이트 개발과 이를 이용한 원산지 판별 방법은 소량의 지느러미 조직을 이용하여 효과적이고 경제적인 방법으로 일본산, 국내산 방어의 유전적 거리 및 집단 분석을 수행하는 것으로서 원산지 판별이 가능함을 나타낸다. 따라서 본 발명을 이용해 유통 과정상 발생하는 부정행위를 단속할 수 있을 뿐만 아니라 수산물 원산지 관리에 대한 국민의 신뢰도 상승 및 어가 소득 증대에 도움을 줄 수 있다.The development of microsatellites provided by the present invention and the method of determining origin using the microsatellite is an effective and economical method using a small amount of fin tissue to perform genetic distance and group analysis of Japanese and domestic yellowtail, indicating that it is possible to determine the origin. indicate Therefore, by using the present invention, it is possible not only to crack down on illegal acts occurring in the distribution process, but also to help increase the public's trust in the management of the origin of aquatic products and increase fishery income.
도 1은 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 국내산, 일본산 방어를 판별하기위한 방법을 설명하기 위한 도이다.
도 2는 GBS 데이터를 통해 새롭게 개발된 69개의 마이크로새틀라이트 마커의 적합성을 확인하고자 국내산 방어 및 일본산 방어 각 3 개체의 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하고 그 산물을 아가로즈 겔 전기영동 방법으로 확인한 결과에 대한 도이다.
도 3은 선정된 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 이용해 국내산 방어 및 일본산 방어 내의 각 유전자 좌위를 증폭하고 그 PCR 산물의 DNA fragment 크기를 분석한 결과에 대한 도이다.
도 4는 DNA fragment 모세관전기영동법(capillary electrophoresis)을 통해 분석된 각각 8개의 마이크로새틀라이트 마커 좌위에 대한 국내산 방어 및 일본산 방어의 유전자형의 allele frequency를 나타낸 결과에 대한 도이다.
도 5는 8개의 각 마이크로새틀라이트에 대한 국내산 방어 및 일본산 방어의 유전적 변이 분포 및 관계를 나타내는 PCoA분석 결과에 대한 도이다.
도 6은 8개의 마이크로새틀라이트 마커 분석 결과를 바탕으로 Arlequin을 통해 국내산 방어 및 일본산 방어의 유전적 유연관계를 나타내는 genotype likelihood 산출값(도 6a)과 PCoA분석 결과(도 6b)를 도표화한 결과에 대한 도이다.
도 7은 Fst 값이 가장 높은 5개의 마이크로새틀라이트 마커 조합(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) 분석 결과를 바탕으로 Arlequin을 통해 국내산 방어 및 일본산 방어의 유전적 유연관계를 나타내는 genotype likelihood 산출값(도 7a)과 pCoA분석 결과(도 7b)에 대한 도이다.
도 8은 선정된 3개의 마이크로새틀라이트 마커 조합(SqMS32, SqMS36, SqMS43) 분석 결과를 바탕으로 arlequin을 통해 국내산 방어 및 일본산 방어의 유전적 유연관계를 나타내는 genotype likelihood 산출값(도 8a)과 PCoA분석 결과(도 8b)에 대한 도이다.1 is a diagram for explaining a method for discriminating domestic and Japanese yellowtail using a microsatellite marker.
Figure 2 is to confirm the suitability of 69 newly developed microsatellite markers through GBS data, a PCR reaction was performed using the genomic DNA of each of three domestic and Japanese defenses as a template, and the product was subjected to agarose gel electrophoresis This is a diagram of the results confirmed by the method.
Figure 3 is a diagram showing the results of amplifying each locus in Korean defense and Japanese defense using eight selected microsatellite markers and analyzing the DNA fragment size of the PCR product.
Figure 4 is a diagram of the results showing the allele frequencies of genotypes of domestic defense and Japanese defense for each of the eight microsatellite marker loci analyzed through DNA fragment capillary electrophoresis.
Figure 5 is a diagram of the PCoA analysis results showing the distribution and relationship of genetic variation of domestic defense and Japanese defense for each of eight microsatellites.
6 is a graphical representation of the genotype likelihood calculation value (FIG. 6a) and the PCoA analysis result (FIG. 6b) showing the genetic affinity between domestic defense and Japanese defense through Arlequin based on the analysis results of eight microsatellite markers. is also about
Figure 7 is a genotype likelihood calculation showing the genetic affinity of Korean and Japanese defenses through Arlequin based on the analysis results of five microsatellite marker combinations (SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, and SqMS45) with the highest Fst values. It is a diagram of the value (FIG. 7a) and pCoA analysis result (FIG. 7b).
Figure 8 is a genotype likelihood calculation value (Fig. 8a) and PCoA showing the genetic relatedness of domestic defense and Japanese defense through arlequin based on the analysis results of three selected microsatellite marker combinations (SqMS32, SqMS36, and SqMS43) It is a diagram of the analysis result (FIG. 8B).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.Hereinafter, the present invention will be described in detail as an embodiment of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following implementation examples are presented as examples of the present invention, and if it is determined that a detailed description of a well-known technology or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. , the present invention is not limited thereby. Various modifications and applications of the present invention are possible within the description of the claims described later and equivalent scopes interpreted therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express a preferred embodiment of the present invention, which may vary according to the intention of a user or operator or customs in the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the contents throughout this specification. Throughout the specification, when a certain component is said to "include", it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.
본 발명은 SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43 및 SqMS45로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방어 원산지 판별용 마이크로새틀라이트 마커 제공을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide one or more microsatellite markers for determining the origin of defense selected from the group consisting of SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43 and SqMS45.
본 발명의 용어 ‘마이크로새틀라이트 마커’는 유전학에서 유전적 유연관계 분석에 널리 사용되는 분자마커로서 1에서 6개의 짧은 염기쌍(base pair, bp) 서열이 여러 번 반복되어 나타나는 DNA상 좌위로서 simple sequence repeat(SSR)이라고도 한다. 높은 다형성(polymorphism)과 재현성(reproductivity)을 가지기 때문에 다양한 생물체를 대상으로 한 혈통, 집단 유전적 관계 분석, 친자확인, 개체식별을 위한 유전형(genotyping) 분석 기술로서 이용되고 있으며 2000년 이후부터 소, 돼지, 연어 등의 동물에서 품종식별, 원산지 판별에 적용되는 유용한 분자마커이다.The term 'microsatellite marker' of the present invention is a molecular marker widely used for genetic relationship analysis in genetics, and is a simple sequence on DNA where a short base pair (bp) sequence of 1 to 6 appears repeatedly. Also called repeat (SSR). Because of its high polymorphism and reproductivity, it is used as a genotyping analysis technology for pedigree, group genetic relationship analysis, paternity confirmation, and individual identification for various organisms, and since 2000, cattle, It is a useful molecular marker applied to breed identification and country of origin in animals such as pigs and salmon.
본 발명은 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1쌍 이상의 방어 원산지 판별용 프라이머 제공을 목적으로 한다.The present invention is a forward direction of SEQ ID NOs: 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, 17 and 18, 19 and 20, 21 and 22, 23 and 24 capable of specifically amplifying microsatellite markers. An object of the present invention is to provide at least one pair of primers for determining origin of defense selected from the group consisting of primers and reverse primer pairs.
본 발명의 용어 ‘프라이머(primer)’란 짧은 염기서열로 구성된 단일 가닥의 핵산 서열로 PCR 또는 DNA 합성에 있어서 주형(template)가닥에 상보적인 수소결합을 하여 시작점을 제공하는 역할을 한다.The term 'primer' of the present invention is a single-stranded nucleic acid sequence composed of short nucleotide sequences, which plays a role of providing a starting point by forming complementary hydrogen bonds with template strands in PCR or DNA synthesis.
또한 상기 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 표적으로 한 PCR 산물들의 크기를 모세관전기영동법을 통해 결정함으로서 국내산과 일본산 방어의 유전자형을 분석하는 것을 특징으로 한다. In addition, it is characterized in that the genotype of domestic and Japanese yellowtail is analyzed by determining the size of PCR products targeting the eight microsatellite markers through capillary electrophoresis.
상기 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 활용하여 유전형을 분석하고 방어의 원산지를 판별하는 방법에는 SqMS17를 증폭하는 서열번호 9 및 10의 프라이머, SqMS24를 증폭하는 서열번호 11 및 12의 프라이머, SqMS32를 증폭하는 서열번호 13 및 14의 프라이머, SqMS33를 증폭하는 서열번호 15 및 16의 프라이머, SqMS35를 증폭하는 서열번호 17 및 18의 프라이머, SqMS36를 증폭하는 서열번호 19 및 20의 프라이머, SqMS43를 증폭하는 서열번호 21 및 22의 프라이머, SqMS45를 증폭하는 서열번호 23 및 24의 프라이머가 포함된다.A method for analyzing genotypes and determining the origin of defense using the eight microsatellite markers includes primers of SEQ ID NOs: 9 and 10 to amplify SqMS17, primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 to amplify SqMS24, and SqMS32 to amplify SqMS32. Primers of
또한, 본 발명의 프라이머는 형광물질로 표지될 수 있으며 서열번호 9 내지 24까지의 프라이머가 추가 또는 제외될 수도 있다.In addition, the primers of the present invention may be labeled with a fluorescent material, and primers of SEQ ID NOs: 9 to 24 may be added or excluded.
본 발명은 마이크로새틀라이트 마커의 특이적인 서열번호 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1쌍 이상의 방어 원산지 판별용 프라이머를 포함하는 방어 원산지 판별용 키트 제공을 목적으로 한다.The present invention provides forward and reverse primer pairs of specific SEQ ID NOs: 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, 17 and 18, 19 and 20, 21 and 22, 23 and 24 of microsatellite markers. It is an object of the present invention to provide a kit for determining origin of defense including at least one pair of primers for determining origin of defense selected from the group consisting of.
본 발명은 분석하고자 하는 방어의 핵산 시료를 SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43 또는 SqMS45로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 9 내지 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분석하여 방어의 유전적 다양성을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방어 원산지 판별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is specific to a microsatellite marker composition consisting of SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43 or SqMS45 for a nucleic acid sample of defense to be analyzed, and primers consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 9 to 24 PCR amplification using; An object of the present invention is to provide a method for determining the origin of defense, comprising the step of analyzing the genetic diversity of defense by analyzing the alleles of each locus of the product amplified in the above step.
마지막으로 본 발명은 분석하고자 하는 방어의 핵산 시료를 SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43, SqMS45로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 9 내지 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분석하여 방어의 원산지별 유전적 유연관계를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방어 원산지 판별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Finally, the present invention is specific to the microsatellite marker composition consisting of SqMS17, SqMS24, SqMS32, SqMS33, SqMS35, SqMS36, SqMS43, SqMS45, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 9 to 24. PCR amplification using the primers formed; The object is to provide a method for determining the origin of defense, characterized in that it includes the step of comparing the genetic relationship by origin of defense by analyzing the alleles of each locus of the product amplified in the above step.
즉, 8개의 마이크로새틀라이트를 바탕으로 하여 유전적 다형성 지수를 분석하는 방법과 유전적 거리 계산 프로그램을 통한 유전적 거리를 비교하여 원산지를 판별하는 방법을 포함한다.That is, it includes a method of analyzing the genetic polymorphism index based on 8 microsatellites and a method of determining the country of origin by comparing the genetic distance through a genetic distance calculation program.
또한 8개 마이크로새틀라이트 마커 중 5개의 마이크로새틀라이트 마커(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) 조합과 3개의의 마이크로새틀라이트 마커(SqMS32, SqMS36, SqMS43) 조합을 이용한 유전자형을 분석할 수 있다.In addition, the genotype can be analyzed using a combination of 5 microsatellite markers (SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) and 3 microsatellite markers (SqMS32, SqMS36, SqMS43) among 8 microsatellite markers. .
상기 5개의 마이크로새틀라이트 마커를 이용해 방어의 원산지를 판별하는 방법에는 SqMS32를 증폭하는 서열번호 13 및 14의 프라이머, SqMS33을 증폭하는 서열번호 15 및 16의 프라이머, SqMS36을 증폭하는 서열번호 19 및 20의 프라이머, SqMS43을 증폭하는 서열번호 21 및 22의 프라이머, SqMS45를 증폭하는 서열번호 23 및 24의 프라이머가 포함된다.A method for determining the origin of defense using the five microsatellite markers includes primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 to amplify SqMS32, primers of SEQ ID NOs: 15 and 16 to amplify SqMS33, and SEQ ID NOs: 19 and 20 to amplify SqMS36. , primers of SEQ ID NOs: 21 and 22 to amplify SqMS43, and primers of SEQ ID NOs: 23 and 24 to amplify SqMS45.
3개의 마커를 이용해 방어의 원산지를 판별하는 방법에는 SqMS32를 증폭하는 서열번호 13 및 14의 프라이머, SqMS36를 증폭하는 서열번호 19 및 20의 프라이머, SqMS43를 증폭하는 서열번호 21 및 22의 프라이머가 포함된다.The method of determining the origin of defense using three markers includes primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 to amplify SqMS32, primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 to amplify SqMS36, and primers of SEQ ID NOs: 21 and 22 to amplify SqMS43. do.
또한 상기 5개와 3개의 마이크로새틀라이트 마커 조합을 바탕으로 하여 유전적 다형성 지수를 분석하는 방법과 유전적 거리 계산 프로그램을 통한 유전적 관계를 비교 분석하는 방법을 통하여 원산지를 판별하는 방법을 포함한다.In addition, it includes a method of determining the country of origin through a method of analyzing a genetic polymorphism index based on a combination of the five and three microsatellite markers and a method of comparatively analyzing genetic relationships through a genetic distance calculation program.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following examples are presented as examples of the present invention, and if it is determined that detailed descriptions of well-known techniques or configurations may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed descriptions may be omitted. , the present invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the scope of equivalents interpreted therefrom and the description of the claims described below.
실시예 1. 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 국내산, 일본산 방어의 원산지 판별 방법 개발Example 1. Development of a method for determining the origin of domestic and Japanese yellowtail using microsatellite markers
본 발명에 따른 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 국내산, 일본산 방어의 원산지 판별 방법은 방어 시료 확보 및 genomic DNA 분리, genotyping by sequencing을 통한 방어 원산지 판별용 마이크로새틀라이트 유전좌위 선정, 선정된 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 fragment analysis를 통한 방어 개체별 유전형 분석, 확보한 정보를 토대로 하여 방어의 원산지별 유전적 다형성 지수 분석, 방어의 원산지별 유전적 유연관계 비교, 국내산, 일본산 방어의 원산지 판별로 이루어진다(도 1).The method for determining the origin of domestic and Japanese yellowtail using the microsatellite marker according to the present invention is to secure defense samples, isolate genomic DNA, select microsatellite genetic loci for determining the origin of defense through genotyping by sequencing, and select 8 microsatellites Genotype analysis by fragment analysis using light markers, genetic polymorphism index analysis by country of origin of yellowtail based on the obtained information, comparison of genetic relatedness by country of origin of yellowtail, discrimination of origin of domestic and Japanese yellowtail is made (Fig. 1).
실시예 2. 방어 시료 확보 및 genomic DNA 분리Example 2. Obtaining defense samples and genomic DNA isolation
원산지 판별을 위한 유전형(genotyping) 분석에 쓰인 국내산 방어 90마리는 부산 자갈치, 통영, 포항의 어시장에서 구입하였으며 일본산 방어 90마리는 수산물 전문 수입업체를 통해 구입하였다. 방어의 각 개체별 지느러미 또는 근육 조직을 샘플링 하여 분석 전까지 -80°C의 초저온냉동고에서 보관하였다. 절단된 약 0.5cm의 지느러미 또는 근육으로부터 지느러미 또는 근육으로부터 genomic DNA를 추출, 정제하기 위해 AccuPrep® Genomic DNA Extraction 키트(Bioneer, Korea)를 이용하였으며 사용 전 이를 희석하여 10ng/μl의 농도로 일정하게 조정하였다. Ninety domestic yellowtails used for genotyping analysis to determine the country of origin were purchased from Jagalchi, Tongyeong, and Pohang fish markets in Busan, and 90 Japanese yellowtails were purchased from a specialized seafood importer. The fin or muscle tissue of each individual yellowtail was sampled and stored in a cryogenic freezer at -80 ° C until analysis. AccuPrep® Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, Korea) was used to extract and purify genomic DNA from fins or muscles of about 0.5 cm, and diluted to a constant concentration of 10 ng/μl before use. did
실시예 3. 방어 원산지판별을 위한 마이크로새틀라이트 유전좌위 선정Example 3. Selection of microsatellite genetic loci for identification of defense origin
GBS(Genotyping by sequencing) 라이브러리 구축을 통한 새로운 마이크로새틀라이트 마커 후보군을 확보하기 위해서 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 GCA_002217815.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_002217815.1/) assembly를 레퍼런스로 이용하여 96개체(국내산 방어 48개체, 일본산 방어 48개체)를 분석하였다. GBS reads로부터 얻은 데이터베이스로부터 2826개의 마커를 확보하였으며 이 가운데 국내산과 일본산 방어 판별을 위한 69개의 후보 마이크로새틀라이트 마커를 선정하였다. 선별된 69개의 마이크로새틀라이트 마커의 적합성을 확인하기 위하여 국내산 3마리, 일본산 3마리의 방어 genomic DNA를 주형으로 한 PCR반응을 수행하여 1차 적합성 확인을 하였다. To secure a new microsatellite marker candidate group through GBS (Genotyping by sequencing) library construction, GCA_002217815.1 (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/assembly/GCA_002217815.1/) assembly was used as a reference to analyze 96 specimens (48 domestic yellowtail, 48 Japanese yellowtail). 2826 markers were obtained from the database obtained from GBS reads, and among them, 69 candidate microsatellite markers were selected for discrimination between domestic and Japanese defenses. In order to confirm the suitability of the 69 selected microsatellite markers, a PCR reaction was performed using the defense genomic DNA of 3 domestic and 3 Japanese breeds as templates to confirm the first suitability.
구체적인 PCR 반응조건으로, 주형 genomic DNA(10ng/μl) 1 μl, forward 프라이머(10 pmol) 1 μl, reverse 프라이머 (10 pmol) 1 μl, Genetbio사의 Prime Taq Premix(2X) 10 μl를 혼합한 조성에 증류수를 첨가하여 최종 부피를 20 μl로 조정하였다. PCR 기기는 SimpliAmp™ Thermal Cycler(Applied biosystems)를 이용하였으며, PCR 반응의 온도 조건으로는 95°C에서 5분간 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분간으로 구성된 반응조건을 1 사이클로 설정하여 40회 반복하였다. 그 후 72°C에서 7분간 연장(extension) 반응 후 PCR 산물 2μl를 2% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였다(도 2). 전기영동 결과를 통해 PCR 산물의 크기 차이가 확인된 8개의 마이크로새틀라이트 유전좌위가 선정되었으며 이를 fragment analysis에 이용하였고 각 마커 및 프라이머에 대한 정보는 표 1 및 표 2에 요약하였다.As specific PCR reaction conditions, 1 μl of template genomic DNA (10ng/μl), 1 μl of forward primer (10 pmol), 1 μl of reverse primer (10 pmol), and 10 μl of Prime Taq Premix (2X) from Genetbio were mixed. Distilled water was added to adjust the final volume to 20 μl. The PCR device used SimpliAmp™ Thermal Cycler (Applied biosystems), and the PCR reaction temperature conditions were 95 °C for 5 minutes, 94 °C for 30 seconds, 60 °C for 30 seconds, and 72 °C for 30 seconds. The reaction condition consisting of 1 minute was set to 1 cycle and repeated 40 times. Then, after extension reaction at 72 ° C for 7 minutes, 2 μl of the PCR product was confirmed by electrophoresis on a 2% agarose gel (FIG. 2). Eight microsatellite loci for which the size difference of PCR products was confirmed through electrophoresis were selected and used for fragment analysis. Information on each marker and primer is summarized in Tables 1 and 2.
실시예 4. Fragment analysis를 통한 유전형 분석Example 4. Genotype analysis through fragment analysis
실시예 3에서 선정된 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 이용해 국내산 방어 90개체, 일본산 방어 90개체의 집단별 유전적 다양성을 확인하기 위한 fragment analysis를 진행하였다. 각 마커에 특이적인 5'-Fam(6-FAM)이 표지된 프라이머를 합성하여 PCR에 이용하였으며 PCR 산물은 capillary array가 장착된 ABI3730xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 유전자형을 분석하였으며 GeneMapper software 5(Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 대립유전자들의 크기를 산출하였다. 증폭된 산물을 모세관전기영동법(capillary electrophoresis)을 이용하여 크기별로 분리하여 DNA fragment의 크기를 결정하였다(도 3). 증폭된 산물의 크기에 따라 각 개체의 유전자형을 결정하여 비교하였으며 결정된 유전자형을 통해 국내산(KR, n=90), 일본산(JP, n=90) 집단별 8개의 좌위에 대한 allele frequency를 막대그래프로 도면 4에 나타내었다.Using the 8 microsatellite markers selected in Example 3, fragment analysis was conducted to confirm the genetic diversity of each group of 90 domestic yellowtail individuals and 90 Japanese yellowtail individuals. Primers labeled with 5'-Fam (6-FAM) specific for each marker were synthesized and used for PCR. The PCR products were genotyped using an ABI3730xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) equipped with a capillary array, and GeneMapper The sizes of alleles were calculated using software 5 (Applied Biosystems, CA, USA). The amplified product was separated by size using capillary electrophoresis to determine the size of the DNA fragment (FIG. 3). The genotype of each individual was determined and compared according to the size of the amplified product, and the allele frequencies for 8 loci for each group of domestic (KR, n = 90) and Japanese (JP, n = 90) were displayed in a bar graph through the determined genotype. As shown in Figure 4.
실시예 5. 방어의 원산지별 유전적 다형성 지수 분석Example 5. Analysis of genetic polymorphism index by country of origin of yellowtail
대립유전자수(Na, number of alleles per locus), 관측이형접합률(Ho, observed heterozygosity), 기대이형접합률(He, expected heterozygosity), 다형정보지수(PIC, polymorphic information content)는 Cervus version 3.0.7 (Marshall et al., 1998)를 이용하여 계산하였다. 대립유전자 풍부도(Ar, allelic richness) 및 근친교배계수(Fis, inbreeding coefficient)는 FSTAT 2.9.4 program(Goudet 1995)을 이용하였다. 하디-바인베르크 평형 테스트 기댓값에 대한 p-value(pHWD)는 Arlequin 3.5.2.2(Exocoffier et al., 2005)을 이용하여 산출하였다(표 3).Number of alleles per locus (Na), observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), and polymorphic information content (PIC) were Cervus version 3.0. 7 (Marshall et al., 1998). Allelic richness (Ar) and inbreeding coefficient (Fis) were measured using the FSTAT 2.9.4 program (Goudet 1995). The p-value (pHWD) for the Hardy-Weinberg equilibrium test expected value was calculated using Arlequin 3.5.2.2 (Exocoffier et al., 2005) (Table 3).
8개의 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 국내산(KR, n=90), 일본산(JP, n=90) 총 180개체를 한 population으로 설정하여 genetic variability를 분석하였을 경우 총 103개의 대립유전자가 검출되었으며 유전자 좌당 전체 평균 대립 유전자의 수는 4에서 29개로 평균 12.9개로 나타났다. 좌위별로 보았을 때 SqMS35에서 4개의 가장 적은 대립유전자가 나타났으며 SqMS43에서는 29개로 가장 많은 수가 관찰되었다. 이와 마찬가지로 대립유전자 풍부도(AR)의 전체 평균은 11.607이며 SqMS43(AR: 25.155)이 가장 높은 값을 보였으며 SqMS35(AR: 3.664)에서 가장 낮은 값을 보였다.When a total of 180 domestic (KR, n=90) and Japanese (JP, n=90) individuals were set as one population and genetic variability was analyzed using 8 microsatellite markers, a total of 103 alleles were detected. The total average number of alleles per locus ranged from 4 to 29, with an average of 12.9. By locus, SqMS35 showed the least 4 alleles, and SqMS43 showed the highest number of alleles with 29. Similarly, the overall mean of allele abundance (AR) was 11.607, with SqMS43 (AR: 25.155) showing the highest value and SqMS35 (AR: 3.664) showing the lowest value.
각 집단별 He값은 유전적 평형 상태에 있는 집단으로 가정하였을 때 예상되는 이형 접합도를 나타내며 Ho값은 실제로 관측된 이형접합상태에 있는 개체들의 이형 접합도를 나타낸다. 본 연구에서 분석된 총 180개체의 8개 locus에 대한 전체 평균 He값은 0.633, 전체 평균 Ho는 0.497였으며 SqMS45를 제외한 모든 좌위에서 Ho값이 He값보다 높게 나타났다. 또한 좌위별로 보았을 때 SqMS43에서 가장 높은 Ho(0.926)값을 기록하였다.The He value for each group represents the expected degree of heterozygosity assuming that the group is in genetic equilibrium, and the Ho value represents the degree of heterozygosity of individuals actually in the observed state of heterozygosity. The total average He value and the total average Ho value for 8 locus of 180 individuals analyzed in this study were 0.633 and 0.497, and Ho values were higher than He values in all loci except SqMS45. Also, when viewed by locus, the highest Ho (0.926) value was recorded in SqMS43.
PIC값은 180개체 내에서 평균 0.612이며 마찬가지로 SqMS43에서 가장 높은 값을 나타내었다. Hardy-Weinberg평형의 이탈은 8개 좌위 가운데 SqMS17, SqMS24에서 두 원산지 집단 모두 평형의 이탈이 관찰되었다(p<0.0001). 또한 나머지 국내산 SqMS35, 일본산 SqMS43에서도 Hardy-Weinberg평형의 이탈이 관찰되는 것을 확인할 수 있다.The average PIC value was 0.612 within 180 individuals, and the highest value was also shown in SqMS43. Out of the Hardy-Weinberg equilibrium, out of equilibrium was observed in both origin groups at SqMS17 and SqMS24 among the 8 loci (p<0.0001). In addition, it can be confirmed that the departure of the Hardy-Weinberg equilibrium is observed in the remaining domestic SqMS35 and Japanese SqMS43.
Fis는 국내산 평균 0.258, 일본산 평균 0.179로서 근친교배로 인한 이형접합자를 갖는 개체들이 비교적 적은 것을 알 수 있다. 8개의 마커를 이용하여 전반적으로 본 방어의 원산지별 집단 유전적 다양성 지수는 두 원산지 그룹들 사이에서 큰 차이를 보이지 않았다.Fis average of 0.258 in Korea and 0.179 in Japan indicates that there are relatively few individuals with heterozygotes due to inbreeding. Overall, the group genetic diversity index by origin of this defense using eight markers did not show a significant difference between the two origin groups.
(n=90)(n=90)
(n=90)(n=90)
(n=180)(n=180)
실시예 6. 방어의 원산지별 유전적 유연관계 비교Example 6. Comparison of genetic relatedness by country of origin of yellowtail
국내산과 일본산 방어의 유전적인 변이 분포를 이용하여 원산지 집단별 기하학적 관계를 2차원적으로 나타내기 위해 GenAlEx program(Peakall and Smouse 2006)을 이용하여 Principal Coordinate(PCoA) 분석을 수행하였다. 또한, 8개의 loci를 이용한 집단간 유전학적 유연관계를 분석하기 위해, Arlequin 3.5.2.2(Exocoffier et al., 2005)을 이용하여 Pairwise Fst 값 및 genotype likelihood matrix 값을 산출하였으며 이를 OriginPro 8.5 소프트웨어(OriginLab, USA)를 이용하여 도표화하였다. Principal Coordinate (PCoA) analysis was performed using the GenAlEx program (Peakall and Smouse 2006) to represent the geometric relationship by origin group in two dimensions using the genetic variation distribution of domestic and Japanese yellowtail. In addition, in order to analyze the genetic affinity between groups using 8 loci, Arlequin 3.5.2.2 (Exocoffier et al., 2005) was used to calculate pairwise Fst values and genotype likelihood matrix values, which were then analyzed using OriginPro 8.5 software (OriginLab , USA).
원산지 집단간 Pairwise Fst 값은 SqMS32, SqMS17, SqMS43, SqMS36, SqMS45, SqMS33, SqMS35, SqMS24순으로 높게 나타났으나 Fst 최대값을 보이는 SqMS32와 SqMS43에서만 p<0.00001, p<0.05 수준으로 유의적인 차이가 나타났다(표 4). 8개의 좌위에 대한 국내산, 일본산 방어간의 Fst값은 0.11078(p<0.00001)으로 유의적인 차이가 나타났다(표 5). 또한 국내산, 일본산 두 집단 모두에서 Hardy-Weinberg평형의 이탈이 나타나는 SqMS17을 제외한 후 Fst값이 높은 순서대로 5개의 마이크로새틀라이트 마커(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45)에 대한 원산지 집단간 Fst값을 비교한 결과 0.11347로 나타났으며(p<0.00001)(표 6), 상위 3개(SqMS32, SqMS36, SqMS43)마커에 관한 Fst 값은 0.18779로 더 높게 나타났다(p<0.00001)(표 7). Pairwise Fst values among the origin groups were high in the order of SqMS32, SqMS17, SqMS43, SqMS36, SqMS45, SqMS33, SqMS35, and SqMS24, but only in SqMS32 and SqMS43 showing the maximum Fst values, with p<0.00001 and p<0.05, significant differences were found. appeared (Table 4). The Fst value between domestic and Japanese yellowtail for 8 loci was 0.11078 (p<0.00001), showing a significant difference (Table 5). In addition, after excluding SqMS17, which shows a deviation from Hardy-Weinberg equilibrium in both domestic and Japanese groups, Fst between the groups of origin for the five microsatellite markers (SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) in order of highest Fst value As a result of comparing the values, it was 0.11347 (p<0.00001) (Table 6), and the Fst value for the top 3 markers (SqMS32, SqMS36, SqMS43) was 0.18779, which was higher (p<0.00001) (Table 7) .
마커별 pCoA분석 결과, Fst 값이 가장 높았던 SqMS32에서 총 변이도는 84.66%(각 성분별 48.80%, 19.18%, 16.68%)인 것으로 나타나며 2차원 그래프 상에서도 국내산(K)과 일본산(J)이 명확하게 구분되는 것으로 보이므로 SqMS32는 방어 원산지 구분을 위한 모든 마이크로새틀라이트 마커 조합에 필수적으로 포함하여 분석하였다(도 5).As a result of pCoA analysis by marker, the total variance was 84.66% (48.80%, 19.18%, 16.68% for each component) in SqMS32, which had the highest Fst value, and domestic (K) and Japanese (J) were clear even on the two-dimensional graph. Since it seems to be clearly distinguished, SqMS32 was analyzed by including it as essential in all microsatellite marker combinations for distinguishing defense origins (FIG. 5).
(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45)(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45)
(SqMS32, SqMS36, SqMS43)(SqMS32, SqMS36, SqMS43)
실시예 7. 국내산, 일본산 방어의 원산지 판별Example 7. Determination of origin of domestic and Japanese yellowtail
본 분석에서 사용된 8가지 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 유전형 분석결과를 바탕으로 arlequin을 통해 얻은 genotype likelihood 산출값을 2차원 상에서 도표화한 결과(도 6a) 국내산, 일본산 방어가 개체별로 명확하게 그룹화되는 것을 확인할 수 있으나 PCoA 결과(도 6b)에서는 국내산, 일본산 개체들이 mix되어 집단별로 그룹화되는 현상이 관찰되지 않았다. Based on the genotype analysis results using the 8 microsatellite markers used in this analysis, the genotype likelihood calculation values obtained through arlequin were plotted in two dimensions (Fig. 6a). Domestic and Japanese yellowtail were clearly grouped by individual. However, in the PCoA result (Fig. 6b), the phenomenon that domestic and Japanese individuals were mixed and grouped by group was not observed.
Fst값을 기준으로 5개의 마이크로새틀라이트 마커(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45)조합을 통하여 위와 같은 분석을 하였을 때 genotype likelihood(도 7a) 및 PCoA분석 결과(도 7b, 39.91%의 총 변이율), 국내산과 일본산 방어들이 집단별로 서로 다른 군집을 이루는 것으로 보인다. 또한 3개의 마이크로새틀라이트 마커(SqMS32, SqMS36, SqMS43) 조합을 이용하였을 경우에도 마찬가지로 genotype likelihood 분석(도 8a)에 있어서 원산지 판별이 가능한 것으로 보이며 PCoA 분석 결과(도 8b)에서도 46.95%의 총 변이율을 나타내어 국내산 및 일본산 방어 집단사이의 변이률을 다음 5개 또는 3개 마커 조합을 통하여 충분이 반영할 수 있는 것으로 예상된다.When the above analysis was performed through the combination of 5 microsatellite markers (SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) based on the Fst value, the genotype likelihood (Fig. 7a) and PCoA analysis results (Fig. 7b, total variation of 39.91% rate), domestic and Japanese yellowtails seem to form different clusters for each group. In addition, even when the combination of three microsatellite markers (SqMS32, SqMS36, and SqMS43) was used, it seemed possible to determine the country of origin in the genotype likelihood analysis (Fig. 8a), and the total mutation rate was 46.95% in the PCoA analysis result (Fig. 8b). , it is expected that the mutation rate between domestic and Japanese defense groups can be sufficiently reflected through the following five or three marker combinations.
상기 결과로부터, 본 연구에서 GBS(genotyping by sequencing) 데이터베이스를 통하여 새롭게 개발된 8개의 마커를 이용해 국내산 및 일본산 방어의 유전형을 분석하여 집단내, 집단간 유전적 다양성 분석을 수행할 수 있었으며 8가지의 마커 중 Fst 값을 토대로 하여 5개(SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) 또는 3개(SqMS32, SqMS36, SqMS43)의 마커 조합을 선정하였고 이를 통해 얻은 genotype 정보로 PCoA, genotype likelihood matrix 분석을 수행함으로서 국내산 또는 일본산 방어를 효과적으로 판별할 수 있음을 확인하였다. From the above results, in this study, it was possible to analyze the genetic diversity within and between groups by analyzing the genotypes of domestic and Japanese yellowtail using eight newly developed markers through the GBS (genotyping by sequencing) database. Among the markers, 5 (SqMS32, SqMS33, SqMS36, SqMS43, SqMS45) or 3 (SqMS32, SqMS36, SqMS43) marker combinations were selected based on the Fst value, and PCoA and genotype likelihood matrix analysis were performed with the genotype information obtained through them. As a result, it was confirmed that domestic or Japanese yellowtail could be effectively discriminated.
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> microsatellite marker for identification of geographical origin of Seriola quinqueradiata and its use <130> PN2108-385 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS17 <400> 1 tgaacagacc actgttcacg tctgatatat atatatacac acacacatat atcctcagcc 60 g 61 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS24 <400> 2 tgtgtttgaa ttggttgttg taggagtgtg tgtgtgtgtg tttgtatgtg tgggatgggc 60 tcgaca 66 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS32 <400> 3 acaggccctg aaaggtacgg taacagatga tgatgatgat gatgtcacgg ggcctaatcg 60 ggctttct 68 <210> 4 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS33 <400> 4 agctgttgct cctctcataa ccgacatgat gatgatgatg atgatgatga tactgtctga 60 tggatgcaga gttt 74 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS35 <400> 5 aaatgtgctg tctatcccta cctcatctct ctctctctct ctctctctgg gtctgtagtt 60 gtagattgtg gt 72 <210> 6 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS36 <400> 6 aatttaagag gcaggacatg gaaatacaca cacacacaca cacattcatc tgctctctgg 60 gggggtca 68 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS43 <400> 7 aaggtaaagg tgcacggtat catcagtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60 tgtgtttgtg tatgtggggt gctgagactg 90 <210> 8 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS45 <400> 8 atcaccgccc tcaatctgag agactcacac acacacacac acacacacac acacacacaa 60 acacatcccc ttttttcaca tcaa 84 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS17 F <400> 9 tggccctgct tcacattgat 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS17 R <400> 10 acggctgagg atatatgtgt gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS24 F <400> 11 acgtcacaaa cagctcacct 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS24 R <400> 12 tcgagcccat cccacacat 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS32 F <400> 13 gcaggaggca aagagaggag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS32 R <400> 14 taagatctgg cttgcagcgg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS33 F <400> 15 caccagtcca gacagaaccc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS33 R <400> 16 tgaaactctg catccatcag aca 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS35 F <400> 17 ttcttgcaaa gctgtgttga gt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS35 R <400> 18 cggatgacca caatctacaa ct 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS36 F <400> 19 atttaagagg caggacatgg aa 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS36 R <400> 20 tcctcctact gagcatccca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS43 F <400> 21 gcgtgtctct gtggagcaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS43 R <400> 22 tcagtctcag caccccacat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS45 F <400> 23 acctctgcac tgctagcttc 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMS45 R <400> 24 acacagaaaa cacagacaca cc 22 <110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> microsatellite marker for identification of geographical origin of Seriola quinqueradiata and its use <130> PN2108-385 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS17 <400> 1 tgaacagacc actgttcacg tctgatatat atatatacac acacacatat atcctcagcc 60 g 61 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS24 <400> 2 tgtgtttgaa ttggttgttg taggagtgtg tgtgtgtgtg tttgtatgg tgggatgggc 60 tcgaca 66 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS32 <400> 3 acaggccctg aaaggtacgg taacagatga tgatgatgat gatgtcacgg ggcctaatcg 60 ggctttct 68 <210> 4 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS33 <400> 4 agctgttgct cctctcataa ccgacatgat gatgatgatg atgatgatga tactgtctga 60 tggatgcaga gttt 74 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS35 <400> 5 aaatgtgctg tctatcccta cctcatctct ctctctctct ctctctctgg gtctgtagtt 60 gtagattgtg gt 72 <210> 6 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS36 <400> 6 aatttaagag gcaggacatg gaaatacaca cacacacaca cacattcatc tgctctctgg 60 ggggggtca 68 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS43 <400> 7 aaggtaaagg tgcacggtat catcagtgg tgtgtgtgg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60 tgtgtttgtg tatgtggggt gctgagactg 90 <210> 8 <211> 84 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS45 <400> 8 atcaccgccc tcaatctgag agactcacac acacacacac acacacacac acacacacaa 60 acacatcccc ttttttcaca tcaa 84 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS17 F <400> 9 tggccctgct tcacattgat 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS17R <400> 10 acggctgagg atatatgtgt gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS24 F <400> 11 acgtcacaaa cagctcacct 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS24R <400> 12 tcgagcccat cccacacat 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS32 F <400> 13 gcaggaggca aagagaggag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS32R <400> 14 taagatctgg cttgcagcgg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS33 F <400> 15 caccagtcca gacagaaccc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS33R <400> 16 tgaaactctg catccatcag aca 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS35 F <400> 17 ttcttgcaaa gctgtgttga gt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS35R <400> 18 cggatgacca caatctacaa ct 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS36 F <400> 19 atttaagagg caggacatgg aa 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS36R <400> 20 tcctcctact gagcatccca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS43 F <400> 21 gcgtgtctct gtggagcaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS43R <400> 22 tcagtctcag caccccacat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS45 F <400> 23 acctctgcac tgctagcttc 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SqMS45 R <400> 24 acacagaaaa cacagacaca cc 22
Claims (9)
상기 SqMS17은 서열번호 1로 표시되는 것이고, SqMS24는 서열번호 2로 표시되는 것이며, SqMS32는 서열번호 3으로 표시되는 것이고, SqMS33은 서열번호 4로 표시되는 것이며, SqMS35는 서열번호 5로 표시되는 것이고, SqMS36은 서열번호 6으로 표시되는 것이며, SqMS43은 서열번호 7로 표시되는 것이고, SqMS45는 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 국내산과 일본산 방어 판별용 마이크로새틀라이트 마커 세트.According to claim 1,
The SqMS17 is represented by SEQ ID NO: 1, SqMS24 is represented by SEQ ID NO: 2, SqMS32 is represented by SEQ ID NO: 3, SqMS33 is represented by SEQ ID NO: 4, and SqMS35 is represented by SEQ ID NO: 5 , SqMS36 is represented by SEQ ID NO: 6, SqMS43 is represented by SEQ ID NO: 7, and SqMS45 is represented by SEQ ID NO: 8. A microsatellite marker set for discrimination between domestic and Japanese defenses.
SqMS24 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍;
SqMS32 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍;
SqMS33 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍;
SqMS35 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍;
SqMS36 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19및 20으로 표시되는 프라이머 쌍;
SqMS43 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍;
SqMS45 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 국내산과 일본산 방어 판별용 프라이머 세트.Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 9 and 10 capable of specifically amplifying the SqMS17 microsatellite marker;
Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 11 and 12 capable of specifically amplifying the SqMS24 microsatellite marker;
Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 13 and 14 capable of specifically amplifying the SqMS32 microsatellite marker;
Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 capable of specifically amplifying the SqMS33 microsatellite marker;
Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18 capable of specifically amplifying the SqMS35 microsatellite marker;
Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 19 and 20 capable of specifically amplifying the SqMS36 microsatellite marker;
Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 21 and 22 capable of specifically amplifying the SqMS43 microsatellite marker;
A primer set for discrimination between domestic and Japanese defense consisting of a pair of primers represented by SEQ ID NOs: 23 and 24 capable of specifically amplifying the SqMS45 microsatellite marker.
상기 키트는 완충용액 및 DNA 중합효소를 포함하는 것인 키트.According to claim 4,
Wherein the kit comprises a buffer solution and a DNA polymerase.
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분석하여 방어의 유전적 다양성을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내산과 일본산 방어 판별 방법.(a) PCR amplifying a nucleic acid sample of defense to be analyzed using the primer set of claim 3;
(b) analyzing the genetic diversity of defense by analyzing the alleles of each locus of the product amplified in step (a).
상기 유전적 다양성을 분석하는 단계는 방어 시료의 유전자좌당 대립유전자수, 관측이형접합률, 기대이형접합률, 다형정보지수, 대립유전자 풍부도 및 근친교배계수 중에서 선택된 하나 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 국내산과 일본산 방어 판별 방법.According to claim 6,
The step of analyzing the genetic diversity is characterized by analyzing one or more selected from the number of alleles per locus of the defense sample, the observed heterozygosity rate, the expected heterozygosity rate, the polymorphic information index, the allele abundance and the inbreeding coefficient How to discriminate domestic and Japanese yellowtail.
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분석하여 방어의 원산지별 유전적 유연관계를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내산과 일본산 방어 판별 방법.(a) PCR amplifying a nucleic acid sample of defense to be analyzed using the primer set of claim 3;
(b) A method for distinguishing domestic and Japanese defenses, comprising the step of analyzing the alleles of each locus of the product amplified in step (a) and comparing the genetic relationship by country of origin of defense.
상기 원산지별 유전적 유연관계를 비교하는 단계는 Pairwise Fst 값, PCoA 결과 및 genotype likelihood matrix 분석결과 중에서 선택된 하나 이상을 비교하는 것을 특징으로 하는 국내산과 일본산 방어 판별 방법.
According to claim 8,
The step of comparing genetic affinity by country of origin compares one or more selected from Pairwise Fst values, PCoA results, and genotype likelihood matrix analysis results.
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