KR102484419B1 - 그래핀을 이용하여 세포가 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법 및 장치 - Google Patents

그래핀을 이용하여 세포가 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 기술적 사상에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 세포 배양 배지가 공급되는 기판 위에서 배양된 세포의 표면에 그래핀을 덮어서 초고진공 환경(ultra-high vacuum environment)에서도 생체 시료의 세포가 살아 있는 상태에서 손상되지 않은 세포막의 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 기술에 관한 것이다. 본 발명의 일실시예에 따른 그래핀을 이용하여 세포가 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법은 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계, 상기 생체 고분자막 상에서 배양된 세포의 세포막을 향해 상기 세포 배양 배지가 그래핀과 상기 세포막 사이에 포함되고, 상기 그래핀이 상기 세포막을 덮도록 상기 세포가 캡핑되는 생체 시료를 준비하는 단계 및 상기 생체 시료에 대한 질량분석 이미징 또는 초고진공 기반 이미징을 수행하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

그래핀을 이용하여 세포가 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법 및 장치{IMAGING ANALYSIS METHOD AND APPARATUS FOR ANALYSIS BIOLOGICAL SAMPLE HAVING LIVING CELLS BY USING GRAPHENE}
본 발명은 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 기술적 사상에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 세포 배양 배지가 공급되는 기판 위에서 배양된 세포의 표면에 그래핀을 덮어서 초고진공 환경(ultra-high vacuum environment)에서도 생체 시료의 세포가 살아 있는 상태에서 손상되지 않은 세포막의 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 기술에 관한 것이다.
가속화된 전자 및 이온을 기반으로 하는 나노 스케일 특성화 기술은 초고 진공 환경(ultra-high vacuum environment)이 요구된다.
따라서, 용액 환경에서 분석을 수행 할 수 없으며 생체 시료는 생체 분자의 고유 상태, 국소화 및 화학화를 방해하는 요소를 방지하기 위해 동결되거나 고정되어서 탈수되어야 한다.
최근 단일층 기반 그래핀 기술은 용액 내 물질과 세포를 투과 전자 현미경 및 주사 전자 현미경을 이용하여 이미징 분석이 가능하게 하였다.
탄소 원자들이 모여 육각형의 격자를 이루고 있는 2차원 평면 구조의 나노 물질인 그래핀은 높은 전기전도성과 비투과성을 가지고 있는 원자 1개로 이루어진 두께의 얇은 막일 수 있다.
수분을 포함하고 있는 생체 시료의 세포를 그래핀으로 덮어서 진공에서도 생체 시료의 세포가 마르지 않게 막고 투과 전자 현미경 및 주사 전자 현미경을 이용한 분석이 가능하게 한다.
생체 시료를 진공 기반의 전자현미경으로 분석하기 전에 수행하는 전처리 방법(화학적 고정, 급속 냉각, 탈수 등)은 생체 시료의 변형을 일으키기 때문에 실험 분석에 오류가 내재되어 있을 가능성이 존재한다.
그리고, 투과 전자 현미경 및 주사 전자 현미경과 같은 전자 현미경은 생체 시료의 구조 분석만 가능하고, 성분 분석은 불가능하다는 단점이 존재한다.
한편, 분석화학분야에서 다양하게 쓰이는 질량분석법은 유기화합물 이온의 원자 조성과 원자량의 정밀 측정을 통해 유기물의 성분과 구조를 파악하는 매우 유용한 분석방법으로 유기물의 복합체인 세포나 생체조직 또한 질량분석법을 통해 그 물질의 분자정보를 얻을 수 있다.
그러나, 일반적인 질량분석법은 고진공 조건에서 시료를 탈착 및 이온화하는 방법을 사용하므로, 수분을 많이 함유하고 있는 생체 시료는 복잡한 전 처리과정 없이 분석할 수 없는 실정이다.
따라서, 주로 생체 시료를 파괴하여 용매에 넣어 분석을 하는 액체 크로마토그래피 또는 전기 분무 이온화 질량분석법을 주로 사용하거나, 전처리 과정을 거쳐 시료를 진공 챔버에 넣어 분석하는 이차이온 질량분석법(secondary ion mass spectrometry, SIMS)이나 매트릭스 레이저 탈착 이온화 질량분석법(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)을 사용한다.
그러나 이러한 방법은 진공기반의 기술이며 이 때문에 생체 시료를 진공 챔버에 넣기 위해 수분을 없애거나 다른 물질로 치환하는 등 여러 가지 전처리가 필요하며 이 과정에서 시료의 훼손이 발생하여 정확한 분석결과를 얻을 수 없다.
체외 질량 분석 이미징(mass spectrometric imaging, MSI)은 전자 현미경 또는 광학 형광 현미경에 대비하여 초고 함량 분자 정보를 제공할 수 있다.
체외 질량 분석 이미징 기술의 발전은 세포 내 측면 해상도로 3D 샘플의 라벨링 없는 분자 매핑을 가능하게 해준다.
MALDI 및 SIMS와 같은 MSI 기술은 생체 의학 및 재료 연구에 적용하는데 있어 주요 한계는 초고 진공 환경과의 호환성을 위한 생체 시료의 준비 절차에 있다.
이러한 문제점을 극복하고자 최근 미국과 유럽을 중심으로 대기압 질량분석기술을 개발하기 위한 연구가 시작되었고, 그 예로 종이 분무 이온화 방법 (paper spray ionization, PSI), 중적외선 레이저(mid-IR lasers)를 이용한 탈착 이온화 방법, 기체 방전을 이용한 실시간 직접 분석법(direct analysis in real-time, DART), 표면 탄성파 소자를 이용한 시료 분무법(surface acoustic wave nebulization, SAWN) 등이 개발되고 있다.
그러나, 이러한 방법들은 여전히 생체 시료 분석 시 오염 문제와 검출 한계 등을 가지고 있으며, 시료의 공간정보를 더해 이미징 분석을 구현하는 데에는 전혀 사용할 수 없을 뿐만 아니라 높은 해상도의 이미징을 얻을 수 없는 문제점이 존재한다.
한국등록특허 제10-1997138호, "그래핀의 화학반응 투명성을 이용하는 방법" 한국공개특허 제10-2018-0065747호, "히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 산화물을 포함하는 나노그래핀센서" 한국공개특허 제10-2020-0069414호, "전자 현미경 관찰용 그래핀 복합체 및 시료 기판의 제조 방법"
본 발명은 세포 배양 배지가 포함된 그래핀을 이용하여 용액에서 처리되지 않은 살아 있는 상태의 세포가 포함된 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법 및 장치를 제공하는 것으로 목적으로 한다.
본 발명은 기초 생물학, 생의학, 전기 화학 및 재료 과학의 다양한 연구를 위한 미처리 세포 및 생체 시료를 위한 초고 진공 환경에서 체외 질량 이미징 분석(mass spectrometric imaging, MSI) 플랫폼을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 생체 시료가 그래핀에 덮힌 진공 상태에서도 세포 배양 배지를 공급하여 진공 상태에서 생체 시료의 세포가 살 수 있는 생체 시료의 환경을 제공함에 따라 상태가 손상되지 않은 세포막의 구조 및 성분에 대하여 이미징 분석을 수행하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 그래핀에 세포 배양 배지 기판을 추가하여 진공 상태에서도 세포의 수분을 유지하면서도 세포가 살아 있는 상태로 유지하고 전처리로 인한 세포 성분의 변형을 방지하는 것으로 목적으로 한다.
본 발명은 전자현미경을 이용한 고분해능 세포 구조 분석뿐만 아니라, 이차이온 이미징 분석 기술을 이용하여 살아있는 세포의 손상되지 않은 세포막의 구조와 성분을 분석하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법은 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계, 상기 생체 고분자막 상에서 배양된 세포의 세포막을 향해 상기 세포 배양 배지가 그래핀과 상기 세포막 사이에 포함되고, 상기 그래핀이 상기 세포막을 덮도록 상기 세포가 캡핑(capping)되는 생체 시료를 준비하는 단계 및 상기 생체 시료에 대한 질량분석 이미징 또는 초고진공 기반 이미징을 수행하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계 는 상기 기판의 양면(both side)에 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막을 증착 형성하는 단계, 상기 기판의 전면부(front side)에서 포토 레지스트(photo resist)를 이용하여 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 마이크로 홀의 어레이를 패턴화하는 단계, 상기 기판의 후면부(back side)의 중앙을 에칭하여 상기 마이크로 홀의 어레이를 노출 시키는 단계, 상기 마이크로 홀의 어레이 상에 상기 생체 고분자막을 형성 하는 단계 및 상기 마이크로 홀의 어레이를 통해 상기 세포 배양 배지를 상기 기판 상에 주입시켜서 상기 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 마이크로 홀의 어레이를 통해 상기 세포 배양 배지를 상기 기판 상에 주입시켜서 상기 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계는 상기 기판의 후면부(back side)의 중앙에 고밀도 폴리에틸렌 필름을 위치시키는 단계, 상기 고밀도 폴리에틸렌 필름 상에 상기 세포 배양 배지를 주입시키는 단계 및 상기 세포 배양 배지를 유리 기판 및 접착제를 이용하여 밀봉하여 상기 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 마이크로 홀의 어레이 상에 상기 생체 고분자막을 형성 하는 단계는 상기 생체 고분자막의 두께를 1 ㎛ 이상으로 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생체 고분자막은 상기 세포의 배양 및 상기 세포 배양 배지의 확산을 지원하고, 상기 질량분석 이미징이 수행될 경우, 상기 마이크로 홀의 어레이에 의한 간섭을 방지할 수 있다.
상기 기판의 전면부(front side)에서 포토 레지스트(photo resist)를 이용하여 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 마이크로 홀의 어레이를 패턴화하는 단계는, 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 1 ㎛의 크기를 갖는 복수의 마이크로 홀을 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 간격으로 포함하는 마이크로 홀의 어레이를 패턴화하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생체 시료는 상기 그래핀이 덮여 있는 상태에서도 상기 세포에 지속적으로 상기 세포 배양 배지를 공급하여 초고진공에서도 상기 세포가 살 수 있는 환경을 제공할 수 있다.
상기 생체 시료에 대한 질량분석 이미징 또는 초고진공 기반 이미징을 수행하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계는 상기 생체 시료에 일차 이온빔 및 가속 전자빔 중 어느 하나의 빔을 주사하고, 상기 세포막으로부터 이차 이온 및 이차 전자 중 어느 하나를 수집하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생체 고분자막은 콜라겐 막 및 라미닌 막 중 적어도 하나의 생체 고분자막을 포함할 수 있다.
상기 초고진공 기반 이미징은 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 이미징 및 헬륨 이온 현미경(Helium ion microscopy, HIM) 이미징 중 적어도 하나의 초고진공 기반 이미징을 포함할 수 있다.
상기 세포는 상기 세포 배양 배지를 지속적으로 공급 받음에 따라 초고진공에서도 40분 내지 60분 동안 살아 있는 상태를 유지할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 장치는 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 포함하되, 상기 생체 고분자막 상에서 배양된 세포의 세포막을 향해 상기 세포 배양 배지가 그래핀과 상기 세포막 사이에 포함되고, 상기 그래핀이 상기 세포막을 덮도록 상기 세포가 캡핑(capping)되는 생체 시료, 상기 생체 시료에 일차 이온빔 및 가속 전자빔 중 어느 하나의 빔을 주사하는 빔 발생부 및 상기 세포막으로부터 상기 주사된 일차 이온빔과 관련된 이차 이온 또는 상기 주사된 가속 전자빔과 관련된 이차 전자를 수집하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 이미징 분석부를 포함할 수 있다.
상기 생체 시료는 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막을 포함하고, 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막의 일부 영역이 마이크로 홀의 어레이로 패턴화되며, 상기 마이크로 홀의 어레이 상에 형성된 생체 고분자막을 포함할 수 있다.
상기 생체 시료는 상기 그래핀이 덮여 있는 상태에서도 상기 세포에 지속적으로 상기 세포 배양 배지를 공급하여 초고진공에서도 상기 세포가 살 수 있는 환경을 제공할 수 있다.
상기 생체 고분자막은 상기 세포의 배양 및 상기 세포 배양 배지의 확산을 지원하고, 상기 질량분석 이미징이 수행될 경우, 상기 마이크로 홀의 어레이에 의한 간섭을 방지할 수 있다.
상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막은 1 ㎛의 크기를 갖는 복수의 마이크로 홀이 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 간격으로 포함되는 마이크로 홀의 어레이를 포함할 수 있다.
본 발명은 세포 배양 배지가 포함된 그래핀을 이용하여 용액에서 처리되지 않은 살아 있는 상태의 세포가 포함된 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법 및 장치를 제공할 수 있다.
본 발명은 기초 생물학, 생의학, 전기 화학 및 재료 과학의 다양한 연구를 위한 미처리 세포 및 생체 시료를 위한 초고 진공 환경에서 체외 질량 분석 이미징(mass spectrometric imaging, MSI) 플랫폼을 제공할 수 있다.
본 발명은 생체 시료가 그래핀에 덮힌 진공 상태에서도 세포 배양 배지를 공급하여 진공 상태에서 생체 시료의 세포가 살 수 있는 생체 시료의 환경을 제공함에 따라 상태가 손상되지 않은 세포막의 구조 및 성분에 대하여 이미징 분석을 수행할 수 있다.
본 발명은 그래핀에 세포 배양 배지 기판을 추가하여 진공 상태에서도 세포의 수분을 유지하면서도 세포가 살아 있는 상태로 유지하고 전처리로 인한 세포 성분의 변형을 방지할 수 있다.
본 발명은 전자현미경을 이용한 고분해능 세포 구조 분석뿐만 아니라, 이차이온 이미징 분석 기술을 이용하여 살아있는 세포의 손상되지 않은 세포막의 구조와 성분을 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법을 설명하는 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료를 설명하는 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료 상에 스퍼터링(sputtering) 과정을 설명하는 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 설명하는 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 광학 이미지 및 전자 현미경 이미지를 설명하는 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 이미지를 시간 경과에 따라 설명하는 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 Ab-initio 분자 역학(Ab-initio molecular dynamics, AIMD) 시뮬레이션을 설명하는 도면이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 다양한 세포의 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 설명하는 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료의 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 결과를 설명하는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 장치를 설명하는 도면이다.
도 8a 내지 도 8i는 본 발명의 일실시예에 따른 습식 세포 배양된 생체 시료를 제조하는 생체 시료의 제조 방법을 설명하는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료를 설명하는 도면이다.
이하, 본 문서의 다양한 실시 예들이 첨부된 도면을 참조하여 기재된다.
실시 예 및 이에 사용된 용어들은 본 문서에 기재된 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 해당 실시 예의 다양한 변경, 균등물, 및/또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
하기에서 다양한 실시 예들을 설명에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 다양한 실시 예들에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
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본 명세서에서, "~하도록 구성된(또는 설정된)(configured to)"은 상황에 따라, 예를 들면, 하드웨어적 또는 소프트웨어적으로 "~에 적합한," "~하는 능력을 가지는," "~하도록 변경된," "~하도록 만들어진," "~를 할 수 있는," 또는 "~하도록 설계된"과 상호 호환적으로(interchangeably) 사용될 수 있다.
어떤 상황에서는, "~하도록 구성된 장치"라는 표현은, 그 장치가 다른 장치 또는 부품들과 함께 "~할 수 있는" 것을 의미할 수 있다.
예를 들면, 문구 "A, B, 및 C를 수행하도록 구성된(또는 설정된) 프로세서"는 해당 동작을 수행하기 위한 전용 프로세서(예: 임베디드 프로세서), 또는 메모리 장치에 저장된 하나 이상의 소프트웨어 프로그램들을 실행함으로써, 해당 동작들을 수행할 수 있는 범용 프로세서(예: CPU 또는 application processor)를 의미할 수 있다.
또한, '또는' 이라는 용어는 배타적 논리합 'exclusive or' 이기보다는 포함적인 논리합 'inclusive or' 를 의미한다.
즉, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 'x가 a 또는 b를 이용한다' 라는 표현은 포함적인 자연 순열들(natural inclusive permutations) 중 어느 하나를 의미한다.
이하 사용되는 '..부', '..기' 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어, 또는, 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법을 설명하는 도면이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법을 설명한다.
도 1을 참고하면, 단계(101)에서 이미징 분석 방법은 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법은 기판의 양면에 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막을 증착 형성하고, 기판의 전면부에서 포토 레지스트를 이용하여 실리콘 나이트라이드 박막에 마이크로 홀의 어레이를 패턴화 시킨다.
예를 들어, 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법은 실리콘 나이트라이드 박막에 1 ㎛의 크기를 갖는 복수의 마이크로 홀을 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 간격으로 포함하는 마이크로 홀의 어레이를 패턴화할 수 있다.
또한, 이미징 분석 방법은 기판의 후면부의 중앙을 에칭(etching)하여 마이크로 홀의 어레이를 노출시키고, 마이크로 홀의 어레이 상에 생체 고분자막을 형성하며, 마이크로 홀의 어레이를 통해 세포 배양 배지를 기판 상에 주입시켜서 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하되, 기판의 후면부의 중앙에 고밀도 폴리에틸렌 필름(high density polyethylene, HDPE)을 위치시키고, 고밀도 폴리에틸렌 필름 상에 세포 배양 배지를 주입시키고 세포 배양 배지를 유리 기판 및 접착제를 이용하여 밀봉함에 따라 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 생체 고분자막은 콜라겐 막 및 라미닌 막 중 적어도 하나의 생체 고분자막을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법은 생체 고분자막의 두께를 1 ㎛ 이상으로 형성할 수 있다. 여기서, 생체 고분자막은 콜라겐 막일 수 있다.
예를 들어, 생체 고분자막은 세포의 배양 및 세포 배양 배지의 확산을 지원하며, 질량분석 이미징이 수행될 경우, 마이크로 홀의 어레이에 의한 간섭을 방지할 수 있다.
또한, 생체 고분자막은 세포 흡착을 증가시키고, 친수성으로 세포 흡착 증가 생체 고분자막을 포함할 수 있다.
또한, 생체 고분자막은 친수성 생체 고분자막으로 지칭될 수 있다.
단계(102)에서 이미징 분석 방법은 생체 고분자막 상의 세포막을 향해 세포 배양 배지를 포함하는 그래핀이 세포막을 덮도록 그래핀을 이용하여 세포를 캡핑하여 생체 시료를 준비할 수 있다.
즉, 이미징 분석 방법은 그래핀이 세포막을 덮어 세포막이 진공 상태가 되더라도 세포 배양 배지가 생체 고분자막을 통해 세포막으로 공급됨에 따라 세포의 생존 시간이 증가된 생체 시료를 준비할 수 있다. 예를 들어, 생체 시료는 생체 시료 기판으로 지칭될 수 있다.
단계(103)에서 이미징 분석 방법은 세포막의 구조와 성분을 분석할 수 있다.
즉, 이미징 분석 방법은 생체 시료에 일차 이온빔 및 가속 전자빔 중 어느 하나의 빔을 주사하고, 세포막으로부터 일차 이온빔과 관련된 이차 이온 및 가속 전자빔과 관련된 이차 전자를 수집하여 세포막의 구조와 성분에 대한 이미징 분석을 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 이미징 분석 방법은 생체 시료에 대한 질량분석 이미징 또는 초고진공 기반 이미징을 수행하여 세포막의 구조와 성분을 분석할 수 있다.
예를 들어, 초고진공 기반 이미징은 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 이미징 및 헬륨 이온 현미경(Helium ion microscopy, HIM) 이미징 중 적어도 하나의 초고진공 기반 이미징을 포함할 수 있다.
예를 들어, 세포는 세포 배양 배지를 지속적으로 공급 받음에 따라 초고진공에서도 40분 내지 60분 동안 살아 있을 수 있다.
따라서, 본 발명은 기초 생물학, 생의학, 전기 화학 및 재료 과학의 다양한 연구를 위한 미처리 세포 및 생체 시료를 위한 초고 진공 환경에서 체외 질량 분석 이미징(mass spectrometric imaging, MSI) 플랫폼을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체 시료가 그래핀에 덮힌 초고진공 상태에서도 세포 배양 배지를 공급하여 진공 상태에서 생체 시료의 세포가 살 수 있는 생체 시료의 환경을 제공함에 따라 상태가 손상되지 않은 세포막의 구조 및 성분에 대하여 이미징 분석을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 그래핀에 세포 배양 배지 기판을 추가하여 초고진공 상태에서도 세포의 수분을 유지하면서도 세포가 살아 있는 상태로 유지하고 전처리로 인한 세포 성분의 변형을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명은 전자현미경을 이용한 고분해능 세포 구조 분석뿐만 아니라, 이차이온 이미징 분석 기술을 이용하여 살아있는 세포의 손상되지 않은 세포막의 구조와 성분을 분석할 수 있다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료를 설명하는 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련하여 이미징 분석을 위한 그래핀으로 세포가 캡핑된 생체 시료의 구성 및 이차이온질량 분석의 개념을 예시한다.
도 2a를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료는 하부부터 유리 기판(200), 접착제(201), 고밀도 폴리에틸렌 필름(202), 세포 배양 배지(203), 실리콘 기판(204), 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막(205), 생체 고분자막(206), 세포(207), 세포 배양 배지(203) 및 그래핀(208) 순서로 위치할 수 있다.
생체 시료의 제조 과정은 도 8a 내지 도 8i를 이용하여 보충 설명하도록 한다.
일례로, 그래핀(208)은 세포(207)를 진공 상태로 캡핑(capping)하고 있으며, 세포(207)와 그래핀(208) 사이에 세포 배양 배지(203)가 위치하고, 세포(207)는 생체 고분자막(206) 상에 배양된다.
세포 배양 배지(203)는 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 형성된 복수의 마이크로 홀로 구성된 마이크로 홀의 어레이를 통해 생체 고분자막(206)과 세포(207)에 공급되어 세포(207)가 살아있는 상태를 유지할 수 있다.
또한, 마이크로 홀은 1 ㎛의 크기를 갖는데, 생체 고분자막(206)이 1 ㎛ 이상의 두께로 형성됨에 따라 세포 배양 배지(203)의 공급에서 마이크로 홀의 영향을 제거한다.
생체 시료에는 일차 이온빔(209)이 주사되고, 생체 시료로부터 일차 이온빔(209)과 관련하여 이차 이온이 발생하고, 이차 이온이 수집되어 세포막의 구조와 성분이 분석될 수 있다.
여기서, 생체 시료에는 가속 전자빔이 주사되고, 생체 시료로부터 가속 전자빔과 관련된 이차 전자가 발생하고, 이차 전자가 수집되어 세포막의 구조와 성분이 분석될 수 있다.
생체 시료에 주사된 일차 이온빔(209)과 관련하여 이차 이온이 발생되는 과정과 관련하여 특정 영역(210)을 확장하여 도 2b를 이용하여 보충설명한다.
도 2b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료 상에 스퍼터링(sputtering) 과정을 설명하는 도면이다.
도 2b를 참고하면, 도 2a의 특정 영역(210)의 외부는 진공(211) 상태이고, 그래핀(212)에 의해 캡핑되어 있으며, 세포는 탄수화물(213), 액체(214), 막관통 단백질(215), 인지질(216), 지방산 꼬리(217), 세포 골격(218) 및 콜레스테롤(219)으로 이루어져 있고, 이차 이온(220)이 일차 이온빔의 주사와 관련하여 발생될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 이미징 분석 방법은 생체 시료 상에 스퍼터링(sputtering) 과정을 통해 세포를 구성하는 탄수화물(213), 액체(214), 막관통 단백질(215), 인지질(216), 지방산 꼬리(217), 세포 골격(218) 및 콜레스테롤(219)에 대한 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 획득할 수 있다.
원자 및 분자 2 차 이온의 탈착을 허용하는 그래핀(212) 구조의 일시적인 파괴 후, 그래핀(212)의 자가 재 조립 공정은 1014 / cm2 이온 용량 내에서 그래 핀층의 불 투과성을 파괴하는 대규모 결함을 생성하지 않고 그래핀 구조를 복원할 수 있다.
도 3a는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 설명하는 도면이다.
도 3a를 참고하면, SIMS 이미지(300)는 콜레스테롤(cholesterol)을 나타낼 수 있고, SIMS 이미지(301)는 포스포 에탄올 아민(phosphoethanolamine)을 나타낼 수 있으며, SIMS 이미지(303)는 팔라미틱 산(palmitic acid)을 나타낼 수 있고, SIMS 이미지(304)는 올레릭 산(oleic acid)을 나타낼 수 있다.
SIMS 이미지(300)를 참고하면 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법은 C27H45 +, m/z 369.25에서 콜레스테롤과 같은 온전한 세포막 지질의 분포를 관찰할 수 있다.
또한, SIMS 이미지(301)를 참고하면 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법은 C2H9NPO4 +, m/z 142.06에서 포스포 에탄올 아민의 세포막 지질의 분포를 관찰할 수 있다.
또한, SIMS 이미지(302) 및 SIMS 이미지(303)을 참고하면 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법은 C16H31O2 -, m/z 255.25 및 C18H32O2 -, m/z 281.26에서 팔라미틱 산 및 올레릭 산과 같은 다양한 지방산을 관찰 할 수 있다.
여기서, SIMS 이미지(300, 301, 302, 303)는 10분 이내에 촬영되었다.
도 3b는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 광학 이미지 및 전자 현미경 이미지를 설명하는 도면이다.
도 3b는 생체 시료 상의 세포의 광학 이미지 및 전자 현미경 이미지를 예시한다.
도 3b를 참고하면, 광학 이미지(310)와 전자 현미경 이미지(311)를 나타내며 도 3a의 SIMS 이미지(300, 301, 302, 303)와 비교하면 세포의 구조를 유사하게 개시한다.
광학 이미지(310)는 생체 시료에서 그래핀을 이용하여 세포를 캡핑한 후 15 분 후 마이크로 홀 근처의 세포 모양과 세포 내 구조가 큰 변화가 없음을 예시한다.
전자 현미경 이미지(311)는 6.02 x 1012 / cm2 이온 선량으로 충격을 받은 후 그래핀으로 덮인 세포에서 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM)을 통해 관찰 할 수 있는 결함이 존재하지 않음을 나타낼 수 있다.
도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 이미지를 시간 경과에 따라 설명하는 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 세포 생존력을 확인하기 위한 형광 이미지를 예시한다.
도 3c를 참고하면, 형광 이미지(320)는 그래핀 캡핑 후 40분이 경과한 상태를 나타낼 수 있고, 형광 이미지(321)는 그래핀 캡핑 후 60분이 경과한 상태를 나타낼 수 있다.
형광 이미지(320) 및 형광 이미지(321)는 그래핀 캡핑 후 40분 또는 60분 경과 후 살아 있는 세포를 손쉽게 확인할 수 있도록 지원한다.
형광 이미지(320)와 형광 이미지(321)는 네모 점선을 이용하여 마이크로 홀의 어레이를 나타내고 있는데, 형광 이미지(320)와 형광 이미지(321)를 비교하면 마이크로 홀의 어레이 주변의 세포의 변화가 적음을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료는 세포와 생체 고분자막에 실리콘 나이트라이드 막에 형성된 마이크로 홀의 어레이를 통해 세포 배양 배지를 공급함에 따라 그래핀에 의해 진공 상태로 캡핑된 세포의 생존력을 증가시킬 수 있다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 Ab-initio 분자 역학(Ab-initio molecular dynamics, AIMD) 시뮬레이션을 설명하는 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 Ab-initio 분자 역학(Ab-initio molecular dynamics, AIMD) 시뮬레이션을 수행하기 위해 그래핀의 중앙에 나트륨 원자를 배치하고, 그래핀의 상면(400), 사선면(401), 전면(402)의 이미지를 제공하면서 각 그래핀의 높이 변화 그래프(403)를 함께 예시한다.
나트륨 원자의 에너지 2 차 이온 시퀀스가 그래핀 기저면(bottom surface)에 수직으로 접근하고, 설정 스케일의 과도 구멍을 통과하고 이후 자체 어닐링된 그래핀에서 탈착될 수 있다.
도 4b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 Ab-initio 분자 역학(Ab-initio molecular dynamics, AIMD) 시뮬레이션을 수행하기 위해 그래핀의 중앙에 산소 원자를 배치하고, 그래핀의 상면(410), 사선면(411), 전면(412)의 이미지를 제공하면서 각 그래핀의 높이 변화 그래프(413)를 함께 예시한다.
산소 원자의 에너지 2 차 이온 시퀀스가 그래핀 기저면에 수직으로 접근하고, 설정 스케일의 과도 구멍을 통과하고 이후 자체 어닐링 된 그래핀에서 탈착될 수 있다.
스퍼터링 된 산소 이온은 방출 될 충분한 에너지(> 25eV)가 없는 경우 산화 그래핀을 형성 할 수 있다.
즉, AIMD 시뮬레이션은 스퍼터링 된 2차 이온이 충돌 캐스케이드 동안 일시적으로 그래핀 상에 구멍이 발생하나 2차 이온 방출 후 자체 어닐링 될 수 있음을 나타낸다.
2차 원자 이온의 에너지 분포는 약 5eV28에서 피크로 100eV 이상으로 확장될 수 있다.
시간 척도는 Ab-initio 분자 역학(Ab-initio molecular dynamics, AIMD) 시뮬레이션에서 탄소 원자의 이완 시간을 나타낼 수 있다.
무한한 단일 층의 그래 핀은 나노 미터 단위의 격자 매개 변수가 1.97, 1.70, 3.00인 사방 정계 단위 셀로 표시될 수 있다.
단일 나트륨 원자가 다양한 z 값의 위치 (0, 0, z)에 추가되고 VASP 코드에서 구현 된 AIMD 시뮬레이션을 나타낸다.
코어 전자는 최대 600eV의 운동 에너지까지의 평면파에 의해 프로젝터로 증강 된 파동의 의사 전위와 원자가 전자로 나타낼 수 있다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 다양한 세포의 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 설명하는 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 콜레스테롤의 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 시간의 경과에 따라 예시한다.
도 5a를 참고하면, SIMS 이미지(500), SIMS 이미지(501), SIMS 이미지(502), SIMS 이미지(503) 각각은 5분, 10분, 20분 및 30분 경과 후의 콜레스테롤의 ToF-SIMS 이미지를 나타낸다.
SIMS 이미지(500), SIMS 이미지(501), SIMS 이미지(502), SIMS 이미지(503)는 5분 또는 10분 마다 획득되었고, 10분 이내에 촬영한 ToF-SIMS 이미지는 심각한 저하가 없으며, 이미지의 배율은 100㎛이다.
도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 팔미틱 산(palmitic acid)의 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지를 시간의 경과에 따라 예시한다.
도 5b를 참고하면, SIMS 이미지(510), SIMS 이미지(511), SIMS 이미지(512), SIMS 이미지(513) 각각은 5분, 10분, 20분 및 30분 경과 후의 팔미틱 산의 ToF-SIMS 이미지를 나타낸다.
SIMS 이미지(510), SIMS 이미지(511), SIMS 이미지(512), SIMS 이미지(513)는 5분 또는 10분 마다 획득되었고, 10분 이내에 촬영한 ToF-SIMS 이미지는 심각한 저하가 없으며, 이미지의 배율은 100㎛이다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료의 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 결과를 설명하는 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 방법과 관련된 생체 시료와 관련하여 세포막 완전성 및 세포 기능에서 콜레스테롤의 중요한 역할을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 메틸-
Figure 112020117589300-pat00001
시클로 덱스트린 (M
Figure 112020117589300-pat00002
CD)을 사용하여 세포막에서 콜레스테롤을 추출하는 과정은 다른 M
Figure 112020117589300-pat00003
CD 처리 시간으로 콜레스테롤 이미지를 통한 결과를 예시한다.
콜레스테롤 강도가 높은 세포의 수는 M
Figure 112020117589300-pat00004
CD 처리 시간이 길어짐에 따라 점진적으로 감소하고 세포 형태가 축소 및 왜곡될 수 있음을 나타낸다.
또한, 단일 세포의 콜레스테롤 이미지에서 픽셀 당 10 카운트 이상의 픽셀을 가진 세포를 분석했을 때 콜레스테롤 수치가 높은 세포의 수가 급격히 감소하는 것이 더 분명하게 나타내고 있다.
이 결과는 M
Figure 112020117589300-pat00005
CD 처리 후 30 분 이내에 콜레스테롤이 풍부한 세포막 영역에서 콜레스테롤 분자가 더 빨리 추출됨을 보여 주고 있다.
도 6a는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료 상에서 0분 동안 M
Figure 112020117589300-pat00006
CD 처리 후 추출한 콜레스테롤을 그래핀으로 캡핑한 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지(600), 개별 세포에 대한 총 양이온 2 차 이온 강도로 정규화 된 콜레스테롤 강도의 상대 주파수 히스토그램(601), 콜레스테롤 이미지의 각 픽셀에서 10 개 이상의 카운트를 갖는 콜레스테롤의 상대 주파수 히스토그램(602)을 예시한다.
도 6b는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료 상에서 30분 동안 M
Figure 112020117589300-pat00007
CD 처리 후 추출한 콜레스테롤을 그래핀으로 캡핑한 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지(610), 개별 세포에 대한 총 양이온 2 차 이온 강도로 정규화 된 콜레스테롤 강도의 상대 주파수 히스토그램(611), 콜레스테롤 이미지의 각 픽셀에서 10 개 이상의 카운트를 갖는 콜레스테롤의 상대 주파수 히스토그램(612)을 예시한다.
도 6c는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료 상에서 45분 동안 M
Figure 112020117589300-pat00008
CD 처리 후 추출한 콜레스테롤을 그래핀으로 캡핑한 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지(620), 개별 세포에 대한 총 양이온 2 차 이온 강도로 정규화 된 콜레스테롤 강도의 상대 주파수 히스토그램(621), 콜레스테롤 이미지의 각 픽셀에서 10 개 이상의 카운트를 갖는 콜레스테롤의 상대 주파수 히스토그램(622)을 예시한다.
도 6d는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료 상에서 60분 동안 M
Figure 112020117589300-pat00009
CD 처리 후 추출한 콜레스테롤을 그래핀으로 캡핑한 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지(630), 개별 세포에 대한 총 양이온 2 차 이온 강도로 정규화 된 콜레스테롤 강도의 상대 주파수 히스토그램(631), 콜레스테롤 이미지의 각 픽셀에서 10 개 이상의 카운트를 갖는 콜레스테롤의 상대 주파수 히스토그램(632)을 예시한다.
도 6a 내지 도 6d를 참고하면 콜레스테롤 분자는 콜레스테롤 농도가 높은 지역에서 더 빨리 추출될 수 있다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 장치를 설명하는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 장치의 구성 요소를 예시한다.
도 7을 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 이미징 분석 장치(700)는 생체 시료 생성부(710), 빔 발생부(720) 및 질량 이미징 분석부(730)를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 생체 시료 생성부(710)는 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 포함하되, 생체 고분자막 상에서 배양된 세포의 세포막을 향해 세포 배양 배지가 그래핀과 세포막 사이에 포함되고, 그래핀이 세포막을 덮도록 그래핀을 이용하여 세포를 캡핑하여 생체 시료를 생성할 수 있다.
일례로, 생체 시료 생성부(710)는 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판에 포함되는 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막을 포함하도록 생체 시료를 생성할 수 있다.
예를 들어, 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막은 마이크로 홀의 어레이로 패턴화될 수 있다.
또한, 마이크로 홀의 어레이 상에 형성된 생체 고분자막은 생체 시료에 포함될 수 있다.
예를 들어, 생체 고분자막은 세포의 배양 및 세포 배양 배지의 확산을 지원하고, 이미징 분석이 수행될 경우, 마이크로 홀의 어레이에 의한 간섭을 방지할 수 있다.
예를 들어, 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막은 1 ㎛의 크기를 갖는 복수의 마이크로 홀이 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 간격으로 포함되는 마이크로 홀의 어레이를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 빔 발생부(720)는 생체 시료 생성부(710)에 의해 생성된 생체 시료에 일차 이온빔 또는 투과 전자빔을 주사할 수 있다.
일례로, 빔 발생부(720)는 생체 시료 생성부(710)에 의해 생성된 생체 시료에 주사되는 일차 이온빔 또는 투과 전자빔의 방향 및 크기를 조절할 수 있다.
예를 들어, 빔 발생부(720)는 생체 시료 생성부(710)에 의해 생성된 생체 시료에 30 keV의 일차 이온빔을 주사할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 질량 이미징 분석부(730)는 세포막으로부터 일차 이온빔과 관련된 이차 이온을 수집하거나 투과 전자빔과 관련된 가속 전자를 수집하여 세포막의 구조와 성분을 분석하기 이 위한 복수의 이미지들을 생성하고, 생성된 복수의 이미지들에 기반하여 세포막의 구조와 성분을 분석할 수 있다.
일례로, 질량 이미징 분석부(730)는 이차 이온 또는 가속 전자를 수집하여 이미징 분석을 수행함에 따라 세포막, 나노 및 바이오 인터페이스의 심각한 왜곡 없이 상세하고 초고 함량 분자 정보를 공개할 수 있다.
질량 이미징 분석부(730)는 펄스 30keV Bi3를 사용하여 256 x 256 픽셀의 500 x 500 ㎛2영역에서 양이온 및 음이온 ToF-SIMS 이미지에 대해 6.02 x 1011 ions / cm2 (분석 시간: 10 분)의 일차 이온 용량을 사용하는 지연 추출 모드의 일차 이온 빔에 대한 이차 이온을 수집하여 이미징 분석을 수행한다.
모든 비행시간형 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS)스펙트럼에 대한 내부 질량 보정은 양이온 모드의 경우 CH3 +, Na+, C2H3 +, C3H5 + 및 C4H7 +의 피크를 사용하고 음이온의 경우 C-, C2 -, C3 - 및 C4 -를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 질량 이미징 분석부(730)는 저속 SIMS 이미징을 30 분 동안 수행 한 후 5 분 또는 10 분마다 획득 한 이미지를 순차적으로 추출하여 데이터를 분석을 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포 배양 배지가 포함된 그래핀을 이용하여 용액에서 처리되지 않은 살아 있는 상태의 세포가 포함된 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법 및 장치를 제공할 수 있다.
도 8a 내지 도 8i는 본 발명의 일실시예에 따른 습식 세포 배양된 생체 시료를 제조하는 생체 시료의 제조 방법을 설명하는 도면이다.
도 8a를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 저 응력(low-stress) 실리콘 나이트라이드(Si3N4)를 플라즈마 강화 화학 기상 증착 방법을 이용하여 실리콘 기판(800)의 양면(both side)에 실리콘 나이트라이드 박막(801)을 형성한다.
예를 들어, 실리콘 나이트라이드 박막(801)은 약 100nm의 두께로 증착 형성될 수 있다.
도 8b를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 포토 레지스트(802)를 이용하여 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 전면부(front side)에 40 X 40 ㎛2 크기의 마이크로 홀의 3 X 3 어레이 또는 2 X 2 어레이를 패턴화한다.
예를 들어, 하나의 홀의 크기는 1 ㎛이고, 하나의 홀과 하나의 홀 사이 간격은 약 3㎛ 내지 4㎛일 수 있다.
도 8c를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 후면부(back side) 중앙에 큰 크기의 윈도우(window)를 형성한다.
예를 들어, 윈도우의 크기는 2.5 X 2.5 ㎜2일 수 있다.
도 8d를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 양면에서 포토 레지스트를 박리(stripped off)하여 제거 한다.
도 8e를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 기판(800)의 후면부(back side)를 에칭하여 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 마이크로 홀 어레이를 노출시킨다.
즉, 생체 시료의 제조 방법은 포토 레지스트(802)를 플라즈마 애칭(etching)으로 실리콘 기판(800)에서 벗겨 낸 다음 실리콘 기판(800)의 뒷면을 80도에서 30 % 수산화 칼륨(KOH) 용액으로 에칭하여 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 마이크로 홀 어레이를 노출시킬 수 있다.
도 8f를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 기판(800)의 전면부 상에 생체 고분자막(803)을 코팅한다.
예를 들어, 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 마이크로 홀 어레이를 증류수(distilled water, DW)에서 1 시간 동안 3 회(특히 남아있는 염분을 제거하기 위해) 세척하고 공기 중에서 건조하여 마이크로 홀 위에 생체 고분자막(803)을 생성한다. 예를 들어, 생체 고분자막(803)은 1 ㎛ 이상의 두께를 갖을 수 있다. 여기서, 생체 고분자막(803)은 콜라겐 막 또는 콜라겐 필름일 수 있다.
도 8g를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 기판(800)의 중앙에 고밀도 폴리에틸렌(high density polyethylene, HDPE) 필름(804)을 위치하고, 고밀도 폴리에틸렌 필름(804) 상에 세포 배양 배지(805) 한방울을 구멍(hollow)을 통해 주입한다.
도 8h를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 웨이퍼 기판(800)의 후면에 유리 기판(806)을 위치하게 하고, 접착제(807)를 이용하여 세포 배양 배지(805)를 밀봉한다. 예를 들어, 접착제(807)는 UV 경화 광학 접착제일 수 있다.
도 8i를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료의 제조 방법은 실리콘 나이트라이드 박막(801)의 마이크로 홀 어레이 상에 위치하는 생체 고분자막(803) 상에서 세포(808)를 배양한 다음에 그래핀(810)을 이용하여 세포(808)를 캡핑(capping)하여 생체 시료를 제조한다. 여기서 그래핀(810)은 세포(808)와 맞닿는 부분에 세포 배양 배지(809)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 생체 시료의 제조 방법은 세포(808)를 배양하기 위해 포름 알데히드를 사용한 화학적 고정을 하고, 세포를 37
Figure 112020117589300-pat00010
에서 5 분 동안 인산염 완충 식염수 (PBS, Gibco)로 3 회 세척하고 실온에서 10 분 동안 10 % 포르말린 용액 (Sigma Aldrich)에 고정 후 고정 된 세포를 PBS(phosphate　buffer　saline)로 3 회 세척하고 4
Figure 112020117589300-pat00011
에서 PBS에 보관하고, 세포를 150mM 암모늄 아세테이트 용액 (AAs, DAEJUNG, Korea)으로 헹구고 공기 건조시킨다.
또한, 별도의 고정 방법으로 세포를 PBS (Electron Microscopy Sciences)의 4 % 글루 타르 알데히드에서 실온에서 30 분 동안 고정하고, PBS에서 3 회 헹구고, 증류수에서 5 분 동안 2 회 더 헹구고, 세포를 0.4 % 사 산화 오스뮴 용액 (Sigma Aldrich)에 실온에서 15 분 동안 후 고정하고 증류수에서 5 분 동안 3 회 헹구고 공기 건조시킨다.
콜레스테롤 추출을 위해 세포를 PBS로 두 번 세척하고 10mM M
Figure 112020117589300-pat00012
CD (Sigma Aldrich)가있는 배양 배지에서 30, 45 및 60 분 동안 37
Figure 112020117589300-pat00013
에서 세포(808)가 생체 고분자막(803)상에 배양시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 기초 생물학, 생의학, 전기 화학 및 재료 과학의 다양한 연구를 위한 미처리 세포 및 생체 시료를 위한 초고 진공 환경에서 체외 질량 이미징 분석(mass spectrometric imaging, MSI) 플랫폼을 제공할 수 있다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료를 설명하는 도면이다.
도 9는 다양한 각도에서 촬영된 생체 시료의 이미지들과 생체 시료의 어느 한 부위의 마이크로 홀 어레이(microhole array)를 다양한 배율의 이미지들로 예시한다.
도 9를 참고하면, 이미지(900)는 생체 시료의 전면부를 나타낼 수 있고, 이미지(910)는 생체 시료의 후면부를 나타낼 수 있으며, 이미지(920)는 생체 시료의 측면부를 나타낼 수 있다.
예를 들어, 생체 시료는 세포 배양 습식 기판(cell culture wet substrate)을 포함할 수 있다.
이미지(900), 이미지(910) 및 이미지(920)를 참고하면, 본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료는 마이크로 홀 어레이 Si3N4 막을 포함하는 기판(substrate)를 포함한다.
이미지(901), 이미지(902) 및 이미지(903)은 마이크로 홀 어레이 Si3N4 막을 각각 서로 다른 배율의 이미지로 예시한다. 예를 들어, 마이크로 홀 어레이 Si3N4 막은 마이크로 홀 어레이가 패터딩된 Si3N4 막을 지칭할 수 있다.
이미지(901)의 배율은 100㎛이고, 이미지(902)의 배율은 40㎛이며, 이미지(903)의 배율은 10㎛이다.
본 발명의 일실시예에 따른 생체 시료는 40 X 40 ㎛2 크기의 마이크로 홀의 3 X 3 어레이가 네 개의 세트로 형성될 경우, 그래핀 상의 마이크로 크랙(micro crack) 없이 생체 시료의 이차이온질량 분석(secondary ion mass spectrometry, SIMS) 이미지의 획득 성공률이 증가될 수 있다.
다만, 생체 시료의 마이크로 홀의 크기는 다양한 실시예에 따라 변경될 수 있으며, 상술한 수치에 한정되지 않는다.
이상에서 설명된 장치는 하드웨어 구성요소, 소프트웨어 구성요소, 및/또는 하드웨어 구성요소 및 소프트웨어 구성요소의 조합으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 실시예들에서 설명된 장치 및 구성요소는, 예를 들어, 프로세서, 콘트롤러, ALU(arithmetic logic unit), 디지털 신호 프로세서(digital signal processor), 마이크로컴퓨터, FPA(field programmable array), PLU(programmable logic unit), 마이크로프로세서, 또는 명령(instruction)을 실행하고 응답할 수 있는 다른 어떠한 장치와 같이, 하나 이상의 범용 컴퓨터 또는 특수 목적 컴퓨터를 이용하여 구현될 수 있다. 처리 장치는 운영 체제(OS) 및 상기 운영 체제 상에서 수행되는 하나 이상의 소프트웨어 애플리케이션을 수행할 수 있다. 또한, 처리 장치는 소프트웨어의 실행에 응답하여, 데이터를 접근, 저장, 조작, 처리 및 생성할 수도 있다. 이해의 편의를 위하여, 처리 장치는 하나가 사용되는 것으로 설명된 경우도 있지만, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 처리 장치가 복수 개의 처리 요소(processing element) 및/또는 복수 유형의 처리 요소를 포함할 수 있음을 알 수 있다. 예를 들어, 처리 장치는 복수 개의 프로세서 또는 하나의 프로세서 및 하나의 콘트롤러를 포함할 수 있다. 또한, 병렬 프로세서(parallel processor)와 같은, 다른 처리 구성(processing configuration)도 가능하다.
소프트웨어는 컴퓨터 프로그램(computer program), 코드(code), 명령(instruction), 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 포함할 수 있으며, 원하는 대로 동작하도록 처리 장치를 구성하거나 독립적으로 또는 결합적으로(collectively) 처리 장치를 명령할 수 있다. 소프트웨어 및/또는 데이터는, 처리 장치에 의하여 해석되거나 처리 장치에 명령 또는 데이터를 제공하기 위하여, 어떤 유형의 기계, 구성요소(component), 물리적 장치, 가상 장치(virtual equipment), 컴퓨터 저장 매체 또는 장치, 또는 전송되는 신호 파(signal wave)에 영구적으로, 또는 일시적으로 구체화(embody)될 수 있다. 소프트웨어는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템 상에 분산되어서, 분산된 방법으로 저장되거나 실행될 수도 있다. 소프트웨어 및 데이터는 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 기록 매체에 저장될 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (16)

  1. 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 방법에 있어서,
    생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계;
    상기 생체 고분자막 상에서 배양된 세포의 세포막을 향해 상기 세포 배양 배지가 그래핀과 상기 세포막 사이에 포함되고, 상기 그래핀이 상기 세포막을 덮도록 상기 세포가 캡핑(capping)되는 생체 시료를 준비하는 단계; 및
    상기 생체 시료에 대한 질량분석 이미징 또는 초고진공 기반 이미징을 수행하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계는,
    상기 기판의 양면(both side)에 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막을 증착 형성하는 단계;
    상기 기판의 전면부(front side)에서 포토 레지스트(photo resist)를 이용하여 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 마이크로 홀의 어레이를 패턴화하는 단계;
    상기 기판의 후면부(back side)의 중앙을 에칭하여 상기 마이크로 홀의 어레이를 노출 시키는 단계;
    상기 마이크로 홀의 어레이 상에 상기 생체 고분자막을 형성 하는 단계; 및
    상기 마이크로 홀의 어레이를 통해 상기 세포 배양 배지를 상기 기판 상에 주입시켜서 상기 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 홀의 어레이를 통해 상기 세포 배양 배지를 상기 기판 상에 주입시켜서 상기 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계는
    상기 기판의 후면부(back side)의 중앙에 고밀도 폴리에틸렌 필름을 위치시키는 단계;
    상기 고밀도 폴리에틸렌 필름 상에 상기 세포 배양 배지를 주입시키는 단계; 및
    상기 세포 배양 배지를 유리 기판 및 접착제를 이용하여 밀봉하여 상기 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 준비하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 홀의 어레이 상에 상기 생체 고분자막을 형성 하는 단계는
    상기 생체 고분자막의 두께를 1 ㎛ 이상으로 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생체 고분자막은 상기 세포의 배양 및 상기 세포 배양 배지의 확산을 지원하고, 상기 질량분석 이미징이 수행될 경우, 상기 마이크로 홀의 어레이에 의한 간섭을 방지하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기판의 전면부(front side)에서 포토 레지스트(photo resist)를 이용하여 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 마이크로 홀의 어레이를 패턴화하는 단계는,
    상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막에 1 ㎛의 크기를 갖는 복수의 마이크로 홀을 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 간격으로 포함하는 마이크로 홀의 어레이를 패턴화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생체 시료는 상기 그래핀이 덮여 있는 상태에서도 상기 세포에 지속적으로 상기 세포 배양 배지를 공급하여 초고진공에서도 상기 세포가 살 수 있는 환경을 제공하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생체 시료에 대한 질량분석 이미징 또는 초고진공 기반 이미징을 수행하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계는
    상기 생체 시료에 일차 이온빔 및 가속 전자빔 중 어느 하나의 빔을 주사하고, 상기 세포막으로부터 이차 이온 및 이차 전자 중 어느 하나를 수집하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 단계를 포함하는
    이미징 분석 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 생체 고분자막은 콜라겐 막 및 라미닌 막 중 적어도 하나의 생체 고분자막을 포함하는
    이미징 분석 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 초고진공 기반 이미징은 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 이미징 및 헬륨 이온 현미경(Helium ion microscopy, HIM) 이미징 중 적어도 하나의 초고진공 기반 이미징을 포함하는
    이미징 분석 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 상기 세포 배양 배지를 지속적으로 공급 받음에 따라 초고진공에서도 40분 내지 60분 동안 살아 있는 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 방법.
  12. 그래핀을 이용하여 살아있는 생체 시료의 세포막 구조 및 성분을 분석하는 이미징 분석 장치에 있어서,
    생체 고분자막이 형성된 세포 배양 배지를 포함하는 기판을 포함하되, 상기 생체 고분자막 상에서 배양된 세포의 세포막을 향해 상기 세포 배양 배지가 그래핀과 상기 세포막 사이에 포함되고, 상기 그래핀이 상기 세포막을 덮도록 상기 세포가 캡핑(capping)되는 생체 시료를 생성하는 생체 시료 생성부;
    상기 생체 시료에 일차 이온빔 및 가속 전자빔 중 어느 하나의 빔을 주사하는 빔 발생부; 및
    상기 세포막으로부터 상기 주사된 일차 이온빔과 관련된 이차 이온 또는 상기 주사된 가속 전자빔과 관련된 이차 전자를 수집하여 상기 세포막의 구조와 성분을 분석하는 이미징 분석부를 포함하고,
    상기 생체 시료는 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막을 포함하고, 상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막의 일부 영역이 마이크로 홀의 어레이로 패턴화되며, 상기 마이크로 홀의 어레이 상에 형성된 생체 고분자막을 포함하는
    이미징 분석 장치.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서,
    상기 생체 시료는 상기 그래핀이 덮여 있는 상태에서도 상기 세포에 지속적으로 상기 세포 배양 배지를 공급하여 초고진공에서도 상기 세포가 살 수 있는 환경을 제공하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 장치.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 생체 고분자막은 상기 세포의 배양 및 상기 세포 배양 배지의 확산을 지원하고, 질량분석 이미징이 수행될 경우, 상기 마이크로 홀의 어레이에 의한 간섭을 방지하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 장치.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 실리콘 나이트라이드(Si3Ni4) 박막은 1 ㎛의 크기를 갖는 복수의 마이크로 홀이 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 간격으로 포함되는 마이크로 홀의 어레이를 포함하는 것을 특징으로 하는
    이미징 분석 장치.
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