KR102482658B1

KR102482658B1 - 비마토프로스트를 포함하는 국소 투여용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102482658B1
Application number: KR1020210173519A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 구교탄; 김범준; 락스만 수베디
Original assignee: 주식회사 바이오빌리프; 목포대학교산학협력단
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-12-29
Also published as: WO2023106754A1

Abstract

본 발명은 특정 휘발성 용매와 비휘발성 공용매, 특정 젖음성/퍼짐성 개선제, 및 항산화제의 조합을 포함하는 비마토프로스트-함유 국소 투여용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 비마토프로스트-함유 국소 투여용 약학 조성물은 프로필렌 글리콜 및 반고체 콜로이드 담체의 사용을 회피할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 비마토프로스트의 피부 투과도 및 진피 침적을 현저하게 높일 수 있으며, 우수한 안정성을 가짐으로써 벤질 알코올 등과 같은 보존제의 사용을 회피할 수 있다.

Description

비마토프로스트를 포함하는 국소 투여용 약학 조성물{Pharmaceutical compositions for topical administration comprising bimatoprost}

본 발명은 탈모증 치료 또는 발모 촉진을 위한 비마토프로스트-함유 국소 투여용 약학 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 특정 휘발성 용매와 비휘발성 공용매, 특정 젖음성/퍼짐성 개선제, 및 항산화제의 조합을 포함하는 비마토프로스트-함유 국소 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.

탈모증은 일반적으로 정상적인 모발 성장주기의 변화(즉, 성장기 단축, 퇴행기 및 휴지기 기간 연장)를 동반하는 비정상적인 탈모를 의미한다(Qi and Garza, (2014). An overview of alopecias. Cold Spring Harb Perspect Med 4:1-14). 호르몬 불균형, 노화, 자가면역 상태, 약물, 영양 결핍 및 유전을 비롯한 다양한 요인이 모발 주기의 변화와 관련이 있다(Houschyar KS, et al. (2020). Molecular Mechanisms of Hair Growth and Regeneration: Current Understanding and Novel Paradigms. Dermatol 236:271-80). 탈모증은 신체적 증상이 심하지 않지만, 심리적, 사회적으로 심각한 악영향을 미친다. 따라서 환자의 웰빙을 유지하기 위해서는 탈모증의 치료가 필요하다. 모발 이식 및 성장 인자와 혈소판이 풍부한 혈장 주입은 탈모증 환자에게 점점 더 많이 사용되고 있지만, 효능이 낮고 다양한 합병증의 가능성이 있다(Kerure and Patwardhan (2018). Complications in Hair Transplantation. J Cutan Aesthet Surg 11:182-9; Ro In B, et al. (2021). Therapeutic effects of a new long-acting growth factor cocktail (Cellcurex^TM) injected using a microneedle on the scalp in patients with androgenetic alopecia: A split study. Glob Dermatol 7:1-4). 탈모증 치료는 모낭의 크기, 밀도 및 성장주기를 정상화하는 것을 목표로 한다.

미국 식품의약품국(FDA)은 피나스테리드, 두타스테리드, 국소 미녹시딜을 포함한 경구용 5α-리덕타아제 억제제를 탈모증에 대해 승인한 바 있다. 피나스테리드는 디하이드로테스토스테론 수용체의 경쟁적이고 특이적인 억제제로 작용하는 합성 4-아자스테로이드 화합물이다. 따라서 현재 임신 중이거나 미래에 임신을 희망하는 여성에게는 금기이다(Sallout and Al Wadi, (2009). Aphalangia possibly linked to unintended use of finasteride during early pregnancy. Ann Saudi Med 29:155-6). 또한 많은 환자가 남성의 성욕 감소 및 발기 부전과 같은 부작용 가능성으로 인해 경구 약물을 피하는 것을 선호한다. 국소 미녹시딜은 일반적으로 남성 및 여성형 대머리의 오프라벨(off-label) 치료제로 사용된다. 미녹시딜은 동맥을 확장시켜 모낭으로 가는 혈류를 증가시켜 진피 유두세포로부터 성장인자의 생성을 자극하고 진피 유두 베타카테닌 경로를 활성화시켜, 성장기의 유도 및 연장을 야기하고 휴지기-성장기 전환을 자극한다(Choi N, et al. (2018). Minoxidil Promotes Hair Growth through Stimulation of Growth Factor Release from Adipose-Derived Stem Cells. Int J Mol Sci 19:691-706). 국소 미녹시딜은 탈모를 예방할 수 없지만, 모발 성장을 가속화할 수 있다. 따라서 모든 환자에게 효과가 있는 것은 아니다. 또한, 미녹시딜을 매일 장기간 사용하는 것은 모발이 끈적거리고 깨끗하지 않게 느껴지기 때문에 환자가 잘 견디지 못한다. 두피 자극과 가려움증도 발생하며, 이는 주로 프로필렌 글리콜(국소 미녹시딜의 핵심 성분)에 의해 발생한다(Suchonwanit P, et al. (2019). Minoxidil and its use in hair disorders: a review. Drug Des Devel Ther 13:2777-86; BinJadeed H, et al. (2021). A Case of Contact Allergic Dermatitis to Topical Minoxidil. Cureus 13:1-12). 따라서 부작용이 적고 효능이 높은 약물에 대한 수요가 증가하고 있다.

프로스타글란딘(PG)은 모발 성장의 중요한 조절제이다. 따라서 PGE2 및 PGF2α 유사체 및 효능제는 탈모증 치료에 유용할 수 있다. 비마토프로스트(BIM; (Z)-7-[(1R,2R,3R,5S)-3,5-디히드록시-2-[(1E,3S)-3-히드록시-5-페닐-1-펜테닐]시클로펜틸]-5-N-에틸헵텐아미드)는 안구고혈압 관리를 위한 0.03% 점안액으로 투여 시 속눈썹 성장을 자극하는 PGF2α 유사체이며, 이는 속눈썹 영양실조증(eyelash hypotrichosis)의 국소 치료제로 FDA 승인을 받은 바 있다. BIM은 휴지기에서 성장기로의 전환을 촉진한 다음, 성장기를 연장하여 모발 길이를 증가시켜 모발 성장을 자극한다(Tauchi M, Fuchs TA, et al. (2010). Characterization of an in vivo model for the study of eyelash biology and trichomegaly: mouse eyelash morphology, development, growth cycle, and anagen prolongation by bimatoprost. Br J Dermatol 162:1186-97; Cohen JL. (2010). Enhancing the growth of natural eyelashes: the mechanism of bimatoprost-induced eyelash growth. Dermatol Surg 36:1361-71). 또한, 멜라닌 생성을 촉진하여 모발의 색을 어둡게 하고, 티로시나아제를 자극하고, 멜라닌 합성, 멜라닌 세포의 수지상 세포 및 멜라노솜의 케라티노사이트로의 전환을 증가시킨다. 이러한 효과는 PG 및/또는 프로스타미드 F2α 수용체와 같은 특정 수용체에 대한 BIM의 작용에 기인한다. 모구(hair bulb)의 진피 유두의 세포막은 세포 내 신호 전달 경로를 자극하고 유전자 발현 및 측분비 신호(paracrine signal)의 세포 외 방출의 변화를 유발한다. 일부 측분비 신호는 진피 유두에서 발생하고 기저막을 통과하여 각질 세포와 멜라닌 세포의 조화된 활동을 자극하여 모발 성장과 색소 침착을 증가시킨다.

국소 적용은 다른 부위의 원하지 않는 모발 성장 및 다른 약물과의 상호 작용과 같은 잠재적인 부작용을 제한하기 때문에 탈모증 치료에 가장 적합한 방법이다. 또한 피부 장벽으로의 침투 효과가 증진된 안정적인 국소 BIM 제제는 두피 모발 재성장을 개선할 수 있다.

약물의 피부 흡수를 향상하기 위해, 리포좀 또는 비이온성 계면활성제 소포를 기반으로 하는 에멀젼, 연고, 페이스트 및 콜로이드 분산액과 같은 다양한 국소 제제가 사용된 바 있다(Garg T, Rath G, Goyal AK. (2015). Comprehensive review on additives of topical dosage forms for drug delivery. Drug deliv 22:969-87). 그러나 이러한 제제는 피부에서 약물 방출 및 확산을 방해할 수 있는 반고체 콜로이드 담체를 함유함으로써, 진피까지 약물이 침투되는 것을 저해한다. 또한 두피에 계면활성제가 포함된 제제의 잔류물은 환자의 순응도를 감소시킬 수 있다(Kim H, et al. (2019). Characteristics of Skin Deposition of Itraconazole Solubilized in Cream Formulation. Pharmaceutics 11:1-13).

본 발명자들은 비마토프로스트(BIM)를 함유하는 탈모증 치료를 위한 개선된 국소 투여용 제제를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 끈적거리거나 두피 자극 및 가려움증을 유발하는 성분(예를 들어, 프로필렌 글리콜)의 사용을 회피할 수 있고, 약물의 피부 침투를 저해하는 반고체 콜로이드 담체의 사용을 회피할 수 있으며, 또한 우수한 피부 투과도를 나타내는 BIM-함유 국소 투여용 제제를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다.

본 발명자들은 특정 휘발성 용매와 비휘발성 공용매, 특정 젖음성/퍼짐성 개선제(wetting or spreading agent), 및 항산화제를 조합하여 얻어진 용액 형태의 BIM-함유 국소 투여용 제제가 프로필렌 글리콜 및 반고체 콜로이드 담체의 사용을 회피할 수 있으며, 또한 현저히 개선된 피부 투과도 및 안정성을 나타낸다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명은 특정 휘발성 용매와 비휘발성 공용매, 특정 젖음성/퍼짐성 개선제, 및 항산화제의 조합을 포함하는 BIM-함유 국소 투여용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 활성성분으로서 비마토프로스트; 젖음성 또는 퍼짐성 개선제로서 시클로메티콘; 항산화제; 휘발성 용매로서 에탄올; 및 비휘발성 공용매로서 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르를 포함하는 탈모증 치료 또는 발모 촉진을 위한 국소 투여용 약학 조성물이 제공된다.

상기 비마토프로스트는, 조성물 총 중량에 대하여, 0.03 내지 7 중량%의 범위로 존재할 수 있다.

상기 시클로메티콘은, 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 15 중량%의 범위로 존재할 수 있다.

상기 항산화제는 부틸화 히드록시톨루엔 또는 부틸화 히드록시아니솔, 바람직하게는 부틸화 히드록시아니솔일 수 있다. 상기 항산화제는, 조성물 총 중량에 대하여, 0.01 내지 1 중량%의 범위로 존재할 수 있다.

상기 에탄올은, 조성물 총 중량에 대하여, 40 내지 70 중량%의 범위로 존재할 수 있으며, 상기 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르는, 조성물 총 중량에 대하여, 20 내지 40 중량%의 범위로 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 비마토프로스트 0.03 내지 7 중량%; 시클로메티콘 1 내지 15 중량%; 항산화제 0.01 내지 1 중량%; 에탄올 40 내지 70 중량%; 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 20 내지 40 중량%를 포함하고, 벤질 알코올, 프로필렌 글리콜 및 올레산을 포함하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 수화 촉진제로서 물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 물은, 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 10 중량%의 범위로 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 비마토프로스트; 시클로메티콘; 항산화제; 에탄올; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 및 물로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 용액 형태의 BIM-함유 국소 투여용 약학 조성물은 특정 휘발성 용매와 비휘발성 공용매, 즉 에탄올과 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르의 조합을 포함함으로써, 프로필렌 글리콜 및 반고체 콜로이드 담체의 사용을 회피할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 젖음성/퍼짐성 개선제로서 시클로메티콘을 함유함으로써 BIM의 피부 투과도(skin permeability) 및 진피 침적(dermal deposition)을 현저하게 높일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 항산화제를 함유함으로써 우수한 안정성을 가지며, 따라서 벤질 알코올 등과 같은 보존제(preservative)의 사용을 회피할 수 있다.

도 1a는 다양한 용매 및 계면활성제에서 비마토프로스트(BIM)의 용해도를 나타낸다.
도 1b 및 도 1c는 인공막을 통한 BIM 에탄올 용액 또는 BIM 국소 제제들(BIM-TFs)의 누적 약물 침투를 나타내는 시간 경과 곡선(도 1b) 및 플럭스(도 1c)를 나타낸다. BIM-TF#4와 비교하여 ^**p < 0.01, ^***p < 0.001; BIM-TF#5와 비교하여 ^###p < 0.001; BIM-TF#7과 비교하여 ^$$$p < 0.001; BIM-TF#8과 비교하여 ^&p < 0.05, ^&&p < 0.01, ^&&p < 0.001.
도 1d 및 도 1e는 에탄올 또는 BIM-TF#5 중의 0.03%, 0.3% 및 5%의 BIM의 누적 침투를 나타내는 시간 경과 곡선(도 1d) 및 플럭스(도 1e)를 나타낸다. 0.03% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^***p < 0.001; 0.3% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^#p < 0.05, ^###p < 0.001; 5% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^$$p < 0.01, ^$$$p < 0.001; 0.03% BIM-TF#5과 비교하여 ^&&p < 0.001; 0.3% BIM-TF#5과 비교하여 ^@@@p < 0.001.
도 2는 에탄올 중의 비마토프로스트(BIM) 및 국소 제제들(BIM-TFs)의 시험관 내 전-두께 인간 피부 투과도를 평가한 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 5% BIM 에탄올 용액 및 BIM-TFs의 10시간 동안 인간 피부를 통한 BIM 침투의 누적 수준을 나타내는 시간 경과 곡선(도 2a) 및 플럭스(도 2b)를 나타낸다. BIM-TF#4와 비교하여 ^***p < 0.001; BIM-TF#5와 비교하여 ^###p < 0.001; BIM-TF#6과 비교하여 ^$$$p < 0.001; BIM-TF#8과 비교하여 ^&p < 0.05, ^&&p < 0.001.
도 2c는 24시간 동안 5% BIM 에탄올 용액 및 BIM-TFs에서 인간 각질층, 표피 및 진피 1 g에 침적된 BIM을 나타낸다. 5% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^***p < 0.001; BIM-TF#1과 비교하여 ^##p < 0.01, ^###p < 0.001; BIM-TF#5와 비교하여 ^$p < 0.05, ^$$p < 0.01, ^$$$p < 0.001.
도 2d 및 도 2e는 10시간 동안 에탄올 또는 BIM-TF#5 중의 0.03%, 0.3% 및 5%의 BIM의 인간 피부를 통한 누적 BIM 침투의 시간 경과 곡선(도 2d) 및 (E) 플럭스(도 2e)를 나타낸다. 0.03% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^***p < 0.001; 0.3% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^###p < 0.001; 5% BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^$$$p < 0.001; 0.03% BIM-TF#5와 비교하여 ^&&p < 0.001; 0.3% BIM-TF#5와 비교하여 ^@@@p < 0.001.
도 3a 및 도 3b는 5% BIM 에탄올 용액을 배양액으로 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 μM BIM이 되도록 희석한 용액, 5% BIM 국소 제제들(BIM-TFs)을 배양액으로 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 μM BIM이 되도록 희석한 용액, 비히클(BIM-TF#5의 비히클) 용액을 배양액으로 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 μM BIM에 해당하는 농도가 되도록 희석한 용액 및 5% 미녹시딜 에탄올 용액을 배양액으로 10 μM 미녹시딜이 되도록 희석한 용액과 함께 각각 배양한 후 각질형성세포(HaCaT 세포)(도 3a) 및 인간모유두세포(hDP 세포)(도 3b)의 상대적 세포 증식을 나타낸다. 비히클(BIM-TF#5의 비히클)과 비교하여 ^**p < 0.01, ^***p < 0.001; BIM 에탄올 용액과 비교하여 ^#p < 0.05, ^##p < 0.01, ^###p < 0.001; BIM-TF#1과 비교하여 ^$p < 0.05, ^$$$p < 0.001; BIM-TF#5와 비교하여 ^&&p < 0.01, ^&&p < 0.001.
도 3c 및 도 3d는 5% BIM 에탄올 용액을 배양액으로 5 μM BIM이 되도록 희석한 용액, 5% BIM-TF#1을 배양액으로 5 μM BIM이 되도록 희석한 용액, 5% BIM-TF#5을 배양액으로 5 μM BIM이 되도록 희석한 용액, BIM-TF#5 비히클 용액을 배양액으로 5 μM BIM에 해당하는 농도가 되도록 희석한 용액 및 5% 미녹시딜 에탄올 용액을 배양액으로 10 μM 미녹시딜이 되도록 희석한 용액과 함께 각각 인큐베이션한 후의 인간모유두세포(hDP 세포)의 스크래치 상처 면적의 상대적 회복율을 나타낸다. 도 3c는 인간모유두세포의 스크래치 상처 면적의 시간 경과 곡선을 나타낸다. 대조군(미처리)과 비교하여 ^**p < 0.01, ^***p < 0.001; 비히클(BIM-TF#5)과 비교하여 ^###p < 0.001; BIM 에탄올 용액(5 μM)와 비교하여 ^$p < 0.05, ^$$$p < 0.001; BIM-TF#1(5μM)과 비교하여 ^&&p < 0.01, ^&&p < 0.001; BIM-TF#5(5 μM)과 비교하여 ^@@p < 0.01. 값은 평균±SD를 나타낸다(n = 6). 도 3d는 인간모유두세포의 스크래치 상처의 대표적인 현미경 이미지를 나타낸다. 스케일 바 = 200 μm.
도 4는 안드로겐 탈모증 마우스에서 1일 1회 BIM 국소 제제들(BIM-TFs) 및 5% 미녹시딜 국소 용액의 생체 내 모발 재성장 효능을 평가한 결과이다.
도 4a는, 모발 재성장(성장기)을 나타내는, 분홍색에서 검정색으로의 등 부위 피부(dorsal skin) 색의 변화에 대한 시간 경과 곡선을 나타낸다. 도 4b는 등 피부의 모발 성장의 시간 경과 곡선을 나타낸다. 도 4c는 분홍색(휴지기)을 나타내는 등 피부의 시간 경과 곡선을 나타낸다. 대조군(정상)과 비교하여 ^ap < 0.05, ^bp < 0.01, ^cp < 0.001; 대조군(비히클)과 비교하여 ^dp < 0.05, ^ep < 0.01, ^fp < 0.001; 미녹시딜 국소 용액(5%)과 비교하여 ^gp < 0.05, ^hp < 0.01, ⁱp < 0.001; BIM 에탄올 용액(5%)과 비교하여 ^jp < 0.05, ^kp < 0.01, ^lp < 0.001; BIM-TF#1(5%)과 비교하여 ^mp < 0.05, ⁿp < 0.01, ^op < 0.001; BIM-TF#5(0.03%)와 비교하여 ^pp < 0.05, ^qp < 0.01, ^rp < 0.001; BIM-TF#5(0.3%)과 비교하여 ^sp < 0.05, ^tp < 0.01, ^up < 0.001. 값은 평균±SEM이다(각 그룹에 대해 n = 8).
도 4d는 도포 0, 3, 5, 7, 10 및 14일째 모발의 재성장을 나타내는 마우스 등 부위 피부의 대표적인 사진을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 도포 14일째 각 그룹의 모발 무게(도 5a) 및 도포 7일, 10일 및 14일 후 모낭의 길이(도 5b)를 나타낸다. 대조군(정상)과 비교하여 ^ap < 0.01, ^bp < 0.001; 대조군(비히클)과 비교하여 ^cp < 0.05, ^dp < 0.001; 미녹시딜 국소 용액(5%)과 비교하여 ^ep < 0.001; BIM 에탄올 용액(5%)과 비교하여 ^fp < 0.05, ^gp < 0.001; BIM-TF#1(5%)와 비교하여 ^hp < 0.001; BIM-TF#5(0.03%)과 비교하여 ⁱp < 0.05, ^jp < 0.001. 값은 평균±SD이다(각 그룹에 대해 n = 8).
도 5c는 헤마토실린 및 에오신(H&E)으로 염색한 마우스 등 부위 탈모 유발 피부 조직의 대표적인 광학 현미경 사진이다. 스케일 바 = 100 ㎛.

본 발명자들은, 높은 피부 투과도를 갖는 비마토프로스트(BIM)의 안정된 국소 제제를 얻기 위하여, 에탄올, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 시클로메티콘 및 부틸화 히드록시아니솔로 구성된 "과포화 휘발성 비히클 시스템"을 설계하였으며, 이들은 각각 휘발성 용매, 비휘발성 공-용매, 퍼짐성 개선제, 및 항산화제의 역할을 한다. 본 발명에 따른 제제 특히, 국소 BIM 제제(BIM-TF#5)는, BIM 에탄올 용액에 비하여, 4.60배 더 높은 인간의 피부 플럭스 및 292% 증가한 피부 약물 침적을 나타낸다. 또한, 본 발명에 따른 제제는 5 μM BIM 농도에서 인간모유두세포의 증식을 효과적으로 활성화하며, 안드로겐 탈모증이 유발된 마우스 모델에서 모발 재성장을 유의성 있게 촉진하고, 비히클 처리 마우스에 비해 10일째 모발로 덮인 발모 면적을 485% 증가시켜 휴지기(telogen)에 있는 모낭 세포의 성장기 단계(anagen phase)로의 전환을 촉진시켰다. 또한, 본 발명에 따른 제제를 도포한 마우스에서 14일째 모발 무게는 5% BIM 에탄올 용액 및 5% 미녹시딜 국소 용액을 도포한 그룹보다 각각 8.45배 및 1.30배 더 증가했으며, 깊은 피하조직(deep subcutis) 내 모낭의 수와 직경은 역시 비히클 또는 5% BIM 에탄올 용액을 도포한 마우스에 비해 유의성 있게 증가하였다. 따라서 본 발명에 따른 제제는, 모낭 내 진피 유두 세포의 프로스타미드 F2α 수용체를 직접적으로 자극하는 새로운 탈모 치료 접근법의 일부로서, 두피 탈모증을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 활성성분으로서 비마토프로스트; 젖음성 또는 퍼짐성 개선제로서 시클로메티콘; 항산화제; 휘발성 용매로서 에탄올; 및 비휘발성 공용매로서 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르를 포함하는 탈모증 치료 또는 발모 촉진을 위한 국소 투여용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 비마토프로스트(BIM)는 치료학적으로 유효한 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 비마토프로스트(BIM)는, 조성물 총 중량에 대하여, 0.03 내지 7 중량의 양으로 존재할 수 있다. 한편, 0.03% 비마토프로스트 용액은 두피 탈모증의 치료 잠재성을 가지지만, 2상 임상 시험에서 국소 미녹시딜보다 더 큰 효능을 나타내지 않았으며, 이는 효과적인 두피 탈모 치료를 위해서는 더 높은 농도의 장기간 치료가 필요함을 시사한다(Barron-Hernandez YL, Tosti A. (2017). Bimatoprost for the treatment of eyelash, eyebrow and scalp alopecia. Expert Opin Investig Drugs 26:515-22). 놀랍게도, 본 발명의 약학 조성물은 비마토프로스트(BIM)를 고농도, 바람직하게는 0.3% 이상의 고농도로 함유할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 비마토프로스트(BIM)는, 조성물 총 중량에 대하여, 0.03 내지 7 중량, 바람직하게는 0.3 내지 7 중량%, 더욱 바람직하게는 약 5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 용액 형태의 BIM-함유 국소 투여용 약학 조성물은 특정 휘발성 용매와 비휘발성 공용매, 즉 에탄올과 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르[예를 들어, 트랜스큐톨^TM P(Transcutol^TM P)]의 조합을 포함한다. 따라서 본 발명의 국소 투여용 약학 조성물은, 프로필렌 글리콜과 같이, 끈적거리거나 두피 자극 및 가려움증을 유발하는 성분을 포함하지 않으므로, 환자의 순응도(compliance)를 개선할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 피부에서 약물의 방출 및 확산을 방해할 수 있는 반고체 콜로이드 담체의 사용을 회피할 수 있다. 따라서 일 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 프로필렌 글리콜을 포함하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 에탄올은, 조성물 총 중량에 대하여, 40 내지 70 중량%의 범위, 바람직하게는 50 내지 60 중량%의 범위로 존재할 수 있다. 또한, 상기 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르는, 조성물 총 중량에 대하여, 20 내지 40 중량%의 범위, 바람직하게는 25 내지 30 중량%의 범위로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 젖음성/퍼짐성 개선제(wetting or spreading agent)로서 시클로메티콘을 함유함으로써 BIM의 피부 투과도(skin permeability) 및 진피 침적(dermal deposition)을 현저하게 높일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 지방산(예를 들어, 올레산) 등의 용액 중 약물의 용해도를 낮추는 투과 촉진제의 사용을 회피할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 올레산 등의 지방산을 포함하지 않는다. 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 시클로메티콘은, 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 15 중량%의 범위, 바람직하게는 3 내지 10 중량%의 범위), 더욱 바람직하게는 약 5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 항산화제를 함유함으로써 우수한 안정성을 가지므로, 벤질 알코올 등과 같은 피부에 대한 자극을 유발하는 보존제(preservative)의 사용을 회피할 수 있다. 따라서 일 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 벤질 알코올 등의 보존제를 포함하지 않는다. 상기 항산화제는 부틸화 히드록시톨루엔 또는 부틸화 히드록시아니솔, 바람직하게는 부틸화 히드록시아니솔일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 항산화제는, 조성물 총 중량에 대하여, 0.01 내지 1 중량%의 범위, 바람직하게는 약 0.1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 벤질 알코올, 프로필렌 글리콜 및 올레산을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 비마토프로스트 0.03 내지 7 중량%; 시클로메티콘 1 내지 15 중량%; 항산화제 0.01 내지 1 중량%; 에탄올 40 내지 70 중량%; 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 20 내지 40 중량%를 포함하고, 벤질 알코올, 프로필렌 글리콜 및 올레산을 포함하지 않는다.

본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 충분한 피부 수화를 유지하기 위한 수화 촉진제(promoting agent for skin hydration)로서 물을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 물은, 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 10 중량%의 범위, 바람직하게는 약 8 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 비마토프로스트; 시클로메티콘; 항산화제; 에탄올; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 및 물로 구성될 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 비마토프로스트 0.03 내지 7 중량%; 시클로메티콘 1 내지 15 중량%; 항산화제 0.01 내지 1 중량%; 에탄올 40 내지 70 중량%; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 20 내지 40 중량%; 및 물 1 내지 10 중량%로 구성될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조성물은 비마토프로스트 5 중량%; 시클로메티콘 5 중량%; 항산화제 0.1 중량%; 에탄올 54.9 중량%; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 27 중량%; 및 물 8 중량로 구성될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서, 달리 명시하지 않는 한, BIM은 비마토프로스트를 지칭하며, BIM-TF는 비마토프로스트를 함유하는 국소 제제(topical formulation)을 지칭한다.

1. 시험방법

(1) 물질

BIM는 연성정밀화학(Yonsung Fine Chemicals Co., Ltd., 경기도, 대한민국)에서 구입하였다. 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 옥타덱-9-엔산(올레산), 폴리에틸렌 글리콜 400(PEG 400), 폴리옥시에틸렌 (80) 소르비탄 모노올레이트(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트(Tween 20), 폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르(Brij O20), 시클로메티콘 및 BHA는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르[트랜스큐톨(Transcutol) P] 및 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트(type II)[카프리올(Capryol) 90)]는 가테포세(Gattefosse, Saint-Prist, France)에서 구입하였다. 상용 5% 미녹시딜 국소 용액은 현대약품(서울, 대한민국)에서 구입하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위한 화학물질 및 용매는 머크(Merck, Darmstadt, Germany) 및 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 얻었다.

(2) 동물

수컷 C57BL/6J 마우스(6-7 주령, 20-25 g)는 G-Bio(광주, 대한민국)에서 구입하였다. 마우스는 조절된 온도(23±2℃) 및 상대습도(55±10%)에서 12시간의 명암 주기가 있는 표준 환경에 수용하였다. 동물에게 표준 실험실 식이(Nestle Purina PetCare Company, St. Louis, MO, USA)와 이온-멸균 수돗물을 자유롭게 먹였다. 목포 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 윤리적 승인을 받았다(승인 번호: MNU-IACUC-2021-014 및 MNU-IACUC-2021-017). 모든 동물 실험은 실험동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드라인 및 IACUC 가이드라인에 따라 수행하였다.

(3) 비마토프로스트 국소 제제(BIM-TF) 성분의 스크리닝 및 선택

약물 용해도는, 피부로의 약물 침투를 증가시키기 위해, 과포화 휘발성 비히클 시스템의 첨가제를 스크리닝하기 위한 가장 중요한 요소이다. 밀봉된 유리 용기에 과량의 BIM를 다양한 하이드로알콜성 용매(에탄올, 이소프로필 알코올, 벤질 알코올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 트랜스큐톨 P), 친유성 용매(이소프로필 미리스테이트, 올레산 및 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드) 및 비이온성 계면활성제(PEG 400, Brij O20, Tween 20, Tween 80 및 Capryol 90) 1 g에 첨가하였다. BIM와 첨가제의 혼합물을 등온 진탕기(isothermal shaker)에서 25±1.0℃에서 볼텍싱하여 평형에 도달시켰다. 48시간 동안 진탕한 후, 샘플을 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 과량의 약물을 제거하고, 상청액을 물과 아세토니트릴의 혼합물(50:50, v/v)로 추가로 희석하였다. 각 용액의 BIM 농도는 25℃에서 Luna C18 컬럼(4.6 × 250 mm, 5 μm, 100 Å)을 사용하여 205 nm에서 HPLC 시스템을 사용하여 결정하였다. 각 샘플의 분취물(30 μL)을 이동상(아세토니트릴의 80-50% 선형 구배를 갖는 물)에서 5분 동안 용리시킨 후, 1.0 mL/min의 유속으로 추가로 5분 동안 아세토니트릴의 50-80% 선형 구배로 용리시켰다.

(4) 비마토프로스트 국소 제제(BIM-TF)의 제조 및 시험관 내 인공막 투과도

에탄올을 용매로 사용하여 5% BIM-TF를 제조하였다. 제제 중 약물의 산화에 대한 추가적인 안정성을 위하여, 부틸화 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA)을 약물 제제에 항산화제로서 가하였다(표 1). 간략하게는, 0.05 g의 약물(1 g 용액에 대하여 5% 비마토프로트스)을 유리 바이알에 칭량하고, 0.3 g의 에탄올에 용해시켰다. 이후, BHA 0.001 g을 첨가한 후, 볼텍싱 혼합하였다. 이후, BIM의 피부 투과도를 개선하기 위하여, BIM가 함유된 바이알에 프로필렌 글리콜(0.22 g), 올레산(0.05 g) 또는 트랜스큐톨 P(0.22, 0.27 또는 0.32 g)를 첨가하였다. 이후, 두피에 대한 퍼짐성(spreadability)을 개선하기 위하여, 시클로메티콘을 5%, 10%, 15% 농도로 혼합물에 첨가하였다. 또한, 피부 수화(hydration)를 촉진하기 위하여, 물 0.02, 0.04, 0.08 g을 가하였다. 제제의 중량은 에탄올을 첨가하여 1 g으로 유지하였다(표 1). 이후, 약물 용해도 및 BIM-TF의 다른 성분과의 혼화성에 대하여 비히클 시스템 중의 상이한 농도의 다양한 첨가제의 효과를 평가하였다. 또한, 3개월 이상 동안 약물 함량 및 색, 재결정화, 상분리 등의 물리화학적 특성의 변화를 매주 조사하였다.

국소 BIM 제제의 조성 및 초기 약물 농도

제제 (%, w/w)	BIM	에탄올	프로필렌 글리콜	트랜스큐톨 P	올레산	시클로메티콘	BHA	물	초기 약물 농도 (%)
BIM-TF#1	5	65.9	22		5		0.1	2	100 ± 3.18
BIM-TF#2	5	59.9	22		5		0.1	8	100 ± 2.37
BIM-TF#3	5	59.9		22	5		0.1	8	101 ± 2.35
BIM-TF#4	5	59.9		22		5	0.1	8	100 ± 5.72
BIM-TF#5	5	54.9		27		5	0.1	8	101 ± 1.47
BIM-TF#6	5	49.9		32		5	0.1	8	99.7 ± 2.69
BIM-TF#7	5	54.9		22		10	0.1	8	98.2 ± 1.33
BIM-TF#8	5	53.9		22		15	0.1	4	102 ± 1.00

각 비히클 시스템에서 BIM의 피부 투과도를 비교하기 위해 프란츠 확산셀 시스템(Labfine, 경기도, 대한민국)을 사용하여 시험관 내 인공 피부막 투과도 시험을 수행하였다. 인공막(Strat-M^TM; EMD Millipore, Temecula, CA, USA)은 0.785 cm² 확산 면적을 갖는 프란츠 확산셀의 공여부(donor) 및 수용부(receptor) 상 컴파트먼트 사이에 고정시켰다. 이후, 수용부 컴파트먼트를 5 mL의 인산염완충액(PBS, pH 7.4)로 채웠다. 수용부 셀의 용액은 가열 시스템 내에서 마그네틱 교반기를 사용하여 600 rpm로 교반하여 인공막의 표면 온도를 32℃로 유지시켰다. 이후, 20 μL의 BIM-TF(1000 μg/cm²)를 공여부 컴파트먼트에 로딩하였다. 이후, 소정의 시점(0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10시간)에서 각 확산셀의 수용부에서 200 μL의 용액을 채취하고, 동일한 부피의 PBS(pH 7.4)로 교체하였다. 수집된 샘플을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인 필터(공극 0.45 μm)를 통해 여과하고, 인공막을 통해 투과된 BIM의 누적 투과량을 앞서 기술된 바와 같이 205 nm에서 HPLC 시스템을 사용하여 결정하였다.

(5) 전-두께(full-thickness) 인간 피부에서의 BIM의 시험관 내 투과 및 침적

BIM-TF의 인간 피부 침투를 평가하기 위해, 프란츠 확산셀 시스템을 사용하여 시험관 내 인체 피부 투과 및 침적 시험을 수행하였다. 전-두께(full-thickness) 인간 피부 샘플(HansBiomed Corp., 대전, 대한민국)을 각질층을 위로 향하게 하여 확산셀의 수용부 컴파트먼트 위에 장착하였다. 공여부 컴파트먼트를 조립한 다음 수용부 컴파트먼트에 5 mL의 PBS(pH 7.4)를 채운 다음, 600 rpm으로 교반하고, 가열하여 피부 표면의 온도를 32℃로 유지시켰다. 샘플 용액을 가하기 전에 확산셀 시스템을 1시간 이상 방치시켜 경피 수분 손실(transepidermal water loss, TEWL)은 < 10 g/m²/h, 경피 전기 저항(transepithelial electrical resistance, TEER) 1-2 kΩ이 되도록 하여 표피층의 무결성(integrity)을 확인하였다.

다음으로, 각 BIM-TF(1000 μg/cm²) 용액을 20 μL씩 공여부 컴파트먼트에 로딩하고, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10시간 후 각 확산셀에서 200 μL씩 수용부 용액을 채취하고 그 즉시 동일 부피의 새로운 PBS(pH 7.4)로 교체하였다. 채취한 수용부 용액을 멤브레인 필터로 여과한 후, 샘플 용액 중 BIM의 농도는 앞서 기술된 바와 같이 HPLC 방법을 사용하여 측정하였다.

약물 로딩 24시간 후, 확산셀을 분해하고, 피부를 조심스럽게 회수한 다음, 탈이온수로 3회 세척하였다. 티슈 페이퍼로 잔류 수분을 흡수시킨 다음, 제제에 노출된 피부를 절단하고 무게를 측정하였다. 또한, 각질층을 분리하기 위하여, D-Squame(CuDerm, Dallas, TX, USA)으로 피부를 35회 스트립핑하였다. 이후, 남은 피부를 5 mL의 얼음-냉각된 0.5% 디스파아제(dispase) 용액에 밤새 담가, 표피와 진피를 분리하였다. 분리된 각질층, 표피, 진피를 작은 조각으로 절단한 후, 각 층에 침적된 약물을 에탄올 2 mL로 추출하였다. 추출된 샘플 용액을 0.45 μm PVDF 필터를 사용하여 여과하고, 원심 증발기(Genevac Ltd., Ipswich, UK)에서 건조시켰다. 마지막으로, 건조된 잔류물에 200 μL의 에탄올을 첨가하여 다시 용해한 다음, 앞서 기술된 바와 같이 205 nm에서 HPLC 시스템을 사용하여 각 시료 중 BIM의 농도를 측정하였다.

(6) 시험관 내 세포 증식 분석

각질형성세포(HaCaT)(ATCC, University Boulevard, VA, USA) 및 인간모유두세포(hDP 세포)(PromoCell GmbH, Heidelberg, Germany)를 사용하여 세포 증식 분석을 수행하여, BIM-TF와 미녹시딜의 생물학적 활성을 비교하였다. 간단히, HaCaT 또는 hDP 세포를 10% (v/v) 소태아혈청(FBS) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 4%의 태아 송아지 혈청(fetal calf serum), 4%의 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract), 1 ㎍/L의 재조합 인간 섬유아세포 성장인자 및 재조합 인간 인슐린(5 mg/L)을 함유하는 hDP 배지(PromoCell GmbH) 100 μL에서 2.5 X 10³ cells/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 이후, HaCaT 및 hDP 세포를 37℃, 95% 공기 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 무혈청 배지에서 24시간 동안 추가로 배양한 후, 세포에 BIM 에탄올 용액, BIM-TF#1 및 BIM-TF#5를 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 μM BIM에 해당하는 농도로 연속-희석한 시료, 각 농도에 해당하는 BIM-TF#5의 비히클 희석액 및 10 μM의 미녹시딜 용액을 처리하였다. 이후, 48시간 동안 추가로 배양한 다음, 10 μL의 WST-1 시약(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. WST-1 시약을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더(Multimode Plate Reader; PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이후, 무처치 대조군 대비 처리군의 생존 세포의 백분율을 계산하였다.

(7) 시험관 내 스크래치 상처 회복 분석

인간모유두세포(hDP 세포)에서 BIM-TF의 세포 증식 및 이동(migration) 증진 활성을 평가하기 위하여, 시험관 내 스크래치 상처 회복 분석을 수행하였다. 4%의 태아 송아지 혈청, 4%의 소 뇌하수체 추출물, 1 ㎍/L의 재조합 인간 섬유아세포 성장인자 및 재조합 인간 인슐린(5 mg/L)을 함유하는 hDP 배지(PromoCell GmbH) 1 mL 중 2.5 X 10⁴개의 hDP 세포를 함유하는 세포 용액을 콜라겐-코팅된 12웰 플레이트의 각 웰에 가한 다음, 37℃에서 72시간 동안 배양하여 단일 세포층을 형성하였다. 이후, 멸균된 마이크로 피펫 팁을 사용하여 스크래치 영역을 만들고, 덜어진 세포를 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하였다. 이후, BIM 에탄올 용액, BIM-TF#1, BIM-TF#5, 및 BIM-TF#5 비히클을 0.5% 태아 송아지 혈청을 포함하는 hDP 배지로 BIM로서 5 μM에 해당하는 농도로 희석한 시료와 5% 미녹시딜 에탄올 용액을 0.5% 태아 송아지 혈청을 함유하는 hDP 배지로 10 μM 미녹시딜 농도로 희석한 용액을 각각 1 mL씩 각 웰에 추가로 처리하였다. 이후, hDP 세포가 있는 플레이트를 37℃에서 배양하면서 시료 도포 후 0, 6, 12, 24 및 48시간째 광학현미경을 사용하여 세포의 이동 및 증식에 의한 스크래치 상처의 회복 면적을 관찰하였다.

(8) BIM-TF의 생체 내 모발 재성장 효능

BIM-TF의 모발 재성장(regrowth) 효능을 평가하기 위하여, 마우스의 등 부위 털을 소동물용 클리퍼 및 덕트 테이프(animal clippers and duct tape)를 이용하여 면도한 다음 제모 부위에 디히이드로테스테론(0.5 mg/kg)을 1일 1회, 5일 동안 국소 도포하여 C57/BL6 마우스에 안드로겐성 탈모를 유발하였다. 이후, 국소 약물 도포를 위해 마우스를 무작위로 다음과 같이 7개 그룹(20 마리/그룹)으로 나누었다: 대조군(비히클)(BIM-TF#5의 비히클 용액), 미녹시딜 국소 용액(5%)(상업적으로 판매되는 5% 미녹시딜 외용액), BIM 에탄올 용액(5%)(에탄올 중의 5% BIM), BIM-TF#1(5%)(5% BIM을 함유하는 BIM-TF#1), BIM-TF#5(0.03%)(0.03% BIM을 함유하는 BIM-TF#5), BIM-TF#5(0.3%)(0.3% BIM을 함유하는 BIM-TF#5), BIM-TF#5(5%)(5% BIM을 함유 BIM-TF#5). 별도로 정상 대조군 마우스 20마리는 클리퍼로만 면도한 후 시험 기간 중 생리식염수를 도포하였다. 14일 동안 1일 1회 각 시료 용액을 20 μL씩 등 부위 피부(dorsal skin)에 적용하였다. 시료 도포 0, 3, 5, 7, 10 및 14일째 각 마우스의 등 부위 사진을 촬영한 다음 ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, 미국)를 사용하여 모발로 덮인 면적(발모 면적), 휴지기(telogen)에서 성장기(anagen)로 전환된 면적(검은 피부), 휴지기 면적(분홍색 피부)을 측정하여 모발 재성장 촉진 효과를 평가하였다. 도포 14일 후, 약물 처리 부위를 제모한 다음 모발의 무게를 측정하였다. 또한, 도포 0, 3, 7, 10, 14일째 각 그룹당 4마리의 마우스를 희생시키고, 탈모를 유도한 등 부위 피부 조직을 적출하여 10% 중성 인산-완충 포르말린에 고정한 다음 피부 조직 샘플을 파라핀 왁스에 포매하였다. 피부 조직을 5 μm 두께의 절편으로 절단하고, 헤마토실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 조직병리학적 변화(gross histopathological changes)를 평가하고 시료 도포 부위 피부 조직 내 모낭을 검사하였다.

(9) 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준 편차(SD) 또는 평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 0.05 미만의 p-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 3개 이상의 평균값을 분석하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트를 수행하였다.

2. 결과 및 고찰

(1) 외용제 첨가제 선정 및 BIM-TF의 제조

BIM는 알코올에 잘 용해되지만, 국소 용액의 빠른 증발은 약물의 피부 흡수 전 표면에서 약물의 석출 및 침전으로 인해 피부 흡수를 방해할 수 있다. 따라서 물, 하이드로알코올성 용매, 친유성 용매 및 비이온성 계면활성제를 포함한 다양한 첨가제에서 BIM의 용해도를 평가하였다(도 1a). BIM의 알코올 용해도는 198±5.40 mg/mL이며, 이는 물, 이소프로필 알코올, 벤질 알코올에 비해 각각 56.0배, 2.61배, 6.31배 높았다. BIM는 극성(아마이드 측쇄) 및 비극성(히드록실기를 갖는 펜텐 고리) 그룹으로 구성되기 때문에, 두 상(both phases)에 모두 용해될 수 있다. 그러나, BIM의 극성 그룹의 우세로, 벤질 알코올보다 극성이지만 물 및 이소프로필 알코올보다 덜 극성인, 에탄올에 더 높은 용해도를 나타낸다. 또한 BIM는 올레산 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 친유성 용매 및 Brij O20, Tween 80, Tween 20 및 Capryol 90을 포함한 비이온성 계면활성제에 덜 용해되었다. 그러나, BIM의 프로필렌 글리콜 및 트렌스큐톨 P에 대한 용해도는 각각 122±3.55 및 217±6.83 mg/mL 이었다.

따라서, 용해도 데이터에 근거하여, BIM를 포함하는 피부 외용제를 제조하기 위한 효과적인 국소 비히클 시스템의 용매로서 에탄올 및 트렌스큐톨 P를 각각 휘발성 용매 및 비휘발성 공용매로 선택하였다. 또한, BIM-TF#1은 프로필렌 글리콜과의 혼화성 및 피부 흡수 특성을 비교하기 위한 참고 제제로 제조하였다. 또한, 시클로메티콘은 습윤제(wetting agent)로 제제에 첨가하였다. 피부에 대한 효과적인 투과도를 나타내기 위해서는 피부 수분을 유지해야 하므로, 탈이온수를 첨가하여 충분한 피부 수분을 유지시켰다. 그러나 모든 제제는 21일 후 약물 함량이 약 20% 감소하여 보관 중 BIM의 산화적 분해를 나타냈다. 이러한 문제를 극복하기 위해, BHA를 항산화제로 제제에 첨가하였으며, 그 결과 실온에서 3개월 이상 각 비히클 시스템에서 약물의 함량은 95-105%를 유지하였다. 또한, BHA 첨가에 따른 침전, 상분리, 색상 변화 등의 물리적 외관의 변화는 없었다.

(2) BIM-TFs의 시험관 내 인공막 투과도

다양한 BIM 제제의 인공막을 통한 투과도는 프란츠 확산셀 시스템을 사용하여 결정하였다. 인공막을 통한 BIM-TF#1 및 BIM-TF#2의 약물 침투는 BIM 에탄올 용액에 비해 각각 1.31배 및 1.49배 개선되었다(도 1b). BIM-TF#3에서 10시간까지 BIM의 투과율은 BIM-TF#2보다 10.8% 더 높았으며, 이는 인공 피부막을 통한 약물의 투과도 향상에 트랜스큐톨 P가 효과적으로 기여함을 알 수 있다. 그러나, BIM-TF#4에 올레산 대신 시클로메티콘을 첨가한 경우 10시간 후 투과된 BIM가 BIM-TF#3에 비해 유의성 있게(22.6%) 증가하였으며, 이는 막에 대한 제제의 개선된 젖음성(wettability)에 기인하는 것으로 생각된다(도 1b). 또한, BIM-TF#4에서 트랜스큐톨 P의 농도를 5% 증가시켰을 때(즉, BIM-TF#5), BIM-TF#4에 비해 10시간까지 BIM의 투과율이 92.3% 유의성 있게 증가하였으며, BIM 에탄올 용액, BIM-TF#1 및 BIM-TF#4에 비해 각각 7.61배, 3.07배 및 1.71배 더 큰 플럭스(flux)를 나타냈다(도 1c). 그러나, 트랜스큐톨 P 또는 시클로메티콘의 농도를 추가로 증가시키더라도, 더 이상의 침투 증강 효과는 나타나지 않았으며, 이는 트랜스큐톨 P가 피부로부터 수분을 흡수하는 작용으로 인해 외용제에서 피부로의 약물의 분배계수가 감소한 것에 기인하는 것으로 생각된다.

0.03% BIM-TF#5를 로딩한 후 10시간 동안 약물의 누적 투과도는 4.94±0.197 μg/cm²이었으며, 이는 0.03% BIM 에탄올 용액에 비해 56.5% 더 높은 플럭스 값을 나타낸다(도 1d 및 도 1e). 또한, BIM-TF#5에서 약물의 농도가 10배 증가하면(0.03%에서 0.3%로) 플럭스 값 역시 0.891±0.154 ng/cm2/s로 증가했으며, 이는 0.3% BIM 에탄올 용액보다 2.60배 더 크다(도 1e). 또한, BIM-TF#5 중 BIM의 농도를 0.3%에서 5%로 증가시키면 10시간 동안 약물의 누적 투과량과 플럭스는 각각 14.0배 및 13.5배 증가하였으며, 이는 BIM-TF#5로부터의 약물의 인공막 투과가 외용액 중 고농도 약물의 침전으로 인한 투과도의 열역학적 추진력의 감소 없이, 농도 의존적으로 증가하였음을 의미한다.

(3) BIM-TFs의 시험관 내 인간 피부 투과도 및 피부 조직 내 침투

인간 피부에서 BIM 에탄올 용액 및 BIM-TFs의 시험관 내 투과를 평가하였다. BIM-TF#2 용액 로딩 후 10시간 동안 누적 투과된 BIM는 BIM 에탄올 용액 대비 73.5% 더 높았고, 피부 플럭스 역시 BIM 에탄올 용액 대비 92.5% 증가하였다(도 2a 및 도 2b). 그러나 BIM-TF#2에서 BIM의 피부 투과는 공용매로 프로필렌 글리콜을 트랜스큐톨 P로 대체해도(즉, BIM-TF#3) 유의성 있게 증가하지 않았다. 10시간 후 BIM-TF#4의 누적 BIM 투과율은 올레산을 시클로메티콘으로 대체함으로써 유의성 있게 증가하여 BIM-TF#3보다 37.3% 더 증가하였다(도 2a). 또한, BIM-TF#4에서 트랜스큐톨 P의 농도를 22%에서 27%로 증가시킨 BIM-TF#5는 BIM-TF#4에 비해 10시간 동안 인체 피부로의 약물 침투가 1.47배 증가하였으며, BIM 에탄올 용액의 피부 플럭스에 비해 360% 증가하였다(도 2a 및 도 2b). 그러나 10시간째 BIM-TF#6 및 BIM-TF#7의 약물 투과도는 BIM-TF#5보다 각각 41% 및 31% 감소하였다(도 2a 및 도 2b). 이러한 결과는 시험관 내 인공막 투과도 결과와 일치하며, 약물의 피부로의 분배계수 감소에 기인한 것으로 추정된다. 트랜스큐톨 P 및 시클로메티콘은 열역학적 추진력을 증가시켜 약물 및 비히클의 특성을 최적화하고 각질층을 변형시킴으로써, 약물의 용해도와 분배계수를 동시에 향상시키고, 수화된 상태를 유지하면서 피부 세포간 지질의 유동화를 유발하는 것으로 생각된다.

BIM 에탄올 용액, BIM-TF#1, BIM-TF#5 및 BIM-TF#8을 인체 피부에 도포한 다음 24시간 후 피부 각층에 침적된 BIM의 양을 도 2c에 나타냈다. BIM 에탄올 용액을 국소 적용한 후 약물 침적은 각질층에서 가장 높았고 진피와 표피가 그 뒤를 이었다. 이는 아마도 BIM의 낮은 수용해도에 기인하는 것으로 추정된다. 따라서 에탄올 증발 후 각질층의 지질에 약물이 잔류하는 것으로 추정된다. 프로필렌 글리콜 기반 제제(즉, BIM-TF#1)의 피부 침적은 BIM 에탄올 용액보다 1.82배 더 높았다. 또한, 트랜스큐톨 P 기반의 BIM-TF#8 도포 후 각질층, 표피 및 진피에 침투한 약물은 BIM-TF#1에 비해, 각각 37.8%, 65.3% 및 52.7% 유의성 있게 증가하였다. BIM-TF#5는, BIM-TF#8에 비해, 1.38배 및 2.27배 더 높은 각질층 및 진피로의 약물 침투 효과를 보였으며, 이는 BIM-TF#5로부터 인간 피부로 약물이 더 효과적으로 분배되었음을 의미한다. BIM-TF#5는 BIM를 국소로 전달하기 위한 트랜스큐톨 P 및 시클로메티콘의 이상적인 조성을 나타내며, 다른 국소 제제보다 두피의 진피에 있는 모낭을 더욱 효과적으로 자극할 수 있을 것으로 판단된다.

인공 피부막 투과도와 유사하게, 모든 약물 농도에서 BIM-TF#5는, BIM 에탄올 용액에 비해, 인간 피부를 통한 약물의 흡수를 유의적으로 증가시켰다(도 2d). 또한, BIM-TF#5에서 약물의 농도가 0.03%에서 0.3%로 증가함에 따라 인간 피부 플럭스가 5.42배 증가했으며, BIM-TF#5에서 약물의 농도가 5%로 증가하였을 때 피부 플럭스는 0.3% BIM-TF#5 대비 6.74배 증가하였다. 따라서 BIM-TF#5로부터의 인간 피부를 통한 약물의 흡수는 외용제 중 약물의 농도가 증가함에 따라 비례적으로 증가하였다.

시험관 내 인체 피부 투과 및 플럭스 데이터에 기초하여, BIM-TF#5가 이상적인 국소 BIM 외용제로 확인되었다. 이후, BIM-TF#5를 사용하여 국소 BIM의 시험관 내 세포 증식 활성 및 안드로겐성 탈모가 유도된 마우스에서 모발 재성장 효과에 대한 추가 시험을 수행하였다.

(4) 각질형성세포(HaCaT) 및 인간모유두세포(hDP 세포) 증식 촉진 활성

BIM-TF#5의 생물학적 활성을 평가하기 위하여, HaCaT 및 hDP 세포를 사용하여 세포 증식 분석을 수행하였다. 비히클(BIM-TF#5), BIM 에탄올 용액, BIM-TF#1, BIM-TF#5 및 10 μM 미녹시딜을 비교하였다. 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 비히클(BIM-TF#5) 처리 후에도 세포 생존율이 100%로 유지되어 비히클에 의한 독성이 없음을 나타낸다. 세포 증식에 대한 약물의 효과는 0.01에서 5 μM까지 용량-의존적으로 증가하였다. 그러나 BIM의 농도를 10 μM로 증가시켜도 세포 증식은 더 이상 증가하지 않았으며, 이는 아마도 수용체 매개 효과의 포화 및 약물의 농도 증가에 따른 외용제 희석액(treatment medium)에서 에탄올의 농도 증가 때문으로 추정된다. 요약하면, HaCaT 세포에 BIM-TF#5를 5 μM BIM 농도로 48시간 동안 처리했을 때, 세포 증식율은 159%에 도달했으며, 이는 BIM 에탄올 용액(5 μM), BIM-TF#1(5 μM) 및 미녹시딜(10 μM)에 비해 각각 26.6%, 18.74% 및 12.4% 더 높았다(도 3a). 또한, hDP 세포의 세포 증식 경향 역시 HaCaT 세포와 유사하였다. 48시간 동안 BIM 에탄올 용액(5 μM)을 hDP 세포에 처리한 경우, 무처치 세포보다 26.8% 더 높은 세포 증식이 나타났다(도 3b). 또한, 프로필렌 글리콜과 올레산을 공용매 및 계면활성제로 함유하는 대조 제제(BIM-TF#1)를 5 μM BIM 농도로 hDP 세포에 처리한 결과 BIM 에탄올 용액(5 μM)에 비해 15.2% 더 높은 세포 증식을 나타냈을 뿐만 아니라 미녹시딜(10 μM) 처리군 대비 동등한 세포 증식 효과를 나타냈다(도 3b). 또한, 5 μM의 BIM-TF#5를 처리한 후 48시간 배양은 세포 증식을 150%로 활성화했으며, 이는 BIM-TF#5의 비히클, BIM-TF#1(5 μM) 및 미녹시딜(10 μM) 보다 각각 49.5%, 10.5% 및 8.82% 더 높았다. BIM-TF#5는 BIM 대비 각질형성세포와 인간모유두세포 모두에서 세포 증식을 더욱 향상시켰으며 이는 제형 내 트랜스큐톨 P와 시클로메틴콘의 존재 때문으로 판단된다. 트랜스큐톨 P와 시클로메틴콘이 세포막으로의 약물의 분배를 증가시켜 세포막에 존재하는 수용체와 약물 분자의 충분한 결합을 초래하였기 때문으로 생각된다. 또한, 트랜스큐톨 P에서 BIM의 높은 용해도 역시 BIM-TF#5로부터 약물의 높은 세포 흡수(uptake)를 야기하여 보다 높은 세포 증식 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 따라서 각질형성세포와 인간모유두세포에 대한 BIM-TF#5의 높은 세포 증식 활성은 강력한 회복(rejuvenation)과 모낭의 자극으로 이어질 수 있으며, 따라서 모발의 발달(즉, 연장된 성장기 단계) 유도로 이어질 수 있다.

세포 활성에 대한 제제의 효과를 추가로 평가하기 위해, 시험관 내 상처 회복 시험을 hDP 세포를 사용하여 48시간 동안 수행하였다. 비히클(BIM-TF#5)을 처리한 세포 스크래치 상처의 회복률은 무처치 대조군과 유사하여 비히클(BIM-TF#5)의 세포 독성이 없음을 확인하였다. hDP 세포의 상처 회복 속도는 대조군(무처리) 및 비히클(BIM-TF#5)에 비해 BIM 에탄올 용액(5μM) 처리 후 가속화되었다. 도 3c 및 도 3d에 나타낸 바와 같이, hDP 세포의 스크래치된 상처에 BIM 에탄올 용액(5 μM) 또는 BIM-TF#1(5 μM)를 처리하고 36시간 배양한 후 상처회복(wound closure) 면적은 대조군(무처치) 대비 각각 19.7% 및 31.8% 더 증가하여 36시간째 상처 회복율은 각각 64.6% 및 76.7%로 평가되었다. BIM-TF#5를 5 μM BIM 농도로 희석하여 처리한 후 48시간째 상처 치유 면적은 87.7%로 증가하여, BIM 에탄올 용액 및 BIM-TF#1보다 각각 10.3% 및 6.77% 더 증가했다. 또한, BIM-TF#5(5 μM) 또는 미녹시딜(10 μM)을 처리한 후 48시간째 상처 회복율은 유사하였다. 따라서 BIM-TF#5(5 μM BIM)는 BIM 에탄올 용액 및 BIM-TF#1에 비해 스크래치 상처의 회복을 유의하게 가속화 했으며, 미녹시딜(10 μM)과 동등한 수준의 상처 회복율을 나타냈다. 이는 BIM-TF#5가 모낭 세포의 생물학적 활성 촉진을 통해 탈모증 치료에 효과적임을 의미한다.

(5) 탈모 유발 마우스에서 BIM-TF의 발모 촉진 효과

(5-1) 탈모 부위의 모발 성장 촉진 효과

BIM-TF를 다양한 농도로 적용한 후 탈모증 마우스의 모발 성장 효능을 평가하기 위해, 도포 후 0, 3, 5, 7, 10 및 14일에 검게 보이거나(성장기) 모발로 덮인 등 부위 피부 영역과 분홍색 피부 영역(휴지기)의 면적을 측정하였다(도 4). 비히클-도포 탈모 유도 마우스는 단순 제모한 대조군(정상, 일반 제모 마우스)과 비교하여 모낭의 휴지기가 유의적으로 증가하였다. 도포 후 최대 14일 동안 비히클 도포 마우스에서 완전한 모발의 재성장 면적은 13.0±3.73%에 불과했고, 이는 단순히 제모만 시행한 정상적인 마우스에서 관찰된 것보다 2.10배 낮았으며, 이는 제모 후 디히이드로테스테론(0.5 mg/d)을 국소에 도포함으로써 안드로겐성 탈모가 성공적으로 유도되었음을 시사한다. 5% 미녹시딜 국소 용액-처리군의 경우 4.13±2.47일 후 피부가 검은색으로 변하는 성장기의 초기 징후가 관찰되었으며, 이는 정상 및 비히클 도포군 대비 각각 2.56배 및 1.79배 빨랐고, 도포 10일째에 휴지기 면적의 80.8±12.1%가 새로운 모발로 덮인 결과는 나타냈다(도 4a 및 도 4b). 따라서 5% 미녹시딜 용액을 1일 1회 국소 도포한 경우 안드로겐성 탈모 마우스에서 새로운 모발의 성장을 유의성 있게 촉진하였다. BIM 에탄올 용액(5%) 또는 BIM-TF#1(5%)를 탈모 마우스에 1일 1회 14일 동안 도포했을 때, 모발 재성장 면적은 각각 46.9%±7.71% 및 57.0±11.2% 이었으며, 대조군(비히클 도포) 보다 유의적으로 모발 성장을 촉진했으나 미녹시딜 국소 용액(5%)보다는 2.02배 및 1.66배 작았다(도 4a 및 도 4b). 반면, BIM-TF#5를 14일 동안 도포한 경우 모든 농도에서 모발의 성장주기를 유의적으로 가속화 했으며, 일부 마우스에서는 7일째에 새로운 모발 성장이 명확하게 나타냈다. BIM-TF#5(0.03% 또는 0.3%)를 도포한 마우스는 각각 4.50±1.14 및 3.50±0.93일 후 최초로 등 부위 피부색이 검은색으로 변화하였다(도 4a). 또한, BIM-TF#5(0.3%) 도포 그룹의 경우 도포 3일째에 등 부위 탈모 면적의 21.8±7.20%가 성장기 징후를 나타내었으며, 이는 대조군(비히클), BIM 에탄올 용액(5%) 및 BIM-TF#1(5%) 도포군 대비 각각 733%, 73.8%, 및 753% 더 컸다(도 4a). 도포 7일 후, 재성장 모발로 덮인 면적은 비히클 도포군은 0%, BIM 에탄올 용액(5%) 도포군은 0.788±0.577%로서 0.03% 및 0.3% BIM-TF#5 도포군(각각 4.62±4.62% 및 22.1±10.4%)에서 더욱 유의적으로 증가했다(도 4b). BIM-TF#5(0.3%) 도포 그룹은 도포 10일 째 모발 재성장이 최대로 나타났으며 등 부위 탈모면적(휴지기 면적)의 74.1±12.8%가 신규 모발로 커버되었다. 이는 BIM-TF#1(5%) 그룹(36.4±10.8%)에 비해 훨씬 높았으며, 5% 미녹시딜 국소 용액 그룹(80.8±12.1%)과 동등하였다(도 4a 및 도 4b).

또한, BIM-TF#5는 농도-의존적으로 모발 성장을 촉진하였다. BIM-TF#5(5%) 도포 3일 이내에 탈모한 분홍색 피부(휴지기)가 검은색(성장기)으로 변했다. 이러한 변화 속도는 비히클(대조군), BIM 에탄올 용액(5%) 및 BIM-TF#5(0.3%)를 도포한 탈모 유도 마우스보다 유의적으로 더 빨랐다(도 4c). 또한, BIM-TF#5(5%)를 도포한 안드로겐 피부 영역에서 발모 효과 역시 BIM 에탄올 용액(5%) 및 BIM-TF#1(5%) 도포 그룹 대비 더욱 증가했다(도 4b). BIM-TF#5(5%) 도포 10일 후 안드로겐 탈모 부위에서의 발모 효과 역시 대조군(비히클), BIM 에탄올 용액(5%), 및 미녹시딜 국소 용액(5%) 도포군에 비해 738%, 123% 및 12.1% 더 증가했다(도 4b). 그러나 도포 10일 후 BIM-TF#5(5%) 도포군의 발모 촉진 효과는 BIM-TF#5(0.3%) 도포군과 유사했으며(도 4b), 이는 모발 성장에 관여하는 약물 수용체의 포화에 기인한 것으로 판단된다. 도포 10일째 잔여 탈모(휴지기) 면적은 대조군(비히클 도포)의 경우 70.1±11.0%, BIM 에탄올 용액(5%) 그룹의 경우 45.4±10.0%, 미녹시딜 국소 용액(5%) 그룹의 경우 0.163±0.163%, BIM-TF#1(5%) 그룹의 경우 4.73±2.56%, BIM-TF#5(0.03%) 그룹의 경우 19.8±8.16%, BIM-TF#5(0.3%)의 경우 7.08±7.08% 그룹 및 BIM-TF#5(5%) 그룹의 경우 3.63±3.63% 이었다(도 4c). 도포 14일째 0.3% 또는 5% BIM-TF#5 또는 5% 미녹시딜 국소 용액을 도포한 등 부위 피부는 새로운 모발로 완전히 덮였으나(각각 91.0±8.16%, 94.2±3.56% 및 94.8±3.51%), 대조군(정상, 일반 제모), 대조군(비히클 도포), BIM 에탄올 용액(5%) 도포 그룹의 경우 각각 38.1±10.3%, 66.5±10.3%, 43.5±9.66%의 피부가 여전히 탈모(휴지기) 상태로 유지되었다(도 4d). 이러한 결과는 BIM의 국소 탈모 부위 전달 효과가 향상되어 안드로겐성 탈모에서 모낭이 휴지기 단계에 머무르는 시간을 단축하고 성장기 단계로의 전환을 가속화하여 모발의 성장을 촉진했음을 시사한다.

(5-2) 발모 부위 모발의 무게 및 피부 조직학적 평가

도포 완료 후, 모든 실험군의 등 부위 피부에서 새로 자란 털의 무게를 측정하였다(도 5a). 비히클 도포군의 모발 중량은 대조군(정상, 일반 제모)보다 적었고, 이는 안드로겐성 탈모로 인해 모발의 성장이 지연되었음을 시사한다. BIM-TF#5(0.3%) 도포군의 모발 중량은 대조군(비히클), BIM 에탄올 용액(5%), BIM-TF#1(5%) 및 BIM-TF#5(0.03%) 도포군 보다 각각 1,198%, 549%, 197% 및 298% 더 증가했다(도 5a). 또한, 도포 14일 후, BIM-TF#5(5%)의 발모 효과는 대조군(정상) 그룹을 포함한 다른 처리 그룹보다 우수하였으며; 모발 중량은 대조군(비히클), BIM-TF#5(0.03%) 및 미녹시딜 국소 용액(5%) 도포 그룹보다 각각 1,591%, 418% 및 30.4% 더 증가했다(도 5a). 이는 BIM-TF#5(5%) 도포 후 조밀한 모낭이 형성되었음을 시사한다. 또한, 도포 기간 중 등 부위 피부에서 새로 자란 모발을 무작위로 뽑아 모낭 길이를 측정하였다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, BIM-TF#5(0.03%, 0.3%, 5%)를 도포한 마우스 털의 모낭은 대조군(비히클) 및 대조군(정상) 그룹보다 더 길었다. 또한, BIM-TF#5(0.3%) 및 BIM-TF#5(5%) 도포 7일 후 마우스의 모낭은 대조군(비히클)보다 각각 1.60배 및 2.02배 더 길었다. 도포 10일째에 새로 자란 모발의 모낭 길이는 모든 처리군에서 유사하였다. 도포 14일 후, BIM-TF#5(5%) 처리 마우스에서 모발의 모낭 길이는 6.66±1.13 mm이었으며, 이는 비히클, BIM-TF#5(0.3%) 및 5% 미녹시딜 국소 용액 도포 마우스에서 채취한 모발의 모낭 길이보다 각각 1.68, 1.21, 1.19배 더 길었다.

안드로겐 탈모증 마우스에서 BIM-TF#5 도포에 따른 발모 촉진 효과를 확인하기 위해 다양한 시점에서 탈모 부위 피부를 적출한 후, H&E로 염색한 다음 조직학적 분석을 통해 모낭의 밀도를 평가하였다(도 5c). 도포 14일 후, BIM-TF#5의 비히클, 5% BIM를 함유 BIM-TF#1, 또는 0.03%, 0.3% 또는 5% BIM를 함유하는 BIM-TF#5를 도포한 피부에서 표피의 비후 혹은 염증 세포의 침윤과 같은, 피부 자극 또는 염증 반응의 징후는 나타내지 않았다. BIM-TF#5를 국소 도포한 피부에서 정상 및 비히클 도포 대조군, BIM 에탄올 용액(5%) 및 BIM-TF#1(5%) 도포한 피부와 비교하여 모낭 수가 유의적으로 증가하였다. 또한, BIM-TF#5(0.3%) 및 BIM-TF#5(5%) 도포 그룹에서 7일 및 10일째 모낭의 수와 직경은 미녹시딜 국소 용액(5%) 도포 그룹을 포함한 다른 모든 군에 비해 유의적으로 증가하였다. 더욱이, 14일째, BIM-TF#5(0.03, 0.3 또는 5%) 도포군은 다른 그룹에 비해 심부 피하조직에서 더 성숙하고 두꺼운 모낭이 관찰되었다.

상기 결과들을 종합하면, BIM-TF#5는 모발의 재성장(발모) 효능을 더욱 향상시켰으며 이는 약물의 신속한 피부 침투와 함께 깊은 진피층에서도 약물의 높은 가용성이 유지되었기 때문이다. 이로 인해 약물의 진피 모유두 세포와 각질형성세포에 대한 직접적인 활성 증진 효과가 극대화되고; 이는 모낭의 성장기를 더욱 유지시켜 모발의 성장을 촉진하고 그 기간을 연장했음을 의미한다.

3. 결론

본 연구는 휘발성 및 비휘발성 성분을 포함하는 비마토프로스트의 "과포화 국소 전달 시스템"이 약물의 제형 내 안정성을 높이고 인간 피부 전 층에 걸쳐 약물의 즉각적인 침투를 촉진함으로써 탈모가 유도된 마우스에서 모발 재성장(발모)을 유의적으로 촉진함을 입증하였다. 비마토프로스트 외용제 처방의 약물전달 최적화 비히클 시스템(BIM-TF#5, 비마토프로스트 5% 함유)은 5% BIM 에탄올 용액(비마토프로스트 5%)에 비해 2.77배 높은 인체 피부투과도를 나타냈으며, 6.29배 높은 비마토프로스트의 진피 내 침적을 효과를 나타내었다. 또한 BIM-TF#5(5 μM)은 미녹시딜(10 μM) 대비 8.82% 및 12.4% 더 높은 각질형성세포 및 인간모유두세포 증식 효과를 나타냈으며, 다른 BIM 외용제 처방에 비해 스크래치 상처 회복을 유의적으로 가속하였다. 이는 BIM-TF#5의 모낭 세포에 대한 직접적인 생물학적 활성 증진 작용을 통해 모발 성장을 효과적으로 촉진함을 시사한다. BIM-TF#5(5%) 도포 3일째 모발의 재성장이 더욱 컸으며; 14일 동안 BIM-TF#5(0.3% 또는 5%) 및 5% 미녹시딜 국소 용액을 도포한 탈모 피부는 새로운 모발로 완전히 덮였다. 또한, BIM-TF#5(5%)를 14일 동안 도포한 피부에서 새로 자란 모발의 무게는 미녹시딜(5%) 도포 마우스보다 11.4 mg 더 증가했고, 모낭은 1.07 mm 더 길었다. 또한 BIM-TF#5(0.3% 또는 5% BIM) 도포는 다른 BIM-TF 도포군 및 미녹시딜(5%) 도포 그룹에 비해 7일 및 10일째의 모낭 수와 직경이 더욱 증가했다. 특히, 이러한 결과는 0.3% 및 5% BIM-TF#5가 탈모에 대한 발모 촉진 목적으로 활용 가능성이 있음을 보여준다.

Claims

활성성분으로서 비마토프로스트;
젖음성 또는 퍼짐성 개선제로서 시클로메티콘;
항산화제;
휘발성 용매로서 에탄올; 및
비휘발성 공용매로서 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르
를 포함하는 탈모증 치료 또는 발모 촉진을 위한 용액 형태의 국소 투여용 약학 조성물로서, 벤질 알코올, 프로필렌 글리콜 및 올레산을 포함하지 않는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비마토프로스트가, 조성물 총 중량에 대하여, 0.03 내지 7 중량%의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시클로메티콘이, 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 15 중량%의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항산화제가 부틸화 히드록시톨루엔 또는 부틸화 히드록시아니솔인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항산화제가, 조성물 총 중량에 대하여, 0.01 내지 1 중량%의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에탄올이, 조성물 총 중량에 대하여, 40 내지 70 중량%의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르가, 조성물 총 중량에 대하여, 20 내지 40 중량%의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 비마토프로스트 0.03 내지 7 중량%; 시클로메티콘 1 내지 15 중량%; 항산화제 0.01 내지 1 중량%; 에탄올 40 내지 70 중량%; 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 20 내지 40 중량%를 포함하는 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수화 촉진제로서 물을 추가로 포함하는 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 물이, 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 10 중량%의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제9항에 있어서, 비마토프로스트; 시클로메티콘; 항산화제; 에탄올; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 및 물로 구성된 약학 조성물.
제9항에 있어서, 비마토프로스트 0.03 내지 7 중량%; 시클로메티콘 1 내지 15 중량%; 항산화제 0.01 내지 1 중량%; 에탄올 40 내지 70 중량%; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 20 내지 40 중량%; 및 물 1 내지 10 중량%로 구성된 약학 조성물.
제9항에 있어서, 비마토프로스트 5 중량%; 시클로메티콘 5 중량%; 항산화제 0.1 중량%; 에탄올 54.9 중량%; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 27 중량%; 및 물 8 중량로 구성된 약학 조성물.