KR102478884B1 - 안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법 - Google Patents

안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102478884B1
KR102478884B1 KR1020170029694A KR20170029694A KR102478884B1 KR 102478884 B1 KR102478884 B1 KR 102478884B1 KR 1020170029694 A KR1020170029694 A KR 1020170029694A KR 20170029694 A KR20170029694 A KR 20170029694A KR 102478884 B1 KR102478884 B1 KR 102478884B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
helix
formula
present
peptides
Prior art date
Application number
KR1020170029694A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180102935A (ko
Inventor
김영우
티 루엉 뉴엔
Original Assignee
동국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동국대학교 산학협력단 filed Critical 동국대학교 산학협력단
Priority to KR1020170029694A priority Critical patent/KR102478884B1/ko
Publication of KR20180102935A publication Critical patent/KR20180102935A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102478884B1 publication Critical patent/KR102478884B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 N-capping box의 특수한 구조적, 그리고 기능적 특성에 착안하여, N-capping box의 수소 결합 상호 작용 중 하나를 공유 결합으로 대체하여 짧은 서열의 펩타이드 단백질 helix 구조 중 특히 효과적으로 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 상기 펩타이드의 결합 네트워크는 나선의 N 말단에서 주쇄(backbone) 수소 결합의 결핍을 보완하여 전체 나선 구조를 안정화시키게 되는바, 310 helix를 통해 활성을 나타내는 단백질이 관여하는 생체 내 단백질 상호작용을 저해할 수 있다는 장점이 있어, 암, 면역질환, 감염성 질환 등 다양한 질병의 치료제나 생물학적 연구에 있어서 유용한 도구로써 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법 {Method for producing stabilized 3(10)-helix peptides}
본 발명은 공유결합의 도입을 통해 펩타이드를 310 helix 나선형 2차 구조로 안정화 시킬 수 있는 방법 등에 관한 것이다.
생명활동의 유지를 위하여 생체 내에서 다양한 단백질들이, 단백질-단백질, 단백질- RNA, 및 단백질-DNA 간의 상호작용과 같은, 다른 생체 고분자 물질과 상호작용을 하면서 생체 내 신호전달 체계에 있어 중요한 역할을 수행하게 되며, 특정 단백질 간의 상호작용이 비정상적으로 활성화되어 특정 질병의 발생 및 해당 질병 상태가 유지되는 경우가 종종 발견된다. 많은 경우 이러한 고분자 물질들 간의 상호작용은 alpha-helix, β-strand와 같은 단백질의 특정 2차 구조를 통해 이루어진다.
가장 잘 알려진 단백질의 2차 구조 중 하나인 알파-나선(alpha-helix) 구조는 구상 단백질에서 발견되는 2차 구조의 30% 이상을 차지하며, 이러한 알파-나선 구조는 상기 생체 고분자 물질의 상호작용에 있어서 핵심적인 역할을 한다. 또한, 상기 단백질을 구성하는 펩타이드는 길이가 짧아서 화학적으로 합성하기가 간단하고 조작이 쉬우며, 구조나 형태에 따라 특이적 활성을 지니기 때문에 이를 기초로 하는 자기조립 나노 구조체에 대한 관심이 증가하고 있다. 따라서 상기 2차 구조를 갖는 짧은 서열의 펩타이드들은 생물학적 기전연구를 위한 유용한 연구도구 또는 질병 치료를 위한 의약품으로서 그 잠재성이 매우 크다고 할 수 있다.
상기 펩타이드들은 단백질 내에서는 안정적이지만, 단백질로부터 분리되어 단량체 펩타이드로 존재하게 될 경우에는 열역학적으로 불안정하여 나선 구조와 같은 2차 구조가 거의 유지되지 못하고, 무질서한 형태를 갖게 되므로, 표적에 대한 높은 친화력과 선택도를 가지는 것이 어렵다. 이에, 상기 문제를 해결하며 생명체의 다양한 상호작용을 조절 또는 저해할 수 있는 약물로서 적용될 수 있도록 하기 위하여, 단량체 펩타이드 또는 자기 조립된 펩타이드 나노구조체의 활성화된 형태 및 접힌 형태의 펩타이드를 환경에 따른 변화에도 안정화할 수 있도록 유지할 수 있는 방안을 마련하는 것이 시급하다.
한편, 지난 20년 동안, 펩타이드를 특정 2차 구조로 안정화 시킬 수 있는 다양한 방법들이 개발되었으며(한국등록특허 10-1254726 참조), 이미 다수의 회사들이 신개념의 의약품 또는 화장료 등을 개발하기 위한 새로운 전략으로서 이러한 방법을 사용하고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.
단백질의 helical 구조 중 310 나선형(helix) 구조는 알파-나선(alpha-helix) 다음으로 가장 많이 발견되는 나선형 2차 구조로서, 다양한 단백질 간의 상호작용에서 중요한 역할을 하고 있지만, 펩타이드 2차 구조를 안정화시키는 기술의 대부분은 주로 alpha-helix를 대상으로 하고 있으며, 310 helix를 안정화시킬 수 있는 효과적인 cross-link 기술은 아직 알려져 있지 않다.
이에 본 발명자들은 펩타이드 2차 구조를 안정화시키는 기술을 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 짧은 서열의 펩타이드 단백질의 helix 구조 중, 특히 310 helix 구조로 안정화시킬 수 있는 방법을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 N3 위치의 알릴 측쇄(allyl side-chain)와 Ncap 잔기의 질소 원자에 부착된 알케닐기(alkenyl group)가 연결되는 것을 특징으로 하는, 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 안정화된 310 나선형(helix) 구조를 가지는 펩타이드를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펩타이드를 310 나선형(helix) 구조로 안정화시키는 방법으로, 상기 펩타이드는 N3 위치의 알릴 측쇄(allyl side-chain)와 Ncap 잔기의 질소 원자에 부착된 알케닐기(alkenyl group)가 연결되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 알케닐기(alkenyl group)는 pro-2-enyl, but-3-enyl, 및 pent-4-enyl를 포함하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 펩타이드는 아미노산 25개 이하로 이루어진 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 펩타이드는 임의의 위치의 아미노산의 알파-질소(alpha-nitrogen)와 그로부터 3번째 위치의 아미노산의 측쇄가 연결된 것을 특징으로 하는, 안정화된 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 구조식 1로 표시되는 안정화된 310 나선형(helix) 구조를 가지는 펩타이드를 제공한다.
[구조식 1]
Figure 112017023344110-pat00001
상기 구조식에서,
R1은 수소(H), 알킬기(alkyl group), 아실기(acyl group), 또는 한 개 내지 그 이상의 일반적인 아미노산이고;
R2, R3, R4, 및 R5는 각각 일반적인 아미노산의 잔기(side-chain)이고;
R6는 수소(H) 또는 알킬기(alkyl group)이고;
Z는 NH(수소화질소) 또는 O(산소)이고;
m은 1과 3 사이의 정수이고; 및
n은 1과 21 사이의 정수이다.
본 발명은 짧은 서열의 펩타이드 단백질 나선형(helix) 구조 중 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 N-capping box의 특수한 구조적, 그리고 기능적인 특성에 착안하여, 310 helix 구조를 효과적으로 안정화시킬 수 있는 새로운 전략으로서, N-capping box의 수소 결합 상호 작용 중 하나를 공유 결합으로 대체한 기술을 개발하게 되었다.
본 발명에 따른 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드의 결합 네트워크는 나선의 N말단에서 주쇄(backbone) 수소 결합의 결핍을 보완하여 전체 나선 구조를 안정화시키게 되는바, 310 helix를 통해 활성을 나타내는 단백질이 관여하는 생체 내 단백질 상호작용을 저해할 수 있다는 장점이 있어, 암, 면역질환, 감염성 질환 등 다양한 질병의 치료제나 생물학적 연구에 있어서 유용한 도구로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 Ncap 잔기의 측쇄가 N3 잔기의 주쇄(backbone)-아미드와 사이에 2개의 상호 수소 결합으로 구성된 전형적인 N-capping box의 구조를 나타낸 것이고, 도 1b는 Ncap 잔기의 주쇄-아미드 질소가 N3 잔기의 Cα 탄소에 공유 결합되어 있는 N-capping box 유사체(mimetics) 펩타이드 1 및 2의 구조를 각 나타낸 것이며, 도 1c는 본 발명에 따라 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드를 나타낸 것이다.
도 2는 펩타이드 1 및 2를 제조하기 위하여 Ncap 위치에 있는 N-allylglysine 또는 N-but-3-enylglysine을 각각 가지고 있는 alanine/lysine 기반 기질 펩타이드 3과 4의 디자인을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 각 펩타이드의 2차 구조를 원편광 이색성(circular dichroism; CD) spectrometer를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 도 3a는 펩타이드 3, 1a, 및 1b를 각 분석한 결과이며, 도 3b는 펩타이드 4, 2a, 및 2b를 각 분석한 결과를 나타낸 것이다.
단백질 구조를 이루는 아미노산 측쇄(side-chain) 간의 다양한 상호 작용은 부분적인 단백질 구조의 특정 2차 구조를 형성하는데 중요한 역할을 담당하는바, 현재 질병에 관여하는 생체분자의 활성을 조절할 수 있는 새로운 분자를 개발하기 위하여 특정한 펩타이드 2차 구조를 안정화시킬 수 있는 다양한 방법이 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 펩타이드 2차 구조를 안정화시키는 더욱 개선된 기술을 제공하기 위해 예의 연구한 결과, 짧은 서열의 펩타이드 단백질의 helix 구조, 특히 310 helix 구조를 안정화시킬 수 있는 방법을 규명하여, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 펩타이드를 310 나선형(helix) 구조로 안정화시키는 방법으로, 상기 펩타이드는 N3 위치의 알릴 측쇄(allyl side-chain)와 Ncap 잔기의 질소 원자에 부착된 알케닐기(alkenyl group)가 연결되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법을 제공한다.
본 발명에서 "310 helix"란, 펩타이드의 310 나선 구조를 지칭하는 것으로서, alpha-helix 양끝의 1회전 부분으로 드물게 볼 수 있으며 짧고 불안정한 것이 많은 alpha-helix 외 나선구조 중 하나를 의미한다. 상기 구조의 나선 일 회전당의 잔기 수는 3이고, i번째의 아미노산의 카르보닐산소원자와 (i＋3)번째의 아미노산의 아미드수소원자가 수소결합을 형성하며, 닫혀진 고리의 구성원자수가 10이다. 1 잔기 당 축방향의 홈은 2Å로서 1.5Å나선에 비하여 가늘고 급하며, 뒤틀어진 각은 alpha-helix에 가까운 값을 취하지만, 측쇄에 약간 입체장애가 걸려있다.
또한, 본 발명은 하기 구조식 1로 표시되는 안정화된 310 나선형(helix) 구조를 가지는 펩타이드를 제공한다.
[구조식 1]
Figure 112017023344110-pat00002
상기 구조식에서,
R1은 수소(H), 알킬기(alkyl group), 아실기(acyl group), 또는 한 개 내지 그 이상의 일반적인 아미노산이고;
R2, R3, R4, 및 R5는 각각 일반적인 아미노산의 잔기(side-chain)이고;
R6는 수소(H) 또는 알킬기(alkyl group)이고;
Z는 NH(수소화질소) 또는 O(산소)이고;
m은 1과 3 사이의 정수이고; 및
n은 1과 21 사이의 정수이다.
본 발명자들은 특정한 펩타이드 2차 구조를 안정화시킬 수 있는 방법에 대하여 예의 연구하던 중, 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드의 구조를 확인하였다(실시예 2 참조).
우선, 본 발명의 일실시예에서는, 공개된 Fmoc/Boc 기반의 고체상 펩타이드 합성 프로토콜을 이용하여 펩타이드의 주쇄를 제조해 올레핀의 기하 이성질체인 것으로 보이는 두 개의 metathesized 생성물을 각각 산출했다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 실시예에 따라 산출된 각 펩타이드의 2차구조를 원편광 이색성(circular dichroism; CD) 분광기(spectrometer)를 이용하여 분석하였을 때, 16-원 환을 갖는 펩타이드 4가 310 helix에서 나타나는 전형적인 CD spectrum을 보이는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험준비 및 분석방법
1-1. 시약준비
상업적으로 이용 가능한 용매 및 시약을 매뉴얼에 따라 이용하였다. General. N-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP), piperidine, dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM), 1,2-dichloroethane (DCE), N,N-diisopropylethylamine (DIPEA), bis(tricyclohexylphosphine)benzylidine ruthenium (IV) dichloride (Grubbs catalyst first generation), (1,3-bis-(2,4,6-trimethylphenyl)-2-imidazolidinylidene)dichloro (o-isopropoxyphenylmethylene)ruthenium (HoveydaGrubbs catalyst second generation), trifluoroacetic acid (TFA), N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC), triisopropylsilane (TIS) 은 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
그리고, Fmoc-protected α-amino acids, (1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)dimethylaminomorpholino-carbenium hexafluorophosphate (COMU), Rink Amide MBHA resin 은 NovaBiochem (San Diago, CA, USA)에서 구입했으며, Fmoc-protected Cα-methyl-L-allylglycine 은 Okeanos Tech Co. Ltd (Beijing, China)에서 구입했다.
1-2. 펩타이드 (Peptide) 합성
실험을 위하여 모든 펩타이드는 MBHA 수지(resin) 상의 전형적인 Fmoc / t-Bu 전략에 기초하여 합성되었다.
먼저, 수지(resin) (30μmol)를 NMP에서 20분 동안 팽윤시킨 후, NMP에서 25% 피페리딘(piperidine) 용액으로 처리하여(2 × 10분) Fmoc group을 제거하였다. 아미노산 커플링(amino acid coupling)은 활성화제(activating agent)로서 4.75 equiv. (당량)의 COMU, 5 equiv.의 아미노산, 및 NMP 중 10 equiv.의 DIPEA로 30분 동안 수지(resin)를 처리함으로써 수행하였다. α,α-bisalkylated amino acid(Cα-methyl-L-allylglycine)의 경우, 3 equiv.의 Fmoc-protected 아미노산, 2.85 equiv.의 COMU 및 6 equiv.의 DIPEA를 사용하여 2시간 동안 커플링 반응을 수행하였다.
상기 각 아미노산 커플링 또는 Fmoc-deprotecting 반응 후, 수지(resin)를 DCM (2 × 2 분), NMP (2 × 2 분), DCM (2 × 2 분) 및 NMP (2 × 2 분)로 조심스럽게 세척하였다. 14 번째 아미노산 잔기(residue)를 결합시킨 후, Fmoc-deprotection 반응을 수행한 다음, DMQ 중 8 equiv.의 DIC 존재 하에 30분 동안 20 equiv.의 브로모아세트산 (bromoacetic acid)으로 수지(resin)를 처리하였다. 그 후, 수지(resin)를 DMF로 세척하고(5 × 2 분), 34 equiv.의 allylamine 또는 butenylamine 및 DMF 중 DIPEA를 사용하여 1시간 동안 아민화(amination)시켰다. 최종 아세틸화(acetylation)를 위해, 세척된 수지(resin)를 아세트산 무수물(acetic anhydride), DIPEA 및 NMP (85 : 315 : 1600)의 혼합물 3 mL로 45분 동안 처리하였다.
1-3. 펩타이드 복분해반응 (Metathesis) 및 정제 (Purification)
수지(resin) 결합된 펩타이드 기질의 고리-닫힘형 복분해 반응(Ring-closing olefin metathesis; RCM)은 실온 또는 60℃에서 2시간 동안 탈기된(degassed) DCE에서 20 mol %의 Grubbs 촉매 제1세대 또는 Hoveyda-Grubbs 촉매 제2세대를 사용하여 수행하였고, 60℃에서의 RCM 반응은 온도 조절 쉐이커 상에서 수행하였다. Shimadzu LCMS-2020 (교토, 일본)을 사용하여 펩타이드 생성물을 수지 분획(resin aliquot)으로부터 절단한 후, 이를 분석함으로써 반응의 진행을 모니터링 하였다. 상기 반응 용액을 배출한 후, 수지(resin)를 DCE 및 DCM으로 완전히 세척한 다음, 진공상태에서 하룻밤 동안 건조시켰다.
펩타이드의 절단(cleavage) 및 측쇄(side chains)의 전체적인 탈 보호는 TFA/-TIS/물의 95 : 2.5 : 2.5 혼합물을 2시간 동안 적용하여 수행하였다. 상기 펩타이드 생성물을 디에틸 에테르(diethyl ether)와 n-펜탄(pentane) (1 : 1)의 혼합물 중에 침전시켰다. 침전된 혼합물을 원심 분리하여 수집하고, 2시간 동안 공기 건조시켰다. 건조된 혼합물을 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물의 혼합물 (1 : 1)에 용해시키고, 이를 여과하여 수지(resin)를 제거하였다. 여액 중의 생성물을 Zorbax C18 칼럼 (Agilent, 9.4 × 250 mm, 5㎛)을 사용하여 역상 (reverse phase) 고속 액체 크로마토그래피 (high-performance liquid chromatography; HPLC)로 정제한 후, LC/MS (Liquid chromatography/mass spectrometry) (Shimadzu LCMS-2020)로 분석하였다.
펩타이드 1a. C67H108N20O16[M+2H]2 +/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 725.87, 측정값 725.90.
펩타이드 1b. C67H108N20O16[M+2H]2 +/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 725.87, 측정값 725.60.
펩타이드 2a. C68H110N20O16[M+2H]2 +/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 732.88, 측정값 732.65.
펩타이드 2b. C68H110N20O16[M+2H]2 +/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 732.88, 측정값 732.65.
펩타이드 3. C69H112N20O16[M+2H]2 +/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 739.89, 측정값 739.85.
펩타이드 4. C70H114N20O16[M+2H]2 +/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 746.89, 측정값 746.95.
1-4. 원편광 이색성 (Circular Dichroism ; CD)
펩타이드를 인산 칼륨(potassium phosphate) 완충액 (25mM, pH 6.5)에 용해시킨 후, 트립토판(tryptophan)의 흡광 계수 (λ280 = 5690/cm)를 사용하여 280nm에서 흡광도 분광법(absorbance spectroscopy)으로 펩타이드 시료의 농도를 측정하였다. 원편광 이색성(Circular dichroism; CD) 스펙트럼은 0.1-cm 경로 길이 세포를 사용하는 온도 제어기가 장착된 Chirascan CD 분광계로 기록되었다. 측정 매개 변수는 1-nm 대역폭(bandwidth), 1-nm 단계 분해능, 3 누적 및 0.5-s 응답으로 설정되었다.
CD 스펙트럼은 배경이 제거된 후, 몰 타원율(molar ellipticity)의 균일한 스케일(scale)로 변환되었고, 표시된 곡선은 표준 매개 변수로 부드럽게 처리되었다. 나선도 (helicities)의 백분율은 -31 500 (1-2.5/15) 및 0 deg cm2 d/mol을 사용하여 [θ] 222 (222 nm에서의 평균-잔기 타원율)로부터 계산되었다. 상기 사용된 모델 서열의 잔기(residues) 수는 15이다.
실시예 2. 안정화된 3 10 helix 구조를 갖는 펩타이드의 구조 확인
상기 실시예 1-4에 기재된 방법에 따른 원편광 이색성 (Circular Dichroism; CD) 분석을 통해 안정화된 310 helix 구조를 갖는 펩타이드의 구조를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 나선의 N말단에서 주쇄(backbone)측쇄(side-chain) 간의 상호적인 수소 결합 시스템을 일컫는 N-capping box의 Ncap 잔기 측쇄는 N3 잔기 (일반적으로 글루타메이트(glutamate) 또는 아스파테이트(aspartate))의 주쇄 아미드와 수소 결합을 형성하며, 그 측쇄는 다시 Ncap 아미드와 다른 수소 결합을 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 1a 참조). 이를 통하여, Ncap 잔기의 주쇄(backbone)-아미드 질소가 N3 잔기의 Cα 탄소에 공유 결합되어 있는 펩타이드 1 및 2를 디자인 하였다(도 1b 참조). 이와 같은 새로운 metathesis 기반 가교 결합 시스템을 통해 형성된 15 또는 16 membered macrocycle은 N3 잔기의 측쇄와 N-capping box 내의 Ncap 아미드 사이의 수소 결합에 의해 형성된 고리와 유사한 것으로 나타났다.
상기 결과들을 종합하였을 때, 도 1c에 나타낸 바와 같은, 안정화된 310 helix 구조를 가지는 펩타이드의 상기와 같은 특별한 수소 결합 네트워크는 나선의 N-말단에서 주쇄(backbone) 수소 결합의 부족을 보완하여, 전체 나선 구조를 안정화시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 펩타이드 화합물의 제조
상기 실시예 1-3에 기재된 방법에 따라 펩타이드의 주쇄는 공개된 Fmoc/Boc 기반의 고체상 펩타이드 합성 프로토콜을 이용하여 제조하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 펩타이드 1 및 2를 제조하기 위하여 Ncap 위치에 있는 N-allylglysine 또는 N-but-3-enylglysine을 각각 가지고 있는 alanine/lysine 기반 기질 펩타이드 3과 4를 디자인했다.
상기 펩타이드의 N3 위치에는 Thorpe-Ingold 효과로 인해 310 helix를 유도하는 것으로 하는 것으로 알려진 α,α-dialkylated amino acid 인 Cα-methyl-L-allylglycine이 포함되어 있으며, Ncap 위치에 있는 N-allylglysine 또는 N-but-3-enylglysine은 전형적인 sub-monomer 합성 프로토콜을 이용하여 도입하였다.
Macrocycle를 형성하기 위해, 수지(resine)에 결합된 기질 3 및 4에 Hoveyda-Grubbs 촉매 제2세대를 사용하여 60℃에서 2시간 동안 수행하였을 때, RCM (ring-closing metathesis) 반응이 90% 이상의 전환율로 원활하게 진행되었다. 같은 조건으로 동일한 반응을 반복했을 때, RCM 반응이 완료되었다. 상기 두 기질의 RCM은 올레핀의 기하 이성질체인 것으로 보이는 두 개의 metathesized 생성물을 각각 산출했다.
실시예 4. 원편광 이색성 분광기를 이용한 펩타이드의 2차구조 분석
실시예 3의 방법에 따라 산출된 각 펩타이드의 2차구조를 자외선 원편광 이색성(circular dichroism; CD) 분광기(spectrometer)를 이용하여 분석해, N-말단 macrocyclic cross-link의 helix 안정화 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, unmetathesized 펩타이드 3과 4는 부분적으로 나선형을 나타내며, 각 27과 26%의 나선형(helicity)를 보인다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 펩티드 3의 RCM 생성물 중 하나인 펩타이드 1a의 나선형이 약간 증가했지만(32.6%) CD의 스펙트럼에 큰 변화를 보이지 않았으며, 다른 RCM 생성물 펩타이드 1b는 펩티드 1a보다 더 나선형으로 나타났다(helical 함량 52.6%)(도 3a 참조).
한편, 펩타이드 4의 경우 고리 폐쇄의 결과가 더 두드러졌는데 310 helix에서 나타나는 전형적인 CD spectrum을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 거대 고리 형성 후에, 200nm 미만의 음성 밴드는 더 긴 파장 영역으로 상당히 이동하였고, 두 개의 metathesized 이성질체의 222 nm에서의 신호 강도는 15-membered 상대자와 비교하여 더욱 현저하게 향상된 것을 확인할 수 있었는데, 펩타이드 2a 및 2b 모두 helical 함량이 현저히 증가 하였다(각 60.2 및 65.1%). 또한, 펩타이드 2a 및 2b의 CD 스펙트럼이 거의 동일하기 때문에 이 시스템에서 16-membered 링의 helix-안정화 효과는 올레핀 기하 구조에 의해 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, 교차 결합(cross-linking)을 통해 형성된 15-membered macrocycle이 모델 서열에서 helix 안정화에 유익할 수 있고, 상기 모델 시스템에서 N 말단에서 RCM에 의해 형성된 16-membered 링이 15-membered 대응보다 나선형 구조 형성을 보다 효과적으로 유도함을 나타낸다.
이를 통하여, N3 위치의 알릴 측쇄(allyl side-chain)와 Ncap 잔기의 질소 원자에 부착된 alkenyl기를 연결한다면, 짧은 펩타이드를 310 helix로 안정화시키는데 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드를 310 나선형(helix) 구조로 안정화시키는 방법으로, 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드는 i+3 위치의 알릴 측쇄(allyl side-chain)와 i 잔기의 질소 원자에 부착된 알케닐기(alkenyl group)가 연결되는 것을 특징으로 하며,
    화학식 1의 n은 1 또는 2인 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112022015776442-pat00010
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드는 하기 화학식 2로 표시되는 펩타이드로 안정화되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법.
    [화학식 2]
    Figure 112022080470759-pat00013
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 아미노산 25개 이하로 이루어진 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 임의의 위치의 아미노산의 알파-질소와 그로부터 3번째 위치의 아미노산의 측쇄가 연결된 것을 특징으로 하는, 펩타이드 안정화 방법.
  5. 하기 구조식 1로 표시되는 안정화된 310 나선형(helix) 구조를 가지는 펩타이드:
    [구조식 1]
    Figure 112022015776442-pat00003

    상기 구조식에서,
    R1은 수소(H),
    Figure 112022015776442-pat00012
    (아세틸)로 표시되는 아실기(acyl group), 하나의 일반적인 아미노산 또는 펩타이드이고;
    R2, R3, R4, 및 R5 는 각각 일반적인 아미노산의 잔기(side-chain)이고;
    R6는 수소(H)이고;
    Z는 NH(수소화질소) 또는 O(산소)이고;
    m은 1과 3 사이의 정수이고; 및
    n 은 1과 21 사이의 정수이다.
KR1020170029694A 2017-03-08 2017-03-08 안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법 KR102478884B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170029694A KR102478884B1 (ko) 2017-03-08 2017-03-08 안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170029694A KR102478884B1 (ko) 2017-03-08 2017-03-08 안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180102935A KR20180102935A (ko) 2018-09-18
KR102478884B1 true KR102478884B1 (ko) 2022-12-20

Family

ID=63718647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170029694A KR102478884B1 (ko) 2017-03-08 2017-03-08 안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102478884B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112513098A (zh) 2018-07-31 2021-03-16 雷莫内克斯生物制药有限公司 多肽递送组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Robertson, N. S., et al., Reports in Organic Chemistry, 2015, vol. 5, pp. 65~74

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180102935A (ko) 2018-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schneider et al. Synthesis and efficacy of square planar copper complexes designed to nucleate. beta.-sheet structure
Shepherd et al. Single turn peptide alpha helices with exceptional stability in water
JP6259861B2 (ja) ビス−スルフヒドリル大環状化系
Hamley Introduction to peptide science
CN114341190A (zh) EphA2特异性的双环肽配体
Fukuzumi et al. Chemoselective cyclization of unprotected linear peptides by α-ketoacid–hydroxylamine amide-ligation
Singh et al. Synthetic peptide templates for molecular recognition: recent advances and applications
IL248059B2 (en) Method for preparing AMG 416
MXPA06011904A (es) Procesos para preparar eptifibatido.
TW200918551A (en) Method for producing peptide
Lelais et al. β‐Peptidic Secondary Structures Fortified and Enforced by Zn2+ Complexation–On the Way to β‐Peptidic Zinc Fingers?
Paradís‐Bas et al. 2‐Methoxy‐4‐methylsulfinylbenzyl: a backbone amide safety‐catch protecting group for the synthesis and purification of difficult peptide sequences
CN111393519B (zh) 作为krasg12c/sos1抑制剂的新型订书肽及其用途
KR102478884B1 (ko) 안정화된 3(10)-helix 구조를 갖는 펩타이드 제조방법
CN111040020A (zh) 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用
Vaz et al. Stable helical peptoids via covalent side chain to side chain cyclization
JP2016113481A (ja) ピロール・イミダゾールからなるポリアミドの製造方法
Avrutina et al. Application of copper (i) catalyzed azide–alkyne [3+ 2] cycloaddition to the synthesis of template-assembled multivalent peptide conjugates
US8247533B2 (en) Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media
Pham et al. Comparison of Oct-2-enyl and Oct-4-enyl staples for their formation and α-helix stabilizing effects
Avrutina et al. Fmoc‐assisted synthesis of a 29‐residue cystine‐knot trypsin inhibitor containing a guaninyl amino acid at the P1‐position
Pham et al. Helix stabilization by stapled N-capping box
Tai et al. Molecularly imprinted cavities template the macrocyclization of tetrapeptides
Huttunen-Hennelly et al. The design, synthesis, and characterization of the first cavitand-based de novo hetero-template-assembled synthetic proteins (Hetero-TASPs)
KR102520353B1 (ko) 안정화된 폴리프롤린 ⅱ 나선구조를 갖는 펩타이드

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant