KR102520353B1

KR102520353B1 - 안정화된 폴리프롤린 ⅱ 나선구조를 갖는 펩타이드

Info

Publication number: KR102520353B1
Application number: KR1020210004754A
Authority: KR
Inventors: 김영우; 루엉수안휘
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2023-04-12
Also published as: KR20220102699A

Abstract

본 발명은 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ나선구조를 갖는 펩타이드의 제조방법 등에 관한 것으로, 보다 자세하게는, α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 ring-closing olefin metathesis를 이용하여 연결함으로써 펩타이드를 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

안정화된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 갖는 펩타이드{Peptide comprising stabilized polyproline Ⅱ helix}

본 발명은 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 갖는 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 아미노산의 α-탄소의 위치를 ring-closing olefin metathesis를 이용하여 연결함으로써 펩타이드를 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

정상적인 생명활동뿐만 아니라 다양한 질병의 발생, 유지 및 악화 과정 중에서도 세포 내에서의 단백질간 상호작용(protein-protein interaction)은 매우 중요한 역할을 하기 때문에, 단백질간 상호작용을 효과적으로 제어할 수 있는 저분자 화합물을 찾기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔지만, 실제로 단백질간 상호작용이 이루어지는 부위는 일반적으로 매우 다양하기 때문에 저분자 화합물을 이용한 전략은 성공 가능성이 매우 낮다.

따라서 최근에는 단백질간 상호작용을 매개하는 단백질의 특정 2차 구조를 이용하여 단백질간 상호작용을 제어하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근에 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조(Polyproline Ⅱ helix) 역시 다양한 단백질간 상호작용을 매개하는 것으로 밝혀지면서, 특정 단백질간 상호작용을 제어할 수 있는 잠재력을 갖는 scaffold로서 그 구조와 기능에 대한 연구가 점차 관심을 받게 되었다. 그러나 단백질에서 분리된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조는 쉽게 그 2차 구조를 상실하여 생물학적 활성을 잃어버리는 경우가 대다수이며, α-Helix와 다르게 분자 내의 기능기(functional group) 간의 상호작용에 의해 안정화되지 않고 프롤린이 갖는 고유의 경직된 분자구조나 곁가지 이온간의 반발력 또는 펩타이드 골격과 물과의 상호작용에 의해 구조가 결정이 되기 때문에, 폴리프롤린 Ⅱ 구조를 안정화시키는 것은 매우 어려운 것으로 알려져 있다.

따라서, 폴리프롤린 Ⅱ 구조를 안정화시킬 수 있다면, 생명체 내에서 단백질의 상호작용을 효과적으로 조절 또는 저해하는데 사용될 수 있는 안정화된 생리활성 펩타이드를 개발할 수 있기 때문에, 암, 면역질환, 감염성 질환 등 다양한 질병의 치료제나 생물학적 연구에 있어서 유용한 도구로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

국내등록특허 10-1254726

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 갖는 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는, α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 ring-closing olefin metathesis를 이용하여 연결함으로써 펩타이드를 안정화시키는 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 펩타이드 내의 임의의 α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 연결함으로써 펩타이드의 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 안정화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 연결은 바람직하게는 고리-닫힘형 올레핀 복분해 반응(Ring-closing olefin metathesis; RCM)에 의하여 연결될 수 있으나, 펩타이드 내의 임의의 α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 연결하여 고리 구조, 즉, 거대환 구조(macrocyclic structure)를 형성할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 거대환 구조는 바람직하게는 15- 내지 25-membered macrocyclic 형태일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15- 내지 23-membered macrocyclic 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ나선구조를 가지는 펩타이드를 제공한다.

상기 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ나선구조를 가지는 펩타이드는 바람직하게는 하기 화학식 1 또는 2로 표기될 수도 있으나, 펩타이드 내의 임의의 α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 연결하여 고리 구조를 형성한 형태라면 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R1은 H, 일반적인 α-아미노산의 곁사슬, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬, 아릴, 아실, benzylcarbamoyl, 또는 한 개 이상의 일반적인 α-아미노산일 수도 있고, 또는 새로운 기능을 더하기 위한, 세포 내 동향을 관찰하기 위한 형광물질, 분리를 용이하게 하기 위한 기능기, 면역침전반응(immunoprecipitation reaction)을 위한 기능기 등으로 펩타이드에 기능을 추가하기 위하여 일반적으로 알려져 있는 다양한 기능기일 수도 있으며,

R2 내지 R6은 각각 독립적으로 H, 일반적인 α-아미노산의 곁사슬, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬 또는 아릴일 수 있으며,

R7은 OH, NH₂, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬아민, 아릴아민, 또는 한 개 이상의 일반적인 α-아미노산일 수 있으며,

R2와 R3은 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R4와 R5는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

n 또는 m은 각각 독립적으로 1 내지 5 사이의 정수이다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

R2 내지 R20은 각각 독립적으로 H, 일반적인 α-아미노산의 곁사슬, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬 또는 아릴일 수 있으며,

R21은 OH, NH₂, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬아민, 아릴아민, 또는 한 개 이상의 일반적인 α-아미노산일 수 있으며,

R2와 R3는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R4와 R5는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R7와 R8는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R9와 R10는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R11와 R12는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R14와 R15는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R16와 R17는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

R18와 R19는 서로 연결되어 링 구조를 형성할 수도 있으며,

m1, m2, m3, n1, n2 또는 n3은 각각 독립적으로 1 내지 5 사이의 정수이며,

x는 0 내지 30 사이의 정수이며,

y는 0 내지 5 사이의 정수이며,

z는 0 내지 20 사이의 정수이다.

본원 명세서에 있어서, “일반적인 α-아미노산”이란 발린, 류신, 이소류신, 리신, 트레오닌, 페닐알라닌, 메티오닌, 히스티딘, 트립토판, 글루타민, 아스파르테이트, 글루탐산염, 아르기닌, 알라닌, 프롤린, 시스테인, 아스파라긴, 세린, 글리신, 티로신, 등 단백질을 구성하는 주요 아미노산을 지칭하지만 반드시 이에 제한되지 않으며, “일반적인 α-아미노산의 곁사슬(side-chain)”이란 아미노산의 α-탄소에 부착된 치환기를 지칭하지만 반드시 이에 제한되지는 않는다.

상기 화학식 2는 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 가지는 펩타이드가 2개 이상 결합된 구조로서, 임의의 α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 연결함으로써 거대환 구조를 형성하고, 이를 여러 개 연결함으로써 펩타이드의 안정성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드의 폴리프롤린 Ⅱ나선구조를 안정화시키는 방법은 다양한 생리활성 펩타이드 내의 임의의 α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 연결함으로써 거대환 구조를 형성하고, 이를 통하여 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 효과적으로 안정화시킬 수 있다. 폴리프롤린 Ⅱ나선구조는 생체 내에서 단백질의 다양한 생리활성을 매개하는데 중요한 역할을 하는 이차구조이므로 본 발명의 방법에 따라 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조의 펩타이드는 암, 면역질환, 감염성 질환 등 다양한 질환의 치료제나 생물학적 연구에 있어서 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 합성 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 복분해 반응 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 캡핑 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 복분해 반응을 실시하지 않은 펩타이드의 캡핑 과정을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 액상 복분해 반응 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 LC/MS 분석 결과를 나타낸 도면이다. 도 6a는 펩타이드 1, 6b는 펩타이드 1u, 6c는 펩타이드 2, 6d는 펩타이드 2u, 6e는 펩타이드 3, 6f는 펩타이드 3u, 6g는 펩타이드 4, 6h는 펩타이드 4u, 6i는 펩타이드 3o, 6j는 펩타이드 3ou, 6k는 펩타이드 H-3, 6l은 펩타이드 H-3u, 6m은 펩타이드 A-3, 6n은 펩타이드 A-3u, 6o는 펩타이드 B-3, 6p는 펩타이드 B-3u, 6q는 펩타이드 3d, 6r은 펩타이드 3du, 6s는 펩타이드 7, 6t는 펩타이드 8, 6u는 펩타이드 9, 6v는 펩타이드 10, 6w는 펩타이드 12, 6x는 펩타이드 12u, 6y는 펩타이드 13, 6z는 펩타이드 13u, 6aa는 펩타이드 14, 6ab는 펩타이드 14u, 6ac는 펩타이드 3r, 6ad는 펩타이드 3ru, 6ae는 펩타이드 14r, 6af는 펩타이드 14ru의 LC/MS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 3의 NMR 분석 결과를 나타낸 도면이다. 도 7a는 1H-NMR spectrum 결과이고, 도 7b는 COSY spectrum 결과이고, 도 7c는 13C-NMR spectrum 결과이고, 도 7d는 NOESY spectrum 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 원편광 이색성 분광기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 3의 농도 또는 용매에 따른 구조 변화를 원편광 이색성 분광기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

폴리프롤린 Ⅱ 나선구조는 다양한 단백질간 상호작용을 매개할 수 있기 때문에, 이를 안정화시킬 수 있는 방법이 있다면 다양한 질병에 관여하는 생체분자의 활성을 효과적으로 조절할 수 있는 분자를 개발함으로써 다양한 질병에 폭넓게 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 이에, 본 발명자들은 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 안정화시키기 위한 기술을 제공하기 위하여 예의 연구한 결과, 아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 아미노산의 α-탄소의 위치를 ring-closing olefin metathesis를 이용하여 연결함으로써, 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 안정화시킬 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에 있어서, “폴리프롤린 Ⅱ 나선구조(polyproline Ⅱ helix)”란 반복되는 프롤린 잔기를 포함하는 단백질에서 발생하는 단백질 이차 구조의 유형을 총칭한다. 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조는 일반적으로 SH3 도메인에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있으며, 젤라틴, 콜라겐 등의 섬유상 단백질(fibrous protein)에서 유사한 형태가 많이 발견되는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에 있어서, “연결(cross-link)”은 펩타이드 내의 임의의 α-아미노산의 α-amine(i)과 그로부터 C 말단 쪽으로 세 번째 위치(i+3)의 α-아미노산의 α-탄소를 연결함으로써, 거대환 구조를 형성하는 것을 총칭하며, 상기 연결은 고리-닫힘형 올레핀 복분해 반응에 의한 것일 수 있으나, 일반적으로 사용되는 펩타이드를 연결하는 방법이라면 제한이 없다. 또한, 상기 연결은 스테이플화(stapling)되어 공유 결합(cross-link)을 형성한 것을 의미할 수도 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 실험준비

상업적으로 이용 가능한 용매 및 시약을 매뉴얼에 따라 이용하였다. N-Fmoc-(S)-α-methyl,α-allylglycine(S1), N-Fmoc-(S)-α-methyl,α-butenylglycine(S2), N-Fmoc-(S)-α-methyl,α-petenylglycine(S3), 및 N-Fmoc-(R)-α-methyl,α-allylglycine(R1)은 Okeanos Tech Co., Ltd.로부터 구입하였다. Fmoc-protected α-amino acids, 1-[(1-(cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uranium hexafluorophosphate(COMU), N-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide(Fmoc-OSu), Rink Amide MBHA resin, 및 2-(4-bromomethylphenoxy)ethyl polystyrene resin은 NovaBiochem으로부터 구입하였다. Benzylisocyanate는 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd로부터 구입하였다. 그리고 N-methyl-2-pyrrolidinone(NMP), dimethylformamide(DMF), N,N-diisopropylethylamine(DIPEA), bis(tricyclohexylphosphine)benzylidine ruthenium(IV) dichloride(first generation Grubbs catalyst), (1,3-bis-(2,4,6-trimethylphenyl)-2-imidazolidinylidene)dichloro(o-isopropoxyphenylmethylene)ruthenium(second generation Hoveyda-Grubbs catalyst), trifluoroacetic acid(TFA), N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC), triisopropylsilane(TIS), 1,2-dichloroethane(DCE), benzoic acid, allylamine, but-3-en-1-amine, 및 di-t-butyl dicarbonate는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

실시예 2: 펩타이드 제조

2.1. 펩타이드 합성

C-말단이 아미노화된 펩타이드(aminated peptide)를 제조하기 위하여, Rink Amide MBHA 수지를 이용하였다(loading capacity = 0.6 mmol/g). 건조 수지(50 mg, 30 μmol)을 NMP에 10분 동안 팽윤시킨 후에, NMP에 25% 피페리딘(piperidine) 용액을 첨가하고 2 X 10분으로 처리하여 fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) 보호기를 제거하였다. 아미노산 커플링(amino acid coupling)을 위하여, 5 당량(equiv.)의 COMU, 5 당량의 Fmoc-protected 아미노산, 10 당량의 DIPEA를 NMP에 첨가하고, 30분 동안 반응시켰다. 그리고 α-methyl,α-alkenylglycine 커플링을 위하여, 2.85 당량의 COMU, 3 당량의 Fmoc-protected 아미노산, 6 당량의 DIPEA를 이용하여 2시간 동안 반응시켰다. 각각의 커플링 단계 또는 deprotection(탈보호) 후에는 수지를 dichloromethane(DCM) 1 X 2분, NMP 1 X 2분, DCM 1 X 2분, 및 NMP 1 X 2분 순서로 세척하였다. Fmoc-deprotection 후에는 N-substituted glycine 커플링을 위하여, 수지를 20 당량의 bromoacetic acid 및 8 당량의 DIC가 첨가된 DMF를 이용하여 30분 동안 반응시켰다. 이후 수지를 DMF 5 X 2분으로 세척하고, 34 당량의 allylamine 또는 but-3-en-1-amine과 DIPEA가 첨가된 DMF를 이용하여 1시간 동안 아미노화(amination)하였다. N-말단 아실화(acylation)를 위하여, 수지를 20 당량의 DIPEA와 10 당량의 아실화 용액(Fmoc-Osu 또는 benzyl isocyanate)을 이용하여 실온에서 2시간 동안 처리하였다.

C-말단이 카복실화된 펩타이드(carboxylated peptide)를 제조하기 위하여, 2-(4-bromomethylphenoxy)ethyl polystyrene 수지를 이용하였다(loading capacity = 0.9 mmol/g). 건조 수지를 DCM을 이용하여 1시간 동안 팽윤시킨 후에, DMF를 이용하여 세척하였다. 그리고 첫번째 아미노산의 커플링 반응을 위하여, 수지를 3 당량의 Fmoc-protected amino acid, 3 당량의 DPIEA, 0.3 당량의 CsI이 첨가된 DMF에서 24시간 동안 처리하였다. NMP에 25% 피페리딘 용액을 첨가하고, 2 X 10분으로 처리하여 Fmoc 보호기(protecting group)를 제거하였다. 첫번째 아미노산을 인스톨시킨 후에, 상기와 동일하게 아미노산 커플링을 실시하여 펩타이드를 합성하였다.

펩타이드의 대표적인 합성 과정은 도 1에 나타내었다.

2.2. 수지-결합 펩타이드의 복분해 반응

수지에 결합되어 있는 N-Fmoc 보호 펩타이드(N-Fmoc protected peptide)의 고리-닫힘형 올레핀 복분해 반응(Ring-closing olefin metathesis; RCM)은 실온에서 20 mol%의 Grubbs 제1세대 촉매(catalyst)를 사용하거나, 60℃에서 Hoveyda-Grubbs 제2세대 촉매를 사용하여 탈기된(degassed) DCE 조건에서 2시간 동안 수행하였다. 반응이 완료된 후, 반응시킨 용액을 모두 제거하고, 수지는 3 X 2분 동안 DCE를 이용하여 세척하고, 3 X 2분 동안 DCM을 이용하여 다시 세척하였다. 그리고 NMP에 25% 피페리딘을 첨가하고 2 X 10분으로 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하고, N-말단은 아실화하였다. N-benzylcarbamoyl- 또는 acetyl로 캡핑(capping)된 아날로그(analog)를 제조하기 위해서는, NMP에 10 당량의 benzyl isocyanate 또는 acetic anhydride와 20 당량의 DIPEA를 첨가된 용액을 이용하여 수지를 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. Benzoyl로 캡핑된 아날로그를 제조하기 위해서는, NMP에 3 당량의 benzoic acid, 2.85 당량의 COMU 및 6 당량의 DIPEA가 첨가된 용액을 이용하여 수지를 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. N-캡핑 반응을 실시한 후에는 수지를 DCM으로 3 X 2분, NMP로 3 X 2분, DCM으로 3 X 2분, 그리고 diethyl ether DCM으로 3 X 2분 동안 세척한 후에, 진공상태에서 16시간 동안 건조시켰다.

대표적인 복분해 반응 과정은 도 2에 나타내었다.

2.3. 펩타이드의 절단 및 정제

수지에 결합되어 있는 펩타이드를 절단(cleavage) 하기 위하여, 16시간 동안 건조시킨 수지에 TFA/TIS/물의 95 : 2.5 : 2.5 혼합용매를 처리하고 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 절단된 펩타이드를 정제(purification)하기 위하여, 1 : 1의 n-펜텐(pentane) 및 디에틸 에테르(diethyl ether) 혼합용매를 첨가하여, 펩타이드를 수지로부터 분리하였다. 그리고 분리된 펩타이드는 원심분리를 통하여 수득하고, 수득된 펩타이드는 2시간 동안 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 펩타이드에 1 : 1의 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물의 혼합용매를 처리하여 용해시킨 후에, 필터를 이용하여 여과시켜 수지를 제거하였다. 그리고 여과된 용액은 다시 Zorbax C18 칼럼(Agilent, 9.4 X 250 mm, 5㎛)을 이용하여 reverse phase high-performance liquid chromatography를 수행하여 정제하였다.

펩타이드의 캡핑 과정은 도 3에 나타내었다. 대조군으로서 복분해 반응을 실시하지 않은 펩타이드의 캡핑 과정은 도 4에 나타내었다.

2.4. 액상 복분해 반응

액상(solution-phase) 기반 고리-닫힘형 올레핀 복분해 반응을 위하여, 도 4의 3u 펩타이드를 이용하였다. 보다 자세하게는, Hoveyda-Grubbs 제2세대 촉매를 DCE에 1.2 μmol/L의 농도로 첨가한 후, 100 μL의 용액에 0.3 mg의 3u 펩타이드(0.56 μmol)를 첨가하고, 60℃에서 강하게 혼합하며 30분 동안 반응시켰다. 그리고 질소 가스 조건 하에서 DCE를 증발시킨 후에, 남아있는 고체에 150 μL의 물을 첨가하여 다시 용해시키고, 여과 과정을 거쳐 용해되지 않은 물질들은 제거하였다. 그리고 여과된 용액은 다시 Zorbax C18 칼럼(Agilent, 9.4 X 250 mm, 5㎛)을 이용하여 reverse phase high-performance liquid chromatography를 수행하여 정제하였다.

액상 복분해 반응의 전반적인 과정은 도 5에 나타내었다.

실시예 3: 제조된 펩타이드의 LC/MS 분석

실시예 2.1 내지 2.4와 동일한 방법으로 제조된 펩타이드들을 LC/MS(Liquid chromatography/mass spectrometry, Shimadzu LCMS-2020)를 이용하여 분석하였다. LC/MS 분석 결과는 도 6a 내지 6af에 나타내었다.

펩타이드 1(C₃₀H₄₂N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 567.33, 측정값 567.40.

펩타이드 1u(C₃₂H₄₆N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 595.36,측정값 595.45.

펩타이드 2(C₂₉H₄₀N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 553.32, 측정값 553.35.

펩타이드 2u(C₃₁H₄₄N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 581.35,측정값 581.40.

펩타이드 3(C₂₈H₃₈N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 539.30, 측정값 539.40.

펩타이드 3u(C₃₀H₄₂N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 567.33, 측정값 567.40.

펩타이드 4(C₃₁H₄₄N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 581.35, 측정값 581.35.

펩타이드 4u(C₂₉H₄₀N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 553.32, 측정값 553.40.

펩타이드 3o(C₂₈H₃₇N₅O₆ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 540.28, 측정값 540.40.

펩타이드 3ou(C₃₀H₄₁N₅O₆ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 568.32, 측정값 568.40.

펩타이드 H-3(C₂₀H₃₁N₅O₄ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 406.25, 측정값 406.30.

펩타이드 H-3u(C₂₂H₃₅N₅O₄ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 434.28, 측정값 434.30.

펩타이드 A-3(C₂₂H₃₃N₅O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 448.26, 측정값 448.30.

펩타이드 A-3u(C₂₄H₃₇N₅O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 476.29, 측정값 476.30.

펩타이드 B-3(C₂₇H₃₅N₅O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 510.27, 측정값 510.20.

펩타이드 B-3u(C₂₉H₃₉N₅O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 538.31, 측정값 538.20.

펩타이드 3d(C₂₇H₃₆N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 525.28, 측정값 525.40.

펩타이드 3du(C₂₉H₄₀N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 553.32,측정값 553.30.

펩타이드 7(C₂₂H₃₀N₆O₅ [M+Na]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 481.22, 측정값 481.25.

펩타이드 8(C₂₃H₃₂N₆O₅ [M+Na]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 495.23, 측정값 495.25.

펩타이드 9(C₂₄H₃₄N₆O₅ [M+Na]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 509.25, 측정값 509.25.

펩타이드 10(C₂₅H₃₄N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 499.27, 측정값 499.30.

펩타이드 12(C₂₄H₃₄N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 487.27, 측정값 487.30.

펩타이드 12u(C₂₆H₃₈N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 515.30, 측정값 515.40.

펩타이드 13(C₂₆H₃₈N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 515.30, 측정값 515.40.

펩타이드 13u(C₂₈H₄₂N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 543.33, 측정값 543.40.

펩타이드 14(C₂₂H₃₀N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 459.24, 측정값 459.30.

펩타이드 14u(C₂₄H₃₄N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 487.27, 측정값 487.35.

펩타이드 3r(C₂₈H₃₈N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 539.30, 측정값 539.40.

펩타이드 3ru(C₃₀H₄₂N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 567.33, 측정값 567.35.

펩타이드 14r(C₂₂H₃₀N₆O₅ [M+H]⁺, stapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 459.24, 측정값 459.30.

펩타이드 14ru(C₂₄H₃₄N₆O₅ [M+H]⁺, unstapled)에 대한 ESIMS m/z 계산값 487.27, 측정값 487.35.

상기 결과에 나타난 바와 같이, 계산값과 측정값이 거의 유사한 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 예상했던 펩타이드들이 정상적으로 제조되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 제조된 펩타이드의 NMR 분석

펩타이드 3을 NMR(Agilent DD2 400 MHz NMR spectrometer, Santa Clara)을 이용하여 분석하였다. NMR 분석 결과는 MestReNova 소프트웨어(Santiago de Compostela)를 이용하여 시각화하였다. 그 결과는 도 7a 내지 7d에 나타내었다.

도 7a는 ¹H-NMR spectrum 결과이고, 도 7b는 COSY spectrum 결과이고, 도 7c는 ¹³C-NMR spectrum 결과이고, 도 7d는 NOESY spectrum 결과이다.

실시예 5: 원편광 이색성 분광기를 이용한 제조된 펩타이드의 분석

실시예 2.1 내지 2.4와 동일한 방법으로 제조된 펩타이드들을 자외선 원편광 이색성 분광기(Chirascan HP dual polarization circular dichroism spectrometer)를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, α-아미노산의 α-amine과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 ring-closing olefin metathesis를 이용하여 연결하여 고리 형태를 제조함으로써, 폴리프롤린 Ⅱ helical 함량이 증가한 것을 확인하였으며, 이와 같은 방법을 이용함으로써 펩타이드 내의 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 안정화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 펩타이드 3을 이용하여 농도에 따라, 또는 용매에 따른 2차 구조를 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 농도의 변화 또는 용매의 종류는 본 발명에 의해 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ2차 구조에 거의 영향을 주지 않는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 본 발명의 방법에 의하여 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 효과적으로 안정화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

펩타이드의 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 안정화시키는 방법으로서,
상기 방법은 펩타이드 내의 임의의 α-아미노산의 α-아민과 그로부터 세 번째 α-아미노산의 α-탄소의 위치를 고리 형태로 연결하여 거대환 구조(macrocyclic structure)를 형성시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 연결은 고리-닫힘형 올레핀 복분해 반응(Ring-closing olefin metathesis; RCM)에 의하여 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 고리 형태는 15- 내지 25-membered macrocyclic 형태인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항의 방법에 의하여 제조된, 안정화된 폴리프롤린 Ⅱ 나선구조를 가지는 펩타이드.