KR102470980B1

KR102470980B1 - Egfr 및 erbb2에 작용하는 피리미딘계 화합물

Info

Publication number: KR102470980B1
Application number: KR1020227006548A
Authority: KR
Inventors: 찰스 제트. 딩; 루 장; 실 리우; 리홍 후; 웬 지앙; 지안 리; 슈후이 첸
Original assignee: 차이나 리소시즈 파마수티컬 홀딩스 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-11-25
Also published as: JP2022533473A; AU2020322881A1; EP4006014B1; US20220289714A1; CN114174269B; JP7154455B2; CN114174269A; EP4006014A1; KR20220088407A; WO2021018017A1; CA3145686C; CA3145686A1; EP4006014A4; AU2020322881B2; US11530196B2

Abstract

본 발명은 EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이 및 ERBB2 엑손 20 삽입 돌연변이에 작용하는 피리미딘계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개시한다.

Description

EGFR 및 ERBB2에 작용하는 피리미딘계 화합물

본 출원은 하기의 우선권을 주장한다：

CN201910684658.1, 출원일: 2019년 07월 26일.

본 발명은 EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이 및 ERBB2 엑손 20 삽입 돌연변이에 작용하는 피리미딘계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

폐암은 가장 일반적인 악성종양 중 하나로 전 세계적으로 매년 160만 명의 새로운 폐암 증례가 있고 전체 악성종양의 13%를 차지하며 폐암으로 인한 사망자수는 매년 140만 명이다. 세계 1위의 암 킬러로 최근 폐암의 발병율은 전 세계적인 범위내에서 여전히 지속적으로 증가하고 있다. 비소세포 폐암(NSCLC)은 전체 폐암의 약 85%를 차지하며 비소세포 폐암 환자는 초기 단계에서 뚜렷한 특징이 없기 때문에 대부분의 환자는 진단 시 이미 진행기이며 NSCLC의 65%는 진단 시 이미 수술 기회를 잃었다. 따라서 약물요법, 즉 화학요법과 표적요법은 진행기의 비소세포 폐암환자의 치료에 매우 중요하다.

EGFR은 ErbB1 (EGFR 또는 HER1로 지칭 됨), ErbB2(HER2), ErbB3(HER3) 및 ErbB4(HER4)를 포함하는 티로신 키나아제 수용체 ErbB 패밀리의 주요 구성원이다. EGFR은 세포외 리간드 결합 도메인, α-나선형 막횡단 도메인, 세포내 티로신 키나아제 도메인 및 자가인산화 포인트를 포함하는 카르복실 말단 도메인으로 구성된다. 리간드가 수용체에 결합하면 EGFR 이량체화를 일으키고, 세포내 단백질 티로신 키나아제의 활성을 활성화시켜, 티로신 잔기의 자가인산화를 유발하고, 관련 신호 단백질을 동원하며, 하류 ERK/MAPK, PI3K/Akt 및 STAT 신호전달 경로의 활성화를 유발하여 종양 세포의 성장, 생존, 분화, 전이 및 종양 혈관의 신생을 조절한다. 따라서, EGFR에 대한 표적 요법은 하류 신호전달 경로의 전도를 억제하여 종양의 성장 및 분화를 억제하는 효과를 달성할 수 있다.

EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이는 NSCLC에서 세 번째로 큰 일련의 EGFR 유전자 돌연변이로, EGFR 돌연변이 전체의 약 4% 내지 7%를 차지하며, 엑손 20으로부터 번역된 아미노산 포인트는 762 내지 823 이다. N-말단에서 시작하는 글루탐산 Glu762는 중요한 촉매 부위이며, 그 다음으로 Ala763-Met766은 EGFR 티로신 키나아제 도메인의 C-헬릭스이며 인산염 전이에서 중요한 역할을 한다. EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이는 대부분 아시아인, 여성, 비흡연자 및 선암종 군에서 많이 발생하며, 기존의 EGFR 돌연변이와 동일한 임상적 및 병리학적 특징을 갖는다. 엑손 20의 가장 보편적인 유형의 돌연변이는 Asp770_Asn771insSerValAsp이고, 그 다음으로 Val769_Asp770insAlaSerVal, Asp770_Asn771insSerValAsp, Ala767_Val769dupAlaSerVal, Val769_Asp770insAlaSerVa 및 Ser768 _Asp770dupSerValAsp이며, 이들은 유사한 삽입 서열을 가지며 엑손 20 돌연변이의 36%를 차지한다. 기타 주요한 돌연변이 유형은 His773_Val774insAsnProHis로 엑손 20 돌연변이의 약 14%를 차지한다.

HER2 엑손 20 삽입 돌연변이는 전체 HER2 돌연변이 유형의 95% 이상을 차지하며, HER2 엑손 20 삽입 돌연변이 유형 중 A775_G776_ins YVMA는 85%를 차지하며 가장 흔한 돌연변이 유형이다.

현재 시장에는 EGFR 및 HER2 엑손 20 삽입 돌연변이를 효과적으로 억제하는 표적 약물이 없다. 임상 연구에서 (Erlotinib/Gefitinib/Afatinib)과 같은 EGFR TKIs는 EGFR 또는 HER2 엑손 20 삽입 돌연변이 모두에 대해 효능이 부족하고, 응답 효율이 낮다. 예를 들어, EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이가 있는 환자의 PFS는 2개월에 불과하여 기존 돌연변이(엑손 19 결손 및 L858R)형 환자보다 훨씬 낮고, 아파티닙(afatinib), 다코미티닙(dacomitinib)과 같은 2세대 EGFR 억제제도 엑손 20 삽입 돌연변이에 대해 임상적으로 이상적이지 않은 것으로 보고되어 EGFR 및 HER2 엑손 20 삽입 돌연변이에 대하여 매우 큰 만족되지 않은 임상적 수요가 있다.

일본 다케다제약에서 개발한 EGFR 및 HER2 엑손 20 삽입 돌연변이 억제제 TAK788은 EGFR 및 HER2 엑손 20 삽입 돌연변이가 있는 비소세포폐암의 전임상 및 임상 I/II상에서 우수한 효능을 보였으며, 임상적으로 이의 객관적 응답 효율이 43%이고, 질병 억제율이 86%에 달하는 것으로 보고되었다. 안전성은 다른 시판되는 EGFR-TKI와 유사하며, EGFR 및 HER2 엑손 20 삽입 돌연변이 치료에 양호한 전망을 가진다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 식（I）으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며,

식중,

R₁은 C_1~3알킬에서 선택되고,

R₂는 H, F, Cl, Br, I, C_1~3알킬 및 시클로프로필에서 선택된다.

본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 상기 R₁은 메틸, 에틸 및 이소프로필에서 선택되고, 기타 변량은 본 발명에 정의된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 상기 R₂는 H, Cl 및 시클로프로필에서 선택되고, 기타 변량은 본 발명에 정의된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태는 또한 상기 변량을 임의로 조합하여 얻는다.

본 발명은 또한 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능하는 염은

에서 선택된다.

본 발명은 또한 치료 유효량으로 활성성분인 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 EGFR 또는 ERBB2 관련 질환의 약물의 제조에 있어서의, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 암을 치료하는 약물의 제조에 있어서의, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.

[기술적 효과]

본 발명의 화합물은 EGFR 및 ERBB2 엑손 20 삽입 돌연변이에 대하여 비교적 양호한 활성을 나타내며, 표피 성장 인자 수용체의 효소의 이상으로 인한 질환에 보다 효과적인 치료를 제공할 수 있다.

[정의 및 설명]

다른 설명이 없으면, 본문에서 사용된 하기 용어와 문구는 다음과 같은 의미를 가진다. 하나의 특정된 용어 또는 문구는 특별히 정의되지 않는 상황에서 확정되지 않거나 명확하지 않은 것으로 간주되어서는 아니되며, 통상적인 의미로 이해되어야 한다. 본문에서 상품 명칭이 나타나면 이는 대응되는 상품 또는 이의 활성 성분을 나타낸다.

여기에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 신뢰 가능한 의학 판단 범위 내에서 그러한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형은 인간과 동물의 조직과 접촉에 사용하기에 적합하되, 과도한 독성, 자극성, 과민성 반응 또는 기타 문제 또는 합병증이 없으며 합리적인 이익/위험 비율을 의미한다.

용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명 화합물의 염으로, 본 발명에서 발견된 특정 치환기를 지닌 화합물과 상대적으로 무독의 산 또는 염기로 제조된다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 산성인 관능기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충족한 양의 염기와 이러한 화합물의 중성 형식으로 접촉시키는 방식으로 염기 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민 또는 마그네슘염 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물에 상대적인 염기성의 관능기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충족한 양의 산과 이러한 화합물의 중성 형식으로 접촉시키는 방식으로 산 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산 부가염의 구현예로, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 중탄산기, 인산, 인산일수소기, 인산이수소기, 황산, 황산수소기, 요오드화수소산, 아인산염 등을 포함하는 무기산염; 및 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베린산, 푸마르산, 락트산, 만델린산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 구연산, 타르타르산 및 메탄술폰산과 같은 유사한 산을 포함하는 유기산염을 포함하고, 아미노산(예를 들어 아르기닌 등)의 염, 및 글루쿠론산과 같은 유기산의 염을 더 포함한다. 본 발명의 일부 특정 화합물은 염기성과 산성 관능기를 포함하여 임의의 염기 또는 산 부가염으로 전환될 수 있다.

본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 산기 또는 염기를 함유한 모체 화합물로 통상적인 화학적 방법으로 합성할 수 있다. 일반적인 경우, 이러한 염의 제조 방법은, 물 또는 유기 용매 또는 양자의 혼합물에서 유리산 또는 염기 형식의 이러한 화합물을 화학적으로 칭량된 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조한다.

다른 설명이 없으면, 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 무독성이지만 원하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 유효량의 결정은 사람에 따라 다르고, 수용자의 연령과 일반적인 상태에 따라 다르며, 또한 구체적인 활성 물질에 따라 다르며, 개별의 경우에 적절한 유효량은 일상적인 실험에 기초하여 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

다른 설명이 없으면, 용어"C_1-3알킬기"는 직쇄 또는 분지쇄의 1 내지 3개의 탄소원자로 조성된 포화 탄화수소기를 나타낸다. 상기 C_1-3알킬기는 C_1-2및 C_2-3알킬기 등을 포함하며; 1가(예를 들어 메틸기), 2가(예를 들어 메틸렌기) 또는 다가(예를 들어 메틴기)일 수 있다. C_1-3알킬기의 예로는 메틸기(Me), 에틸기(Et), 프로필기(예를 들어, n-프로필기 및 이소프로필기) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 용매는 시판되는 것이다.

본 발명은 하기와 같은 약칭을 사용한다: DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 나타내며; TsOH.H₂O는 p-톨루엔술폰산 일수화물을 나타내며； EDCI는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 나타내며; DBU는 1,8-디아자비시클로운데크-7-엔을 나타내며; DIPEA는 N,N-디이소프로필에틸아민을 나타내며; NaH는 수소화나트륨을 나타내며; EtONa는 나트륨 에톡시드를 나타내며; m-CPBA는 m-클로로퍼옥시벤조산을 나타내며; DCM은 디클로로메탄을 나타내며; NH₄Cl은 염화암모늄을 나타내며; NaOH는 수산화 나트륨을 나타내며; DMF-DMA는 N,N-디메틸포름아미드 디메틸아세탈을 나타내며; MgCl₂는 염화마그네슘을 나타내며; CDI는 카르보닐 디이미다졸을 나타내며; THF는 테트라히드로푸란을 나타내며; NaH₂PO₄는 인산이수소칼륨을 나타내며; t-BuOH는 tert-부탄올을 나타내며; POCl₃은 옥시 염화인을 나타내며; NaClO₂는 아염소산나트륨을 나타내며; TOMAC는 트리옥틸메틸암모늄 클로라이드를 나타내며; MTBE는 메틸 tert-부틸 에테르를 나타낸다.

본 발명에서 사용하는 컬럼 크로마토그래피 분리의 충전제는 달리 명시되지 않는 한 모두 실리카겔이고, 본 발명에서 사용하는 박층 크로마토그래피 분리의 충전제는 달리 명시되지 않는 한 모두 실리카겔이다.

화합물은 인위적으로 또는 ChemDraw® 소프트웨어로 명명되고, 시판되는 화합물은 공급업체 목록명칭을 사용한다.

도1은 인간 폐암 NCI-H1975 마우스 피하 이종이식 종양 모델의 종양 성장 곡선이다.
도2는 인간 폐암 NCI-H1975 마우스 피하 이종 이식 종양 모델에서의 종양 담지 마우스의 투여 과정에서의 체중의 변화이다.
도3은 Ba/F3 EGFR D770_N771 ins SVD 피하 동종 이식 종양 모델의 종양 성장 곡선이다.
도4는 Ba/F3 EGFR D770_N771 ins SVD 피하 동종 이식 종양 모델에서의 종양 담지 마우스의 투여 과정에서의 체중의 변화이다.
도5는 HuPrime 폐암 LU0387 마우스 피하 이종 이식 종양 모델의 종양 성장 곡선이다.
도6은 HuPrime 폐암 LU0387 마우스 피하 이종 이식 종양 모델에서의 종양 담지 마우스의 투여 과정에서의 체중의 변화이다.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]

아래, 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 어떠한 불리한 제한도 받지 않는다. 본 발명의 화합물은 하기에 열거된 구체적인 실시형태, 이를 이와 다른 화학 합성 방법과 조합하여 형성된 실시형태, 및 당업자에게 공지된 등가 치환을 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 합성 방법에 의해 제조될 수 있고, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 기술분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않는 범위에서 본 발명의 구체적인 실시형태를 다양하게 변화 및 개선하는 것은 명백할 것이다.

실시예1

화합물1B

화합물1A（12.3g, 89.69mmol）의 DMF（100mL）용액에 DBU（1.37g, 8.97mmol） 및 DMF-DMA（26.91g, 225.83mmol）를 가하였다. 혼합물을 120 내지 130℃에서 16시간 동안 교반하여 반응을 종료시켰다. 반응용액을 농축하여 표제의 화합물을 얻었다.

화합물1C

질소가스의 보호하에서 화합물1B(17.24g, 89.69mmol)의 MTBE(300mL) 용액에 배치로 아연 분말(70g, 1.07mol) 및 염화암모늄(19g, 355.20mol)의 수용액(60mL)을 가하였다. 혼합물을 20 내지 30℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응을 종료시켰다. 반응용액을 감압하에서 흡인 여과하고, 케이크를 MTBE(50mL)로 세척하고, 여액을 합병하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(50mL×2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켜, 표제의 화합물 용액을 얻었으며 직접 다음 단계의 반응에 사용하였다. LCMS(ESI): m/z: 134.6[M+1].

화합물1D

화합물1C(11.94g, 89.68mmol)의 MTBE(350mL) 용액에 요오드화메틸(68.40g, 481.9mmol), NaOH 수용액(2.5M, 300mL) 및 TOMAC(1.81g, 4.48mmol)를 가하였다. 혼합물을 20 내지 30DegC에서 12시간 동안 교반하였다. 반응을 종료시켰다. 반응용액을 분층시키고, 하층의 수상을 아세트산에틸(100mL)로 추출하고, 유기상을 합병하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유에테르:아세트산에틸=80:1, 체적비)로 분리하고 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 7.62 - 7.57 (m, 1H), 7.45 (dd, J = 0.9, 8.2 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.26 - 7.23 (m, 1H), 7.11 (ddd, J = 1.0, 7.0, 7.9 Hz, 1H), 6.36 (dd, J = 0.7, 3.4 Hz, 1H), 4.09 (s, 3H). LCMS (ESI) m/z: 148.6 [M+1].

화합물1E

질소가스의 보호하에 0 내지 10DegC에서 DMF(20mL)용액에 POCl₃(4.7g, 30.65mmol, 2.85mL)를 천천히 적가하고, 15분간 교반한 다음, 화합물1D(2.3g, 15.63mmol)를 가하고, 혼합물을 20 내지 30DegC에서 2시간 동안 교반하였다. 반응용액에 15%의 NaOH 수용액(20mL)을 가하여 퀀칭시키고, 반응용액에 아세트산에틸(20mL×3)를 가하여 추출하였다. 합병한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르:아세트산에틸=10:1, 체적비)로 분리하고 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.99 (s, 1H), 8.36 - 8.31 (m, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.53 - 7.48 (m, 1H), 7.40 (dt, J = 1.3, 7.6 Hz, 1H), 7.38 - 7.33 (m, 1H), 4.21 (s, 3H).

화합물1F

0DegC에서 화합물1E（2.6g, 14.84mmol）의 t-BuOH（120mL） 및 2-메틸-2-부텐(120mL) 용액에 배치로 NaClO₂(26.85g, 296.83mmol) 및 NaH₂PO₄(26.71g, 222.62mmol)의 수용액（150mL）을 가하고, 혼합물을 20 내지 30DegC에서 24시간 동안 교반하였다. 반응용액에 아세트산에틸（300mL）를 가하여 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 여액을 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.18 - 8.14 (m, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.45 - 7.39 (m, 1H), 7.26 (d, J = 1.1, 7.3 Hz, 2H), 4.11 (s, 3H). LCMS (ESI) m/z: 192.5 [M+1].

화합물1G

화합물1F(2.8g, 14.65mmol) 및 CDI(3.56g, 21.97mmol)를 THF(50mL)에 용해시키고, 20DegC에서 2시간 동안 교반하고, 혼합물에 모노에틸 말로네이트 칼륨염(3.74g, 21.97mmol) 및 MgCl₂(2.79g, 29.29mmol)를 가하고, 반응용액을 20 내지 30DegC에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산에틸(60mL)를 가하고, 반응용액을 물(50mL)로 세척하고, 수상을 아세트산에틸(50mL)로 추출하고, 유기상을 합병하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르:아세트산에틸=10:1 체적비)로 분리하고 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.33 - 8.28 (m, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.42 - 7.38 (m, 1H), 7.27 (dtd, J = 1.2, 7.3, 16.3 Hz, 2H), 4.18 - 4.12 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 3.78 (s, 2H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z:262.1 [M+1].

화합물1H

화합물1G(0.5g, 1.91mmol)를 DMF-DMA(0.26g, 2.18mmol)에 가하고 반응용액을 80 내지 90DegC에서 1시간 동안 교반하였다. 반응용액을 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. 조질의 생성물을 직접 다음 반응에 사용하였다.

화합물1I

화합물1H(605mg, 1.91mmol)를 에탄올(6mL)에 용해시키고, 천천히 EtONa(0.27g, 3.97mmol) 및 S-메틸이소티오우레아 설페이트(300mg, 1.08mmol)를 천천히 가하고, 혼합물을 30DegC에서 12시간 교반하고, 반응용액을 농축하고, 혼합물에 아세트산에틸(30 mL)를 가하고, 반응용액을 포화 식염수(20mL)로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 박층 실리카겔 크로마토그래피 플레이트(석유에테르:아세트산에틸=5:1)로 분리하고 정제하여, 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.86 (s, 1H), 8.18 - 8.14 (m, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.51 (td, J = 0.9, 8.1 Hz, 1H), 7.37 - 7.32 (m, 1H), 7.29 - 7.24 (m, 1H), 4.31 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.19 (s, 3H), 2.70 (s, 3H), 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 344.2 [M+1].

화합물1J

화합물1I(180mg, 0.524mmol)을 DCM(5mL)에 용해시키고, 상기 혼합물에 m-CPBA(226mg, 1.05mmol, 80%의 순도)를 가하고, 반응용액을 25DegC에서 5시간 동안 교반하였다. 반응용액에 포화 아황산나트륨 용액(20ml)을 가하여 퀀칭시키고, DCM(50ml)을 가하여 추출하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 376.0 [M+1].

화합물1K

화합물1J(300mg, 0.8μmol) 및 4-플루오로-2-메톡시-5-니트로-아닐린(179mg, 0.961mmol)의 다이옥세인(10mL) 용액에 TsOH.H₂O(456mg, 2.40mmol)를 가하고, 반응용액을 100DegC에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산에틸(50mL)를 가하여 추출하고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨(30mL)으로 세척하고, 유기층을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 조질의 생성물을 얻었으며, 박층 실리카겔 크로마토그래피 플레이트(석유 에테르:아세트산에틸=2:1)로 분리하고 정제하여, 표제의 화합물을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 482.1 [M+1].

화합물1L

화합물1K(150mg, 311.57μmol)의 DMF(2mL) 용액에 N,N,N-트리메틸 에틸렌 디아민(58mg, 567.6μmol) 및 DIPEA(82.14mg, 0.635mmol)를 가하였다. 반응용액을 100DegC에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응용액을 실온으로 냉각시키고, 정제수(20mL)를 가하여, 용액에서 고체가 석출되고, 감압 하에서 흡인 여과하고, 케이크를 건조시켜, 표제의 화합물을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 564.2 [M+1].

화합물1M

질소가스의 보호하에, NaH(47mg, 1.18mmol, 60%의 순도)를 이소프로판올(1mL)에 가하고, 반응용액을 25DegC에서 15분 동안 교반하고, 화합물1L(130mg, 230.66μmol)의 THF(0.5mL) 용액을 상기 용액에 적가하였다. 반응용액을 80DegC에서 1시간 동안 교반하였다. 반응용액에 정제수(30mL)를 가하여 퀀칭시키고, 수상을 DCM(60mL)으로 추출하고, 유기층을 건조시키고, 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 578.0 [M+1].

화합물1N

질소가스의 보호하에, 화합물1M(89mg, 0.154mmol)의 에탄올(3mL) 및 정제수(1mL)에 아연 분말(101mg, 1.54mmol) 및 NH₄Cl(83mg, 1.55mmol)을 가하고, 반응용액을 25DegC에서 1시간 동안 교반하였다. 반응용액을 감압하에서 흡인 여과하고, 여액에 정제수(20mL)를 가하고, 여액에 DCM(45mL)을 가하여 추출하고, 유기층을 건조시키고, 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 548.2 [M+1].

화합물1O

화합물1O(84mg, 153.38μmol) 및 아크릴산(17mg, 0.236mmol)의 디클로로메탄(2mL) 용액에 EDCI(44mg, 229μmol) 및 DIPEA(40mg, 309μmol)를 가하고, 반응용액을 25DegC에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물(10mL)을 가하고, DCM(15mL×2)으로 추출하고, 유기상을 분리하여 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 조질의 생성물을 얻었으며, 조질의 생성물을 박층 실리카겔 크로마토그래피 플레이트(DCM:MeOH=10:1)로 분리하고 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 = 9.31 - 9.13 (m, 1H), 8.85 - 8.76 (m, 1H), 8.47 (br d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.73 - 7.63 (m, 1H), 7.51 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.31 - 7.23 (m, 1H), 7.17 - 7.08 (m, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.66 - 6.34 (m, 2H), 5.97 - 5.74 (m, 1H), 5.04 - 4.96 (m, 1H), 4.59 (br s, 3H), 4.20 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.15 - 3.05 (m, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.58 - 2.45 (m, 2H), 2.35 (br s, 3H), 1.08 (d, J = 6.1 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 602.3 [M+1].

화합물1

화합물1O(15mg, 24.93μmol)의 아세토 니트릴(0.5mL) 및 물(10mL)의 용액에 메탄술폰산(2.40mg, 24.93μmol)을 가하였다. 혼합물을 동결건조시켜 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 = 9.18 - 8.95 (m, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.44 - 8.29 (m, 1H), 7.73 (br d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.26 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.17 - 7.08 (m, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.58 - 6.31 (m, 2H), 5.83 (dd, J = 2.1, 9.6 Hz, 1H), 5.00 (quin, J = 6.3 Hz, 1H), 4.57 (br s, 3H), 4.19 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.25 - 3.10 (m, 2H), 2.77 - 2.62 (m, 6H), 2.48 (br s, 5H), 1.09 (d, J = 6.3 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 602.3 [M+1].

실시예2

화합물2B

본 화합물은 실시예1의 화합물1B의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1A를 화합물2A로 대체하였다.

화합물2C

본 화합물은 실시예1의 화합물1C의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1B를 화합물2B로 대체하였다.

화합물2D

화합물2C(11.08g, 83.22mmol)의 2-MeTHF(400mL) 용액에 요오도에탄(65.13g, 417.59mmol), NaOH 수용액(2M, 400mL) 및 TOMAC(1.67g, 4.14mmo)를 가하였다. 혼합물을 20 내지 30DegC에서 12시간 동안 교반하였다. 반응을 종료시켰다. 반응용액을 분리하고, 하층의 수상을 아세트산에틸(200mL×2)로 추출하고, 유기상을 합병하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유에테르:아세트산에틸=1:0, 체적비)로 분리하고 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 7.51 (td, J = 0.9, 8.0 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 0.9, 8.2 Hz, 1H), 7.18 - 7.13 (m, 2H), 7.02 (ddd, J = 1.1, 7.0, 8.0 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 1.0, 3.4 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 162.5 [M+1].

화합물2E

본 화합물은 실시예1의 화합물1E의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1D를 화합물2D로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.89 (s, 1H), 8.26 - 8.21 (m, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.41 - 7.37 (m, 1H), 7.32 - 7.27 (m, 1H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 4.32 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 190.1 [M+1].

화합물2F

본 화합물은 실시예1의 화합물1F의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1E를 화합물2E로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.28 - 8.23 (m, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.52 - 7.48 (m, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 2H), 4.41 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.47 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 205.8 [M+1].

화합물2G

본 화합물은 실시예1의 화합물1G의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1F를 화합물2F로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.32 - 8.29 (m, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.40 - 7.36 (m, 1H), 7.30 - 7.22 (m, 2H), 4.32 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.78 (s, 2H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 276.4 [M+1].

화합물2H

본 화합물은 실시예1의 화합물1H의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1G를 화합물2G로 대체하였다.

화합물2I

본 화합물은 실시예1의 화합물1I의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1H를 화합물2H로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.76 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.27 - 7.21 (m, 1H), 7.19 - 7.14 (m, 1H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.61 (s, 3H), 1.38 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.14 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 358.2 [M+1].

화합물2J

화합물2I(0.74g, 2.07mmol)를 에탄올(8mL)에 용해시키고 수산화나트륨(2M, 4mL) 수용액을 가하였다. 반응계를 20 내지 30DegC에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응의 종료를 모니터링하였다. 반응용액을 염산 수용액(2M)으로 pH를 3 내지 4로 조절한 다음, 아세트산에틸(10mL×3)로 추출하였다. 유기상을 합하여 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 감압하에 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.90 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.42 - 7.38 (m, 1H), 7.24 (dt, J = 1.1, 7.6 Hz, 1H), 7.19 - 7.16 (m, 1H), 4.30 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.62 (s, 3H), 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z: 330.3 [M+1].

화합물2K

화합물2J(0.66g, 2.00mmol) 및 요오도이소프로판(1.70g, 10.00mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(7mL)에 용해시키고, 탄산세슘(1.31g, 4.01mmol)을 가하였다. 40 내지 50DegC의 내부온도에서 1시간 동안 교반하였다. 반응용액에 아세트산 에틸(30mL)을 가하고 여과하였다. 여액을 포화 염화나트륨 수용액(7mL×1)으로 세척하였다. 세척한 수층을 아세트산에틸(7mL×2)로 추출하였다. 유기상을 합하여 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 감압하에 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.73 (s, 1H), 8.06 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.26 - 7.21 (m, 1H), 7.19 - 7.13 (m, 1H), 5.07 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 4.31 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.14 (d, J = 6.4 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 372.3 [M+1].

화합물2L

본 화합물은 실시예1의 화합물1J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1I를 화합물2K로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.00 (s, 1H), 8.40 - 8.35 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.54 - 7.49 (m, 1H), 7.41 - 7.32 (m, 2H), 5.29 (m, 1H), 4.43 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.43 (s, 3H), 1.48 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.32 (d, J = 6.4 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 404.2 [M+1].

화합물2M

화합물2L(760mg, 1.88mmol)을 테트라히드로푸란(10mL)에 용해시키고, 나트륨 tert-부톡사이드(905.17mg, 9.42mmol)를 가하고, 25DegC에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. LCMS로 반응의 종료를 모니터링하였다. 반응용액에 물(20mL)을 가하고 디클로로메탄(20mL×3회)으로 추출하였다. 유기상을 합하여 포화 식염수(20mL×2회)로 세척하고, 분층시켜, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고, 여액을 회전 증발시켜, 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 델타기호 = 8.51 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.72 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.26 - 7.18 (m, 1H), 7.14 - 7.03 (m, 1H), 4.82 - 4.71 (m, 1H), 4.40 - 4.28 (m, 2H), 1.34 (t, J=7.0 Hz, 3H), 0.96 (d, J=6.3 Hz, 6H).

화합물2N

화합물 2M(640mg, 1.87mmol)을 옥시염화인(13.20g, 86.09mmol)에 가하고 80DegC에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응용액을 감압하에 농축하고, 잔여물에 0DegC에서 아세트산에틸(20mL) 및 포화 탄산수소나트륨 수용액(10mL)을 가하였다. 분층시켜, 유기층을 포화 식염수(20mL×1)로 세척하였다. 수층을 분리하고, 유기상을 건조시키고, 농축하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 델타기호 = 8.91 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.12 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.67 - 7.55 (m, 1H), 7.39 - 7.33 (m, 1H), 7.32 - 7.25 (m, 1H), 5.14 (spt, J=6.3 Hz, 1H), 4.42 (q, J=7.0 Hz, 2H), 1.35 (t, J=7.0 Hz, 3H), 1.21 (d, J=6.3 Hz, 6H).

화합물2O

본 화합물은 실시예1의 화합물1K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1J를 화합물2N으로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 델타기호 = 9.12 (s, 1H), 8.82 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.84 (br d, J=7.3 Hz, 1H), 7.60 - 7.49 (m, 1H), 7.41 (d, J=13.4 Hz, 1H), 7.33 - 7.25 (m, 1H), 7.10 (t, J=7.4 Hz, 1H), 5.10 - 4.95 (m, 1H), 4.40 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 1.38 - 1.34 (m, 3H), 1.15 (d, J=6.2 Hz, 6H).

화합물2P

본 화합물은 실시예1의 화합물1L의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1K를 화합물2O로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 델타기호 = 8.93 (s, 1H), 8.75 - 8.68 (m, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.85 (br s, 1H), 7.55 - 7.49 (m, 1H), 7.25 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.07 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 6.88 - 6.76 (m, 1H), 5.02 (td, J=6.3, 12.4 Hz, 1H), 4.41 - 4.35 (m, 2H), 3.94 - 3.89 (m, 3H), 3.30 - 3.27 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.48 - 2.47 (m, 2H), 2.15 (s, 6H), 1.36 - 1.32 (m, 3H), 1.18 - 1.14 (m, 6H).

화합물2Q

본 화합물은 실시예1의 화합물1N의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1M을 화합물2P로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 델타기호 = 8.74 - 8.65 (m, 2H), 8.01 - 7.87 (m, 2H), 7.51 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.25 (br t, J=7.4 Hz, 1H), 7.18 - 7.06 (m, 2H), 6.80 (br s, 1H), 5.76 (s, 2H), 5.01 (td, J=6.2, 12.4 Hz, 1H), 4.37 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.95 - 2.90 (m, 2H), 2.65 (s, 3H), 2.40 (br d, J=6.4 Hz, 2H), 2.20 (s, 6H), 1.34 (t, J=7.0 Hz, 3H), 1.15 (d, J=6.2 Hz, 6H).

화합물2R

본 화합물은 실시예1의 화합물1O의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1N을 화합물2Q로 대체하였다. LCMS (ESI) m/z: 616.2 [M+1].

화합물 2

본 화합물은 실시예1의 화합물1의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1O를 화합물2R로 대체하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 = 8.80 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.90 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.25 (t, J=7.3 Hz, 1H), 7.16 - 7.08 (m, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.50 - 6.41 (m, 2H), 5.93 - 5.76 (m, 1H), 5.06 (td, J=6.2, 12.5 Hz, 1H), 4.41 (q, J=7.0 Hz, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.52 - 3.44 (m, 2H), 3.28 - 3.25 (m, 2H), 2.86 (s, 6H), 2.70 (d, J=3.0 Hz, 6H), 1.43 (t, J=7.0 Hz, 3H), 1.16 (d, J=6.3 Hz, 6H).

실시예3

화합물3B

본 화합물은 실시예1의 화합물1B의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1A를 화합물3A로 대체하였다.

화합물3C

본 화합물은 실시예1의 화합물1C의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1B를 화합물3B로 대체하였다.

화합물3D

화합물3C(1.39g, 10.44mmol)의 2-MeTHF(50mL) 용액에 요오도 이소프로판(8.50g, 50mmol), NaOH 수용액(2M, 50mL) 및 TOMAC(210mg, 519.60μmol)를 가하였다. 혼합물을 20 내지 30DegC에서 48시간 동안 교반하였다. 반응을 종료시켰다. 반응용액을 분층시켜, 하층의 수상을 아세트산에틸(20mL×2)로 추출하고, 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유에테르:아세트산에틸=1:0, 체적비)로 분리하고 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 7.51 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 0.9, 8.2 Hz, 1H), 7.17 - 7.11 (m, 2H), 7.01 (dt, J = 1.0, 7.6 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 0.7, 3.4 Hz, 1H), 4.47 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 176.5 [M+1].

화합물3E

본 화합물은 실시예1의 화합물1E의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1D를 화합물3D로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.99 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.50 - 7.45 (m, 1H), 7.41 - 7.31 (m, 2H), 4.65 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 1.42 (d, J = 6.1 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 204.5 [M+1].

화합물3F

본 화합물은 실시예1의 화합물1F의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1E를 화합물3E로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.29 - 8.23 (m, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.51 - 7.46 (m, 1H), 7.38 - 7.30 (m, 2H), 4.65 (spt, J = 6.1 Hz, 1H), 1.42 (d, J = 6.3 Hz, 6H)。 LCMS (ESI) m/z: 220.4 [M+1].

화합물3G

본 화합물은 실시예1의 화합물1G의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1F를 화합물3F로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.42 - 8.37 (m, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.47 - 7.43 (m, 1H), 7.38 - 7.30 (m, 2H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.23 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 1.42 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z:289.9 [M+1].

화합물3H

본 화합물은 실시예1의 화합물1H의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1G를 화합물3G로 대체하였다.

화합물3I

본 화합물은 실시예1의 화합물1I의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1H를 화합물3H로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.84 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (dt, J = 1.1, 7.6 Hz, 1H), 7.28 - 7.23 (m, 1H), 4.64 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 4.30 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.70 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.3 Hz, 6H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LCMS (ESI) m/z:372.3 [M+1].

화합물3J

본 화합물은 실시예2의 화합물2J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2I를 화합물3I로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.87 (s, 1H), 8.24 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.28 - 7.19 (m, 2H), 4.59 - 4.49 (m, 1H), 2.68 (s, 3H), 1.32 (d, J = 5.9 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z:344.2 [M+1].

화합물3K

본 화합물은 실시예2의 화합물2K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2J를 화합물3J로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.81 (s, 1H), 8.19 - 8.13 (m, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.32 (dt, J = 1.1, 7.6 Hz, 1H), 7.27 - 7.22 (m, 1H), 5.16 (spt, J = 6.3 Hz, 1H), 4.63 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 2.69 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.1 Hz, 6H), 1.23 (d, J = 6.1 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z:386.3 [M+1].

화합물3L

본 화합물은 실시예1의 화합물1J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1I를 화합물3K로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.00 (s, 1H), 8.41 - 8.36 (m, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.52 - 7.48 (m, 1H), 7.41 - 7.31 (m, 2H), 5.38 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 4.66 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 3.43 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 1.32 (d, J = 6.4 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 418.2 [M+1].

화합물3M

본 화합물은 실시예1의 화합물1K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1J를 화합물3L로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.53 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.76 (br d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.24 - 7.19 (m, 1H), 7.12 (dt, J = 1.0, 7.6 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.95-5.02 (m, 1H), 4.68 - 4.58 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 1.36 (d, J = 6.1 Hz, 6H), 1.03 (d, J = 6.1 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z:524.2 [M+1].

화합물3N

본 화합물은 실시예1의 화합물1L의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1K를 화합물3M으로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.19 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.80 - 7.72 (m, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.18 (br d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.15 - 7.07 (m, 1H), 6.60 (s, 1H), 4.97 (quin, J = 6.2 Hz, 1H), 4.62 (td, J = 6.2, 12.4 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.25 - 3.19 (m, 2H), 2.81 (s, 3H), 2.54 - 2.47 (m, 2H), 2.20 (s, 6H), 1.35 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 1.02 (d, J = 6.3 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 606.2 [M+1].

화합물3O

본 화합물은 실시예1의 화합물1N의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1M을 화합물3N으로 대체하였다. LCMS (ESI) m/z: 576.3 [M+1].

화합물3P

본 화합물은 실시예1의 화합물1O의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1N을 화합물3O로 대체하였다. LCMS (ESI) m/z: 630.2 [M+1].

화합물3

본 화합물은 실시예1의 화합물1의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1O를 화합물3P로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 = 8.69 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.17 - 7.10 (m, 1H), 7.04 - 6.98 (m, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 6.35 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.79 - 5.73 (m, 1H), 4.95 (spt, J = 6.2 Hz, 1H), 4.57 (spt, J = 6.1 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.38 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.17 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.76 (s, 6H), 2.62 - 2.58 (m, 6H), 1.29 (d, J = 6.1 Hz, 6H), 1.05 (d, J = 6.1 Hz, 6H). LCMS (ESI) m/z: 630.2 [M+1].

실시예4

화합물4B

화합물 4A(10.5g, 69.26mmol)를 아세트산(50mL)에 용해시키고, 시아노수소화붕소나트륨(13.06g, 207.79mmol)을 가하고, 내부온도를 10DegC로 제어하였다. 반응용액을 25DegC에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. TLC(PE/EA=1/0)로 원료가 전부 소모되었음을 모니터링하였다. 반응용액에 물(30.0mL)을 가하고, 수산화나트륨 수용액(2M)으로 반응용액을 PH=7 내지 8로 조절하고, 아세트산에틸(80mL×3회)로 추출하고, 유기상을 합하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 다음 감압하에 농축하였다. 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO₂, 석유 에테르:아세트산에틸=1:0)로 정제한 다음, 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호：6.96 - 7.05 (m, 2 H)，6.63 (t, J=7.64 Hz, 1 H)，4.00 (br s, 1 H), 3.63 (t, J=8.44 Hz, 2 H) ,3.12 (t, J=8.44 Hz, 2 H)

화합물4C

텅스텐산나트륨(2.26g, 6.86mmol)을 물(30mL)에 용해시키고, -20DegC에서 화합물4B(6.2g, 40.36mmol)의 메탄올(300mL) 용액에 적가하였다. 과산화수소수(39.35g, 347.12mmol, 30%의 함량)를 메탄올(100mL)에 용해시키고 천천히 반응용액에 적가하였다. 적가 완료 후 25°C에서 3시간 동안 교반하였다. 반응용액에 탄산칼륨(44.63g, 322.90mmol)과 디메틸설페이트(8.15g, 64.58mmol)를 가하고 25DegC에서 15분간 교반하였다. TLC(석유 에테르: 아세트산에틸=20:1)는 원료가 전부 소모되었음을 나타냈다. 반응용액을 여과하고, 여액에 물(200.0mL)을 가하고 아세트산에틸(300mL×3회)로 추출하고 유기층을 합하여 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압농축하였다. 잔여물을 칼럼 크로마토그래피(SiO₂, 석유 에테르：아세트산에틸=1/0)로 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 7.48 (dd, J=7.97, 0.82 Hz, 1 H), 7.28 (d, J=3.39 Hz, 1 H), 7.22 (dd, J=7.65, 0.63 Hz, 1 H) , 7.00 - 7.06 (m, 1 H), 6.39 (d, J = 3.51 Hz, 1 H) , 4.13 (s, 3 H)

화합물4D

본 화합물은 실시예1의 화합물1E의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1D를 화합물4C로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 9.98 (s, 1 H), 8.22 - 8.28 (m, 1 H) , 7.91 (s, 1 H) , 7.33 - 7.37 (m, 1 H) , 7.21 - 7.27 (m, 1 H) ,4.22 (s, 3 H).

화합물4E

본 화합물은 실시예1의 화합물1F의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1E를 화합물4D로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 8.17 (dd, J = 8.01, 0.79 Hz, 1 H), 8.08 (s, 1 H), 7.30 - 7.34 (m, 1 H), 7.20 - 7.26 (m, 1 H) , 4.21 (s, 3 H).

화합물4F

본 화합물은 실시예1의 화합물1G의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1F를 화합물4E로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 8.34 (dd, J=8.00, 1.00 Hz, 1 H), 8.00 (s, 1 H),7.31 - 7.34 (m, 1 H), 7.20 - 7.25 (m, 1 H), 4.22 - 4.26 (m, 2 H), 4.21 (s, 3 H), 3.85 (s, 2 H), 1.27 - 1.31 (m, 3 H).

화합물4G

본 화합물은 실시예1의 화합물1H의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1G를 화합물4F로 대체하였다.

화합물4H

본 화합물은 실시예1의 화합물1I의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1H를 화합물4G로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 8.88 (s, 1 H), 7.93 - 8.11 (m, 2 H) , 7.29 (dd, J=7.75, 0.75 Hz, 1 H), 7.09 - 7.22 (m, 1 H), 4.29 (q, J=7.13 Hz, 2 H), 4.20 (s, 3 H), 2.66 (s, 3 H) , 1.25 - 1.33 (m, 3 H).

화합물4I

본 화합물은 실시예2의 화합물2J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2I를 화합물4H로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 9.00 (s, 1 H), 8.05 - 8.10 (m, 2 H), 7.29 (dd, J=7.75, 0.75 Hz, 1 H) , 7.13 - 7.19 (m, 1 H) , 4.19 (s, 3 H), 2.67 (s, 3 H) ,

화합물4J

본 화합물은 실시예2의 화합물2K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2J를 화합물4I로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 8.85 (s, 1 H), 7.98 - 8.05 (m, 2 H) , 7.27 - 7.30 (m, 1 H), 7.12 - 7.17 (m, 1 H) , 5.15 (m, 1 H) , 4.20 (s, 3 H) , 2.66 (s, 3 H), 1.24 (s, 3 H) , 1.23 (s, 3 H),

화합물4K

본 화합물은 실시예1의 화합물1J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1I를 화합물4J로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 9.03 (s, 1 H), 8.28 (d, J=8.07 Hz, 1 H) ,8.20 (s, 1 H) , 7.34 (d, J=7.58 Hz, 1 H) , 7.21 - 7.26 (m, 1 H) , 5.28 (m, 1 H) , 4.22 (s, 3 H) , 3.41 (s, 3 H) , 1.33 (s, 3 H) ,1.32 (s, 3 H)

화합물4L

본 화합물은 실시예2의 화합물2M의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2L을 화합물4K로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 8.37 - 8.94 (m, 1 H), 8.17 (s, 1 H) , 7.78 - 8.04 (m, 1 H) , 7.29 (br d, J=7.70 Hz, 1 H) , 7.15 (br t, J=7.89 Hz, 1 H), 5.03 - 5.12 (m, 1 H), 4.23 (s, 3 H) , 1.20 (br s, 3 H) , 1.18 (br s, 3 H).

화합물4M

본 화합물은 실시예2의 화합물2N의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2M을 화합물4L로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 8.85 (s, 1 H), 8.15 (s, 1 H) , 8.13 (dd, J=8.13, 1.00 Hz, 1 H), 7.32 (dd, J=7.69, 0.81 Hz, 1 H) , 7.18 - 7.23 (m, 1 H) , 5.21 (m, 1 H) , 4.20 (s, 3 H) , 1.29 (s, 3 H) , 1.27 (s, 3 H).

화합물4N

본 화합물은 실시예1의 화합물1K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1J를 화합물4M으로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 9.65 (d, J=8.25 Hz, 1 H), 8.95 (s, 1 H) , 8.12 (s, 1 H), 7.90 (s, 1 H) , 7.68 (br d, J=8.25 Hz, 1 H) , 7.29 (d, J=0.75 Hz, 1 H) , 7.11 (t, J=7.88 Hz, 1 H) , 6.79 (d, J=12.01 Hz, 1 H), 5.07 (m, 1 H) , 4.27 (s, 3 H) , 4.05 (s, 3 H) , 1.15 (s, 3 H),1.14 (s, 3 H)

화합물4O

본 화합물은 실시예1의 화합물1L의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1K를 화합물4N으로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 9.34 (s, 1 H), 8.93 (s, 1 H), 8.09 (s, 1 H), 7.85 (s, 1 H), 7.70 (br d, J=5.62 Hz, 1 H) , 7.24 - 7.26 (m, 1 H) , 7.08 - 7.14 (m, 1 H), 6.80 - 6.87 (m, 1 H) , 5.07 (m, 1 H) , 4.26 (s, 3 H) , 4.05 (s, 3 H) , 3.50 (s, 4 H) , 2.91 (s, 3 H) , 2.44 - 2.68 (m, 6 H) , 1.15 (s, 3 H) , 1.14 (s, 3 H)

화합물4P

본 화합물은 실시예1의 화합물1N의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1M을 화합물4O로 대체하였다.

화합물4Q

본 화합물은 실시예1의 화합물1O의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1N을 화합물4P로 대체하였다.

화합물4

본 화합물은 실시예1의 화합물1의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1O를 화합물4Q로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 9.06 (br s, 1 H), 8.83 (d, J=0.88 Hz, 1 H) , 8.39 (br s, 1 H) , 7.65 (br d, J=6.88 Hz, 1 H) , 7.23 (br d, J=7.63 Hz, 1 H) , 7.06 (br t, J=7.82 Hz, 1 H) , 6.97 (br s, 1 H) , 6.50 - 6.58 (m, 1 H), 6.40 - 6.47 (m, 1 H), 5.83 (br d, J=9.76 Hz, 1 H), 4.96 - 5.07 (m, 1 H) , 4.19 (s, 3 H) , 3.95 (s, 3 H) , 3.16 (br s, 2 H), 2.65 - 2.70 (m, 5 H), 2.44 (s, 6 H) , 1.43 (t, J=7.0 Hz, 3H), 1.12 (s, 3 H) ,1.10 (s, 3 H).

실시예5

화합물5B

본 화합물은 실시예4의 화합물4B의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물4A를 화합물5A로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 7.17 (dd, J=0.6, 8.1 Hz, 1H), 7.04 (dd, J=1.1, 7.2 Hz, 1H), 6.62 - 6.52 (m, 1H), 4.08 - 3.71 (m, 1H), 3.62 (t, J=8.5 Hz, 2H), 3.16 (t, J=8.5 Hz, 2H).

화합물5C

본 화합물은 실시예4의 화합물4C의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물4B를 화합물5B로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 7.53 (dd, J=0.8, 7.9 Hz, 1H), 7.41 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J=3.5 Hz, 1H), 6.98 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.39 (d, J=3.5 Hz, 1H), 4.11 (s, 3H).

화합물5D

본 화합물은 실시예1의 화합물1E의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1D를 화합물5C로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 10.02 - 9.84 (m, 1H), 8.28 (dd, J=0.8, 7.9 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.55 - 7.46 (m, 1H), 7.16 (t, J=7.8 Hz, 1H), 4.20 (s, 3H).

화합물5E

본 화합물은 실시예1의 화합물1F의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1E를 화합물5D로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.22 (d, J=7.9 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.50 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.16 (t, J=7.9 Hz, 1H), 4.25 (s, 3H).

화합물5F

본 화합물은 실시예1의 화합물1G의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1F를 화합물5E로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.40 (d, J = 0.9, 8.1 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.51 (d, J = 0.7, 7.6 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.25 - 4.20 (m, 5H), 3.85 (s, 2H), 1.32 - 1.27 (m, 3H). LCMS (ESI) m/z: 342.1 [M+1].

화합물5G

본 화합물은 실시예1의 화합물1H의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1G를 화합물5F로 대체하였다.

화합물5H

본 화합물은 실시예1의 화합물1H의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1H를 화합물5G로 대체하였다. ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.88 (s, 1H), 8.32 - 7.96 (m, 2H), 7.67 - 7.37 (m, 1H), 7.09 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.19 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 3H) LCMS (ESI) m/z: 421.9 [M+1].

화합물5I

화합물 5H(1g, 2.37mmol) 및 시클로프로필보론산 (407mg, 4.74mmol)을 톨루엔(5mL) 및 물(5mL)에 용해시키고 탄산세슘(926mg, 2.84mmol) 및 Pd(dppf)Cl₂.CH₂Cl₂(200mg, 244.91μmol)를 가하고, 질소가스의 보호하에 100DegC에서 16시간 동안 교반하였다. 반응용액을 감압하에 농축하고, 잔여물에 물(10mL)을 가하고, 아세트산에틸(10mL×2회)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 감압하에 농축하고, 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO₂, 석유 에테르:아세트산에틸=50:1 내지 20:1)로 정제하여 표제의 화합물을 얻었다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.83 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.94 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.14 (t, J=7.7 Hz, 1H), 6.87 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.29 (q, J=7.2 Hz, 2H), 4.18 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 1.27 (s, 1H), 1.22 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.08 - 1.03 (m, 2H), 0.89 - 0.86 (m, 2H).

화합물5J

본 화합물은 실시예2의 화합물2J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2I를 화합물5I로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 = 8.80 (s, 1H), 8.22 - 8.13 (m, 1H), 8.01 (dd, J=0.8, 8.1 Hz, 1H), 7.11 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.88 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.20 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 1.21 - 1.16 (m, 1H), 1.10 - 1.04 (m, 2H), 0.88 - 0.83 (m, 2H).

화합물5K

본 화합물은 실시예2의 화합물2K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2J를 화합물5J로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.82 - 8.77 (m, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.92 (dd, J=0.7, 8.1 Hz, 1H), 7.13 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.87 (d, J=7.4 Hz, 1H), 5.14 (m, 1H), 4.17 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 1.28 - 1.25 (m, 1H), 1.22 (d, J=6.3 Hz, 6H), 1.07 - 1.01 (m, 2H), 0.90 - 0.84 (m, 2H).

화합물5L

본 화합물은 실시예1의 화합물1J의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1I를 화합물5K로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.99 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.12 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.22 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.92 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.26 (m, 1H), 4.20 (s, 3H), 3.41 (s, 3H), 2.67 (tt, J=5.3, 8.4 Hz, 1H), 1.33 - 1.28 (m, 6H), 1.10 - 1.05 (m, 2H), 0.91 - 0.86 (m, 2H).

화합물5M

본 화합물은 실시예2의 화합물2M의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2L을 화합물5L로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.01 - 8.60 (m, 1H), 8.14 (br s, 1H), 7.81 - 7.33 (m, 1H), 7.09 (br t, J=7.4 Hz, 1H), 6.85 (br d, J=7.3 Hz, 1H), 5.09 - 4.95 (m, 1H), 4.29 (s, 3H), 2.71 - 2.60 (m, 1H), 1.12 (br d, J=5.6 Hz, 6H), 1.04 (br d, J=8.2 Hz, 2H), 0.85 (br d, J=4.8 Hz, 2H).

화합물5N

본 화합물은 실시예2의 화합물2N의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물2M을 화합물5M으로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.84 - 8.76 (m, 1H), 8.17 - 8.09 (m, 1H), 8.00 (dd, J=0.7, 8.1 Hz, 1H), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.90 (d, J=7.4 Hz, 1H), 5.19 (spt, J=6.3 Hz, 1H), 4.19 (s, 3H), 2.67 (tt, J=5.3, 8.4 Hz, 1H), 1.26 (d, J=6.4 Hz, 6H), 1.08 - 1.03 (m, 2H), 0.90 - 0.85 (m, 2H).

화합물5O

본 화합물은 실시예1의 화합물1K의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1J를 화합물5N으로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.71 (d, J=8.3 Hz, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.61 - 7.50 (m, 1H), 6.85 (d, J=7.3 Hz, 1H), 6.78 (d, J=12.0 Hz, 1H), 5.05 (td, J=6.3, 12.5 Hz, 1H), 4.26 (s, 3H), 4.04 (s, 3H), 2.75 - 2.65 (m, 1H), 1.11 (d, J=6.1 Hz, 6H), 1.07 - 1.04 (m, 2H), 0.89 - 0.85 (m, 2H).

화합물5P

본 화합물은 실시예1의 화합물1L의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1K를 화합물5O로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 9.38 (br s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.54 (br d, J=5.9 Hz, 1H), 7.08 (t, J=7.7 Hz, 1H), 6.84 (d, J=7.4 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 5.03 (td, J=6.3, 12.5 Hz, 1H), 4.25 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 3.32 - 3.27 (m, 2H), 2.90 (s, 3H), 2.74 - 2.67 (m, 1H), 2.58 (t, J=7.1 Hz, 2H), 2.27 (s, 6H), 1.10 (br d, J=6.3 Hz, 6H), 1.06 - 1.01 (m, 2H), 0.87 - 0.83 (m, 2H).

화합물5Q

본 화합물은 실시예1의 화합물1N의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1M을 화합물5P로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃-d) 델타기호 = 8.88 (s, 2H), 8.17 (br d, J=13.3 Hz, 1H), 7.98 (br s, 3H), 7.17 (br s, 1H), 7.05 - 6.96 (m, 1H), 6.89 (br d, J=16.5 Hz, 1H), 6.73 (br s, 1H), 5.11 (br d, J=6.3 Hz, 1H), 4.19 (br s, 3H), 3.85 (br s, 3H), 2.78 (br s, 2H), 2.56 (br s, 6H), 2.42 (br s, 2H), 2.27 (br s, 3H), 1.24 (br s, 6H), 1.07 - 1.03 (m, 2H), 0.83 - 0.76 (m, 2H).

화합물5R

본 화합물은 실시예1의 화합물1O의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1N을 화합물5Q로 대체하였다.

화합물 5

본 화합물은 실시예1의 화합물1의 방법에 따라 제조하였으며, 화합물1O를 화합물5R로 대체하였다. ¹HNMR (400MHz, 메탄올-d ₄) 델타기호 = 8.77 (s, 1H), 8.46 (br s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.71 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.01 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.82 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 5.91 - 5.77 (m, 1H), 5.07 (td, J=6.2, 12.5 Hz, 1H), 4.18 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.52 - 3.46 (m, 2H), 3.27 - 3.24 (m, 2H), 2.86 (s, 6H), 2.70 (d, J=4.8 Hz, 6H), 1.28 (s, 1H), 1.17 (d, J=6.2 Hz, 6H), 1.10 - 1.04 (m, 2H), 0.85 - 0.80 (m, 2H).

실험예1 상이한 종의 혈장에서 화합물의 안정성 시험

본 연구에서는 재료로서 마우스, SD 랫트, 비글 견, 게잡이 원숭이 및 인간 혈장을 사용하여 상기 5종의 혈장에서의 시험 화합물의 안정성을 연구하였다. 대조군 화합물로서 프로판텔린(Propantheline), 에날라프릴(Enalapril), 비사코딜(Bisacodyl) 및 프로카인(Procaine)을 사용하였다.

시험 화합물의 실험조건은 하기와 같다:

-시험 농도: 2μM (DMSO≤0.5%);

-인큐베이션 시간: 0, 10, 30, 60 및 120분;

-시험계는 냉동혈장(여러 종으로부터 채취)을 사용하였다;

-인큐베이션 조건: 37DegC.

실험 전에, 혼합 냉동 혈장을 37DegC의 물에서 해동하였다. 혈장을 4000회/분으로 5분간 원심분리하고, 응집체가 있으면 제거하였다. 필요에 따라 pH 값을 7.4±0.1로 조절하였다.

1mM의 화합물 및 양성 대조군의 중간 용액은 90μl의 디메틸술폭시드로 10mM의 저장액을 희석하여 제조하였다. 180μl의 45% 메탄올/물로 20μl의 중간 용액(1mM)을 희석하여 100μM의 용액을 제조하였다.

100μM의 용액 2μl를 98μl의 공백 혈장에 가하여 최종 농도가 2μM(1식 2부)인 시료를 얻었으며, 시료를 37DegC의 수욕에서 배양하였다. 각 시점(0, 10, 30, 60 및 120분)에서 400μl의 정지 용액(200ng/ml의 톨루엔 설포닐 우레아 및 200ng/ml의 라베탈롤, 50%의 ACN/MeOH)을 가하여 단백질을 침전시키고 충분히 혼합하였다.

샘플 플레이트를 4000회/분으로 10분간 원심분리하였다. 각 웰로부터 상청액(50μl)을 소량씩 옮겨, 100μl의 초 정제수와 혼합하였다. LC-MS/MS 분석을 수행하기 전에 시료를 800rpm에서 약 10분간 쉐이킹하였다.

데이터 처리에 사용되는 공식은 하기와 같다:

%잔여량=(임의의 시점에서의 대조품과 내부 표준의 피크 면적비/0분에서의 대조품과 내부 표준의 피크 면적비)×100%.

실험결과: 표1 및 2를 참조.

[표 1] 화합물의 체외 혈장 안정성

[표 2] 화합물의 체외 혈장 반감기

실험결론：

표1-1 및 1-2로부터, 본 발명의 화합물은 상이한 종에서 모두 우수한 혈장 안정성을 가짐을 알 수 있다.

실험예2 생물화학적 실험

실험목적： EGFR WT, EGFR (D770_N771insNPG), ERBB2 (V777_G778ins>CG), EGFR T790M/L858R 효소활성에 대한 시험 화합물의 억제효과를 검출하는 것이다.

실험재료：

EGFR WT (Invitrogen, Cat.No. PR7295B), EGFR [L858R] (Invitrogen, Cat.No. PR7447A), EGFR [d746-750] (Invitrogen, Cat.No. PV6179), ATP (Sigma, Cat. No. A7699-1G), DMSO (Sigma, Cat. No. D2650), DTT (Sigma, Cat. No. 43815), 384웰 플레이트, 화합물 희석 플레이트(Greiner, Cat. No. 781280), 384월 플레이트， 시험 플레이트(Perkin Elmer, Cat. No.6007299), HTRF KinEASE TK Kit (Cisbio, Cat. No. 62TK0PEB), 염화 마그네슘(Sigma, Cat. No. M1028), Orthovanadate (Sigma, Cat. No. S6508), BSA (Sigma, Cat. No. A7030), HEPES (Life technology, Cat. No. 11344-041).

실험방법：

화합물의 최종 시험 농도：

시험 화합물의 최종 시험 농도는 10μM 내지 0.17nM이며, 3배로 구배 희석하였고, 11개의 농도였다.

키나아제의 검출：

50mM의 HEPES(pH7.5), 0.01%의 BSA, 5mM의 염화 마그네슘, 0.1mM의 Orthovanadate를 포함하는 완충액을 제조하였다. 완충액을 제조 한 다음, 효소 및 기질을 사전에 희석하여 제조된 상이한 농도의 화합물과 혼합하여 실온에서 15분간 방치하였다. ATP를 가하여 반응을 시작시키고, 실온에서 60분간 인큐베이션하였다(음양 대조군을 설정하였다). 10μL의 반응계에는 2.5μL의 화합물, 5μL의 효소 및 기질의 혼합물 및 2.5μL의 ATP가 포함되었다. 반응 종료 후 항체를 가하여 검출하고, 실온에서 60분간 인큐베이션한 다음, Envision(플레이트 리더)로 검출하고, 데이터를 수집하였다. XLfit5 소프트웨어(데이터 분석 소프트웨어)에 따라 데이터 분석 및 플로팅을 수행하였다.

실험결론: 표3을 참조.

[표 3] 효소에 대한 화합물의 억제활성

주: "/"는 미검출을 나타낸다.

실험결론：

본 발명의 화합물은 EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이 및 ERBB2 엑손 20 삽입 돌연변이 대해 모두 우수한 효소 활성을 가지며, 동시에 L858R 및 T790M 이중 돌연변이에 대해 우수한 효소 활성을 갖는다.

실험예 3 세포에 대한 화합물의 항 증식 실험

（1）LU-0387(EGFR 엑손 20NPH 삽입 돌연변이) 세포 항 증식 활성 시험

실험재료：

소 태아 혈청 FBS, CellTiter Glo^® 발광 세포 생존율 검출, 96웰의 투명한 평면 바닥 흑색 벽 플레이트

실험기기：

EnVision 멀티 라벨 마이크로 플레이트 검출기, PerkinElmer Instrument Co., Ltd, 모델번호: 2104-0010A；

CO₂인큐베이터, Thermo Fisher Scientific, 모텔 3100 시리즈;

바이오 보안 캐비닛, Thermo Fisher Scientific, 모델 1300 시리즈 A2;

도립 현미경, Olympus, 모델번호: CKX41SF;

전자저울, METTLER TOLEDO, 모델번호: AL-104;

냉장고, Siemens, 모델번호: KK25E76TI.

실험 스텝:

세포 계수기로 세포를 카운팅하여 세포의 활성을 측정하여, 각 세포계의 생존율을 90% 이상으로 확보하였으며, 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 가하여 세포의 밀도가 소정의 농도로 되도록 하였으며, 37DegC, 5% CO₂, 95% 습도의 조건 하에 밤새 배양하였다. T0 플레이트에 배양액을 보충하고, CTG 시약을 용해시키고 세포 플레이트를 실온까지 평형화시켰다. 각 웰에 CTG 용액을 가하였다. 진동하여 세포를 용해시키고, 냉광값을 판독하였다. 시험 화합물 및 참조약물을 구배 희석하여 10배 용액을 얻었다. 세포를 접종 한 96웰 플레이트에 웰 당 10μl의 약물 용액을 가하였다. 37DegC, 5% CO₂, 95% 습도의 조건 하에 계속하여 4일간 배양하고, 각각 CTG 분석을 수행하고, 냉광값을 판독하였다. GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 한 다음 IC₅₀ 값을 계산하였다.

실험결론: LU-0387 세포 EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이 NPH에 대한 본 발명의 화합물의 IC₅₀ 데이터는 표4에 나타내는 바와 같다.

실험결론: 본 발명의 화합물은 EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이를 억제함에 있어서 우수한 활성을 나타내었다.

（2）화합물의 H1975 세포에 대한 항 증식 활성 및 A431 세포에 대한 항 증식 활성 IC₅₀ 시험

실험재료：

RPMI1640 배지, FBS 소 태아 혈정, 트립신-EDTA는 모두 Giboco사에서 구입하였다. DPBS는 Corning사에서 구입하였으며, 페니실린/스트렙토 마이신 용액은 Hyclone사에서 구입하였고, Cell-Titer Glo reagent는 Promega (1kit, 제품번호 G7571)사에서 구입하였다. 플레이트 리더: Envision (PerkinElmer).

실험방법：

384웰 플레이트의 1, 2, 24열에 45μL의 배지를 가하고, 세포 현탁액을 Multi-drop으로 분주하여, 웰 당 45μL(1000개의 세포)였으며, 인큐베이터에 넣어 밤새 배양하였다. 화합물을 Echo 분액 요구에 따라 source 플레이트에 가하고, source 플레이트 중의 화합물을 inter 플레이트에 가하여 중간 농도로 희석하고, source 플레이트 및 inter 플레이트 중의 화합물을 세포 플레이트에 가하고, 세포를 계속하여 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후, Cell-Titer Glo reagent 및 세포를 꺼내어 실온에서 30분간 평형화시키고, Multi-drop로 25μL의 Cell-Titer Glo reaction을 384웰 플레이트에 분주하여 3분간 진탕하고, 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 10분간 정치하였다. Envision으로 플레이트를 판독하였다(Luminescence).

본 발명의 화합물의 H1975 세포의 항증식 활성 IC₅₀ 및 A431 세포의 항증식 활성 IC₅₀ 데이터는 표4에 나타내는 바와 같다.

[표 4] 세포에 대한 화합물의 항 증식 활성 데이터

실험결론：

본 발명의 화합물은 H1975(L858R/T790M)세포, LU0387 EGFR-H773_V774ins NPH(엑손 20 삽입 돌연변이)에 대하여 매우 양호한 항 증식 활성을 가지며, 동시에 A431(EGFR 야생형)에 대한 억제 작용은 약함으로, 본 발명의 화합물이 비교적 우수한 선택성을 가짐을 나타내었다.

실험예 4 Ba/F3 엑손 20 삽입 돌연변이 세포에 대한 화합물의 항 증식 실험

실험재료：

RPMI1640 배지는 Hyclone사에서 구입하였으며, FBS 소 태아 혈청은 GBICO사에서 구입하였으며, 트립신-EDTA는 Giboco사에서 구입하였다. DPBS는 Corning사에서 구입하였으며, 페니실린/스트렙토 마이신 용액은 Hyclone사에서 구입하였으며, Cell-Titer Glo reagent는 Promega(화물 번호 G7572)사에서 구입하였다. Ba/F3 EGFR-D770_N771insSVD、Ba/F3 EGFR-H773_V774insNPH, Ba/F3 EGFR-V769_D770insASV、BaF3 ERBB2 A775 _G776 ins YVMA, 세포주는 Beijing Kang Yuan Bochuang Biotechnology Co., Ltd.에 의해 구축되었다. 플레이트 리더: Envision(PerkinElmer).

실험방법：

대수 증식기에 있는 세포를 회수하고, 혈소판 계수기를 사용하여 세포를 카운팅하였다. 트리판 블루 배제법을 사용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 세포의 농도를 조절하고; 각각 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 가하였다. 96웰플레이트의 세포를 37DegC, 5% CO₂ 및 95% 습도의 조건하에 밤새 배양하였다. 약물 용액을 제조하기 위해, 세포가 접종된 96웰 플레이트의 각 웰에 10μL의 약물 용액을 가하고, 각 약물 농도에 3개의 반복 웰을 설정하였다. 약물을 가한 96웰 플레이트의 세포를 37DegC, 5% CO₂, 95% 습도 조건하에서 계속하여 72시간 동안 배양한 다음, CTG 분석을 수행하고, 오비탈 셰이커에서 진탕하여 세포를 용해시켰다. 세포 플레이트를 실온에 방치하여 냉광 신호를 안정화시켜 냉광값을 판독하였다. GraphPad Prism 7.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 비선형 S곡선 회귀를 사용하여 데이터를 피팅하여 용량-효과 곡선을 얻었으며, 이로부터 IC₅₀값을 계산하였다.

Ba/F3 엑손 20 삽입 돌연변이 세포에 대한 본 발명의 화합물의 항 증식 활성 IC₅₀는 표5에 나타내는 바와 같다.

[표 5] Ba/F3 엑손 20 삽입 돌연변이 세포에 대한 화합물의 항 증식 활성 데이터

주: "/"는 미검출을 나타낸다.

실험결과:

Ba/F3 엑손 20 삽입 돌연변이 세포는 마우스 B 세포를 사용하여 인공적으로 구축된 SVD, NPH, ASV, YVMA 삽입 돌연변이를 갖는 세포주이며, 표 5로부터 알수 있듯이, 본 발명의 화합물은 SVD, NPH, ASV, YVMA 등의 돌연변이 빈도가 높은 엑손 20 삽입 돌연변이에 대하여 모두 우수한 세포 항증식 활성을 가지고, SVD 돌연변이와 같은 일반적인 엑손 20 삽입 돌연변이에 대하여서도 우수한 세포 항증식 활성을 나타내었다.

실험예 5 마우스 폐암NCI-H1975세포 피하 이종 이식 종양 BALB/c 누드 마우스 모델의 체내 약동학 연구

세포의 배양：

인간 폐암NCI-H1975세포를 체외 단층 배양하였으며, 배양조건은 1640배지에 10％의 소태아혈청, 1%의 이중항체를 가하여, 37DegC, 5%CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 일주일에 두번 통상적인 처리를 진행하여 계대 배양하였다. 세포 포화도가 80% 내지 90%이고, 수량이 요구 사항에 도달하면, 세포를 회수하고, 계수하여, 접종하였다.

동물：

BALB/c nude 누드 마우스, 암컷, 6 내지 8주령, 체중18 내지 22g. Shanghai Xipuer-Bikai Laboratory Animal Co., Ltd. 또는 기타 자질을 가지는 공급사로부터 제공되었다.

종양의 접종：

인간 폐암 이종 이식 모델 H1975 종양 담지 마우스에서 종양조직을 취하여, 직경이 2 내지 3mm인 종양 조각으로 절단하여 Balb/c 누드 마우스의 우측 전방 견갑골에 피하 접종하고，평균 종양 체적이145mm³이 되면，종양의 크기에 따라 무작위로 군을 나누고, 군을 나눈 당일을 0일째로 정의하였다.

종양의 측정 및 실험 지표:

실험 지표는 종양의 성장이 억제, 지연 또는 치유되었는지를 조사하는 것이다. 종양의 직경은 버니어 캘리퍼스로 일주일에 두 번 측정하였다. 종양 체적의 계산 공식은: V=0.5a×b ²이고, a 및 b는 각각 종양의 장경과 단경을 나타낸다. 화합물의 종양 억제 효과를 TGI(%) 또는 상대 종양 성장률T/C(%)로 평가하였다. TGI(%)는 종양 성장 억제율을 나타낸다. TGI(%)의 계산: TGI(%)=[(1-（특정 처리군의 투여 종료시의 평균 종양 체적-해당 처리군의 투여 시작시의 평균 종양 체적）)/(용매 대조군의 치료 종료시의 평균 종양 체적-용매 대조군의 치료 시작시의 평균 종양 체적)]×100%. 상대적 종양 성장율T/C（%）： 계산 공식은 하기와 같다:

T/C%=T_RTV/C_RTV×100%（T_RTV: 치료 군의 RTV; C_RTV: 음성 대조군의 RTV）. 종양 측정 결과로부터 상대적 종양 체적（relative tumor volume, RTV）을 계산하였으며, 계산 공식은 RTV=V_t/V₀이고, 여기서, V₀은 군을 나누어 투여시（즉 d₀）측정한 평균 종양 체적이고, V_t는 특정 측정시의 평균 종양 체적이고, T_RTV 및 C_RTV는 동일한 날의 데이터를 사용하였다. 실험 종료 후 종양의 중량을 검출하고, T/C_weight백분율을 계산하였으며, T_weight 및 C_weight는 각각 투여 군 및 용매 대조군의 종양의 중량을 나타내었다.

실험결과: 도 1, 2 및 표 6을 참조.

실험결론:

도 1, 2 및 표 6의 종양 체적 데이터로부터, 본 발명의 화합물의 항 종양 효과는 유의하고, TGI는 105%에 도달하며, 종양 축소 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

[표 6] 인간 폐암 세포 H1975V피하 이종이식 모델에 대한 화합물의 억제 효과

주: a. 평균치±표준 오차, n=6.

실험예 6 마우스 Ba/F3 EGFR D770_N771 inss SVD 피하 동종 이식 종양 모델에서의 화합물의 증식 억제 작용

실험목적：

Ba/F3(EGFR-D770_N771ins SVD) 세포는 마우스 B 세포를 사용하여 인공적으로 구축된 EGFR-D770_N771ins SVD 삽입 돌연변이를 갖는 세포주이며, 해당 세포주에 의해 구축된 CDX 모델을 이용하여 동물체내 Exon 20 EGFR-D770_N771ins SVD 삽입 돌연변이에 대한 바람직한 화합물의 억제 효과를 평가하였다.

실험재료：

누드 마우스(BALB/c Nude), Ba/F3 (EGFR-D770_N771insSVD) 세포주

실험방법:

1. 세포의 배양：세포를 체외 단층 배양하였으며, 배양 조건은RPMI-1640(세포 배양액)에 10％의 소태아혈청, 100U/ml의 페니실린 및 100μg/ml의 스트렙토마이신을 가하여, 37DegC, 5%CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 주2회 트립신-EDTA로 통상적인 소화처리를 진행하여 계대 배양하였다. 세포 Ba/F3(EGFR-D770_N771insSVD의 포화도가 80% 내지 90%이고, 수량이 요구 사항에 도달하면, 세포를 회수하고, 카운팅하였다. 밀도는 5×10⁶세포였다.

2. 세포의 접종: 0.2ml(5×10⁶개를 포함)의 Ba/F3(EGFR-D770_N771insSVD)의 세포 현탁액(PBS:Matrigel=1:1)을 각 마우스의 오른쪽 등에 피하 접종하였으며, 총 64마리의 마우스였다. 접종 7일 후, 종양의 평균 체적이 133mm³에 도달하면, 종양의 체적 및 동물의 체중에 의해 무작위로 계층화 그룹화 방법으로 군을 나누어 투여를 시작하였다. PBS는 인산염 완충액이고, Matrigel는 마트리겔이다.

3. 투여: 투여량은 0 내지 7일째: 10mg/kg, 8 내지 21일째: 40mg/kg; 경구투여; 투여 빈도: 일1회×3주.

종양의 측정 및 실험 지표:

종양의 직경은 버니어 캘리퍼스로 주2회 측정하였다. 종양의 체적의 계산 공식은: V=0.5a×b²이고 a 및 b는 각각 종양의 장경과 단경을 나타낸다.

화합물의 항종양 효과는 TGI(%) 또는 상대 종양 성장율T/C(%)로 평가하였다.

상대적 종양 성장율T/C(%)=TRTV/CRTV×100%(TRTV: 치료 군 평균RTV; CRTV: 용매 대조군 평균RTV).

종양 측정 결과로부터 상대적 종양 체적(relative tumor volume，RTV)을 계산하였으며, 계산 공식은 RTV=V_t/V₀이고, 여기서, V₀은 군을 나누어 투여 시（즉 d₀）측정한 평균 종양 체적이고, V_t는 특정 측정시의 평균 종양 체적이고, TRTV 및 CRTV는 동일한 날의 데이터를 사용하였다.

TGI(%)는 종양 성장 억제율을 나타낸다. TGI(%)=[(1-（특정 처리군의 투여 종료 시의 평균 종양 체적-해당 처리군의 투여 시작 시의 평균 종양 체적）)/(용매 대조군의 치료 종료 시의 평균 종양 체적-용매 대조군의 치료 시작 시의 평균 종양 체적)]×100%.

실험 종료 후 종양의 중량을 측정하고, T/C(%)를 계산하였으며, T 및 C는 각각 투여 군 및 용매 대조군의 종양의 중량을 나타낸다.

실험결과: 표 7 및 도 3, 4을 참조.

[표 7] Ba/F3(EGFR-D770_N771insSVD) 피하 동종 이식 모델에 대한 화합물의 억제 효과

주: a. 평균치±표준 오차, n=6.

실험결론：

도 3, 4 및 표 7의 종양 체적 데이터로부터, Ba/F3(EGFR-D770_N771insSVD) 피하 동종이식 종양 체내 약효 모델에서, 본 발명의 화합물은 종양 성장에 대해 유의한 억제 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 7 HuPrime® 폐암 LU0387 피하 이종 이식 BALB/C 암컷 누드 마우스 모델에서의 화합물의 성장 억제 효과

실험목적：

HuPrime^® 폐암 LU0387 피하 이종 이식 BALB/C 누드 마우스 모델에서의 시험 화합물의 항 종양 효과를 평가하는 것이다.

실험재료：

BALB/c 누드 마우스, 암컷, 7 내지 8 주령, HuPrime^® 폐암 이종 이식 모델 LU0387 종양 담지 마우스 종양 조직.

실험방법：

BALB/c 누드 마우스에 HuPrime^® 모델 LU0387 종양 조각을 피하 접종하여 인간 폐암 피하 이식 종양 모델을 구축하였다. 시험은 용매 대조군, 시험 약물군으로 나누었다. 위내 투여로, 일1회, 21일간 연속 투여하였다. 상대 종양 억제율(TGI)에 기초하여 치료 효과를 평가하고, 동물의 체중 변화 및 사망 상황에 기초하여 안전성 평가를 수행하였다.

종양의 측정 및 실험 지표

종양의 직경을 캘리퍼스로 주2회 측정하였다. 종양의 체적의 계산식은 V=0.5a×b²이고, a 및 b는 각각 종양의 장경 및 단경을 나타낸다.

화합물의 종양 억제 효과는 TGI(%) 또는 상대적 종양 성장율T/C(%)로 평가하였다.

상대적 종양 성장율T/C(%)=TRTV/CRTV×100%(RTV: 치료군 평균 RTV; CRTV: 용매 대조군 평균 RTV).

종양 측정 결과로부터 상대적 종양 체적(relative tumor volume，RTV)을 계산하였으며, 계산 공식은 RTV=V_t/V₀이고, 여기서, V₀은 군을 나누어 투여 시（즉 D₀）측정한 평균 종양 체적이고, V_t는 대응되는 마우스의 특정 측정 시의 평균 종양 체적이고, TRTV 및 CRTV는 동일한 날의 데이터를 사용하였다.

실험 종료 후 종양 중량을 측정하고, T/C(%)를 계산하였으며, T 및 C는 각각 투여군 및 용매 대조군의 종양의 중량을 나타낸다.

실험결과: 표 8 및 도 5, 6을 참조.

실험결론：

도 5, 6 및 표 8의 종양 부피 데이터로부터, HuPrime® 폐암 LU0387 피하 이종 이식 BALB/c 누드 마우스 동물 모델에서, 본 발명의 화합물은 종양 성장에 현저한 억제 효과를 가지며 TGI=114%으로 종양 축소 효과를 달성하였음을 알 수 있다.

[표 8] HuPrime®폐 암 LU0387 모델의 종양 억제 효과

주: a. 평균치±표준 오차, n=6.실험예 8 마우스, 랫트, 비글 견의 단일 정맥 및 경구 투여의 약동학 연구

실험목적：

본 실험은 시험 화합물의 단일 정맥 및 단일 경구 투여 후, 상이한 종의 체내에서의 화합물의 약동학 (PK) 상황을 연구하는 것을 목적으로 한다.

시료의 수집 및 제조：

정맥 주사 또는 경구 투여 후, 동물의 혈액 시료를 채취하고, 실제 채혈 시간을 기록하였다. 혈액 시료를 채취한 다음, 즉시 라벨이 부착된 K2-EDTA를 포함하는 원심분리관에 옮기고, 그 다음 원심처리하여 혈장을 채취하였다. 혈장을 사전에 냉각시킨 원심 분리 튜브로 옮기고 드라이 아이스에서 급속 동결시키고 LC-MS/MS 분석을 수행 할 때까지 -70±10DegC의 초저온 냉장고에 보관 하였다.

약동학 데이터의 분석：

약동학 소프트웨어를 사용하여 비 구획 모델로 화합물의 혈장 약물 농도 데이터를 처리하였다. 피크 도달 농도 (C_max) 및 피크 도달 시간 (T_max) 및 최종 정량 가능한 종료 시간은 혈장 농도-시간 곡선으로부터 직접 얻었다. 로그 선형 사다리꼴 방법을 사용하여 하기의 약동학 파라미터: 반감기(T_1/2), 겉보기 분포 용적(V_dss) 및 클리어런스(Cl), 0시간에서 무한대 시간까지의 시간-혈장 농도 곡선하 면적(AUC_0-last), 초기 농도(C₀)를 계산하였다.

실험결과: 표9-1, 표9-2, 표9-3를 참조.

[표 9-1] 마우스에 상이한 제량을 단일 정맥 내 및 경구 투여 시의 약동학 파라미터

[표 9-2] 랫트에 상이한 제량을 단일 정맥 내 및 경구 투여 시의 약동학 파라미터

[표 9-3] 비글 견에 상이한 제량을 단일 정맥 내 및 경구 투여 시의 약동학 파라미터

실험결론：

본 발명의 화합물은 마우스, 렛트 및 견에 있어서 경구 흡수가 비교적 좋고, 노출량이 높고, 생체이용률이 우수하고, PK 성질이 우수하다.

Claims

식（I）으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

식중,
R₁은 C_1~3알킬에서 선택되고,
R₂는 H, F, Cl, Br, I, C_1~3알킬 및 시클로프로필에서 선택된다.
제1항에 있어서,
R₁이 메틸, 에틸 및 이소프로필에서 선택되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서,
R₂가 H, Cl 및 시클로프로필에서 선택되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항에 있어서,
R₂가 H, Cl 및 시클로프로필에서 선택되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
하기의 식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제5항에 있어서,
약학적으로 허용 가능한 염이 하기 식에서 선택되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
치료유효량으로 활성성분인 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
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