KR102457477B1 - 질량분석법 기반의 포괄적 pivka-ii 단백질형 정량 방법 및 그 간암 진단용 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 PIVKA-II 단백질 유래 3개의 비카르복실화 펩타이드의 정량 수치를 질량분석 방법을 통해 동시에 모니터링 함으로써, 포괄적으로 PIVKA-II 단백질형을 정량 수치화하여, 이를 간암 고위험군의 조기 간암 판별에 사용할 수 있다.

Description

질량분석법 기반의 포괄적 PIVKA-II 단백질형 정량 방법 및 그 간암 진단용 용도 {Method of quantification of inclusive PIVKA-II proteoforms based on mass spectrometry and it use for diagnosis of liver cancer}

본원은 간암의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 질량분석법 기반의 포괄적 PIVKA-II 단백질형 정량 방법에 관한 것이다.

간암은 전세계에서 다섯번째로 흔한 암이며 암 관련 사망 중 3번째 주요 원인으로, 이중 간세포암(Hepatocellular carcinoma)이 원발(primary) 간암의 90% 이상을 차지한다(Ferrin, G.; Aguilar-Melero, P.; Rodriguez-Peralvarez, M.; Montero-Alvarez, J. L.; de la Mata, M. Hepatic medicine : evidence and research 2015, 7, 1-10). 비록 HCC에 대한 연구가 계속되고 있고 그 증상이 잘 알려져 있지만, 상기 질병을 초기 단계에 진단하는 것은 여전히 어렵고 진단후 생존율이 매우 낮으며( Xiao, J. F. et al., Journal of proteome research 2012, 11, 5914-5923). 종양의 완전한 제거를 위해서는 수술치료가 필요하지만 수술이 가능한 경우도 10-20% 정도로 낮아, 간암 발생빈도가 높은 위험인자를 가진 환자에서의 조기진단이 임상적으로 중요하다.

간암의 진단 방법으로는 초음파촬영, 전산화 단층촬영 및 자기공명영상과 같은 영상진단법이 유용하지만, 크기가 작은 종양의 검출이 어렵고 비용이 많이 드는 단점이 있다. 알파태아단백(alpha-fetoprotein, AFP)은 간암의 진단에 사용되어 온 혈청 진단마커이지만, 민감도가 약 50-60%에 불과하고, 알코올간염, 바이러스간염 및 간경화와 같은 양성 간질환에서도 AFP의 양이 증가되어서 특이도가 40- 50%로 낮다. 또한 PIVKA-II도 간암 진단에 사용되는 진단마커이다.

기존의 PIVKA-II를 검출/정량하기 위한 대부분의 분석법은 항체를 기반으로 하여 단백질 수준에서 단백질과 항체의 친화력을 이용하여 정량하는 방법이다. 이는MU-3 세포주를 이용하여 생산된 단일 클론 항체를 이용하고 있으며, MU-3의 항원결정기(에피토프)는 아미노산 17-27에 위치하고 있어, PIVKA-II 분자 내 항원 결정기에 아미노산 19 및 20의 글루탐산(Glu) 잔기를 포함하고 있는 (9-10개의 Glu 잔기를 가진) PIVKA-II 저카르복실화 단백질형들만을 주로 탐지한다.

하지만 2-9개의 Glu 잔기를 함유하는 비타민 K 결핍에 의해 유도된 PIVKA-II는 또한 MU-3 항체와 일부 반응하여, 비-HCC인 개인에게서도 PIVKA-II가 상승되어 탐지되는 문제점이 있다. 아울러 PIVKA-II 레벨은 또한 비타민 K 결핍증이 있어 와파린을 복용하고 있는 환자 혈청에서도 증가하는 문제점이 있다.

따라서 MU-3 항체를 기초로 하는 현재의 분석 방법에 의해 불필요한 치료를 하게 되거나 잘못된 치료로 유도할 수도 있다. 또한 항체 기반의 분석법의 경우, 비-특이적으로 결합하는 항-시약 항체(anti- reagent antibody)로 인해 정량성이 떨어지며, 일정 농도 이상 측정물질(analyte)가 존재하는 경우, 신호강도가 떨어지는 현상 (high dose hook effect)이 발생하는 문제점이 있다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0057495호는 ‘측정 시약에서의 비특이 반응의 억제 방법’에 관한 것으로, 특정한 2가 금속 이온을 첨가하여 PIVKA-II 및 프로트롬빈에 각각 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 비특이적인 응집 반응을 억제시킴으로써 시료 중 PIVKAII를 특이적으로 측정하는 방법이 개시되어 있다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0041620호는 ‘Ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트’에 관한 것으로, 프로트롬빈 프래그먼트 F1 및 F2, 및 항 PIVKA-II 항체를 이용하여 검체 중 PIVKA-Ⅱ를 측정하는 방법이 개시되어 있다.

대한민국 특허 10-1796874호는 “다중동시정량법을 이용한 PIVKA-II의 정량 또는 검출 방법”에 관한 것이다. 하지만 이 특허는 PIVKA-II의 Gla domain에 위치한 단 하나의 대리 (surrogate) 펩타이드만을 정량하여, 이는 기존 면역 분석법에서 사용하는 항체인 MU-3의 에피토프와 동일한 일부 저카르복실화 단백질형(proteoforms) 만을 정량 한다는 한계로 인해서, 조기 간암 환자를 간암 고위험군 환자로부터 높은 구분력으로 구분할 수 있는 조기 간암 진단에 부적합하다.

따라서 항체를 기반으로 하는 면역분석법의 단점을 극복하면서도, PIVKA-II 보다 다양한 저카르복실화 (des-carboxylation) PIVKA-II 단백질형 소그룹을 동시에 포괄적으로 정량 할 수 있는 포괄적 PIVKAII 정량방법이 필요하다.

본원에서 질량분석법 기반의, 다양한 저카르복실화 PIVKA-II 단백질형 소그룹을 동시에 정량 할 수 있는 포괄적 PIVKAII 정량방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 간암 고위험군으로부터 조기 간암 진단에 대한 정보를 제공하기 위해, 인비트로에서 PIVKA-II 단백질을 질량 분석법에 의해 정량하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은 간암 고위험군으로부터 외부로 분리된 검체를 제공하는 단계; 상기 검체로부터 단백질 분해물을 제조하는 단계; 상기 단백질 분해물에 내부 표준물질을 혼합하는 단계; 상기 혼합물에서 상기 PIVKA-II 단백질에 존재하는 3개의 Glu-펩타이드 단편의 양 및 상기 내부 표준물질의 양을 질량분석법으로 결정하는 단계; 및 상기 결정된 3개의 Glu-펩타이드 단편의 양을 상기 내부 표준물질의 양으로 표준화하여, 표준화된 PIVKA-II 단백질 양을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 간암 고위험군은 간암의 발생 위험이 높은 만성 간염 또는 간경화 질환을 포함하는 간질환 환자를 포함하며, 상기 Glu-펩타이드 단편의 아미노산 서열은 ANTFLEEVR (서열번호 1), ERECVEETCSY(서열번호 2), 및 ESSTATDVF(서열번호 3)이고, 상기 PIVKA-II 단백질은 상기 3개의 Glu-펩타이드의 글루탐산 잔기에서 카르복시기로 변형이 일어나지 않은 상태의 Glu-펩타이드를 포함하는 PIVKA-II 단백질이다.

상기 본원에 따른 방법에서 정량/검출하고자 하는 PIVKA-II는 상기 세 개의 펩타이드의 검출을 통해 카르복실기로 변형되지 않은 다양한 개수의 글루탐산 잔기를 포함하는 PIVKA-II의 혼합물을 포괄적으로 검출할 수 있는 효과적 방법이다.

일 구현예에서 본원에 따른 검체는 관련 조직 또는 혈청을 포함하는 혈액 일 수 있다.

일 구현예서 본원에 따른 방법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 질량 분석법을 이용하여 수행된다.

다른 구현예에서 본원의 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM), 특히 MRM이 사용된다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법의 단백질 분해물은 단백질 분해효소로서 트립신 및/또는 키모트립신을 이용하여 제조될 수 있다.

또한 본원은 간암고위험군의 간암 발병을 조기 진단하기 위해, 또는 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 본원에 개시된 정량 방법을 이용하는 것이다.

이에 다른 양태에서 본원에 따른 정량/검출 방법을 이용하여 결정된 상기 표준화된 3개의 Glu-펩타이드의 정량 수치의 조합을 간암 고위험군 검체의 조기 간암 발생과 연관시키는 단계를 포함하는, 간암 고위험군의 간암 조기 진단을 위해 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 연관시키는 단계에서 상기 각 펩타이드의 정량 수치는 하기 로지스틱 식에 대입되어 간암 양성 확률로 결정되는 단계를 포함하는 것인, 방법:

일 구현예에서 간암 양성 확률의 최적 컷오프 값은 상기 표준화된 펩타이드 정량분석 수치를 이용한 ROC커브 분석에 의해 결정된 특이도 및 민감도를 이용한 Youden index (민감도 + 특이도 -1)를 이용하여 결정되며, 상기 ROC 커브는 컷오프 값에 따른 민감도와 특이도 값을 이용하여 작성되며, 상기 민감도 및 특이도는 대조군인 간암이 발생하지 않은 간경화 또는 간염의 간암 고위험군 검체와, 간암군 검체에서 결정된 상기 3개의 표준화된 Glu-펩타이드의 정량 수치의 조합을 상기 로지스틱 함수식에 대입하여 얻은 값을, 각 컷오프 값과 비교하여 결정한 예측된 간암 여부와, 실제 간암 여부를 비교하여 결정될 수 있다.

일 구현예에서 상기 컷오프 값은 간암 양성 확률 0.60635으로, 해당 값 이상을 가질 경우 간암 양성으로 판단할 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 간암 마커로서 AFP 발현량에 대한 정보를 추가로 포함하며, 이 경우 상기 연관시키는 단계에서 상기 AFP 발현량은 상기 각 Glu-펩타이드의 정량 수치에 상기 AFP 발현량에 대한 정보를 통합한 하기 로지스틱 함수식으로 계산되는 것인, 방법:

본원에 따른 방법은 간암 진단 마커인 PIVKA-II 단백질 유래 3개의 비카르복실화 펩타이드를 선정하고, 이를 액체 크로마토그래피 질량 분석기 기반의 MRM(Multiple Reaction Monitoring) 분석법을 이용하여 동시에 모니터링 함으로써, 다양한 PIVKA-II 단백질형이 포함된 포괄적 정량이 가능하다. 이는 기존의 항체 및 질량분석 PIVKA-II 정량법으로 얻을 수 없는 PIVKA-II 단백질형에 대한 정량 정보를 효율적이고 신속하게 얻을 수 있는 방법이다. 본원에 따른 방법은 상기 정량이 필요한 다양한 질환의 진단에 사용될 수 있으며, 특히 간암 고위험군의 조기 간암 판별에 사용할 수 있다.

도 1은 본원 발명의 실험 설계를 나타낸 것이다. 두 기관 (아산병원 및 삼성병원) 으로부터 총 618명의 환자로부터 얻은 혈청 시료가 본 연구에 사용되었다. 아산병원에서 얻은 300례 환자 시료는, 진단 모델 구축 및 성능 확인에 사용하기 위해, 무작위로 훈련세트와 평가세트로 나누었다. 70례의 간암환자와 140례의 간암 고위험군 (간염 70례 및 간경화 70례)으로부터 얻은 혈청 시료들로 구성된 훈련세트에서, 단계적 로지스틱 회귀 분석을 수행하여, 간암 진단 모델을 구축하였다. 구축한 모델의 성능은 30례의 간암 환자와 60례의 간암 고위험군 (간염 30례 및 간경화 30례)으로부터 얻은 혈청 시료로 구성된 평가세트에서 ROC curve를 이용하여 평가하였다. 그 다음, 삼성 서울병원에서 얻은 총 318례의 환자 혈청 시료로 구성된 독립 검증 세트에서 모델의 성능을 검증하였다. 318례의 환자 혈청 시료는 184례의 간암 환자 시료와, 134례의 간암 고위험군 시료 (간염 105례 및 간경화 29례)로 구성되었다. 추가적으로, 독립 검증 세트를 구성하는 시료 중, AFP와 PIVKA-II 수치가 기준치 이하인 간암 시료들로 구성된 서브 그룹과, 극초기단계의 간암으로 이루어진 서브그룹들에서의 모델의 간암 진단 성능을 평가하였다. 약어: HV, patients with hepatitis virus infections; LC, patients with liver cirrhosis; HCC, hepatocellular carcinoma.
도 2는 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 패널의 훈련세트와 평가세트에서의 진단적 성능 및, 최적 cutoff값을 사용하였을 때, PIVKA-II 패널과 면역어세이 기반 PIVKA-II 값의 성능 비교한 것이다. (A) PIVKA-II 패널의 훈련세트(검정색 실선) 및 평가세트(검정색 점선) 에서의 ROC curve. AUROC 값은 훈련세트에서 0.873이었고, 평가세트에서도 0.844로 훈련세트에서의 AUROC값과 상응하게 나타났다 (DeLong`s test, P = 0.5722). (B) 전체 모델 구축 코호트 (훈련세트와 평가세트의 합)에서의 세 개의 Glu 펩타이드의 상대적 농도. ERECVEETCSY 펩타이드 및 ESSTATDVF 펩타이드의 상대적 농도는 대조군에 비하여 간암군에서 유의하게 증가한 반면, ANTFLEEVR 펩타이드의 상대적 농도는 대조군에 비하여 간암군에서 유의하게 감소하여 나타났다. PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 패널과 면역어세이 기반의 혈청 PIVKA-II 값에 대한, 최적 절단값 (optimal cutoff)에서의 Roc curve와 그에 상응하는 혼동 행렬을 훈련세트(C)와 평가세트(D)에 대하여 각각 나타내었다. 혈청 PIVKA-II 값(회색선)에 대한 최적 cutoff 값은 40 mAU/mL 이고, 훈련세트에서의 Youden Index를 이용하여 나타낸 3-Glu-펩타이드 패널(검정색 선)의 logit(P) 값에 대한 최적 cutoff 값은 0.432으로, 간암 양성의 확률(P)에 대한 최적 cutoff 값은 0.60635이다 (도 10 참조). 훈련세트와 검증세트 모두에서 최적 cutoff값에서의 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 패널과 면역어세이 기반 PIVKA-II 값의의 AUROC값은 통계적으로 비교 동등했다 (DeLong`s test, P > 0.05). 모든 AUROC값은 95% 신뢰구간(CI)와 함께 제시 되었다. 세 개의 Glu-펩타이드의 상대적 농도는 각 개별 시료에 대하여 heavy 내부 표준 물질 펩타이드에 대한 light 펩타이드의 피크 면적 비율 (peak area ratio) 값으로 표현 되었다. 중간 수평선과 오차 바는 각각 평균과 표준편차를 나타내었다. 각 펩타이드의 상대적 농도를 비교하기위해 Mann-Whitney U 테스트를 수행하여 P-값을 얻었다. **P < 0.01, ****P < 0.0001. Abbreviations: AUROC, area under the ROC curve; CI, confidence interval; ROC, receiver operating characteristic.
도 3은 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드와 AFP 수치, 그리고 조합 모델 (PIVKA-II 3-Glu-펩타이드와 AFP 수치)의 훈련세트(A)와 평가세트(B)에서의 진단적 성능 비교한 것이다. AUROC값은 95% 신뢰구간(CI)와 함께 제시 되었다. 모든 데이터 세트에서 조합 모델 (검정색 선)이 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델(회색 실선)이나 AFP 수치(회색 점선)에 비하여 높은 AUROC 값을 나타내었다. (A) 훈련 세트에서, 조합 모델은 AUROC 값이 0.903으로, AFP 수치의 AUROC 값인 0.77 또는 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델의 AUROC 값인 0.873보다 높게 나타났다. 특히, 조합 모델의 AUROC 값은 AFP 수치의 AUROC 값 보다는 통계적으로 유의하게 높았지만 (DeLong`s test, P < 0.05), PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델에 비교 하였을 때는 통계적으로 유의한 차이가 아니었다. (DeLong`s test, P = 0.079). (B) 평가 세트에서도 역시, 조합 모델의 AUROC 값이 0.913으로, AFP 수치의 AUROC 값인 0.889 또는 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델의 AUROC 값인 0.844보다 높게 나타났다. 또한, 조합 모델의 AUROC 값은 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델의 AUROC 값 보다는 통계적으로 유의하게 높았지만(DeLong`s test, P < 0.05), AFP 수치의 AUROC 값에 비해서는 유의한 차이가 아니었다 (DeLong`s test, P = 0.484).
Abbreviations: AUROC, area under the ROC curve; CI, confidence interval; ROC, receiver operating characteristic.
도 4는 독립 검증 세트에서의 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드와 AFP 수치, 그리고 조합 모델 (PIVKA-II 3-Glu-펩타이드와 AFP 수치)의 진단적 성능 검증한 결과이다. (A) 독립 검증 세트에서의 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델(회색 실선), 혈청 AFP 수치 (회색 점선), 그리고 조합 모델 (검정색 실선)의 ROC curve들. 모든 AUROC값은 95% 신뢰구간(CI)와 함께 제시 되었다. 독립검증세트에서 조합 모델의 AUROC 값과 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델 및 혈청 AFP 수치의 AUROC값의 차이는 각 비교에서 유의했다 (DeLong`s test, P < 0.005). PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델의 진단적 성능은 독립 검증 세트에 비해 훈련 세트(AUROC = 0.873) 에서 약간 높았으나, 비교 동등한 수준이었다 (DeLong`s test, P = 0.0336). (B) 독립 검증 세트에서의 3개의 Glu-펩타이드의 상대적 농도. 훈련 세트에서 관찰된 각 펩타이드에 대한 상대적 농도의 경향은 독립 검증 세트에서도 유지되었다. 세 개의 Glu-펩타이드의 상대적 농도는 각 개별 시료에 대하여 heavy 내부 표준 물질 펩타이드에 대한 light 펩타이드의 피크 면적 비율 (peak area ratio) 값으로 표현 되었다. 중간 수평선과 오차 바는 각각 평균과 표준편차를 나타내었다. 각 펩타이드의 상대적 농도를 비교하기위해 Mann-Whitney U 테스트를 수행하여 P-값을 얻었다. ****P < 0.0001.
Abbreviations: AUROC, area under the ROC curve; CI, confidence interval; ROC, receiver operating characteristic.
도 5는 독립 검증 세트의 소그룹에서의 PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델과 조합 모델 (PIVKA-II 3-Glu-펩타이드와 혈청AFP 수치)의 간암 감시 진단력을 검증한 결과이다. (A) 127례의 간암 고위험군과 39례의 간암군 시료로 구성된 AFP 및 PIVKA-II가 기준치 이하 (< 20 ng/mL for AFP and < 40 mAU/mL for PIVKA-II)인 소그룹에 대한 ROC curve. (B) 36례의 극초기 간암(tumor size < 2 cm) 시료를 134례의 간암 고위험군으로부터 구분하는 ROC curves. 모든 AUROC값은 95% 신뢰구간(CI)와 함께 제시 되었다. PIVKA-II 3-Glu-펩타이드 모델(회색 실선)과 조합 모델 (검정색 실선)은 극초기 간암 환자의 진단과 혈청 AFP 및 PIVKA-II 수치가 기준치 이하인 간암 환자의 구별에서 AUROC 값이 0.8이상으로, 믿을만한 감시 진단 성능을 나타내었다. Abbreviations: AUROC, area under the ROC curve; CI, confidence interval; ROC, receiver operating characteristic.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른, triple quardrupole을 이용한 질량 분석의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 각 펩타이드에 대한 내부표준물질(SIS peptide)의 6개 transition에 대한 크로마토그램을 나타내었다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 혼합 (pooled) 혈청에서 각 Glu-펩타이드의 정량자 이온에 대한 역 반응 커브를 나타낸 것이다. 다양한 농도로 혈청에 스파이크 된 내부표준물질을 사용하여, MRM분석 시의 선형성(linearity)을 결정하였다. 각 농도 포인트에서의 Peak area ratio는 3 반복 실험의 평균 값으로 플랏하였다.
도 9는 본원의 일 실시 예에 따른, 개별 시료 검체에서 Glu-펩타이드를 얻기 위한 일련의 시료 전처리 과정을 도식화 한 것이다.
도 10은 훈련 세트와 평가 세트에서, 3-Glu-peptide 모델을 구성하는 3개의 각 개별 펩타이드의 진단적 성능 (ANTFLEEVR, 노란색 실선; ERECVEETCSY, 초록색 실선; ESSTATDVF, 파란색 실선)과, 세 개 펩타이드를 조합한 3-Glu-peptide 모델의 진단적 성능 (붉은색 실선)을 ROC curve로 나타낸 것이다. 훈련세트에서 도출된 optimal cutoff 값 (최적의 절단값)은 붉은 점으로 나타내었다.

본원은 질량분석법 기반의, 다양한 소그룹 단백질형의 PIVKA-II (protein induced by vitamin K absence/antagonist-II)를 포함하도록 포괄하여 정량할 수 있는 정량 방법 및 이를 간암 고위험군 환자의 간암 발생 조기 진단에 사용할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

구체적으로 본원은 PIVKA-II 단백질 내 감마-카르복시 글루탐산 도메인 (Gla domain) 내의 비카르복실화 (non-carboxylation) 상태의 펩타이드 3개를 선정하고 이를 질량분석법을 이용하여 정량하여, 다양한 저카르복실화 PIVKA-II 단백질형 소그룹을 포괄적으로 포함하는 PIVKA-II 단백질 정량 방법 및 이를 이용한 조기 간암 확률 계산 모델 및 사용 방법과 용도에 관한 것이다. 본원에서 조합으로 사용되는 세 개의 비카르복실화 상태의 펩타이드를 정량/검출에 사용하는 경우, 기존의 9-10개의 Glu 잔기를 포함하는 일부 저카르복실화 단백질형만의 정량 한계점을 극복하고, 다양한 PIVKA-II 저카르복실화 단백질형 소그룹 별 정량 정보를 동시에 얻을 수 있어, 조기 간암 환자를 간암 고위험군 환자로부터 높은 구분력으로 구분해 낼 수 있도록 한다.

PIVKA-II는 응고단백질인 프로트롬빈의 합성 과정에서 비정상적으로 생성되는 프로트롬빈 전구체이다. 프로트롬빈은 Gla 도메인 (프로트롬빈 아미노산 잔기 44부터 89: UniProtKB - P00734) 내에 총 10개의 글루탐산(Glu) 잔기를 가진 전구체(precursor) 형태로 생산된 후, 비타민 K의 존재 하에서 상기 10개의 글루탐산 잔기가 γ-카르복시 글루탐산 (Gla) 잔기로 변형된 카르복실화된 프로트롬빈으로 성숙한다.

하지만 간세포 암종 (HCC) 환자에서 이러한 카르복실화 과정이 비정상적으로 일어난다. 즉 간세포 암종에서는 10개의 글루탐산 잔기의 전부 또는 일부가 Gla로 변환되지 못하고, 이것이 PIVKA-II라는 이상프로트롬빈이 혈액으로 분비된다. 혈액의 PIVKA-II 단백질은 Gla로 전환되지 않은 Glu 잔기의 수가 달라짐에 따라, 1 내지 10 범위내의 다양한 수의 Glu 잔기를 가진 혼합물로 존재하며 이러한 아미노산 잔기 차이에 근거하여 정상 트롬빈과 구분할 수 있다.

Uehara et al. (Uehara S, Gotoh K, Handa H, Honjo K, Hirayama A. Process of carboxylation of glutamic acid residues in the gla domain of human des-gamma-carboxyprothrombin. Clin Chim Acta 1999;289:33-44.)에 의하여, 인간 프로트롬빈의 Gla 도메인의 10개의 Glu 잔기는 순차적으로 즉, Glu 잔기 26부터 25, 16, 29, 20, 19, 14, 32, 7, 6의 순서로 카르복실화를 거친다는 것이 밝혀졌다. 따라서 PIVKA-II 단백질은 Gla로 전환되지 않은 Glu 잔기의 수가 달라짐에 따라, PIVKA-II 단백질은 Gla 도메인에 1 내지 10개 범위내의 다양한 수의 Glu 잔기를 가진 저카르복실화 (des-carboxylation) 단백질형 (proteoforms)이 혼합물로 존재한다. 따라서 간암 진단에 사용될 수 있는 저카르복실화된 PIVKA-II의 정확한 정량/검출을 위해서는 이러한 다양한 수의 Glu을 가능한 많이 포괄적으로 포함하여 정량하는 것이 필요하다.

이에 한 양태에서 본원은 간암 고위험군으로부터 조기 간암 진단에 대한 정보를 제공하기 위해, 질량 분석법을 이용하여, 인비트로에서 Gla 도메인에 비카르복실화된 다양한 수의 Glu 잔기를 포함하는 PIVKA-II 단백질을 정량하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 질량분석법 기반의 방법으로 간암 고위험군으로부터 외부로 분리된 검체를 제공하는 단계; 상기 검체로부터 단백질 분해물을 제조하는 단계; 상기 단백질 분해물에 내부 표준물질을 혼합하는 단계; 상기 혼합물에서 상기 PIVKA-II 단백질의 Gla 도메인에 존재하는 3개의 Glu-펩타이드 단편의 양 및 상기 내부 표준물질의 양을 질량분석으로 결정하는 단계; 및 상기 결정된 3개의 Glu-펩타이드 단편의 양을 상기 내부 표준물질의 양으로 표준화하여, 표준화된 PIVKA-II 단백질 양을 결정하는 단계를 포함한다

본원에 따른 방법에서 정량 대상이 되는 PIVKA-II 단백질은 Gla 도메인의 포함된 10개의 글루탐산 잔기에 카르복실기로 변형되지 않은 상태의 PIVKA-II로 글루탐산 잔기의 수는 1개부터 10개까지 다양할 수 있다. 본원에서는 Gla 도메인에서 ANTFLEEVR (서열번호 1), ERECVEETCSY(서열번호 2), 및 ESSTATDVF(서열번호 3)을 정량하여 다양한 개수의 글루탐산 잔기를 포함하는 PIVKA-II의 검출이 가능하다.

본원에 따른 방법에 사용되는 질량분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함할 수 있다. 이때 사용되는 질량 분석법 모드는, 예를 들어 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM) 일 수 있다.

일 구현예에서는 특히 MRM 모드가 사용된다. MRM 질량분석법의 원리는 선정된 타겟 단백질들을 모두 펩타이드로 가수분해 시킨 후에, 각 타겟 단백질들에 특이적인 mass to charge (m/z)를 가지는 펩타이드(precursor ion, MS1)를 선택한다. 이 특이적인 펩타이드를 충돌시켰을 때(Quadruple 2, Q2), 발생하는 파편들 중에서 특징적인 m/z를 가지는 특이적 질량을 가진 단편(fragmentation ion, MS2)을 선택한다. MS1/MS2에서 각각 얻어지는 precursor ion/fragment ion의 쌍을 타겟 단백질의 특이적 transition(타겟 단백질의 특이적 질량 지문)이라 명명하며, 이 transition들을 모든 타겟 단백질(300 단백질 이상)에 대해서 측정하면 시료에 있는 모든 타겟 단백질의 양을 동시에 상대 혹은 절대 정량할 수 있다. 상대 혹은 절대 정량을 위해서는 SIS (동위원소 치환된 동일 아미노산 순서의) 펩타이드를 표준 물질로 사용하는데, 측정 시료의 input 표준 물질 (SIS 펩타이드) 양을 알고 있기 때문에 타겟 펩타이드 양을 비례적으로 계산할 수 있는 원리이다. MS2를 통과한 transition은 검출기에서 digital signal로 전환되어 peak chromatogram으로 전환되며 peak 면적을 계산하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다.

본원에 따른 방법에서 검체 시료의 PIVKA-II의 MRM 분석을 위해 검체는 단백질 분해효소 (protease, peptidase)로 처리되어 절단 또는 분해된다. 그 결과 전장 단백질이 잘려져 다양한 길이의 단편이 생성될 수 있다. 본원에 따른 방법에 사용되는 단백질 분해효소는 pH7-8에서 활성을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 공지된 다양한 단백질 분해효소가 사용될 수 있으며, 예를 들면 MEROPS 데이터베이스 (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/pathway_index)에서 검색을 할 수 있으며, 시중에서 구입이 가능하다. 단백질 분해효소 다양한 기준으로 분류 될 수 있으며 예를 들면 촉매잔기 또는 활성을 갖는 적정 pH에 따라 분류될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 단백질 분해효소는 중성(Neutral) pH에서 작용하는 중성 단백질분해효소이다. 이러한 단백질 분해효소는 예를 들면 카이모트립신, 트립신, Lys-C, Asp-N 및 Glu-C를 포함한다. 카이모트립신은 소수성 잔기 (tryptophan, tyrosin, phenyalalnine, leucine, methionine)의 카복시 말단 측을 자르며, 트립신은 라이신 및 알지닌의 카복시 말단 측을 자르며 pH 7-8에서 활성을 가진다. Lys-C는 라이신 잔기의 카복시 말단 측을 자르며, pH 7-9에서 활성을 가지며, Asp-N는 아스파르트산의 아미노 말단 측을 자르며, pH 4-9에서 활성을 가진다. Glu-C는 아스파르트산 및 글루탐산의 카복시 말단 측을 잘라내고, pH 4-9에서 활성을 가진다. 일 구현예에서는 특히 트립신 및 키모트립신이 사용된다.

본원에 따른 방법에서 MRM 모드가 사용되고, 이 경우 서열번호 1의 펩타이드의 양은 고유질량 값 539.780++의 상기 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y6, 792.4250+; y7, 893.4727+; y5, 645.3566+; y4, 532.2726+; b8, 904.4411+; b8, 452.7242++)의 피크 면적을, 고유질량 값 544.784++의 내부 표준물질 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y6, 802.4333+; y7, 903.4810+; y5, 655.3649+; y4, 542.2808+; b8, 904.4411+; b8, 452.7242++)의 피크 면적으로 나눈 것으로 결정되고, 서열번호 2의 펩타이드의 양은 고유질량 값 731.285++의 상기 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y2, 269.1132+; y4, 530.1915+; y1, 182.0812+; b5, 674.2926+; b7, 932.3778+; b10, 1280.4882+)의 피크 면적을, 고유질량 값 736.298++의 내부 표준물질 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y2, 279.1404+; y4, 540.2188+; y1, 192.1084+; b5, 674.2926+; b7, 932.3778+; b10, 1280.4882+)의 피크 면적으로 나눈 것으로 결정되고, 서열번호 3의 펩타이드의 양은 고유질량 값 478.714++의 상기 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(b7, 692.2733+; b5, 476.1987+; b6, 577.2464+; b8, 791.3418+; y4, 481.2293+; y3, 380.1816+)의 피크 면적을, 고유질량 값 483.728++의 내부 표준물질 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(b7, 692.2733+; b5, 476.1987+; b6, 577.2464+; b8, 791.3418+; y4, 491.2565+; y3, 390.2088+)의 피크 면적으로 나눈 값으로 결정될 수 있다.

본원 방법에 사용되는 검체 또는 시료는 PIVKA-II를 검출할 수 있는 조직, 세포, 혈액, 전혈, 혈청 또는 혈장 등으로 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본원의 일 구현예에서 상기 시료는 혈액, 특히 혈청 시료이다. 시료로서 혈액을 이용하는 경우, 단백질 고갈 및 변성 후 단백질 분해 효소(예컨대, 트립신 및/또는 키모트립신)로 분해하여 사용할 수 있다.

본원 방법에 사용되는 검체 또는 시료는 포유류 특히 인간으로부터 수득된다. 인간 대상체는 간암 고위험군, 특히 간염 또는 간경화 환자로서, 간암의 조기 진단이 필요한 사람이다.

간암은 간세포가 지속적인 다양한 자극에 의해 자신의 고유 기능을 상실하고 암세포로 변신하여 끊임없는 자기 증식을 이루면서 주변 또는 먼 곳으로 퍼져 나가는 특징을 갖게 되는 종양을 말하며, 원발성 종양과 간에서 발생하여 다른 장기로 이전된 전이암 있다. 원발성 간암은 간세포의 이상으로 발생하는 간세포암과 담관세포의 이상으로 발생하는 담관암, 맥관육종을 포함하며, 90% 이상이 간세포암이다

본원에 따른 일 구현예에서 간암은 조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양이며, 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)이다.

간세포암은 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다. 이러한 간암은, 간에서 발생 된 만성 염증으로, 간조직이 재생결절화되고 섬유화되어 결국 간세포 손상, 반흔, 간기능 감소, 복수, 출열성 질환, 간성 혼수 증상을 나타내는 간경변증 또는 간경화증과 구별된다. 간암 환자의 경우 보통 간염 (inflammation) 및 간경화 (fibrosis)를 모두 가지고 있는데, 간염의 경우 약제에 의해 대부분의 간암 환자에서 없어지지만, 간경화 환자에서 90% 정도가 간암으로 진단되기 때문에 간경화증 환자의 조기 진단이 특히 필요하다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정을판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 예후 측정은 간질환으로 진단 후 치료를 받고 회복 여부를 판별하는 것을 포함하는 것이다.

본원에 따른 방법에서 조기 간암 진단을 위해 대조군으로 사용될 수 있는 시료는 간염, 간경화 및/또는 간암으로 치료 후 완치된 환자 (간경화 유지) 유래의 하나 이상의 시료가 사용될 수 있다. 이러한 대조군 환자와 비교하여, 간암 환자에서 본원에 방법으로 정량된 Gal 도메인의 비카르복실화 PIVKA-II의 발현량이 증가된다.

이에 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법을 이용하여 결정된 상기 표준화된 3개의 Glu-펩타이드의 정량 수치의 조합을 간암 고위험군 검체의 조기 간암 발생과 연관시키는 단계를 포함하는, 간암 고위험군의 간암 조기 진단을 위해 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 연관시키는 단계에서 상기 각 펩타이드의 정량 수치의 조합은 하기 로지스틱 식으로 계산될 수 있다.

상기 식에서 검체를 간암 양성으로 판별할 수 있는 최적의 컷오프 값은 본원의 표준화된 펩타이드 정량 분석 수치를 간암 양성의 확률 (P) 값으로 치환한 값을 컷오프 값과 비교하여 얻은 간암 여부 예측과 실제 간암 여부를 비교하여 특이도 및 민감도를 계산하고, 컷 오프 값의 변화에 따른 민감도와 특이도를 이용하여 ROC 커브를 작성한 후, Youden 지수 (Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430)(J 지수)가 최대가 되는 수치(J 지수 = 민감도 + 특이도 - 1)로 결정할 수 있다. 민감도 및 특이도는 대조군인 간암이 발생하지 않은 간경화 또는 간염의 간암 고위험군 검체와, 간암군 검체에서 결정된 상기 3개의 표준화된 Glu-펩타이드의 정량 수치의 조합을 상기 로지스틱 함수식에 대입하여 얻은 값을, 각 컷오프 값과 비교하여 결정한 예측된 간암 여부와, 실제 간암 여부를 비교하여 결정된다. 민감도 = 실제 간암군 환자 중, 간암군으로 예측한 비율이며, 특이도 = 실제 대조군 환자 중, 대조군으로 예측한 비율이다.

일 구현예에서 간암일 확률의 최적의 컷오프 값은 특이도와 민감도의 합이 최대가 되는 점을 구하는 Youden index 방법을 이용하여 0.60635으로 결정하였으며, 이 컷오프에서 민감도는 90.0%, 특이도는 71.4%였다.

본원에 따른 방법에서 각 회귀 계수 및 절편 값을 이용하여, 건강 상태에 대한 정보가 없는, 임의의 개체에 적용해 환자에 대한 확률 값을 도출하고, 이 값을 컷오프 값과 비교하여 간암 여부를 진단하기 위하여 사용할 수 있다.

해당 컷오프 값은 모델 구축을 위해 분석한 샘플에서, Youden index를 이용하여 설정한 최적의 값으로, 모델 구축을 위해 분석한 샘플 또는 민감도/특이도에 따라 달라질 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 간암 마커로서 AFP 발현량에 대한 정보를 추가로 포함하며,

일 구현예서 본원에 따른 방법은 진단을 위해 AFP 마커의 사용을 추가로 포함한다. AFP 발현량은 상기 각 Glu-펩타이드의 정량 수치에 상기 AFP 발현량에 대한 정보를 통합한 하기 로지스틱 함수식으로 계산될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 재료 및 시약

water, acetonitrile, formic acid, 0.1% formic acid in water, 그리고 0.1% formic acid in acetonitrile 등의 고성능 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)용 용액은 Fisher Scientific (Loughborough, UK)에서 구입하였다. Ammonium bicarbonate (ABC, 200 mM) 용액은 iNtRON Biotechnology (Sungnam, Korea)에서 구입하였다. Dithiothreitol (DTT)와 iodoacetamide (IAA)는 각각 Merck Co. (Darmstadt, Germany)와 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. RapiGest surfactant (SF)는 Waters Corp. (Milford, MA, USA)에서 구입하였다. 시퀀싱-grade 키모트립신(chymotrypsin)과 트립신 (trypsin)은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. Formic acid는Fisher Scientific에서 구매하였다. 내부표준물질 (Stable isotope-labeled standard, SIS) peptides (heavy peptides)는 SynPeptide CO., LTD (Shanghai, China)로부터 구입하였다 (>99% isotope purity와 약 >60% individual peptides purity를 가짐). 2개의 트립신 절단 펩타이드에 대한 Heavy peptides는 C-terminal arginine (Arg, R)과 lysine (Lys, K)에 ¹³C 및 ¹⁵N 으로 표지 되었고, 3 개의 키모트립신 절단 펩타이드의 Heavy peptides는 C-terminal tyrosine (Tyr, Y), phenylalanine (Phe, F), 그리고 leucine (Leu, L)에 ¹³C and ¹⁵N으로 표지 되었다.

실험 방법

시료의 임상적 특징

본 발명에 사용된 시료는 아산병원에서 수집된 300명의 환자로부터 얻은 혈청 시료와 삼성병원에서 수집된 318명의 환자로부터 얻은 혈청 시료로 구성되었으며, 각 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받은 시료이다 (아산병원; IRB No. 2017-1049, 삼성병원; IRB No. 2017-08-164).

B형 간염 및 C형 간염 환자와, 간염 유래 간경화 환자로 구성된 간암 고위험군 환자로부터 얻은 혈청 시료를 대조군으로, 조기 간암 환자의 시료를 간암군으로 사용하였다. 시료를 제공한 618명의 모든 환자로부터 서면 동의서를 제공 받았으며, 제공된 환자의 임상적 특징은 표 1-1 및 1-2에 기재되어 있다.

[표 1-1]

[표 1-2]

6-multiple affinity removal system (MARS)를 이용한 혈청 시료 전처리

HPLC system과 Agilent 사의 6-multiple affinity removal system (MARS)을 이용하여, 혈청 내에 높은 농도로 존재하는 6개의 단백질인 albumin, IgG, antitrypsin, IgA, transferrin, 및 haptoglobin을 제거 (depletion)하는 전처리 과정을 수행하였다. 높은 농도로 존재하는 6개 단백질을 제거한 후, 3K centrifugal filer를 이용하여 시료의 농축을 수행 함으로써, 혈액 내에 낮은 농도로 존재하는 PIVKA-II 단백질의 농도를 증가시켜 검출 능력을 증가시키는 효과를 얻었다.

다중 효소를 이용한 시료 내 단백질의 펩타이드화 수행 (Rapigest in-solution digestion)

MARS depletion 수행 및 농축 과정을 거친 전처리 된 시료의 단백질 농도를 BCA(bicinchoninic acid) assay를 이용하여 측정하였다. 200 μg의 단백질에 해당하는 전처리 된 시료를 Eppendorf tube에 넣은 후, D.W를 이용하여 40 μL를 맞추어 주었다. 50 mM DTT와 200 mM ABC, 0.5% RapiGest를 포함한 반응 용액 10 μL를 시료가 들어있는 tube에 넣은 후, vortexing하여, 단백질과 반응 용액이 잘 섞이도록 하여준 후, spin-down하여 시료 및 용액이 tube 끝에 모이도록 만들어 주었다. Tube를 Thermomixer에 넣어 1시간 동안 가열 (1,000 rpm, 60℃)하였다. Tube에 120 mM IAA와 100 mM ABC를 포함한 용액을 10 μL 넣은 후, vortexing 후 spin-down을 수행하였다. IAA를 넣어준 tube를 은박지로 싸서 빛을 차단한 후, 상온 (25℃)에서 30분 동안 incubation 시켰다. Incubation을 마친 시료의 절반(30 μL)을 새 tube로 옮겨 담아, 각 tube에 100 μg의 단백질이 포함되도록 만들고, 각각 효소 반응을 수행할 준비를 하였다. 0.1333 μg/μL 트립신과 키모트립신을 각각 50 mM ABC에 녹여 준비하여, 각 시료의 tube에 15 μL씩 넣은 후 (효소: 단백질 = 1 : 50), vortexing 후 spin-down을 수행하였다. Thermomixer에서 4시간 동안 incubation을 수행하여, 단백질을 펩타이드화 하였다. (1,000rpm, 37℃)

MRM-MS 분석을 위한 시료 제작

트립신을 이용한 digestion반응이 끝난 시료에 10% formic acid를 5 μL 넣은 후, 약하게 vortexing 한 뒤, Thermomixer에서 30분 incubation (1,000rpm, 37℃) 하고, 원심분리 1시간 수행하였다(15,000rpm, 4℃). 원심분리 후 펠렛을 제외한 상층액 50 μL를 새tube로 옮긴 후, 또 다른 새 tube에 트립신 digestion 시료 및 키모트립신 digestion 시료를 1:1로 혼합하였다. 유리 vial에 트립신 및 키모트립신 digestion 시료의 혼합물을 47.5 μL 옮겨 주고, SIS 펩타이드 혼합물을 2.5 μL spiking하여, 총 50 μL를 만들어, 1분 가량 vortexing한 후 spin-down한 뒤, LC-MS/MS 시스템에 20 μL를 주입하였다. SIS 펩타이드 혼합물은 ANTFLEEVR와 ERECVEETCSY 펩타이드는 312.5 fmol/μL, ESSTATDVF 펩타이드는 625.0 fmol/μL, EEVRKGNL 펩타이드는 156.25 fmol/μL 의 농도를 갖도록 제작하였다.

시료 내의 펩타이드 분리 및 online desalting을 위한 액체 크로마토그래피

MRM-MS 분석을 하기에 앞서, 시료 내 존재하는 4개의 PIVKA-II 펩타이드 및 상응하는 SIS 펩타이드를 액체 크로마토그래피 (1260 Capillary-flow liquid chromatography system; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. Autosampler injector의 needle을 통하여 시료를 2개의 column으로 구성된 LC (liquid chromatography) 시스템으로 도입하였다. 시스템 상에서는 용매 A (0.1% formic acid in water)와 용매 B (0.1% formic acid in acetonitrile)가 사용되었다. 도입된 시료는 먼저 3% solvent B를 10 μL/min의 유속으로 10분 동안 guard column (Zorbax Eclipse plus-C18 2.1 ×15.0 mm, 1.8 μm, 80 Å으로 주입 되어, 시료에 포함되어있는 불순물 (여분의 rapigest 및 염(salt))을 제거하였다. 밸브를 전환 하여, guard column에 부착되어 있던 펩타이드들을 analytical column (0.5 ×35.0 mm, 3.5 μm, 80 Å으로 이동하여 부착하고, 용매 B를 3%에서 50%까지 40 μL/min의 유속으로 45분간 흘려주어, analytical column에 부착된 펩타이드의 분리를 수행하였다. 펩타이드 분리를 마친 후, 60% 용매 B를 40 μL/min의 유속으로 1.5분간 흘려주어 column 세척을 진행하고, 용매 B를 0.5 분간 60%에서 3%까지 떨어뜨리며 40 μL/min의 유속으로 column을 평형 상태로 재조정을 수행하였다. 3분 동안 3% 용매 B를 흘려주며 equilibration 후에 밸브를 original position으로 바꾸어 10분간 guard column과 analytical column의 reconditioning을 동시에 수행하였다. 즉, 총 시료 분석 시간은 70 분이 소요되었다.

MRM-MS assay 를 이용한 펩타이드 정량 분석

LC system을 통하여 분리되어 용출 된 펩타이드들은 순차적으로MS/MS 시스템(Agilent 6400 series)으로 이온화 되어 도입되었다. 이온화된 펩타이드는 Quadrupole 1 (Q1)으로 유입되고, Q1에서 특정 m/z (mass to charge ratio)를 가진 precursor ion이 선별되었다. Q1의 mass filter를 통과한 precursor ion은 Quadrupole 2 (Q2)에서 충돌 에너지에 의해 이온의 fragmentation이 일어나 product ion으로 분해되었다. 분해된 product ion은 Quadrupole 3 (Q3)로 유입되고, 이 곳에서 특정 m/z를 가진 product ion이 선별되어 detector로 이동하여 digital signal로 전환되고, peak chromatogram으로 보여지게 되었다. Peak chromatogram의 면적을 Skyline 등의 프로그램을 이용하여 계산하고, 이 값을 이용하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행하였다.

Mass spectrometry 는 Agilent technology 사의 6490-Triple quadrupole(QQQ) 장비를 이용하였으며, 선정한 transition 에 대해 MRM mode 로 monitoring 하였다. gas temperature 는 250℃, gas flow 는 15 L/min으로 사용하였으며, nebulizer 는 30 psi, sheath gas temperature 는 250℃, sheath gas flow 는 12 L/min으로 사용하였다. capillary voltage 및 nozzle voltage 는 각각 2500 V, 2000 V 로 사용하였다. Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 resolution 은 unit 으로 설정하였으며, unscheduled MRM 방식으로 dwell time 은 total cycle time이 2 seconds 정도가 되도록 설정해서, 모든 target peptide 에 대해서 분석을 한 다음, eluting 되는 retention time 을 확인하여 window size 6 minute의 scheduled MRM 으로 개별 시료 분석을 수행하였다.

결과 데이터 처리 및 통계 분석

본 LC-MS/MS 분석을 통해 분석된 raw file의 후 처리를 위해 skyline 소프트웨어에 raw file을 삽입하고, PIVKA-II 펩타이드에 대한 정량 분석 수치를 산출하기 위해, 해당 펩타이드 peak에 대한 peak integration (각 펩타이드의 retention time에 해당하는 peak을 지정)을 수행하였다. Skyline에서 계산된 retention time 내의 SIS peptide (Heavy peptide) peak과 endogenous peptide (Light peptide) peak의 면적을 얻어, SIS 펩타이드 peak에 대한 endogenous 펩타이드 peak의 면적비 (peak area ratio)를 산출하였다. PIVKA-II 펩타이드의 면적비 (light/heavy)를 이용하여 Mann-Whitney test, area under the receiver operating curve 분석, logistic regression 분석 등의 통계 분석을 IBM SPSS및 R 소프트웨어를 활용하여 수행함. 통계 분석 자료 및 결과의 시각화를 위해 R 소프트웨어 및 Prism 소프트웨어를 이용하였다.

실험결과

실시예 1. PIVKA-II 단백질형 내 비카르복실화 펩타이드의 질량분석기 검출 가능성 확인

Skyline S/W를 이용하여, 비카르복실화 PIVKA-II 단백질의 N-말단 Gla 도메인의 서열로부터 가능한 키모트립신 분해 펩타이드 5개 및 트립신 분해 펩타이드 3개를 in silico로 얻었다.

아미노산 길이가 6개 이하이거나 30개 이상인 펩타이드나 메티오닌 잔기를 포함하고 있는 펩타이드는 질량분석기를 통한 재현성있는 정량이 어렵기 때문에 제외하고, 아미노산 길이가 6개에서 30개 사이인, 메티오닌 잔기를 포함하지 않는 5개 펩타이드를 후보 펩타이드로 선정하였다.

5개의 후보 펩타이드는 2개의 트립신 분해 펩타이드 (ANTFLEEVR, ECVEETCSYEEAFEALESSTATDVFWAK)와 3개의 키모트립신 분해 펩타이드 (ERECVEETCSY, ESSTATDVF, EEVRKGNL) 를 포함하며, 각 펩타이드 서열은 Glu 잔기들이 Gla로 변화하지 않은 전구체 상태였다. (Glu-peptide로 지칭)

후보 펩타이드에 대한 동일한 서열을 가진, 펩타이드의 C-말단의 하나 이상의 아미노산의 N또는 C에 방사선 동위원소 ¹³C 또는 ¹⁵N로 표지화된 내부표준물질 (SIS) 펩타이드를 합성하였다. 합성한 5개SIS 펩타이드 혼합물을 대조군 pooling matrix에 spiking하여 Agilent 사의 6400 Series Triple quadrupole 질량분석기를 사용해 MRM-MS 방법으로 분석하여, 유의한 시그널이 검출 가능한 (detectable) 4개의 Glu-peptide를 선정 (ANTFLEEVR, ERECVEETCSY, ESSTATDVF, EEVRKGNL) 하고, 각 펩타이드에 대해 높은 intensity로 검출할 수 있는 6개의 transition을 선정하였다.

도 7에 각 펩타이드에 대한 내부표준물질의 6개 transition에 대한 크로마토그램을 나타내었다.

각 Transition에 대한 MRM-MS assay를 위한 Collision Energy 및 Q1/Q3 파라미터 정보는 다음 표 2와 같다.

이러한 결과는 PIVKA-II 단백질형에서 유래한 4개의 비카르복실화 펩타이드에 대하여, 각 6개 transition 중, 일부 또는 전부를 사용하여 질량분석기로 정량이 가능함을 나타내는 것이다. 이를 통하여, 결과적으로 PIVKA-II 단백질 형에 대한 정량 수치화가 가능하다는 것을 나타낸다.

[표 2]

실시예 2. 다중 PIVKA-II 펩타이드의 MRM-MS 분석 확립 및 역교정 (calibration) 커브 분석

표 2의 4개 펩타이드에서 얻어지는 6개의 transition 중, MRM-MS 분석 시 간섭(interference)이 없고, 검출 한계가 낮으며, 정량 가능한 범위 내에서 선형성이 가장 높은 최적의 transition 을 정량에 사용할 정량자 이온 (quantifier ion)으로 선정하기 위하여, reversed calibration curve 및 AuDIT 분석을 수행 하였다.

대조군 pooling 시료에 4개 펩타이드의 내부 표준물질 혼합물을 Serial dilution 하여 만든 15개 농도 포인트로 제작한 용액을 spiking하여, 각 포인트 별 분석 시료를 제작하고, 이를 3반복 MRM-MS 분석 수행하여, 역교정 커브를 생성하였다.

구체적으로 각 포인트에서 Spiking 하는 SIS 펩타이드의 농도 값은 20000.0, 10000.0, 5000.0, 2500.0, 1250.0, 625.0, 312.5, 156.25, 78.125, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 fmol 으로 하였다. 역교정 커브는 내부표준물질 펩타이드 (heavy) 피크에 대한 내부 (endogenous) (light) 펩타이드 피크의 피크 면적 비 (heavy/light) 의 3반복 평균값에 log₁₀을 취한 값을 각 포인트의 농도의 log₁₀값에 대하여 플로팅하였으며, 선형 회귀 분석을 수행 및 회귀식을 도출하고 linearity를 확인하였다.

더불어, pooled 간암 혈청 시료에 4개 펩타이드의 내부 표준물질 혼합물을 spiking하여 질량분석기를 이용하여 3반복으로 MRM-MS 분석을 수행한 결과를 바탕으로, AuDIT (Automated detection of inaccurate and imprecise transitions) 분석을 통해, 간섭(interference) 여부를 확인하였다.

역교정 커브 및 AuDIT 분석 결과를 통해 검출 한계가 낮으며, 정량 가능한 범위 내에서 선형성이 가장 높으며, 간섭이 없는 최적의 transition을 정량을 위하여 사용할 quantifier ion으로 선정하였다.

선정한 1개의 최적 정량자 이온에 대한 AuDIT 결과를 아래 표 3에 제시하였으며, 4개 펩타이드 각각에 대한 최적 정량자 이온 모두 AuDIT 결과에서 20% 이하의 낮은 변동성과, 간섭이 없는 상태를 갖는 것을 알 수 있었다.

[표 3]

최적 정량자 이온에 대한 역교정 커브 [표 4]를 분석하여, MRM-MS 분석을 위한 펩타이드의 검출 및 정량 한계 (LOD; Limit of detection, LOQ; Limit of quantification) 및 기타 변수 (Linearity; R², LLOQ; Lower limit of quantification, ULOQ; Upper limit of quantification)들을 도출하였다[도 8].

[표 4]

LOD는 영시료 (내부표준물질이 없는 대조군 pooling 시료)의 3반복 분석의 피크면적 비의 평균값에 3배의 표준편차를 더한 값으로 구하였다. LOQ는 영시료 (내부표준물질이 없는 대조군 pooling 시료)의 3반복 분석의 피크면적 비의 평균에 10배의 표준편차을 더한 값으로 구하였다. LLOQ는 노이즈 대비 시그널 값이 5 이상이고, 정량의 정밀성 (precision)이 20% 이하이고, 정확도 (accuracy)가 20% 이내인 가장 낮은 농도로 구하였다. ULOQ는 정량의 정밀성 (precision)이 20% 이하이고, 정확도 (accuracy)가 20% 이내인 가장 높은 농도로 구하였다.

ANTFLEEVR 펩타이드의 y6 product ion의 LOD = 20.47 fmol, LOQ = 44.41 fmol, LLOQ = 78.13 fmol, ULOQ = 10 pmol, calibration curve에 대한 추세선 식 Y=1.0309X - 2.5052의 linear regression value (R²) = 0.9991 이었고, calibration curve상의 3반복 분석 변동계수 (CV) 범위는 4.18%에서 16.76% 였다.

ERECVEETCSY 펩타이드의 y2 product ion의 LOD = 88.78 fmol, LOQ = 206.03 fmol, LLOQ = 312.50 fmol, ULOQ = 20 pmol, calibration curve에 대한 추세선 식 Y=0.9244X - 1.6296의 linear regression value (R²) = 0.9939 이었고, calibration curve상의 3반복 분석 CV 범위는 1.35%에서 19.68% 였다.

ESSTATDVF 펩타이드의 b7 product ion의 LOD = 43.43 fmol, LOQ = 61.90 fmol, LLOQ = 625.00 fmol, ULOQ = 20 pmol, calibration curve에 대한 추세선 식 Y=0.89X - 2.4551의 linear regression value (R²) = 0.9872이었고, calibration curve상의 3반복 분석 CV 범위는 3.72%에서 13.45% 였다.

EEVRKGNL 펩타이드의 b7 product ion의 LOD = 11.51 fmol, LOQ = 19.02 fmol, LLOQ = 78.13 fmol, ULOQ = 10 pmol, calibration curve에 대한 추세선 식 Y=0.9919X - 1.774의 linear regression value (R²) = 0.9952 이었고, calibration curve상의 3반복 분석 CV 범위는 3.78%에서 18.06% 였다.

실시예 3. 혈청 시료의 전처리 과정 및 MRM-MS 분석 시료 제조

개별 임상 혈청 시료 내에 존재하는 PIVKA-II 단백질로부터, 타겟 펩타이드들을 얻어 MRM-MS 분석을 수행하기 위하여, 혈청 시료 전처리를 수행하였다.

시료는 6-multiple affinity removal system (MARS)을 이용하여 혈액 내 high abundant 단백질 6개를 제거한 후 농축한 뒤, bicinchoninic acid (BCA) 분석으로 단백질 농도를 결정하여, 200 μg 을 분석에 사용하였다. [도 9]

분석할 시료에서 PIVKA-II 단백질로부터 트립신 및 키모트립신 분해 펩타이드를 동시에 얻기 위한 다중 효소 전처리 과정을 확립하였다.

다중 효소 전처리 과정을 이용해 전처리한 시료의 MRM-MS 분석 시의 재현성을 확인하기 위하여 간암 pooled 혈청 시료를 전처리하여, 1개의 트립신 분해 펩타이드와 3개의 키모트립신 분해 펩타이드를 5일 동안 3반복 분석하였을 때, 20% 이하의 낮은 변동성으로 정량 분석이 가능한 것을 확인하였다. [표 5]

[표 5]

실시예 4. 300례 개별 임상 시료에서 비카르복실화 펩타이드의 MRM-MS assay 결과

간암군과 대조군을 구분할 수 있는 PIVKA-II 다중 펩타이드 모델을 발굴하기 위하여, 100례의 간암군 시료와 200례의 대조군(만성 B형 및 C형 간염 및 간경화) 시료 내에 존재하는 4개 비카르복실화 펩타이드를 MRM-MS 분석법으로 정량 분석하였다.

시료의 전처리 및 MRM 분석 순서는 각 배치 내의 간암군 및 대조군 비율이 동일하도록 무작위로 배치한 후, 환자 군 여부를 실험자가 확인할 수 없도록 blinding 하여 분석하였다. 이를 통해서 얻어진 각 펩타이드에 대한 내인성 펩타이드의 피크 면적값을 이와 대응하는 내부 표준물질 펩타이드의 피크 면적값으로 normalization 한 Peak area ratio 값으로 정량 data를 얻었다.

전체 시료에서, 각 펩타이드에 대하여 산출된 면적비(Peak area ratio)를 정량 수치로 이용하여 비교한 결과, ANTFLEEVR, ERECVEETCSY, 및 ESSTATDVF 펩타이드가 대조군과 간암군에서 통계적으로 유의한 차이를 가지고 있음을 확인하였다 (도 2).

Mann-Whitney test에 의하여, 대조군에 비하여 간암군에서 ANTFLEEVR 펩타이드가 유의하게 감소 (P<0.01)하며 ERECVEETCSY와 ESSTATDVF 펩타이드가 유의하게 증가 (P<0.0001)하는 것으로 분석되었다.

실시예 5. 간암 고위험군으로부터 조기 간암을 구분하는 최적의 PIVKA-II 다중펩타이드 로지스틱 모델을 구축

상기 분석한 300개의 개별 시료를 훈련 세트 (총 210례; 간암군 70례, 대조군 140례) 와 테스트 세트 (총 90례; (환자군 30례, 대조군 60례) 로 무작위 구성하였다. MRM-MS 기반 PIVKA-II 다중 펩타이드 모델을 구축하기 위하여 훈련 세트 210례의 정량 분석 결과 (각 펩타이드의 면적비, Peak area ratio)를 이용하여, 기계학습 방법인 로지스틱 회귀분석(Logistic regression) 기반으로 Stepwise selection 및 10-fold cross validation (100번 반복 분석) 방법을 통해 3개 펩타이드가 조합된 최적의 PIVKA-II 3-Glu-peptide 로지스틱 모델을 개발하였다.

PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델에 각 3개 펩타이드의 정량 수치(Peak area ratio)를 대입하여 계산된 확률 값 (0~1)을 이용하여, 간암일 위험성을 계산할 수 있었다.

상기 모델에서 계산된 확률 값 (p)이 절단 값 (cutoff value)보다 클 경우, 이는 간암 양성으로 간주되며, 절단 값 (cutoff value)은 원하는 민감도 및 특이도에 따라 선택될 수 있었다. 펩타이드의 정량 수치에 따른 간암 양성의 확률은 아래 로지스틱 함수식으로 계산 되었다.

회귀 계수는 [표 6]와 같이 최적화되어 얻어졌다.

[표 6]

간암일 확률의 절단 값은 특이도와 민감도의 합이 최대가 되는 점을 구하는 Youden index 방법을 이용하여 0.60635으로 결정하였으며, 절단 값에서의 민감도는 90.0%, 특이도는 71.4%였다.

각 회귀 계수 및 절편 값을 이용하여, 건강 상태에 대한 정보가 없는, 임의의 개체에 적용해 환자의 건강 상태에 대한 확률 값을 도출하고, 이 값을 절단 값과 비교하여 간암 여부를 진단하기 위하여 사용할 수 있었다.

훈련세트(Training set)에서 PIVKA-II 단일 ERECVEETCSY 펩타이드 MRM-MS assay 분석법의 진단적 성능은 AUC 0.801이었던 반면, 본 발명을 통해 개발된 3-Glu-peptide 모델은 AUC 0.873으로 향상됨을 확인하였다 (DeLong`s test, P < 0.05). [도 10]

본 훈련 세트에서 개발된 3-Glu-peptide 모델을 평가 세트(Test set)에서 적용하였을 경우에도, AUC 0.844 의 진단적 성능을 얻을 수 있었으며, 이는 단일 ERECVEETCSY 펩타이드 분석법의 진단적 성능(AUC 0.721)에 비해 향상된 것임을 확인하였다 (DeLong`s test, P < 0.05).

즉, 훈련 세트 및 평가 세트에서, 3-Glu-peptide 모델을 구성하는 3개의 각 개별 펩타이드의 진단적 성능보다도 세 개 펩타이드를 조합한 3-Glu-peptide 모델의 진단적 성능이 유의하게 우수한 것을 확인하였다 (DeLong`s test, P < 0.05).

실시예 6. PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델과 기존 마커인 AFP의 효용성 비교 및 이를 결합한 조합 모델의 효용성 확인

현재 간암 진단의 혈액 마커로 쓰이고 있는 AFP 단독의 진단적 구분력과, 본원에서 개발된 PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델의 진단적 구분력을 통계적으로 비교한 결과, 훈련세트와 평가 세트 모두에서 유의한 차이 (DeLong’Test, 각각 P < 0.01, P < 0.001)로 본원의 PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델에서 진단적 구분력이 우수한 것임을 확인하였다.

AFP 정량은 대조군 및 간암군 검체에서 얻은 혈청 시료에 대하여, chemiluminescent microparticle immunoassay (ARCHITECT i2000SR; Abbott, Chicago, IL) 방법으로 측정되었다. AFP 정량 값을 이용하여, 기계학습 방법인 로지스틱 회귀분석(Logistic regression) 기반으로 Stepwise selection 및 10-fold cross validation (100번 반복 분석) 방법을 통해 로지스틱 모델을 개발하였다. AFP 정량 수치에 따른 간암 양성의 확률은 아래 로지스틱 함수식으로 계산 되었으며, 계산된 확률 값 (0~1)을 이용하여, AFP 단독의 진단적 구분력을 확인하였다.

회귀 계수는 [표 7]와 같이 최적화되어 얻어졌다.

[표 7]

PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델의 AFP와의 보완적 마커로서의 특성을 알아보기 위하여 개발된 PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델과 AFP을 결합하여 조합 모델을 만들어, 훈련 세트 및 평가 세트에서의 검증 작업을 동일하게 수행하였다.

조합 모델은, 3-Glu-peptide 모델의 로지스틱 함수식으로 계산된 간암 양성의 확률(P)과, AFP 정량 수치에 대한 로지스틱 함수식으로 계산된 간암 양성의 확률(P)을 이용하여 계산한 logit(P) 값 [ln (P/(1-P))]을 로지스틱 회귀분석(Logistic regression)을 통해 결합하여 만들었다. 부트(boot) 샘플링 방법(10 fold)을 이용하여, ROC 값이 최적인 모델로 조합 모델을 개발하였으며, 조합 모델을 이용한 간암 양성인 확률은 하기 로지스틱 회귀 함수식을 이용하여 계산되었다.

회귀 계수는 아래 [표 8]과 같이 최적화되어 얻어졌다.

[표 8]

그 결과, AFP와 PIVKA-II 3-Glu-peptide를 결합한 조합 모델은 훈련 세트에서 AUC=0.903, 평가 세트에서 AUC=0.913의 성능을 가지는 것을 확인하여, AFP에 대하여 상호 보완적으로 진단 능력을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. [도 3]

실시예 7. 외부 코호트의 318례 시료를 이용한 MRM-MS 분석 기반 PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델의 효용성 검증 (Validation)

PIVKA-II 다중 펩타이드 분석의 일반성 및 신뢰성을 높이며, 서로 다른 코호트에 적용 가능한 임상적 유용성을 확보하기 위해 단일 기관 독립 검증 세트(independent validation set)에서 진단적 성능의 평가를 진행하였다.

본원의 3-Glu-peptide 모델의 구축에 사용되지 않은 외부 코호트로부터 구성된, 184례의 간암군 시료 및 134례의 대조군(만성 B형 및 C형 간염 및 간경화) 시료, 총 318개의 시료를 독립 검증 세트로 구성하여, MRM-MS 기반 PIVKA-II 3-Glu-peptide 모델의 성능을 검증하였다.

그 결과 독립 검증 세트에서의 진단적 성능은 AUC 0.793으로, PIVKA-II 단일 ERECVEETCSY 펩타이드 MRM-MS assay 분석법의 진단적 성능 (AUC 0.714)보다 유의하게 향상됨을 확인하였다. [도 4]

구축한 3-Glu-peptide 모델과 기존 마커인 AFP를 결합한 조합 모델 또한, 독립 검증 세트에서 AUC 0.863로, 기존 PIVKA-II 단일 펩타이드 MRM-MS assay 분석법에 비해 향상된 진단적 구분력을 가짐을 확인하였다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Method of quantification of inclusive PIVKA-II proteoforms based on mass spectrometry and it use for diagnosis of liver cancer <130> DP202104003P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe 1 5

Claims (11)

1. 간암 고위험군으로부터 조기 간암 진단에 대한 정보를 제공하기 위해, 인비트로에서 PIVKA-II 단백질을 정량하는 방법으로,
   간암 고위험군으로부터 외부로 분리된 검체를 제공하는 단계;
   상기 검체로부터 단백질 분해물을 제조하는 단계;
   상기 단백질 분해물에 내부 표준물질을 혼합하는 단계;
   상기 혼합물에서 상기 PIVKA-II 단백질에 존재하는 3개의 Glu-펩타이드 단편의 양 및 상기 내부 표준물질의 양을 질량분석으로 결정하는 단계; 및
   상기 결정된 3개의 Glu-펩타이드 단편의 양을 상기 내부 표준물질의 양으로 표준화하여, 표준화된 PIVKA-II 단백질 양을 결정하는 단계를 포함하며,
   상기 간암 고위험군은 만성 간염 또는 간경화 환자를 포함하며,
   상기 Glu-펩타이드 단편의 아미노산 서열은 ANTFLEEVR (서열번호 1), ERECVEETCSY(서열번호 2), 및 ESSTATDVF(서열번호 3)이고,
   상기 PIVKA-II 단백질은 상기 3개의 Glu-펩타이드의 글루탐산 잔기에서 카르복시기로 변형이 일어나지 않은 상태의 Glu-펩타이드를 포함하는 PIVKA-II 단백질인, 간암 고위험군의 PIVKA-II 단백질 발현량을 측정하는 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 검체는 간 조직 또는 혈액인 간암 고위험군의 PIVKA-II 단백질 발현량을 측정하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 간암 고위험군의 PIVKA-II 단백질 발현량을 측정하는 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)인 것인, 간암 고위험군의 PIVKA-II 단백질 발현량을 측정하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 단백질 분해물은 단백질 분해효소로서 트립신 및 키모트립신을 이용하여 제조된 것인, 간암 고위험군의 PIVKA-II 단백질 발현량을 측정하는 방법.
   
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 방법은 MRM 모드로 수행되며,
   이 경우 상기 서열번호 1의 펩타이드의 양은 고유질량 값 539.780++의 상기 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y6, 792.4250+; y7, 893.4727+; y5, 645.3566+; y4, 532.2726+; b8, 904.4411+; b8, 452.7242++)의 피크 면적을, 고유질량 값 544.784++의 내부 표준물질 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y6, 802.4333+; y7, 903.4810+; y5, 655.3649+; y4, 542.2808+; b8, 904.4411+; b8, 452.7242++)의 피크 면적으로 나눈 것으로 결정되고,
   상기 서열번호 2의 펩타이드의 양은 고유질량 값 731.285++의 상기 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y2, 269.1132+; y4, 530.1915+; y1, 182.0812+; b5, 674.2926+; b7, 932.3778+; b10, 1280.4882+)의 피크 면적을, 고유질량 값 736.298++의 내부 표준물질 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(y2, 279.1404+; y4, 540.2188+; y1, 192.1084+; b5, 674.2926+; b7, 932.3778+; b10, 1280.4882+)의 피크 면적으로 나눈 것으로 결정되고,
   상기 서열번호 3의 펩타이드의 양은 고유질량 값 478.714++의 상기 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(b7, 692.2733+; b5, 476.1987+; b6, 577.2464+; b8, 791.3418+; y4, 481.2293+; y3, 380.1816+)의 피크 면적을, 고유질량 값 483.728++의 내부 표준물질 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 6개(b7, 692.2733+; b5, 476.1987+; b6, 577.2464+; b8, 791.3418+; y4, 491.2565+; y3, 390.2088+)의 피크 면적으로 나눈 것으로 결정되는 것인, 방법.
   
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 결정된 상기 표준화된 3개의 Glu-펩타이드의 정량 수치의 조합을 간암 고위험군 검체의 조기 간암 발생과 연관시키는 단계를 포함하는, 간암 고위험군의 간암 조기 진단을 위해 정보를 제공하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 연관시키는 단계에서 상기 각 Glu-펩타이드의 정량 수치는 하기 로지스틱 식에 대입되어 간암 양성 확률로 결정되는 단계를 포함하는 것인, 방법:
   

   

   
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 간암 양성 확률의 최적 컷오프 값은 상기 표준화된 펩타이드 정량분석 수치를 이용한 ROC커브 분석에 의해 결정된 특이도 및 민감도를 이용한 Youden index (민감도 + 특이도 -1)를 이용하여 결정되며,
   상기 ROC 커브는 컷오프 값에 따른 민감도와 특이도 값을 이용하여 작성되며,
   상기 민감도 및 특이도는 대조군인 간암이 발생하지 않은 간경화 또는 간염의 간암 고위험군 검체와, 간암군 검체에서 결정된 상기 3개의 표준화된 Glu-펩타이드의 정량 수치의 조합을 상기 로지스틱 함수식에 대입하여 얻은 값을, 각 컷오프 값과 비교하여 결정한 예측된 간암 여부와, 실제 간암 여부를 비교하여 결정되는 것인,
   간암 고위험군의 간암 조기 진단을 위해 정보를 제공하는 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 컷오프 값은 간암 양성 확률 0.60635으로, 해당 값 이상을 가질 경우 간암 양성으로 판단하는 것인, 방법.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 방법은 간암 마커로서 AFP 발현량에 대한 정보를 추가로 포함하며,
    상기 연관시키는 단계에서 상기 AFP 발현량은 상기 각 Glu-펩타이드의 정량 수치에 상기 AFP 발현량에 대한 정보를 통합한 하기 로지스틱 함수식으로 계산되는 것인, 방법:
    

    

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