KR102445087B1 - 통증 관리용 제형 - Google Patents

Abstract

통증을 경험하는 개체에 의해 사용하기 위한 통증 관리용 제형이 기술된다. 하나 이상의 부형제, 희석제 또는 담체가 상기 제형이 포함된다. 제형으로 관리될 통증의 유형에 암, 부상, 사고, 수술, 신경병증성 통증 또는 조직 손상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 주요 칸나비노이드들은 5:5:5 내지 5:1:5 범위의 THC:CBC:CBD의 비에 따른 양으로 존재한다. 5:5:5 mg 이상의 CBD:CBC:THC가 포함될 수 있는 제형의 사용방법, 용량, 투여 형태들이 기술된다.

Description

통증 관리용 제형

관련 출원 상호 참조

본 출원은 2019년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/842,696호 및 2020년 4월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/011,508호의 우선권 이익을 주장하고, 둘 모두의 내용은 여기에 참조로 포함된다.

기술분야

본 개시는 일반적으로 의약 용도용 제형에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 개시내용은 통증 관리에 사용하기 위한 칸나비노이드 제형에 관한 것이다.

통증을 관리하는 개체(individual)들은 흔히 통증 완화를 제공하는 의학적 옵션들에 의지하지만, 이 의학적 옵션들은 위장 질환, 변비 및 중독 위험과 같은 의도치 않은 부작용을 동반한다. 아편제 약물에 대한 대안이 시급하다.

칸나비노이드들(Cannabinoids)은 칸나비스 식물들로부터 분리된 구조적으로 유사한 화합물들의 그룹이고, 세포의 칸나비노이드 수용체 및 이온 채널을 활성화한다. 칸나비노이드는 칸나비스 식물 또는 식물 추출물(본 명세서에서: 칸나비노이드-함유 식물 추출물)로부터 합성되거나 분리될 수 있다. 칸나비노이드들은, 다른 자연 발생 화합물들(예를 들면 다른 칸나비노이드들 또는 테르펜(terpenes)과 같은 식물-유래 분자들)의 상당한 양이 없는 거의 순수한 형태, 또는 본질적으로 순수한 형태로 수득될 정도로 식물 또는 추출물로부터 분리될 수 있다. 공지된 칸나비노이드는 테트라하이드로칸나비놀(tetrahydrocannabinol; THC); 칸나비디올(cannabidiol; CBD), 칸나비크로멘(cannabichromene; CBC); 테트라하이드로칸나비디바린(tetrahydrocannabidivarin; THCV); 테트라하이드로칸나비놀산(tetrahydrocannabinolic acid; THCA); 칸나비제롤(cannabigerol; CBG); 칸나비디바린(cannabidivarin; CBDV), 칸나비놀(cannabinol; CBN), 및 칸나비디올산(cannabidiolic acid; CBDA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 칸나비스 식물은, 상이한 목적에 따라 바람직하게, 상이한 양의 특정 칸나비노이드를 갖도록 육종될 수 있다. THC와 CBD는, 현재까지, 칸나비노이드의 주요 관심 대상으로 여겨졌다.

의약 효과에 대해 CBD는 널리 연구되었다. CBD는 5HT1A 수용체-매개 신경 전달뿐만 아니라, CB1- 및 CB2- 매개 반응을 용이하게 하는, 아난다미드(anandamide) 대사 및 TRPV1 수용체 채널의 활성화에 영향을 미치는 것으로 여겨진다(Crippa JS 2018).

Δ ⁹ -THC는 CB1 및 CB2 수용체에 대한 부분 작용 활성(partial agonistic activity)을 나타내며, CB1 수용체와의 높은 결합 친화도는 정신 활성(psychoactive activity)을 생성한다.

칸나비크로멘(CBC)은 칸나비스 사티바(Cannabis sativa) 식물에서 자연적으로 발견되는 주요 비-향정신성 칸나비노이드이다(Elsohly M 2014).

하지만, 칸나비스 식물에서 이 칸나비노이드들 각각의 비율은 환경 성장 조건, 지리적 위치, 유전학 및 화학형(chemotype)에 따라 다르다(Lewis M A 2017).

CBC는 CB2 수용체에 대해서만 중간 친화도(Ki ~ 100 나노몰)를 가지고 1 마이크로몰 초과의 농도에서만 CB1 수용체에 결합한다(Shinjyo N 2013). 뇌에서의 주요 CBC 활성은 아난다미드의 세포 흡수 억제(De Petrocellis L 2011) 및 TRPA1(일과성 수용체 전압 A1) 채널의 활성화에 의한 CB1 수용체의 간접적인 활성화에 부분적으로 의존하는 것으로 제안되었다(Izzo and Capasso R 2012). 사실, CBC는 TRPA1 채널에서 모든 식물칸나비노이드 중 가장 강력한 작용제인 것으로 밝혀졌다(Maione S 2011). CBC는 또한 항염증 효과를 보여줬다(Izzo and Capasso R 2012).

CBD는 Δ⁹-THC와 시너지 작용을 하고 의약용(medicinal-based) 칸나비스 추출물의 진통 효과에 기여할 수 있음이 입증되었다(Russo 2011).

CBC의 CB1 및 CB2 수용체와의 작용 활성은 CB1 및 CB2 수용체의 결합 및 활성화를 통해 활성을 나타내는 다른 칸나비노이드들의 효과를 강화시키는 유망한 접근을 제공할 수 있다.

칸나비노이드의 의약 용도는 공지되어 있고, 특히 통증을 치료하기 위한 제형이 기술되었다. WO2007/083098 A1(GW Pharma Ltd)은 신경세포 퇴행 치료용 칸나비노이드 함유 식물 추출물을 기술한다. 미국 특허 공개공보 제US2016/0106705호(United Cannabis Corp.)는 불안, 통증 및 관련 질환을 완화하는데 사용하기 위한 4 이상의 칸나비노이드들 및 테르펜 또는 플라보노이드(flavonoid)를 갖는 칸나비스 추출물들을 기술한다. WO2016/044370 A1(India Globalization Capital Inc.)은 THC, CBD 및 코발라민(cobalamin)의 조합을 함유하는 국소 통증 완화 제형을 교시하고 있다. WO2013/165251 A1(ECHO Pharmaceuticals BV)은 오직 소량의 CBN 또는 CBD를 가질 수 있는 THC-함유 분리물(isolate)을 수득하기 위한 박막 증발 방법(thin film evaporation method)을 기술한다. WO2012/144892 A1(Fytagoras BV)에서, 질병에 대한 동물의 자연적인 세포 저항성을 향상시키기 위한, THC, CBD 및 기타 칸나비노이드와 같은 산성 칸나비노이드들의 용도가 기술된다. 또한, WO2012/160358 A1(GW Pharma Ltd.)에서, 신경병증성 통증의 치료로서 CBG, CBC, CBDV 및 THCV 중 적어도 하나의 용도가 기재되어 있다.

의약 용도를 위한 칸나비노이드 조합의 가능성은 완전히 탐구되지 않았다. 통증 관리에 사용하기 위한 유익한 특성을 갖는 칸나비노이드 제형을 제공하는 것이 바람직하다.

본 개시의 목적은, 통증 관리 및 통증 치료를 위한 이전의 제형의 하나 이상의 단점들을 제거하거나 완화하는 것이다.

상기 제형은, 칸나비디올(CBD), (-)-트랜스-델타-9-테트라하이드로칸나비놀(Δ⁹-THC, 또는 본 명세서에서 "THC"), 및 칸나비크로멘(CBC)을 이들을 필요로 하는 개체의 통증을 관리 또는 치료하기 위한 양으로 포함한다. 제형은 하나 이상의 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 주요 칸나비노이드들(primary cannabinoids)로서 THC, CBC 및 CBD를 포함한다. 주요 칸나비노이드들은, 주요 칸나비노이드들 총량의 중량% 기준으로, 하기를 포함하거나 하기로 이루어진다: 30% - 45% THC; 9% - 35% CBC; 및 30% - 45% CBD. 상기 제형으로 관리될 통증의 유형은 암, 부상, 사고, 수술, 염증, 조직 손상, 관절염, 관절 통증, 감염으로 인한 통증, 위장 통증, 당뇨병, 당뇨병 신경병증, 대상포진 후 신경통(post-shingles neuralgia), 신경병증성 통증, 말초 신경병증 또는 다발성 경화증으로 인한 통증의 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 주요 칸나비노이드들의 예시적인 비는, 예를 들면: 5:1:5 또는 5:5:5의 THC:CBC:CBD일 수 있다.

본 개시의 다른 양태 및 특징은 특정 구현예의 하기 설명을 검토하면 당업자에게 명백해질 것이다.

이제 본 개시내용의 구현예들은 첨부된 도면들을 참조하여 단지 예시로서 기술될 것이다.
도 1은 실시예 4에 기재된 행동 단계(behavioral phase)에 대한 연구 개략도를 보여준다.
도 2는 실시예 4에서 동물의 발바닥에 대한 폰 프레이 테스트(von Frey test)에 사용된 테스트 부위를 나타낸다.
도 3a는 MotoRater 관찰을 위한 움직임과 관련된, 동물 신체 부위의 사진을 나타낸다.
도 3b는 신경병증성 통증의 모델로서, 쥐의 척추 신경 결찰(spinal nerve ligation; SNL) 수술 후 동물 움직임 매개변수의 기준선으로부터의 변화를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 모의 수술(sham) 쥐 대 SNL 쥐 모델에 대한 기준선으로부터의 전체 보행 점수의 변화(gait overall score changes)의 비교를 제공한다.
도 5는 SNL 수술을 받은 SD 쥐의 체중에 대한 1-3 칸나비노이드들의 개별 용량(distinct dose)의 효과를 보여주는 시간 경과에 따른 체중 변화를 나타낸다.
도 6은 발 회피반응 역치(paw withdrawal threshold; PWT)를 사용한, 쥐에서 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 상이한 칸나비노이드 제형들의 효과를 나타낸다.
도 7은 5 mg/Kg의 상이한 칸나비노이드들을 복용하는 동물의 아집단의 도 6에 대한 곡선 아래 면적(Area Under the Curve; AUC) 및 전자 폰 프레이 테스트(electronic von Frey test)에 대한 치료 그룹 대 비히클(vehicle)의 통계학적 유의도를 나타낸다.
도 8은 evF 변화에 의해 측정된 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량의 효과를 보여준다. A는 공통되는 기간 동안의 상이한 치료 그룹들을 비교하는 반면, B는 시간 경과에 따른 치료 그룹 내 비교를 나타낸다.
도 9는 SNL 쥐들에서 치료 후 7일차 내지 9일차의 전체 보행 점수를 보여준다. A는 공통되는 기간 동안의 상이한 치료 그룹들을 비교하는 반면, B는 시간 경과에 따른 치료 그룹 내 비교를 나타낸다.
도 10a는 모든 연구 그룹들에서 기준선(BL)과 D7의 차이의 주성분 분석(Principle component analysis; PCA)에 기초한, SNL 유도된 운동 표현형을 나타내는 판별 벡터 막대 그래프(discriminant vector bar graph)를 나타낸다.
도 10b는 척추 신경 결찰 부위의 해부학 도면이다.
도 10c는 미세 운동 운동역학적 보행 분석 프로토콜 및 매개변수들의 흐름도를 나타낸다.
도 11은 10 mg/kg의 상이한 칸나비노이드 제형을 복용하는 동물의 아집단에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 나타낸다. 상단은 시간 경과에 따른 치료 그룹 내 기준선으로부터의 백분율을 보여준다.
도 12는 evF에 의해 측정된 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량의 효과를 나타낸다. A는 각 시점에서 상이한 치료들의 비교를 나타내고; B는 시간 경과에 따른 치료 그룹 내의 비교를 나타낸다.
도 13은 시간 경과에 따라 비교한, evF를 사용한 기계적 과민증에 대한 칸나비노이드 제형들의 다수의 개별 용량의 효과를 보여준다. A는 치료 그룹들 사이의 비교를 나타내는 반면, B는 시간 경과에 따른 치료 그룹 내 비교를 나타낸다.
도 14는 evF에 의해 측정된 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량의 효과를 나타낸다.
도 15는 SNL을 갖는 동물의 전체 보행 점수(overall gait scores)를 보여준다. A는 치료 그룹들 사이에서 비교하는 반면, B는 시간 경과에 따라 치료 그룹 내에서 비교한다.
도 16은, 기준선, 투여 후 D7, D8-5h, D8-9h 및 D9에, CBC를 CBD+THC에 첨가하는 효과를 나타내는, 운동역학적 보행 매개변수 대표값들(representatives)을 나타낸다.
도 17은 3000μM 머스타드 오일을 적용하여 생성된 전류의 대표 트레이스(representative trace)를 보여준다.
도 18은 이온 채널 연구 설계의 특정 양태들의 개략도를 제공한다.
도 19a는 A 내지 F에서 작용제 효과(agonist effects)의 CBD+THC 농도 반응 곡선을 보여주는 TRPA1 수용체에서의 화합물 활성의 플롯 표현 및 수치 정보를 제공한다.
도 19b는 G 내지 L에서 작용제 효과의 CBD+THC 농도 반응 곡선을 보여주는 TRPA1 수용체에서의 화합물의 활성의 플롯 표현 및 수치 정보를 제공한다.
도 20a는 A 내지 F에서 작용제 효과의 CBC 반응 곡선에 대한 TRPA1 수용체에서의 화합물 활성의 플롯 및 수치 정보를 보여준다.
도 20b는 G 내지 L에서 작용제 효과의 CBC 반응 곡선에 대한 TRPA1 수용체에서의 화합물 활성의 플롯 및 수치 정보를 제공한다.

일반적으로, 본 개시는 통증 관리용 제형 및 통증 관리를 위한 방법을 제공한다.

다른 칸나비노이드들 또한 존재할 수 있지만, 상기 제형은 세 주요 칸나비노이드 성분들을 함유한다. 세 주요 칸나비노이드 성분들의 경우, 서로에 대한 비는 서로에 대해 최적화되었다. 하기 주요 칸나비노이드 성분들이 상기 제형에 존재한다: 본 명세서에서 "THC"로 지칭되는 (-)-트랜스-델타-9-테트라하이드로칸나비놀(Δ⁹-THC), 칸나비크로멘(CBC) 및 칸나비디올(CBD). 주요 칸나비노이드 성분들의 백분율로 서로에 대해 상대적으로 표시되는, 제형에 존재하는 THC:CBC:CBD의 양(퍼센트 wt/wt 기준)은 30% - 45% THC; 9% - 35% CBC 및 30% - 45% CBD일 수 있다.

이러한 범위들을 비로 표현할 때, 예시적인 비가 사용될 수 있다. THC, CBC 및 CBD은 약 5:1:5 내지 5:5:5 범위의 비다.

이러한 비들(ratios) 내의 투여량은, mg 양으로, 예를 들면 하기와 같을 수 있다: 용량당 5 mg THC, 1 - 5 mg CBC 및 5 mg CBD. 용량당 더 많은 양이지만 유사한 비로 용량당 8 mg THC, 1.6 - 8 mg CBC 및 8 mg CBD일 수 있다. 용량당 더 적은 양이지만 유사한 비로 3mg THC, 2mg CBC 및 3mg CBD일 수 있다. 다양한 상이한 비들이 가능하다.

이 제형에서 주로 변경되는 것은 칸나비크로멘(CBC) 함량인 반면, THC 및 CBD 함량은 일반적으로 CBC의 양과 동일하거나 이보다 많은, 유사한 양으로 제공된다. 따라서, 예를 들면, CBC는 THC 및 CBD 양보다 적은(약 1/5만큼 적은) 양으로 존재할 수 있으며, 대안적으로, 세 주요 칸나비노이드 성분들 모두가 대략 유사한 양으로 존재할 수 있다.

따라서, 통증 관리가 필요한 대상체에 의한 통증 관리 방법에 사용하기 위한 제형이 제공되며, 상기 제형은 주요 칸나비노이드들로서 테트라하이드로칸나비놀(THC), 칸나비크로멘(CBC), 및 칸나비디올(CBD), 및 부형제를 포함하고; 이때 주요 칸나비노이드들은 중량% 기준으로, 하기를 포함하거나 하기로 이루어진다:

30% - 45% THC;

9% - 35% CBC; 및

30% - 45% CBD.

또한, 상기 제형은 암, 부상, 사고, 수술, 염증, 조직 손상, 관절염, 관절 통증, 감염으로 인한 통증, 위장 통증, 당뇨병, 당뇨병 신경병증, 대상포진 후 신경통, 신경병증성 통증, 말초 신경병증 또는 다발성 경화증으로 인한 통증의 관리에 사용될 수 있다.

주요 칸나비노이드들은 5:5:5 내지 5:1:5 범위의 THC:CBC:CBD 비에 따른 양으로 제형에 존재할 수 있다.

제형은 환제, 정제, 젤 캡슐제, 시럽제, 오일계 스프레이(oil-based spray) 및 액상 오일 형태로 이루어진 군에서 선택되는 투여 형태(dosage form)로 제조될 수 있다.

제형은 용량당 약 1 mg 내지 약 25 mg, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 20 mg의 주요 칸나비노이드의 총량을 제공할 수 있다. 예를 들면, 제형은 용량당 최대 20:20:20 mg, 바람직하게는 용량당 5:5:5 내지 10:10:10 mg 범위의 양으로 THC:CBC:CBD를 대상체에 제공할 수 있다.

통증 관리를 필요로 하는 대상체의 통증 관리를 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 주요 칸나비노이드들인 테트라하이드로칸나비놀(THC), 칸나비크로멘(CBC), 및 칸나비디올(CBD)을 포함하는 제형 및 부형제의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고; 이때 주요 칸나비노이드들은 중량% 기준으로, 하기를 포함하거나 하기로 이루어진다:

30% - 45% THC;

9% - 35% CBC; 및

30% - 45% CBD.

상기 방법에 따르면, 관리해야 할 통증은 암, 부상, 사고, 수술, 염증, 조직 손상, 관절염, 관절 통증, 감염으로 인한 통증, 위장 통증, 당뇨병, 당뇨병 신경병증, 대상포진 후 신경통, 신경병증성 통증, 말초 신경병증 또는 다발성 경화증으로 인한 통증일 수 있다.

상기 방법들에 사용되는 제형은 주요 칸나비노이드가 5:5:5 내지 5:1:5 범위의 THC:CBC:CBD 비에 따른 양으로 존재하는 제형일 수 있다. 상기 방법에서, 제형은 환제, 정제, 젤 캡슐제, 시럽제, 오일계 스프레이 및 액상 오일 형태로 이루어진 군에서 선택되는 투여 형태로 투여될 수 있다. 상기 방법은 용량당 약 1 mg 내지 약 25 mg, 바람직하게는 용량당 약 5 mg 내지 약 20 mg의 주요 칸나비노이드의 총량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 제형은 용량당 최대 20:20:20 mg, 바람직하게는 5:5:5 내지 10:10:10 mg 범위의 양으로 THC:CBC:CBD가 대상체에 제공되는 양으로 투여될 수 있다.

제형의 용도가 본원에 기재되어 있으며, 상기 제형은 주요 칸나비노이드들인 테트라하이드로칸나비놀(THC), 칸나비크로멘(CBC) 및 칸나비디올(CBD), 및 부형제를 포함한다. 상기 용도는 통증 관리를 위한 것이거나, 통증 관리를 필요로 하는 대상체의 통증 관리를 위한 약제의 제조를 위한 것이고, 제형에 사용되는 주요 칸나비노이드들은 중량% 기준으로, 하기를 포함하거나 하기로 이루어진다:

30% - 45% THC;

9% - 35% CBC; 및

30% - 45% CBD.

상기 용도는 암, 부상, 사고, 수술, 염증, 조직 손상, 관절염, 관절 통증, 감염으로 인한 통증, 위장 통증, 당뇨병, 당뇨병 신경병증, 대상포진 후 신경통, 신경병증성 통증, 말초 신경병증 또는 다발성 경화증으로 인한 통증의 관리를 위한 것일 수 있다.

주요 칸나비노이드들은 5:5:5 내지 5:1:5 범위의 THC:CBC:CBD 비에 따른 양으로 제형에 사용될 수 있다.

상기 제형은 환제, 정제, 젤 캡슐제, 시럽제, 오일계 스프레이 및 액상 오일 형태로 이루어진 군에서 선택되는 투여 형태로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 기재된 것과 같이, 상기 제형은 용량당 약 1 mg 내지 약 25 mg, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 20 mg의 주요 칸나비노이드의 총량을 제공할 수 있다. 또한, 제형은 용량당 최대 20:20:20 mg, 바람직하게는 5:5:5 내지 10:10:10 mg 범위의 양으로 THC:CBC:CBD를 대상체에 제공하는 데 사용될 수 있다.

주요 칸나비노이드들. 용어 "주요(primary)"는 본 명세서에서 기재된 것과 같이, 통증 관리의 의도된 효과에 주된 책임이 있는 칸나비노이드들을 나타내는 것을 의미한다. THC, CBC 및 CBD는 이러한 맥락에서 주요 칸나비노이드들이다. 또 다른 칸나비노이드가 제형에 더 적거나, 대략적으로 유사하거나, 심지어 더 많은 양으로 존재하는 경우, 이러한 추가의 칸나비노이드들이 존재할 수 있지만, 그 존재하는 양이 제형의 "주요" 성분임을 의미하지는 않는다.

칸나비노이드 공급원. 주요 칸나비노이드들 THC, CBC 및 CBD는 천연 공급원, 예를 들면 하나 이상의 칸나비스 식물들, 특히 이들의 추출물로부터 얻은 제형에 존재할 수 있다. 또는 칸나비노이드는 하나 이상의 분리된 공급원들, 또는 하나 이상의 바람직한 칸나비노이드들이 합성되는 합성 공급원으로부터 수득될 수 있다. 천연 및 합성 칸나비노이드들의 혼합물은, 가변적인 함량의 천연 공급원(성장 조건 또는 기타 이유로 인해)이 합성 또는 분리된 공급원의 조정을 사용하여 미리 결정된 양으로 표준화될 수 있도록 사용될 수 있다.

추출물은, 존재하는 임의의 주요 칸나비노이드의 양을 극적으로 변경하거나 보충할 필요 없이, 바람직한 주요 칸나비노이드 비에 특히 적합한 칸나비노이드 비를 생산하는데 도움이 되는 조건 하에서 특별히 변형되거나 성장된 식물에서 얻을 수 있다.

칸나비노이드의 정제가 바람직한 경우, 에탄올 추출 또는 CO₂ 기반 추출(CO₂ based extraction)과 같은 추출 방법이 사용될 수 있다.

식물들은 육종되거나 배양될 수 있고, 또는 성장 조건들은 THC:CBC:CBD의 필수 비(requisite ratio)를 반영하도록 최적화될 수 있다. 또한, 의도된 비와 다른 비를 갖는 둘 이상의 식물들 또는 추출물들은 미리 결정된 바람직한 비를 생성하는 양으로 조합될 수 있다.

다른 칸나비노이드들이 제형에 부수적으로 존재할 수 있고, 존재하는 경우, 이러한 추가 칸나비노이드 성분들의 양은 제형의 통증 관리 특징들을 감소시키지 않을 것이다.

통증 관리. 통증 관리용 제형의 의도된 용도는 암 관련 통증뿐만 아니라 암과 관련 없는 통증(non-cancer-related pain), 예를 들면 부상, 사고, 수술, 염증으로 인한 급성 통증, 또는 관절염 및 관절 통증과 같은 조직 손상 상태로 인한 급성 통증, 감염, 위장 통증, 당뇨병, 당뇨병 신경병증, 대상포진 후 신경통, 신경병증성 통증, 말초 신경병증, 다발성 경화증으로 인한 통증 또는 통증의 기타 공급원으로부터의 암과 관련 없는 통증을 포함할 수 있다. 말초 통각수용 감각 섬유의 흥분성의 증가에 기인할 수 있는, 염증성 통증, 신경병증성 통증, 또는 염증이 기저 원인에 기여하는 통증은 본 제형에 의해 해결될 수 있다. 통증을 유발하는, 감각 뉴런에서의 이온 채널의 변경된 활성은 감소될 수 있다. 이는 만성 염증과 관련된 다수의 상태들을 해결할 수 있다.

대상체 및 인구. 상기 제형은 인간 또는 애완동물(개 또는 고양이와 같은 반려 동물)뿐만 아니라 말과 같은 작업 동물(working animals)에 의해 사용될 수 있다.

의도된 적응증의 통증 관리를 위해 치료 효과를 필요로 하는 대상체는 의학적 사건 또는 필요가 발생하기 전에, 도중에 또는 후에 상기 제형을 사용할 수 있다. 암 통증은 여러 가지 이유로 쇠약하게 하고, 암 치료 또한 고통스러운 에피소드로 이어질 수 있다. 본 명세서에서 기재된 제형으로 관리하는 경우, 변비 및 중독과 같은 아편제 사용에 내재된 문제를 방지할 수 있다. 중독은 남용으로 이어질 수 있고, 결국에는 과다 투여(overdose)로 이어질 수 있는, 조성이 예측될 수 없는 제형의 불법적인 공급(illegal sourcing)으로 이어질 수 있다.

비암성 통증과 관련하여, 예를 들면 일반적으로 통증이 예상될 수 있는 수술을 받기 전에, 상기 제형은 예상되는 통증을 줄이기 위해 예방적으로 사용될 수 있다. 부상의 통증 또는 사고로 인한 예상치 못한 손상의 통증의 경우, 제형은 제자리에서 급성으로 또는 지속적으로 사용되거나, 아편유사제 또는 NSAID 진통제와 같은 더 가혹하거나 더 해로운 진통제에 사용될 수 있다.

전달 방식 및 전달 형태. 제형은 환제, 정제, 젤 캡슐, 시럽제, 오일계 스프레이 또는 액상 오일 형태와 같은 경구 전달이 가능하다. 경구 형태는 식품으로 제공되거나 식품 보충제로 제공될 수 있고, 대상체가 더 맛있게 또는 쉽게 섭취할 수 있도록 식품에 첨가될 수 있다. 국소 또는 비강 흡수가 가능하다. 지용성 담체, 또는 나노- 또는 마이크로-입자 또는 에멀젼은 고도의 지용성 칸나비노이드가 보다 쉽게 흡수되기 위해 사용될 수 있다. 제형은 정맥 내, 근육 내 또는 안구 내 전달용으로 주사할 수 있게 제조될 수 있다. 제형은, 예를 들면, 베이핑(vaping)과 같은 증기로 기화기(vaporizer) 또는 퍼핑기(puffer)로 전달되거나, 가열되어 "스모킹(smoking)"으로 여겨질 수 있는 휘발 및 흡입을 유발할 수 있다.

투여량. 제형은 THC, CBC 내지 CBD의 중량 기준으로 약 5:1:5 내지 5:5:5(즉, 1:1:1) 범위의 상대적인 양으로 전달될 수 있다. 기타 칸나비노이드들이 이 제형들에 존재할 수 있다. 투여량 기준으로, 주요 칸나비노이드들의 총량은 용량당 0.1mg - 50mg의 범위, 예를 들면, 용량당 1mg - 25mg 또는 5mg - 20mg의 범위일 수 있다. 오일과 같은 액체로 전달되는 경우, 양은 용량당 0.1 mg/mL - 50 mg/mL와 같이 mg/mL 기준, 예를 들면, 용량당 1 mg/mL - 25 mg/mL 또는 5 mg/mL - 20 mg/mL로 표시될 수 있다. 필요에 따라 경험한 통증의 중증도에 따라 투여량이 사용될 수 있지만, 개체는 하루에 한 번(또는 필요하지 않은 경우 더 적게) 내지 더 빈번하게, 4시간마다의 빈도로 하루에 6 용량을 복용하는 것과 같이, 필요에 따라 제형을 사용하고 싶을 것이다.

예시적인 제형은 환제, 정제 또는 과립-함유 캡슐과 같은 고체의 투여 형태일 수 있다. 또한, 제형은 액체 기반이고, 분리된 또는 합성된 주요 칸나비노이드를 함유하거나, 또는 제형은 오일, 및 오일계 스프레이, 또는 액체-함유 젤 캡슐(소프트-젤 캡슐)과 같은 액체 형태의 약 5 mg/mL Δ-THC, 약 1-5 mg/mL CBC 및 약 5 mg/mL를 갖는 칸나비스의 오일계(oil-based) 추출물일 수 있다. 액체 함유 캡슐 또는 젤 함유 캡슐이 사용되는 경우, 부피가 제한될 수 있는데, 예를 들면 약 200μL의 부피로 제한될 수 있다. 투여량 범위로 상기 언급된 밀리그램 양은 이러한 캡슐 각각에 포함되거나, mg/mL 단위로 덜 농축되기 위해 캡슐들이 제형화될 수 있다. 덜 농축된 캡슐이 사용되는 경우 용량당 소비되는 캡슐 수를 증가킴으로써 적절한 투여량이 전달된다.

부형제 및 제형 성분. 제형은 약물 또는 칸나비노이드를 제형화하는데 알려진 임의의 허용 가능한 부형제들을 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 전분, 셀룰로오스, 알기네이트, 콜로이드성 규소, 스테아레이트와 같은 윤활제, 염, 수성 및 비-수성(지용성) 성분이 포함될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 것과 같이, 통상적인 제형 고려사항이 적용될 것이다.

실시예 1

암 통증 관리에 사용하기 위한 제형

암에 수반되는 통증은 암의 유형, 암과 관련된 치료, 종양 자체가 대상체에 불편함을 유발하는지 여부에 따라 매우 가변적이다.

4기 암종의 통증을 경험하는 개체는 이 통증을 관리하기 위해 상기 제형을 사용할 수 있다. 이후 개체는 하기와 같은 오일계 칸나비노이드 제형을 예를 들면, 6시간마다 정기적으로 경구로 섭취할 수 있다.

상기 제형은 오일계 액체 중, 5 mg/mL THC, 1 mg/mL CBC 및 5 mg/mL CBD를 포함한다. 적절한 간격으로, 개체는 1 mL를 경구로 복용할 수 있다.

초기에, 개체는 1일 2회의 빈도로 1mL의 제형을 섭취하는 것으로 시작할 수 있다. 1일 4 내지 6회로, 1~2mL의 용량을 복용하는 것에 도달할 때까지, 개체가 제형에 익숙해지면서 시간이 지남에 따라 용량이 더 많은 양으로 적정될 수 있다.

실시예 2

수술 결과로 인한 통증의 관리

수술 후 회복의 고통은, 때때로, 수술 절차 전에 미리 예상될 수 있다.

수술 전에, 개체는 효과적인 통증 완화가 가능함을 알게 되어 스트레스나 걱정을 완화하는 것을 원할 수 있다. 수술 후, 또는 수술이 전신 마취 또는 구강 수술(충전 또는 치근관 절차)과 같은 오랜 기간의 금식이 요구되지 않을 때, 개체는 가능하면 미리, 또는 수술 후에, 하기 환제-기반 칸나비노이드 제형의 용량을 경구로 섭취할 수 있다.

상기 제형은 환제, 정제 또는 소프트-젤 캡슐 형태로, 5 mg THC, 3 mg CBC 및 5 mg CBD를 포함한다. 개체는 1개 또는 2개의 이러한 환제, 정제 또는 캡슐을 경구로 복용할 수 있다. 임의적으로, 고지방 음식은 장내 흡수 효율을 돕기 위해 동시에 섭취될 수 있지만, 수술법에 따라 음식물 섭취(food consumption)가 허용되는 시간에만 섭취될 수 있다.

실시예 3

부상 후 통증 관리에 사용하기 위한 제형

급성 및 예상치 못한 사고 또는 부상에 수반되는 통증은 회복 및 치유가 진행됨에 따라 개체를 쇠약하게 할 수 있다.

이러한 예상치 못한 사건으로 야기된 급성 통증을 경험하는 개체는 이 통증을 관리하기 위해 상기 제형을 사용할 수 있다. 이어서, 개체는 통증이 견딜 수 있는 수준으로 가라앉을 때까지 후속의 캡슐화된 오일계 칸나비노이드 제형을 정기적으로 또는 필요에 따라, 경구로 섭취할 수 있다.

제형은 캡슐당 200μL의 대략적인 부피를 갖는 소프트-젤 캡슐에 존재한다. 각 캡슐은 오일계 액체 중, 5mg THC, 2mg CBC 및 5mg CBD를 포함한다. 소프트-젤 캡슐은, 삼키기 쉽도록, 글리세린 또는 소르비톨과 같은 다른 일반적으로 알려진 젤 캡슐 성분을 포함할 수 있는 젤라틴계 쉘(gelatin-based shell)로 오일계 액체를 캡슐화한다. 적절한 간격으로, 개체는 1개의 캡슐을 경구로 복용할 수 있다.

초기에, 개체는 1일 2회의 빈도로 1개의 캡슐을 섭취하는 것으로 시작할 수 있습니다. 초기 용량이 내약성이 우수하고(well tolerated) 개체가 제형에 익숙해지면 용량을 더 많은 양으로 증량할 수 있다. 통증이 가장 급성일 때, 1일당 4~6 용량, 1 내지 2개의 캡슐의 용량이 사용될 수 있다. 시간이 지남에 따라, 개체가 회복되고 치유됨에 따라, 사용 빈도는 1일당 2회 1개의 캡슐의 용량으로 낮추어 적정되거나, 필요에 따라 더 적게 사용된다.

실시예 4

통증 관리용 제형

서론. 전 세계적으로, 최대 10%의 인구가 화학요법, 당뇨병, 염증성 및 감염성 질환(Colloca L, 2017)과 동반하는 질병으로 신경병성 통증(Bouhassira D, 2008; Colloca L, 2017)의 영향을 받는다. 하지만, 효과적이고 안전한 치료법은 아직 발견되지 않았다. 여러 칸나비노이드들이 항통각제(antinociceptives)로서의 효능을 보유하고 있는 것으로 나타났다. 이 실시예에서, 만성 통증 치료를 위한 고유한 제형이 기재되어 있다. 신경병증성 통증은 작열감(burning sensations) 및 전기가 오는 것과 같은 감각(electrical-life sensation), 고통스럽지 않은 자극(non-painful stimulant)에 의해 유발되는 통증을 특징으로 하고, 증상이 지속되면, 수면 장애, 불안 및 우울증 및 삶의 질의 손상으로 이어진다(Colloca L, 2017). 본 연구는 신경병성 통증의 표현형 프로파일에 초점을 맞추고 임상 중개(clinical translation)의 문제를 해결하도록 설계되었다.

본 연구는 만성 신경병증성 통증에 대한 칸나비노이드 치료의 영향의 종합적인 행동 표현형 평가를 제공한다. 기계적 역치 테스트의 2개의 다른 척도, 전자 폰 프레이 및 보행 분석에 의한 운동역학적 분석을 사용하여, 기계적 통각 및 결찰된 신경과 같은 쪽에서 이질통(allodynia)의 상당한 감소가 1:1:1 비의 칸나비디올(CBD), 델타 9-테트라하이드로칸나비놀(Δ9-THC), 칸나비크로멘(CBC)의 치료시 관찰되었다. 5:5:5 mg/kg 또는 10:10:10 mg/Kg 비일 때 CBD:THC:CBC는 기계적 과민증의 강력한 감소 및 촉각 이질통의 강력한 복구(reversion)를 보여주었고 SNL-유발된 신경병성 통증의 운동역학적 성능을 효과적으로 개선했다. 놀랍게도, 이 제형은, 신경병증성 통증의 1차 치료 선택들(first-line treatment choices) 중 하나인 GABA 유사체(감마 아미노부티르산), 프레가발린과 비교할 때, 탁월한 진통 효과에 기인했다. 이 진통 효과는 제형에 존재하는 칸나비크로멘에 의해 주로 매개되는 것으로 보인다.

이 결과는 본 제형(1:1:1 비의 CBD:THC:CBC)이 신경병성 통증을 강력하게 감소시키고 진통제로서 아편 유사제의 새로운 대체제를 제공하는 것을 보여준다. 또한, 칸나비크로멘을 첨가하는 것은 CBD 및 Δ9-THC의 진통제 효과를 강력하게 완화한다. 본 발견은 CBC를 첨가하는 것이 만성 통증이 있는 환자에서 CBD 및 Δ9-THC의 일일 용량(daily dose) 및 총 복용량(total intake)을 상당히 감소시키는 가능성이 있다는 것을 보여준다. 중요하게도, 1:1:1 비의 CBD:THC:CBC는, 아편 유사제의 해로운(poor) 결과, 아편 유사제 의존 위험, 약물 복용 증가 및 여러 의료 서비스 제공자의 방문으로 인해 환자의 삶의 질이 손상되는 것에 대한 새로운 해결책을 제공한다.

본 연구의 목적. 본 연구의 목적은 만성 신경병증성 통증의 검증된 모델로서 SNL-유도된 기계적 과민증 및 변경된 운동역학적 성능의 강도에 대한 세 칸나비노이드의 개별 용량의 효과를 평가하는 것이다. 연구 대상인 칸나비노이드들은 칸나비디올(CBD), 칸나비크로멘(CBC) 및 델타 9-테트라하이드로칸나비놀(Δ9-THC)이다. 척수 신경 결찰 수술은 말초(좌골) 신경 내 부분적인 탈신경을 유발하고, 이로 인해 좌골 신경 분포 영역(nerve innervation area) 내 촉각 과민증(이질통)을 유발한다. SNL 쥐 모델은 1992년에 처음으로 기술되었다(Kim SH, 1992). 칸나비노이드들은 체내 칸나비노이드 시스템(endocannabinoid system)과 이들의 반응에 따라 여러 기능들을 보유한다. 이들은 다양한 통증 유형을 연구할 수 있는 가장 유망한 후보에 속한다.

일생 동안의 연구(The study in-life)는 하기 단계를 통해 실행되었다.

N = 그룹당 7-10마리

7일차(또는 수술 후 1일차):

- 전자 폰 프레이 테스트(evF)를 사용한 촉각 이질통의 기준선 (baseline tactile allodynia)(자연상태의 쥐(naive rats)의 기계적 민감도) 평가;

- 미세 운동 운동역학의 기준선 기록

D0: SNL-수술;

D0-D6: 수술 후 관리 기간(care period)

D7: - 이질통의 부상 기준선 (injury baseline allodynia)을 정의하고 투여 전 테스트 결과를 얻기 위한, evF;

- 운동 결함의 부상 기준선 (injury baseline motor deficits)을 정의하고 투여 전 테스트 결과를 얻기 위한, 운동역학적 분석

D8: - D8에, CBD, CBC 및 THC 투여

- 투여 후 2시간, 4시간 및 8시간일 때의 evF

- 투여 후(PD) 5시간 및 9시간일 때의 운동역학적 분석

D9: - 투여 후 24시간일 때의 evF

- evF 테스트 후 운동역학적 분석

- 9마리/그룹의 안락사

재료 및 방법

동물

모든 동물 실험은 핀란드 국립 동물 실험 위원회(National Animal Experiment Board of Finland)에서 승인한 라이센스에 명시된 것에 따라, 및 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)의 지침에 따라 수행되었다.

총 180마리의 Sprague-Dawley 수컷 쥐를 Charles River(독일)에서 구입하였고 이들은 연구 절차를 거쳤다. SNL 수술 당일 쥐들의 체중은 200-300g이었다. SNL 수술 전에, 취급할 때 및 기준선 테스트를 할 때 - 동물의 수는, 동물 교체가 필요한 드물지만 가능한 상황(예를 들면, 선천적으로 과민한 동물)을 예견하기 위해 약 5 - 10% 더 많았다. 동물들은 접근 표준 온도(22 ± 1°C) 및 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있는(ad libitum access) 빛이 조절되는 환경(오전 7시부터 오후 8시까지 조명이 켜져 있음)에서 사육(housed)되었다.

모든 동물들은 척수 신경 결찰 수술을 받았고; 모든 그룹은 n=15를 포함했다. 치료 그룹은 하기와 같은 테스트 물품을 투여 받았다:

그룹 1: D8에, 비히클(0.9% 식염수)로 치료받음

그룹 2: D8 및 D9에, 프레가발린(50 mg/kg)로 치료받음

그룹 3: D8에, CBD(5mg/kg) 및 THC(5mg/kg)로 치료받음

그룹 4: D8에, CBD(5mg/kg) 및 CBC(1mg/kg) 및 THC(5mg/kg)로 치료받음

그룹 5: D8에, CBD(5mg/kg) 및 CBC(5mg/kg) 및 THC(5mg/kg)로 치료받음

그룹 6: D8에, CBD(10mg/kg) 및 CBC(10mg/kg)로 치료받음

그룹 7: D8에, CBC(10mg/kg) 및 THC(10mg/kg)로 치료받음

그룹 8: D8에, CBD(10mg/kg) 및 THC(10mg/kg)로 치료받음

그룹 9: D8에, CBD(10mg/kg) 및 CBC(10mg/kg) 및 THC(10mg/kg)로 치료받음

그룹 10: D8에, CBD(10mg/kg) 및 CBC(2mg/kg) 및 THC(10mg/kg)로 치료받음

모든 쥐들은 D9의 행동 테스트가 완료될 때까지 동일한 연구 설계를 따랐다.

표 1은 치료의 세부 사항을 보여준다.

5mg/kg 처리 아집단에 대해 이 결과들이 제공된다. 10mg/kg 치료 아집단의 결과들이 하기에 나타나 있다.

[표 1]

도 1은 연구 패러다임의 개략적인 개요를 제공한다. 이 개요는 D9의 테스트까지 모든 연구 대상 동물에게 수행된, 연구의 행동 단계를 나타내는 개략도의 형태이다. 두 번의 테스트가 진행되었는데, 첫 테스트는 4h evF를 마친 이후에 진행되고 두 번째 테스트는 8h evF를 마친 후 진행되었기 때문에, D8의 Motorater 테스트 시점은 표시되지 않는다.

테스트 물품 및 제형. 테스트 물품은 표준 수술 절차에 따라 취급 및 보관되었다. 벤더(vendor)가 제공한 상세한 지침에 따라 투여 제형(dose formulations)을 제조했다.

약물 투여. 연구 8일째에 테스트 물품, 이들의 비히클 또는 프레가발린(양성 대조군 약물)을 모든 연구 동물에 표 1에 따라 투여하였다. 칸나비노이드 또는 비히클의 투여 경로는 위내(po) 투여인 반면, 프레가발린은 복강내(ip) 투여되었다. D8외에도 D9에, evF 테스트 2시간 전에, 프레가발린을 투여했다.

척수 신경 결찰(SNL) 수술. 동물들은 n=6의 일일 코호트(daily)로 SNL 수술에 등록되었다. 신경병증과 무관한 수술 통증 및 수술 후 통증을 완화하기 위해 수술 최소 30분 전에 0.03 mg/kg의 부프레노르핀(buprenorphine) (Temgesic)을 쥐들에 복강 내 투여했다. 척수 신경 결찰(SNL) 절차 전에, 300 ml/분의 유속, 및 70% N₂O 및 30% O₂ 중 이소플루란(isoflurane)으로 쥐들을 마취했다. 5% 이소플루란이 포함된 챔버에서 2-3분 동안 마취하였고, 이후 1-2% 이소플루란을 갖는 주둥이 마스크(snout mask)를 통해 마취가 유지되었다. 직장 온도를 모니터링하기 위해 항온 블랭킷 시스템(homeothermic blanket system)을 사용했고 항온 블랭킷 시스템은 수술 동안 37.0°C ±1.5°C로 유지되었다.

L3에서 S2로 이어지는 등쪽 절개(dorsal incision)는 무균 기술을 사용하여 쥐의 등쪽 내측 영역(medial dorsal area)에서 수행되었다. L6/S1 후방 관절간 돌기를 무딘 박리(blunt dissection) 및 예리한 박리(sharp dissection)의 조합을 사용하여 노출하였다. 척추의 L6 횡돌기(transverse process)를 시각화했고, 신경을 조작하지 않은 채 L6 횡돌기를 부분적으로 제거하였고, 이어서 추간공(intervertebral foramina)으로부터 나오는 원위의 L4 및 L5 척수 신경을 노출시켰다.

6-0 실크 봉합사(silk suture)로 L5 신경을 단단히 결찰하였다. 이어서, L6 신경을 천장 접합부의 꼬리 쪽과 내측에 위치시키고, L5와 유사하게 6-0 실크 봉합사로 단단히 결찰했다. 두 결찰 모두 이중 매듭(double knots)으로 수행됐다.

결찰을 수행한 이후, 근육층, 결합 조직 및 피부를 봉합했고, 동물들이 항온 케이지에서 마취로부터 회복되도록 하였다. 완전히 깨어나서 케이지에서 움직일 때까지 쥐들을 모니터링했다.

수술 후 추가 7일 동안(for ad 7 days) 1일 2회의 수술 후 관리 기간을 가졌고 하기 절차들이 포함되었다. 동물의 수술된 발과 보행을 모니터링하면서 일반적인 상태 및 복지(welfare)를 주의 깊게 관찰했다. 수술 상처 및 봉합 - 및 필요시 적절히 소독되었는지 -을 하루에 두 번, 상처가 제대로 봉합될 때까지 확인했다. 0.03 mg/kg 부프레노르핀을 수술 후 첫 2일 동안 피하(s.c) 투여로, 대략 12시간마다 투여했다. 수술 직후 4ml의 멸균 식염수를 복강 내 투여하여 수분을 보충시켰고, 더 이상의 체중 감소가 나타나지 않을 때까지, 7일 동안 하루에 2번 이를 계속했다. 모델 및 이 모델과 관련된 수술을 넘어선 통증, 운동 결핍 또는 건강 문제의 임의의 명확한 징후를 기록하였고 마비 또는 모델과 관련 없는 기타 운동 결핍이 있는 동물을 추가 테스트에서 제외했다.

촉각 이질통 테스트(evF) 및 사전 처리 및 기준선 evF. 본 연구에서, 접촉 자극에 대한 기계적 민감도는 부착된 분석 소프트웨어(Somedic®, 스웨덴)와 함께 전자 폰 프레이(evF) 장치를 사용하여 4 시점들에서 정의된다.

쥐들을 기준선 evF에 적용하기 전에, 테스트에서 과민증을 감소시키기 위해, 쥐들을 이틀 연속으로 2-3분간 사전-처리했다. 사전-처리를 기준선 테스트하기 최대 3일 전에 수행했다. 쥐들이 CR 동물 시설(CR animal facility)에 도착한 후 최소 5일 후, 및 수술날(d0) 최대 5일 전에 기준선 evF가 일어났다.

선천적 과민증을 보이는 쥐들은 본 실험에서 자격이 박탈되었다. 과민증은 1 mm 프로브로 20g 미만의 기준선 발 회피반응 역치(PWT)로 정의된다. 기준선 evF 테스트 이후, 쥐들의 무게를 측정하고, 번호를 매기고, PWT 기준선 및 체중과 관련하여 치료 그룹들에 균등하게 분배했다.

임의의 절차(취급 또는 테스트) 전에, 절차가 수행될 방에서 동물들이 60분 동안 습관화(habituation) 되도록 하였다.

evF 테스트를 수행하기 위해, 쥐들을 높은 철망(steel mesh) 위에 있는 폰 프레이 테스트 챔버 각각에 배치했다. 이어서 쥐들이 챔버에서 적응하도록 했고, 그 자체 테스트(Test per se)는 쥐들이 정착한 이후에 나타났고, 그 이후 챔버 및 그루밍(grooming)을 조사했다(약 15분). 동물들이 그루밍하거나, 소변을 보거나, 배변을 하거나 잠을 자는 동안 테스트를 수행했다. 테스트 절차의 추가 설명은 하기에서 제공된다.

evF 테스트 수행. 연구 대상 동물들의 개별 민감도 수준을 정의하기 위해, 기계적 이질통을 SNL 수술(기준선) 전에 evF 테스트로 평가했다. 다음으로, SNL 수술로 인해 유발된 과민증을 평가하기 위해, SNL후 D7에 evF를 수행했다. D8에, 투여 후(PD) 2h, 투여 후 4h, 및 투여 후 8h 일 때, 동물들에 테스트를 수행했다. 그 후, 투여 후 24h일 때, 즉, D9에 테스트를 수행했다. D9에, 그룹 2는 테스트 전 2h에 프레가발린(i.p)을 받았다.

임의의 테스트 날에, 쥐들이 테스트 전 대략 1시간 동안 테스트 방에 적응하도록 하였다. 스트레스를 감소시키고 테스트를 용이하게 하기 위해, 상기 시간의 일부를 테스트 챔버 적응을 테스트하기 위해 사용했다. 동물이 주변을 탐색하고, 그루밍하고 진정되면 테스트를 시작할 수 있다. 쥐가 소변을 보거나, 배변을 하거나, 잠을 자면 쥐들을 테스트하지 않았다.

제조자의 지침에 따라 evF 장치를 사용했다. 간략하게 말하면, 각각의 측정시, 선형적으로 증가하는 속도(rate)로 뒷발의 발바닥 중간 표면에 힘을 가했다.

사용된 evF 프로브 직경은 1 mm이었고, 힘의 상승 속도를 10 g/s로 선택했다. 힘 적용의 선형성은 실시간으로 모니터링되었다. 발 회피반응을 일으키는 적용된 힘(그램 단위)을 시험 결과로 하여 장치에 기록했다.

테스트 동안 메모를 하여, 테스트 물품의 가능한 진정 효과들(sedative effects)이 감각 효과(sensory effects)들과 구별되도록 하였다.

종합하면, 각 반복 사이에 최소 3분 간격을 두어 각 시점에서 5번의 반복된 측정들을 각 뒷발에 적용했다. 임의의 주어진 시점에서 5번 측정 반복의 중앙값들을 결정했다. 각 테스트 날에 동측(ipsilateral) 및 반대측(contralateral) 발 모두 테스트했다.

도 2는 발바닥 상의 폰 프레이 테스트 부위를 보여준다.

미세 운동 운동역학적 보행 분석. 기준선 및 연구 8일차, 9일차, 11일차, 14일차 및 17일차에, evF 테스트 최소 30분 후에 쥐들에 보행 분석을 수행했다. 이 분석은 분석모드로 MotoRater(TSE Systems, 홈부르크, 독일)에 의해 수행됐다. 테스트를 시작하기 전에, 필수 신체 지점들(예를 들면, 관절, 사지, 코, 꼬리)을 추적용으로 표시했다. 고속 카메라 (300 프레임/초)를 사용하여 아래 및 양 측면에서 보행 분석의 정보를 포착했다. 이어서, 포착된 영상들을 SimiMotion^TM 소프트웨어로 변환했다. 3차원 모두에서 기록된 영상들로부터 표시된 지점들을 추적하여 원시 데이터(raw data)를 얻었다. 따라서 이 원시 데이터는 지면 및 각 3차원과 관련된 좌표들에서 상이한 신체 지점들의 움직임의 상관관계를 포함한다.

맞춤형(custum-made) 자동화된 분석 시스템을 사용하여 상이한 보행 패턴 및 움직임들을 분석했다. 종합하여 100 초과의 운동역학적 매개변수들에 대한 정보들을 얻었다. 이 정보들은 예를 들면 하기를 포함한다:

- 일반적인 보행 패턴 매개변수들, 예를 들면: 보폭 시간 및 보폭 속도, 보폭, 보폭 중 입각 시간(stance time) 및 유각 시간(swing time), 사지간 협동(interlimb coordination).

- 신체 자세 및 균형 매개변수들, 예를 들면: 발가락 들림(toe clearance), 장골능 및 엉덩이 높이, 뒷다리 내밈(protraction) 및 들임(retraction), 꼬리 위치 및 움직임.

- 미세 운동 스킬, 예를 들면, 미세 운동 스킬은 보폭 중 유각 속도, 유각기(swing phase) 동안 저크 메트릭(jerk metric), 상이한 관절들의 각도 범위 및 편위(deviations), 및 머리의 수직 및 수평 움직임을 포함함.

개별 매개 변수들에 대해 모든 Motorater 데이터를 분석했고, 뿐만 아니라 주성분 분석(PCA)를 사용하여, 조합된(combined) 매개변수들에 대해 모든 Motorater 데이터를 분석했다. 얻어진 결과들은 보행 분석에서 모델 표현형, 즉, 개별 매개변수들 및 PCA 모두와 관련된, 비히클 및 칸나비노이드-치료받은 동물들 사이의 차이를 생성했다.

기준선 테스트에 추가하여, 행동 연구 단계 동안 총 4번 motorater 테스트를 수행했다.

- D7에, 투여 전, 모델-특이적 운동 결함들을 평가하기 위해 수행함

- D8에, 4-h evF를 마친 후 수행함.

- D8에, 8-h evF를 마친 후 수행함.

- D9에, 24-h evF를 마친 후 수행함.

evF 테스트 후 최소 30분 전에는 동물들에 운동역학적 분석을 수행하지 않았다.

도 3a 및 도 3b는 모든 연구 그룹들에서 BL과 D7의 차이의 PCA를 기반으로, SNL 유도된 운동 표현형을 보여준다.

도 3a는 움직임 추적(motion tracking) 및 운동역학적 모델을 보여준다. 움직임 추적은 MotorRater을 사용하여 동물을 3 측면에서 동시에(배쪽, 좌측, 우측) 관찰하였고 움직임과 관련된 모든 신체 부위, 즉, 발, 발목, 관절, 꼬리, 머리, 엉덩이, 장골능에 대한 자세한 판독값들(readouts)을 제공하여 미묘한 편위, 조기 증상 발병 및 치료 효과를 안정적으로 감지할 수 있다.

도 3b는 “기준선으로부터의 거리(Distance from Baseline)”의 판별 방향(discriminant direction)을 보여준다. 바 그래프는 어떤 매개 변수들이 SNL 후 변화하는 지를 보여준다(0 = BL 또는 기준선). 바 길이 및 방향은 각 매개변수들이 전체 점수에 기여하는 가중치를 나타낸다.

SNL 모델의 운동 표현형은 하기와 같은 보행 특성들의 변화의 조합으로 특성화되고 해석될 수 있다:

- 전체 속도는 주로 더 긴 보폭 거리(보폭 증가)로 인해 증가됨

- 뒷다리 좌-우 교대 리듬이 증가하는 것(L/R 커플링 H(L/R Coupling H))을 제외하고 사지간 협동은 극적으로 변화하지 않음.

- 전체 엉덩이 높이 및 엉덩이 움직임의 수직 범위는 증가됨(꼬리 기저부 평균값/최대값/범위, 엉덩이 높이, 엉덩이 높이 범위, 장골능 높이)

- 꼬리 끝 위치가 더 낮음(꼬리 끝 최소값/평균값/최대값)

- 엉덩이 각도 범위가 증가됨

- 뒷다리 발가락 들림 증가

하기 세 슬라이드(three slides)에 제시된 전체 보행 점수는 모든 이러한 변화들을 반영하고(판별 방향 벡터를 “야드자(yardstick)”로 사용함), 기준선에서 평균 점수가 0인 방식으로 제시된다. D7에, 모든 연구 그룹들의 평균 점수는 3.107이다(Z-점수). 전체 점수의 감소는 보행 성능이 SNL 이전 상태(BL)를 향해 변하는 것을 의미한다.

도 4는 보행 전체 점수(기준선으로부터의 거리)를 보여주고, 모의 수술 쥐(sham)(쌍에서 좌측의 밝은 바들) 대 SNL 쥐 모델(쌍에서 우측의 어두운 바들)에 대해 표시된, 판별 벡터로 강조된 개별 보행 매개변수들의 예시들을 제공한다. 전체 보행 점수는 SNL 모델과 연관된 모든 보행 매개변수들에 의해 결정된다.

체중 모니터링. 동물들의 체중을 기준선 evF 테스트할 때, 수술 당일에(D0), 및 수술 후 매일 기록했다.

종점, 혈액 샘플 및 조직 처리. D9에, 마지막 motorater 테스트 후, PK-단계로 계속 진행하기 위해 그룹당 6마리의 쥐들을 선택하여 행동 연구 단계를 완료하였다. CO₂ 과다 투여에 의해 나머지 동물들을 안락사시켰고, 머리를 제거(decapitation)했다.

Pk-단계의 종점일인 D11에, 펜토바르비탈(60 mg/kg Mebunat)로 쥐들이 삶을 마무리하도록 마취(terminally anesthetize)시켰다. 혈액 샘플들을 심장 천자(cardiac punctures)를 통해 수집했고, 10분 동안 2000 x g로 원심분리하여 혈장을 분리했다. 분리된 혈장 샘플을 깨끗한 튜브에 옮겼고 선적할 때까지 -80℃에서 보관했다.

이어서, PBS로 동물들을 경심관류(transcardially perfused)하였다. 두개골에서 뇌를 분리하고 액체 N₂에서 급속-냉동(snap-freezing)시켰다. 그 후, 선적할 때까지 뇌 샘플들을 -80℃에서 보관했다.

요추 DRG들이 보이도록 준비했고, 양 측면으로부터 수득했다. 각 측면의 요추 DRG들 L4-L6를 미리-라벨링한 2-ml 튜브에 풀링하고(동측 DRG들을 한 튜브에 풀링하고; 반대측 DRG들을 또 따른 튜브에 풀링함), 24h 동안(+ 4℃) 10% 상용 포르말린에서 사후-고정(post-fixation)을 수행했다. 마지막으로, DRG 샘플들을 0.1M PBS로 간단히 플러싱하였고(briefly flushed), + 4°C에서 및 선적 동안 완충액에 보관했다.

일반적인 건강 상태 및 인도적 종점. 실험실 직원에 의해 동물들을 매일 모니터링했다. 동물의 일반적인 건강상태가 상당히 악화되는 경우, CO₂ 과다 투여로 희생시켰고, 머리를 제거했다. 허용가능한 종점의 정의는 하기를 포함한다: 24h 관찰 기간 동안 자발적인 움직임이 없고 마시거나 먹을 능력이 없음, 과다 출혈, 자발적 염증(spontaneous inflammation), 해부학적 손실(missing anatomy), 팽창(swelling) 또는 20 mm 초과하는 종양, 30초 기간 동안 스스로 바로 설 능력이 없음.

또한, 모델 특이적 종점의 기준은 하기를 적용한다:

- 창상 봉합사(wound suture)가 세 번 열림(처음에는 새로운 봉합을 하고; 두번째에는 조직 접합제(tissue glue)가 추가로 사용될 수 있다).

- 48h 치료에도 불구하고 악화되는 상처 염증

- 뒷다리 어느 쪽의 어느 정도의 마비

- 때때로 신경병증성 통증 모델과 관련된 자기 상해(Automutilation)

장치 및 시약. 하기 재료들 및 물질들이 본 연구에 사용되었다:

- 철망 테스트 평면: Ugo Basile, 독일

- 플렉시글라스(Plexiglass) 테스트 챔버: Ugo Basile, 독일

- 전자 폰 프레이 테스트 하드웨어 및 소프트웨어: Somedic, 스웨덴.

- MotoRater: TSE Systems, Homburg, 독일

- 가스 마취 장치: Harvard Apparatus

- 이소플루란 액체: Attane Vet

- 광학 현미경: Zeiss Stereomicroscope, Stemi DV4

- 항온 수술 블랭킷 항온기 및 프로브: Harvard Apparatus

- 결찰용 실크 봉합사: 6-0 Ethicon

- 폴리아미드 봉합사 (5-0): Ethicon

- 부프레노르핀 Temgesic®: Oriola Finland

- 0.9 % NaCl (식염수): Braun

통계학적 분석. 모든 값들은 평균값 ± 평균값의 표준 오차로 제시된다.

GraphPad Prism(버전 8, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)을 사용하여, α = 0.05의 유의 수준으로 모든 통계학적 분석을 수행했다. 데이터의 특성에 따라, 하기 매개변수들 중에서 통계학적 테스트를 선택했다.

두 그룹들 간의 단순한 비교는 독립표본 스튜던트 t-검정(unpaired Student's t-test)에 의해 수행되거나, 정규성 가정이 디구스티노-피어슨 검정(D'Agostino-Pearson test) 또는 샤피로-윌크 검정(Shapiro-Wilk test)에 의해 기각되는 경우, 맨-휘트니 U-검정(Mann-Whitney U-test)에 의해 수행됐다. 데이터가 정규 분포를 따르는 것으로 가정되거나, 아니면 분산이 동일하지 않은 경우, 웰치 t-검정(Welch's t-test)이 쌍별 비교를 위해 사용됐다. 동일한 세트의 대상들에 대해 수행된 두 측정들 사이의 비교를 위해, 스튜던트 t-테스트 또는 윌콕슨 부호-순위 검정(Wilcoxon signed-rank test)이 적절히 사용됐다.

3 이상의 독립적인 그룹들을 포함하는 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 수행되거나, 데이터가 정규 분포를 따르지 않으면, 크러스컬-월리스 검정(Kruskal-Wallis test)에 의해 수행됐다. 그룹/치료 인자(group/treatment factor)가 유의한 경우, 사후 검정(post hoc) 다중 비교를 수행했다. 모든 평균값들을 모든 다른 평균값들과 비교하기 위해, 터키 검정(Tukey test) 또는 홀름-시닥 검정(Holm-Sidak test)을 사용했다. 듀넷 검정(Dunnett's test)에 의해 대조군 평균값과의 비교를 수행했다. 크러스컬-월리스 검정의 경우, 던 검정(Dunn's test)을 사용하여 사후 검정 다중 비교를 수행했다.

동일한 그룹에 대한 반복된 관찰을 위해, 반복 측정 ANOVA(정규 분포 데이터용) 또는 프리드만 검정(Friedman test)(정규성 가정이 기각된 그룹용)에 의해 매칭된 값들을 분석했다. 상이한 지점들에서 2개 이상의 그룹들 사이의 비교는, 그룹/치료를 “그룹 사이(between)” 인자로 하고 시간을 “그룹 내(within)” 인자로 하는 이원 반복 측정 ANOVA에 의해 수행됐다. 그룹의 주된 효과 및 시간은 초기에 결정되었고 이들이 유의한 상호작용을 갖는 경우, 관련 사후 검정 다중 비교를 수행했다.

결과

연구 전체에 걸쳐 다양한 그룹의 snl-쥐들의 체중에 있어 유의한 차이가 없었다. 상이한 치료 그룹들을 비히클 치료받은 동물들과 비교시 어떠한 통계학적 유의도도 관찰되지 않았다.

도 5는 SNL 수술받은 SD 쥐들의 체중에 대한 1-3 칸나비노이드들의 개별 용량들의 효과를 보여준다. 데이터는 평균값 + SEM으로 제시된다. 그룹 크기: 비히클, n = 12; 프레가발린, n = 12; CBD+CBC 10 mg/kg, n = 9; CBC+THC 10 mg/kg, n = 9; CBD+THC 10 mg/kg, n = 9; CBD+THC 5 mg/kg, n = 7; CBD+CBC+THC 5 mg/kg, n = 9; CBD+THC 5 mg/kg + CBC 1 mg/kg, n = 9; CBC 10 mg/kg, n = 9. 이원 ANOVA, 터키 사후 검정.

5:5:5mg/kg일 때 CBD:THC:CBC가 만성 통증으로 인한 기계적 과민증을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 중요한 발견이다.

기계적 과민증을 평가하기 위해, 본 연구는 수술 후 8일에 전자 폰 프레이(evF)를 사용했고, 각 치료 그룹에서 투여 후 24시간 내에 발 회피반응 역치를 결정했다. 그 결과를 그래프로 나타냈고 기준선(시간 0)과 비교했다.

도 6은 쥐들에서 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 효과를 보여준다. 상이한 치료들에 대한 다양한 시점 이후 PWT 기준선으로부터의 백분율을 평가했다. SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 효과를 7일차에 측정했고 이어서 수술 후 2, 4, 8 및 24 시간일 때 측정했다. 데이터는 SNL 이후 시점에서 기준선 값으로부터의 백분율로 평균값 + SEM로 제시된다. 그래프의 곡선은 AUC들을 분석하기 위해 사용된다. 약어들은 다음과 같이 정의된다: D7: 7일차; D8: 8일차; D9: 9일차, CBD: 칸나비디올; CBC: 칸나비크로멘; THC: Δ-9 테트라하이드로칸나비놀, AUC: 곡선 아래 면적, CBD+THC+CBC 5mg/kg: CBD 5mg/kg 및 THC 5mg/kg 및 CBC 5mg/kg의 치료

도 7은 전자 폰 프레이 테스트로 측정된 치료 그룹들 대 비히클의 통계학적 유의도를 나타내는 곡선 아래 면적(AUC)을 보여준다. SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 효과는 2, 4, 8 및 24시간일 때 측정됐고 곡선들은 곡선 아래 면적을 측정하기 위해 사용됐다; 데이터는 평균값 + SEM로 제시됐고 독립표본 웰치 t-검정에 의해 테스트됐다; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001****, p < 0.0001.

5:5:5 mg/kg일 때 CBD+THC+CBC로 쥐들을 치료하는 것은 evF 테스트에서 비히클 그룹과 비교시 SNL-유도된 기계적 과민증을 유의하게 감소시켰다(p < 0.01). 흥미롭게도, 5:5:5 mg/kg일 때 CBD+THC+CBC의 치료는, 도 6 및 도 7, 및 하기 표 2)에서 제시된 데이터에서 입증되는 것과 같이, 프레가발린 양성 대조군과 비교시 SNL-유도된 과민등을 유의하게 감소시켰다(p < 0.01).

[표 2] - 전자 폰 프레이 영역에서 치료 그룹들의 다중/쌍별 비교

곡선 아래 면적(AUC)의 분석은 5:5:1 mg/kg로 CBD:THC:CBC를 치료받은 쥐들과 비교하여 5:5:5 mg/kg로 CBD+THC+CBC로 치료받은 쥐들에서 현저한 증가를 보여줬다(도 6 및 도 7)(p = 0.0019). 따라서, 1에서 5mg/kg로 증가한 칸나비크로멘은 24시간의 시간 프레임에 걸쳐 기계적 회피반응 역치(mechanical withdrawal thresholds)를 현저하게 변화시켰다.

표 2는 전자 폰 프레이 곡선 아래 면적(AUC)에서 치료 그룹들의 다중/쌍별 비교를 보여준다. 밝은 회색 배경: 터키 다중 비교에서 p < 0.05 b; 어두운 회색 배경: 쌍별 비교를 위한 피셔 LSD에서 p < 0.05. Diff: 차이. CI: 신뢰 구간. SE: 표준 오차.

비록, 5:5 mg/kg 비의 CBD:THC를 통한 쥐들의 치료는 비히클과 비교하여 기계적 과민증의 강도를 감소시키는데 효과적인 것으로 나타났고(p < 0.05), 5mg/kg 칸나비크로멘을 이 화합물에 첨가하는 것은 CBD 및 THC의 효과를 향상시키는 것으로 보인다(p < 0.01). 이 개념을 뒷받침하기 위해, 5:5:5 mg/kg의 CBD+THC+CBC 또한 프레가발린보다 현저하게 뛰어난 효능을 보여준 반면(p = 0.0186), 5:5 mg/kg의 CBD+THC(CBC 없음)는 기계적 과민증을 감소시키는데 있어 프레가발린과 비슷했다(p = 0.6414) (표 2). 각 행동 테스트 시점에서 추가 그룹 비교는 칸나비크로멘 첨가의 영향을 밝힐 것이다.

도 8은 evF로 측정되는 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량들의 효과를 보여준다. 데이터는 각 그룹마다 기준선 + SEM의 백분율로 제시된다. (그룹 크기: 비히클, n = 12; 프레가발린, n = 12; CBD+THC 5 mg/kg, n = 8; [CBD+CBC+THC 5 mg/kg], n = 9; [CBD+THC 5 mg/kg + CBC 1 mg/kg], n = 9). A) ㆍ p < 0.1; * p < 0.05, vs. 비히클 (오직 [CBD+CBC+THC 5 mg/kg] 및 [CBD+THC 5 mg/kg + CBC 1 mg/kg] vs 비히클 사이의 쌍별 사후 검정 비교); B) ㆍ p < 0.1; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. D7 (이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정).

쌍별 사후 검정 비교를 좁히기 위해 그룹별 차이(Group-wise differences)를 테스트하였다. 5:5:5 mg/Kg일 때 CBD+THC+CBC의 효과를 평가하기 위해, 그룹간 비교(도 8, A) 및 그룹 내 비교(도 8, B)를 수행했다.

투여 후 2시간일 때 CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg 치료와 비히클을 비교시 그룹간 비교는 유의한 차이를 보여주었다(p = 0.0494, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 8, A). 이 데이터는 CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg에 의해 유발된 효과가 쥐의 기계적 과민증의 감소로 표시되는 것을 보여준다.

또한, CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg로 치료받은 SNL 쥐들은 투여 후 2시간일 때 기준선으로부터 발 회피반응 역치(% PWT)에서 33%의 증가를 보여주었다(p<0.05). 투여 후 4시간일 때, 유의한 수준에 도달하지 못했다(p = 0.086; 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정)(도 8, A). 이 관찰은 쥐의 수가 적기 때문일 수 있다(n = 9).

그룹내 비교는 이원 ANOVA에 의해 수행되었고, 매우 유의한 시간-제한 효과(time-bound effect)가 존재하는 것으로 나타났으며, 투여 후 2시간일 때 피크에 도달하고 점차적으로 투여 전 수준으로 되돌아가는 투여에 대한 동적 반응을 특징으로 한다.

투여 전부터 투여 후 2시간까지의 유의한 변화는 이 아집단의 모든 칸나비노이드 그룹들, 및 프레가발린 그룹에서 확인되었다(p < 0.05, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 8, B). 분명히, CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg는 투여 전 수준과 비교하여 매우 유의한 차이를 보여주었다(p<0.0001) (도 8, B). 투여 후 4시간일 때, CBD+THC 5:5 mg/kg 및 CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg은 여전히 투여 전보다 유의하게 높은 수준이었다(각각, p < 0.05 및 p < 0.01, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정)(도 8, B). 동물 주변 환경의 변화와 합해진 테스트의 민감도(sensitivity)로 인해 테스트는 가끔 유의하지 않지만 가시적인 변화를 생성하기 때문에, 비히클 그룹에서도 유의하지는 않지만, 약간 상승하는 경향을 볼 수 있었다.

eVF 분석 결과에 기초하면, CBC를 1mg/kg부터 5 mg/kg까지 증가시키는 것은, CBD+THC의 효과를 연장하는 것으로 보인다. 투여 후 24시간일 때, 가장 높은 CBC 농도를 갖는 그룹의 결과값이 여전히 북용 전 수준보다 높은 것은 주목할 가치가 있다. 하지만 이 시점에서와 투여 전 수준과의 차이는 여전히 유의하지 않다. 또한, 여기서 주목할 가치가 있는 것은 투여 후 2시간일 때 피크에 도달하고 점차적으로 SNL 부상 수준(SNL injury level)에 가깝게 되돌아 가는 투여에 대한 동적 반응의 형태이다. 시간이 지남에 따라 변하는 반응 강도는 낮은 CBC 투여 그룹과 비교하여, 높은 CBC 투여 그룹과 분명히 차이가 있다.

칸나비크로멘을 CBD 및 THC에 첨가하는 효과 또한 CBD:THC 10:10 mg/Kg로 치료받은 SNL 쥐들의 아집단으로 평가되었고 그 결과는 하기에서 보고된다.

종합하면, 전기적 폰 프레이 테스트의 결과는 SNL-유도된 기계적 과민증을 감소시키는데 있어 5:5:5 mg/kg의 CBD:THC:CBC의 효능을 확인하고 이 만성 통증 관리용 제형의 효능을 나타낸다. 하기의 만성 통증의 추가 평가 및 운동역학적 분석을 통한 운동 조절(motor control)은 CBC가 더해질 때 CBD+THC의 향상된 효능을 설명한다.

칸나비크로멘은 CBD 및 Δ9-THC의 효과를 연장시키고 신경병증성 통증의 동물 모델에서 전체 운동 활성(Overall Locomotor Activity)을 현저하게 개선시킨다.

SNL 모델에서 임의의 미묘한(subtle) 내지 심각한(severe) 보행 변화를 감지할 수 있는 고 민감도 MotoRater에 의해 종합적인 운동역학적 분석을 수행했다. 속도 및 가속도와 같은, 각각의 특성들을 갖는 결합 위치 및 각도의 궤적을 기반으로 움직임을 평가하기 위해 복부, 측면 좌측 및 우측에서 3차원 관찰 및 분석을 수행했다. 비히클과 비교하거나, 각 치료 그룹 내에서 각 치료 그룹 마다 기준선으로부터의 거리를 기반으로 전체 점수를 보고하였다. 기록된 총 97개의 별개의 매개변수들을 사용하여 SNL 수술 후 4번, 투여 후 2h, 5h, 9h 및 24시간일 때 동물의 미세 운동 능력 및 보행을 평가하였다.

도 9는 SNL 쥐들의 치료 이후 7일 내지 9일 때의 보행 전체 점수를 보여준다. 이원 혼합된 ANOVA: 고정 효과(유형 III): 시간 p<0.0001, 그룹 p=0.0003; 시간 x 그룹 p = 0.0064; A. 통계학적으로 유의한 차이 vs. 비히클; 듀넷 검정 (5 패밀리, 패밀리당 4 비교). B. D7에 그룹 내 비교; 듀넷 검정 (5 패밀리, 패밀리당 4 비교).

도 10a는 모든 연구 그룹들에서 BL과 D7의 차이들의 PCA에 기초하여, SNL 유도된 운동 표현형을 나타내는 판별 벡터 바 그래프를 보여준다. 원래의 벡터 그래프를 화살표로 강조하였고, 상이하게 음영 표시된 바들은 SNL 운동 표현형에서 가장 많이 나타나는 특징적인 보행 특성들로서, 화살표로 강조하였다.

조정된 p-값들의 통계학적 유의도: * p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

변수의 수를 감소시키고, 별개의 매개변수들 사이의 상관관계를 밝히기 위해 매개변수 데이터에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행했다. PCA는 모든 매개 변수 데이터를 조합하고, 이들 사이의 상관관계를 밝히고, SNL-수술받은 쥐들의 미세 운동 및 보행 특징들의 전체적인 개요를 제공한다. SNL(0 = BL) 이후 매개변수들이 변화된 것을 보여주기 위해, 모든 연구 그룹들에서 기준선 BL과 D7의 차이들을 바 그래프로 나타냈다(도 10a). 바 길이 및 방향은 전체 점수에 기여하는 각 매개변수의 가중치를 나타낸다. SNL 모델의 운동 표현형은 하기와 같은 보행 특성들의 변화의 조합으로 특성화되고 해석될 수 있다(도 10a):

- 전체 속도는 주로 더 긴 보폭 거리(보폭 증가)로 인해 증가됨

- 뒷다리 좌-우 교대 리듬(L/R 커플링 H)이 증가하는 것을 제외하고 사지간 협동은 극적으로 변화하지 않음.

- 전체 엉덩이 높이 및 엉덩이 움직임의 수직 범위는 증가됨(꼬리 기저부 평균값/최대값/범위, 엉덩이 높이, 엉덩이 높이 범위, 장골능 높이)

- 꼬리 끝 위치가 더 낮음(꼬리 끝 최소값/평균값/최대값)

- 엉덩이 각도 범위가 증가됨

- 뒷다리 발가락 들림 증가

본 연구는, PCA를 기반으로 한 SNL-유도된 운동 표현형을 보고하고, 그룹들 사이를 기반으로 전체 보행 점수를 제시하고 CBD:THC 5:5 mg/kg 및 0-5mg 칸나비크로멘으로 치료한 쥐들의 그룹 내 비교를 제시한다. 그룹들은 비히클(음성 대조군) 및 프레가발린(양성 대조군)과 비교되었다. CBD:THC 10:10 mg/kg로 치료받은 SNL 쥐의 아집단의 추가 운동 표현형 평가는 하기와 같이 보고된다.

5:5:5 mg/kg 비의 CBD:THC:CBC 치료와 다른 칸나비노이드 또는 프레가발린 치료 그룹들 사이에서 한가지 현저한 차이점은 투여 후 5 시간 및 9 시간일 때 보행 전체 점수가 매우 개선된 것이었다 (각각, p < 0.05 및 p < 0.0001, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정)(도 9, A). 이 발견은 칸나비크로멘의 두 기능적 기여에 대한 강력한 증거를 제공한다.

도 9, A에서 나타난 것과 같이, CBD:THC 5:5 mg/kg는 비히클과 비교시 쥐들에서 보행 전체 점수를 개선하지 않았다. 반면, 칸나비크로멘을 CBD 및 Δ9-THC에 1:1:1 비로 첨가하는 경우 CBD 및 THC의 효과를 현저하게 증가시켰고 치료 후 최대 9시간까지 강력하게 촉각을 복구시켰다. 특히, 이 발견들은 촉각 이질통이 칸나비노이드들로 치료된 모든 다른 그룹들에 여전히 존재한다는 것을 나타낸다. 그러므로, CBD:THC:CBC 5:5:5 mg/kg로 치료받은 SNL 쥐들에서 향상된 운동성 및 촉각 이질통의 복구는 CBC의 첨가 때문이지 Δ9-THC의 향정신성 효과의 가리움(masking) 때문이 아니다. 칸나니크로멘을 CBD 및 THC에 첨가하는 것은 신경병증성 통증 관리에서 5:5:5 mg/kg 비의 CBD:THC:CBC의 효능을 입증하는 SNL 쥐의 전체 움직임을 효과적으로 개선했다.

미세 운동 운동역학적 분석의 또 다른 주요 발견은 5:5:5 mg/kg일 때 CBD:THC:CBC로 치료받은 쥐들의 전체 보행 점수에서 나타난 현저하게 유의한 시간-제한 효과였다. 이 데이터들은 모든 칸나비노이드 그룹들에서 투여에 대한 반응을 보여주었고; 여기서 기준선 점수로부터 멀어지는 것으로 지칭되는, 성장하는 전체 점수를 계속적으로 보여주는 비히클 및 프레가발린 그룹과 대조적으로, 점수는 기준선과 가깝게 감소되거나, 증가세가 멈추었다 (도 9, B). 분명히, 투여 후 2h 및 4h일 때, CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg를 치료받은 동물들은 투여 전 테스트와 비교하여 개선된 보행 성능 및 촉각의 복구를 보여주었다(도 9, B). 쥐의 수를 증가시키는 것은 통계학적 분석 및 테스트 결과를 개선시킬 수 있다.

따라서, 본 명세서는 CBD:THC:CBC 5:5:5 mg/kg가 투여 후 24h 기간에 걸쳐 촉각을 복구하는데 가장 강력한 화합물로 증명하는 증거를 제공한다. 이 제형은 투여 후 최대 9시간까지 운동 장애를 효과적으로 감소시켰다(p < 0.0001). 이 장기간의 효과는 프레가발린 또는 다른 칸나비노이드 그룹들로 치료받은 SNL-쥐들에서 관찰되지 않았다.

종합하면, 본 연구는 만성 신경병증성 통증에 대한 칸나비노이드 치료의 영향에 대한 종합적인 행동 표현형 평가를 제공한다. 5:5:5 mg/kg의 비 또는 1:1:1 비일 때 CBD:THC:CBC는 기계적 과민증에 있어 강력한 감소를 보여주었고, 또한, 단일 치료 후 9시간에 걸쳐 SNL-유도된 신경병증성 통증 모델의 이질통의 강력한 복구 및 매우 개선된 운동역학적 성능을 보여줬다.

이 발견은 칸나비크로멘의 적절한 투여량을 칸나비디올 및 Δ9-THC에 첨가하는 것은 통증 환자들의 일일 용량을 현저하게 감소시키고 또한 진통제인 CBD 및 Δ9-THC의 환자에 의한 총 복용량도 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

도 10b는 척추 신경 결착 부위의 해부학적 그림을 보여준다.

도 10c는 미세 운동 운동역학적 보행 분석의 개략적인 대표도를 보여준다. 움직임 추적 및 운동역학적 모델은, 일반적인 시-공간 매개변수(속도, 거리, 시간); 사지간 협동; 유각기(swing phase) 및 사지 궤적; 신체 자세 및 관절 각도, 및 총 100 초과의 매개변수들을 결정하기 위해 운동역학적 매개변수들에 대해 평가한다.

전체 보행 점수는 운동역학적 매개변수들을 하나의 단일 점수로 조합하여 결정된다. 이 점수는 건강한 대조군에 대한 질병 모델을 가장 잘 특성화 하는 운동역학적 매개변수들을 기초로 한다. 이 접근은 질병 모델 특이적 치료 효과를 결정하는데 매우 민감하다.

10:10mg/kg일 때 CBD:THC의 결과. CBD:THC 10:10 mg/kg - 아집단 비교. 이 아집단에서, 투여 후 24h의 기간에 걸쳐 통각을 복구하는데 가장 강력한 화합물은 [CBD+THC 10:10 mg/kg]이었다. 하지만, [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg] 및 [CBD+THC 10 mg/kg + CBC 2 mg/kg 또는 10:2:10mg/kg] 둘 모두 또한 비히클과 비교시, AUC의 매우 유의한 증가를 나타냈다. 곡선의 점들: 투여 전, 투여 후 2h, 4h, 8h, 및 24h (도 11).

도 11은 10 mg/kg THC를 복용한 아집단 그룹에 대한 AUC를 보여준다. 데이터는 각 그룹마다 PWT 기준선 + SEM의 백분율로 제시되고(상단), 이에 대응하는 곡선의 AUC로 제시된다. (그룹 크기 [CBD+THC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+CBC+THC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+THC 10 mg/kg + CBC 2 mg/kg], n = 7). 통계학적 유의도: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. 비히클 (Welch 독립표본 t-검정(Welch's unpaired t-test)).

도 12는 evF에 의해 측정되는 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량들의 효과를 보여준다. 데이터는 각 그룹마다 기준선 + SEM의 백분율로 제시된다. (그룹 크기: 비히클, n = 12; 프레가발린, n = 12; [CBD+CBC 10 mg/kg], n = 9; [CBC+THC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+THC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+CBC+THC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+THC 10 mg/kg + CBC 2 mg/kg], n = 7). 통계학적 유의도: A) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. 비히클; B) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. D7 (이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정).

10 mg/kg THC의 투여량을 공유하는 상이한 칸나비노이드 조합들을 비교하기 위해, 아집단의 그룹들을 구성하고 비교하였고 그 결과를 제시했다(도 12).

이 아집단에서, 이전에 제시된 5 mg/kg THC -아집단과 마찬가지로 유사한 효과가 나타났다. 하지만, 이 용량-혼합물에서, 실행된 이원 ANOVA는 이전에 선택된 그룹들 기준으로, 매우 유의한 치료-시간 상호작용 효과를 생성했다. 이 차이들을 더 시험하기 위해, 비히클과 [CBD+THC 10:10 mg/kg] 및 [CBD+THC 10:10 mg/kg + CBC 2 mg/kg] 둘 모두 사이의 적절한 쌍별 상후 검정 비교를 수행했다. 두 그룹들 모두 투여 후 2h일 때 비히클 그룹과 유의한 차이를 나타냈다. 투여 후 4h일 때 [CBD+THC 10:10 mg/kg + CBC 2 mg/kg]의 결과는 비히클 결과보다 여전히 유의하게 높았지만, 이 시점일 때 [CBD+THC 10:10 mg/kg]의 결과는 더 낮게 유지되었고, 비히클과 비교시 유의하게 복구된 과민증을 향한 약간의 경향 (p<0.1)을 나타냈다(이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정)(도 12).

그룹 내 비교는 10 mg/kg의 THC 아집단의 민감도 수준에 대한 매우 유의한 시간-제한 효과를 나타냈는데, 이는 이전에 5 mg/kg THC 아집단에서 확인한 것과 같이, 투여 후 2시간에 피크에 도달하고 이후 투여 전 수준으로 점차적으로 되돌아가는, 투여에 대한 유사한 동적 반응을 보였다. 투여 전부터 투여 후 2h까지 인지할 수 있는 통계학적 유의도는 이 아집단의 모든 칸나비노이드 그룹들에서 확인되었고, 프레가발린 그룹에서도 확인되었다(p < 0.05, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 12). [CBC+THC 10:10 mg/kg], [CBD+THC 10:10 mg/kg], [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg] 및 [CBD+THC 10 mg/kg + CBC 2 mg/kg 또는 10:10:2 mg/kg]에서 또한 투여 전 수준과 유의한 차이 또는 거의 유의한 차이들이 확인되었다. 심지어 투여 후 8시간일 때에도, [CBD+THC 10:10 mg/kg 및 [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg]에서는 복구된 과민증이 여전히 유의했다(p < 0.05, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 12).

5 mg/kg THC 아집단 비교에서 거의 유의한 것으로 확인된, 약간 상승하는 경향은 10 mg/kg THC 아집단에서 유의하지 않은 것으로 확인되었다(p = 0.1588, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 12).

이 분석들 사이의 차이는 단지 통계학적 모델링의 특성을 나타내는 것일 뿐이며, 따라서 신뢰 구간 및 p-값들은 분석에 포함된 모든 그룹들에서 확인된 전체 분산(overall variance)을 기초로 하므로, 분석에 포함되는 그룹들의 조합에 따라 최종 p-값들이 약간 변화되는 것은 주목할 가치가 있다.

증가하는 CBC 용량의 효과. 증가하는 CBC 투여량의 효과를 시험하기 위해, 하기와 같은 아집단의 그룹들을 구성하였다. CBD+THC 5 mg/kg, CBD+THC 5:5 mg/kg + CBC 1 mg/kg 및 CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg (도 13). CBD+THC :10 mg/kg, CBD+THC+CBC 10:10:2 mg/kg 및 CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg (도 14).

도 13은, evF에 의해 측정되는 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량들의 효과를 보여준다. 데이터는 각 그룹마다 기준선 + SEM의 백분율로 표시된다. (그룹 크기: [CBD+THC 5 mg/kg], n = 8; [CBD+THC 5 mg/kg + CBC 1 mg/kg], n = 9; [CBD+THC+CBC 5 mg/kg], n = 9). 통계학적 유의도: A) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. 비히클; B) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. D7 (이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정).

제1 아집단 (5 mg/kg THC-그룹들)에서, 증가된 CBC 용량은, 0 또는 1 mg/kg CBC를 치료받은 그룹들과 비교시, 과민증 복구가 조금 개선되는 것으로 보인다. 그럼에도, 유의한 치료 효과, 또는 치료-시간 상호작용 효과가 이 아집단의 그룹들에서 나타나지 않았다(p > 0.05, 이원 ANOVA) (도 13). 하지만, 투여 후 24h일 때, CBC가 없는 그룹, 즉 [CBD+THC 5:5 mg/kg]에 대한 쌍별 사후 검정 비교에서, [CBD+CBC 5 mg/kg] 및 [CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg] 사이에서 “유의한 차이 (p < 0.1)를 향한 확립된 경향”이 존재한다(p = 0.0904, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 13).

또한, 매우 유의한 시간-제한 효과 또한 이 아집단에서 확인되었다. 투여 전 및 투여 후 2h 값 사이의 통계학적으로 유의한 차이가 이 아집단의 모든 그룹에서 확인되었다(p < 0.05, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 13). [CBD+THC 5:5 mg/kg] 및 [CBD+THC+CBC 5:5:5 mg/kg] 그룹들의 경우에도 투여 후 4h일 때 투여 전 수준과 유의한 차이가 확인되었다.

투여 후 24h일 때, 가장 높은 CBC 농도를 갖는 그룹의 결과값이 여전히 투여 전 수준보다 높다는 것은 주목할 가치가 있다. 하지만, 이 시점에서 투여 전 수준과의 차이는 유의하지 않게 유지된다.

도 14는, evF에 의해 측정되는 SNL-유도된 기계적 과민증의 강도에 대한 칸나비노이드들의 다수의 개별 용량들의 효과를 보여준다. 데이터는 각 그룹마다 기준선 + SEM의 백분율로 제시된다. (그룹 크기 [CBD+THC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+THC+CBC 10 mg/kg], n = 9; [CBD+THC 10 mg/kg + CBC 2 mg/kg], n = 7). 통계학적 유의도: A) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. 비히클. B) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. D7 (이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정).

제2 아집단의 그룹들 사이의 비교: [CBD+THC 10:10 mg/kg], [CBD+THC+CBC 10:10:2 mg/kg], [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg]는 도 14에서 차이를 보인다.

10 mg/kg THC에서, 증가하는 CBC 용량은 THC+CBD의 복구 효과(reversing effectivity)를 조금 감소(marginal reduction)시키는 것으로 보인다. 하지만, 유의한 치료 효과 또는 치료-시간 상호작용이 이 아집단의 그룹들 사이에 나타나지 않았다(p > 0.05, 이원 ANOVA) (도 14). 하지만, 투여 후 2h(2h PD)일 때, [CBD+THC 10:10 mg/kg]에 대한 쌍별 사후 검정 비교에 의해, [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg]에서 유의하게 낮은 결과(= 더 높은 과민증/이질통)가 나타났다(p < 0.0264, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 14).

다시 말하자면, 매우 유의한 시간-제한 효과가 이 아집단의 그룹들에서 나타났다. 통계학적 유의함이 모든 그룹들에서 확인되었다. 이 아집단에서 투여 후 2h일 때 유의하거나 거의 통계적으로 유의한 이질통 복구(더 높은 값)를 나타냈다(p < 0.05, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정) (도 14). 투여 전과의 유의한 차이는 투여 후 4h일 때 모든 그룹들에서 추가로 발견되었고, 투여 후 8h일 때 [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg]에서 추가로 발견되었다(도 14).

이 아집단과 마찬가지로, 이전 아집단들의 경우, 투여 후 24시간일 때, 가장 높은 CBC 농도를 갖는 그룹의 결과값이 여전히 투여 전 수준보다 높다는 것은 주목할 가치가 있다. 하지만 이 시점에서 투여 전 수준과의 차이는 유의하지 않게 유지된다.

여기서 주목할 가치가 있는 것은, 투여 후 2시간일 때 피크에 도달하고 점차적으로 SNL 부상 수준에 가깝게 되돌아가는 투여에 대한 동적 반응의 형태이다. 시간에 따라 변화하는 반응 강도는 낮은 CBC 투여 그룹들과 비교시, 높은 CBC 투여 그룹과 분명히 차이가 있다. 다른 그룹들에서 볼 수 있는 유사한 투여 후 2시간일 때의 피크가 [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg]에서 없더라도, 점차적인 증가(더 낮은 과민증)가 4h 및 8h 시점을 통해 나타난다. 투여 후 24시간일 때, 그 수준은 여전히 투여 전 값보다 높다(유의하지 않은 차이).

전체 보행 점수는, PCA 분석에서 확인되는(및 판별 방향 벡터를 “야드자(yardstick)”로 사용함) 이러한 모든 변화들을 반영하고, 기준선에서 평균 점수가 0인 방식으로 제시된다. D7에, 모든 연구 그룹들의 평균 점수는 3.107이다(Z-점수). 전체 점수의 감소는 보행 성능이 SNL 이전 상태(BL)를 향해 변하는 것을 의미한다.

하기에서, 앞서 기재된 아집단들에서 제시된 전체 보행 점수가 제시된다.

CBC는 CBD 및 THC의 효과를 강력하게 연장시키고 SNL-유도된 이동 장애를 현저하게 개선했다: THC 10 mg/kg - 아집합 비교. 10 mg/kg의 THC 투여량을 공유하는 상이한 칸나비노이드 조합들을 비교하기 위해, 하기와 같은 그룹들의 아집합을 구성하고 비교하였고 이는 도 15에 따라 제시되었다. 비히클, CBD+THC 10:10 mg/kg, CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg 및 CBD+THC+CBC 10:10:2 mg/kg.

도 15는 THC 10 mg/kg - 아집합들 내의 전체 보행 성능(보행 전체 점수)을 보여준다. 데이터는 각 그룹마다 평균값 + SEM으로 제시된다. 통계학적 유의도: A) * p < 0.05, vs. 비히클; B) ㆍ p < 0.1; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, vs. D7 (이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정).

비히클 그룹과 비교할 때, 유의한 치료 효과 및 매우 유의한 치료 효과(기준선에 대한)가 이 아집단의 그룹에서 생성되었다. 추가의 쌍별 사후 검정 비교는, 투여 후 5h 및 9h 시점 둘 모두에서, [CBD+THC 10:10 mg/kg] 및 [CBD+THC+CBC 10:10:10 mg/kg] 둘 모두 비히클 그룹과 상당한 차이를 생성할 수 있음을 보여주었다(p < 0.05, 이원 ANOVA, 듀넷 사후 검정)(도 15, A).

또한, 그룹 내 시점 간 전체 보행 점수들을 비교할 때, 매우 유의한 시간-제한 효과(time-bound effect)가 나타났다. 5 mg/kg THC 아집단과 유사하게, 모든 칸나비노이드 그룹들에서, 점수는 기준선과 가깝게 감소되거나, 증가세가 멈추었다. 비히클 및 프레가발린 그룹에서는 완전히 상이한 점수 패턴이 나타났고, 투여 후 9h까지 점수가 증가하였다가, 투여 후 24h까지 조금 감소하였다(도 15, B).

표 3은 전기적 폰 프레이 곡선 아래 면적(AUC)에서 치료 그룹들의 다중/쌍별 비교를 제공한다. 더 밝은 음영 배경: 터키 다중 비교에 의한 p < 0.05; 더 어두운 음영 배경: 쌍별 비교를 위한 피셔 LSD에서 p < 0.05. Diff: 차이, CI: 신뢰구간, SE: 표준 오차.

[표 3]

전자 폰 프레이 AUC에서 치료 그룹들의 다중/쌍별 비교

이 데이터들은 CBC가 없는 제형들에 비해 CBD, CBC 및 THC 모두 존재하는 제형들에서 통증 관리/통증 완화가 개선되는 것을 보여준다.

운동역학적 매개변수를 평가하기 위해, 동일한 양의 CBD, CBC, 및 THC를 함유하는 제형들을 오직 CBD 및 THC만을 갖는 제형들에 대해, 또는 비히클에 대해 테스트하였다. 이 데이터들은 제형이 제3의 주요 칸나비노이드인 CBC를 갖는 이점을 강조한다.

도 16은, 제형에서 CBC를 CBD+THC에 첨가하는 유익한 영향을 보여주는, 운동역학적 보행 매개변수의 대표값들을 보여준다. 데이터는 기준선, 투여 후 D7, D8-5h, D8-9h 및 D9에 제시된다. 통계학적 유의도: p ≤ 0.01이 조정된 p-값에 기초하여 유의한 것으로 여겨진다.

A- 발목 가동 범위(Ankle Range of Motion; ROM) - 투여 후 D9: CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg) vs. CBD+THC (5:5 mg/Kg): **p = 0.009. B - %발 궤적 형태(앞다리) - D9: CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg) vs. CBD+THC (5:5 mg/Kg): **p = 0.003. C - 전체 %듀티 사이클(overall %Duty cycle)-D8-5h 및 D8-9h: CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg) vs. 비히클: ** p = 0.003 및 ** p = 0.004. D- %뒷다리 듀티 사이클 - D8-5h 및 D8-9h: CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg) vs. 비히클: 각각, ** p = 0.005 및 ** p = 0.003. E - 발가락 리프트오프(Toe Liftoff) 각도 뒷다리 [도(degree)] - 투여 후 D9: CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg) vs. 비히클: **p = 0.000598. F - 한다리 지지(Support Single): D8-5h 및 D8-9h: CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg) vs. 비히클: 각각, ** p = 0.003 및 *p = 0.014. N1/N2: 그룹 크기.

표 4는 투여 전 및 투여 후를 비교한 특정 운동역학적 보행 매개변수의 다중/쌍별 비교를 보여준다. 유의한 효과(p ≤0.01) 만이 표시되고, Adj. sig(조정된 유의도) = *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001이다.

[표 4]

도 16 및 표 4에 제시된 데이터는 세 주요 칸나비노이드들이 제형에 함께 존재할 때 CBC의 CBD+THC의 효과를 연장시키는 상당한 효과를 보여주는데, 이는 CBD+THC 혼합물(CBC 부재)에 비해 더 오래 지속되는 통증 관리로 나타난다. 예를 들면, CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg)를 치료받은 쥐들은 투여 후 최대 24시간(도 16, A, B, E)까지 관절 각도 및 발 궤적에서 현저한 개선을 보여주었다. 또한, CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg)의 치료는 투여 후 최대 9시간까지 표면에 대한 발 접촉(paw contact)의 지속시간(% 듀티 사이클)에 있어 상당한 향상을 보여준 반면, CBC 부재 하에 CBD+THC는 비히클과 비교시, 연장 효과를 보여주지 않았다. CBD+THC+CBC (5:5:5 mg/kg)로 SNL 쥐들을 치료하는 것은 비히클과 비교하여 투여 후 최대 9시간까지 % 한다리 지지(도 16, F)로 나타낸 사지간 협동(interlimb coordination)을 실질적으로 개선한 반면, CBD+THC는 사지간 협동 및 통증 관리를 효과적으로 개선하지 않았다.

실시예 5

통증 관리용 제형: 포유동물 세포들에서 발현되는 TRPA1 채널에 대한 효과

요약

작용제 모드의 ScreenPatch® 분석(IonWorks™ Barracuda Based Assay)을 사용하여, 포유동물 세포들에 발현되는 인간 TRPA1 채널에 대한 효과에 대해 통증관리를 위한 제형들을 테스트하였다. 제시된 데이터는 이온 채널 수준에서 칸나비노이드들(CBD:THC:CBC)의 시너지 효과를 확인했다.

재료 및 방법

테스트 물품. 테스트 물품(여기서 테스트 제형으로도 지칭됨)을 8-포인트 농도-반응 포맷(4 반복수의 웰/농도, 표 4)으로 평가했다. 테스트 물품들을 용해시키고 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 초기에 연속으로 희석했다. 세포외 용액에서 최종 희석했다. 최종 DMSO 농도는 0.6% (v/v)였다.

양성 대조군 치료 그룹. 양성 대조군 물품들의 스톡 용액들을 배치로(in batches) 제조했고, 개별 사용을 위해 분획화했다(aliquoted). 실험 당일에 양성 대조군 테스트 용액들을 새로 제조했다. 최종 DMSO 농도는 0.6% (v/v)였다. 본 연구에서, TRPA1 작용제 머스타드 오일(MO)을 양성 대조군 작용제로 사용했고. 기준 길항제(Reference antagonist), 루테늄 레드 (0-10 μM)를 TRPA1 둘 모두에 사용했다.

측정. 도 17은 3000 μM 머스타드 오일의 적용에 의해 생성된 전류의 대표 예시 및 피크 전류 진폭(peak current amplitude)에서의 최대 전류의 측정을 보여준다.

도 17은 TRPA1 수용체를 발현하는 세포들에 3000 μM 머스타드 오일을 적용하여 생성된 전류의 대표 트레이스를 보여준다. 수직선은 적용의 시작을 나타낸다. 수직 방향의 2개의 화살표는 측정이 수행된 지점들을 나타낸다(~ 4nA).

TRPA1 채널.

테스트 시스템: CHO 세포에서 발현된 TRPA1 이온성 수용체들

테스트 플랫폼: Ionworks Barracuda™

전기생리학적 절차. 세포내 용액 (mM): 50 mM CsCl, 90 mM CsF, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES. CsOH로 pH를 7.2로 조정함. 세포내 용액을 배치로(in batches) 제조하고 실온에서 보관했다. 기록 세션(recording session)을 위한 준비로, 세포내 용액을 PPC 평면 전극 (PPC planar electrode)의 세포내 구획 내에 로딩했다.

세포외 용액, HB-PS(mM의 조성): NaCl, 137; KCl, 1.0: MgCl₂, 2; CaCl₂, 2; HEPES, 10; 글루코스, 10; NaOH로 pH를 7.4로 조정함(사용할 때까지 냉장 보관). 고정 전압(Holding potential): -70 mV, 작용제/길항제 적용 동안의 전압: -70 mV.

기록 절차. 세포외 완충액을 PPC 플레이트 웰들에 로딩했다(웰당 11 μL). 세포 현탁액을 PPC 평면 전극의 웰들에 피펫팅했다(웰당 11 μL).

온-보드 패치 클램프 증폭기(on-board patch clamp amplifiers)에 의해 기록된 막 전류로 패치 천공(patch perforation)을 통해 전체 세포 기록 구성을 구축했다.

단일 적용 (스캔) 프로토콜을 사용했다.

테스트 물품 투여. 상기 적용은 20 μL의 2X 농축된 테스트 물품 용액을 10 μL/s (총 적용 시간 2초)로 첨가하는 것으로 이루어진다.

TRPA1 양성 대조군 - 작용제. 0-3000 μM 머스타드 오일 (8 농도 용량-반응, 4 반복수, 반 로그 스케일).

양성 대조군 - 길항제. 0-10 μM(루테늄 레드) (8 농도, 4 반복수, 반 로그 스케일).

대조군 물품.

TRPA1 수용체 작용제:

명칭: 알릴 이소티오시아네이트 (머스타드 오일)

공급원: Sigma-Aldrich

M.W. 99.15

선정 이유: 알릴 이소티오시아네이트는 TRPA1 수용체의 작용제이다.

TRPA1 수용체 길항제:

명칭: 루테늄 레드

공급원: Sigma-Aldrich

M.W. 786.35

선정 이유: 루테늄 레드는 TRPA1 수용체의 길항제이다.

플레이트 로드 맵(Plates Load Map)

본 연구에서 사용된 예시적인 플레이트 로드 맵은 도 18에 나타낸 개략도에서 나타난다.

작용제 및 길항제 기준 대조군(reference control): 각각 TRPA1 0-3000 μM 머스타드 오일 및 루테늄 레드 0-10 μM, 1x 농도에서 수행됨.

결과

HTS 전기생리학-기반 접근, Ion Work Barracuda (IWB)를 사용하여 칸나비크로멘(CBC), 및 칸나비디올 (CBD)과 Δ9-THC의 혼합물의 작용제 특성들을 시험했다. 단일-적용 프로토콜을 사용했다.

TRPA1 수용체들에서 CBC 및 CBD+THC 혼합물의 작용제 활성

기준 작용제(Reference agonist), 머스타드 오일은 TRPA1 수용체들의 활성화를 EC50= 479 μM로 생성했다. 비선택적 억제제, 루테늄 레드(ruthenium red)는 TRPA1 수용체들을 IC50=1.79 μM로 억제했다. EC₅₀ 및 IC-₅₀ 값들 모두 과거 데이터와 일관되었다.

도 19a 및 도 19b, 및 도 20a 및 도 20b에서 보여지는 것과 같이, 3000 μM 머스타드 오일을 적용하여 생성한 전류를 기준으로 활성화의 퍼센트를 계산했다.

도 19a는 TRPA1 수용체에서 화합물의 활성의 플롯 표현 및 수치 정보를 보여준다. 플롯들은 CBD+THC 농도 반응 곡선(CRC)을 나타낸다. A: 머스타드 오일 CRC. B: 메탄올 CRC 0-10%, 반 로그 스케일. C: 루테늄 레드 CRC 0-10 μM, 반 로그 스케일. D: CBC CRC, 0-300 μM. E(+0.1 μM CBC) 및 F(+0.1 μM CBC): CBC (0.1 및 0.3 μM)의 증가하는 농도 하에서 CBD+THC 혼합물의 농도 반응 곡선. E 및 F의 X축은 CBD+THC의 농도 (각각 0.1 내지 300 uM)를 보여준다. 100%(대조군의 %)로 설정된 3000 μM 머스타드 오일에 의해 생성된 전류를 기준으로 모든 값들을 계산한다.

도 19b는 TRPA1 수용체에서 화합물의 활성의 플롯 표현 및 수치 정보를 보여준다. 플롯들은 CBD+THC 농도 반응 곡선(CRC)을 나타낸다. G 내지 L: CBC의 증가하는 농도(1 내지 300 μM) 하에서 CBD+THC 혼합물의 농도 반응 곡선. G 내지 L의 X축은 CBD+THC의 농도(각각 1 내지 300 μM)를 보여준다. 100%(대조군의 %)로 설정된 3000μM 머스타드 오일에 의해 생성된 전류를 기준으로 모든 값들을 계산한다.

도 20a는 TRPA1 수용체에서의 화합물의 활성의 플롯 표현 및 수치 정보를 보여준다. 플롯들은 CBC 농도 반응 곡선(CRC)을 나타낸다. A: 머스타드 오일 CRC. B: 메탄올 CRC, 0-10%, 반 로그 스케일. C: 루테늄 레드 CRC, 0-10 μM, 반 로그 스케일. D: CBC CRC, 0-300 μM. E 및 F: CBD+THC 혼합물의 증가하는 농도(각각 0.1 및 0.3 μM) 하에서 CBC CRC. 100%(대조군의 %)로 설정된 3000 μM 머스타드 오일에 의해 생성된 전류를 기준으로 모든 값들을 계산한다.

도 20b는 TRPA1 수용체에서의 화합물의 활성의 플롯 표현 및 수치 정보를 보여준다. 플롯들은 CBC 농도 반응 곡선(CRC)을 나타낸다. G 내지 L: CBD+THC 혼합물의 증가하는 농도(각각 1-300 μM) 존재 하에서 CBC CRC. 100%(대조군의 %)로 설정된 3000 μM 머스타드 오일에 의해 생성된 전류를 기준으로 모든 값들을 계산한다.

CBC는 TRPA1 수용체들에서의 약한 부분 작용제 활성(partial agonist activity)을 EC₅₀ ~ 40 μM 및 E_MAX ~10%로 보여줬다. CBD+THC 혼합물은, 2.94 μM 내지 5.4 μM (CBC의 상이한 농도에서) 범위의 EC-₅₀ 및 3000μM 머스타드 오일에 의해 생성된 최대 전류 기준 50% - 60%의 E_MAX로, 보다 강력하고 보다 뚜렷한 부분 작용제 활성을 보여줬다.

두 방식으로 데이터 분석을 수행했다: 제1 방식: 표 5 및 도 19a 및 19b는 CBC의 증가하는 농도(0-300 μM)의 존재 하에서 CBD+THC 혼합물 CRC를 보여준다. 제2 방식: 표 6 및 도 20a 및 20b는 CBD+THC 혼합물의 증가하는 농도(각각 0-300 μM) 하에서 CBC CRC를 보여준다.

표 5는, CBC의 증가하는 농도(0-300 μM) 하에서 CBD+THC 혼합물(각각 0-300 μM)의 작용제 활성의 수치 정보를 보여준다. CBC는 CBD+THC 혼합물에 대한 농도 반응에 유의한 효과를 갖지 않는 약한 부분 작용제로 농도 반응을 생성했지만, 세 칸나비노이드들 모두를 합한 작용제 효과에 대한 경향을 보여주었음을 주목한다.

[표 5]

표 6은 대조군에서 CBC (0-300 μM) 및 CBD+THC 혼합물의 증가하는 농도(0.1-300 μM)의 존재 하에서 CBC의 작용제 활성의 수치 정보를 보여준다. 농도 ≥ 3 μM일 때, CBD+THC 혼합물은, CBC에 대한 농도 반응을 차단한(occlude), 농도 자체 반응(concentration own response)을 생성했음을 주목한다. CBD+THC 혼합물 (1μM)에 의한 TRPA1 수용체들의 역치 활성화에서, TRPA1 수용체들의 농도 반응은 역가 및 효능에 있어 증가했다(굵은 글씨로 표시).

[표 6]

CBC CRC는 CBD+THC 혼합물의 농도를 증가시켜 차단됐고(occluded), 3μM CBD+THC 혼합물로 시작하여 CBC CRC가 가려졌다(masked).

CBC는 CRD+THC 혼합물 CRC의 EC₅₀ 및 E_MAX에 효과를 갖지 않는다. 테스트된 가장 높은 농도의 CBC에서, CBD+THC 혼합물 CRC의 초기 부분이 증가되었고, CBD+THC 혼합물 CRC에서 EC₅₀를 우측으로 조금 이동시켰다. CBC 및 CBD+THC 혼합물이 TRPA1 수용체들의 동일한 결합 부위에 작용하여 상이한 정도의 부분 작용으로 수용체 활성화를 일으키는 것이라는 결론을 내릴 수 있다.

CBC에 대한 농도 반응의 양성 조작(시너지)은 CBD+THC 혼합물의 역치 가까이의 농도(1μM, 표 6 및 도 20a의 D, 및 도 20b의 G)에서 관찰됐고 하기로 이루어졌다: (1) EC₅₀=44.1 μM(도 20a의 D)에서 EC₅₀=26.0 μM(도 20b의 G)의 농도 반응 곡선의 좌측 이동; 및 (2) 300 μM CBD+THC 혼합물에서 10.3±1.9% (n=4)부터 최대 16.2±1.3% (n=4)까지의 효율 증가.

2개의 부분 작용제들에서 관찰된 시너지는, TRPA1 수용체에 대한 2개의 동일한 결합 부위의 존재 및 상기 수용체들에 대한 2개의 리간드 모이어티들의 결합할 때의 양성 협동성(오르토스테릭 조절(orthosteric modulation))에 기인할 수 있다. 예를 들면, 제1 결합 부위에 대한 하나의 리간드 모이어티의 결합은 수용체를 프라이밍(prime)하거나 제2 결합 부위에 대한 결합 친화도를 증가시킨다. 다른 설명은 양성 알로스테릭 조절 부위의 존재이다. 작용 메커니즘에 국한되지 않고, 시너지 효과들이 관찰됐다.

결론

상기 데이터들은 인간 통각의 중요한 센서(sensor)로서, TRPA1(일과성 수용체 전압 안키린 1) 이온 채널에 대한 CBC의 직접적인 활성화가 확인된다.

TRPA1 수용체에서 CBC 및 CBD+THC 혼합물의 부분 작용 활성 또한 확인되었다.

CBC 및 CBD+THC의 작용제 활성은 아마도 동일한 결합 부위를 통해 매개되었을 것이다.

CBD+THC 혼합물(각각 1 μM)에 의한 TRPA1 수용체의 역치 가까이의 활성화에서, CBC는 더 높은 효능 및 역가(potency)로 TRPA1 수용체들을 활성화했다. 칸나비크로멘 E_MAX (효능)은 10±2%에서 최대 16±1%까지 증가했고, 이의 역가는 EC₅₀=44 μM에서 EC₅₀=26 μM로 변하였다(도 20a 및 20b).

본 연구는 또한 CBC와 CBD+THC 사이의 시너지 효과를 확인한다.

상기 2개의 부분 작용제들에서 관찰된 시너지는 이론적으로 TRPA1 수용체에 2개의 동일한 결합 부위가 존재하는 것, 및 2개의 리간드 모이어티가 수용체에 결합할 때의 양성 협동성(오르토스테릭 조절)으로 설명된다. 예를 들면, 제1 결합 부위에 대한 한 리간드 모이어티의 결합은 수용체를 프라이밍하거나 제2 결합 부위의 친화도를 증가시킨다. 다른 설명은 특정 양성 알로스테릭 조절 부위의 존재이다. 이 시너지 효과의 정확한 메커니즘을 밝히기 위해서는 추가 실험들이 설계되어야만 한다.

종합하면, TRAPA1 이온 채널의 활성화에 대한 칸나비크로멘의 직접적인 효과 및 칸나비크로멘과 CBD+THC의 역가의 증가는 CBC가 통증 관리 특성을 갖고 있음을 더 확인한다. 그러므로, CBD 및 Δ9-THC에 CBC를 첨가하면 통증 관리를 위한 환자의 CBD 및 THC의 복용을 낮출 수 있다.

전술한 설명에서, 구현예들의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 세부사항들이 설명의 목적으로 제시된다. 하지만, 이러한 특정 세부사항들이 필요하지 않음이 당업자에게 명백할 것이다. 여기에 인용된 참조문헌들은 참조로 포함된다.

전술한 구현예들은 단지 예시로 의도된 것이다. 특정 구현예들에 대한 변경, 수정, 변형들이 당업자에 의해 수행될 수 있다. 청구범위는 여기에 제시된 특정 구현예들로 국한되어서는 안 되고, 명세서 전체에 걸쳐 일관된 방식으로 해석되어야 한다.

참조문헌

하기 문서들은 여기서 참조로 포함된다.

WO2016/044370 A1

WO2013/165251 A1

WO2012/144892 A1

WO2012/160358 A1

WO2007/083098 A1

US2016/0106705

US2016/0360721

US2018/0193304

Bouhassira D, 2008 “Prevalence of chronic pain with neuropathic characteristics in the general population.” Pain, Jun;136(3):380-7.

Crippa JA, Crippa AC, Hallak JE, Martin-Santos R, Zuardi AW. 2016. "Δ9-THC intoxication by cannabidiol-enriched cannabis extract in two children with refractory epilepsy: full remission after switching to purified cannabidiol." Front. Pharmacol. 7:35.

Crippa JS, Suimeraes FS, Campos AC, Zuardi AW. 2018. "Translational Investigation of the Therapeutic Potential of Cannabidiol (CBD): Toward a New Age." Fron. Immunol.

De Petrocellis L, Ligresti A, Moriello AS, Allara M, Bisogno T, Petrosino S, Stott CG, Di Marzo V. 2011. "Effects of cannabinoids and cannabinoid-enriched Cannabis extracts on TRP channels and endocannabinoid metabolic enzymes." Br J Pharmacol 163:1479.

Deyo R, Musty R. 2003. "A cannabichromene (CBC) extract alters behavioral despair on the mouse tail suspension test of depression." Proceedings 2003 Symposium on the Cannabinoids. Cornwall, ON: International Cannabinoid Research Society. Cornwall, ON. 146.

Elsohly M, Gul W. 2014. “Constituents of Cannabis sativa”. In: Pertwee RG (ed) Handbook of Cannabis. Oxford: Oxford University Press.

Guimar

es FS, Chiaretti TM, Graeff FG, Zuardi AW. 1990. "Antianxiety effect of cannabidiol in the elevated plus-maze”. Psychopharmacology (1990)100:558-9.

Izzo AA, Borrelli F, Capasso R, Di Marzo V, Mechoulam R. 2009. "Non-psychotropic plant cannabinoids: new therapeutic opportunities from an ancient herb." Trends Pharmacol Sci 30:515.

Izzo, AA, and Aviello G, Borrelli F, Romano B, Piscitelli F, Gallo L, Capasso F, Orlando P, Di Marzo V Capasso R. 2012. "Inhibitory effect of cannabichromene, a major non-psychotropic cannabinoid extracted from Cannabis sativa, on inflammation-induced hypermotility in mice." Br J Pharmacol 166(4):1444-60.

Kim, SH, and Chung JM. 1992 “An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat.” Pain. Sep;50(3):355-63.

Lewis M A, Russo EB, and Smith KM. 2017. "Pharmacological foundations of cannabis chemovars." Planta Med. 84: 225-233.

Maione S, Piscitelli F, Gatta L, D. Vita, L. De Petrocellis, E. Palazzo, V. de Novellis, V. Di Marzo. 2011. "Non-psychoactive cannabinoids modulate the descending pathway of antinociception in anaesthetized rats through several mechanisms of action." Br. J. Pharmacol. 162: 584-596.

Mandolini GM, Lazzaretti M, Pigoni A, Oldani L, et al. 2018. "Pharmacological properties of cannabidiol in the treatment of psychiatric disorders: a critical overview." Epidemiol Psychiatr Sci. 27(4):327-335.

Morales P, Hurst, D. P., and Reggio, P. H. 2017. "Molecular targets of the phytocannabinoids-a complex picture." Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 103-131.

Patel, S., Hill, M. N., Cheer, J. F., Wotjak, C. T., and Holmes, A. 2017. "The endocannabinoid system as a target for novel anxiolytic drugs." Neurosci. Biobehav. Rev. 76: 56-66.

Reithmeier D, Tang-Wai R, Seifert B, Lyon AW, Alcorn J, Acton B, Corley S, Prosser-Loose E, Mousseau DD, Lim HJ, Tellez-Zenteno J, Huh L, Leung E, Carmant L and Huntsman RJ. 2018. "The protocol for the Cannabidiol in children with refractory epileptic encephalopathy (CARE-E) study: a phase 1 dosage escalation study." BMC Pediatrics 18:221.

Russo, EB. 2011. "Taming THC: potential cannabis synergy and phytocannabinoid-terpenoid entourage effects." Br J Pharmacol 163:1344.

Shinjyo N, Di Marxo V. 2013. "The effect of cannabichromene on adult neural stem/progenitor cells." Neurochemistry International 63(5): 432-437.

Wolf SA, Bick-SanderA, Fabel K, Leal-Galicia P, Tauber S, Ramirez-Rodriguez G, et al. 2010. "Cannabinoid receptor CB1 mediates baseline and activity-induced survival of new neurons in adult hippocampal neurogenesis." Cell Commun Signal. 8:12.

Claims (18)

1. 통증 관리(pain management)를 필요로 하는 대상체에 의한 통증 관리에 사용하기 위한 제형으로서, 상기 제형은 테트라하이드로칸나비놀(THC), 칸나비크로멘(CBC), 및 칸나비디올(CBD); 및 하나 이상의 부형제로 이루어지고;
   상기 THC:CBC:CBD의 비는 중량 % 기준으로 1:1:1:이고,
   상기 통증 관리는 부상으로 인한 통증, 신경병증성 통증, 또는 말초 신경병증으로 인한 통증의 감소를 포함하는 것인, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 통증 관리는 신경병증성 통증의 치료를 포함하는 것인, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 제형은 환제, 정제, 젤 캡슐, 시럽제, 오일계 스프레이(oil-based spray), 및 액상 오일 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 형태(dosage form)로 제조되는, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 제형은 용량당(per dose) 1 mg 내지 25 mg의 칸나비노이드의 총량을 제공하는, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 제형은 용량당 5 mg 내지 20 mg의 칸나비노이드의 총량을 제공하는, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 제형은 용량당 최대 20:20:20 mg의 양으로 THC:CBC:CBD를 대상체에 제공하는, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 제형은 용량당 5:5:5 내지 10:10:10 mg 범위의 양으로 THC:CBC:CBD를 대상체에 제공하는, 통증 관리에 사용하기 위한 제형.
   
9. 부상으로 인한 통증, 신경병증성 통증, 또는 말초 신경병증으로 인한 통증의 감소를 포함하는 통증 관리에 사용하기 위한 지침들(instructions)과 함께, 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 통증 관리에 사용하기 위한 제형을 포함하는, 상용 패키지(commercial package).
   
   
   
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제

Images