KR102442231B1 - 종양 치료를 위한 키누레닌 고갈 효소의 투여 - Google Patents

종양 치료를 위한 키누레닌 고갈 효소의 투여 Download PDF

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Abstract

키누레니나제 활성을 가진 단백질을 사용하는 것과 연관된 방법 및 조성물이 기술된다. 예를 들면, 특정 양태에서 키누레닌을 분해할 수 있는 변형된 키누레니나제가 개시될 수 있다. 추가로, 본 발명의 특정 양태는 개시된 단백질 또는 핵산을 이용한 키누레닌 고갈을 통해 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

종양 치료를 위한 키누레닌 고갈 효소의 투여{ADMINISTRATION OF KYNURENINE DEPLETING ENZYMES FOR TUMOR THERAPY}
발명의 배경
본 출원은 2013년 8월 30일에 출원된 제61/872,132호, 및 2014년 4월 30일에 출원된 제61/986,366호 미국 가출원 특허의 우선권 이익을 주장하며, 본 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명은 미 국립보건원이 수여한 인가 번호 제R01 CA154754호 하의 정부지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명에 특정한 권리를 갖는다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 L-키누레닌 또는 L-3-하이드록시키누레닌을 고갈시키는 효소를 이용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 인간 치료를 위해 적절한 L-키누레닌 분해 활성을 가진 박테리아 및 포유류 효소의 유전자조작, 약리학적 최적화 및 사용에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
암 세포에 의해 인돌아민-2,3-디옥시게나제 동형 (IDO1 또는 IDO2)이 과발현되는 것 또는 암 침투 백혈구가 재프로그램되어 상기 효소 중 하나를 발현하는 것이 암에 대한 후천성 면역 반응을 약화시키는 데 상당한 영향을 준다는 관찰이 있었다. 효소의 기질 세포에 의한 발현이 일부 종양에 의해 유도될 수 있는 IDO1 및 IDO2 그리고 트립토판 2,3-디옥시게나제 (TDO)는 L-키누레닌 (KYN)으로의 트립토판 (Trp) 이화작용에서 속도제한 단계를 촉매한다 (Godin-Ethier et al., 2011). 종양은 LAT1-유사 아미노산 치환인자를 이용하여 세포질 KYN 분자를 세포외 Trp 분자로 치환하고 (Kaper et al., 2007), 이는 면역 세포에서 국부적으로 Trp 수준을 고갈시키는 동시에 국부적으로 KYN 수준을 증가시키는 이중 효과를 지닌다. 인접한 면역 세포가 KYN를 내재화하면, 이것은 아릴 탄화수소 수용체 (AHR)에 대한 활성화 리간드가 되어 면역 세포 분화 및/또는 아폽토시스 유발을 통한 종양 내성을 일으키는 수많은 사이토킨 및 케모카인의 발현을 야기한다 (Della Chiesa et al., 2006; Opitz et al., 2011; Song et al., 2011). 또한, 키누레닌으로부터 형성된 다른 KYN-관련 화합물, 특별히 언급하자면 키누렌산은 또한 외톨이 GPCR인 GPCR35의 작용제로서 기능함으로써 면역억제 효과를 지닌다. KYN 형성의 저해 (및 따라서 IDO1 또는 TDO의 저해를 통한 키누렌산, 3-하이드록실 키누레닌산 및 퀴놀린산을 비롯한 KYN 대사 부산물 형성의 저해는 암 표적으로서 상당한 관심을 받아왔다 (Chen 및 Guillemin, 2009; Rutella et al., 2009; Prendergast, 2011). IDO1을 위한 기질 유사체 저해제, 가령 1-DL-메틸트립토판이 개발되었고 이는 암 유래 종양 내성을 극복하는, 즉 종양과 싸우는 자연적인 면역 시스템의 능력을 회복시킬 가능성을 최초로 나타냈다 (Lob et al., 2009). 그러나, KYN는 또한 트립토판 2,3-디옥시게나제 (TDO)에 의해 생산되는데, 상기 효소는 또한 종양에서 흔히 발현되고 1-DL-메틸트립토판에 의해 저해되지 않는다 (Pilotte et al., 2012). 또한 제1 및 제2상 임상 실험에서 현재 1-DL-메틸트립토판 (1-D-MT)의 D-이성질체에 대한 추가적인 우려가 존재한다. 역설적이게도, 1-D-MT는 IDO1 발현을 상향조절하여, 사실상 KYN 수준을 증가시키고 특정 암에서 면역억제를 야기할 수 있다 (Opitz et al., 2011).
KYN의 종양 생산을 조절하는 것에 많은 연구의 초점이 맞추어졌고 특히, 유방암, 난소, 교모세포종, 및 췌장 암종과 같은 암을 치료할 잠재성을 지닌다. KYN는 T 세포 및 NK 세포에서 증식을 억제할 뿐만 아니라 아폽토시스를 유발시켜 (Opitz et al., 2011; Mandi 및 Vacsei, 2012) 종양이 환자의 면역 시스템에 의한 검출 및 파괴를 피할 수 있게 하는 것으로 알려져 있다. KYN는 아릴 탄화수소 수용체 (AHR)의 강력한 리간드로서 T 세포에서 활성화되면 CD25+FoxP3+ T 조절 세포 (Tregs)로의 분화를 유도한다 (Mezrich et al., 2010). KYN은 또한 NK 매개 세포 살해 종양 세포주에 필수적인 특정 수용체 (NKp46 및 NKG2D)의 사이토킨 매개 상향-조절을 방해하는 것으로 나타났으며 (Della Chiesa et al., 2006), 상기 작용은 또한 AHR에 대한 이의 작용제 효과에 의해서도 매개된다고 여겨진다 (Shin et al., 2013). 또한 상승된 혈청 KYN 수준과 복합형 암에서 생존 감소를 연결하는 임상적 증거가 존재한다. 건강한 환자에서, 혈청 내 KYN 수준은 0.5 내지 1 μM 범위이다. 미만성 거대 B-세포 림프종과 같이, KYN을 생산하는 암 유형을 가진 환자에서 혈청 KYN 수준은 이보다 10배 더 높게 측정되며 (Yoshikawa et al., 2010; de Jong et al., 2011; Yao et al., 2011) 동일한 치료 요법을 받은 림포종 환자 중의 예후는; 1.5 μM 미만의 혈청 수준을 갖는 환자의 89%가 3년의 생존률을 나타낸데 반해, 1.5 μM 이상의 KYN 수준을 갖는 환자의 58%만이 생존하는 것으로 나타났다. 이러한 생존의 차이는 KYN의 면역 억제 효과 때문인 것으로 여겨졌다 (Yoshikawa et al., 2010). 소형 분자 IDO 저해제, 가령 1-D-MT의 사용은 면역 기능을 회복함에 있어서 KYN 수준을 조절하는 효용성을 나타냈지만, 1-D-MT에 의해 IDO1이 상향-조절되는 표적이탈 효과를 나타냈으며 TDO 및 IDO1 동형에 대한 저해 부족은 우려할 정도다.
본 발명은 종양 및/또는 혈액 내 KYN 및 이의 대사산물을 특이적으로 고갈시키기 위한 효소의 사용을 개시한다. KYN 고갈 효소는 IDO1, IDO2, 또는 TDO를 발현하는 종양의 치료를 위해 KYN 농도를 낮추고 따라서 종양-매개 내성화 효과를 방지하고 그 대신 종양-제거 염증-촉진 반응을 매개하기 위해 사용된다. 특히, KYN 및 KYN 대사 부산물의 고갈을 위한 효소의 사용은 상기 논의된 IDO 동형 및 TDO의 소형 분자 저해제와 연관된 문제들을 회피하고 나아가 소형 분자 약물에 매우 흔히 동반하는 예측되지 않은 독성 및 부작용을 일으키는 표적이탈 효과를 완전히 방지한다.
발명의 요약
본 발명의 양태는 L-키누레닌 및 3-하이드록시-L-키누레닌을 분해하고 암 치료를 위해 요망되는 유리한 혈청 내 약동학을 내보일 수 있는 박테리아 및 포유류 폴리펩티드 서열을 포함하는 효소를 제공함으로써 당해 분야의 주요 문제점을 극복한다. 일부 양태에서, 키누레니나제 효소는 3'OH-키누레닌보다 키누레닌에 대하여 더 높은 촉매 활성을 가질 수 있다. 박테리아종으로부터의 키누레니나제가 사용될 수 있다. 그러한 효소는 서열번호 7 및 13-52으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이들의 변형된 버전을 가질 수 있다. 특히, 치료제는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 효소인, 키누레니나제 (Pf-KYNU)로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 키누레니나제가 사용될 수 있다. 치료제는 무실라지니박터 팔루디스(Mucilaginibacter paludis) 키누레니나제 효소로부터 유도될 수 있다. 또한, 이종 키누레니나제의 면역원성으로 인한 역효과를 방지하기 위해, 인간(Homo sapiens) 효소 또는 인간 효소에 대해 >95% 서열 동일성을 나타내는 다른 영장류 키누레니나제가 사용될 수 있다. 예를 들면, 신규한 효소는 서열번호 7-9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 양태에서, KYN을 분해할 수 있고 3-하이드록시키누레닌 또는 키누렌산을 분해하는 활성을 가지는 자연적인 또는 변형된 인간 또는 영장류 키누레니나제 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드가 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 생리학적 조건 하에 KYN을 분해할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 KYN (k cat/K M)에 대하여 적어도 또는 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 M-1s-1 또는 이들 중 도출가능한 임의 범위의 촉매 효율을 가질 수 있다.
위에서 논의된 변형된 폴리펩티드는 변형되지 않은 폴리펩티드(예컨대, 자연적인 폴리펩티드) 또는 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩티드 서열에 대하여 특정 비율의 동일성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들면, 변형되지 않은 폴리펩티드는 적어도, 또는 최대, 약 150, 200, 250, 300, 350, 400 잔기 (또는 이들 중 도출가능한 임의 범위)의 자연적인 키누레니나제를 포함할 수 있다. 상기 동일성 비율은 변형된 및 변형되지 않은 폴리펩티드, 또는 임의의 두 서열을 비교할 때 대략, 최대 또는 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 중 도출가능한 임의 범위)일 수 있다. 또한 상기 논의된 동일성 비율은 폴리펩티드의 변형되지 않은 영역과 비교할 때 폴리펩티드의 특정 변형된 영역과 연관될 수 있다고 여겨진다. 예를 들면, 폴리펩티드는 키누레니나제의 변형되거나 돌연변이를 일으킨 기질 인식 부위를 포함할 수 있고 이 부위는 동일한 종 또는 다른 종으로부터의 변형되지 않았거나 돌연변이를 일으킨 키누레니나제의 아미노산 서열 대비 키누레니나제의 변형되거나 돌연변이를 일으킨 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성을 기초로 특징화될 수 있다. 예를 들면, 변형되지 않은 키누레니나제에 대해 적어도 90% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형되거나 돌연변이를 일으킨 인간 폴리펩티드는 상기 변형되거나 돌연변이를 일으킨 인간 폴리펩티드 내 아미노산의 적어도 90%가 변형되지 않은 폴리펩티드 내 아미노산과 동일함을 의미한다.
그러한 변형되지 않은 폴리펩티드는 자연적인 키누레니나제, 특히 인간 동형 또는 다른 영장류 동형일 수 있다. 예를 들면, 자연적인 인간 키누레니나제는 서열번호 8 서열을 가질 수 있다. 다른 자연적인 영장류 키누레니나제의 비-제한적인 예시는 폰고 아벨리(Pongo abelii) 키누레니나제 (Genbank ID: XP_002812508.1; 서열번호 10), 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) 키누레니나제 (Genbank ID: EHH54849.1; 서열번호 11), 및 판 트로글로다이츠(Pan troglodytes) 키누레니나제 (Genbank ID: XP_003309314.1; 서열번호 12)를 포함한다. 예시적인 자연적인 폴리펩티드는 서열번호 8 또는 10-12 또는 이들의 단편의 약, 최대 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성 (또는 이들 중 도출가능한 임의 범위)을 가지는 서열을 포함한다. 예를 들면, 자연적인 폴리펩티드는 서열번호 8 또는 10-12의 서열의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 415 잔기 (또는 이들 중 도출가능한 임의 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 자연적인 키누레니나제는 하나 이상의 다른 조작, 가령 화학적 개질, 치환, 삽입, 결실, 및/또는 절단에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 변형은 자연적인 효소의 기질 인식 부위에 일어날 수 있다. 특정 구체예에서, 자연적인 키누레니나제는 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 치환의 개수는 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상일 수 있다. 추가의 구체예에서, 자연적인 키누레니나제는 기질 인식 부위 또는 기질에 특정하게 영향을 줄 수 있는 임의의 영역에 변형이 일어날 수 있다.
한 구체예에서, 단리된, 변형된 인간 키누레니나제 효소가 제공되며, 여기서 변형된 효소는 자연적인 인간 키누레니나제에 비해 적어도 하나의 치환을 가지며 (서열번호 8을 참조), 및 여기서 적어도 하나의 치환은 자연적인 인간 키누레니나제의 306번 위치에서 일반적으로 발견되는 Phe의 Met 또는 Leu 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, Phe306Met 치환을 포함하는 단리된, 변형된 인간 키누레니나제 효소가 제공된다. 따라서, 한 양태에서, Phe306Leu 치환을 포함하는 단리된, 변형된 인간 키누레니나제 효소가 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 이종 아미노산 서열에 연결된 키누레니나제를 포함하는 폴리펩티드를 고려한다. 예를 들면, 키누레니나제는 이종 아미노산 서열에 융합 단백질로서 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 키누레니나제는 생체 내 반-감기를 증가시키기 위해 아미노산 서열, 가령 IgG Fc, 알부민, 알부민 결합 단백질, 또는 XTEN 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
혈청 안정성을 높이기 위해, 키누레니나제는 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다. 폴리펩티드는 특정한 아미노산 잔기, 가령 리신 또는 시스테인을 통해 PEG에 (예컨대, 공유적으로) 연결될 수 있다. 치료적 투여를 위해, 키누레니나제를 포함하는 그러한 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 담체 내에 분산될 수 있다.
일부 양태에서, 그러한 키누레니나제를 인코딩하는 핵산이 고려된다. 일부 구체예에서, 핵산은 박테리아에서 발현이 최적화된 코돈이었다. 특정한 구체예에서, 박테리아는 대장균(E. coli)다. 다른 양태에서, 핵산은 균류 (예컨대, 효모), 곤충, 또는 포유동물에서 발현이 최적화된 코돈이었다. 본 발명은 추가로 벡터, 가령 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터를 고려한다. 특정한 구체예에서, 키누레니나제를 인코딩하는 핵산은 이종 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 프로모터에 작동가능하도록 연결된다. 한 구체예에서, 키누레니나제는 벡터 (예컨대, 유전자 치료 벡터)에 의해 표적 세포로 송달될 수 있다. 그러한 바이러스는 표적 세포에서 키누레니나제-인코딩 핵산의 발현이 가능하도록 재조합 DNA 기술에 의해 변형될 수 있었다. 이들 벡터는 비-바이러스성 (예컨대, 플라스미드) 또는 바이러스성 (예컨대, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스) 유래의 벡터로부터 도출될 수 있다. 비-바이러스성 벡터는 바람직하게는 세포막을 통한 DNA의 유입을 가능하게 하는 물질과 복합체를 이룬다. 그러한 비-바이러스성 벡터 복합체의 예시는 DNA 축합반응 및 지질-기반 송달 시스템을 촉진하는 다중양이온성 물질을 갖는 제형을 포함한다. 지질-기반 송달 시스템의 예시로는 핵산의 리포좀 기반 송달이 포함될 수 있다.
더욱 추가적인 양태에서, 본 발명은 추가로 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 고려한다. 숙주 세포는 박테리아 (예컨대, E. coli), 균류 세포 (예컨대, 효모), 곤충 세포, 또는 포유류 세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 키누레니나제를 발현하기 위해 숙주 세포에 도입된다. 단백질은 임의의 적절한 방식으로 발현될 수 있다. 한 구체예에서, 단백질은 숙주 세포에서 단백질이 글리코실화되어 발현된다. 또다른 구체예에서, 단백질은 숙주 세포에서 단백질이 탈글리코실화되어 발현된다.
본 발명의 특정 양태는 또한 키누레니나제 펩티드, 유전자 치료 벡터 내 키누레니나제를 인코딩하는 핵산, 또는 본 발명의 제형을 투여하는 치료 방법, 및 특히 종양 세포 또는 암을 가진 개체를 치료하는 방법을 고려한다. 개체는 임의의 동물, 가령 마우스일 수 있다. 예를 들면, 개체는 포유동물, 특히 영장류, 및 더 상세하게는 인간 환자일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 암을 가진 환자를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 암은 키누레닌 고갈에 민감한 임의의 암이다. 한 구체예에서, 본 발명은 그러한 폴리펩티드를 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함하는 종양 세포 또는 암 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 일부 구체예에서, 투여는 암 세포의 적어도 일부가 사멸되게 하는 조건하에 이루어진다. 또다른 구체예에서, 제형은 생리학적 조건 하에 키누레닌-분해 활성을 가지며 부착된 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 추가로 포함하는 그러한 키누레니나제를 포함한다. 일부 구체예에서, 제형은 상기 논의된 키누레니나제 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형이다. 그러한 약제학적으로 허용되는 부형제는 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 모든 상기 키누레니나제가 인간 치료에 유용할 것으로 고려될 수 있다.
추가의 구체예에서, 종양 세포를 처리하는 방법이 또한 제공될 수 있으며 상기 방법은 키누레닌-분해 활성을 가진 비-세균성 (포유류, 예컨대, 영장류 또는 마우스) 키누레니나제 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함한다.
투여 또는 처리는 세포의 영양 공급원에 이루어지며, 반드시 세포 자체에 부가되어야 할 필요는 없다. 그러므로, 생체 내 적용에서, 종양 세포의 처리 단계는 종양 세포 집단을 위한 영양 매체를 키누레니나제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 구체예에서, 매체는 혈액, 림프성 유체, 척수액 등 키누레닌 고갈이 요망되는 유사 체액일 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 키누레니나제를 함유하는 그러한 제형은 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 활막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막으로, 심막내, 탯줄내, 안내, 경구로, 국소적으로, 흡입, 주입, 연속 주입, 국부 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물내 (예컨대, 리포좀), 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 방법 또는 앞서 나열한 것들의 임의 조합에 의해 투여될 수 있다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 또한 적어도 2차 항암 요법을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 2차 항암 요법은 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 한랭 요법, 호르몬 요법, 면역 요법 또는 사이토킨 요법일 수 있다. 특정 양태에서, 2차 항암 요법은 항-PD-1, 항-CTLA-4, 또는 항- PD-L1 항체일 수 있다.
일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 키누레니나제 효소를 포함하는 세포가 암을 가진 개체의 치료에 사용하기 위해 고려된다. 일부 양태에서, 세포는 CAR 및 키누레니나제 및, 일부 경우에, 트랜스포사제를 인코딩하는 DNA로 형질주입될 수 있다.
CAR은 예컨대 HER2, CD19, CD20, 및 GD2를 비롯한 임의의 관심의 암-세포 항원을 표적화할 수 있다. 항원 결합 부위 또는 도메인은 본 명세서에서 그 전체가 참고로서 포함되는 미국 특허 제7,109,304호에 기술된 바와 같은 특정 인간 단클론 항체로부터 유도된 단일-사슬 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 사슬 단편을 포함할 수 있다. 단편은 또한 임의 개수의 인간 항원-특이적 항체의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더욱 특정한 구체예에서, 단편은 인간 세포에서 발현시키려는 인간 코돈 용도로 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원-특이적 scFv이다. CAR의 추가적인 예시는, 예를 들면, WO 2012/031744, WO 2012/079000, WO 2013/059593, 및 미국 특허 제8,465,743호를 참조하고, 상기 문헌은 모두 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
키누레니나제는 본 명세서에서 개시된 어느 한 키누레니나제일 수 있다. 세포를 형질감염시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있지만, 특정 양태에서, 고도로 효율적인 형질감염 방법 가령 전기천공이 사용된다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오펙션(nucleofection) 장치를 이용하여 세포에 주입될 수 있다. 바람직하게는, 형질감염 단계는 세포를 바이러스로 감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함하지 않는데, 이것이 처리된 개체에서 유전독성을 일으키거나 및/또는 바이러스 서열을 포함하는 세포에 대한 면역 반응을 야기할 수 있기 때문이다.
다양한 CAR 구조체 및 이를 위한 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있으며 추가로 본 명세서에서 자세히 언급된다. 예를 들면, 일부 양태에서, CAR 발현 벡터는 DNA 발현 벡터 가령 플라스미드, 선형 발현 벡터 또는 에피솜(episome)이다. 일부 양태에서, 벡터는 추가적인 서열, 가령 CAR, 그러한 프로모터, 촉진제, 다중-A 신호, 및/또는 하나 이상의 인트론의 발현을 촉진하는 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, CAR 암호화 서열은 전이인자 서열의 측면에 존재하므로, 트랜스포사제의 존재는 암호화 서열이 형질주입된 세포의 유전체에 끼어들어갈 수 있게 한다.
특정 양태에서, 세포는 CAR 암호화 서열이 형질주입된 세포의 유전체 내로 통합되도록 촉진하는 트랜스포사제로 인해 추가로 형질주입된다. 일부 양태에서, 트랜스포사제는 DNA 발현 벡터로서 제공된다. 그러나, 바람직한 양태에서, 트랜스포사제는 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공되므로 트랜스포사제의 장기 발현은 형질전환 세포에서 일어나지 않는다. 본 구체예에 따라 어떠한 트랜스포사제 시스템도 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 세포는 CAR 암호화 서열 및 키누레니나제 암호화 서열이 세포의 유전체로 통합되도록 촉진하는 렌티바이러스로 감염될 수 있다.
한 구체예에서, 키누레니나제 또는 키누레니나제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 개체에서 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 종양의 치료를 위한 의약의 제조에서 키누레니나제 또는 키누레니나제를 인코딩하는 핵산을 사용하는 방법이 제공된다. 상기 키누레니나제는 구체예 중 어느 한 키누레니나제일 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물의 맥락에서 논의된 구체예는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물로 존재하는 구체예는 당연히 본 발명의 다른 방법 및 조성물에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 핵산과 관련하여 사용된 용어 "인코딩된" 또는 "인코딩하는"은 당해 분야의 숙련가가 본 발명을 쉽게 이해할 수 있게 하기 위하여 사용되었지만; 이들 용어는 "포함된" 또는 "포함하는"과 각각 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서의 청구범위(들)에서, "a" 또는 "an"은 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
비록 본 개시가 단지 대안들과 "및/또는"을 나타내는 정의를 택하고 있지만, 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 달리 분명하게 대안만 지칭하거나 대안들이 상호배타적임을 지칭한다고 나타내지 않은 경우 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본 명세서에서 사용된 "또다른"은 적어도 차선 또는 후선의 것들을 의미할 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 수치가 장비, 수치를 측정하기 위해 사용된 방법, 또는 연구 개체 중에 존재하는 변화에 대한 고유한 오차를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목표, 특징 및 장점이 이어지는 상세한 설명을 통해 명확해질 것이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화와 변형이 상세한 설명으로부터 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정한 예시가, 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내긴 하지만, 단지 예시의 방식으로 제공됨이 이해되어야 한다.
도면의 간략한 설명
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정한 양태를 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정한 구체예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참고하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 - (1열) PRECISION PLUS PROTEIN™ MW 표준 (BioRad)과 (2-4열) Pf-KYNU의 농도 증가 및 (5열) PEG 5,000 MW 변형된 Pf-KYNU의 SDS-PAGE.
도 2 - (개방 사각형) PBS 및 (개방 원) 인간 혈청 풀 내 Pf-KYNU의 안정성.
도 3 - 종양 성장 속도로 측정한 자가(autologous) B16 마우스 흑색종 모델에서 PEG-Pf-KYNU의 효능. (폐쇄 사각형) 열 비활성화된 PEG-Pf-KYNU. (폐쇄 원) 활성 PEG-Pf-KYNU.
도 4 - 생존으로 측정한 자가 B16 마우스 흑색종 모델에서 PEG-Pf-KYNU의 효능. (폐쇄 사각형) 열 비활성화된 PEG-Pf-KYNU. (폐쇄 원) 활성 PEG-Pf-KYNU.
도 5A-B - 열-비활성화된 PEG-Pf-KYNU로 처리된 마우스. (·) 활성 PEG-Pf-KYNU로 처리된 마우스. 도 5A - 순환하는 CD4+ 조절 T-세포의 집단은 활성 PEG-Pf-KYNU로 처리된 군에서 상당히 더 적다. 도 5B - 종양 침투 CD8+ T-세포의 집단은 상당히 더 높은 그랜자임 B 및 인터페론 γ의 발현을 보인다.
도 6 - E. coli에서 키누레니나제 활성에 대한 유전적 선별. L-Trp (Trp), 완충액 (-), 안트라닐산 (AA), 또는 L-Kyn (Kyn)에 적신 종이 필터 디스크가 있는 M9 최소 배지 플레이트 상에 도말한 E. coli-ΔtrpE 세포.
도 7 - 무실라지니박터 팔루디스(Mucilaginibacter paludis) 키누레니나제 (Mu-KYNU)의 시험관 내 안정성. 시간에 따른 Mu-KYNU의 활성은 37℃의 PBS(개방 사각형)에서 1T1/2 = 6 h였고 잔여 활성의 진폭은 74%, 이후의 2T1/2 = 150 h였고, 37℃의 인간 혈청 풀(폐쇄 원)에서 1T1/2 = 5 h였고 잔여 활성의 진폭은 30%, 이후의 2T1/2 = 73 h였다.
도 8 - PEG-Pf-KYNU (--●), 불활성화 PEG-Pf-KYNU (-●●), 항-PD1 (●●●), 또는 항-CTLA-4 (━) 중 어느 하나로 처리된 C57BL/6J에서 B16 동종이식편의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯. 화살표는 처리 날짜를 나타내고, (A)는 항체 처리를 나타내고, (E)는 효소 처리를 나타낸다.
도 9A-C - 도 9A - PBS (원) (대조), 항-PD1 단독 (사각형), 항-PD1/PEG Mu-KYNU (뒤집힌 삼각형), 또는 항-PD1/PEG-Pf-KYNU (똑바른 삼각형)로 처리된 C57BL/6J 내포 B16 종양 동종이식편. 도 9B - 부가 효과로써 항-PD1 단독에서 0% 종양 제거와 비교할 때 항-PD1/PEG-Pf-KYNU 조합 처리군에서 60%의 종양 제거 및 항-PD1/PEG-Mu-KYNU 조합에서 20%의 종양 제거가 관찰되었다. 도 9C - 상응하는 카플란-마이어 플롯.
도 10A-B - 도 10A - 열-비활성화된 PEG-Mu-KYNU (■) 또는 활성 PEG-Mu-KYNU (▲)로 처리된 C57BL/6J 내포 B16 종양 동종이식편. 도 10B - 상응하는 카플란-마이어 플롯은 PEG-Mu-KYNU (---)에 대해 25일의 평균 생존 시간, 및 열-비활성화된 PEG-Mu-KYNU (━)에 대해 22일의 평균 생존 시간을 도시한다 (화살표는 처리 날짜를 표시).
예시적인 구체예의 설명
키누레닌은 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO) 또는 트립토판-2,3-디옥시게나제 (TDO) 중 어느 하나의 작용을 통해 생성된 아미노산 트립토판의 대사산물이다. 키누레닌은 세포 생리학에 복합적인 영향을 주며, 그중 가장 중요한 것은 T 세포 반응의 조절이다. 많은 종양 세포는 키누레닌의 국부 농도를 상승시키기 위해 IDO 및/또는 TDO의 합성을 조절하며, 이는 트립토판의 고갈을 동반한다. 높은 수준의 키누레닌은 원래는 종양을 공격했었을 종양 침투 T 세포의 기능을 저해하는 강력한 수단으로 기능한다.
본 발명은 종양 미세환경 내 뿐만 아니라 혈청 내 국부 키누레닌 수준을 고갈시키고 따라서 T-세포 작용의 종양-매개 억제를 방지하기 위한 수단으로 키누레닌 분해 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 키누레닌 가수분해 효소 (키누레니나제)는 키누레닌을 알라닌 및 안트라닐산으로 전환하고, 안트라닐산은 T-세포 기능에 영향을 주는지 공지되어 있지 않다. 본 발명자는 생리학적 조건 하에 효소가 더 오랜 시간 유지되게 하는 키누레니나제 효소의 약제학적 제제를 생산했다. 본 발명자는 이후 효소의 종양내 투여가 마우스에서 공격성 종양의 성장을 극적으로 저지함을 보았다.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 가리키며 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "융합 단백질"은 비-자연적인 방식으로 작동가능하도록 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "반-감기" (½-감소기간)은 시험관 내 또는 생체 내, 예를 들면, 포유동물에게 주입 후 폴리펩티드의 농도가 반으로 떨어지는데 필요한 시간을 가리킨다.
용어 "작동가능한 조합", "작동가능한 순서" 및 "작동가능하도록 연결된"은 그렇게 기술된 성분이 의도된 방식으로, 예컨대, 핵산 서열의 연결이 소정의 유전자의 전사 및/또는 요망되는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 방식으로, 또는 아미노산 서열의 연결이 융합 단백질을 생산하게 하는 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 연결을 가리킨다.
용어 "링커"는 두 가지 상이한 분자를 작동가능하도록 연결하는, 여기서 링커의 한 부분을 첫 번째 분자에 작동가능하도록 연결하고, 링커의 또다른 부분을 두 번째 분자에 작동가능하도록 연결하는 분자 가교로서 작용하는 화합물 또는 모이어티를 가리키도록 의도된다.
용어 "페길화(PEGylated)"는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과의 접합을 가리키며, 상기 접합은 이의 높은 생체적합성 수준 및 변형의 용이성 때문에 약물 담체로서 널리 사용되고 있다. PEG는 PEG 사슬의 말단의 하이드록시 기를 통해 화학적 방법으로 활성 물질에 연결 (예컨대, 공유적으로 연결)될 수 있지만; PEG 그 자체는 분자당 최대 두 개의 활성 물질로 제한된다. 상이한 접근법에서, PEG 및 아미노산의 공중합체는 PEG의 생체적합성을 유지할 수 있지만, 분자당 수많은 부착점을 가지는 (따라서 더 높은 약물 로드를 제공하는) 부가적인 장점을 지니며, 다양한 적용에 적합하도록 합성을 설계할 수 있는 신규한 생체물질로서 연구되어 왔다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 생산을 위해 필요한 조절 및 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열을 가리킨다. 폴리펩티드는 요망되는 효소 활성이 보유되도록 전장 암호화 서열 또는 암호화 서열의 임의 부분에 의해 인코딩될 수 있다.
용어 "자연적인"은 유전자, 유전자 산물, 또는 자연발생적 공급원에서 단리되었을 때 유전자 또는 유전자 산물의 특징의 전형적인 형태를 가리킨다. 자연적인 형태는 자연적인 집단에서 가장 흔히 발견되며 따라서 임의로 정상 또는 야생형으로 지칭되는 형태이다. 반대로, 용어 "변형된", "변이체" 또는 "돌연변이"는 자연적인 유전자 또는 유전자 산물과 비교했을 때 서열 및 기능적 특성에서 변형 (즉, 변형된 특징)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 가리킨다.
용어 "벡터"는 복제할 수 있는 세포 내로 도입하려는 핵산 서열을 삽입할 수 있는 캐리어 핵산 분자를 가리키기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외생성"일 수 있으며, 이는 그러한 서열이 벡터가 도입되는 세포에게 낯선 것이거나 서열이 세포 내 서열과 상동이나 본래 그러한 서열이 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내 위치에 있는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공적인 염색체 (예컨대, YAC)를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 구성하는 장비를 이미 갖추었을 것이다 (예를 들면, Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994를 참조, 상기 문헌은 모두 본 명세서에 참고로서 포함된다).
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 구조체를 가리킨다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 예를 들면, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서, 이들 서열은 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 보유할 수 있고, 이는 특정 숙주 세포에서 작동가능하도록 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 번역을 위해 필요한 핵산 서열을 가리킨다. 전사 및 번역을 관장하는 조절 서열 외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능도 수행하는 핵산 서열을 보유할 수 있고 이것들은 이하에 설명된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료적으로 효과적인 양"은 치료 효과를 얻기 위한 방법에서 사용되는 세포 및/또는 치료적 조성물 (가령 치료적 폴리뉴클레오티드 및/또는 치료적 폴리펩티드)의 양을 가리킨다. 본 명세서 전반에서 사용된 용어 "치료적 이익" 또는 "치료적으로 효과적인"은 증상의 의학적인 치료와 관련하여 개체의 삶의 질을 증진 또는 향상시키는 임의의 것을 가리킨다. 여기에는 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도 감소가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 암의 치료는 예를 들면, 종양 크기의 감소, 종양 침투의 감소, 암 성장 속도의 감소, 또는 전이 방지를 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 가진 개체의 생존 연장을 가리킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "K M"는 효소에 대한 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수를 가리키며 소정의 효소가 효소 촉매된 반응에서 이의 최대 속도의 절반에 이르는 특정한 기질의 농도로서 정의된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "k cat"는 각각의 효소 부위가 단위 시간당 산물로 전환시키는 재생 수 또는 기질 분자의 수를 가리키며, 여기서 효소는 최대 효율로 작동한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "k cat/K M"는 효소가 얼마나 효율적으로 기질을 산물로 전환시키는지의 척도인 특이성 상수다.
본 명세서에서 사용된 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 인공적인 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체, 또는 키메라 면역수용체를 가리킬 수 있고, 예를 들면, 특정 면역 수식인자 세포에 대한 인공적인 특이성을 이식하는 조작된 수용체를 포함한다. CAR는 T 세포 상에 단클론 항체의 특이성을 부여하기 위해 사용될 수 있고, 이를 통해 예를 들면 입양면역 세포 치료를 위해 사용하는 수많은 특이적 T 세포를 생성할 수 있다. 특정한 구체예에서, CAR는 예를 들면 종양 연관성 항원에 대한 세포 특이성을 지시한다. 일부 구체예에서, CAR는 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 종양 연관성 항원 결합 부위를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정한 양태에서, CAR는 단클론 항체에서 유래한 단일-사슬 가변 단편 (scFv)이 CD3-제타 막관통 및 막내도메인(endodomain)에 융합된 융합을 포함한다 (가령 미국 특허 제7,109,304호에 기술된 것, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다). 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체 리간드 (예컨대, 펩티드) 또는 패턴-인식 수용체, 가령 덱틴(Dectin)에서 유래될 수 있다. 특정한 구체예에서, B-계열 분자에 대해 특이적인 CAR인, CD19를 이용하여 T 세포의 특이성을 재지시함으로써 악성 B 세포를 표적화할 수 있다. 특정한 경우에, 항원-인식 도메인을 멀어지게 함으로써 활성화-유도 세포사가 감소하도록 조절할 수 있다. 특정한 경우에, CAR은 부가적인 보조-조절성 신호전달을 위한 도메인, 가령 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 보조-조절성 분자, 영상화를 위한 리포터 유전자(예컨대, 양전자방출 단층촬영용), 전구-약물의 부가시 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토킨, 및 사이토킨 수용체를 비롯한 분자가 CAR과 동시-발현될 수 있다.
"치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강-관련 용태의 치료적 이익을 얻기 위한 목적으로 치료 물질을 개체에 투여 또는 적용하는 것 또는 절차 또는 요법을 개체에 시행하는 것을 가리킨다. 예를 들면, 치료는 약제학적 유효량의 키누레니나제의 투여를 포함할 수 있다.
"개체" 및 "환자"는 인간 또는 비-인간, 가령 영장류, 포유동물, 및 척추동물 중 어느 하나를 가리킨다. 특정한 구체예에서, 개체는 인간이다.
II. 키누레니나제 폴리펩티드
일부 구체예는 변형된 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정한 구체예는 변형되지 않은 버전에 필적하는 적어도 하나의 기능적 활성, 바람직하게는, 키누레닌 분해 활성 또는 3'-하이드록시-키누레닌 분해 활성을 나타내는 변형된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"를 언급하는 경우, 당해 분야의 숙련가는 예를 들면, 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드, 가령 키누레닌 분해 활성 또는 3'-하이드록시-키누레닌 분해 활성을 뛰어 넘는 추가적인 장점을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드가 포함됨을 이해할 것이다. 특정 구체예에서, 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드는 자연적인 키누레니나제, 바람직하게는 인간 키누레니나제 또는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 키누레니나제이다. "변형된 단백질"에 관련된 구체예가 "변형된 폴리펩티드"에 관해 적용될 수 있음, 그리고 역도 성림함이 특정하게 고려된다.
활성의 측정은 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 어세이, 특히 단백질의 활성에 관한 어세이를 이용하여 이루어질 수 있고, 비교의 목적으로, 변형된 또는 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드의 자연적인 및/또는 재조합 버전의 사용을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 변형된 폴리펩티드, 가령 변형된 키누레니나제는 키누레닌 및/또는 3'-하이드록시-키누레닌 분해 활성에서의 증가를 기초로 하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 변형되지 않은 폴리펩티드의 기질 인식 부위가 확인될 수 있다. 이러한 확인은 구조적 분석 또는 상동체 분석을 기반으로 할 수 있다. 그러한 기질 인식 부위의 변형을 포함하는 돌연변이 집단이 생성될 수 있다. 추가의 구체예에서, 증가된 키누레닌 분해 활성을 갖는 돌연변이가 돌연변이 집단으로부터 선택될 수 있다. 요망되는 돌연변이의 선택은, 가령 키누레닌 분해의 부산물 또는 산물을 검출하는 방법을 포함할 수 있다.
변형된 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 보유할 수 있고; 따라서, 결실을 갖는 단백질, 치환을 갖는 단백질, 및 결실 및 치환을 갖는 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 구체예에서, 이들 변형된 단백질은 예를 들어, 융합 단백질 또는 링커를 갖는 단백질과 같이 추가로 삽입 또는 부가된 아미노산을 포함할 수 있다. "변형된 결실된 단백질"은 자연적인 단백질 중 하나 이상의 잔기가 결여되지만, 자연적인 단백질의 특징 및/또는 활성을 보유할 수 있다. "변형된 결실된 단백질"은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실된 단백질의 예시는 적어도 하나의 항원 부위 즉 특정 유기체, 가령 변형된 단백질을 투여할 수 있는 유형의 유기체에서 항원으로 결정되는 단백질의 부위에 결실된 아미노산 잔기를 가지는 단백질이다.
치환 또는 대체 변이체는 전형적으로 단백질 내 하나 이상의 위치에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 바뀐 것을 포함하며 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 수식인자 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있거나 아닐 수 있고, 즉 하나의 아미노산이 유사한 형태와 전하를 가진 아미노산으로 교체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신, 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다.
결실 또는 치환 외에도, 변형된 단백질은 잔기의 삽입을 포함할 수 있고, 이는 전형적으로 폴리펩티드 내 적어도 하나의 잔기의 부가를 포함한다. 이는 표적화 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라고 지칭하는 말단 부가는 하기에서 논의된다.
용어 "생물학적 기능적 균등물"은 당해 분야에 널리 알려져 있으며 본 명세서에서 더욱 상세하게 정의된다. 따라서, 대조 폴리펩티드의 아미노산에 비해 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%의 아미노산이 동일하거나 기능적으로 균등한 서열은, 단백질의 생물학적 활성이 유지된다는 단서 하에 포함된다. 변형된 단백질은 특정 양태에서 대응되는 자연적인 단백질에 대해 생물학적으로 기능적으로 균등물일 수 있다.
또한 아미노산 및 핵산 서열이 추가적인 잔기, 가령 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열을 포함할 수 있으며, 그럼에도 해당 서열이 단백질 발현이 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 비롯하여 상기 제시된 기준에 부합하는 한 여전히 본질적으로는 본 명세서에 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 같음이 이해될 것이다. 말단 서열의 부가는 특히 핵산 서열에 해당하는데, 예를 들면, 암호화 부위의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나의 옆에 부착된 다양한 비-암호화 서열을 포함할 수 있거나 다양한 내부 서열, 즉, 유전자 내에 발생하는 것으로 공지된 인트론을 포함할 수 있다.
III. 치료를 위한 효소적 키누레닌 분해
특정 양태에서, 폴리펩티드는 키누레닌을 고갈시키는 효소와 함께, 키누레닌 고갈에 민감한 암을 비롯한 질환의 치료를 위해 사용되어, 종양-매개 관용원성 효과를 방지하고 그 대신 종양-제거 염증-촉진 반응을 매개할 수 있다. 특정 양태에서, 키누레니나제는 IDO1, IDO2, 및/또는 TDO를 발현하는 종양을 치료하는데 사용하기 위해 고려된다.
본 발명의 특정 양태는 질환, 가령 종양을 치료하기 위한 변형된 키누레니나제를 제공한다. 특히, 변형된 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 서열을 가질 수 있고 따라서 인간 환자에서 알러지 반응을 방지하고, 반복된 투여가 가능하며, 치료적 효능을 증가시킬 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 가령 충실성 종양 또는 혈액성 종양에서 발견되는 유형을 포함한다. 예시적인 충실성 종양은 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어진 군에서 선택된 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수 종양, T 또는 B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 아세포종, 골수종, 등을 포함한다. 추가로 본 명세서에 제공된 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암의 예시는, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평세포 암, 폐암 (소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종을 포함), 복막의 암, 간세포 암, 위 또는 위 암 (위장 암 및 위장 기질의 암을 포함), 췌장 암, 교모세포종, 자궁경부 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 유방암, 결장 암, 대장 암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신 또는 신장 암, 전립선암, 음문 암, 갑상선 암, 다양한 유형의 두경부 암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 말단 흑색점 흑색종, 결절성 흑색종, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/소포성 비-호지킨(Hodgkin)성 림프종 (NHL); 소형 림프구성 (SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프모구 NHL; 고등급 소형 비-분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-연관성 림프종; 및 발렌스트롬(Waldenstrom) 매크로글로불린혈증을 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 유모세포 백혈병, 다중 골수종, 급성 골수의 백혈병 (AML) 및 만성 골수아구성 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
암은 특히 다음의 조직학적 유형을 갖지만, 이들에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추상세포 암종; 소세포 암종; 갑상선유두 암종; 편평세포 암종; 림프상피성 암종; 기저의 세포 암종; 모기질 암종; 이행세포 암종; 갑상선유두 이행세포 암종; 선암종; 가스트린, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 혼합 간세포 암종 및 담관암종; 육주상 선암종; 선모낭포 암종; 선종성 폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 대장용종증; 고체 암종; 유암종 종양, 악성; 세기관지-폐포성 선암종; 갑상선유두 선암종; 난염성세포 암종; 호산성구 암종; 호산소구 선암종; 호염기구 암종; 투명세포 선암종; 과립 세포 암종; 소포성 선암종; 갑상선유두 및 소포성 선암종; 비피막성 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액상피 암종; 췌장낭선암종; 갑상선유두 췌장낭선암종; 갑상선유두 장액성 췌장낭선암종; 점액성 췌장낭선암종; 점액성 선암종; 반지세포 위선 암종; 침투 도관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증 암종; 파젯(paget) 질환, 유방; 소엽 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 화생; 흉선종, 악성; 난소 기질의 종양, 악성; 협막세포종, 악성; 과립막세포 종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 레이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 외-유선 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무흑색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 색소침착 모반 내 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포성 횡문근육종; 기질의 육종; 혼합 종양, 악성; 뮐러 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종증; 간엽세포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 미분화배세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소갑상샘종, 악성; 융모암; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시(kaposi) 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간엽 연골육종; 뼈의 거세포 종양; 유잉(ewing) 육종; 치성 종양, 악성; 사기질모세포성 치아육종; 에나멜상피종, 악성; 사기질모세포성 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경교, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시성 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경인성 종양; 뇌수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경초종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소세포성 림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 소포성; 균상식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다중 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수의 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구 백혈병; 단세포성 백혈병; 비만세포 백혈병; 거대모구성 백혈병; 골수의 육종; 및 유모세포 백혈병.
본 명세서에서 키누레니나제는 종양 조직, 또는 암을 가진 포유동물의 순환계로부터 키누레닌 및/또는 3'-하이드록시-키누레닌을 고갈시키기 위한, 또는 키누레닌의 고갈이 요망된다고 고려되는 경우에 키누레닌을 고갈시키기 위한 다양한 요법에서 항종양 물질로서 사용될 수 있다.
고갈은 포유동물의 순환계에서는 생체 내, 조직 배양 또는 다른 생물학적 배지 내 키누레닌 및 3'-하이드록시-키누레닌 고갈이 요망되는 경우에 시험관 내, 및 생물학적 유체, 세포, 또는 조직이 신체 외부에서 조작되고 나중에 환자 포유동물의 신체로 되돌려지는 경우 생체외 절차에서 수행될 수 있다. 순환계, 배양 배지, 생물학적 유체, 또는 세포로부터 키누레닌의 고갈은 처리되는 물질에 접근가능한 키누레닌의 양을 감소시키기 위해 수행되며, 그러므로 접촉되는 물질에서 주변 키누레닌을 분해하도록 키누레닌-고갈 조건 하에서 고갈되어야 하는 물질을 키누레닌을-고갈시킬 양의 키누레니나제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
고갈은 세포의 영양 공급원에 이루어지며, 세포 자체에 부가되어야 할 필요는 없다. 그러므로, 생체 내 적용에서, 종양 세포의 처리 단계는 종양 세포 집단을 위한 영양 매체를 키누레니나제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 구체예에서, 배지는 혈액, 림프성 유체, 척수액 등 키누레닌 고갈이 요망되는 유사 체액일 수 있다.
키누레닌- 및 3'-하이드록시-키누레닌-고갈 효율은 적용에 따라, 및 전형적으로는 물질 내에 존재하는 키누레닌의 양, 요망되는 고갈 속조, 및 키누레니나제에 도출되어야 하는 물질의 내성에 따라 매우 달라질 수 있다. 물질 내 키누레닌 및 키누레닌 대사산물 수준, 및 따라서 물질로부터 키누레닌 및 키누레닌 대사산물이 고갈되는 속도는 당해 분야에 널리 공지된 다양한 화학 및 생화학적 방법에 의해 쉽게 관찰할 수 있다. 예시적인 키누레닌-고갈 양이 추가로 본 명세서에 기술되며, 처리되는 물질의 밀리리터(mL)당 0.001 내지 100 단위 (U) 키누레니나제, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 U, 및 더 바람직하게는 약 0.1 내지 5 U 키누레니나제 범위일 수 있다. 전형적인 투여량이 체중을 기초로 투여될 수 있고, 약 5-1000 U/킬로그램 (kg)/일, 바람직하게는 약 5-100 U/kg/일, 더 바람직하게는 약 10-50 U/kg/일, 및 더 바람직하게는 약 20-40 U/kg/일의 범위이다.
키누레닌-고갈 조건은 키누레니나제의 생물학적 활성에 적합한 완충액 및 온도 조건이며, 효소에 적합한 온화한 온도, 염, 및 pH 조건, 예를 들면, 생리학적 조건을 포함한다. 예시적인 조건은 약 4-40℃, 약 0.05 내지 0.2 M NaCl와 동등한 이온 강도, 및 약 5 내지 9의 pH이며, 생리학적 조건도 포함된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 항종양 물질로서 키누레니나제를 사용하는 방법을 고려하며, 그러므로 종양 세포 집단을 치료적으로 효과적인 양의 키누레니나제와 종양 세포 성장을 저해하기에 충분한 기간 동안 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 생체 내 접촉시키는 단계는 치료적으로 효과적인 양의 생리학적으로 용인되는 본 발명의 키누레니나제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써, 정맥내 복강내, 또는 종양내 주입함으로써 달성되며, 이를 통해 환자에게 존재하는 종양 세포의 키누레닌 공급원을 고갈시킨다.
키누레니나제의 치료적으로 효과적인 양은 요망되는 효과를 얻게하도록, 즉, 종양 조직 또는 환자의 순환계에서 키누레닌을 고갈시키고, 이를 통해 종양-제거 염증-촉진 반응을 매개하도록 산출되어 설정된 양이다. 따라서, 본 발명의 키누레니나제의 투여를 위한 투여량 범위는 종양 세포 분열 및 세포 순환의 증상이 감소되는 요망되는 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 투여량은 과점조도 증후군, 폐 수종, 울혈성 심부전, 신경학적 효과, 등과 같은 유해한 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별, 및 질환 정도에 따라 달라지며 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 합병증이 발생한 경우 개인의 전문의에 의해 조정될 수 있다.
키누레니나제는 주사 또는 시간에 따른 점진적인 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 키누레니나제는 정맥내, 복강내, 경구, 근육내, 피하, 체강내, 경피, 진피로 투여될 수 있고, 연동적 수단에 의해 전달될 수 있으며, 종양 세포를 포함하는 조직으로 직접 주입될 수 있고, 또는 키누레닌에 대한 가능한 생체센서를 포함할 수 있는 카테커에 연결된 펌프로 투여될 수 있다.
키누레니나제를 포함하는 치료적 조성물은 통상적으로 정맥내, 예를 들면, 단위 용량을 주입함으로써 투여된다. 치료적 조성물에 관하여 사용되는 경우 용어 "단위 용량"은 개체에게 한 번에 투여하기에 적절하도록 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 요망되는 희석제, 즉, 담체, 또는 비히클과 함께 요망되는 치료 효과를 만들도록 산출된 소정량 의 활성 물질을 함유한다.
조성물은 투여 제형에 적합한 방식으로, 및 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 투여되는 양은 치료받는 개체, 활성 성분을 이용할 개체 시스템의 크기, 및 요망되는 치료 효과의 정도에 의존적이다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 전문의의 판단에 의존적이며 각 개체에 따라 달라진다. 그러나, 전신 투여를 위해 적절한 투여 범위가 본 명세서에 개시되며 투여의 경로에 의존적이다. 최초 투여 및 보강 투여(booster shot)를 위한 적절한 계획이 또한 고려되며 전형적으로는 초기 투여 이후 추가적인 주입 또는 다른 투여에 의해 한 시간 이상의 간격으로 반복 투여가 이루어진다. 예시적인 다중 투여가 본 명세서에 기술되며 지속적으로 높은 키누레니나제의 혈청 및 조직 수준 및 역으로 낮은 키누레닌의 혈청 및 조직 수준을 유지하는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로, 생체 내 요법을 위해 규정된 범위로 혈액내 농도를 유지하기에 충분한 연속적인 정맥내 주입이 고려된다.
IV. 접합체
본 발명의 조성물 및 방법은, 가령 이종 펩티드 조각 또는 중합체, 가령 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 접합체를 형성함으로써 변형된 키누레니나제를 포함한다. 추가의 양태에서, 키누레니나제는 PEG에 연결되어 효소의 수화 반경을 증가시키고 따라서 혈청 지속성을 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 개시된 폴리펩티드는 임의의 표적화 물질, 가령 외부 수용체 또는 종양 세포의 결합 부위에 특정하고 안정하게 결합하는 능력을 가진 리간드에 공액결합될 수 있다 (미국 특허 공보 제2009/0304666호).
A. 융합 단백질
본 발명의 특정 구체예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 자연적인 또는 변형된 키누레니나제를 가질 수 있다. 예를 들면, 융합은 또한 다른 종으로부터의 선도 서열을 사용하여 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 가능하게 할 수 있다. 또다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 단백질 친화성 태그, 가령 혈청 알부민 친화성 태그 또는 여섯 히스티딘 잔기, 또는 면역학적 활성 도메인, 가령 항체 에피토프, 바람직하게는 절단가능한 에피토프의 부가를 포함한다. 비-제한적인 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 및 글루타티온-S-전이효소 (GST)를 포함한다.
특정 구체예에서, 키누레니나제는 생체 내 반-감기를 증가시키는 펩티드, 가령 XTEN 폴리펩티드 (Schellenberger et al., 2009), IgG Fc 도메인, 알부민, 또는 알부민 결합 펩티드에 연결될 수 있다.
융합 단백질을 생성하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 그러한 단백질은 예를 들면, 완전한 융합 단백질의 신생(de novo) 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착, 이후 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생산될 수 있다.
모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은 나란히 연결된 폴리펨티드 사이에 끼어든 펩티드 링커를 인코딩하는 가교 DNA 조각과 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 접힘을 허용하기에 충분한 길이일 수 있다.
B. 링커
특정 구체예에서, 키누레니나제는 이관능성 가교-연결 시약을 이용하여 화학적으로 공액결합되거나 단백질 수준에서 펩티드 링커와 융합될 수 있다.
이관능성 가교-연결 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 식별, 및 구조 연구를 비롯한 다양한 목적을 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 적절한 펩티드 링커, 가령 Gly-Ser 링커가 또한 키누레니나제를 연결하기 위해 사용될 수 있다.
두 개의 동일한 관능기를 지니는 동종이관능성 시약은 동일한 및 상이한 거대분자 또는 거대분자의 하위 단위 사이의 가교-연결을 비롯하여, 이들의 특정한 결합 부위에 대한 폴리펩티드 리간드의 연결에 있어서 고도로 효율적인 것으로 증명되었다. 이종이관능성 시약은 두 개의 상이한 관능기를 보유한다. 두 가지 상이한 관능기의 차별적인 반응성을 이용함으로써, 가교-연결은 선택적으로 및 연속적으로 동시에 제어될 수 있다. 이관능성 가교-연결 시약은 이들의 관능기에 대한 특이성에 따라, 예컨대, 아미노-, 설프히드릴-, 구아니딘-, 인돌-, 카르복실-특이적 기로 구분될 수 있다. 이들 중에서, 유리 아미노 기를 겨냥하는 시약은 이들의 상업적인 이용가능성, 합성의 용이성, 이들을 적용할 수 있는 온화한 반응 조건으로 인해 특히 널리 애용되어 왔다.
대부분의 이종이관능성 가교-연결 시약은 일차 아민-반응기 및 티올-반응기를 지닌다. 또다른 예에서, 이종이관능성 가교-연결 시약 및 가교-연결 시약을 이용하는 방법이 기술된다(미국 특허 제5,889,155호, 그 전체가 특정하게 본 명세서에 참고로서 포함됨). 가교-연결 시약은 친핵성 히드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 조합시켜, 한 예에서, 알데히드가 유리 티올과 커플링되게 한다. 가교-연결 시약은 다양한 관능기를 가교-연결시키기 위해 변형될 수 있다.
추가적으로, 키누레니나제를 조합하기 위해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 연결/커플링 물질 및/또는 메커니즘, 가령, 예를 들면, 항체-항원 상호작용, 아비딘 비오틴 연결, 아미드 연결, 에스테르 연결, 티오에스테르 연결, 에테르 연결, 티오에테르 연결, 포스포에스테르 연결, 포스포아미드 연결, 무수물 연결, 이황화 연결, 이온 및 소수성 상호작용, 이중특이적 항체 및 항체 단편, 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다.
혈액에서 합리적인 안정성을 가지는 가교-연결제를 사용하는 것이 바람직하다. 표적화 및 치료/예방 물질을 공액결합시키기 위해 성공적으로 사용될 수 있는 링커를 내포하는 수많은 유형의 이황화-결합이 공지되어 있다. 입체 장애를 갖는 이황화 결합을 보유하는 링커는 생체 내에서 더 높은 안정성을 부여할 것으로 확인될 것이다. 이들 링커는 따라서 연결 물질의 한 군이다.
장애를 갖는 가교-연결제 외에도, 장애가 없는 링커가 또한 본 명세서에 따라 사용될 수 있다. 보호된 이황화물을 보유하거나 생성한다고 간주되지 않는 다른 유용한 가교-연결제는 SATA, SPDP, 및 2-이미노티올란을 포함한다 (Wawrzynczak 및 Thorpe, 1987). 그러한 가교-연결제의 사용은 당해 분야에서 널리 알려져 있다. 또다른 구체예는 유연한 링커의 사용을 포함한다.
일단 화학적으로 공액결합되면, 펩티드는 일반적으로 공액결합되지 않은 물질 및 다른 오염물질로부터 접합체를 분리하여 정제될 것이다. 가공되어 임상적으로 사용될 수 있을만한 충분한 순도를 갖는 접합체를 제공하는데 사용하기 위해 수많은 정제 기술이 이용가능하다.
크기 배제, 가령 겔 여과, 겔 투과, 또는 높은 성능 액체 크로마토그래피를 기반으로 하는 정제 방법이 일반적으로 가장 많이 사용될 것이다. 다른 크로마토그래피 기술, 가령 블루-세파로스 분리가 또한 사용될 수 있다. 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하기 위한 통상적인 방법, 가령 나트륨 N-라우로일-사르코신 (SLS)과 같은 약한 세제를 이용하는 방법이 유용할 수 있다.
C. 페길화(PEGylation)
본 발명의 특정 양태에서, 키누레니나제의 페길화에 관련된 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들면, 키누레니나제는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 페길화될 수 있다.
페길화는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 사슬을 또다른 분자, 일반적으로는 약물 또는 치료적 단백질에 공유적으로 부착시키는 과정이다. 페길화는 표적 거대분자와 PEG의 반응성 유도체를 항온처리함으로써 일상적으로 얻어진다. 약물 또는 치료적 단백질에의 PEG의 공유적 부착은 숙주의 면역 시스템으로부터 물질을 "차폐"시키거나 (면역원성 및 항원성을 감소) 또는 물질의 유체역학 크기 (용액 내 크기)를 증가시킬 수 있고, 이는 신장 배출을 감소시킴으로써 물질의 순환 기간을 연장시킨다. 페길화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 수용해성을 제공할 수 있다.
페길화의 첫 번째 단계는 하나 또는 양 말단에서 PEG 중합체를 적절히 관능화하는 것이다. 동일한 반응성 모이어티로 각 말단에서 활성화된 PEG는 "동종이관능성"으로 공지되며 여기서 만일 존재하는 관능기가 상이한 경우, PEG 유도체는 "이종이관능성" 또는 "이종관능성"이라고 지칭된다. 요망되는 분자에 PEG를 부착하기 위해 PEG 중합체의 화학적으로 활성인 또는 활성화된 유도체가 제조된다.
PEG 유도체를 위해 적절한 관능기의 선택은 PEG에 연결될 분자에 있는 이용가능한 반응기의 유형을 기반으로 한다. 단백질에 있어서, 전형적인 반응성 아미노산은 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 및 티로신을 포함한다. N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복실산이 또한 사용될 수 있다.
제1 세대 PEG 유도체를 형성하기 위해 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 중합체를 하이드록실 기, 전형적으로 무수물, 산 클로라이드, 클로로포르메이트, 및 카르보네이트와 반응성인 기와 반응시키는 것이다. 제2 세대 페길화 화학은 공액 결합을 위해 이용가능한 더 효율적인 관능기, 가령 알데히드, 에스테르, 아미드, 등으로 이루어진다.
페길화 적용이 더욱 더 발전하고 복잡해짐에 따라, 공액 결합을 위한 이종이관능성 PEG에 대한 수요가 증가해왔다. 이들 이종이관능성 PEG은 친수성, 유연성, 및 생체적합성 스페이서를 필요로 하는 두 가지 독립체를 연결하는데 매우 유용하다. 이종이관능성 PEG를 위한 바람직한 말단 기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카르복실산, 및 NHS 에스테르이다.
가장 공통적인 변형 물질, 또는 링커는 메톡시 PEG (mPEG) 분자를 기반으로 한다. 이들의 활성은 알코올 말단에 단백질-변형 기를 부가하는데 의존적이다. 일부 경우에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 디올)은 전구체 분자로서 사용된다. 디올은 나중에 이종- 또는 동종-이량체 PEG-연결된 분자를 만들기 위해 양쪽 말단이 변형된다.
단백질은 일반적으로 친핵성 부위, 가령 비보호된 티올 (시스테이닐 잔기) 또는 아미노 기에 페길화된다. 시스테이닐-특이적 변형 시약의 예시는 PEG 말레이미드, PEG 아이오도아세테이트, PEG 티올, 및 PEG 비닐설폰을 포함한다. 상기 네 가지는 온화한 조건 및 중성 내지 알칼리 pH에서 강하게 시스테이닐-특이적이지만 각각 단점을 일부 지닌다. 말레이미드로 형성된 티오에테르는 알칼리 조건 하에 다소 불안정할 수 있으며 따라서 이 링커에는 제형화 선택지에 있어서 일부 제약이 존재할 수 있다. 아이오도 PEG로 형성된 카르바모티오에이트 연결은 더 안정하지만, 유리 요오드가 일부 조건 하에 티로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 함께 이황화 결합을 형성하지만, 이 연결 또한 알칼리 조건 하에 불안정할 수 있다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 아이오도 PEG에 비해 비교적 느리지만; 그러나, 형성된 티오에테르 연결은 상당히 안정하다. 이의 더 느린 반응 속도는 또한 PEG-비닐설폰 반응을 더 쉽게 제어하도록 만들 수 있다.
자연적인 시스테이닐 잔기에서의 부위-특이적 페길화는 거의 수행되지 않는데, 이들 잔기가 일반적으로 디설파이드 결합의 형태이거나 생물학적 활성을 위해 필요하기 때문이다. 반면에, 부위-겨냥성 돌연변이유발 방법은 티올-특이적 링커를 위한 시스테이닐 페길화 부위를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 돌연변이는 이것이 페길화 시약과 접촉할 수 있으면서도 페길화 후에도 여전히 생물학적으로 활성이도록 설계되어야 한다.
아민-특이적 변형 물질은 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데히드, PEG 이소티오시아네이트, 및 기타 여러가지를 포함한다. 모든 반응은 온화한 조건 하에 일어나며 아미노 기에 매우 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마도 더 반응성인 물질 중 하나이지만; 그러나, 이의 높은 반응성은 대규모 공정에서 페길화 반응을 제어하기 어렵게 만들 수 있다. PEG 알데히드는 아미노 기와 함께 이민을 형성하며, 이민은 이후 나트륨 시아노보로하이드라이드를 통해 이차 아민으로 환원된다. 나트륨 보로하이드라이드와 달리, 나트륨 시아노보로하이드라이드는 디설파이드 결합을 환원시키지 않을 것이다. 그러나, 상기 화학 물질은 고도로 독성이며 특히 이것이 휘발성이 되는 더 낮은 pH에서 주의해서 취급해야 한다.
대부분의 단백질에 있는 복수의 리신 잔기로 인해, 부위-특이적 페길화가 어려울 수 있다. 다행히, 이들 시약이 양자화되지 않은 아미노 기와 반응하기 때문에, 더 낮은 pH에서 반응을 수행함으로써 더 낮은-pK 아미노 기에 페길화를 진행할 수 있다. 일반적으로알파-아미노 기의 pK는 리신 잔기의 엡실론-아미노 기보다 더 낮은 1-2 pH 단위이다. PH 7 이하에서 분자를 페길화함으로써, N-말단에 대한 높은 선택성을 흔히 얻을 수 있다. 그러나, 이는 단백질의 N-말단 부분이 생물학적 활성을 위해 요구되지 않는 경우에만 가능하다. 하지만, 페길화로부터의 약동학적 이익은 시험관 내 생체활성의 상당한 손실을 능가하며, 페길화 화학과 관계없이 훨씬 더 큰 생체 내 생체활성을 갖는 산물을 생성한다.
페길화 절차를 개발할 때 고려해야 할 몇 가지 변수가 존재한다. 다행히, 일반적으로 최대 넷 또는 다섯 가지 핵심 변수만이 존재한다. 페길화 조건의 최적화를 위한 "실험 설계" 접근법은 아주 유용할 수 있다. 티올-특이적 페길화 반응에 있어서, 고려할 변수는: 단백질 농도, PEG-대-단백질 비율 (몰 기준), 온도, pH, 반응 시간, 및 일부 경우에는, 산소의 배제를 포함한다. (산소는 단백질에 의한 분자간 디설파이드 형성을 야기할 수 있고, 이는 페길화 산물의 수율을 감소시킬 것이다.) 아민-특이적 변형을 위해 (산소의 배제를 포함하여) 동일한 요인을 고려해야 하지만 예외적으로 pH는, 특히 N-말단 아미노 기를 표적하는 경우 훨씬 더 중요할 수 있다.
아민- 및 티올-특이적 변형 모두를 위해, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이는 온도, 단백질 농도, 및 pH를 제한할 수 있다. 또한, 페길화 반응을 시작하기 전에 PEG 링커의 반응성을 알아야 한다. 예를 들어, 페길화 물질이 단지 70 퍼센트 활성이라면, 사용되는 PEG의 양은 단백질-대-PEG 반응 화학양론에서 반드시 활성 PEG 분자만 계산에 포함되도록 해야 한다.
V. 단백질 및 펩티드
특정 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드, 가령 키누레니나제를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 이들 펩티드는 융합 단백질에 포함되거나 상기 기술된 바와 같은 물질에 공액결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 약 200 아미노산을 초과하여, 유전자로부터 번역된 전장 서열까지의 단백질; 약 100 아미노산을 초과하는 폴리펩티드; 및/또는 약 3 내지 약 100 아미노산의 펩티드를 가리키지만, 이에 제한되지 않는다. 편의를 위해, 용어 "단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된, "아미노산 잔기"는 당해 분야에 공지된 임의의 자연발생적 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 임의의 아미노산 모방체를 가리킨다. 특정 구체예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 연속적이며, 아미노산 잔기의 서열을 중단시키는 어떠한 비-아미노산도 없다. 다른 구체예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 단백질 또는 펩티드 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
따라서, 용어 "단백질 또는 펩티드"는 자연발생적 단백질에서 발견되는 20가지 공통 아미노산 중 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형된 또는 이례적 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포괄한다.
단백질 또는 펩티드는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술, 가령 표준 분자생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원에서 단백질 또는 펩티드의 단리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드 서열은 이미 개시된 바 있으며, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 컴퓨터에 기록된 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 그러한 데이터베이스 중 하나는 국립 생명과학기술 정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 유전자은행(Genbank) 및 유전자단백질(GenPept) 데이터베이스(웹주소 ncbi.nlm.nih.gov/로 접근가능)다. 공지된 유전자를 위한 암호화 부위는 본 명세서에 개시된 기술을 이용하거나 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 이용하여 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드의 다양한 상업적인 제조방법이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
VI. 핵산 및 벡터
본 발명의 특정 양태에서, 키누레니나제 또는 키누레니나제를 내포하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 사용되는 발현 시스템에 따라, 핵산 서열은 통상적인 방법을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 키누레니나제가 인간 키누레니나제에서 유도되고 E. coli에서 거의 사용되지 않는 복수의 코돈을 내포하는 경우, 이것이 발현을 방해할 수 있다. 그러므로, 각각의 유전자 또는 이들의 변이체는 E. coli 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 다양한 벡터가 또한 관심의 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 전이인자, 또는 리포좀-계 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
VII. 숙주 세포
숙주 세포는 키누레니나제 및 이들의 접합체의 발현과 분비를 허용하도록 변환될 수 있는 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모, 또는 사상균일 수 있다. 다양한 박테리아는 대장균(Escherichia) 및 간균(Bacillus)을 포함한다. 사카로미세스(Saccharomyces), 키유베로미세스(Kiuyveromyces), 한세눌라(Hansenula), 또는 피키아(Pichia)속에 속하는 효모가 적합한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 다음 속을 포함하는 다양한 종의 사상균이 발현 숙주로 사용될 수 있다: 아스퍼길루스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실룸(Penicillium), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 아킬라(Achlya), 포도스포라(Podospora), 엔도티아(Endothia), 무코어(Mucor), 코킬로볼루스(Cochliobolus), 및 피리쿨라리아(Pyricularia).
이용가능한 숙주 생물의 예시는 박테리아, 예컨대, 에셰리아 콜라이(Escherichia coli) MC1061, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BRB1 유도체(Sibakov et al., 1984), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) SAI123 (Lordanescu, 1975) 또는 스트렙토코쿠스 리비단스(Streptococcus lividans) (Hopwood et al., 1985); 효모, 예컨대, 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) AH 22 (Mellor et al., 1983) 또는 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 및 사상균, 예컨대, 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길루스 아와모리(Aspergillus awamori) (Ward, 1989), 또는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) (Penttila et al., 1987; Harkki et al., 1989)를 포함한다.
포유류 숙주 세포의 예시는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; ATCC CCL61), 래트 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC CCL2.2), 래트 간암 세포 (H-4-II-E; ATCCCRL 1548), SV40-형질전환 원숭이 신 세포 (COS-1; ATCC CRL 1650), 및 쥐의 배아 세포 (NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다. 상술된 내용은 예시적이며 당해 분야에 공지된 많은 가능한 숙주 생물을 배제하는 것이 아니다. 원칙적으로, 분비 능력이 있는 모든 숙주가 원핵생물이든 진핵생물이든 사용될 수 있다.
키누레니나제 및/또는 이들의 융합 단백질을 발현하는 포유류 숙주 세포는 모세포주를 배양하기 위해 전형적으로 사용되는 조건 하에 배양된다. 일반적으로, 세포는 전형적으로 5%-10% 혈청, 가령 소의 태아 혈청으로 보충된 생리학적 염분 및 영양분을 함유하는 표준 배지, 가령 표준 RPMI, MEM, IMEM, 또는 DMEM에서 배양된다. 배양 조건은 또한 표준이며, 예컨대, 배양물질은 요망되는 수준의 단백질이 얻어질 때까지 37℃의 고정 또는 유동 배양기에서 배양된다.
VIII. 단백질 정제
단백질 정제 기술은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 이들 기술은 공통적으로 세포, 조직, 또는 기관을 균질화하고 크게 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로 분리하는 단계를 포함한다. 관심의 단백질 또는 폴리펩티드는 달리 명시되지 않은 경우 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 더욱 정제되어 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있다 (또는 균질하게 정제될 수 있다). 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석적 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 및 등전점 맞춤이다. 펩티드를 정제하는데 특히 효율적인 방법은 고속-성능 액체 크로마토그래피 (FPLC) 또는 균등한 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)이다.
정제된 단백질 또는 펩티드는 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 가리키는 것으로 의도되며, 여기서 단백질 또는 펩티드는 자연적으로-얻을 수 있는 상태에 비해 임의의 정도까지 정제된다. 단리된 또는 정제된 단백질 또는 펩티드는, 그러므로, 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질 또는 펩티드를 가리킨다. 일반적으로, "정제된"은 분별을 거쳐 다양한 다른 성분들이 제거된 단백질 또는 펩티드 조성물을 가리킬 것이며, 상기 조성물은 발현되는 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 표현은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 구성하는, 가령 조성물 내 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 그 이상을 구성하는 조성물을 가리킬 것이다
단백질 정제에서 사용하기에 적절한 다양한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 이들은, 예를 들면, 암모늄 설페이트, PEG, 항체 등을 이용한, 또는 열 변성에 의한 침전, 이후 원심분리; 크로마토그래피 단계, 가령 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트, 및 친화성 크로마토그래피; 등전점 맞춤; 겔 전기영동; 및 이들 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 일반적으로 당해 분야에 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계의 수행 순서는 달라질 수 있거나, 혹은 특정 단계가 빠질 수 있지만 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조를 위해 적절한 방법을 구성하는 것으로 생각된다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법을 당해 분야의 숙련가는 본 개시에 비추어 알 것이다. 이들은, 예를 들면, SDS/PAGE 분석에 의해 활성 분획의 특이적 활성을 측정, 또는 분획 내 폴리펩티드의 양을 측정하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 측정하기 위해 바람직한 방법은 분획의 특이적 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 특이적 활성과 비교하고, 이를 통해 "-배 정제 수"로 평가한 분획의 순도를 산출하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는, 물론, 정제 후 선택되는 특정한 분석 기술에 따라, 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 따라 달라질 것이다.
단백질 또는 펩티드가 항상 이의 가장 순수한 상태로 제공되어야 하는 일반적인 조건은 존재하지 않는다. 실제로, 실질적으로 덜 정제된 산물이 특정 구체예에서 사용될 수 있음이 고려된다. 부분적인 정제가 더 적은 정제 단계를 조합하거나, 상이한 형태의 동일한 일반 정제 계획을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 이용하여 수행된 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피가 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기술에 비해 일반적으로 더 높은 "-배" 정제를 성취할 것임이 이해된다. 더 낮은 상대 정제 정도를 나타내는 방법은 단백질 산물의 총 회수에, 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 장점을 가질 수 있다.
특정 구체예에서 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 키누레니나제, 키누레니나제를 내포하는 융합 단백질, 또는 페길화 후 변형된 키누레니나제가 단리 또는 정제될 수 있다. 예를 들면, His 태그 또는 친화성 에피토프가 정제를 용이하게 하기 위해 그러한 키누레니나제에 포함될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 단리될 물질과 이것이 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특이적인 친화성을 기반으로 하는 크로마토그래피 절차이다. 이는 수용체-리간드 유형의 상호작용이다. 컬럼의 물질은 불용성 매트릭스에 결합 파트너 중 하나를 공유적으로 결합시켜 합성된다. 컬럼의 물질은 이후 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡수할 수 있게 된다. 용리는 결합이 일어나지 않는 방향으로 조건을 변화시킴으로써 (예컨대, pH, 이온 강도, 온도, 등의 변화) 일어난다. 매트릭스는 어떠한 상당한 정도로든 분자를 흡수하지 않으며 광범위하게 화학적, 물리적, 및 열적 안정성을 가지는 물질이어야 한다. 리간드는 이의 결합 특성에 영향을 주지 않는 방식으로 연결되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 긴밀한 결합을 제공해야 한다. 샘플이나 리간드를 파괴하지 않고 물질을 용리할 수 있어야 한다.
크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography, SEC)는 용액 내 분자가 이들의 크기, 또는 더 기술적으로 말하면, 이들의 유체역학적 부피를 기초로 하는 크로마토그래피 방법이다. 상기 기술은 보동 대형 분자 또는 거대분자 복합체, 가령 단백질 및 산업적 중합체에 적용된다. 전형적으로, 컬럼을 통해 샘플을 전달하기 위해 수성 용액이 사용되는 경우, 이는 겔 여과 크로마토그래피로 공지되며, 반면 이동상으로서 유기 용매가 사용되는 경우 이는 겔 투과 크로마토그래피라고 부른다.
SEC의 기본 원리는 상이한 크기의 입자가 고정된 상을 통해 상이한 속도로 용리(여과)되는 것이다. 그 결과 입자의 용액이 크기에 따라 분리된다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 주입된다는 전제 하에, 동일한 크기의 입자들은 함께 용리될 것이다. 각각의 크기 배제 컬럼은 분리될 수 있는 분자량 범위를 가진다. 배제 한계는 범위의 상한에 해당하는 분자량으로 정의되며 이는 분자가 고정상에 포획되기에 너무 거대한 지점이다. 투과 한계는 분리 범위의 하한에 해당하는 분자량으로 정의되며 여기서 충분히 작은 크기의 분자는 고정상의 공극을 완전히 투과하고 상기 분자량 미만의 모든 분자는 너무 작기 때문에 단일 밴드로서 용리된다.
고-성능 액체 크로마토그래피 (또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리, 규명 및 정량하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 자주 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 한 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 충전 물질 (고정상)을 고정하는 컬럼, 컬럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프, 및 분자의 체류 시간을 표시하는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석되는 분자, 및 사용되는 용매(들) 사이의 상호작용에 따라 달라진다.
IX. 약학 조성물
신규한 키누레니나제가 국부적으로 진행된 또는 전이성 암을 가진 암 환자에서 종양 세포 성장을 저해하기 위해 및, 가장 바람직하게는, 암 세포를 죽이기 위해 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있음이 고려된다. 이들은 정맥내, 척추강내, 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 항-증식 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 이들은 수술 또는 다른 절차 전에 환자에서 암의 부피를 줄이기 위해 투여된다. 대안적으로, 이들은 수술 후에 잔여하는 임의의 암(예컨대, 수술에서 제거되지 못한 암)이 생존하지 못하도록 보장하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명이 치료 제제의 특정한 성질에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들면, 그러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 희석제, 및 부형제를 갖는 제형으로 제공될 수 있다. 이들 치료 제제는 포유동물에게, 수의학적 용도를 위해, 가령 가축에게, 및 임상 용도를 위해 인간에게 다른 치료제와 유사한 방식으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료적 효능를 위해 요망되는 투여는 투여의 목적 및 방식, 뿐만 아니라 개별적인 개체의 특화된 요구조건에 따라 달라질 것이다.
그러한 조성물은 전형적으로 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 적절한 희석제 및 부형제는, 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 등, 및 이들의 조합이다. 또한, 요망되는 경우, 조성물은 미량의 보조제, 가령 습윤제 또는 유화제, 안정화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
임상적인 적용이 고려되는 경우, 의도되는 적용을 위해 적절한 형태로 단백질, 항체, 및 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 키누레니나제 또는 부가적인 물질을 포함할 수 있다. 표현 "약제학 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물, 가령, 예를 들면, 인간에게, 적절히 투여될 때 부작용, 알러지, 또는 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 가리킨다. 본 명세서에 개시된 방법으로 단리된 적어도 하나의 키누레니나제, 또는 부가적인 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조를 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에 참고로서 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990에 예시된 바와 같이, 본 개시에 비추어 알 것이다. 게다가, 동물 (예컨대, 인간) 투여에 있어서, 제조는 FDA 생물 표준청에서 요구하는 무균성, 발열원성, 일반적 안전성, 및 순도 표준에 부합해야 함이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된, "약제학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매체, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예컨대, 항생제, 항진균제), 등장화제, 흡수지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 활택제, 감미제, 착향 물질, 염료, 이들의 유사 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들면, 본 명세서에 참고로서 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990를 참고). 임의의 통상적인 담체는 활성 성분에 적합하지 않을 경우를 제외하고, 약제학적 조성물 내 사용이 고려된다.
본 발명의 특정 구체예는 고체, 액체, 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 투여의 경로, 가령 주사를 위해 무균이어야 하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함한다. 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 정맥내, 피내, 경피, 척추강내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막으로, 경구, 국소, 국부적으로, 흡입 (예컨대, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 세포를 직접 표적하는 국소 관류 목욕에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물 (예컨대, 리포좀) 내, 또는 다른 방법에 의해 또는 상기 서술한 것들의 조합에 의해 투여될 수 있다 (예를 들면, 본 명세서에서 참고로서 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990를 참고).
변형된 폴리펩티드는 유리 염기, 중성, 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가 염, 예컨대, 단백질성 조성물의 유리 아미노 기를 통해 형성된 것들, 또는 무기산, 가령, 예를 들면, 염산 또는 인산을 통해, 또는 유기산, 가령 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산을 통해 형성된 것들을 포함한다. 유리 카르복실 기를 통해 형성된 염은 또한 무기 염기, 가령, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 제2철 하이드록사이드; 또는 유기 염기 가령 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 제형에 따라, 용액은 투여 제형에 적합한 방식으로 및 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 가령 비경구 투여를 위해 제형화된 형태, 가령 주사 용액, 또는 폐로 송달하기 위한 에어로졸, 또는 경구 투여를 위해 제형화된 형태, 가령 약물 방출 캅셀 등으로 용이하게 투여된다.
추가로 본 발명의 특정한 양태에 따르면, 투여를 위해 적절한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 없이 약제학적으로 허용되는 담체 내에 제공될 수 있다. 담체는 소화가 가능해야 하며 액체, 반-고체, 즉, 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매체, 물질, 희석제, 또는 담체는 수용자 또는 이것이 함유된 조성물의 치료 효과에 유해한 경우를 제외하고는, 본 방법의 실시에서 사용하기 위한 투여가능한 조성물에 사용하는 것이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예시는 지방, 오일, 물, 식염수 용액, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제, 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 파라벤 (예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 보존제, 가령 다양한 항생 및 항진균 물질에 의해 미생물 작용의 방지가 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로 즉, 용해, 현탁, 유화, 배합, 캡슐화, 흡수, 등에 의해 담체와 조합된다. 그러한 절차는 당해 분야의 숙련가에게 일상적인 것이다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 조성물은 반-고체 또는 고체 담체와 충분히 조합 또는 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 안정화제가 또한 혼합 과정에서 위장 내 변성과 같은 치료 활성의 손실로부터 조성물을 보호하기 위해 부가될 수 있다. 조성물에서 사용하기 위한 안정화제의 예시는 완충제, 아미노산, 가령 글리신 및 리신, 탄수화물, 가령 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토오스, 소르비톨, 만니톨, 등을 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 키누레니나제, 하나 이상의 지질, 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물에 관한 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "지질"은 물에서 불용성이고 유기 용매로 용출될 수 있음을 특징으로 하는 광범위한 물질 중 어느 하나를 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 폭넓은 부류의 화합물은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에서 용어 "지질"이 사용될 때 이는 임의의 구체적인 구조에 제한되지 않는다. 예시는 긴-사슬 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 자연발생적 또는 합성 (즉, 인공적으로 설계되거나 제조된 것)일 수 있다. 그러나, 지질은 보통 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소리피드, 글리코스핑고리피드, 글리코리피드, 설파타이드, 에테르- 및 에스테르-연결된 지방산을 갖는 지질, 중합가능한 지질, 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 본 명세서에 구체적으로 기술된 것들 외에 당해 분야의 숙련가에게 지질로서 이해되는 화합물이 또한 본 조성물 및 방법에 포함된다.
당해 분야의 숙련가는 지질 비히클 내에 조성물을 분산하기 위해 사용되는 기술 범위에 익숙할 것이다. 예를 들면, 키누레니나제 또는 이의 융합 단백질은 지질을 함유하는 용액 내에 분산되거나, 지질에 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유적으로 결합되거나, 현탁액으로서 지질 내에 내포되거나, 미셀(micelle) 또는 리포좀 내에 내포되거나 복합체를 이루거나, 또는 달리 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 연관될 수 있다. 분산은 리포좀을 형성하거나 형성하지 못할 수 있다.
동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 물리적 및 생리적 요인, 가령 체중, 용태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 사전 또는 현재의 치료 개입, 환자의 특발증, 및 투여의 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여의 경로에 따라서, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 개체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여를 담당하는 전문의는 어떠한 경우에도, 개별적인 개체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 투여량(들)을 결정할 것이다.
특정 구체예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 활성 화합물은 예를 들면, 단위의 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 이들 중 도출가능한 임의 범위를 포함할 수 있다. 자연적으로, 각각의 치료적으로 유용한 조성물 내 활성 화합물(들)의 양은 어떠한 소정의 단위 용량의 화합물에서도 적절한 투여가 이루어지게 될 방식으로 제조될 수 있다. 용해성, 생체이용률, 생물학적 반-감기, 투여 경로, 산물의 사용 기한, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 요인들이 그러한 약제학적 제형을 제조하는 당해 분야의 기술자에게 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여 및 치료 계획이 바람직할 수 있다.
다른 비-제한적인 예시에서, 투여량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 이상, 및 이들 중 도출가능한 임의 범위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 나열된 수치로부터 도출가능한 범위의 비-제한적인 예시에서, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 범위, 등이 상기 기술된 수치를 기초로 하여 투여될 수 있다.
X. 병행 치료
특정 구체예에서, 본 구체예의 조성물 및 방법은 키누레니나제의 투여를 차선 또는 추가의 요법과 병행하는 것을 포함한다. 그러한 요법은 키누레닌 의존성과 연관된 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들면, 질환은 암일 수 있다.
병행 치료를 포함하는 방법 및 조성물은 치료 또는 보호 효과를 증진하며, 및/또는 또다른 항-암 또는 항-과다증식 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료 및 예방 방법 및 조성물은 암 세포 사멸 및/또는 세포 과다증식의 저해와 같은 요망되는 효과를 얻기에 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이러한 과정은 키누레니나제 및 2차 요법을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 2차 요법은 직접적인 세포독성 효과을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. 예를 들면, 2차 요법은 직접적인 세포독성 효과는 없지만 면역 시스템을 상향조절하는 물질일 수 있다. 조직, 종양, 또는 세포는 하나 이상의 물질 (예컨대, 키누레니나제 또는 항암제)을 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)에 노출되거나 조직, 종양, 및/또는 세포는 둘 이상의 개별 조성물 또는 제형에 노출될 수 있고, 여기서 하나의 조성물은 1) 키누레니나제, 2) 항암제, 또는 3) 키누레니나제 및 항암제를 둘다 제공한다. 또한, 그러한 병행 요법이 화학 요법, 방사선 요법, 수술 요법, 또는 면역 요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.
용어 "접촉된" 및 "노출된"은 세포에 적용되는 경우 본 명세서에서 치료적 구조체 및 화학요법제 또는 방사선치료제가 표적 세포에 송달되거나 표적 세포와 가까이 위치하도록 배치되는 과정을 설명하기 위해 사용된다. 세포 사멸을 얻기 위해, 예를 들어 물질은 모두 세포를 사멸시키거나 세포 분열을 막기에 효과적인 양으로 조합되어 세포로 송달된다.
키누레니나제는 항-암 치료 전, 도중, 이후, 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 수 분 내지 수 일 내지 수 주의 간격으로 이루어질 수 있다. 키누레니나제가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 경우의 구체예에서, 각각의 송달 시간 사이에 상당한 기간이 경과하지 않게 하여, 두 가지 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 전달할 수 있도록 보장해야 한다. 그러한 경우에, 환자에게 키누레니나제 및 항암 요법을 약 12 내지 24 또는 72 시간 이내에 각각 및, 더 상세하게는, 약 6-12 시간 이내에 각각 제공할 수 있음이 고려된다. 일부 경우에 각각의 투여 사이에 수 일 (2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일) 내지 수 주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주) 간격을 띄우는, 치료를 위한 기간을 상당히 연장하는 것이 요망될 수 있다.
특정 구체예에서, 치료 과정은 1-90 일 또는 그 이상 지속될 것이다 (이러한 범위는 개입하는 날을 포함한다). 하나의 물질이 제1일 내지 제90일 중 아무 날짜 (이러한 범위는 개입하는 날을 포함한다) 또는 이중 임의의 조합에 제공되고, 및 또다른 물질이 제1일 내지 제90일 중 아무 날짜 (이러한 범위는 개입하는 날을 포함한다) 또는 이중 임의의 조합에 제공될 수 있음이 고려된다 하루 이내에 (24-시간 동안), 환자는 물질(들)의 일회 또는 다회 투여를 받을 수 있다. 게다가, 치료 기간 후에, 항-암 치료제가 투여되지 않는 일정 기간이 존재함이 고려된다. 이러한 기간은 환자의 조건, 가령 이들의 예후, 체력, 건강, 등에 따라 1-7 일, 및/또는 1-5 주, 및/또는 1-12 달 또는 그 이상이 걸릴 수 있다 (이러한 범위는 개입하는 날을 포함한다). 치료 주기는 필요에 따라 반복될 수 있음이 예상된다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기 실시예에서 키누레니나제는 "A"이고 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에게 본 구체예의 화합물 또는 요법 중 어느 하나의 투여는 해당하는 경우, 물질의 독성을 고려하여, 그러한 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜을 따를 것이다. 그러므로, 일부 구체예에서 병행 요법으로 인한 독성을 관찰하는 단계가 존재한다.
A. 화학 요법
다양한 화학요법제가 본 구체예에 따라 사용될 수 있다. 용어 "화학 요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 가리킨다. "화학요법제"는 암의 치료에서 사용되는 화합물 또는 조성물을 통칭하기 위해 사용된다. 이들 물질 또는 약물은 세포 내 이들의 활성 방식, 예를 들면, 이들이 세포 주기에 영향을 주는지 및 어떤 단계에서 영향을 주는지에 따라 분류된다. 대안적으로, 물질은 이것이 DNA를 직접 가교-연결하거나, DNA에 끼어들거나, 또는 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 및 유사분열 변이를 일으키는지를 기초로 하여 특징화될 수 있다.
화학요법제의 예시는 알킬화제, 가령 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 가령 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 가령 벤조도파, 카르보쿠온, 마투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 가령 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 및 트리메틸로로멜라민; 아세토제닌 (특별히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도제레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1를 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코틱틴; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 가령 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 염화수소산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 가령 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 가령 에네딘 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특별히 칼리케아미신 감마lI(gammalI) 및 칼리케아미신 오메가I1(omegaI1)); 디네미신, 가령 디네미신 A; 비스포스포네이트, 가령 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 연관 색소단백질 에네딘 항생 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모미시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 가령 미토마이신 C, 미코페놀 산, 노갈아르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항-대사산물, 가령 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 가령 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 가령 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 가령 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 가령 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스토락톤; 항-부신, 가령 미토탄 및 트릴로스탄; 폴산 보충제, 가령 후롤린 산; 아세토글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린 산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데모콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 가령 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린 산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존 산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특별히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 복합체, 가령 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예컨대, CPT-11); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 가령 레티노산; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 젬시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 전이효소 저해제, 트랜스플래티넘, 및 상기 언급된 것들 중 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.
B. 방사선요법
DNA 손상을 일으키며 광범위하게 사용되어 온 다른 요인은 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소를 종양 세포로 유도 전달하는 것으로 흔히 공지되어 있다. DNA 손상 요인의 다른 형태로는 또한, 마이크로웨이브, 양성자 빔 방사선 (미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호), 및 UV-방사선 같은 것들이 고려된다. 모든 이들 요인들은 DNA 상에, DNA의 전구체에, DNA의 복제 및 복구에, 및 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 일으키는 것으로 여겨진다. X-선량 범위는 오랜 기간(3 내지 4주) 동안 매일 50 내지 200 뢴트겐 선량부터, 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량까지의 범위이다. 방사성 동위원소의 투여량 범위는 크게 달라지며, 동위원소의 반-감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
C. 면역 요법
당해 분야의 숙련가는 면역 요법이 구체예의 방법과 병행되어 또는 조합되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역요법제는, 일반적으로, 면역 수식인자 세포 및 분자를 사용하여 암 세포를 표적하고 파괴하는 방법에 의존한다. 리툭시맙(RITUXAN®)이 그러한 예시이다. 관문 저해제, 가령, 예를 들면, 이필루미맙이 또다른 그러한 예시이다. 면역 수식인자는 예를 들면, 종양 세포의 표면에 있는 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체가 단독으로 치료의 수식인자로 기능할 수 있거나 다른 세포를 조종하여 실제로 세포 사멸에 영향을 줄 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학요법제, 방사선핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소, 등)에 공액결합되어 단지 표적화 물질로서 기능할 수 있다. 대안적으로, 수식인자는 직접 또는 간접적으로, 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 지닌 림프구일 수 있다. 다양한 수식인자 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
면역 요법의 한 양태에서, 종양 세포는 표적화하기 쉬운, 즉 대부분의 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 지녀야 한다. 많은 종양 마커가 존재하며 이들 중 임의의 것들이 본 구체예의 맥락에서 표적화를 위해 적절할 수 있다. 흔한 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스(Sialyl Lewis) 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역 요법의 대안적인 양태는 면역 자극 효과와 항암 효과를 조합한 것이다. 다음을 비롯한 면역 자극 분자가 또한 존재한다: 사이토킨, 가령 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 가령 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 가령 FLT3 리간드.
현재 조사중이거나 사용되는 면역 요법의 예시는 면역 어쥬번트, 예컨대, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물 (미국 특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호; Hui 및 Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); 사이토킨 요법, 예컨대, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); 유전자 요법, 예컨대, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward 및 Villaseca, 1998; 미국 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호); 및 단클론 항체, 예컨대, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 제5,824,311호)이다. 하나 이상의 항-암 요법이 본 명세서에 기술된 항체 요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.
D. 수술
암을 가진 사람의 대략 60%가 어떤 유형이든 수술을 받으며 수술은 예방적, 진단적 또는 단계적, 치유적, 일시적인 수술을 포함한다. 치유적 수술은 암 조직 전체 또는 일부가 물리적으로 제거, 절단, 및/또는 파괴되는 절제를 포함하며 다른 요법, 가령 본 구체예로의 처리, 화학 요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역 요법, 및/또는 대안적인 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 가리킨다. 종양 절제 외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온 수술, 전기 외과술 및 현미경-제어 수술 (Mohs 수술)을 포함한다.
암성 세포, 조직, 또는 종양 전체 또는 부분의 절제시, 신체에 공동이 형성될 수 있다. 추가적인 항암 요법과 함께 해당 영역의 관류, 직접 주입, 또는 국소 적용에 의한 처리가 이루어질 수 있다. 그러한 처리는, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5 주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 달마다 반복될 수 있다. 이들 처리는 물론 다양한 투여량을 가질 수 있다.
E. 기타 물질
치료의 치유 효능을 향상하기 위해 본 구체예의 특정 양태와 함께 따른 물질이 사용될 수 있음이 고려된다. 이들 추가적인 물질은 세포 표면 수용체 및 GAP 연결부의 상향조절에 영향을 주는 물질, 세포분열억제제 및 양성분화제, 세포 부착 저해제, 과증식성 세포의 아폽토시스 유도제에 대한 민감성을 증가시키는 물질, 또는 다른 생물학적 물질을 포함한다. GAP 연결부의 수를 증가시켜 세포간 신호전달을 증가시키는 것은 이웃하는 과다증식성 세포 집단에 대한 항-과다증식 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 세포분열억제제 또는 양성분화제는 치료의 항-과다증식성 효능을 향상하기 위해 본 구체예의 특정 양태와 함께 사용될 수 있다. 세포 부착 저해제는 본 구체예의 효능을 향상하는 것으로 생각된다. 세포 부착 저해제의 예시는 초점 접착 키나아제 (focal adhesion kinase, FAK) 저해제 및 로바스타틴이다. 과다증식성 세포의 아폽토시스에 대한 민감성을 증가시키는 다른 물질, 가령 항체 c225가 치료 효능을 향상하기 위해 본 구체예의 특정 양태와 함께 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
XI. 키트
본 발명의 특정 양태는 키트, 가령 치료 키트를 제공할 수 있다. 예를 들면, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 약제학적 조성물 및 임의로 이의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 그러한 조성물의 투여를 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 예를 들면, 해당 키트는 약제학적 조성물 및 조성물을 암 종양으로 직접 정맥내 주입할 수 있게 하기 위한 카테터를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 해당 키트는 송달 장치를 통해 사용하도록, 임의로 약품으로 제형화된, 또는 동결건조된 키누레니나제를 사전에-충전한 앰풀을 포함할 수 있다.
키트는 라벨이 달린 용기를 포함할 수 있다. 적절한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 가령 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 상기 기술된 바와 같은 치료적 또는 비-치료적 용도를 위해 효과적인 키누레니나제를 포함하는 조성물을 담을 수 있다. 용기의 라벨은 조성물이 특정한 치료 또는 비-치료적 적용을 위해 사용됨을 나타낼 수 있고, 또한 상기 기술된 바와 같은 생체 내 또는 시험관 내 용도를 위한 설명을 나타낼 수 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기술된 용기 및 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 포장 삽입물과 사용을 위한 설명서를 포함하는 상업적 및 사용자적 입장에서 바람직한 물질들을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
XII. 실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 보여주기 위해 포함되었다. 당해 분야의 숙련가는 하기의 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 본 발명자에 의해 잘 기능하는 것으로 확인된 기술을 나타내며, 따라서 본 발명의 실시의 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는, 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구체예에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 본 발명의 정신과 범위에서 벗어나지 않으면서도 유사하거나 비슷한 결과를 얻음을 이해해야 할 것이다.
실시예 1 - 슈도모나스 플루오레센스( Psuedomonas fluorescens ) 키누레니나제의 유전자 구성, 발현, 및 정제
슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens)로부터의 키누레니나제 효소의 발현을 위한 유전자(Pf-KYNU)를 DNA-Works 소프트웨어를 이용하여 설계된 네 코돈 최적화된 유전자 블록을 오버랩 연장(overlap extension) 중합효소 사슬 반응 (PCR)시킴으로써 구성하였다(Hoover 및 Lubkowski, 2002). 전장 유전자는 N-말단 XbaI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1-6), 최적화된 리보솜 결합 부위 (RBS; 뉴클레오티드 29-55), 출발 코돈 (뉴클레오티드 56-58), N-말단 His6 태그 (뉴클레오티드 59-91), E. coli 코돈 최적화된 Pf-KYNU 유전자 (뉴클레오티드 92-1336), 중지 코돈 (뉴클레오티드 1337-1342), 및 C-말단 BamHI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1342-1347)를 포함한다 (서열번호 1을 참조). 전술된 제한 효소 부위를 사용하여 조립된 유전자를 pET-28a+ 벡터 (Novagen)로 클로닝하였다. 이러한 구조체를 사용하여 이후 발현을 위한 BL21 (DE3) E. coli 로 형질전환시켰다. 세포를 50 mg/L의 카나마이신이 담긴 최소 배지 (Terrific Broth, TB)에서 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600 ~1.0에 도달하면 IPTG (0.5 mM 최종농도)를 부가함으로써 발현을 유도시키고 37℃에서 밤새 계속 교반하였다. 세포를 이후 원심분리하여 수확하고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.5 mM 피리독실 포스페이트 (PLP), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 및 1 μg/mL DNA 가수분해효소로 이루어진 용해 완충액에 재-현탁시켰다. 세포 용해를 프렌치 프레스(French press)로 성취하고 용해물을 4℃에서 1시간 동안 20,000 x g로 원심분리하여 입자를 제거하였다. 상청액을 이후 5 μm 주사기 필터를 통해 여과시키고 pH 7.4의 50 mM 나트륨 포스페이트, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP로 이루어진 완충액 내에 미리-평형화시킨 Ni-NTA/아가로스 컬럼 (Qiagen)에 도포하였다. 용해물을 컬럼 상에 로딩한 후에, 수지를 5 컬럼 부피 (CV)의 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP로 30 mM 이미다졸과 함께 세척하였다. 이후, 유속을 느리게 설정하여 컬럼을 밤새 0.1 mM PLP 및 1% v/v TRITON® X114이 함유된 100 CV의 무-내독소 PBS (Corning) 완충액으로 세척하였다. 밤새 세척함으로써 박테리아 발현 시스템의 전형적인 오염물질인 지질다당류(LPS 또는 내독소)가 제거된다. 세척된 효소를 이후 250 mM 이미다졸과 0.1 mM PLP를 함유한 5 CV의 무-내독소 PBS로 용리하였고, 수지를 두 번째로 0.1 mM PLP가 담긴 5 CV 분량의 내독소가 없는 PBS로 헹구었다. 이 시점에서, 효소의 완충액을 신선한 PBS로 교환하여 이미다졸을 제거하고, 10% 글리세롤을 부가하고 분취액을 저장하기 위해 -80℃의 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 대안적으로, 효소의 완충액을 즉시 갓 제조한, 무균 100 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.4의 완충액으로 교환하여, 이미다졸을 제거하고 페길화를 준비한다 (실시예 4를 참조). 효소 순도는 SDS-PAGE 분석을 기준으로 전형적으로 >95%였고 전형적인 수율은 평균 약 75 mg/배양물의 L였다. Abs280 nm를 측정하고 산출된 63,745 M-1cm-1의 효소 흡광 계수를 이용함으로써 단백질 함량을 측정하였다.
실시예 2 - 인간( Homo sapiens ) 키누레니나제의 유전자 구성, 발현, 및 정제
인간(Homo sapiens)으로부터의 키누레니나제 효소의 발현을 위한 유전자(h-KYNU)를 DNA-Works 소프트웨어를 이용하여 설계된 네 코돈 최적화된 유전자 블록을 오버랩 연장 중합효소 사슬 반응 (PCR)시킴으로써 얻었다(Hoover 및 Lubkowski, 2002). 전장 유전자는 N-말단 XbaI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1-6), 최적화된 RBS (뉴클레오티드 28-60), 출발 코돈 (뉴클레오티드 61-63), N-말단 His6 태그 (뉴클레오티드 64-96), E. coli 코돈 최적화된 h-KYNU 유전자 (뉴클레오티드 97-1488), 중지 코돈 (뉴클레오티드 1489-1491), 및 C-말단 BamHI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1492-1497)를 포함한다 (서열번호 2를 참조). 전술된 제한 효소 부위를 사용하여 조립된 유전자를 pET-28a+ 벡터 (Novagen)로 클로닝하였다. 이러한 구조체를 사용하여 이후 발현을 위한 BL21 (DE3) E. coli 로 형질전환시켰다. 세포를 50 mg/L의 카나마이신이 담긴 최소 배지 (Terrific Broth, TB)에서 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600 ~1.0에 도달하면 IPTG (0.5 mM 최종농도)를 부가함으로써 발현을 유도시키고 37℃에서 밤새 계속 교반하였다. 세포를 이후 원심분리하여 수확하고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.5 mM 피리독실 포스페이트 (PLP), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 및 1 μg/mL DNA 가수분해효소로 이루어진 용해 완충액에 재-현탁시켰다. 세포 용해를 프렌치 프레스(French press)로 성취하고 용해물을 4℃에서 1시간 동안 20,000 x g로 원심분리하여 입자를 제거하였다. 상청액을 이후 5 μm 주사기 필터를 통해 여과시키고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP 완충액 내에 미리-평형화시킨 Ni-NTA/아가로스 컬럼 (Qiagen)에 도포하였다. 용해물을 컬럼 상에 로딩한 후에, 수지를 5 컬럼 부피 (CV)의 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP로 30 mM 이미다졸과 함께 세척하였다. 이후, 유속을 느리게 설정하여 컬럼을 밤새 0.1 mM PLP 및 1% v/v TRITON® X114이 함유된 100 CV의 무-내독소 PBS (Corning) 완충액으로 세척하였다. 밤새 세척함으로써 효소의 박테리아 발현에서 전형적인 오염물질인 지질다당류(LPS 또는 내독소)가 제거된다. 세척된 효소를 이후 250 mM 이미다졸과 0.1 mM PLP를 함유한 5 CV의 내독소가 없는 PBS로 용리하였고, 수지를 두 번째로 0.1 mM PLP가 담긴 5 CV 분량의 내독소가 없는 PBS로 헹구었다. 이 시점에서, 효소의 완충액을 신선한 PBS로 교환하여 이미다졸을 제거하고, 10% 글리세롤을 부가하고 분취액을 저장하기 위해 -80℃의 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 대안적으로, 효소의 완충액을 갓 제조한, 무균 100 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.4의 완충액으로 교환하여, 이미다졸을 제거하고 페길화를 준비할 수 있다 (실시예 4를 참조). 효소 순도는 SDS-PAGE로 측정하여 전형적으로 >95%였고 전형적인 수율은 평균 약 20 mg/액체 배양물의 L였다. Abs280 nm를 측정하고 산출된 76,040 M-1cm-1의 효소 흡광 계수를 이용함으로써 단백질 함량을 측정하였다.
실시예 3 - 무스 무스쿨루스( Mus musculus ) 키누레니나제의 유전자 구성, 발현, 및 정제
무스 무스쿨루스(Mus musculus)으로부터의 키누레니나제 효소의 발현을 위한 유전자(m-KYNU)를 DNA-Works 소프트웨어를 이용하여 설계된 세 코돈 최적화된 유전자 블록을 오버랩 연장 중합효소 사슬 반응 (PCR)시킴으로써 얻었다(Hoover et al., 2002). 전장 유전자는 N-말단 XbaI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1-6), 최적화된 RBS (뉴클레오티드 29-58), 출발 코돈 (뉴클레오티드 59-61), N-말단 His6 태그 (뉴클레오티드 62-94), E. coli 코돈 최적화된 m-KYNU 유전자 (뉴클레오티드 95-1483), 중지 코돈 (뉴클레오티드 1484-1486), 및 C-말단 BamHI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1487-1492)를 포함한다 (서열번호 3 참조). 전술된 제한 효소 부위를 사용하여 조립된 유전자를 pET-28a+ 벡터 (Novagen)로 클로닝하였다. 이러한 구조체를 사용하여 이후 발현을 위한 BL21 (DE3) E. coli 로 형질전환시켰다. 세포를 50 mg/L의 카나마이신이 담긴 최소 배지 (Terrific Broth, TB)에서 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600 ~1.0에 도달하면 0.5 mM IPTG를 부가함으로써 발현을 유도시키고 37℃에서 밤새 지속하였다. 세포를 원심분리하여 수확하고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.5 mM 피리독실 포스페이트 (PLP), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 및 1 μg/mL DNA 가수분해효소로 이루어진 용해 완충액에 재-현탁시켰다. 세포 용해를 프렌치 프레스(French press)로 성취하고 용해물을 4℃에서 1시간 동안 20,000 x g로 원심분리하여 입자를 제거하였다. 상청액을 5 μm 주사기 필터를 통해 여과시키고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP 완충액 내에 미리-평형화시킨 Ni-NTA/아가로스 컬럼 (Qiagen)에 도포하였다. 용해물을 컬럼 상에 로딩한 후에, 수지를 5 컬럼 부피 (CV)의 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP로 30 mM 이미다졸과 함께 세척하였다. 이후 유속을 느리게 설정하여 밤새 0.1 mM PLP 및 1% v/v TRITON® X114이 함유된 100 CV의 무-내독소 PBS (Corning) 완충액으로 세척하였다. 밤새 세척함으로써 효소의 박테리아 발현에서 전형적인 오염물질인 지질다당류(LPS 또는 내독소)가 제거된다. 세척된 효소를 250 mM 이미다졸과 0.1 mM PLP를 함유한 5 CV의 내독소가 없는 PBS로 용리하였고, 수지를 두 번째로 0.1 mM PLP가 담긴 5 CV 분량의 내독소가 없는 PBS로 헹구었다. 이 시점에서, 효소의 완충액을 신선한 PBS로 교환하여 이미다졸을 제거하고, 10% 글리세롤을 부가하고 분취액을 저장하기 위해 -80℃의 액체 질소에서 급속 냉동시켰다.
실시예 4 - 슈도모나스 플루오레슨스( Pseudomonas fluorescens ) 키누레니나제의 약리학적 제조
생체 내에서 효소의 순환 시간을 증가시키기 위해, KYNU 효소를 PEG에 접합시킴으로써 단백질의 표면 반응기를 관능화하여 효소의 수화 반경을 증가시켰다. 한 구체예에서, Pf-KYNU는 표면 리신 잔기를 메톡실 PEG 석신이미딜 카르보네이트 5000 MW (NANOCS)와 반응시켜 관능화시켰다. 정제된, 무-내독소 효소의 완충액을 갓 제조한 100 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.4로 완전히 교환하고, 10 mg/mL까지 농축시켰다. 생성된 용액을 100:1 몰과량의 고체 PEG 시약에 직접 부가하고 실온에서 1 시간동안 반응하게 두었다 (도 1). 100 kDa 차단(cut off) 원심분리 여과 장치(AMICON®)에서 완충액을 신선한, 무-내독소 PBS로 완전히 교환하여 용액으로부터 미-반응된 PEG를 제거하였다. 효소의 명목상 몰 질량을 이후 PBS 내 크기 배제 HPLC 컬럼 (Phenomenex)에서 확인하였다. BioRad사의 MW 표준 용액을 사용하여 단백질 표준의 수치와 비교한 표준화 곡선 및 효소 체류 시간을 생성하였다. 표준 곡선을 기준으로, 비-페길화된 효소는 40 kDa의 명목 질량을 가지며, 이는 Pf-KYNU의 단량체 하나의 질량과 유사하다. 페길화 버전의 효소는 1,300 kDa의 명목 질량을 가지는 것으로 나타났으며, 즉 변형되지 않은 효소보다 실질적으로 더 컸다. Chromo-LAL 역학 발색성 내독소 시험 키트 (Associates of Cape Cod, Inc.)를 이용하여 내독소 수준을 정량화하였다. 상기 기술된 방식으로 세척한 효소는 전형적으로 정제된 Pf-KYNU의 0.19 ± 0.07 EU/mg의 내독소 수준을 보였다.
실시예 5 - 인간( Homo sapiens ) 키누레니나제의 약리학적 제조
생체 내에서 인간 효소의 순환계 체류 시간을 증가시키기 위해, h-KYNU를 PEG에 접합시킴으로써 단백질의 표면 반응기를 관능화하여 이의 수화 반경을 증가시켰다. 한 구체예에서, h-KYNU는 표면 리신 잔기를 메톡실 PEG 석신이미딜 카르보네이트 5000 MW (NANOCS)와 반응시켜 관능화시켰다. 정제된, 무-내독소 효소의 완충액을 갓 제조한 100 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.4로 완전히 교환하고, 10 mg/mL까지 농축시켰다. 생성된 용액을 100:1 몰과량의 고체 PEG 시약에 직접 부가하고 실온에서 1 시간동안 반응하게 두었다. 100 kDa 차단(cut off) 원심분리 여과 장치(AMICON®)에서 완충액을 신선한, 무-내독소 PBS로 완전히 교환하여 용액으로부터 미-반응된 PEG를 제거하였다. 효소의 명목상 몰 질량을 PBS로 평형화시킨 크기 배제 HPLC 컬럼 (Phenomenex)을 이용하여 측정하였고 체류 시간을 MW 표준 용액(BioRad)과 비교하였다. Chromo-LAL 역학 발색성 내독소 시험 키트 (Associates of Cape Cod, Inc.)를 이용하여 내독소 수준을 정량화하였다.
실시예 6 - 키누레니나제의 역학 변수를 측정하기 위한 어세이
Pf-KYNU 및 h-KYNU, 뿐만 아니라 실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 이들의 페길화 버전의 역학 변수를 분광측정 어세이로 정량화하였고, 여기서 효소 기질인, L-키누레닌의 최대 흡광도의 감소를 시간의 경과에 따라 관찰하였다. L-키누레닌 용액을 pH 7.4의 PBS 완충액에 제조하여, 8 μM 내지 250 μM 범위의 최종 농도를 만들었다. L-키누레닌은 365 nm에서 λmax와 함께 4,500 M-1cm-1 의 흡광 계수를 가지는 반면 키누레니나제 반응의 산물인, L-안트라닐산 및 L-알라닌은 365 nm에서 주목할만한 흡수를 보이지 않았다. 효소 용액 (~20 nM 최종)을 기질 용액에 부가하고 빠르게 혼합시켜 반응을 개시하고 시간에 따른 Abs365 nm를 측정하여 25℃에서 기질 KYN의 손실을 관찰하였다. 생성된 데이터를 처리하고 미하엘리스-멘텐 등식에 대입하여 역학 상수를 산출하였다. 페길화된 Pf-KYNU 효소의 동역학을 동일한 방식으로 측정하였다. 비-페길화된 효소에 있어서, k cat/K M = 1.0 × 105 M-1s-1였고 페길화 형태에 있어서, k cat/K M = 1.3 × 105 M-1s-1였다. 3-하이드록시-L-키누렌산의 가수분해에 대한 역학 변수를 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 측정하였다.
실시예 7 - 키누레니나제의 시험관 내 안정성
Pf-KYNU의 시험관 내 안정성을 측정하기 위해, 효소를 PBS 완충액 또는 인간 혈청 풀(pool)에 10 μM의 최종 농도로 부가하고 37℃에서 배양하였다. 10 μL 분량을 각각 시점마다 분취하고 990 μL의 250 μM L-키누레닌/PBS 용액에 부가하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 시간에 따라 365 nm에서 흡광도의 감소를 측정하여 반응의 초기 속도를 관찰하였다. L-키누레닌 촉매반응의 초기 속도를 각 시점의 속도와 비교하고 시간 = 0에서의 속도와 비교함으로써 효소 안정성을 측정하였다. 생성된 데이터를 % 활성 대 시간으로 도표화하고 지수 등식에 대입하여 반-감기 (T1/2)를 측정하였다. Pf-KYNU 효소는 PBS에서 T1/2 = 34.3 시간을 가지고 인간 혈청 풀에서 T1/2 = 2.4 시간을 가지는 것이 확인되었다 (도 2).
실시예 8 - 생체 내 키누레닌 및 트립토판 수준을 정량화하기 위한 어세이
L-키누레닌, 트립토판, 키누레닌산, 3-하이드록시-L-키누레닌 및 L-안트라닐산 (키누레니나제 촉매반응의 산물 중 하나)의 생체 내 수준을 정량화하고 HPLC로 관찰하였다. 마우스를 부검하여, 혈액, 종양, 비장, 및 간 샘플을 제거하였다. 혈액 샘플을 원심분리하여 혈청과 전혈을 분리하였다. 조직 샘플을 먼저 균질화하고, 이후 원심분리하여 고체 부분을 제거하였다. 각각의 액체 분량에 1:10 v/v 분량의 100% 트리클로로아세트산을 부가하여 거대분자를 침전시켰다. 고체를 다시 원심분리하여 제거하고 상청액을 0.45 μm 주사기 필터로 통과시켰다. 처리한 상청액을 HPLC (Shimadzu)에 직접 적용하고 표준 분석용 C-18 컬럼에서 0% 용액 B에서 출발하여 100% 용액 B이 되는 구배를 이용하여 분리하였고 여기서 용액 A는 H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산이고 용액 B는 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산이다. 190 nm 내지 900 nm 범위의 전체 흡광도를 지속적으로 수집하여 모든 가능한 분자를 지속적으로 관찰하였고 형광 분광학 (Ex = 365 nm, Em = 480 nm)을 동시에 수집하여 키누레닌 수준을 특정하게 관찰하였다. 농도 및 체류 시간을 순수한 분자 (Sigma)로 제조한 표준 용액을 이용하여 측정하였다.
실시예 9 - 자가 B16 마우스 흑색종 모델에서 PEG- Pf -KYNU의 효능
B6-WT 마우스 (n = 20)에게 2.5 × 105 B16 쥐의 흑색종 세포를 피하 옆구리 주사로 접종하였다. 종양을 10일간 정착되게 한 뒤 (종양 평균 = 20 mm2) 마우스를 각각 n=10인 두 군으로 나누었다. 대조군에게 이후 20 mg/kg의 열 비활성화된 PEG-Pf-KYNU를 종양이 350 mm2 크기가 될때까지 매 3일마다 종양내 주사하였다. 실험군에게 20 mg/kg의 활성 PEG-Pf-KYNU를 종양이 350 mm2 크기 종말점에 도달할 때까지 매 3일마다 종양내 주사하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 처리하였다. B16 흑색종 종양의 성장 속도는 동일하게 처리한 열-비활성 PEG-Pf-KYNU 군(도 3)에 비해 활성 PEG-Pf-KYNU를 투여한 처리군에서 상당히 지연되어 상당한 수명 연장을 가져왔다(도 4). 대조군 및 실험 처리군으로부터 단리한 림프구를 항체의 패널로 평가하였고 (즉, 항-CD45, CD4, Nk1.1, CD25, FoxP3, CD8, 그랜자임 B, IFNγ, CTLA4, CD11c, CD11b, F4/80, GR-1, 및 Ly6-C) 이는 순환하는 CD4+ CD25+ FoxP3+ 조절 T-세포의 집단이 활성 PEG-Pf-KYNU로 처리한 군에서 상당히 더 낮음을 나타내었다 (4.8 ± 0.8% vs. 8.6 ± 0.8%). 또한, 종양 침투성 CD8+ 그랜자임 B 및 인터페론 γ를 발현하는 T-세포의 집단은 활성 효소로 처리한 마우스에서 상당히 더 높았다 (26 ± 19% vs. 4 ± 2%) (도. 5A-B).
실시예 10 - 종양 표적화를 위한 키누레니나제-scFv 융합 단백질
일부 양태에서, 본 발명은 또한 이종 아미노산 서열에 연결된 변형된 박테리아 또는 포유류 키누레니나제를 포함하는 폴리펩티드를 고려한다. 예를 들면, 자연적인 또는 변형된 키누레니나제는 특정한 세포 표면 종양 항원에 결합하는 단-사슬 가변 단편 (scFv) 항체에 연결될 수 있다. 이러한 구체예에서 공지의 종양 항원, 바람직하게는 더 느린 속도로 내면화하는 종양 특이적 항원, 예컨대, MUC-1에 대해 특이적인 친화성을 가지는 단백질의 scFv 부분을 갖는 scFv-키누레니나제 융합 단백질은, 융합 단백질의 키누레니나제 부분을 종양 세포로 송달하여 KYN를 분해하게 할 수 있다. 한 예시는 scFv 부분이 특정 유형의 유방암에서 상향조절되는 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2)를 표적화하고 결합하는 scFv-키누레니나제 융합 단백질일 것이다.
이러한 구체예에서 자연적인 또는 변형된 키누레니나제-항-HER2-scFV 융합 단백질은 종양 표면에 키누레니나제를 직접 표적화하고 농축하도록 작용하고 종양-생산된 KYN을 분해하도록 작용할 것이다.
실시예 11 - 키누레니나제-항-CTLA4-scFv 융합 단백질
일부 양태에서, 본 발명은 또한 이종 아미노산 서열에 연결된 변형된 박테리아 또는 포유류 키누레니나제를 포함하는 폴리펩티드를 고려한다. 예를 들면, 자연적인 또는 변형된 키누레니나제는 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4) 수용체, 예정세포사 1 (PD-1), 또는 예정세포사 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 단-사슬 가변 단편 (scFv) 항체에 연결될 수 있디. 항체 또는 항체 단편에 반대로 작용함에 의한 CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1의 봉쇄는 저해성 T-세포 신호전달이 역으로 일어나게 하여 CD28가 T-세포 활성화를 촉진하게 만든다. 이러한 구체예에서 자연적인 또는 변형된 키누레니나제-항-CTLA4-, 항-PD-1-, 또는 항-PD-L1-scFv 융합 단백질은 저해성 단백질:단백질 상호작용 신호전달 및 저해제 키누레닌 신호전달을 모두 제거하도록 작용할 것이다. 자연적인 또는 변형된 키누레니나제-scFv 융합 단백질의 이러한 구체예는 T-세포 활성화를 강하게 상향조절하고 격렬한 항-종양 반응을 촉진할 것으로 예상된다.
실시예 12 - 키누레니나제를 T 세포로 보내기 위한 키메라 항원 수용체 구조체
일부 양태에서, 본 발명은 또한 변형된 박테리아 또는 포유류 키누레니나제가 CAR 구조체와 더불어 동시-발현되도록 키메라 항원 수용체 (CAR) 구조체로 T 세포를 형질감염시키기에 적절한 렌티바이러스 벡터를 고려한다. CAR 구조체는 CD3-ζ 사슬로부터의 막관통 및 세포질 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원 결합 도메인 및 흔히 CD28 분자를 내포하는 단백질이다 (Ahmed et al., 2010). 항원 결합 도메인은 종양 세포에 의해 발현된 항원, 가령 교모세포종 또는 골육종에 의해 발현되는 HER2, 다양한 B-세포 악성종양에 의해 발현되는 CD19 또는 CD20, 또는 신경모세포종에 의해 발현되는 GD2 (Lipowska-Bhalla et al., 2012) 또는 임의의 다른 관련 표적과 결합하도록 설계된 scFv일 수 있다. 이러한 구체예에서 적절한 CAR 구조체를 T 세포에 전달하는 렌티바이러스 벡터는, 또한 세포질에서 자연적인 또는 변형된 박테리아 또는 포유류 키누레니나제를 동시-발현시킬 수 있다. 이러한 CAR/키누레니나제 구조체를 함유하는 T 세포는 1) 특정한 종양 세포에 결합하고 및 2) KYN를 분해하고, 조절성 표현형 및 또는 아폽토시스의 KYN 유도를 차단하는 이중의 능력을 가질 수 있다. 또다른 구체예에서 T 세포는 CD19+ 또는 CD20+ 미만성 거대 B-세포 림프종에 결합하는 CAR 구조체를 발현시키는 동시에 이러한 종양 유형에 의해 흔히 야기되는 고농도의 KYN을 분해하기 위한 키누레니나제를 동시-발현시킬 수 있다 (Yoshikawa et al., 2010; de Jong et al., 2011; Yao et al., 2011).
실시예 13 - 키누레니나제 활성에 대한 유전적 선별
아미노산 L-트립토판 (L-Trp)은 trp 생합성 유전자의 발현에 의해 펜토스 유래 전구체, 코리스미산염으로부터 합성된다. E. coli와 같은 박테리아에서 trp 생합성 유전자는 다섯 가지 유전자; trpE, trpD, trpC, trpB, 및 trpA로 구성된 오페론으로 조직된다. TrpE 및 TrpD 단백질은 코리스미산염 및 L-글루타민을 안트라닐산 및 L-글루타메이트로 전환하는 첫 번째 단계를 촉매하는 안트라닐산염 합성효소 복합체의 성분이다. 안트라닐산은 이후 나중에 TrpC, TrpA, 및 TrpB의 작용에 의해 L-Trp로 전환된다. 관능적 안트라닐산염 합성효소 유전자가 결여된 세포는 L-Trp를 영양분으로 요구하며 트립토판이 없는 최소 배지에서 성장하지 못한다. 본 발명자는 키누레닌이 많은 유기체의 세포질로 수송될 수 있기 때문에, 충분히 높은 촉매 활성을 보이며 재조합 L-키누레니나제 효소를 발현하는 세포는 세포질의 L-키누레닌을 안트라닐산으로 전환할 수 있으며 후자는 이후에 L-Trp의 합성을 가능하게 할 것으로 가정하였다. 대조적으로, 효소를 발현하지 못하거나 낮은 촉매 활성을 가진 변이체를 발현하는 세포는 L-키누레닌이 존재하는 최소 배지에서 각각 전혀 성장하지 않거나 매우 낮은 성장을 보일 것이었다.
E. coli trpE 및 trpD 결실 돌연변이를 Yale CGSC의 유전자 공급업체(Genetic Resources)로부터 얻었다. 균주 유전형은 각각 (F-,Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, ΔtrpE772::kan, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514) 및 (F-, Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3),λ-,ΔtrpD771::kan, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514)였다. 세포를 M9 최소 배지 플레이트에 도말하였다. L-Trp, L-Kyn, 안트라닐산, 또는 완충액 중 어느 하나를 적신 필터 페이퍼 디스크를 이후 플레이트에 배치한 후에 37℃에서 배양하였다. E. coli-ΔtrpD 세포는 L-Trp의 존재에서만 성장하지만, E. coli-ΔtrpE는 또한 안트라닐산의 존재에서는 성장하지만 완충액 또는 L-Kyn에서 성장하지 못하므로, 이는 trpC, trpA, 및 trpB가 발현되어, 중간 대사산물로서 안트라닐산을 갖는 L-Trp 영양요구변이체를 생존시킬 수 있음을 증명한다 (도 6). 더 나아가, Pf-KYNU 유전자를 내포하는 플라스미드로 형질전환된 E. coli-ΔtrpE 세포는 L-Kyn의 존재에서 M9 최소 배지 플레이트에서 급격히 성장하였다.
실시예 14 - 키누레닌에 대해 높은 촉매 활성을 보이며 인간 키누레니나제에 동일성을 나타내는 박테리아 키누레니나제의 유전자 구성, 발현 및 정제
다른 진핵생물 키누레니나제와 유사하게 인간(Homo sapiens) 효소는 3'-OH 키누레닌의 가수분해에 대해 고도로 선택적이며 키누레닌에 대하여 약 1,000-배 더 낮은 촉매 활성을 갖는다. 키누레닌에 대한 빈약한 촉매 활성으로 인해, 인간 효소는 치료 목적으로 적절하지 못하다. 페길화 Pf-KYNU (실시예 9), Mu-KYNU (실시예 22 및 실시예 23), 또는 Cp-KYNU (실시예 17) (이들 모두는 3'-OH 키누레닌 대신에 키누레닌에 대하여 높은 촉매 활성을 보인다)의 투여는 실시예 9에 나타난 바와 같이 종양 성장을 지연시켰다 (도 3). 그러나, 유사하거나 더 높은 투여량으로의 페길화 인간 키누레니나제의 투여는 B16 흑색종 종양 (n = 4)의 성장에 효과가 없었다. 그러나, 실시예 20에 나타난 바와 같이, h-KYNU의 조작은 인간 효소의 L-키누레닌 분해 활성을 높일 수 있다. 그렇게 조작된 h-KYNU 변이체는 페길화 Pf-KYNU (실시예 9), Mu-KYNU (실시예 22 및 실시예 23), 및 Cp-KYNU (실시예 17)에서 나타난 바와 같이 종양 성장을 지연시킬 수 있었다.
Pf-KYNU는 인간 대응물에 대해 낮은 서열 동일성을 나타낸다 (24% 아미노산 동일성). 인간 단백질에 대한 낮은 서열 동일성으로 인해, Pf-KYNU는 환자에서뿐 아니라 중성화 항체의 생산에서 유해한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 그러므로 키누레닌에 대해 높은 촉매 활성 및 선택성을 나타내고 인간(Homo sapiens) 키누레니나제에 대해 더 높은 수준의 아미노산 동일성을 가지는 키누레니나제 효소를 발견하는 것이 중요하다. 본 발명자는 인간(Homo sapiens) 키누레니나제에 대해 >38% 아미노산 동일성을 나타내고 또한 높은 키누레닌 가수분해 활성을 가지는 수많은 박테리아 효소를 확인하였다. 이들 효소의 서열은 서열번호 13-52로 제공된다. 인간(Homo sapiens) 키누레니나제와 비교한 이들의 효소의 동일성 백분율은 표 1에 제공된다. 대표적인 예시로서, 무실라지니박터 팔루디스(Mucilaginibacter paludis)로부터 키누레니나제 효소를 발현하기 위한 유전자(Mu-KYNU) (서열번호 33)를 DNA-Works 소프트웨어를 이용하여 설계된 두 코돈 최적화된 유전자 블록을 오버랩 연장 중합효소 사슬 반응 (PCR)시킴으로써 구성하였다(Hoover 및 Lubkowski, 2002). 전장 유전자는 N-말단 NcoI 제한 효소 부위, 최적화된 RBS, N-말단 His6 태그, E. coli 코돈 최적화된 Mu-KYNU 유전자, 중지 코돈 및 C-말단 EcoRI 제한 효소 부위를 포함한다. 전술된 제한 효소 부위를 사용하여 조립된 유전자를 pET-28a+ 벡터 (Novagen)로 클로닝하였다. 이러한 구조체를 사용하여 이후 발현을 위한 BL21 (DE3) E. coli 로 형질전환시켰다. 세포를 50 mg/L의 카나마이신이 담긴 최소 배지 (Terrific Broth, TB)에서 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600 ~1.0에 도달하면 IPTG (0.5 mM 최종농도)를 부가함으로써 발현을 유도시키고 37℃에서 밤새 계속 교반하였다. 세포를 이후 원심분리하여 수확하고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.5 mM 피리독실 포스페이트 (PLP), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 및 1 μg/mL DNA 가수분해효소로 이루어진 용해 완충액에 재-현탁시켰다. 세포 용해를 프렌치 프레스(French press)로 성취하고 용해물을 4℃에서 1시간 동안 20,000 x g로 원심분리하여 입자를 제거하였다. 상청액을 이후 5 μm 주사기 필터를 통해 여과시키고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP 완충액 내에 미리-평형화시킨 Ni-NTA/아가로스 컬럼 (Qiagen)에 도포하였다. 용해물을 컬럼 상에 로딩한 후에, 수지를 5 컬럼 부피 (CV)의 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP로 30 mM 이미다졸과 함께 세척하였다. 세척된 효소를 이후 250 mM 이미다졸과 0.1 mM PLP를 함유한 5 CV의 PBS로 용리하였다. 이 시점에서, 효소의 완충액을 신선한 PBS로 교환하여 이미다졸을 제거하고, 10% 글리세롤을 부가하고 분취액을 저장하기 위해 -80℃의 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 효소 순도는 SDS-PAGE 분석을 기준으로 전형적으로 >95%였고 전형적인 수율은 평균 약 75 mg/배양물의 L였다. Abs280 nm를 측정하고 산출된 78,185 M-1cm-1의 효소 흡광 계수를 이용함으로써 단백질 함량을 측정하였다.
표 1. 인간(Homo sapiens) 키누레니나제와 비교한 진정세균 키누레니나제 효소의 동일성 백분율.
Figure 112021072986672-pat00001
Figure 112021072986672-pat00002
Figure 112021072986672-pat00003
실시예 15 - 무실라지니박터 팔루디스 ( Mucilaginibacter paludis ) 키누레니나제 ( Mu -KYNU)의 역학 변수
Mu-KYNU 의 역학 변수를 분광측정 어세이로 정량화하였고, 여기서 효소 기질인, L-키누레닌의 최대 흡광도의 감소를 시간의 경과에 따라 관찰하였다. L-키누레닌 용액을 pH 7.4의 PBS 완충액에 제조하여, 16 μM 내지 500 μM 범위의 최종 농도를 만들었다. L-키누레닌은 365 nm에서 λmax와 함께 4,500 M-1cm-1 의 흡광 계수를 가지는 반면 키누레니나제 반응의 산물인, L-안트라닐산 및 L-알라닌은 365 nm에서 주목할만한 흡수를 보이지 않았다. 효소 용액 (~ 20 nM 최종 농도)을 기질 용액에 부가하고 빠르게 혼합시켜 반응을 개시하고 시간에 따른 Abs365 nm를 측정하여 25℃에서 기질의 손실을 관찰하였다. 생성된 데이터를 처리하고 미하엘리스-멘텐 등식에 대입하여 역학 상수를 산출하였다. Mu-KYNU는 k cat/K M = 1.2 × 105 M-1s-1를 가지는 것으로 측정되었다.
실시예 16 - 무실라지니박터 팔루디스( Mucilaginibacter paludis ) 키누레니나제 ( Mu -KYNU)의 시험관 내 안정성
Mu-KYNU의 시험관 내 안정성을 측정하기 위해, 효소를 PBS 완충액 또는 인간 혈청 풀(pool)에 10 μM의 최종 농도로 부가하고 37℃에서 배양하였다. 10 μL 분량을 각각 시점마다 분취하고 990 μL의 250 μM L-키누레닌/PBS 용액에 부가하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 시간에 따라 365 nm에서 흡광도의 감소를 측정하여 반응의 초기 속도를 관찰하였다. L-키누레닌 촉매반응의 초기 속도를 각 시점의 속도와 비교하고 시간 = 0에서의 속도와 비교함으로써 효소 안정성을 측정하였다. 생성된 데이터를 시간에 대한 백분율 활성으로 도표화하고 이-상성 감소 모델(Stone et al., 2010)에 대입하여 반-감기 (T1/2)를 측정하였다. PBS에서 Mu-KYNU 효소의 활성은 1T1/2 = 6 h였고 잔여 활성의 진폭은 74%, 이후의 2T1/2 = 150 h인 것으로 측정되었다 (도 7). 인간 혈청 풀에서 Mu-KYNU 효소의 안정성은 1T1/2 = 5 h였고 잔여 활성의 진폭은 30%, 이후의 2T1/2 = 73 h인 것으로 측정되었다 (도 7).
실시예 17 - 클라미도필라 페코룸( Chlamydophila pecorum ) 키누레니나제의 유전자 구성, 발현, 및 정제
클라미도필라 페코룸 (Chlamydophila pecorum)로부터 키누레니나제 효소를 발현하기 위한 유전자 (Cp-KYNU)를 E. coli-코돈 최적화된 유전자 블록을 이용하여 합성하였다. 전장 유전자는 N-말단 NcoI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1-6), 출발 코돈 (뉴클레오티드 3-5), N-말단 His6 태그 (뉴클레오티드 6-35), E. coli 코돈 최적화된 Cp-KYNU 유전자 (뉴클레오티드 36-1295), 중지 코돈 (뉴클레오티드 1296-1298), 및 C-말단 EcoRI 제한 효소 부위 (뉴클레오티드 1299-1304)를 포함한다 (서열번호 53). 전술된 제한 효소 부위를 사용하여 조립된 유전자를 pET-28a+ 벡터 (Novagen)로 클로닝하였다. 이러한 구조체를 사용하여 이후 발현을 위한 BL21 (DE3) E. coli 로 형질전환시켰다. 세포를 50 mg/L의 카나마이신이 담긴 최소 배지 (Terrific Broth, TB)에서 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600 ~1.0에 도달하면 IPTG (0.5 mM 최종농도)를 부가함으로써 발현을 유도시키고 16℃에서 밤새 계속 교반하였다. 세포를 이후 원심분리하여 수확하고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.5 mM 피리독실 포스페이트 (PLP), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 및 1 μg/mL DNA 가수분해효소로 이루어진 용해 완충액에 재-현탁시켰다. 세포 용해를 프렌치 프레스(French press)로 성취하고 용해물을 4℃에서 1시간 동안 20,000 x g로 원심분리하여 입자를 제거하였다. 상청액을 이후 5 μm 주사기 필터를 통해 여과시키고 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP 완충액 내에 미리-평형화시킨 Ni-NTA/아가로스 컬럼 (Qiagen)에 도포하였다. 용해물을 컬럼 상에 로딩한 후에, 수지를 10 컬럼 부피 (CV)의 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 300 mM NaCl, 및 0.1 mM PLP로 30 mM 이미다졸과 함께 세척하였다. 세척된 효소를 이후 0.1 mM PLP 및 250 mM 이미다졸과 5 CV의 PBS로 용리하였다. 용리된 효소의 완충액을 신선한 PBS로 교환하여 이미다졸을 제거하고, 10% 글리세롤을 부가하고 분취액을 저장하기 위해 -80℃의 액체 질소에서 급속 냉동시켰다.
실시예 18 - 클라미도필라 페코룸( Chlamydophila pecorum ) 키누레니나제 ( Cp -KYNU)의 역학 변수
Cp-KYNU (서열번호 57) 의 역학 변수를 분광측정 어세이로 정량화하였고, 여기서 효소 기질인, L-키누레닌의 최대 흡광도의 감소를 시간의 경과에 따라 관찰하였다. L-키누레닌 용액을 pH 7.4의 PBS 완충액에 제조하여, 16 μM 내지 500 μM 범위의 최종 농도를 만들었다. L-키누레닌은 365 nm에서 λmax와 함께 4,500 M-1cm-1 의 흡광 계수를 가지는 반면 키누레니나제 반응의 산물인, 안트라닐산염 및 L-알라닌은 365 nm에서 주목할만한 흡수를 보이지 않았다. 효소 용액 (200 nM 최종 농도)을 기질 용액에 부가하고 빠르게 혼합시켜 반응을 개시하고 시간에 따른 Abs365 nm를 측정하여 25℃에서 기질의 손실을 관찰하였다. 생성된 데이터를 처리하고 미하엘리스-멘텐 등식에 대입하여 역학 상수를 산출하였다. Cp-KYNU는 k cat/K M = 3 × 104 M-1s-1를 가지는 것으로 측정되었다.
실시예 19 - 무실라지니박터 팔루디스( Mucilaginibacter paludis ) 키누레니나제의 약리학적 제조
생체 내에서 효소의 순환 시간을 증가시키기 위해, Mu-KYNU를 PEG에 접합시킴으로써 단백질의 표면 반응기를 관능화하여 효소의 수화 반경을 증가시켰다. 한 구체예에서, Mu-KYNU는 표면 리신 잔기를 메톡실 PEG 석신이미딜 카르보네이트 5000 MW (NANOCS)와 반응시켜 페길화시켰다. 정제된 Mu-KYNU는 하기 기술된 바와 같이, 매우 낮은 내독소 수준 (<20 EU/mg)을 보유하는 것으로 측정되었다. 이것의 완충액을 갓 제조한 100 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 8.4로 완전히 교환하고, 1 mg/mL 이상으로 농축시켰다. 생성된 용액을 100:1 몰과량의 고체 PEG 시약에 직접 부가하고 실온에서 1 시간동안 교반하면서 반응하게 두었다. 100 kDa 차단 원심분리 여과 장치(Amicon)에서 완충액을 신선한, 무-내독소 PBS로 완전히 교환하여 용액으로부터 미-반응된 PEG를 제거하였다. 효소의 명목상 몰 질량을 이후 PBS 내 크기 배제 HPLC 컬럼 (Phenomenex)에서 확인하고 BioRad사의 MW 표준 용액을 사용하여 표준화 곡선을 생성하고, 효소 체류 시간을 단백질 표준의 수치와 비교하였다. Chromo-LAL 역학 발색성 내독소 시험 키트 (Associates of Cape Cod, Inc.)를 이용하여 내독소 수준을 정량화하였다.
실시예 20 - 조작된 인간 키누레니나제 변이체에서 증진된 L-키누레닌 분해
h-KYNU 효소는 3'-OH 키누레닌의 가수분해에 대해 고도로 선택적이며 L-키누레닌에 대하여 약 1,000배 더 낮은 촉매 활성을 갖는다. L-키누레닌에 대한 빈약한 촉매 활성으로 인해, 야생형 인간 효소는 치료 목적으로 적절하지 못하다. 향상된 L-키누레닌 분해 활성을 h-KYNU에 도입시키기 위해, h-KYNU 유전자 및 아미노산 F306에 상응하는 코돈의 돌연변이를 유도하도록 설계된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 오버랩 연장 중합효소 사슬 반응 (PCR)에 의해 포화 돌연변이유발 라이브러리를 구성하였다. F306은 기질 결합에 중요한 역할을 수행한다고 여겨지는 h-KYNU의 활성 부위 내에 위치한다. F306 포화 라이브러리를 실시예 6의 미세적정 플레이트 키누레니나제 어세이를 이용하여 활성에 대해 선별하였다. 열 두 가지 이상의 클론이 야생형 h-KYNU보다 상당히 더 높은 활성을 나타냈고 추가의 분석을 위해 선별되었다. 이들 클론의 서열 분석을 통해 위치 F306에서의 두 개의 아미노산 치환, 즉 h-KYNU-F306M (서열번호 55) 및 h-KYNU-F306L (서열번호 56)이 향상된 L-키누레닌 분해 활성을 생성함이 드러났다. 이들 변이체를 이후 균일하도록 정제하였고 구체적인 역학 분석은 L-키누레닌에 대한 k cat/K M이 h-KYNU-F306M 및 h-KYNU-F306L에 있어서 야생형 h-KYNU에 비해 각각 2-배 및 5-배 증가했음을 나타내었다.
실시예 21 - 자가 B16 마우스 흑색종 모델에서 Pf -KYNU, 항-PD1, 및 항-CTLA-4 요법의 비교
페길화된 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence) 키누레니나제 (PEG-Pf-KYNU)를 B16 흑색종 마우스 모델에서 항-PD1 (클론 RMP1-14, BioXCell # BE0146) 또는 항-CTLA-4 (클론 UC10-4F10-11, BioXCell # BE0032) 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor) 항체와 나란히 비교하여 평가하였다. 5만 개의 B16 세포를 C57BL/6J 마우스의 옆구리에 이식하였다 (제0일, 각 군의 n = 8 마리 마우스). 명백한 종양이 발생하면 (제10일), 동물을 250 μg의 표시된 시간에 항-PD1, 100 μg 항-CTLA-4 (Holmgaard et al. (2013)에 따르면 최초 투여는 200 μg), 또는 500 μg의 PEG-Pf-KYNU로 처리하였다 (도 8). 열-비활성화된 PEG-Pf-KYNU를 대조로서 사용하였다. PEG-Pf-KYNU의 투여는 비활성화된 효소 또는 PBS 단독에 대비한 PEG-Pf-KYNU에 있어서 항-PD1 또는 항-CTLA-4 관문 저해제 항체에서 관찰된 것과 구별하기 어려울 정도의 상당한 종양 성장 지연 및 생존 연장을 가져왔다(도 8).
실시예 22 - 자가 B16 마우스 흑색종 모델에서 Mu -KYNU 또는 Pf -KYNU 및 항-PD1 병행 요법의 효능
페길화된 효소 (PEG-Pf-KYNU 및 PEG-Mu-KYNU)를 항-PD1 면역 관문 저해제 항체와 함께 B16 흑색종 동종이식편에서 평가하였다(Curran et al., 2010). 네 군의 C57BL/6J 마우스 (군당 10마리)에 50,000개 B16 세포를 이식하고 (제0일) 종양이 성장하게 하였다. 명백한 종양이 발생하면 (제10일), 동물의 종양 부위 부근에 500 μg PEG-Pf-KYNU 또는 500 μg PEG-Mu-KYNU 피하(s.c.) 주사하거나 하지 않고, 제10일, 제13일, 및 제16일에 250 μg의 항-PD1을 정맥내(IP) 주사하여 (클론 RMP1-14, BioXCell # BE0146) 처리하였다. 마우스는 제10일과 제25일 사이에 총 여섯 차례 KYNU를 투여받았다. 하나의 군에는 PD-1에 대한 대조로서 PBS를 정맥내(i.p.) 주사하였다. PBS 대조에 비교할 때 모든 처리받은 군에서 종양 성장은 급격하게 약회되거나 심지어 역행했다 (도 9A). 중요하게는, 항-PD1를 KYNU와 함께 투여한 경우에 PEG-Pf-KYNU/항-PD1 처리군에서 종양의 60%가, PEG-Mu-KYNU/항-PD1 처리군에서 종양의 20%가 완전히 경감되는 부가적인 효과가 관찰되었다(도 9B). 상응하는 카플란-마이어 플롯이 도 9C에 제공된다.
실시예 23 - 자가 B16 마우스 흑색종 모델에서 PEG- Mu -KYNU 요법의 효능
페길화된 무실라지니박터 팔루디스(Mucilaginibacter paludis) 키누레니나제 (PEG-Mu-KYNU)를 B16 흑색종 마우스 모델에서 평가하였다. 50,000 개의 B16 세포를 C57BL/6J 마우스의 옆구리에 이식하여 동종이식편을 개시하였다 (제0일, 군당 n = 9 마리 마우스). 명백한 종양이 발생하면 (제10일), 동물에게 500 μg의 PEG-Mu-KYNU를 종양 부위 부근에 매 3일마다 피하 주사하여 총 6차례 처리하였다. 열-비활성화된 PEG-Mu-KYNU을 이용한 동일한 처리 계획을 대조로서 사용하였다. PEG-Mu-KYNU의 투여는 열-비활성화된 PEG-Mu-KYNU 대조에서의 22일(도 10B)에 비해 25일로 연장된 중간 생존 시간을 가지며 종양 성장 지연을 나타냈다 (도 10A).
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본 명세서에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 무수한 실험을 하지 않고도 이행하고 실시할 수 있다. 본 발명의 구성 및 방법이 바람직한 구체예의 방식으로 기술되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위에서 벗어나지 않고서 본 명세서에 기술된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 변화들이 적용될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다. 더 상세하게는, 화학적으로 및 생리학적으로 연관된 특정 물질이 본 명세서에 기술된 물질을 대체할 수 있으며 동시에 동일하거나 유사한 결과를 도출할 수 있음이 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 그러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부되는 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌은, 본 명세서에 제시된 것들에 예시적이고 절차적이거나 달리 세부 사항을 보충하는 내용을 제공하는 한도 내에서, 본 명세서에 참고로서 특정하게 포함된다.
미국 특허 제4,870,287호
미국 특허 제5,739,169호
미국 특허 제5,760,395호
미국 특허 제5,801,005호
미국 특허 제5,824,311호
미국 특허 제5,830,880호
미국 특허 제5,846,945호
미국 특허 제5,889,155호
미국 특허 제7,109,304호
미국 특허 제8,465,743호
미국 특허 공보 제2009/0304666호
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gatcgagaag gagggcgaca gtatcgcggt gatacttttc 660 agcggcgtgc atttctacac gggccaacac ttcaatatcc cggccattac caaagccggc 720 caggcgaaag ggtgctatgt aggctttgat ctggcgcatg cagtgggcaa cgtcgaactg 780 tatcttcatg attggggcgt tgattttgcg tgctggtgca gctataagta tctgaatgcc 840 ggggccggtg ggattgcggg agcctttatt catgagaaac acgcgcatac cattaaaccg 900 gcgctggttg gctggtttgg gcacgaactg agcacccgct tcaagatgga taacaaactg 960 caattgattc cgggcgtgtg cggctttcgt attagcaacc ccccgattct gctggtctgc 1020 agcctgcacg cgtctctgga gattttcaag caggcgacca tgaaagcgct gcgtaagaaa 1080 agtgtgcttc tgacgggcta cctggagtac ctgataaagc acaactacgg caaggataag 1140 gcggccacga agaagccggt tgtgaacatt atcaccccgt ctcatgtgga agaacgtggc 1200 tgccaactga cgataacgtt cagcgtgcca aacaaggacg tgttccaaga gctggagaag 1260 cgtggcgtgg tgtgtgataa acgtaatccg aatggcattc gtgtggcgcc tgtgccgctg 1320 tacaacagct tccacgacgt gtataagttc accaacctgc tgacgagcat tctggacagt 1380 gcggaaacca aaaactag 1398 <210> 6 <211> 1395 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 atggagccga gcccgctgga 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BAL39 <400> 42 Met Lys Val Val Asp Asn Lys Lys Thr Gly Leu Phe Asn Tyr Ile Pro 1 5 10 15 Phe Leu Trp Ile Phe Gly Thr Met Asn Phe Glu Asn Thr Leu Ala Phe 20 25 30 Ala Gln Gly Leu Asp Gln Ala Asp Pro Leu Arg Asp Leu Arg Asn Glu 35 40 45 Phe Leu Phe Pro Gln Gln Asn Gly Lys Pro Phe Ile Tyr Leu Cys Gly 50 55 60 Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro Lys Val Ala Arg Glu Val Leu Asp Arg 65 70 75 80 Gln Leu Asn Asn Trp Gln Asn Leu Ala Val Glu Gly Trp Phe Glu Gly 85 90 95 Glu Thr Pro Trp Met Tyr Tyr His Lys Ala Leu Lys Glu Leu Met Ala 100 105 110 Pro Ile Val Gly Ala Arg Pro Ala Glu Val Cys Pro Met Asn Thr Leu 115 120 125 Thr Val Asn Leu His Leu Leu Met Val Ser Phe Tyr Lys Pro Lys Ala 130 135 140 Lys Arg Phe Lys Ile Met Met Glu Ala Gly Ala Phe Pro Ser Asp Gln 145 150 155 160 Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Val Arg Phe His Gly Tyr Asp Pro Lys Asp 165 170 175 Ala Ile Ile Glu Val Ser Pro Arg Pro Gly Glu Tyr Thr Leu Arg Thr 180 185 190 Glu Asp Ile Leu Glu Gln Ile Ser Leu Gln Gly Asp Gln Ile Ala Leu 195 200 205 Val Leu Phe Gly Gly Ile Asn Tyr Phe Thr Gly Gln Trp Phe Asp Met 210 215 220 Glu Ala Ile Thr Arg Ala Gly His Gln Ala Gly Ala Val Val Gly Phe 225 230 235 240 Asp Leu Ala His Ala Ala Gly Asn Val Pro Val Gln Leu His Asp Trp 245 250 255 Asp Val Asp Phe Ala Cys Trp Cys Ser Tyr Lys Tyr Gln Asn Ser Gly 260 265 270 Pro Gly Gly Ile Ser Gly Ile Phe Val His Glu Arg His Phe Gly Asp 275 280 285 Gln Thr Leu Ser Arg Phe Ala Gly Trp Trp Gly Tyr Gln Glu Ser Gln 290 295 300 Arg Phe Lys Met Glu Lys Gly Phe Val Pro Glu Ala Gly Ala Asp Gly 305 310 315 320 Trp Gln Val Ser Cys Thr Gln Val Met Pro Met Ala Leu Tyr His Ala 325 330 335 Ala Leu Gln Ile Phe Glu Lys Ala Gly Phe Ile Gly Pro Leu Arg Lys 340 345 350 Lys Ser Lys Ala Leu Thr Ala Tyr Leu Phe Tyr Leu Ile Asn Glu Val 355 360 365 Asn Asn Glu Leu Cys Glu Met Gln Tyr Gln Val Ile Thr Pro Ser Ser 370 375 380 Ala Glu Asp Arg Gly Ala Gln Val Ser Ile Ile Ala Lys Ala Asn Gly 385 390 395 400 Lys Tyr Ile Phe Glu Gln Leu Val Ala Asn Asn Val Leu Gly Asp Trp 405 410 415 Arg Glu Pro Asn Val Ile Arg Leu Ser Pro Val Pro Ser Tyr Asn Ser 420 425 430 Phe Glu Asp Val Phe Arg Thr Ala Glu Leu Leu Leu Gln Ile Gly Arg 435 440 445 Lys <210> 43 <211> 428 <212> PRT <213> Pedobacter sp. V48 <400> 43 Met Asn Phe Glu Asn Asn Leu Ala Phe Ala Gln Ser Leu Asp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Pro Leu Ser Ser Phe Arg His Asp Phe Leu Phe Pro Gln Gln Asn 20 25 30 Gly Asn Pro Phe Ile Tyr Leu Cys Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 35 40 45 Lys Ala Val Arg Lys Val Val Asp Glu Gln Leu Asn Asn Trp Arg Asn 50 55 60 Leu Ala Val Glu Gly Trp Phe Glu Gly Asp Asn Pro Trp Met Phe Tyr 65 70 75 80 His Lys Glu Leu Lys Lys Leu Met Gly Pro Leu Val Gly Ala Ser Thr 85 90 95 Asp Glu Val Cys Pro Met Asn Thr Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 100 105 110 Met Val Ser Phe Tyr Lys Pro Val Arg Gly Arg Phe Lys Ile Ile Met 115 120 125 Glu Ala Gly Ala Phe Pro Ser Asp Gln Tyr Ala Val Glu Ser Gln Val 130 135 140 Arg Phe His Gly Tyr Asp Ala Lys Glu Ala Ile Val Glu Val Ala Pro 145 150 155 160 Arg Ile Gly Glu Tyr Ile Leu Arg Thr Glu Asp Ile Leu Ala Gln Ile 165 170 175 Ala Lys His Gly Asp Glu Val Ala Leu Val Leu Phe Ser Gly Val Asn 180 185 190 Tyr Phe Thr Gly Gln Trp Phe Asp Met Glu Ala Ile Thr Met Ala Gly 195 200 205 His Ala 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Lewin <400> 46 Met Gln Glu Val Gln Phe Glu Asp Ala Leu Asp Tyr Ala Lys Ala Gln 1 5 10 15 Asp Val Ser Asp Pro Leu Ala His Phe Arg Pro Gln Phe His Phe Pro 20 25 30 Lys Gln Ala Asp Gly Ser Pro Ile Ile Tyr Leu Cys Gly Asn Ser Leu 35 40 45 Gly Leu Gln Pro Arg Leu Ala Gln Gln Leu Met Gln Asp Glu Met Asp 50 55 60 Val Trp Lys Glu Leu Ala Val Glu Gly His Phe Lys Ala Glu Arg Pro 65 70 75 80 Trp Met Thr Tyr His Glu Glu Phe Ser Arg Gln Leu Ser Pro Ile Val 85 90 95 Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Met Asn Thr Leu Ser Val Asn 100 105 110 Leu His Leu Met Met Val Ser Phe Tyr Arg Pro Thr Lys Ser Arg Tyr 115 120 125 Lys Ile Val Ile Glu Gly Gly Ala Phe Pro Ser Asp Lys Tyr Ala Val 130 135 140 Asp Ser Gln Leu Arg Phe His Gly Ile Asp Pro Gln Asp Gly Leu Ile 145 150 155 160 Gln Leu Arg Pro Arg Met Gly Glu Asp His Leu Arg Thr Glu Asp Ile 165 170 175 Leu Gln Ala Leu Glu Arg Glu Lys Asp Ser Ile Ala Leu Val Met Leu 180 185 190 Ser Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr Gly Gln Cys Phe Asp Met Lys Ser Ile 195 200 205 Thr Lys 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Gln Leu Ser Ile Gln 355 360 365 Val Lys Asn Ala Asn Lys Ser Leu Phe His Gln Leu Met Asp Lys Gly 370 375 380 Val Val Ala Asp Trp Arg Glu Pro Asp Val Ile Arg Ile Ala Pro Ala 385 390 395 400 Pro Leu Tyr Asn Ser Tyr Thr Asp Val Phe Thr Phe Val Glu Ile Leu 405 410 415 Lys His Cys Leu Asn Ala 420 <210> 50 <211> 422 <212> PRT <213> Lewinella cohaerens <400> 50 Met Thr Tyr Gln Ala Thr Arg Glu Tyr Ala Gln Ser Gln Asp Asp Lys 1 5 10 15 Asp Pro Met Arg Gly Phe Arg Glu Arg Phe His Leu Pro Arg Gln Ala 20 25 30 Asn Gly Glu Pro Phe Ile Tyr Leu Cys Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln 35 40 45 Pro Lys Ser Thr Lys Ala Ala Ile Asp Gln Glu Leu Leu Asp Trp Gln 50 55 60 Asn Leu Gly Val Glu Gly His Leu His Ala Lys Asn Pro Trp Leu Pro 65 70 75 80 Tyr His Glu Phe Leu Thr Glu Lys Met Ala Glu Ile Val Gly Ala Lys 85 90 95 Pro Ile Glu Val Val Met Met Asn Thr Leu Thr Val Asn Leu His Leu 100 105 110 Met Met Val Ser Phe Tyr Arg Pro Glu Gly Lys Arg Thr Lys Ile Leu 115 120 125 Met Glu Ala Asp Ala Phe Pro Ser Asp Arg Tyr Ala 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Lys Ile Ser Ile 340 345 350 Ile Thr Pro Arg Asp Pro Glu Arg Arg Gly Cys Gln Leu Ser Ile Gln 355 360 365 Val Gln Asp Ala Asp Lys Ser Leu Tyr Glu Ala Ile Ser Ala Ala Gly 370 375 380 Val Ile Ala Asp Trp Arg Glu Pro Asp Val Ile Arg Val Ala Pro Val 385 390 395 400 Pro Leu Tyr Asn Thr Phe Thr Glu Val Tyr Asp Phe Val Lys Ile Leu 405 410 415 Gly Glu Lys Met Glu Ala 420 <210> 51 <211> 425 <212> PRT <213> Lewinella persica <400> 51 Met Val Glu Glu Phe Gln Asn Asp Leu Ala Phe Ala Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 Glu Arg Asp Glu Leu Arg Ala Tyr Arg Ser Gln Tyr His Met Pro Val 20 25 30 Gln Ala Asn Gly Gln Pro Tyr Val Tyr Leu Cys Gly Asn Ser Leu Gly 35 40 45 Leu Gln Pro Lys Ala Thr Glu Gly Tyr Leu Leu Gln Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Trp Lys Asn Leu Gly Val Glu Gly His Phe His Ala Lys Asn Pro Trp 65 70 75 80 Met Pro Tyr His Glu Phe Leu Thr Glu Ala Met Ala Arg Val Val Gly 85 90 95 Ala Lys Pro Ser Glu Val Val Val Met Asn Thr Leu Thr Val Asn Leu 100 105 110 His Leu Met Met Val Ser Phe Tyr Arg Pro Val Gly Arg Arg Lys Lys 115 120 125 Ile Ile Ile Glu Ala Asp Ala Phe Pro Ser Asp Lys Tyr Ala Val Glu 130 135 140 Ser Gln Ile Arg Phe His Gly Leu Ser Pro Glu Asp Cys Leu Ile Glu 145 150 155 160 Leu Lys Ala Arg Asp Gly Glu Val Cys Leu Arg Gln Glu Asp Ile Leu 165 170 175 Gly Val Ile Asp Ala His Ser Glu Asp Ile Ala Leu Ile Leu Leu Gly 180 185 190 Asn Thr Asn Tyr Tyr Thr Gly Gln Phe Phe Asp Met Lys Thr Ile Ser 195 200 205 Glu His Gly His Ala Lys Gly Cys Met Val Gly Phe Asp Cys Ala His 210 215 220 Gly Ala Gly Asn Val Pro Leu Asn Leu His Asp Ser Gly Cys Asp Phe 225 230 235 240 Ala Val Trp Cys Asn Tyr Lys Tyr Leu Asn Ser Gly Pro Gly Gly Met 245 250 255 Gly Gly Ala Phe Ile His Glu Arg His Ala Asp Ser Lys Asp Ile Pro 260 265 270 Arg Phe Glu Gly Trp Trp Gly His Asn Lys Glu Thr Arg Phe Lys Met 275 280 285 Arg Asp Ala Phe Asp Pro Thr Pro Gly Thr Glu Ala Trp Gln Leu Ser 290 295 300 Asn Pro Pro Ile Leu Ala Met Val Ala Val Trp Ser Ala Leu Lys Leu 305 310 315 320 Phe Asp Glu Val Gly Met Thr Arg Leu Arg Lys Lys Ala Ile Ser Leu 325 330 335 Thr Gly Tyr Leu Glu Tyr Leu Val Asn Thr Leu Gly Asp Asp Val Val 340 345 350 Asn Ile Val Thr Pro Ala Asp Pro Ala Gln Arg Gly Ser Gln Leu Ser 355 360 365 Ile Gln Val Lys Thr Ala Asp Lys Lys Leu Phe Asn Lys Ile Thr Glu 370 375 380 Ala Gly Val Ile Ala Asp Trp Arg Glu Pro Asp Val Ile Arg Val Ala 385 390 395 400 Pro Val Pro Met Tyr Asn Ser Tyr Glu Asp Val Tyr Asn Phe Tyr Thr 405 410 415 Ile Leu Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asn 420 425 <210> 52 <211> 424 <212> PRT <213> Pontibacter roseus <400> 52 Met Asn Tyr Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ala Gln Glu Gln Asp Asn Leu 1 5 10 15 Asp Pro Leu Lys His Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Phe Pro Gln Val Asn 20 25 30 Gly Arg Asp Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 35 40 45 Lys Ser Ala Gln Met Tyr Ile Asp Asn Glu Met Tyr Lys Trp Ala Asn 50 55 60 Tyr Ala Val Glu Gly His Phe Lys Val Glu Glu Pro Trp Phe Asn Tyr 65 70 75 80 His Arg Leu Leu Thr Asp Gly Ala Ala Arg Val Val Gly Ala Arg Pro 85 90 95 Gln Glu Val Val Ile Met Asn Gln Leu Thr Val Asn Leu His Leu Met 100 105 110 Leu Val Ser Phe Tyr Arg Pro Glu Gly Arg Arg Ile Lys Ile Ile Met 115 120 125 Glu Gly Gly Ala Phe Pro Ser Asp Gln Tyr Ala Leu Glu Thr Gln Val 130 135 140 Lys Phe His Gly Tyr Thr Pro Glu Glu Ala Ile Ile Glu Leu Phe Pro 145 150 155 160 Arg Glu Gly Glu His Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ile Leu Lys Ser Ile 165 170 175 Glu Ala Ala Gly Asp Glu Leu Ala Leu Val Leu Met Gly Gly Ile Asn 180 185 190 Tyr Tyr Thr Gly Gln Val Tyr Asp Met Ala Ala Ile Thr Gln Ala Gly 195 200 205 His Gly Val Gly Ala Val Val Gly Phe Asp Leu Ala His Ala Ala Gly 210 215 220 Asn Val Pro Leu Gln Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Val Trp 225 230 235 240 Cys Thr Tyr Lys Tyr Leu Asn Ser Gly Pro Gly Gly Thr Ala Gly Val 245 250 255 Phe Val His Glu Arg His Ala Asn Asn Pro Asp Leu Pro Arg Phe Ala 260 265 270 Gly Trp Trp Gly His Asp Ala Ser Val Arg Phe Gln Met Lys Lys Gly 275 280 285 Phe Ile Pro Met Thr Gly Ala Glu Gly Trp Gln Leu Ser Asn Ala Gln 290 295 300 Ile Leu Pro Met Ala Val His Arg Ala Ala Leu Glu Leu 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agcaatgaag tgaccctgat gaatagcttg accgtgaatc 360 tgcacatgtt gttgattagt ttctatcgtc cgaccaaaat gcgttataag atactgattg 420 atggcccagc ctttccgtcc gatctgtatg ccattaagtc gcatctgcgt tttcataaga 480 aagaagaagg tcttattctg atagaaccgc gtccgggcga acatctggtg caggaagaag 540 actttctgcg cgtgataaag aagcaaggag aggaaattgc gttggtgttt ctgaactgcg 600 tgaattttct gagcggccag gtgctgaaag tggatgaaat cacccgttat gccaaggagg 660 ctggctgctg cgtcggttat gatctggcgc atgcagcagg caatattccc ttaagcttgc 720 atgatcttgg cggcgacttt gcggtgggct gctcctacaa atatctgtgc ggaggcccag 780 gaggtccagg catagcctac gttcacgcgt cacatcacca ccaacagttc gtgcgtttca 840 gcgggtggtg gggcaatgat ccgaataccc ggttttactt ccccaaagag tttgtgccgt 900 atggcggtgc gagctcctgg caggtgagca ccccgtcgat tctggcgaaa ctgccgttaa 960 ttgcggcact ggaggtgttt gaggaagcgg gcatggagaa tatacgtgaa aagagcaaga 1020 aacaaacagc gttcctgtat accctgttag aaaatgctcg cggcacccat tttgatatga 1080 taaccccgaa agaaccggag ctgcgtggct gtcagcttag cctgcgtatc aaatgcagcc 1140 gtagcgaaga gatcttacgg aagctggaac gtttaggcat tacatgcgat ttccgttcgc 1200 cgaacattct gcgtgtggcg ccgagcccgt tgtacaccag cttttacgaa atctatcgtt 1260 ttgcgtacac ctttctggaa gtcctgaaaa ccatttgaga attc 1304 <210> 54 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 54 Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Ile Glu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Gln Tyr His Asp Glu Ala Ile Ser Leu Asp Ser Leu Asp Pro Leu Gln 20 25 30 Lys Phe Lys Glu Cys Phe Thr Leu Pro Lys Glu Pro Gly Ala Leu Tyr 35 40 45 Phe Cys Ser Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Ser Gln Lys 50 55 60 Leu Glu Glu Gln Leu Gln Arg Trp Ser Glu Leu Gly Ala Arg Gly Trp 65 70 75 80 Phe Glu Gly Glu Gly Asn Trp Tyr Asn Ser Leu Glu Glu Pro Ile Val 85 90 95 Arg Pro Leu Ser Lys Ile Leu Gly Ala Glu Ser Asn Glu Val Thr Leu 100 105 110 Met Asn Ser Leu Thr Val Asn Leu His Met Leu Leu Ile Ser Phe Tyr 115 120 125 Arg Pro Thr Lys Met Arg Tyr Lys Ile Leu Ile Asp Gly Pro Ala Phe 130 135 140 Pro Ser Asp Leu Tyr Ala Ile Lys Ser His Leu Arg Phe His Lys Lys 145 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125 Lys Glu Ile Ala Leu Met Asn Ala Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 130 135 140 Met Leu Ser Phe Phe Lys Pro Thr Pro Lys Arg Tyr Lys Ile Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Lys Ala Phe Pro Ser Asp His Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Leu 165 170 175 Gln Leu His Gly Leu Asn Ile Glu Glu Ser Met Arg Met Ile Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Gly Glu Glu Thr Leu Arg Ile Glu Asp Ile Leu Glu Val Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Gly Asp Ser Ile Ala Val Ile Leu Phe Ser Gly Val His 210 215 220 Phe Tyr Thr Gly Gln His Phe Asn Ile Pro Ala Ile Thr Lys Ala Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Gly Cys Tyr Val Gly Phe Asp Leu Ala His Ala Val Gly 245 250 255 Asn Val Glu Leu Tyr Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Cys Trp 260 265 270 Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Ala Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Met Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ile Ser Asn Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Thr 340 345 350 Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu Glu 355 360 365 Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys Lys 370 375 380 Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly Cys 385 390 395 400 Gln Leu Thr Ile Thr Phe Ser Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln Glu 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly Ile 420 425 430 Arg Val Ala Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr Lys 435 440 445 Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys Asn 450 455 460 <210> 56 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 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Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Ala Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Leu Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ile Ser Asn Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Thr 340 345 350 Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu Glu 355 360 365 Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys Lys 370 375 380 Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly Cys 385 390 395 400 Gln Leu Thr Ile Thr Phe Ser Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln Glu 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly Ile 420 425 430 Arg Val Ala Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr Lys 435 440 445 Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys Asn 450 455 460 <210> 57 <211> 420 <212> PRT <213> Chlamydophila pecorum <400> 57 Ile Glu Lys Leu Lys Gln Tyr His Asp Glu Ala Ile Ser Leu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asp Pro Leu Gln Lys Phe Lys Glu Cys Phe Thr Leu Pro Lys Glu 20 25 30 Pro Gly Ala Leu Tyr Phe Cys Ser Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ala Lys 35 40 45 Ala Ala Ser Gln Lys Leu Glu Glu Gln Leu Gln Arg Trp Ser Glu Leu 50 55 60 Gly Ala Arg Gly Trp Phe Glu Gly Glu Gly Asn Trp Tyr Asn Ser Leu 65 70 75 80 Glu Glu Pro Ile Val Arg Pro Leu Ser Lys Ile Leu Gly Ala Glu Ser 85 90 95 Asn Glu Val Thr Leu Met Asn Ser Leu Thr Val Asn Leu His Met Leu 100 105 110 Leu Ile Ser Phe Tyr Arg Pro Thr Lys Met Arg Tyr Lys Ile Leu Ile 115 120 125 Asp Gly Pro Ala Phe Pro Ser Asp Leu Tyr Ala Ile Lys Ser His Leu 130 135 140 Arg Phe His Lys Lys Glu Glu Gly Leu Ile Leu Ile Glu Pro Arg Pro 145 150 155 160 Gly Glu His Leu Val Gln Glu Glu Asp Phe Leu Arg Val Ile Lys Lys 165 170 175 Gln Gly Glu Glu Ile Ala Leu Val Phe Leu Asn Cys Val Asn Phe Leu 180 185 190 Ser Gly Gln Val Leu Lys Val Asp Glu Ile Thr Arg Tyr Ala Lys Glu 195 200 205 Ala Gly Cys Cys Val Gly Tyr Asp Leu Ala His Ala Ala Gly Asn Ile 210 215 220 Pro Leu Ser Leu His Asp Leu Gly Gly Asp Phe Ala Val Gly Cys Ser 225 230 235 240 Tyr Lys Tyr Leu Cys Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Ala Tyr Val 245 250 255 His Ala Ser His His His Gln Gln Phe Val Arg Phe Ser Gly Trp Trp 260 265 270 Gly Asn Asp Pro Asn Thr Arg Phe Tyr Phe Pro Lys Glu Phe Val Pro 275 280 285 Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Trp Gln Val Ser Thr Pro Ser Ile Leu Ala 290 295 300 Lys Leu Pro Leu Ile Ala Ala Leu Glu Val Phe Glu Glu Ala Gly Met 305 310 315 320 Glu Asn Ile Arg Glu Lys Ser Lys Lys Gln Thr Ala Phe Leu Tyr Thr 325 330 335 Leu Leu Glu Asn Ala Arg Gly Thr His Phe Asp Met Ile Thr Pro Lys 340 345 350 Glu Pro Glu Leu Arg Gly Cys Gln Leu Ser Leu Arg Ile Lys Cys Ser 355 360 365 Arg Ser Glu Glu Ile Leu Arg Lys Leu Glu Arg Leu Gly Ile Thr Cys 370 375 380 Asp Phe Arg Ser Pro Asn Ile Leu Arg Val Ala Pro Ser Pro Leu Tyr 385 390 395 400 Thr Ser Phe Tyr Glu Ile Tyr Arg Phe Ala Tyr Thr Phe Leu Glu Val 405 410 415 Leu Lys Thr Ile 420

Claims (19)

  1. 서열번호 8과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변형된 키누레니나제 효소로서, 상기 변형된 효소가 서열번호 8에 비해 적어도 하나의 치환을 가지며, 이때 상기 적어도 하나의 치환이 서열번호 8의 306번 위치에서 발견되는 Phe에 대한 치환을 포함하고, 상기 변형된 효소가 서열번호 8의 효소보다 키누레닌-분해 활성이 더 높은 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  2. 제1항에 있어서, 자연적인 인간 키누레니나제의 306번 위치에서 발견되는 Phe에 대한 상기 적어도 하나의 치환이 보존적 치환인, 변형된 키누레니나제 효소.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 8과 95% 이상 동일한 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  4. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 Phe306Met을 포함하는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  5. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 Phe306Leu을 포함하는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  6. 제1항에 있어서, 이종 펩티드 절편을 추가로 포함하는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  7. 제6항에 있어서, 상기 이종 펩티드 절편이 XTEN 펩티드, IgG Fc, 알부민 또는 알부민 결합 펩티드인 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 결합되는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  9. 제8항에 있어서, 상기 효소가 하나 이상의 리신 또는 시스테인 잔기를 통해 PEG에 결합되는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  10. 제1항에 있어서, 상기 키누레니나제가 3'-OH 키누레닌보다 키누레닌에 대해 더 높은 촉매 활성을 갖는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  11. 제1항에 있어서, 상기 키누레니나제가 키누레닌에 대하여 0.5 M-1/s-1이상의 k cat/K M를 갖는 것인, 변형된 키누레니나제 효소.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 핵산이 박테리아, 균류, 곤충 또는 포유동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인, 핵산.
  14. 제12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제12항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 숙주 세포가 박테리아 세포, 균류 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포인 것인, 숙주 세포.
  17. 암에 걸린 개체의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 효소 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
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