KR102441806B1 - ion concentration of cell culture media online monitoring system - Google Patents

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Abstract

세포배양 과정에서 세포 증식 및 사멸에 의해 발생되는 세포배양액의 이온농도의 미세변화를 직류전기전도도를 이용해 신속하고 정밀하게 온라인 상에서 실시간 모니터링 하는 시스템에 관한 것이다.It relates to a system for rapidly and precisely online real-time monitoring of minute changes in the ion concentration of a cell culture medium caused by cell proliferation and death during the cell culture process using direct current electrical conductivity.

Figure 112020076333457-pat00001
Figure 112020076333457-pat00001

Description

세포배양액의 이온농도 온라인 모니터링 시스템 {ion concentration of cell culture media online monitoring system }Ion concentration of cell culture media online monitoring system {ion concentration of cell culture media online monitoring system }

본 발명은 세포배양액의 이온농도 온라인 모니터링 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포배양 과정에서 세포 증식 및 사멸에 의해 발생되는 세포배양액의 이온농도의 미세변화를 직류전기전도도를 이용해 온라인에서 실시간으로 모니터링 하는 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to an online monitoring system for ion concentration of a cell culture medium, and more particularly, online real-time monitoring of minute changes in the ion concentration of a cell culture medium caused by cell proliferation and death during the cell culture process using direct current electrical conductivity. It's about a system that

일반적으로 세포배양 과정에서 배양시간 및 배양조건에 따라 세포 증식 및 사멸에 의한 세포의 개체수의 변동이 발생한다. 또 세포의 세포막은 거대분자 단백질의 세공으로 된 이온채널이 존재하며, 이 이온채널을 통해 초당 약 107 개의 이온의 이동이 이루어진다. 그러므로 일정부피에서 세포 개체수의 변화는 세포배양액의 이온농도의 변화를 발생시킨다. 세포배양액의 전기전도도를 측정함으로써 세포배양액의 이온농도 변화를 모니터링 할 수 있다. In general, in the cell culture process, the number of cells varies by cell proliferation and death depending on the culture time and culture conditions. In addition, the cell membrane of the cell has ion channels made of pores of macromolecular proteins, and through these ion channels, about 10 7 ions move per second. Therefore, a change in the number of cells in a certain volume causes a change in the ion concentration of the cell culture medium. By measuring the electrical conductivity of the cell culture medium, it is possible to monitor the change in the ion concentration of the cell culture medium.

세포막의 이온 채널에서 초당 약 107개 이온의 이동에 의해서 측정되는 전류값은 1V 인가전압에 대하여 약 수십 pA 수준이다. 세포배양에 사용하고 있는 상용 배양액은 160~200mM의 이온농도를 가지고 있으며 이로부터 측정되는 전류값은 인가된 1V 전압에 대하여 uA~ mA 수준이다. 세포배양에서 초기 세포의 개체수는 1x103 ~1x105 개 범위이며, 상기 범위의 세포 개체수에 대한 세포배양과정에서 변동되는 전류는 nA ~ uA 수준이다. 그러나 직류전기기기를 이용한 미세한 이온농도 변화를 전기전도도를 이용해 모니터링 할수 있다. 그러나 전극 표면에서의 분극 현상과 직류 전압 인가로 인한 세포배양 과정에 영향을 미칠 수 있다는 문제점이 있다. The current value measured by the movement of about 10 7 ions per second in the ion channel of the cell membrane is about several tens of pA with respect to an applied voltage of 1V. Commercial culture medium used for cell culture has an ion concentration of 160~200mM, and the current value measured therefrom is at the level of uA~mA with respect to the applied voltage of 1V. In cell culture, the initial number of cells is in the range of 1x10 3 to 1x10 5 , and the current fluctuating in the cell culture process for the number of cells in the range is nA to uA level. However, it is possible to monitor minute changes in ion concentration using direct current electrical devices using electrical conductivity. However, there is a problem that the polarization on the electrode surface and the application of DC voltage may affect the cell culture process.

본 발명의 목적은 상기 문제를 해결하고 직류전기전도도를 사용하여 신속하고 정밀하게 세포배양 과정에서 세포배양액의 이온농도 변화를 온라인에서 실시간으로 모니터링 할 수 있는 시스템을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to solve the above problem and to provide a system capable of monitoring the change in the ion concentration of a cell culture medium in real time online in a fast and precise cell culture process using direct current electrical conductivity.

상기한 과제를 실현하기 위한 본 발명의 실시예와 관련된 세포배양 과정에서 세포배양액의 이온농도에 대한 직류 전기전도도 측정은, 세포배양액에 외부에서 직류 전압들을 순간적으로 인가하고 이 때 생성된 피크전류를 획득하여 전압에 따른 전류의 관계로 부터 전기전도도를 계산해 세포배양액의 이온농도 변화를 모니터링 하는 것이다. In the cell culture process related to the embodiment of the present invention for realizing the above object, the direct current electrical conductivity measurement for the ion concentration of the cell culture medium instantaneously applies direct current voltages from the outside to the cell culture medium, and the peak current generated at this time is measured. This is to monitor the change in the ion concentration of the cell culture medium by calculating the electrical conductivity from the relationship of the current according to the voltage.

본 발명에서 세포배양액의 전기전도도 계산은 In the present invention, the calculation of the electrical conductivity of the cell culture medium is

(1) 세포배양용기에 세포배양액과 세포를 넣은 후에 일정 직류 전압 V1과 전압 V2를 일정시간(t)동안 인가하여 배양액의 전류 I1과 전류 I2를 획득하고 전압에 따른 전류의 직선관계식으로 부터 초기배양액의 전기전도도(C0) 구하는 단계와, (1) After putting the cell culture medium and cells in the cell culture vessel, constant DC voltage V1 and voltage V2 are applied for a predetermined time (t) to obtain the current I1 and current I2 of the culture medium, and the initial obtaining the electrical conductivity (C0) of the culture medium;

(2) 세포를 배양하면서 주기적 시간(T)마다 일정시간(t)동안 직류 전압 V1과 전압 V2를 인가하여 전류값들을 획득하고, 전압에 대한 전류의 직선관계식으로 부터 세포 배양액의 전기전도도(Cx) 구하는 단계, (2) While culturing the cells, the DC voltage V1 and the voltage V2 are applied for a predetermined time (t) at every periodic time (T) to obtain current values, and the electrical conductivity (Cx) of the cell culture medium from the linear relationship between the voltage and the current. ) step to obtain,

(3) 초기배양액의 전기전도도값(C0)과 세포배양액의 전기전도도값(Cx)를 이용하여 전기전도도 차(Cv, Cx-C0)를 구하는 단계를 포함한다. (3) obtaining the electrical conductivity difference (Cv, Cx-C0) using the electrical conductivity value (C0) of the initial culture medium and the electrical conductivity value (Cx) of the cell culture medium.

본 발명과 관련해서 직류 전압의 인가 시간은 세포 증식 및 사멸에 영향을 최소화 할 수 있는 짧은 시간이여야 바람직하다. 전압을 인가하고 세포이온채널이 영향을 받는데 통상 1밀리세컨드(ms) 내외인 것으로 알려져 있다. 따라서 세포에 대한 영향을 최소하기 위해서 일정전압을 인가하는데 바람직한 시간은 1ms미만이 바람직하다. 세포배양에서 사용되는 배양액의 이온농도가 160~200mM 내외범위에서 전극표면의 분극현상을 최소화 하기 위해서는 전압인가에 적절한 시간은 100μs 미만이다. 상기 세포에 대한 영향과 전극 표면의 분극을 고려하면 세포배양 과정에서 적절한 일정전압의 인가시간은 5μs~100μs 사이의 범위가 적절하다. In relation to the present invention, the application time of the DC voltage is preferably a short time to minimize the effect on cell proliferation and death. When a voltage is applied, cell ion channels are affected, and it is known that it is usually around 1 millisecond (ms). Therefore, in order to minimize the effect on the cells, the preferred time for applying a constant voltage is preferably less than 1 ms. In order to minimize the polarization of the electrode surface when the ion concentration of the culture medium used in cell culture is in the range of 160~200mM, the appropriate time for voltage application is less than 100μs. Considering the effect on the cells and the polarization of the electrode surface, the appropriate constant voltage application time in the cell culture process is in the range of 5 μs to 100 μs.

또한, 상기한 과제를 실현하기 위하여 본 발명은, 세포 배양용기에 전극을 구비하고 전극에 주기적 시간(T)마다 일정 직류 전압(V)을 일정시간(t)동안 인가하도록 하는 전압 인가부와, 전류를 측정하는 전류 측정부, 및 전압에 대한 전류의 관계로 부터 전기전도도를 결정하는 제어부를 포함하는 모니터링 시스템을 포함한다. In addition, in order to achieve the above object, the present invention is provided with an electrode in a cell culture vessel and a voltage applying unit for applying a constant DC voltage (V) to the electrode for a predetermined time (t) at periodic time (T), and a monitoring system including a current measuring unit that measures current, and a control unit that determines electrical conductivity from the relationship of current to voltage .

본 발명에 의하면, 세포배양 과정에서 전기전도도를 이용한 세포배양액의 이온농도 변화에 대한 온라인 모니터링은 세포배양과정에서 세포 증식 및 사멸에 대한 세포배양 상태를 장기적으로 정밀하게 측정할 수 있는 장점이 있다According to the present invention, the online monitoring of the ion concentration change of the cell culture medium using electrical conductivity during the cell culture process has the advantage of being able to accurately measure the cell culture state for cell proliferation and death in the cell culture process in the long term.

도 1은 본 발명의 일 실시예와 관련된 세포이온농도 실시간 모니터링 방법을 나타낸 흐름도
도 2는 전압을 단계적으로 증가시키고, 각 전압마다 측정된 전류값을 이용하여, 전기전도도를 획득하는 방법을 나타낸 개념도.
도 3은 본 발명과 관련된 세포이온농도 모니터링 시스템 개념도.
도 4는 전기전도도를 이용한 세포 배양액의 이온농도 모니터링을 나타낸 그래프.
1 is a flowchart showing a method for real-time monitoring of cell ion concentration related to an embodiment of the present invention;
2 is a conceptual diagram illustrating a method of increasing the voltage step by step and obtaining electrical conductivity by using a current value measured for each voltage.
3 is a conceptual diagram of a cell ion concentration monitoring system related to the present invention.
Figure 4 is a graph showing the monitoring of the ion concentration of the cell culture medium using electrical conductivity.

이하,본 발명에 관련된 세포배양액의 이온농도 모니터링 시스템에 대하여 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the ion concentration monitoring system of the cell culture medium according to the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.

본 명세서에서는 서로 다른 실시예라도 동일·유사한 구성에 대해서는 동일·유사한 참조번호를 부여하고, 그 설명은 처음 설명으로 갈음한다. 본 명세서에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. In the present specification, the same and similar reference numerals are assigned to the same and similar components even in different embodiments, and the description is replaced with the first description. As used herein, the singular expression includes the plural expression unless the context clearly dictates otherwise.

도 1은 본 발명의 일예와 관련된 전기전도도를 결정하고 세포배양액의 이온농도에 대한 모니터링에 관해 나타낸 흐름도이다. 도 2는 직류전압 V1과 V2를 단계적으로 일정시간 인가시키고, 각 전압에서 전류값을 획득하고 전기전도도를 결정 방법을 나타낸 개념도이다. 도 2에서는, 일정 시간마다 전압(V1, V2) 을 2단계적으로 증가시키는 것을 예시하고 있다. 전압은 일정 시간마다 단계적으로 감소되도록 구성될 수도 있고, 임의의 서로 다른 전압이 순간적으로 인가되도록 구성될 수도 있다. 전압의 인가 시간 및 인가 단계는 전기적으로 세포배양에 미치는 시간보다 짧은 시간으로 증가시키거나 감소시키도록 하는 것이 바람직하다. 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 인가 전압에 대한 전류의 직선 관계로부터 기울기인 전기전도도를 획득하는 과정을 거치게 된다. 일정 직류 전압을 기설정된 시간(t)마다 단계적으로 변화시키고, 이때의 전압마다 측정된 전류값를 이용하여 전압에 대한 전류의 직선 관계로부터 기울기인 세포배양액의 전기전도도를 획득하게 된다. 1 is a flowchart showing the determination of the electrical conductivity related to an example of the present invention and monitoring of the ion concentration of the cell culture medium. 2 is a conceptual diagram illustrating a method of applying the DC voltages V1 and V2 in stages for a predetermined time, obtaining a current value at each voltage, and determining the electrical conductivity. In FIG. 2 , it is exemplified that the voltages V1 and V2 are increased in two steps every predetermined time. The voltage may be configured to be stepwise reduced every predetermined time, or any different voltages may be applied instantaneously. It is preferable that the voltage application time and the application step be increased or decreased in a time shorter than the time electrically applied to the cell culture. As shown in FIG. 2 , a process of obtaining a slope of electrical conductivity from the linear relationship of the current with respect to the applied voltage is performed. A constant DC voltage is changed stepwise at a predetermined time (t), and the electrical conductivity of the cell culture medium, which is a slope, is obtained from the linear relationship of the current to the voltage by using the current value measured for each voltage at this time.

도 3은 본 발명과 관련된 세포배양 모니터링 시스템(100)의 일 예를 보인 개념도이다. 도 3을 참조하면, 세포배양액의 이온농도 실시간 모니터링 시스템(100)은 세포배양용기(110), 전극부,(120) 전압 인가부(130), 전류 측정부(140) 및 제어부(150)를 포함한다. 전압 인가부(120)는 전극부(130)에 일정 직류 전압을 기설정된 시간마다 단계적으로 변화시키며 인가한다. 전류 측정부(140)는 각 인가전압에서 전류를 측정하도록 이루어진다. 제어부(150)는 전압에 대한 전류의 직선관계로부터 기울기인 세포배양액(10)의 전기전도도를 계산한 후, 초기 배양액과 세포배양액의 전도도 차이를 이용하여 세포배양 과정에서 세포배양액의 이온농도 모니터링이 이루어진다. 3 is a conceptual diagram showing an example of a cell culture monitoring system 100 related to the present invention. 3, the ion concentration real-time monitoring system 100 of the cell culture medium includes a cell culture vessel 110, an electrode unit 120, a voltage application unit 130, a current measurement unit 140, and a control unit 150. include The voltage applying unit 120 applies a predetermined DC voltage to the electrode unit 130 in a stepwise manner every preset time. The current measuring unit 140 is configured to measure a current at each applied voltage. The control unit 150 calculates the electrical conductivity of the cell culture medium 10, which is a slope from the linear relationship of the current to the voltage, and then uses the difference in conductivity between the initial culture medium and the cell culture medium to monitor the ion concentration of the cell culture medium during the cell culture process. is done

이하, 실시예1 내지 3를 통하여 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through Examples 1 to 3.

[실시예 1] 초기 배양액의 전기 전도도 측정[Example 1] Measurement of electrical conductivity of initial culture medium

다음은 세포배양에 사용하는 배양액의 전기전도도를 구하는 과정에 관한 것이다. 배양액을 세포배양용기에 넣은 후, 전극에 -5V와 5V까지의 전압을 인가하여 각각의 전압에서 측정된 전류의 값을 얻었다. 상기 측정값을 이용하여 전압의 변화량에 따른 전류의 변화량으로 얻어지는 기울기의 값, 즉 전기전도도은 42.442 (uS/cm)이다The following relates to the process of obtaining the electrical conductivity of the culture medium used for cell culture. After the culture solution was placed in a cell culture vessel, voltages of -5V and 5V were applied to the electrodes to obtain current values measured at each voltage. The value of the slope obtained as the amount of change of current according to the amount of change of voltage using the above measurement value, that is, the electrical conductivity is 42.442 (uS/cm).

[실시예2] 세포배양과정에서 세포 배양시간에 따른 전기 전도도 측정 [Example 2] Measurement of electrical conductivity according to cell culture time in the cell culture process

다음은 24시간, 48시간, 72시간의 세포배양액의 전기전도도를 구하는 과정에 관한 것이다. 배양액와 세포를 세포배양용기에 넣은 후, 세포배양시간이 24시간, 48시간, 72시간 시점의 세포배양액에 -5V와 5V까지의 전압을 인가하여 각각의 전압에서 측정된 전류의 값을 얻었다. 상기 측정값을 이용하여 전압의 변화량에 따른 전류의 변화량으로 얻어지는 기울기의 값, 즉 전기전도도 값은 다음과 같다.The following relates to the process of obtaining the electrical conductivity of the cell culture medium for 24 hours, 48 hours, and 72 hours. After the culture medium and cells were placed in a cell culture vessel, voltages of -5V and 5V were applied to the cell culture medium at the cell culture times of 24 hours, 48 hours, and 72 hours to obtain the current values measured at each voltage. The value of the slope obtained as the amount of change of current according to the amount of change of voltage using the measured value, that is, the electrical conductivity value is as follows.

배양시간incubation time 24시간24 hours 48시간48 hours 72시간72 hours 전기전도도(uS/cm)Electrical conductivity (uS/cm) 46.53446.534 49.17549.175 49.98849.988

[실시예3] 직류 전기전도도를 이용한 세포배양액의 이온농도 모니터링[Example 3] Monitoring of ion concentration in cell culture solution using direct current electrical conductivity

세포배양 시간 0시간 / 24시간 / 48시간 / 72시간에 전압의 변화량에 따른 전류의 변화량으로 얻어지는 전기전도도 값을 이용해서 전기기전도도 차를 구하고 도4 와 같이 도식화하여 세포배양액 이온농도 변화를 모니터링 하였다.At cell culture time 0 hours / 24 hours / 48 hours / 72 hours, the difference in electrical conductivity is obtained using the electrical conductivity value obtained as the amount of change in current according to the amount of change in voltage, and the change in ion concentration of the cell culture medium is obtained by diagramming it as shown in FIG. was monitored.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하는 것이 아니라 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 그러므로 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. The disclosed embodiments are not intended to limit the present invention, but rather to illustrate the present invention. Therefore, it will be understood by those skilled in the art that various modifications and equivalent other embodiments are possible therefrom. Accordingly, the true technical protection scope of the present invention should be defined by the technical spirit of the appended claims.

Claims (4)

세포와 배양액을 넣고 세포를 배양하는 세포배양용기(110);
세포배양 과정에 배양액에 담기는 전극부(120);
전극부에 일정 직류 전압을 일정시간(t)동안 단계적으로 인가하는 전압인가부(130);
각 인가전압에 대해서 피크전류를 획득하는 전류측정부(140); 및
상기 전압에 대한 전류의 직선관계로부터 전기전도도를 구하는 제어부(150)를 포함하고 주기적 시간(T) 간격으로 직류 전기전도도를 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포배양액의 이온농도 온라인 모니터링 시스템.
a cell culture vessel 110 for culturing cells into cells and a culture medium;
an electrode unit 120 immersed in the culture medium during the cell culture process;
a voltage applying unit 130 for stepwise applying a predetermined DC voltage to the electrode portion for a predetermined time t;
a current measuring unit 140 for obtaining a peak current for each applied voltage; and
Ion concentration online monitoring system of a cell culture medium, characterized in that it comprises a control unit 150 for obtaining the electrical conductivity from the linear relationship of the current to the voltage, and can measure the DC electrical conductivity at periodic time (T) intervals.
제1항에 있어서,
상기 일정시간(t)은
세포배양 과정에 전기적으로 영향을 최소화할 수 있는 5us ~100us 사이인 것을 특징으로 하는 세포배양액의 이온농도 온라인 모니터링 시스템.
The method of claim 1,
The predetermined time (t) is
An online monitoring system for ion concentration of a cell culture medium, characterized in that it is between 5us and 100us, which can minimize the electrical influence on the cell culture process.
제1항에 있어서,
상기 단계적으로 인가는
세포배양 과정에 세포에 영향이 미치지 않도록 전압의 인가단계를 2단계로 구성하는 것을 특징으로 하는 세포배양액의 이온농도 온라인 모니터링 시스템.
The method of claim 1,
The step-by-step application is
An online monitoring system for ion concentration of a cell culture medium, characterized in that the voltage application step is configured in two steps so as not to affect the cells in the cell culture process.
제1항에 있어서,
상기 주기적 시간(T)는
세포배양 과정에 세포배양액의 전기전도도를 측정하는 시간적 간격으로서 세포에 전기적 영향이 미치지 않도록 시간적 간격을 1초 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포배양액의 이온농도 온라인 모니터링 시스템.
The method of claim 1,
The periodic time (T) is
An online monitoring system for ion concentration of a cell culture medium, characterized in that the time interval is 1 second or more so as not to have an electrical effect on the cells as a time interval for measuring the electrical conductivity of the cell culture medium during the cell culture process.
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