KR102437662B1 - 신규한 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의학적 용도를 위한 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질에 관한 것이다.
Description
본 발명은 개선된 특성을 갖는 인간 알파-1-마이크로글로불린 단백질의 변형된 변이체 및 의학적 치료 및 진단에서의 이러한 변이체의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 특이적 아미노산 치환의 도입 및/또는 특이적 N-말단 연장부의 첨가가 헴(heme)의 안정성, 용해도 및 결합과 관련하여 알파-1-마이크로글로불린에 개선된 특성을 부여한다는 것을 발견하였다.
A1M(α1-마이크로글로불린)은 세포외 조직-클리닝 기능을 갖는 저분자량 단백질이다
. 그것은 어류, 조류, 설치류, 포유동물 및 다른 척추동물에서 모든 조직 및 기관에 존재한다. A1M은 주로 간에서 합성되지만, 또한 신체 내의 대부분의 다른 세포에서 더 낮은 비율로 합성된다. 그것은 α1-마이크로글로불린-비쿠닌 전구체 유전자(α1-microglobulin-bikunin precursor gene: AMBP)에 의해서 암호화되고, 모든 세포 및 종에서 또 다른 단백질인 비쿠닌과 함께 연속적인 펩타이드 전구체로서 번역된다(Kaumeyer et al., 1986). 그러나, 두 단백질은 프로테아제 절단에 의해서 분리되고, 가공되고, 상이한 기능을 갖는 2종의 상이한 단백질로서 혈액 중에 분비된다(Lindqvist et al., 1992; Bratt et al., 1993). A1M 및 비쿠닌의 아주 흔한 공합성에 대한 이유는 여전히 알려져 있지 않다. 혈액 중에서, A1M 중 약 50%는 유리 단량체 형태로 발견되고, 나머지 50%는 면역글로불린 A, 알부민 및 프로트롬빈과 공유 결합된 고분자량 복합체로서 발견된다
.
A1M은 1-도메인, 183-아미노산의 글리코실화된 단백질이다. 이.콜라이에서 발현된 A1M의 큰 단편의 결정 구조는 최근에 공개되었다(Meining and Skerra, 2012). 이의 구조를 기반으로, A1M은 동물, 식물 및 박테리아로부터의 50종 이상의 구성원을 갖는 단백질 패밀리인 리포칼린에 속한다
. 리포칼린은 하나의 폐쇄 단부(바닥) 및 개방 단부(상부)를 갖는 배럴(barrel)을 형성하는 8개의 역평행 β-가닥으로 이루어진 일반적인 3차원 구조를 갖는다. 배럴은 대부분의 리포칼린에서 소수성 리간드를 위한 포켓으로서 기능한다. 배럴의 개방 단부의 가장자리를 구성하는 배럴의 개방 단부의 4개의 루프(루프 1 내지 4)는 다양한 리포칼린 사이에서 길이 및 조성이 상당히 달라진다. A1M에서, 이들 루프 상에 또는 포켓의 내부 상에 위치된 소수의 아미노산 측기가 단백질의 식별된 기능에 중요한 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 루프 1 상의 짧은 헬릭스 상에 위치된, 유리 시스테인, C34는 음의 환원 전위를 갖고, A1M 리덕타제 특성을 제공한다(Allhorn et al., 2005). 2개의 타이로신 잔기, Y22 및 132는 시험관내에서 라디칼 산화 생성물에 의해서 공유 변형되는 것으로 밝혀져 있다
. 4개의 라이신 잔기, K69, 92, 118 및 130은 리덕타제 활성도를 조절하고(Allhorn et al., 2005), 유리 헴 기의 결합에 영향을 주고(Rutardottir et al., 2015), 저분자량 황갈색 불균질 물질을 갖는 인간 소변 및 양수로부터 정제된 A1M 상에서 공유 변형된다
.
리덕타제 활성도, 라디칼 포집 및 헴-결합 특성을 사용하여, A1M은 산화성 손상으로부터 세포 및 조직을 보호하는 항산화제로서 작용한다. A1M은 시험관내에서 헤모글로빈, 헴 및 반응성 산소 종(ROS)으로부터의 산화성 손상에 대해서 혈액 세포 배양물, 태반 조직 및 피부를 보호하는 것으로 밝혀졌다(Olsson et al., 2008; May et al., 2011; Olsson et al., PloS One 2011; Olsson et al., ARS 2012). A1M은 또한 생체내에서 헤모글로빈 주입 후에 태반 및 신장 조직 손상에 대해서 래트 및 토끼에서 보호 효과를 나타내었다
. 일련의 보고에서, 헤모글로빈 및 산화성 스트레스는 임신의 심각한 합병증인 자간전증의 발병기전에 관여되는 것으로 밝혀졌고(Centlow et al., 2008; Hansson et al., 2013), 간, 태반 및 혈장에서 A1M-mRNA 및 단백질의 수준은 자간전증을 갖는 임산부에서 증가되었다(Olsson et al., 2010; Anderson et al., 2011). 따라서, 산화성 손상 및 이에 따른 이 질환의 임상적 증상을 개선시키기 위해서 자간전증을 갖는 임산부를 치료하기 위한 치료제로서 A1M을 사용할 수 있다는 것이 제안되었다(Olsson et al., 2010).
재조합 인간 A1M의 생산 공정은 이.콜라이에서 개발되었고, 리덕타제, 라디칼-결합 및 헴-결합 특성을 보유하는 것이 밝혀졌다(Kwasek et al., Allhorn et al., 2002; 2005; 
. 실제로, 이러한 재조합 A1M 변이체는 자간전증의 양 모델에서 생체내에서 치료 효과를 나타내었다
. 그러나, 기능적인 이.콜라이-발현된 재조합 A1M은 글리코실화가 결핍되어 있고, 소변 또는 혈장으로부터 정제된 인간 A1M에 비해서 불량한 용해도 및 안정성을 갖는다. 단백질의 안정성 및 용해도의 부족은 주로 생리 pH 및 염 조건에서 완충제 중에서 고도로 농축된 용액 및 장기간 저장 조건을 획득하는 것의 어려움으로 인해서, 인간 사용을 위한 약물로서의 이의 용도를 제한한다.
따라서, 인간 A1M과 구조적 유사성을 갖지만, 안정성 및 용해도와 관련하여 개선된 특성을 갖는 단백질을 개발할 필요성이 존재한다. 더욱이, 이러한 단백질은 치료 용도에 적합한 양으로 제조하기에 상대적으로 용이해야 한다.
본 발명은 개선된 안정성 및 용해도 프로파일을 갖는 신규 알파-1-마이크로글로불린 단백질에 관한 것이다.
부위-지향되고 부가적인 돌연변이유발을 사용하여 기능적 특성이 유지되거나 또는 가능하게는 향상되지만, 생리 완충제 중에서 높은 농도에서 장기간 저장이 가능한 개선된 단백질 안정성 및 용해도를 갖는 A1M-종을 조작하였다.
본 명세서 실시예로부터 나타난 바와 같이, 돌연변이된 아미노산 측기의 위치 및 아이덴터티를 선택할 때 하기 4가지의 추리를 따른다:
1) 산화성 스트레스, 온도, 산소 압력과 관련하여 상이한 예상된 환경 압력을 갖는 다양한 종으로부터의 동물 동족체를 발현시켰음(N=12);
2) 루프 1 내지 4 또는 소수성 포켓의 내면에 위치된 위치에서의 56개의 서열결정된 A1M-동족체 중에서 자주 일어나는 단일 아미노산 치환을 인간 유전자 작제물 내에 도입하고, 발현시켰음(N=3); 및
3) 이들이 C35 티올릴의 pKa에 영향을 줄 수 있거나(Allhorn et al., 2005), 라디칼-트랩핑 부위로서 제공된다
는 가설을 기초로 하여, 유리하게 위치된 라이실 또는 타이로실 잔기를 첨가 또는 제거하였음(N=5); 4).
또한, N-말단의 하전된 친수성 연장부의 영향을 일부 A1M-변이체 상에서 시험하였다. 시험된 N-말단 연장부의 설계에 대한 이유는 4) A1M의 생리학적 기능을 손상시키지 않으면서, 1) 정제를 위한 태그(예를 들어, His-태그), 2) A1M 단백질의 코어로부터 태그를 분리하기 위한 링커, 3) 수용액 중에서의 최대 안정성 및 용해도를 얻기 위해서 단백질에 친수성 특성을 부여하는 몇몇(1 내지 5개) 하전된 아미노산 측기를 부가하는 것이었다.
프로젝트는 3개의 주요 단계로 나뉘었다:
단계 I) 상기에 기술된 27개의 A1M-변이체의 발현 그 다음 용해도, 안정성 및 기능의 분석;
단계 II) 단계 1의 결과를 기초로 예상된 최적의 특성을 갖는 소수의 A1M-변이체의 설계, 발현 및 분석; 및
단계 III) 비-돌연변이된 야생형(wt)-A1M 및 N-말단의 하전된 친수성 연장부가 존재하거나 존재하지 않는 가장 성공적인 돌연변이된 A1M-변이체의 설계, 발현 및 분석.
본 명세서에서 보다 상세하게 설명될 바와 같이, 본 발명은 하기 구조식 I의 아미노산 서열을 갖는 A1M-유래 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
식 중, 적어도 하나의 X가 존재하고(괄호 안은 추가 치환에 대한 제안임);
X1은 존재하지 않거나 또는 Met 또는 N-폼일 Met을 나타내고;
X2는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X3은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X4는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X5는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X6은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X7은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X8은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X9는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X10은 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X11은 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X12는 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X13은 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X14는 존재하지 않거나 또는 Lys Glu, Asp 또는 Arg 또는 Met 또는 N-폼일 Met을 나타내고;
X15는 Asp 또는 Asn 또는 Glu를 나타내고;
X16은 Met 또는 Lys 또는 Arg를 나타내고;
X17은 Arg 또는 His 또는 Lys를 나타내고;
X18은 Asp 또는 Asn 또는 Glu를 나타내되;
단 모든 X1 내지 X14가 존재하지 않고, X15가 Asn을 나타내고, X16이 Met을 나타내고, X17이 Arg를 나타내는 경우, X18은 Asn을 나타낼 수 없다.
본 발명은 또한 A1M의 유도체, 즉, X1-X14-A1M을 제공하며, 식 중, A1M은 표 2에 언급된 종(즉, 인간, 마우스, 벌거숭이 두더지쥐(naked mole-rat), 개구리, 닭, 토끼, 다람쥐 원숭이, 바다코끼리, 매너티, 넙치(plaice) 및 오랑우탄)으로부터 수득된 임의의 A1M일 수 있다. 본 발명자들은 X1 내지 X14의 포함이 적어도 인간 A1M에 개선된 특성을 부여하는 것을 발견하였고, 따라서 이러한 출발 서열은 또한 다른 종으로부터의 A1M 또는 종-재조합 A1M에 중요한 개선된 특성을 부여할 수 있다고 고려된다.
본 발명은 또한 하기 구조식 II의 아미노산 서열을 갖는 A1M-유래 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
식 중, 적어도 하나의 X가 존재하고(괄호 안은 추가 치환에 대한 제안임);
X1은 존재하지 않거나 또는 Met 또는 N-폼일 Met을 나타내고;
X2는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X3은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X4는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X5는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X6은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X7은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X8은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X9는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X10은 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X11은 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X12는 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X13은 존재하지 않거나 또는 Asp 및 Glu, Lys 및 Arg으로부터 선택되고;
X14는 존재하지 않거나 또는 Lys 또는 Glu, Asp 또는 Arg 또는 Met 또는 N-폼일 Met을 나타내고;
X15는 Asp 또는 Asn 또는 Glu을 나타내고;
X16은 Met 또는 Lys 또는 Arg을 나타내고;
X17은 Arg 또는 His 또는 Lys을 나타내고;
X18은 Asp 또는 Asn 또는 Glu을 나타내되;
단 모든 X1 내지 X14가 존재하지 않고, X15가 Asn을 나타내고, X16이 Met을 나타내고, X17이 Arg을 나타내는 경우, X18은 Asn을 나타낼 수 없다.
본 발명은 또한 A1M의 유도체, 즉, X1-X14-A1M을 제공하고, 식 중, A1M은 표 2에 언급된 종(즉, 인간, 마우스, 벌거숭이 두더지쥐, 개구리, 닭, 토끼, 다람쥐 원숭이, 바다코끼리, 매너티, 넙치 및 오랑우탄)으로부터 수득된 임의의 A1M일 수 있고, 여기서 A1M은 C-말단에서 절두되어, C-말단 테트라펩타이드 서열 LIPR은 단백질의 부분을 형성하지 않는다.
본 명세서에서 실시예로부터 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 하기를 발견하였다:
i) 초기 서열 X1 내지 X14는 A1M에 개선된 특성을 부여하는 것 같음,
ii) A1M 분자의 점 돌연변이 M41K, R66H 또는 N17,96D는 A1M의 기능을 유지시키면서 개선된 안정성을 부여함,
iii) 돌연변이(M41K + R66H), (M41K + N17,96D), (R66H + N17,96D), 및/또는(M41K + R66H + N17,96D)는 기능을 유지시키면서 증가된 용해도 및/또는 안정성을 나타냄,
iv) 돌연변이(R66H + N17,96D)는 수행된 실험에서 가장 양호한 전체 성능을 가졌음,
v) 돌연변이(R66H + N17,96D) 및 N-말단 서열로서 초기 서열 MHHHHHHHHGGGGGIEGR(M8H5GIEGR); MHHHHHHHHDDDDK(M8H4DK), MHHHHHHDDDDK(M6H4DK) 또는 MHHHHHHHH(M8H)를 갖는 A1M을 시험하였고, N-말단 서열로서 M8H4DK를 갖는 단백질 변이체가 다른 N-말단 연장부와 비교할 때 더 높은 용해도 및/또는 안정성을 나타내었음,
vi) A1M의 C-말단의 절두는 개선된 gpa 결합 및 분해를 부여하는 것 같음.
이러한 N-말단 연장부 서열이 엔테로키나제 절단 부위를 갖는 His-태그와 유사하지만, 아미노산 Ala이 포함되지 않기 때문에 그것은 A1M로부터 His-태그를 절단하는 능력이 없다는 것을 주목하는 것은 흥미롭다. DDDKA에서 Ala의 존재는 엔테로키나제 절단 부위를 나타낸다. 따라서, 반복된 His-잔기 다음에 5개의 하전된 아미노산이 이어진 경우 N-말단 서열 자체가 A1M에 개선된 단백질 안정성 및 용해도 특성을 부여한다고 고려된다.
이러한 발견을 기초로, 상기에 나타낸 방식에 따른 A1M의 변이는 A1M 기능성을 갖지만, 안정성 및/또는 용해도와 관련하여 개선된 특징을 갖는 단백질을 제공할 것이라고 고려된다.
따라서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 X1 내지 X18을 함유하는 A1M의 가능한 조합물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 하기 A1M 유래 단백질이 본 발명의 범위 내에 포함되어, 모든 단백질은 인간 야생형 A1M에 상응하는 전장일 수 있거나; 또는 C-말단이 절두될 수 있고, 즉, LIPR이 존재하지 않을 수 있다:
알파-1-마이크로글로불린 - 일반 배경
A1M은 간에서 높은 비율로 합성되고, 혈류로 분비되고, 혈관벽을 통해서 모든 기관의 혈관외 컴파트먼트로 수송된다. 이 단백질은 다른 조직(혈액 세포, 뇌, 신장, 피부)에서도 합성되지만, 더 낮은 비율로 합성된다. 작은 크기로 인해서, 유리 A1M은 신장에서 혈액으로부터 신속하게 여과된다.
A1M은 보존되는 3차원 구조를 갖지만 매우 다양한 기능을 갖는 동물, 식물 및 박테리아로부터의 단백질의 군인 리포칼린 슈퍼패밀리의 구성원이다. 각각의 리포칼린은 소수성 내부를 갖는 β-배럴 포켓으로 접힌 160 내지 190개의 아미노산 쇄로 이루어진다. 적어도 12개의 인간 리포칼린 유전자가 공지되어 있다. A1M은 포유동물, 조류, 어류 및 개구리에서 어느 정도 식별된 26kDa 혈장 및 조직 단백질이다. X-선 결정학에 의해서 결정된 A1M의 3차원 구조가 도 10에 도시되어 있다. A1M은 간에서 높은 비율로 합성되고, 혈류로 분비되고, 혈관벽을 통해서 모든 기관의 혈관외 컴파트먼트로 신속하게(T½ = 2 내지 3분) 수송된다. A1M은 혈액 및 사이질 조직에서 유리 단량체 형태로 그리고 더 큰 분자(IgA, 알부민, 프로트롬빈)와의 공유 복합체로서 둘 모두로 발견된다. 작은 크기로 인해서, 유리 A1M은 신장에서 혈액으로부터 신속하게 여과된다. 이어서, 주요 부분은 재흡수되지만, 상당한 양은 소변으로 배출된다.
항산화제는 산화제를 제거하거나 유해한 산화 반응을 예방하는 보호 인자이다. 인간 유기체는 산화성 스트레스에 반응하여 항산화제를 생성할 수 있다. 이러한 내인성 항산화제는 슈퍼옥사이드-분해 효소 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 과산화수소-분해 효소 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제 및 헴-분해 효소 헴 옥시게나제-1(HO-1)를 포함한다. A1M은 라디칼 및 헴의 스캐빈저뿐만 아니라 리덕타제 및 산화의 저해제 둘 모두로서 기능함으로써 산화성 조직 손상에 대한 보호에 관여된다고 최근에 밝혀졌다. 몇몇 최근의 문헌은 A1M이 미토콘드리아에서 부분적으로 축적되고, 미토콘드리아 기능을 보호함으로써 세포 배양물 및 기관 외식편을 산화성 손상에 대해서 보호한다는 것을 예증한다. 실제로, 인간 재조합 A1M의 주입은 동물 모델에서 산화성 스트레스-관련 질환인 자간전증 및 헤모글로빈-유도된 사구체 손상의 생체내 치료를 위해서 성공적으로 사용되었다.
A1M의 서열 및 구조적 특성
인간 A1M의 전체 서열은 공지되어 있다. 이 단백질은 183개의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드로 이루어진다. 다수의 추가적인 A1M cDNA 및/또는 단백질이 다른 포유동물, 조류, 양서류, 및 어류로부터 검출, 단리 및/또는 서열결정되었다. A1M의 펩타이드 쇄의 길이는, 주로 C-말단에서의 변이로 인해서, 종 간에 약간 상이하다. 상이한 추론된 아미노산 서열의 정렬 비교는 동일성 백분율이 설치류 또는 페룽굴라트류(ferungulate)와 인간 사이에서 대략 75 내지 80% 다르고, 어류와 포유동물 간에는 대략 45%로 낮아진다는 것을 나타낸다. 위치 34에서의 유리 시스테인 측쇄는 보존된다. 이 기는 다른 혈장 단백질과의 복합체 형성 시에 그리고 결합 시에, 황갈색 발색단으로의 산화환원 반응(하기 참조)에 관여되는 것으로 밝혀져 있다. A1M의 3차원 구조는 C34가 용매 노출되고, 리포칼린 포켓의 개구부 근처에 위치된다는 것을 나타낸다(도 10 참조).
본 문맥에서, 용어 "a1-마이크로글로불린"은 유사한 치료 활성도를 갖는 이들의 동족체, 단편 또는 변이체를 비롯하여, 서열번호 1(인간 A1M), 서열번호 2(인간 재조합 A1M) 및 다른 종으로부터의 A1M에서 식별된 바와 같은 a1-마이크로글로불린을 포괄하도록 의도된다. 따라서, A1M은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 단백질을 의미하도록 의도된다. A1M은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. A1M은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 95%. 예컨대, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것이 보다 더 바람직하다. 바람직한 양상에서, a1-마이크로글로불린은 본 명세서에서 식별된 바와 같이 서열번호 1 또는 2에 따른다. 서열 목록에서 인간 A1M 및 인간 재조합 A1M의 아미노산 서열(각각 서열번호 1 및 2)이 주어져 있다. 그러나, 하기에 식별된 바와 같은 단백질의 중요한 부분을 갖는 A1M의 동족체, 변이체 및 단편이 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 A1M에 포함된다. 정렬/동일성과 관련하여 하기 단락을 참조하기 바란다.
정렬/동일성의 상세사항
본 명세서에서 아미노산 잔기의 위치는 인간 혈액 혈장에서 발견된 바와 같은 인간 wt A1M(서열번호 1)에서의 위치를 지칭한다. wt-A1M(서열번호 2) 내에서 또는 돌연변이된 인간 A1M 또는 다른 종으로부터의 A1M 내에서의 초기 잔기인 글라이신 잔기에 N-말단으로 연결된 메티오닌 또는 N-폼일 메티오닌 잔기를 보유하는, 재조합 A1M 내의 아미노산 잔기를 지칭하는 경우, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 위치가 예를 들어, 결실 또는 삽입으로 인해서 이동된 경우에도 인간 wt-A1M(서열번호 1) 내의 잔기에 상응하는 잔기를 식별하는 방법을 이해할 것이다.
재조합 단백질이 생산되는 경우, 이것은 가장 자주는 초기 Met 잔기에서 시작하는데, 이것은 예를 들어, 메티오닌 아미노펩티다제 또는 유사한 활성도를 갖는 또 다른 효소를 사용하여 제거될 수 있다. 본 명세서에 제시된 A1M 변이체는 초기 Met 잔기가 있거나 없을 수 있다.
A1M의 동족체
상기에 언급된 바와 같이 A1M의 동족체는 또한 본 명세서의 설명에 따라서 사용될 수 있다. 이론상으로, 어류(넙치)로부터 유래된, 지금까지 발견된 가장 원시적인 것을 비롯한 모든 종으로부터의 A1M이 본 명세서에 기술된 목적을 위해서 사용될 수 있다. A1M은 또한 인간, 오랑우탄, 다람쥐 원숭이, 래트, 벌거숭이 두더지쥐, 마우스, 토끼, 기니피그, 젖소, 개구리, 닭, 바다코끼리, 매너티 및 넙치로부터 단리된 형태로 입수 가능하다.
A1M의 동족체, 변이체 및 단편을 고려하여, 하기가 항-산화성 효과를 위한 단백질의 중요한 부분으로서 식별되어 왔다:
Y22(타이로신, pos 22, 염기쌍 64-66)
C34(시스테인, 위치 34, 염기쌍 100-102)
K69(라이신, pos 69, 염기쌍 205-207)
K92(라이신, pos 92, 염기쌍 274-276)
K118(라이신, pos 118, 염기쌍 352-354)
K130(라이신, pos 130, 염기쌍 388-390)
Y132(타이로신, pos 132, 염기쌍 394-396)
L180(류신, pos 180, 염기쌍 538-540)
I181(아이소류신, pos 181, 염기쌍 541-543)
P182(프롤린, pos 182, 염기쌍 544-546)
R183(아르기닌, pos 183, 염기쌍 547-549)
문헌 전체에서 아미노산 및 뉴클레오타이드의 넘버링은 서열번호 1을 지칭하고; 다른 종으로부터의 다른 A1M, A1M 유사체 또는 이의 재조합 서열이 사용되는 경우, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 서열번호 1에서의 아미노산에 상응하는 아미노산을 식별하는 방법을 알고 있을 것이다.
따라서, 이러한 경우에, A1M eg가 서열번호 1 또는 2 중 하나와 80%(또는 90% 또는 95%) 서열 동일성을 갖는 경우, 상기에 언급된 아미노산은 분자 내의 적절한 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
인간 A1M은 3개의 위치에서 올리고당과 치환되는데, 2개는 시알릴화된 복합체-유형, 아마도 N17 및 N96에 탄수화물로 연결된 다이안테너리(diantennary)이고 하나는 T5에 연결된 더 단순한 올리고당이다. 상이한 종으로부터의 A1M 단백질의 탄수화물 함량은 제노푸스 리비스(Xenopus leavis)에서 전혀 글리코실화되지 않은 것으로부터 여러가지의 상이한 글리코실화 패턴에 걸친 범위로, 상당히 달라진다. 그러나, 인간에서 N96에 상응하는 하나의 글리코실화 부위가 포유동물에서 보존되는데, 이는 이러한 특정 탄수화물이 나머지 2개의 올리고당보다 단백질의 더 중요한 구성성분일 수 있다는 시사한다.
A1M은 혈장 또는 소변으로부터 정제되는 경우 황갈색이다. 이 색상은 포켓에 대한 입구에 주로 위치된 다양한 아미노산 측기에 공유 결합된 불균질 화합물에 의해서 유발된다. 이러한 변형은 생체 내에서 A1M에 의해서 공유적으로 트랩핑된 유기 산화제의 산화된 분해 생성물, 예를 들어, 헴, 카이뉴레닌 및 타이로실 라디칼을 나타낸다.
A1M은 또한 전하- 및 크기-불균질하고 더 상당히 갈색인 A1M-분자는 더 음으로 하전되어 있다. 불균질성에 대한 가능한 설명은 상이한 측기가 상이한 라디칼로 다양한 정도로 변형된다는 것 및 그 변형이 단백질의 순전하를 변경한다는 것이다. 공유 연결된 유색 물질은 C34, 및 K92, K118 및 K130에 국지화되어 있고, 후자는 100 내지 300Da의 분자량을 갖는다. 트립토판 대사산물 카이뉴레닌은 혈액투석 환자의 소변으로부터의 A1M에서 라이실 잔기에 공유 부착된 것으로 발견되었고, 이러한 경우에 단백질의 갈색의 원천인 것으로 보인다[6]. 합성 라디칼 ABTS(2,2'-아지노-다이-(3-에틸벤조티아졸린)-6-설폰산)의 산화된 단편은 Y22 및 Y132에 결합되었다.
C34는 A1M의 반응성 중심이다. 그것은 매우 전기음성이 되는데, 이는 그것이 K69, K92, K118 및 K130의 양으로 하전된 측쇄 근방에 의해서, 전자를 내어줄 높은 가능성을 갖는다는 것을 의미하고, 이것은 황 원자의 산화의 전제 조건인 C34 티올기의 탈양성자화를 유도한다. 예비 데이터는 C34가 공지된 가장 전기음성인 기 중 하나임을 나타낸다.
이론적으로, 하기에 보다 상세히 기술될 A1M의 특성을 특징규명하는 아미노산(C34, Y22, K92, K118, K130, Y132, L180, I181, P182, R183)은 또 다른 프레임워크, 예를 들어, 동일한 전반적인 접힘을 갖는 단백질(또 다른 리포칼린) 또는 완전히 인공적인 유기 또는 무기 분자, 예컨대, 플라스틱 중합체, 나노입자 또는 금속 중합체 상에서 3차원 입체배치로 배열될 수 있다.
이들 아미노산 중 일부의 3차원 배열(청색 타원형, 라이신은 +"로 도시됨), A1M-프레임워크(배럴), 전자-유동 및 라디칼-트랩핑이 도 10에 도시되어 있다.
따라서, 상기에 나타낸 바와 같은 반응성 중심 및 이의 주변을 포함하는 구조를 포함하는 동족체, 단편 또는 변이체가 바람직하다.
본 개시내용의 폴리펩타이드의 구조에서 변형 및 변화가 수행되고, 본래 폴리펩타이드와 유사한 기능적 특징을 갖는 분자를 여전히 초래하였다(예를 들어, 보존적인 아미노산 치환). 예를 들어, 특정 아미노산은 활성도를 감지 가능하게 손실시키지 않으면서 서열에서 다른 아미노산에 대해서 치환될 수 있다. 그것은 상호작용 능력이고, 그 폴리펩타이드의 생물학적 기능적 활성도를 정의하는 폴리펩타이드의 본성이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩타이드 서열에서 수행될 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 기능적 특성을 갖는 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
이러한 변화의 수행 시에, 아미노산의 수치 지수가 고려될 수 있다. 폴리펩타이드 상에 상호작용 생물 기능을 부여하는 데 있어서의 아미노산 수치 지수의 중요성은 관련 기술 분야에서 일반적으로 이해된다. 특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 대해서 치환될 수 있고, 유사한 생물학적 활성도를 갖는 폴리펩타이드를 여전히 초래한다는 것이 공지되어 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징을 기초로 배정된 수치 지수가 배정되어 있다. 이들 지수는 다음과 같다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(- 1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
아미노산의 상대적인 수치 특징은 생성된 폴리펩타이드의 2차 구조를 결정하고, 이것은 결국 폴리펩타이드와 다른 분자, 예컨대 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 등의 상호작용을 정의한다고 여겨진다. 아미노산은 유사한 수치 지수를 갖는 또 다른 아미노산에 의해서 치환될 수 있고, 기능적으로 동등한 폴리펩타이드를 여전히 수득할 수 있다는 것이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 변화에서, 수치 지수가 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ± 1 이내인 것이 특별하게 바람직하고, ± 0.5 이내인 것이 보다 더 특별하게 바람직하다.
유사한 아미노산의 치환은 또한 친수성을 기초로 수행될 수 있고, 특히 여기서 이에 의해서 생성된 생물학적으로 기능적으로 동등한 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 면역학적 실시형태에서 사용되도록 의도된다. 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 대해서 배정되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신 (0); 프롤린(-0.5 ± 1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 것에 대해서 치환될 수 있고, 생물학적으로 동등한, 특별하게는, 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드를 여전히 수득할 수 있음이 이해된다. 아미노산의 치환의 이러한 변화에서, ± 2 이내인 친수성 값이 바람직하고, ± 1 이내인 것이 특히 바람직하고, ± 0.5 이내인 것이 보다 더 특별하게 바람직하다.
상기에 요약된 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 상기 특징 중 하나 이상을 고려하는 예시적인 치환은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다(본래 잔기: 예시적인 치환):(Ala: GIy, Ser), (Arg: Lys), (Asn: GIn1 His), (Asp: GIu, Cys, Ser), (GIn: Asn), (GIu: Asp), (GIy: Ala), (His: Asn, GIn), (Ile: Leu, VaI), (Leu: Ile, VaI), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Trp: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), 및 (VaI: Lle, Leu). 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 상기에 언급된 바와 같은 폴리펩타이드의 기능적 또는 생물학적 등가물을 고려한다. 특히, 폴리펩타이드의 실시형태는 관심 폴리펩타이드와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 95% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 두 아미노산 서열 간의 또는 두 핵산 서열 간의 상동성은 파라미터 "동일성"에 의해서 기술된다(또한 상기 참조). 서열의 정렬 및 상동성 점수의 계산은 단백질 및 DNA 정렬 모두에 대해서 유용한 완전 스미쓰-워터만(Smith-Waterman) 정렬을 사용하여 수행될 수 있다. 디폴트 스코어링 매트릭스 BLOSUM50 및 동일성 매트릭스가 각각 단백질 및 DNA 정렬에 대해서 사용된다. 갭 내의 제1 잔기에 대한 페널티는 단백질의 경우 -12이고, DNA의 경우 -16인 반면, 갭 내의 추가적인 잔기에 대한 페널티는 단백질의 경우 -2이고, DNA의 경우 -4이다. 정렬은 FASTA 패키지 버전 v20u6으로 수행될 수 있다.
단백질 서열의 다중 정렬은 "ClustalW"를 사용하여 수행될 수 있다. DNA 서열의 다중 정렬은 주형으로서 단백질 정렬을 사용하고, 아미노산을 DNA 서열로부터의 상응하는 코돈으로 대체하여 수행될 수 있다.
대안적으로 상이한 소프트웨어를 아미노산 서열 및 DNA 서열을 위해서 사용될 수 있다. 두 아미노산 서열의 정렬은 예를 들어, EMBOSS 패키지(http://emboss.org) 버전 2.8.0으로부터의 Needle 프로그램을 사용함으로써 결정된다. Needle 프로그램은 에 기술된 글로벌 정렬 알고리즘을 구현한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 개방 페널티는 10이고, 갭 연장 페널티는 0.5이다.
아미노산 서열; 예를 들어, 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2) 간의 동일성 정도는 두 서열의 정렬에서의 실제 매치 수를 "서열번호 1"의 길이 또는 "서열번호 2"(어느 것이든 가장 짧은 것)의 길이로 나눔으로써 계산된다. 결과는 백분율 동일성으로 표현된다. 정렬 및 동일성에 관련된 상기 내용을 참조하기 바란다.
두 서열이 중첩부의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 갖는 경우 정확한 매치가 일어난다.
관련성이 있는 경우, 두 뉴클레오타이드 서열 간의 동일성 정도는 동일성 표와 함께 LASER-GENE(상표명) MEGALIGN(상표명) 소프트웨어(드나스타, 인크.(DNASTAR, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 및 하기 다중 정렬 파라미터를 사용하여 윌버-리프만(Wilbur-Lipman) 방법에 의해서 결정될 수 있다: 갭 페널티 10 및 갭 길이 페널티 10. 쌍 정렬 파라미터는 크터플(Ktuple)=3, 갭 페널티=3, 및 윈도우=20이다.
서열번호 1의 아미노산과 또는 이에 대한 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 동일성 백분율은 i) 두 아미노산 서열을 BLOSUM62 치환 매트릭스, 갭 개방 페널티 10, 및 갭 연장 페널티 0.5와 함께 Needle 프로그램을 사용하여 정렬하고; ii) 정렬 시에 정확한 매치의 수를 계수하고; iii) 정확한 매치의 수를 두 아미노산 서열 중 가장 짧은 것의 길이로 나누고, iv) iii)의 나눗셈의 결과를 백분율로 변환함으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 다른 서열에 대한 또는 이것과의 동일성 백분율은 유사한 방식으로 계산된다.
예의 방식에 의해서, 폴리펩타이드 서열은 100% 동일한 참조 서열과 동일할 수 있거나 또는 그것은 참조 서열과 비교할 때 아미노산 변경의 특정 정수 이하를 포함할 수 있어서 % 동일성이 100% 미만이다. 이러한 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환(보존적인 치환 및 비-보존적인 치환 포함) 또는 삽입으로부터 선택되고, 여기서 상기 변경은 참조 폴리펩타이드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치에서 또는 참조 서열 내의 아미노산 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기 내에 산재된 이들 말단 위치 사이의 어디에서든 일어날 수 있다.
보존적인 아미노산 변이체는 또한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 아미노산은 제한 없이 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메탄오프롤린, 시스-4-하이드록시프롤린, 트랜스-4-하이드록시프롤린, N-메틸-글라이신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 하이드록시-에틸시스테인, 하이드록시에틸호모시스테인, 나이트로-글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카복실산, 데하이드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-다이메틸프롤린, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐-알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비-자연 발생 아미노산 잔기를 단백질 내에 혼입하기 위한 몇몇 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 시험관내 시스템이 사용될 수 있고, 여기서, 넌센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 사용하여 억제된다. 아미노산을 합성하는 방법 및 tRNA를 아미노아실화하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역이 이. 콜라이 S30 추출물 및 상업적으로 입수 가능한 효소 및 다른 시약을 포함하는 무세포 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해서 정제된다. 제2 방법에서, 번역은 돌연변이된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA의 미세주사(microinjection)에 의해서 제노푸스 오오사이테스(Xenopus oocytes)에서 수행된다. 제3 방법에서, 이. 콜라이 세포는 대체될 자연 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌)의 부재 하에서 그리고 목적하는 비-자연 발생 아미노산(들)(예를 들어, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재 하에서 배양된다. 비-자연 발생 아미노산은 이의 자연 상대 대신에 단백질 내에 혼입된다. 자연 발생 아미노산 잔기는 시험관내 화학적 변형에 의해서 비-자연 발생 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 부위-지향된 돌연변이 유발과 조합되어 치환의 범위를 추가로 확장시킬 수 있다. A1M의 항산화 특성을 지지하기에 충분한 3차원 구조를 제공하는 대안적인 화학 구조는 다른 기술, 예를 들어, 인공 스캐폴드, 아미노산 치환 등에 의해서 제공될 수 있다. 추가로, 상기에 열거된 바와 같은 A1M의 활성 부위를 모방하는 구조는 A1M과 동일한 치료적 또는 생리학적 기능을 갖는 것으로 고려된다.
약제학적 조성물 및 투여량
본 발명은 또한 하기를 포함하는 키트를 제공한다:
i) 조영제(contrast medium)를 포함하는 약제학적 조성물, 및
ii) A1M, 서열번호 1 내지 10 및 17 중 임의의 것 또는 본 명세서에 언급된 A1M 유래 단백질 중 임의의 것(또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 돌연변이체, 유사체, 단편 또는 변이체)을 포함하는 약제학적 조성물.
하기에 서열 목록이 제공된다. 본 발명은 모든 가능한 변이, 예를 들어, 예컨대 본 명세서에 예시된 것을 포함한다.
서열번호 1: wt hA1M
서열번호 2: rhA1M(즉, Met-A1M)
서열번호 3: "연장부"가 없는 바람직한 돌연변이 - N17,96D, R66H
서열번호 4: 연장부 없음, M41K
서열번호 5: 6His, N17,96D, R66H를 갖는 바람직한 돌연변이
서열번호 6: 6His, M41K
서열번호 7: 8 His 연장부, N17,96D, R66H를 갖는 바람직한 돌연변이
서열번호 8: 8 His, M41K
서열번호 9: 연장부 + wt hA1M
서열번호 10: 가능한 연장부를 갖는 옴니버스 A1M.
서열번호 11-16: wt hA1M의 분절
서열번호 17: 가능한 연장부를 갖는 옴니버스 C-말단 절두된 A1M
서열번호 18: "연장부"가 없는 바람직한 돌연변이 - N17,96D, R66; C-말단 절두됨.
서열번호 19: 연장부 없음, M41K; C-말단 절두됨.
서열번호 20: 6 His, N17,96D, R66H를 갖는 바람직한 돌연변이; C-말단 절두됨.
서열번호 21: 6His, M41K; C-말단 절두됨.
서열번호 22: 8 His 연장부, N17,96D, R66H를 갖는 바람직한 돌연변이; C-말단 절두됨.
서열번호 23: 8 His, M41K; C-말단 절두됨.
키트는 상기에 언급된 2종의 조성물을 함유하는 하나의 패키지의 형태로 존재한다.
조영제를 포함하는 약제학적 조성물은 전형적으로 이미 시판되는 조성물이다.
A1M(또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 이의 유사체, 단편 또는 변이체)을 포함하는 약제학적 조성물은 i.v. 투여가 의도된다. 따라서, A1M은 액체, 예를 들어, 용액, 분산액, 에멸션, 현탁액 등으로 제형화될 수 있다.
비경구 용도를 위해서 적합한 용매는 물, 식물유, 프로필렌 글리콜 및 이러한 목적을 위해서 일반적으로 승인된 유기 용매를 포함한다. 일반적으로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 문헌["Remington's Pharmaceutical Science" edited by Gennaro et al.(Mack Publishing Company)], ["Handbook of Pharmaceutical Excipients" edited by Rowe et al.(PhP Press)] 및 특정 제형 유형에 대한 관련된 부형제 및 특정 제형을 제조하는 방법에 관련된 공식 논문(예를 들어, Ph.Eur. 또는 USP)에서 지침을 찾아볼 수 있다.
A1M은 조영제의 투여와 관련하여 또는 몇몇 용량으로 투여될 것이다. 바람직하게는, 각각의 용량은 단일 용량, 단일 용량 이후에 최대 60분의 짧은 시간 기간 동안의 느린 주입 또는 단지 최대 60분의 짧은 시간 기간 동안의 느린 주입 중 어느 하나로서 i.v.로 투여될 것이다. 제1 용량은 조영제와 동시에 또는 조영제의 주사 전 0 내지 60분 내지 주사 후 0 내지 30분의 기간 내에 투여될 수 있다. 조영제의 주사 이후에, 추가적인 A1M-용량이 첨가될 수 있지만, 필수적이지 않을 수 있다. 각각의 용량은 환자 체중에 관련된 양의 A1M을 함유한다: 1 내지 15㎎ A1M/환자 ㎏.
서열 목록 프리 텍스트
서열번호 1
<223> 야생형 인간 A1M, 돌연변이 없음
서열번호 2
<223> rhA1M, 즉. N-말단 Met
서열번호 3
<223> hA1M, 태그 없음, N-말단 Met, N17,96D; R66H
서열번호 4
<223> hA1M, 태그 없음, N-말단 Met, M41K
서열번호 5
<223> 6His, N17,96D; R66H
서열번호 6
<223> hA1M, 6His, M41K
서열번호 7
<223> 8His, N17,96D; R66H
서열번호 8
<223> hA1M, 8His, M41K
서열번호 9
<223> hA1M, 8His, mut 없음
서열번호 10
<211> 193
<212> PRT
<213> 호모 사피엔스
<220>
<221> 변이체
<222> 1
<223> Xaa = Met 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 1
<223> Xaa = Met 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 2
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 2
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 3
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 3
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 4
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 4
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 5
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 5
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 6
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 6
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 7
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 7
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 8
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 8
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 9
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 9
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 31
<223> Xaa = Asn 또는 Asp
<220>
<221> 변이체
<222> 55
<223> Xaa = Met 또는 Lys
<220>
<221> 변이체
<222> 80
<223> Xaa = Arg 또는 His
<220>
<221> 변이체
<222> 110
<223> Xaa = Asn 또는 Asp
서열번호 11
<223> Y1
서열번호 12
<223> Y2
서열번호 13
<223> Y3
서열번호 14
<223> Y4
서열번호 15
<223> Y5
서열번호 16
<223> Y5
서열번호 17
<211> 197
<212> PRT
<213> 호모 사피엔스
<220>
<221> 변이체
<222> 1
<223> Xaa = Met 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 1
<223> Xaa = Met 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 2
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 2
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 3
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 3
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 4
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 4
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 5
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 5
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 6
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 6
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 7
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 7
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 8
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 8
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 9
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 9
<223> Xaa = His 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
<220>
<221> 변이체
<222> 10
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<220>
<221> 변이체
<222> 11
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<220>
<221> 변이체
<222> 11
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<220>
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<222> 12
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<220>
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<222> 12
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<222> 13
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<222> 13
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<220>
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<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg 또는 존재하지 않음
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<222> 31
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<222> 80
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<220>
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<223> Xaa = Asn 또는 Asp
서열번호 18
<223> hA1M, 태그 없음, N-말단 Met, N17,96D; R66H; 절두됨
서열번호 19
<223> hA1M, 태그 없음, N-말단 Met, M41K; 절두됨
서열번호 20
<223> 6His, N17,96D; R66H; 절두됨
서열번호 21
<223> hA1M, 6His, M41K; 절두됨
서열번호 22
<223> 8His, N17,96D; R66H; 절두됨
서열번호 23
<223> hA1M, 8His, M41K; 절두됨
서열번호 24
<223> 1.M8H5GIEGR-마우스
서열번호 25
<223> 2. M8H5GIEGR-벌거숭이 두더지쥐
서열번호 26
<223> 3. M8H5GIEGR-개구리
서열번호 27
<223> 4. M8H5GIEGR-닭
서열번호 28
<223> 5. M8H5GIEGR-토끼
서열번호 29
<223> 6. M8H5GIEGR-SQ 원숭이
서열번호 30
<223> 7. M8H5GIEGR-바다코끼리
서열번호 31
<223> 8. M8H5GIEGR-매너티
서열번호 32
<223> 9. M8H5GIEGR-넙치
서열번호 33
<223> 10. M8H5GIEGR-오랑우탄
서열번호 34
<223> 11. M8H5GIEGR-인간 P35K
서열번호 35
<223> 12. M8H5GIEGR-인간 M41K
서열번호 36
. M8H5GIEGR-인간 R66H
서열번호 37
<223> 14. M8H5GIEGR-인간 T75K
서열번호 38
<223> 15. M8H5GIEGR-인간 T75Y
서열번호 39
<223> 16. M8H5GIEGR-인간 M99K
서열번호 40
<223> 17. M8H5GIEGR-인간 S101Y
서열번호 41
<223> 18. M8H5GIEGR-인간 K69.92.118.130R
서열번호 42
<223> 19. M8H5GIEGR-실러캔스
서열번호 43
<223> 21. M8H5GIEGR-인간 L89T
서열번호 44
<223> 22. M8H5GIEGR-인간 N1796D
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서열번호 46
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<223> 25. M8H5GIEGR-인간 V170S
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<223> 26. M8H5GIEGR-인간
서열번호 49
<223> 27. M8H5GIEGR-인간 G172Q
서열번호 50
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서열번호 51
<223> 34. M8H4DK-인간 M41K+N1796D 34
서열번호 52
<223> 35. M8H4DK-인간 R66H+N1796D
서열번호 53
<223> 36. M8H4DK-인간 M41K+R66H+N1796D
서열번호 54
<223> 38. M8H4DK-인간 R66H
서열번호 55
<223> 39.M8H4DK-인간
서열번호 56
<223> 40. M8H-인간 wt
서열번호 57
<223> 41. M8H-인간 R66H+N1796D
서열번호 58
<223> 60. M8H4DK-인간 wt
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<223> 1.M8H5GIEGR-마우스
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<223> 5. M8H5GIEGR-토끼
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서열번호 70
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서열번호 71
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서열번호 72
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서열번호 75
<223> 17. M8H5GIEGR-인간 S101Y
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<223> 18. M8H5GIEGR-인간 K69.92.118.
서열번호 77
<223> 19. M8H5GIEGR-실러캔스
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서열번호 79
<223> 22. M8H5GIEGR-인간 N1796D
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<223> 23. M8H5GIEGR-인간 T45K
서열번호 81
<223> 24. M8H5GIEGR-인간 A135E
서열번호 82
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서열번호 83
<223> 26. M8H5GIEGR-인간 V148D
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서열번호 85
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서열번호 86
<223> 34. M8H4DK-인간 M41K+N1796D
서열번호 87
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서열번호 92
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서열번호 93
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서열번호 94
<223> 42. 비태깅된-인간 R66H+N1796D
서열번호 95
<223> 61. 비태깅된-인간 wt
약어
A1M: 알파-1-마이크로글로불린, IB: 봉입체, wt: 야생형, R66H: 위치 66에서 Arg 대신에 His의 발현으로 이어지는 A1M-유전자 내의 점 돌연변이: N17,96D: 위치 17 및 96에서 Asn 대신에 Asp의 발현으로 이어지는 A1M-유전자 내의 점 돌연변이, M8H4DK: 아미노산 서열 MHHHHHHHHDDDDK를 갖는 펩타이드, M6H4DK: 아미노산 서열 MHHHHHHDDDDK를 갖는 펩타이드, M8H: 아미노산 서열 MHHHHHHHH를 갖는 펩타이드, M8H5GIEGR: 아미노산 서열 MHHHHHHHHGGGGGIEGR을 갖는 펩타이드, CV: 칼럼 체적, SEC: 크기-배제 크로마토그래피, DLS: 동적 광 산란, DSF: 시차 주사 형광측정법, Gu-HCl: 구아닌이딘 염산염, ORAC: 산소 라디칼 항산화제 능력, SD: 표준 편차, PAGE: 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법
정의
개시된 발명 주제를 기술 및 청구하는 데 있어서, 하기 용어가 하기에 제시된 정의에 따라서 사용될 것이다. 달리 정의되지 않는 한 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 준비된 참조를 위해서 본 명세서에 정의되고, 본 명세서에서 이러한 정의의 포함은 관련 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것을 넘어서는 상당한 차이를 나타내는 것으로 필수적으로 이해되어서는 안 된다. 본 명세서에 설명되고 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 종래의 방법을 사용하여 널리 이해되고 일반적으로 사용된다. 적절한 경우, 상업적으로 입수 가능한 키트 및 시약의 사용에 관여되는 절차는 달리 주목되지 않는 한 일반적으로 제조사 정의된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라서 수행된다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료는 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 명세서에 기술되어 있다.
본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, 단수 표현은 "하나 이상"을 의미한다.
용어 "치료 또는 예방조치"는 본 발명과 관련하여 이의 다양한 문법적 형태에서 (1) 장애의 해로운 효과, (2) 장애 진행 또는 (3) 장애 병원체를 예방, 치유, 반전, 감쇠, 개선, 완화, 저해, 최소화, 억제 또는 중단시키는 것을 지칭한다.
용어 "유효량"은 본 발명과 관련하여 주어진 병태 및 투여 치료요법에 치료 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 이것은 요구되는 첨가제 및 희석제; 즉, 담체 또는 투여 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 생성시키기 위해서 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양이다. 추가로, 그것은 숙주의 활성도 및 반응에서의 임상적으로 유의한 결핍을 감소, 가장 바람직하게는 예방하는 양을 의미하도록 의도된다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의한 상태에서의 개선을 유발하기에 충분하다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 화합물의 양은 이의 특이적 활성도에 따라서 달라질 수 있다. 적합한 투여량은 요구되는 희석제; 즉, 담체 또는 첨가제와 함께 목적하는 치료 효과를 생성시키기 위해서 계산된 활성 조성물의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다. 추가로, 투여될 투여량은 사용될 유효 성분 또는 성분들, 치료될 환자의 연령, 체중 등에 따라서 달라질 것이지만, 일반적으로 0,001 내지 1000㎎/㎏ 체중/일의 범위 이내일 것이다. 더욱이, 용량은 투여 경로에 좌우된다.
용어 "폴리펩타이드"는 단백질 및 이의 단편을 포함한다. 폴리펩타이드는 본 명세서에서 아미노산 잔기 서열로서 개시되어 있다. 이러한 서열은 아미노로부터 카복시 말단의 방향으로 좌에서 우로 기재되어 있다. 표준 명명법에 따라서, 아미노산 잔기 서열은 하기에 제시된 바와 같은 3문자 또는 단문자 중 어느 하나에 의해서 명명된다: 알라닌(Ala, A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글루탐산d(Glu, E), 글라이신(Gly1 G), 히스티딘(His, H), 아이소류신(lie, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M)1 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 타이로신(Tyr, Y), 및 발린(Val, V).
"변이체"는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 상이하지만, 본질적인 특징을 보유하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드의 전형적인 변이체는 또 다른 참조 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 차이는 참조 폴리펩타이드 및 변이체의 서열이 전체적으로 근접하게 유사하고(상동), 많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 첨가 및/또는 결실)에 의해서 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환된 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 암호에 의해서 암호화된 것일 수 있거나 암호화된 것이 아닐 수 있다. 폴리펩타이드의 변이체는 자연 발생, 예컨대, 대립유전자 변이체일 수 있거나 또는 그것은 자연적으로 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다.
본 발명은 도면- 이에 제한되지 않음-에서 추가로 설명된다.
도면의 설명
도 1. 12개의 상이한 종으로부터의 A1M의 아미노산 서열 정렬.
프로젝트 단계 I에서 조사된 인간 wt A1M 및 11개의 추가적인 종의 아미노산 서열을 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ 소프트웨어를 사용하여 정렬하였다. 인간 서열에 대한 상이한 서열의 동일성을 백분율로 제시한다. 세트에서 모든 종 사이에서 동일한 아미노산을 황색으로 표시한다. 추가로, 인간 A1M에서 중요하다고 여겨지는 아미노산을 표시하고: 환원 및 항산화제 특성(Allhorn et al., 2005)뿐만 아니라 헴 결합에 중요한 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기(C34)를 분홍색으로 표시한다(Mening and Skerra, 2012). 글리코실화되었다고 공지된 아스파라긴(N17 및 96)을 녹색으로 표시한다(Escribano et al, 1990). 소변 A1M에서 변형되어 발견되고
, 리덕타제 활성도에 중요하다고 여겨지는(Allhorn et al., 2005) 4개의 라이신(K69, 92, 118 및 130)을 밝은 청색으로 표시한다. 헴-결합에 참여하는 것으로 제안된 H123(Meining and Skerra, 2012)은 회색으로 표시하고, 마지막으로 라디칼 포집에 관여되는 것으로 보이는 타이로신(Y22 및 132)
은 어두운 청색으로 표시한다.
도 2. 단계 III에서 발현된 단백질의 SDS-PAGE
비유도된 샘플(0로 표시) 및 유도 1 내지 4시간 후 취한 샘플(1, 2, 3, 4로 표시)로부터의 동일한 양의 박테리아 용해물을 SDS-PAGE에 의해서 분리하였다. 이들 샘플에서, 25kDa보다 약간 작은 밴드가 시간에 따라서 증가되는 양으로 발현된다. 밴드의 강도는 유도 3시간 후에 끝난다. 8H-태깅된 wt-A1M 및 R66K+N17,96D-A1M은 M8H4DK 밴드에 대한 것보다 약간 더 작은 분자량으로 발현되지만, 또한 여기에서 그 발현 수준은 대략 3시간에 끝난다. 비태깅된 wt-A1M 및 R66H+N17,96D-A1M은 훨씬 더 작은 밴드로서 보이지만, 여기서 그 밴드의 강도는 특히 wt A1M의 경우에는, 3시간이 아닌 4시간에 더 강한데, 이는 약간 지연된 발현을 나타낸다.
도 3. 단계 III 변이체의 수율, 순도 및 응집.
A. 모든 단계 III 변이체의 정제된 A1M의 수율을 비교하였다. All 변이체는 양호한 수율을 초래하였고, 비태깅된 wt-A1M은 약간 더 낮은 수율이었다. 10㎍의 모든 변이체를 SDS-PAGE 상에서 분리함으로써 순도를 조사하였다. B. 주요 단량체 밴드를 바이오-라드(Bio-Rad)로부터의 이미지 소프트웨어를 사용하여 모든 밴드와 비교하는 농도계 분석에 의해서 순도를 결정하였다. 모든 히스티딘-태깅된 변이체는 매우 높은 순도를 나타내었고, 비태깅된 변이체의 순도는 약간 더 낮았다(대략 90%). C. 네이티브 PAGE에 의해서 각각의 변이체 20㎍을 분리함으로써 큰 응집물의 존재를 분석하였다. 주요 단량체 밴드의 강도 및 적용 슬릿에 남아있는 물질(매우 큰 응집된 것)을 농도계에 의해서 결정하였다. 대부분의 변이체는 M8H-wt-A1M 및 비태깅된 변이체(이것은 약간 더 높은 농도 백분율을 나타냄)를 제외하고 많은 양의 큰 응집물을 나타내었다. 모든 변이체는 패널 A에 주어진 숫자에 의해서 암호화되어 있다.
도 4. 다양한 완충액 중에서 단계 III 변이체의 100μM 및 1mM 용액의 응집 분석.
상이한 완충액 중에서 100μM 내지 1mM로 농축한 후 응집되는 경향성을 네이티브 PAGE 분석에 의해서 조사하였다. 20㎍의 단백질을 각각의 레인에서 분리하였다. 큰 응집물의 백분율을 개별 밴드 강도의 농동계 분석에 의해서 계산하였다.
A. 모든 변이체를 트리스-완충액 pH 8.0 또는 7.4 중에서 100μM 내지 1mM로 농축하였고, PAGE에 의해서 분리하였다. M8H4DK-wt, R66H+N1796D, M41K, R66H, N1796D를 각각 60, 35, 37, 38 및 39로 표지하고, M8H-wt 및 M8H-R66H+N1796D를 40 및 41로 표지하고, 비태깅된 wt 및 R66H+N1796D를 61 및 42로 표지한다.
B. 변이체를 트리스-완충액 pH 8.0 및 7.4 중에서 그리고 PBS pH7.4 중에서 1mM로 농축하고, 1회의 동결-해동 사이클에 적용하고, 이어서 PAGE에 의해서 분리하고, 기술된 바와 같이 분석하였다.
도 5. 단계 III 변이체의 리덕타제 및 항산화제 능력의 분석.
A. 리덕타제 활성도를 ABTS 라디칼의 환원으로서 분석하였다. 0 내지 2μM의 A1M을 2개 복제물에서 56μM ABTS 라디칼에 첨가하였다. 환원은 95초 동안 405㎜에서의 흡광도 감소로서 이어졌다. 각각의 농도에 대한 곡선하 면적(AUC)을 계산하고, 완충액 단독의 AUC를 뺄셈함으로써 순 AUC를 계산하였다. 2개 복제물의 평균 순 AUC+/- SEM을 농도에 대해서 플롯팅하였다. 모든 M8H4DK-변이체는 M41K 및 R66H에 대해서 더 낮은 활성도에 대한 경향성을 갖는 wt A1M과 대략 동일한 활성도를 갖는다. M8H 및 비태깅된 변이체는 또한 wt A1M과 비교할 때 R66H+N1796D 변이체의 더 높은 활성도의 작은 경향성을 갖는 완전 활성도를 나타낸다.
B. ORAC 검정으로 항산화 능력을 조사하였다. A1M-변이체의 활성도를 트롤록스 표준품과 비교하고, 트롤록스 당량의 수로서 표현한다. 각각의 검정을 3개 반복물에서 수행하였고, M84DK-wt의 결과를 100%로 설정하였다. 모든 다른 변이체의 항산화 능력을 관계식으로 표현하였다. M8H4DK-R66H+N17,96D 변이체는 M8H4DK-wt A1M보다 상당히 더 높은 능력을 나타내었다. 태그가 단축 또는 제거된 경우, 그 차이는 더 작았다. 제시된 데이터는 2개의 독립적인 실험의 조합된 결과이다.
도 6. 단계 III 변이체의 리덕타제 활성도 및 헴 결합의 분석.
A. A1M의 희석물 시리즈(0 내지 10μM)와 100μM 사이토크롬 c+100μM NADH를 혼합하고, 20분 동안 550㎜에서의 흡광도의 증가를 지켜봄으로써 사이토크롬 c를 감소시키는 A1M-변이체의 능력을 조사하였다. 2개 복제물에서 검정을 수행하였다. 각각의 농도에 대해서 AUC를 계산하고, 완충액 단독의 AUC를 뺄셈함으로써 순 AUC를 계산하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험의 순 AUC +/- SEM으로서 제시된다. 오브알부민을 음성 대조군으로서 사용하였다. 대부분의 A1M 변이체는 더 낮은 농도에서 wt와 비교할 때 약간 더 낮은 환원 능력을 나타내었다. N17,96D-A1M 및 R66H+N17,96D-A1M의 경우 그것은 상당하다(0.3 내지 0.6μM에서). 태그의 단축 및 제거는 이 특성에 영향이 없었다.
B. 410 내지 420㎜의 흡광도 피크의 출현 및 그 피크의 적색-이동의 크기에 의해서 헴의 A1M-변이체 내로의 혼입을 분석하였다(Karnaukhova et al., 2014; Rutardottir et al., 2016). 44μM의 단백질 용액을 2개 복제물에서 40μM 헴과 혼합하고, 2시간 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 혼합물을 270 내지 450㎜의 파장 스캔에 의해서 분석하였다. 최대 피크의 위치 및 413:386 비를 계산하였다. 모든 M8H4DK-변이체는 wt-A1M와 대략 동일한 적색-이동 및 비를 갖지만, M8H-태깅된 변이체는 상당히 더 높은 비를 갖는다. 비태깅된 변이체는 적색-이동 활성도가 부족한데, 이는 이전 결과를 확인해 준다(Karnaukhova et al., 2014).
C. 헴 아가로스에 대한 A1M의 결합.
A1M의 희석물 시리즈 또는 대조군 오브알부민과 헴-아가로스 또는 대조군 아가로스를 혼합함으로써 A1M의 특이적 결합을 분석하였다. 검정은 2개 복제물에서 실시되었다. 출발 물질 및 헴-아가로스 및 대조군 아가로스 인큐베이션의 단백질 정량화를 BCA를 사용하여 결정하였다. 이들 데이터로부터 헴 아가로스에 특이적으로 결합한 단백질의 양을 각각의 샘플에 대해서 결정할 수 있었다. 결합된 단백질을 첨가된 단백질에 대해서 플롯팅하였고, 선형 상관관계가 모든 변이체에 대해서 인지되었다. 선형 회귀를 사용하여 선의 기울기를 계산하고, 2개 복제물 간의 평균을 나타낸다. 모든 변이체는 본 방법에서 대략 동일한 정도로 헴에 결합한다.
도 7. 헴-유도된 세포사로부터의 K562 세포의 구조
K562 세포를 A1M의 희석물 시리즈(0 내지 10μM)의 존재 하에서 1시간 동안 100μM 헴에 노출시켰다. 이어서, 배지로의 LDH의 방출로서 세포사를 모니터링하였다. 살아있는 세포로부터의 흡광도 값을 뺄셈하고, A1M 없이 헴-인큐베이션된 세포의 신호를 100%로 설정하였다. A1M 인큐베이션의 값을 이와 관련하여 계산하였다. 검정을 2개 복제물에서 수행하였다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 결과(평균 +/-SEM)를 도에 나타낸다. 비태깅된 wt-A1M보다 더 낮은 활성도를 갖는 비태깅된 R66H+N17,96D-A1M을 제외하고는 변이체 중 어느 것도 상당한 변화가 인지될 수 없었다.
도 8. +4℃ 및 실온에서의 저장 후 M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M 및 M8H4DK-wt-A1M의 크기-분포, 및 리덕타제 활성도.
M8H4DK-Wt-A1M 및 M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M을 각각 "wt" 및 "변이체 35"로 표시하고, 상단 패널 및 하단 패널에 도시한다. SEC-FPLC에 의해서 응집을 분석하였다. 단량체 A1M 및 큰 응집물은 각각 대략 15㎖ 및 8㎖에서 용리되었다. 대략 13 내지 14㎖에서 인지된 작은 숄더는 아마도 이량체 A1M일 것이다. 총 피크 면적과 비교하여 8㎖ 피크하 면적으로부터 큰 응집물의 백분율을 계산하였다. 스트레스 노출 후 단백질의 회수율(%; 이탤릭체로 나타냄)을 출발 물질의 총 피크 면적과 비교하여 총 피크 면적으로부터 계산하였다. ABTS의 환원 활성도를 2μM A1M 용액 중에서 분석하였다. 데이터는 2개 복제물의 평균으로서 나타낸다. 새로 해동된 100μM A1M 용액을 (A)로, 5회 동결-해동 사이클에 노출된 100μM A1M을 (B)로, +4℃에서 밤새 저장된 1mM A1M을 (C)로, +4℃에서 일주일 동안 저장된 1mM A1M을 (D)로, RT에서 일주일 동안 저장된 100μM A1M을 (E)로, 그리고 RT에서 일주일 동안 저장된 1mM A1M을 (F)로 나타낸다. 데이터는 M8H4DK-R66H+N1796D가 1mM까지의 농도(C 및 D) 및 RT에서의 저장(E 및 F)을 더 양호하게 용인함을 나타낸다.
도 9. +37℃에서 저장 후 1mM M8H4DK-wt-A1M 및 M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M 의 크기-분포 및 리덕타제 활성도.
Wt-A1M 및 R66H+N17,96D-A1M을 "ht2014" 및 "35"로 표시하고, 각각 상단 패널 및 하단 패널에 도시한다. 응집을 SEC-FPLC에 의해서 분석하였다. 단량체 A1M 및 큰 응집물은 각각 대략 20분 및 12분에 용리되었다. 대략 18 내지 19분에서 인지된 작은 숄더는 아마도 이량체 A1M일 것이다. 12분에서의 피크하 면적으로부터 총 피크 면적과 비교하여 큰 응집물의 백분율을 계산하였다. 총 피크 면적으로부터 출발 물질의 총 피크 면적과 비교하여 스트레스 노출 후 단백질의 회수율(%; 이탤릭체로 나타냄)을 계산하였다. ABTS의 환원 활성도를 2μM A1M 용액 중에서 분석하였다. 데이터를 2개 복제물의 평균으로서 나타낸다. 1.5시간(B), 2.5시간(C) 및 4.5시간(D) 동안 저장된 1mM A1M 용액을 1mM A1M 출발 물질(A)과 비교하였다. 4.5시간에서 M8H4DK-wt는 완전히 침전되었고, 분석될 수 없었다. 데이터는, M8H4DH-R66H+N1796D가 M8H4DK-wt보다 +37℃에서 저장을 더 양호하게 용인한다는 것을 나타낸다.
도 10. A1M의 구조의 모델. 모델을 기술된 바와 같이 제조하였다(참고 문헌 29). 리본으로 나타낸 8개의 β-가닥은 소수성 내부: "리포칼린 포켓"을 갖는 약간 원뿔형의 원통을 형성한다. 리포칼린 포켓의 한 면은 개방되어 있고(화살표로 나타냄), 즉, 그것은 작은 분자의 도입을 허용한다. 반대 면은 폐쇄되어 있다. 2개의 α-헬릭스가 원통으로서 도시되어 있다. 3개의 탄수화물기(T5; N17; N96)의 위치 및 리덕타제 활성도의 활성도에 관여되는 4개의 측쇄(C34; K92; K118; K130)가 도시되어 있다.
도 11
네이티브 PAGE(A 및 B), 및 UV-흡광도 분광광도법(C)에 대한 이송 이동/형광 켄칭에 의해서 분석된 헴-결합. A. 15㎍의 M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 또는 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)을 상이한 양의 헴과 함께 30분 동안 20℃에서 인큐베이션시키고, 네이티브 PAGE에 의해서 분리하고, 트립토판 형광(형광) 및 쿠마시 염색(염색) 후 농도계 스캔에 의해서 젤을 분석하였다. B. 이미지 랩(상표명) 소프트웨어(바이오-라드)를 사용함으로써 영상을 디지털화하였다. 형광 켄칭으로서 측정된 헴 결합(흑색) 및 이송 거리(청색)를 몰비 A1M:헴에 대해서 플롯팅하였다. 2회 반복 실험의 평균 값을 나타낸다: wt-A1M(채워진 기호), 35-A1M(빈 기호). C. A1M 및 헴을 혼합하고(각각 32 및 19μM), 2시간 동안 20℃에서 인큐베이션시키고, 스캔하였다. 32μM에서의 단백질 단독의 흡광도를 비교로서 나타낸다. 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0 + 0.15M NaCl)의 흡광도를 블랭크로서 모든 스캔으로부터 뺄셈하였다.
도 12
M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)의 효소 특성의 비교. A. 다양한 농도에서 새로 정제된 wt-A1M(■) 또는 35-A1M(○)을 마이크로타이터 플레이트 웰 내에서 25mM 인산나트륨 완충액 pH 8.0 중에서 56μM로 ABTS-라디칼과 혼합하고, 환원 속도 이후에 95초 동안 405㎜에서 흡광도를 판독하였다. 각각의 농도에 대한 흡광도를 시간에 대해서 플롯팅하고, 0 내지 95s에서의 곡선하 면적(AUC)을 각각의 농도에 대해서 계산하였다. 완충액 단독의 AUC를 뺄셈함으로써 순 AUC를 계산하였다. 3개 반복물의 평균 +/- SEM을 나타낸다. B. 7일 동안 4℃ 또는 실온 및 0.1 또는 1mM에서 저장한 후 wt-A1M(■) 또는 35-A1M(○)을 사용하여 A에 기술된 바와 같이 ABTS-환원 속도를 결정하였다. 단일 실험을 나타낸다. C. wt-A1M(■) 또는 35-A1M(○)의 희석물 시리즈(0 내지 10μM)를 100μM의 사이토크롬 c+100μM의 NADH과 혼합하고, 550㎜에서 20분 동안 흡광도의 증가를 지켜봄으로써 사이토크롬 c의 환원을 조사하였다. 검정을 2회 수행하였다. 각각의 농도에 대해서 AUC를 계산하고, 완충액 단독의 AUC를 뺄셈함으로써 순 AUC를 계산하였다. 2회의 독립적인 실험의 순 AUC +/- SEM으로서 데이터를 제공한다. 오브알부민을 음성 대조군으로서 사용하였다. D. ORAC 검정으로 항산화 능력을 조사하였다. 5μM에서 A1M-변이체의 활성도를 트롤록스 표준품과 비교하고, 트롤록스 당량의 수로서 표현하였다. 각각의 검정을 3개 반복물에서 수행하고, wt-A1M의 결과를 100%로 설정하였다. 제시된 데이터는 2개의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM이다.
도 13
96-웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 웰당 105개 세포로 배양된 K562 세포를 M8H4DK-wt A1M (wt-A1M) 또는 M8H4DK-35-A1M (35-A1M)의 희석물 시리즈(0 내지 10μM)의 존재 하에서 1시간 동안 100μM 헴에 노출시켰다. 배지로의 LDH의 방출로서 세포사를 모니터링하였다. 살아있는 세포로부터의 LDH-값을 뺄셈하고, A1M 없이 헴-인큐베이션된 세포의 신호를 100%로 설정하고, A1M 인큐베이션의 값을 이와 관련하여 계산하였다. 검정을 2개 복제물에서 수행하였다. 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균 결과(Mean +/-SEM)를 나타낸다. Wt-A1M(■) 또는 35-A1M (○).
도 14
HK-2 세포를 0 내지 20μM의 M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)(■ 및 흑색 칼럼으로 나타냄) 또는 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)(○ 및 백색 칼럼으로 나타냄)을 동시에 첨가하고 또는 동시에 첨가하지 않고 6시간 동안 200μM(NH4)Fe(SO4)2, 400μM 과산화수소, 및 2mM 아스코르베이트(펜톤(Fenton) 반응, A 및 B에 나타냄)의 혼합물 또는 0 내지 30μM 헴(C 및 D에 나타냄)에 노출시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 WST-1(A 및 C에 나타냄) 또는 HO-1 및 Hsp70의 mRNA 발현(B 및 D에 나타냄)을 사용하여 세포 생존력에 대해서 분석하였다. 세포 생존력(A 및 C)을 미처리 세포로부터의 대조군 샘플에 대해서 정규화하였다. 결과는 3개 반복물 실험으로부터 유래하며, 평균±SEM으로서 제공된다. HO-1 및 Hsp70의 mRNA 발현(B 및 D)을 GAPDH에 대해서 정규화하고, 배수 변화로서 제공한다. 배수 변화 값을 미처리 세포로부터의 대조군 샘플에 대해서 정규화함으로써 계산하였다. 결과는 3개 반복물 실험으로부터 유래하며, 평균 ± SEM으로서 제공된다. 각각의 노출 및 대조군 상태 간의 차이를 사후 본페로니 교정(post hoc Bonferroni correction)과 함께 일측 ANOVA를 사용하여 분석하였다. *은 펜톤(B에 나타냄) 또는 헴(D에 나타냄)에 대한 통계학적 비교를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. wt-A1M 대35-A1M을 비교하는 경우 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다.
도 15
동물에서 정맥내로 주사된 M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)의 혈장 클리어런스(약동학, A에 나타냄) 및 생체분포(B에 나타냄). A. Wt-A1M(■) 또는 35-A1M(○)을 위스타 래트에게 주사하고(5㎎/㎏), 혈액을 규칙적인 간격으로 수집하였다. A1M-농도를 표준품으로서 특정 A1M-변이체를 사용하여 RIA에 의해서 결정하였다. 각각의 지점은 3개의 동물로부터 유래하고, 평균±SEM으로 제공된다. B. Wt- 또는 35-A1M, 5㎎/㎏을 C57BL/6NRj-마우스에게 정맥내로 주사하였고, 이것을 주사 후 10분 및 30분에 희생시켰다. 기관을 샘플링하고, 칭량하고, 균질화하였다. 주사된 (인간) A1M의 농도를 샌드위치-ELISA에 의해서 결정하였다. 각각의 막대는 3마리의 동물로부터 유래하고, 평균±SD으로서 제공된다. Wt-A1M, 10분(흑색) 및 30분(어두운 회색); 35-A1M, 10분(백색) 및 30분(밝은 회색).
도 16
암컷 C57BL/6 마우스를 글리세롤(2.0㎖/㎏, i.m.)에 노출시키고, 그 다음 글리세롤 주사 후 30분에 M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)(어두운 회색 막대, n=10), M8H4DK-35-A1M(35-A1M)(백색 막대, n=10) 또는 비히클 완충액(샴(Sham) 대조군, 회색 막대, n=6) 중 어느 하나를 i.v. 투여하였다. 4시간(글리세롤 투여 후)에, 동물을 안락사시키고, 신장을 절제하고, 스냅을 동결시키고, 그 다음 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 실시간 PCR을 사용하여 HO-1(A) 및 Hsp70(B)의 mRNA 발현에 대해서 분석하였다. mRNA 발현을 GAPDH의 것에 대해서 정규화하고, 미처리 동물(대조군)로부터의 대조군 샘플에 대해서 정규화함으로써 배수 변화 값을 계산하였다. 결과를 중간값 및 25분위 및 75분위를 나타내는 박스 플롯으로 제공한다. 사후 본페로니 교정과 함께 ANOVA에 의해서 군들 간의 통계학적 비교를 수행하였다. *는 글리세롤에 대한 통계학적 비교를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01. wt-A1M 대 35-A1M을 비교하는 경우 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다.
본 발명은 하기 실시예에 추가로 예시된다. 실시예는 예시이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실험
실험 작업을 3가지 주요 단계로 나누었다.
단계 I) 상기에 기술된 27종 A1M-변이체의 발현, 그 다음 용해도, 안정성 및 기능의 분석;
단계 II) 단계 1의 결과를 기초로 예상된 최적의 특성을 갖는 소수의 A1M-변이체의 설계, 발현 및 분석;
단계 III) wt-A1M 및 N-말단 태그가 있거나 또는 없는 가장 성공적인 돌연변이된 A1M-변이체의 설계, 발현 및 분석.
단계 I에서, 돌연변이된 아미노산 측기의 위치 및 아이덴터티를 선택할 때 4개의 추리를 사용하였다: 1) 산화성 스트레스, 온도, 산소 압력과 관련하여 상이한 예상된 환경 압력을 갖는 다양한 종으로부터의 동물 동족체를 발현시켰음(N=12); 2) 루프 1 내지 4 또는 소수성 포켓의 내면에 위치된 위치에서의 56개의 서열결정된 A1M-동족체 중에서 자주 일어나는 단일 아미노산 치환을 인간 유전자 작제물 내에 도입하고, 발현시켰음(N=3); 3) 이들이 C35 티올릴의 pKa에 영향을 줄 수 있거나(Allhorn et al., 2005), 라디칼-트랩핑 부위로서 제공된다
는 가설을 기초로 하여, 유리하게 위치된 라이실 또는 타이로실 잔기를 첨가 또는 제거하였음(N=5); 4) 기능 및 접힘에 예상된 영향이 없는, 단백질의 표면 상의 소수성→친수성 치환(N=7).
물질 및 방법
발현
A1M 변이체의 서열을 DNA2.0, 인크.(DNA2.0, Inc.)(미국 소재)에 제공하였고, 여기서 유전자를 합성하고, 그것을 그의 PJ401Express 벡터(T5 프로모터, 카나마이신 내성) 내로 클로닝하였다. DNA 서열을 서열결정에 의해서 확인하였다. 벡터를 제조사의 지시서에 따라서 수용성(competent) 이. 콜라이(BL21 Star(DE3)(인비트로젠(Invitrogen), 라이프 테크놀로지스 코프(Life technologies corp), 미국 소재) 내에서 형질전환시키고, 각각의 변이체의 4개의 개별 클론을 미세-발현에 대해서 시험하였다. 각각의 변이체의 최고 발현을 갖는 클론을 글리세롤 스톡으로서 제조하였고, 이것을 생산 발현을 위해서 사용하였다.
A1M 변이체 발현 클론을 완전 NYAT(15mM (NH4)2SO4, 84mM K2HPO4, 23mM NaH2PO4xH2O, 2.2mM (NH4)2H 시트레이트, 1%(w/v) 글루코스, 2mM MgSO4, 9μM CaCl2x2H2O, 85μM FeCl3x6 H2O, 1.3μM ZnSO4x7 H2O, 1.3μM CuSO4x5 H2O, 1.8μM MnSO4x H2O, 1.5μM CoCl2x6 H2O, 108μM EDTA, 50㎍/㎖ 카나마이신) 중에서 1.5의 OD600까지 성장시켰다. 이어서, 1mM IPTG의 첨가에 의해서 단백질 발현을 유도하였다. 생산을 4시간 동안 계속하였다. SDS-PAGE 분석을 위한 샘플을 유도 전, 유도 1, 2, 3 및 4시간 후에 취하였다.
정제
배양물로부터의 박테리아를 5000rpm에서, 15분 동안의 원심분리에 의해서 수집하였다. 박테리아 펠릿을 5회 동결-해동 사이클에 의해서 용해시키고, 20mM 트리스-HCl pH 8.0 중에 3회 희석시키고, 초음파처리하였다. 봉입체(IB)를 6000rpm에서, 30분 동안 원심분리에 의해서 수집하고, 재현탁 및 원심분리의 3회 추가의 사이클에 의해서 세척하였다. 추출을 위해서, IB를 6M 구아니딘-염산염, 20mM 트리스-HCl pH 8.0(6M Gu-HCl) 중에 재현탁하고, +4℃에서 밤새 교반하면서 인큐베이션시켰다. 26000g에서 60분 동안의 고속 원심분리에 의해서 추출물을 투명하게 하였다. 상청액을 추가 투명화를 위해서 모으고, 펠릿을 또 다른 추출 사이클에 통과시켰다. 추출물의 상청액을 합하고, 뎁쓰 필터 여과(depth filter filtration)(KS50P 필터의 상부 상에 장치된 K700P 필터, 폴 코프.(Pall Corp.), 미국 소재)에 의해서 추가로 투명화하였다. 투명해진 추출물 중의 A1M을 Ni-아가로스 수지(시그마-알드리치, 미국 소재)를 사용하여 정제하였다. 간략하면, 수지를 10-㎖ 일회용 크로마토그래피 칼럼(바이오-라드, 미국 소재)에 충전하고, 6M Gu-HCl 중에서 평형화하엿다. A1M 추출물을 자유-유동을 사용하여 칼럼 상에 적용하고, 통과액을 수집하였다. 칼럼을 5배의 칼럼 체적의 6M Gu-HCl로 세척하고, 이어서 4배 부피의 6M Gu-HCl + 0.5M 이미다졸로 용리시켰다. 출발 물질, 통과액 및 용리된 분획을 에탄올로 침전시키고, 1xSDS-PAGE 로딩 완충액 중에서 분할시키고, SDS-PAGE에 의해서 분리하였다. 통과액이 상당한 양의 A1M을 함유하면 정제 절차를 반복하였다. 추출물의 단백질 함량을 흡광도 280㎜에 의해서 결정하였다.
Ni-아가로스 용리물을 5.0의 근사치 A280까지 희석시키고, +4℃까지 냉각시킨 후, 재폴딩시켰다. 이어서, 용리물을 20mM 트리스-HCl pH 9.5 + 0.1M NaCl 중의 2/3 부피의 0.275M L-시스테인과 혼합하였다. 이어서 16.7 부피의 재폴딩 완충액을 신속하게 첨가하였다. 최종 완충액 농도는 다음과 같았다: (0.2㎎/㎖ A1M, 0.1M 트리스, 0.6M NaCl, 0.45M L-아르기닌, 2mM EDTA, 10mM L-시스테인 및 1mM L-시스테인, pH 9.5). 이어서 혼합물을 1시간 동안 +4℃에서 교반하고, 용액을 센트리콘 플러스(Centricon plus) 70, 10K 초미세여과 장치(머크 밀리포어(Merck Millipore); 미국 소재)를 사용하여 A1M 용액의 초기 부피까지 농축하였다. 농축 후, A1M 용액을 동일한 장치를 사용하여, 10회의 연속적인 2.5x 희석/농축 사이클에 의해서, 20mM 트리스-HCl pH 8.0로 투석여과하였다. 투석여과 후, 용액을 15000g에서 15분 동안의 원심분리에 의해서 투명화하였고, 이어서 0.2㎛ 필터에 통과시켰다.
재폴딩된 A1M을 즉시 20mM 트리스-HCl pH 8.0으로 평형화된 5㎖ 바이오-스케일 미니 우노스피어 Q 카트리지(Bio-Scale Mini UNOsphere Q Cartridge)(바이오-라드)에 적용하였다. 칼럼을 카트리지에 대한 바이오-라드의 지시서에 따라서 
정제기 10 장비(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 소재) 상에서 구동시켰다. 샘플 적용 후 칼럼을 5배 칼럼 체적(CV)의 20mM 트리스-HCl pH 8.0으로 세척하고, 그 후에 0에서 0.35M NaCl로의 20CV 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. 마지막으로, 칼럼을 1M NaCl의 3배 CV로 세척하였다. 선형 구배 동안 수집된 통과액 및 선택된 분획을 SDS-PAGE에 의해서 분석하였다. 잔류하는 A1M을 갖는 통과액을 새로운 칼럼 상에서 즉시 통과시키고, A1M 함유 분획을 풀링시키고, 100μM로 농축시키고, 멸균 필터하고, 분취물 중에서 -20℃에서 동결시켰다.
젤 전기영동법
SDS-PAGE를 표준 프로토콜을 사용하여 램리(Laemmli)(Laemmli, 1970)에 따라서 실시하였다. 단백질을 무착색제 4 내지 20% TGX 젤(바이오-라드) 상에서 300V에서 17분 동안 분리하였다. 네이티브 PAGE를 SDS 없이, 그리고 환원제 없이 무착색제 4 내지 20% TGX 젤 상에서 200V에서 40분 동안 실시하였다. 젤을 케미독(Chemidoc) MP 장비(바이오-라드) 상에서 분석하였다
원편광 이색성(Circular Dichroism)
2-mm 큐벳에서 20mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.15M NaCl 중의 10μM 용액의 원편광 이색성 스펙트럼을 자스코(Jasco)-J180 분광형광계 장비(자스코 인크.(JASCO Inc.), 일본 소재) 상에서 보고하였다. 용액을 +22℃에서 190 내지 260㎜에서 스캔하였다. 각각의 샘플에 대해서 3회 실시를 더하였다. α-헬릭스 및 β-시트 구조의 백분율을 http://k2d3.ogic.ca 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
SEC-FPLC
단백질을 24-㎖ 슈퍼로스(Superose) 12 10/30 GL 칼럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 
정제기 10 장비 상에서 크기 배제에 의해서 분석하였다. 칼럼을 1㎖/분의 유량을 사용하여 20mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.15M NaCl로 평형화하였다. 100 내지 200㎍의 단백질을 100㎕의 부피로 칼럼 상에 적재하고, 0.75㎖/분의 유량을 사용하여 20mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.15M NaCl로 용리시켰다. 전형적으로, 단량체 A1M은 15㎖/20분 후에 용리되었고, 이량체는 13 내지 14㎖/18 내지 19분에 용리되었고, 큰 응집물은 8㎖/12분 후에 용리되었다. 큰 응집물의 백분율을 총 피크 면적과 비교하여 8-㎖ 피크하 면적으로부터 계산하였다. 처리 샘플 대 미처리 샘플의 총 피크 면적을 비교함으로써 스트레스 처리(하기 참조) 후 칼럼 상에 회수된 총 단백질의 백분율을 계산하였다.
RP-HPLC
역상 HPLC를 애질런트 1260 인피니티 바이너리(Agilent 1260 Infinity Binary) LC 시스템 상에서 애리스 와일드포어(Aeris Wildpore) 3.6μM XP-C8 칼럼(페노메넥스 인크.(Phenomenex Inc.), 미국 소재)을 사용하여 실시하였다. 칼럼을 1㎖/분의 유량을 사용하여 +25℃에서 실시하였고, 70% H2O+0.1% TFA와 30% 아세토나이트릴+0.1% TFA의 혼합물로 평형화시켰다. 10㎕(=10㎍의 단백질)를 적재하고, 30에서 50%로의 아세토나이트릴의 선형 구배로 20분에 걸쳐서 용리시켰다. 95% 아세토나이트릴로의 10분 동안의 세척에 의해서 칼럼을 재생시켰다.
동적 광 산란
스트레스 받지 않은 샘플 및 전단-스트레스 받은 샘플의 동적 광 산란(DLS) 분석을 사모닉스 바이오스트럭쳐 에이비.(룬드 소재)의 서비스를 사용하여 수행하였다. 10mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.125M NaCl 중에 10μM로 희석된 A1M 샘플을 맬번(Malvern) APS 장비 상에서 +20℃에서 분석하였다, 샘플을 2개 복제물에서 제조하고, 각각의 샘플을 3회 모니터링하였다.
시차 주사 형광측정법
A1M 변이체의 열안정성을 사모닉스 바이오스트럭쳐 에이비(룬드 소재)의 서비스를 사용하여 시차 주사 형광측정법(DSF)에 의해서 분석하였다. 10mM HEPES pH 8.0 + 0.125M NaCl 중에 4.4μM로 희석된 A1M을 SYPRO 오렌지(총 SYPRO 오렌지 1000x 희석)와 혼합하였다. 분석을 2개 복제물에서 수행하였고, 평균 용융 온도,(Tm)를 계산하였다.
전단력에 의한 스트레스의 도입
10㎕의 100-μM A1M 용액을 0 내지 10㎕ 피펫 팁을 사용하여 다중 채널 피펫으로의 80회 피펫팅에 의해서 전단력 스트레스에 노출시켰다. 스트레스-처리를 2개 복제물에서 수행하였다. 피펫팅 후, 2개 복제물을 합하고, 10배 희석한 후 기술된 바와 같이 DLS로 분석하였다.
고농도-유도된 스트레스
A1M의 용해도 및 안정성을 고농도에서 분석하였다. 500㎕의 100μM A1M 용액을 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-0.5, 10K 장치(머크 밀리포어)를 사용하여 14000g에서 10분 동안의 원심분리에 의해서 50㎕로 10배 농축하였다. 농축 후, 각각의 통과액을 사용하여 부피를 정확하게 50㎕로 맞추었다. 농축 샘플 및 비농축 샘플(10㎍)을 네이티브 PAGE 상에서 나란하게 비교하였다. 상이한 완충액의 영향을 농축 전 샘플의 투석여과에 의해서 관찰하였다. 아미콘 울트라-15, 10K 장치에서의 5회 사이클 10회-회석/농축에 의해서 이를 수행하였다.
유리 티올기의 정량화
A1M 변이체의 유리 티올기를 몰레큘러 프로브(Molecular probe)로부터의 "티올 및 설파이드 정량화 키트"를 사용하여 결정하였다. 키트 메뉴얼에 따라서 96-웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 3㎕ 표준품 또는 A1M(100μM)의 부피를 3㎕의 시스타민 작업 용액, 100㎕ 파파인-SSCH, 100㎕ L-BAPNA와 혼합하였다. 흡광도 405㎜로서 검정을 판독하였다.
ABTS 환원 검정
검정은 
의 변형이다. 7mM의 2,2 아지노-비스 (3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 다이-암모늄염(시그마-알드리치)을 2.45mM K2S2O8로 밤새 산화시키고, 이어서 25mM 인산나트륨 완충액 pH 8.0 중에서 56μM로 희석시켰다. 100㎕의 ABTS 작업 용액을 96-웰 플레이트 내의 웰에 첨가하였다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 플레이트 리더를 사용하여 A405에서 시간-지점 0 측정을 수행하였다. 2㎕의 A1M 용액(0 내지 100μM)을 다중 채널 피펫에 의해서 신속하게 첨가하였다. 405㎜에서 흡광도 감소의 속도론은 95s동안 이어졌다. 현실적인 이유를 위해서 단지 8개 웰을 그 시기에 분석하였다. A1M 희석물 시리즈를 2회 반복물 또는 3회 반복물로 시험하였다. 분석될 샘플의 수가 몇몇 플레이트를 요구하면, 새로운 ABTS 스톡을 각각의 플레이트를 위해서 작업 스톡 중에 희석하고, wt-A1M 참조 샘플을 모든 플레이트에 포함시켰다. 각각의 농도에 대한 흡광도를 시간에 대해서 플롯팅하고, 곡선하 면적(AUC)을 각각의 농도에 대해서 계산하였다. 완충액 단독의 AUC를 뺄셈함으로써 순 AUC를 계산하였다.
산소 라디칼 항산화제 능력(ORAC) 검정
상업적인 키트 옥시셀렉트(OxySelect)(상표명) 산소 라디칼 항산화제 능력(ORAC) 활성도 검정(셀 바이오렙스, 인크. 미국 소재)은 퍼옥실 라디칼에 의한 형광 프로브의 산화 및 파괴를 기초로 한다. 항산화제가 존재하는 경우, 이러한 파괴가 저해된다. 표준품으로서 수용성 비타민 E 유도체, 트롤록스를 사용한다. 성능, 분석 및 계산은 키트 메뉴얼을 따랐고, 2.5 내지 5μM의 A1M 농축액이 표준 곡선에 정확히 맞았다. 오브알부민(시그마-알드리치)을 음성 단백질 대조군으로 사용하였다.
사이토크롬 c 환원 검정
검정을 문헌(Allhorn el al. 2005)으로부터 변형시킨다. 100μM 사이토크롬 c(시그마-알드리치) 및 100μM NADH를 10mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.125M NaCl 중에 혼합함으로써 작업 용액을 제조하였다. 11㎕의 A1M 용액(0 내지 100μM)을 96-웰 플레이트에 2회 반복물에 첨가하였다. 100㎕의 사이토크롬 c 작업 용액을 다중채널 피펫을 사용하여 웰에 신속하게 첨가하였다. 550㎜에서 흡광도 증가의 속도론은 20분 동안 이어졌다. 이 때 하나의 플레이트를 분석하였다. 시간에 따라서 어떤 편향도 관찰될 수 없었다. 몇몇 플레이트를 분석하려는 경우, 이러한 절차에 의해서 유발되는 어떠한 관찰 가능한 인공물 없이 모두에 대해서 동일한 작업 용액을 사용하였다. 측정 후, 결과를 ABTS 검정에 대해서 기술된 바와 같이 분석하였다.
적색-이동 검정
A1M 내의 유리 헴의 혼입은 소렛(Soret) 밴드 흡광도 피크의 적색-이동을 야기하고(Karnaukhova et al., 2014; Rutardottir et al., 2016), A1M-돌연변이체에서 A413/A386 비로서 평가되었다. 20mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.25M NaCl 중의 44μM A1M을 40μM 유리 헴(애플리켐(Applichem))과 혼합하였다. 인큐베이션을 2회 반복물에서 수행하였고, 2시간 실온에서 인큐베이션시켰다. 베크만 스펙트로포토미터(Beckman Spectrophotometer)에서 파장 스캔에 의해서 4배 희석된 샘플에서 적색-이동을 분석하였다. 2회 반복물의 평균 최대 피크뿐만 아니라 413 및 386㎜에서의 흡광도 간의 평균 비를 계산하였다. 오브알부민 및 완충액 단독을 음성 대조군으로서 사용하였다.
헴-아가로스에 대한 A1M의 특이적 결합
헴-아가로스에 대한 A1M의 결합을 문헌(Larsson et al., 2004)의 방법에 의해서 분석하고, 문헌(Rutardottir et al., 2016)에 기술된 바와 같이 변형시켰다. 헴-아가로스(시그마-알드리치) 및 대조군 세파로스 4B(시그마-알드리치)를 20mM 트리스-HCl pH 8.0 + 0.25M NaCl로 평형화시키고, 50% 슬러리로서 제조하였다. 75㎕의 A1M 희석물 시리즈(0 내지 13.3μM)를 2개 복제물 96-웰 플레이트에 첨가하였다(하나의 플레이트는 헴 아가로스에 대한 것이고, 하나는 대조군 세파로스에 대한 것임). 20㎕의 헴-아가로스 och 대조군 세파로스 슬러리를 유사한 양의 전달을 보장하기 위한 주의 깊은 피펫팅에 의해서 웰에 첨가하고, 30분 동안의 RT에서 회전 교반 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 주의 깊게 아크로프렙 어드밴스(AcroPrep Advance) 96-웰 필터 플레이트, 1.2μm 슈포(Supor) 막(폴 코프(Pall Corp))으로 옮겼다. 플레이트를 2분 동안 1000g에서 원심분리하여, 저-결합 마이크로플레이트에서 통과액을 수집하였다. 25㎕의 각각의 통과액, 뿐만 아니라 비-인큐베이션된 출발 물질을 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트(써모 사이언티픽 인크.(Thermo Scientific Inc.), 미국 소재)를 사용하여 단백질 함량에 대해서 검정하였다. 단백질 양을 헴- 및 대조군 세파로스-인큐베이션된 샘플 둘 모두에 대해서 결합된 양(통과액 중의 마이너스 양을 추가함)으로서 재계산하였다. 대조군 세파로스에 결합된 양의 뺄셈 후에, 헴 아가로스에 특이적으로 결합된 양을 첨가된 양에 대해서 플롯팅하였다. 곡선의 기울기를 선형 회귀로 계산하였다. 2개 복제물의 SD를 사용하여 A1M 변이체 간의 차이의 유의성을 평가하였다.
M8H4DK-wt A1M(Wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)의 헴
결합
헴 결합을 네이티브 PAGE(Karnaukhova et al., 2014) 및 UV-분광광도법 (Ruttarsdottir et al., 2016)에 의해서 이미 기술된 바와 같이 분석하였다. 간략하면, 네이티브 PAGE이 경우, A1M 및 다양한 농도의 헴을 트리스-완충액, pH 8.0 중에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 무착색제 12% 크리테리온(Criterion) TGX 젤 상에서 200V에서 40분 동안 네이티브 PAGE에 의해서 분리하였다. 젤 밴드를 케미독 MP 장비(바이오-라드) 상에서 무책색제 설정을 사용하여 트립토판 형광에 대해서 분석하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 착색하고, 탈착색하고, 쿠마시 설정을 사용하여 케미독 상에서 다시 영상화하였다. 이어서 밴드의 두 세트 모두를 이미지 랩(상표명) 소프트웨어(바이오-라드)를 사용하여 정량화하였다. 이어서, 헴 결합을 쿠마시 염색 후에 총 단백질 양에 대한 트립토판 형광의 켄칭 양으로서 추산하였다. 흡광도 스펙트럼을 베크만(Beckman)(베크만 인스트루먼먼츠(Beckman Instruments), 미국 캘리포니아주 플러톤 소재) DU 800 분광광도계 상에서 22℃에서 250 내지 700㎜ 사이의 UV-VIS 영역에서 600㎜/분의 스캔 비율을 사용하여 측정하였다. A1M 및 헴의 농도는 각각 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.15M NaCl 중에서 32 및 19μM이었다. 헴을 DMSO 중의 10mM의 스톡 용액으로부터 첨가하였다. 단백질 용액을 혼합 2시간 후 스캔하였다.
혈장 클리어런스 및 생체분포
혈장 클리어런스 연구를 위해서, 각각의 A1M-변이체를 6마리의 수컷 위스타 래트(5.0㎎/㎏; 20mM 트리스-HCl, pH 8.0 중의 스톡-용액)에게 정맥내(i.v)로 주사하고, 오버-샘플링을 회피하기 위해서 3마리의 래트의 군에서 상이한 샘플링 간격을 사용하여, 혈액 샘플을 주사 후 1, 5, 15, 30분, 및 1, 3, 6, 16 및 24시간에 EDTA-튜브에 취하였다. 혈장을 140xg에서 10분 동안 원심분리한 후 흡입시키고, 표준품으로서 특이적 A1M-변이체를 사용하여, 문헌(Gram et al. 2015)에 기술된 바와 같이 방사면역검정(RIA)에 의해서 A1M의 농도를 결정하였다. 생체분포 연구를 위해서, A1M-변이체를 C57BL/6NRj 마우스(5.0㎎/㎏; 20mM 트리스-HCl, pH 8.0 중의 스톡-용액)에게 i.v.로 주사하였다. 마우스를 주사 10분 후(n=3) 및 30분 후(n=3)에 에 희생시켰다. 기관을 샘플링하고, 칭량하고, 50㎕/㎖ 씨옴플레트 미니(cOmplete Mini), EDTA-무함유 프로테이나제 저해제 칵테일 정제(로슈(Roche), cat. no. 11836170001)를 함유하는 5:1(체적:중량) 세포 추출 완충액(인비트로젠, cat. No. FNN0011) 중에 균질화시켰다. 인-하우스 샌드위치 ELISA에 의해서 A1M-농도를 결정하였다. 간략하면, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 밤새 4℃에서 마우스 단클론성 항-A1M(클론 35.14, PBS 중의 5㎍/㎖)으로 코팅하고, 세척하고, 이어서 A1M-표준품(인간 소변 A1M)과 함께 인큐베이션시키고, 본 발명자들의 실험실에서 기술된 바와 같이 정제하거나
또는 조직 샘플을 균질화하고, 60분 동안 RT에서 인큐베이션 완충액(PBS + 0.05% 트윈(Tween) 20 + 0.5% 소 혈청 알부민) 중에 희석시켰다. 세척 후, 웰을 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 마우스 단클론성 항-A1M(클론 57.10, 인큐베이션 완충액 중의 5ng/㎖)과 함께 60분 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 슈어블루(SureBlue) TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질(KPL)과 함께 20분 동안 암실에서 인큐베이션시킴으로써 현상시키고, 마지막으로 1M 황산으로 중단시켰다. 흡광도를 왈락 1420 멀티레이블 카운터(Wallac 1420 Multilabel Counter)에서 450㎜에서 판독하였다. 2개의 마우스 단클론성 항체를 아리세라 에이비(AgriSera AB)(바나스(
), 스웨덴 소재)에 의해서 인간 소변 A1M에 의해서 증가시켰다. ELISA는 인간 A1M에 대해서 특이적이었고, 내인성 마우스 혈장 A1M과 교차-반응하지 않고, 인간 소변 A1M, M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)과 동등하게 잘 반응하였다.
횡문근융해증 유도된 신장 손상
본 연구는 동물 연구에 대한 윤리 위원에 의해서 
, no. M21-15로 승인받았다. 체중이 20.5 ± 0.7g인 암컷 C57BL/6 마우스를 타코닉(Taconic)(덴마크 소재)으로부터 입수하고, 12시간 암광 사이클이 있는 일정한 실온에서 와이어 뚜껑이 있는 유형 III 케이지에 넣었다. 온도(20±0.5℃) 및 상대 습도(50±5%)를 연구 전체에서 유지시켰다. 모든 동물은 음식(RM1(E) SQC, SDS, 영국 소재), 수돗물 및 풍요로운 환경에 자유롭게 접근하였다. 밤새 수분 제한(15시간) 후 동물을 칭량하고, 아이소플루란을 사용하여 마취시키고, 이어서 하기 4개의 군으로 배정하였다: 1) 대조군(n=6), 근육내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 투여 제공되지 않음; 2) 글리세롤 (n=10), 50% 멸균 글리세롤(테크노바(Teknova), 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)이 i.m.(2.0㎖/㎏ 체중, 단일 용량, 뒷 다리 모두에 분할 투여됨)으로 제공됨; 3) 글리세롤 + M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)(n=10), wt-A1M이 i.v.(7㎎/㎏ 체중, 단일 용량)로 글리세롤 글리세롤 i.m.(2.0㎖/㎏ 체중) 투여 30분 후에 제공됨; 및 4) 글리세롤 + M8H4DK-35-A1M(35-A1M)(n=10), 35-A1M i.v.(7㎎/㎏ 체중, 단일 용량)이 글리세롤 i.m.(2.0㎖/㎏ 체중) 투여 30분 후에 제공됨. i.m. 투여 후에, 동물을 깨어나는 동안 따뜻한 패드에 놓고, 이어서 그의 케이지에 다시 넣고, 음식 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 4시간(글리세롤 주사 후) 후에, 동물을 아이소플루란을 사용하여 마취시키고, 하기에 기술된 바와 같이 RNA 추출 및 그 다음 mRNA 평가를 위해서 신장을 수집하였다.
RNA 단리 및 실시간 PCR
전체 RNA를 지모 리서치(Zymo Research)(미국 캘리포니아주 이리빈 소재)에 의해서 공급된 다이렉트-졸(Direct-zol)(상표명) RNA 미니프렙을 사용하여 HK-2 세포로부터 또는 뉴클레오스핀 RNA/프로테인(NucleoSpin RNA/Protein)(머처리-나젤(Machery-Nagel), 독일 두렌 소재), 그 다음 RNeasy(등록상표) 미니 키트(퀴아젠(QIAGEN), 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재)를 사용하여 마우스 신장으로부터 단리하였다. RNA의 OD 비(260㎜/280㎜에서의 광학 밀도)는 항상 1.9보다 높았다. 역전사를 제조사에 따라서 1.0㎎의 총 RNA 상에서 아이스크립트(iScript)(상표명) cDNA 합성 키트(바이오-라드, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 수행하였다. RT2 qPCR 프라이머 검정(퀴아젠으로부터의 인간(HK-2 세포) 및 마우스(신장) 프라이머)을 사용하여 헴 옥시게나제 1(HO-1) 및 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 mRNA 발현을 정량화하였다. 데이터를 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(인간(HK-2 세포) 및 마우스(신장) GAPDH, 퀴아젠으로부터의 RT2 qPCR 프라이머 검정)에 정규화시켰다. 데이터를, 시험관내 데이터의 경우 평균 ± SEM을 나타내는 칼럼으로서 제공하고, 생체내 데이터의 경우 중간값 및 25분위 및 75분위를 나타내는 박스 플롯으로 제공한다. 미처리 세포 또는 동물(대조군)으로부터의 대조군 샘플에 대해서 정규화함으로써 배수 변화값을 계산하였다. 발현을 iTaq(상표명) 유니버설(Universal) SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(바이오-라드)를 사용하여 분석하였다. 제조사(바이오-라드)에 의해서 기술된 바와 같이 아이사이클러 써멀 사이클러(바이오-라드)에서 40회 사이클 동안 증폭을 수행하고, 아이사이클러 아이큐 옵티컬 시스템 소프트웨어(iCycler iQ Optical System Software)(바이오-라드)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
헴 유도된 세포사로부터의 K562 세포의 구조
A1M은 인간 적혈구 K562 세포의 헴-유도된 세포사를 저해하는 것으로 이미 밝혀져 있다(Olsson et al., 2008). 세포를 글루타맥스 + 10% FCS 및 항생제를 갖는 DMEM(깁코(Gibco), 라이프 테크놀로지스 코프., 미국 소재) 중에서 ATCC에서 지시서에 따라서 배양하였다. 세포를 세척하고, 페놀 레드 및 FCS가 없지만 글루타맥스 I 및 항생제가 보충된 DMEM(깁코) 중에서 재현탁하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 105 세포로 시딩하고, 0 내지 10μM A1M 희석물 시리즈의 존재 하에서 100μM 헴에 노출시켰다. 세포사에 대한 양성 대조군으로서, LDH 검출 키트(하기 참조)로부터의 10㎕의 용해 용액을 첨가하였다. 세포를 37℃ CO2-인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 350g에서 4분 동안 신속하게 원심분리한 후, 사이토톡스(cytoTox) 96(등록상표) 논-라디오(Non-Radio)를 사용하여 LDH 방출의 분석을 위해서 50㎕의 배지를 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 제조사의 지시서에 따른 세포독성 검정(프로메가 바이오테크 에이비(Promega Biotech AB), 스웨덴 소재). 헴-유도된 세포는 전형적으로 살아있는 세포와 비교할 때 7배 더 높은 신호 및 완전히 용해된 세포의 신호의 70%를 제공하였다. 헴- 또는 A1M-첨가 없이 인큐베이션된 세포의 평균 신호를 모두로부터 뺄셈하고, 헴 단독-인큐베이션된 세포의 신호를 100%로 설정하였다. 모든 다른 신호는 이 값에 관련되었다. 이러한 절차는 몇몇 독립적인 실험의 비교를 가능하게 하였다.
HK-2 세포의 보호
인간 신장 피질 근위 세관 상피 세포(HK-2, ATCC(등록상표(CRL-2190, ATCC, 영국 테딩톤 소재)를 소 뇌하수체 추출물(BPE, 0.05㎎/㎖) 및 표피 성장 인자(5 ng/㎖)(모두 인비트로젠 제품, 영국 페이슬레이 소재)가 보충된 케라티노사이트 무혈청 배지(K-SFM) 중에서 배양하였다. 세포가 대략 80 내지 90%의 컨플루언스에 도달하면, A1M(0 내지 20μM, M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M))을 동시에 첨가하면서 또는 첨가되지 않으면서 헴(새로 제조된 10mM 스톡 용액으로부터의 0 내지 30μM) 또는 (NH4)Fe(SO4)2, 과산화수소, 및 아스코르베이트(0 내지 200μM, 펜톤 반응)의 혼합물을 첨가하고, 세포를 6시간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 제조사의 지시서에 따라서 WST-1을 사용하여 세포 생존력에 대해서 분석하였다(세포의 측정된 대사 활성도, 예를 들어, 가용성 포마잔 염료에 대한 WST-1 안정한 테트라졸륨 염의 세포 절단의 척도는 생존 가능한 세포의 수에 직접적으로 관련됨)(로슈 다이어그나스틱스(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임 소재). 세포 생존력을 미처리 세포로부터의 대조군 샘플에 대해서 정규화하였다. 평행 배양물을 퀴아졸(Qiazol)(상표명) 용해 시약(RNA 추출의 경우, 퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재)을 사용하여 수거하였다. 전체 RNA를 세포로부터 추출하여 하기에 기술된 바와 같이 mRNA 발현을 평가하였다.
통계학
사후 본페로니 교정을 사용하여 ANOVA에 의해서 미관련 군 간의 비교를 수행하였다. 0.05 미만의 P-값을 유의한 것으로 간주하였다.
결과 및 논의
프로젝트 개요
본 조사의 목적은 보존된 기능적 특성을 갖는 A1M의 보다 안정적이고 가용성인 변이체를 식별하는 것이다. 3단계로 프로젝트를 수행하였다. 단계 I에서, 인간 A1M의 상이한 종 및 점 돌연변이의 A1M을 스크리닝하여 기능을 손상시키지 않으면서 안정성에 대해서 긍정적인 효과를 갖는 개별 아미노산을 식별하였다. 단계 II에서, 단계 I에서 긍정적인 효과를 갖는 것으로 밝혀진 아미노산을 조합하여 보다 더 양호한 조합물을 발견하였다. 마지막으로 단계 III에서, 단계 I 및 II로부터의 데이터를 확인하고, 상이한 N-말단 태그의 효과를 조사하였다. 3단계 모두에서, 단백질을 동일한 벡터 및 정제 프로토콜을 사용하여 동일한 이 콜라이계에서 발현시켰다. 모든 변이체를 각각의 단계 내에서 유사한 프로토콜 및 절차를 사용하여 동시에 발현, 정제 및 분석하였다. 각각의 단계의 분석 패널을 표 1에 요약한다. 모든 작제물의 아미노산 및 DNA 서열을 하기에서 찾아볼 수 있다.
A1M 변이체 작제의 근거
인간 wt-A1M, 다양한 종으로부터의 11개의 A1M-동족체, 및 점 돌연변이를 갖는 15개의 A1M-변이체, 즉 총 27개의 A1M-변이체를 단계 I에서 작제, 발현, 정제 및 분석하였다(표 2). 11개의 A1M-동족체를 하기와 같이 선택하였다. A1M은 종들 간에 잘 보존된다. 상이한 종의 A1M 서열을 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov 및 www.uniprot.org)에서 탐색하였다. 67개의 상이한 종으로부터의 AMBP 서열을 발견하였다. 서열을 A1M-특이적 작용기(K69, K92, K118, K130, Y22; Y132, H122 및 H123), 리포칼린 모티프(SCR1, 2, 3)(도입부의 참고 문헌 참조) 및 예측된 탄수화물 결합 부위(Escribano et al., 1990)의 존재에 대해서 조사하였다. 5개를 비-A1M으로서 분류하고, 배제시켰는데, 그 이유는 그것이 시스테인 34가 없기 때문이었으며, 3개를 배제시켰는데, 그 이유는 그것이 시스테인 169가 없기 때문이었으며, 4개를 배제시켰는데, 그 이유는 그것이 불완전하기 때문이었으며, 2개를 배제시켰는데, 그 이유는 그것이 긴 의심스러운 삽입부를 갖기 때문이었다. 남아있는 53개의 동족체의 아미노산 서열을 정렬하고, 그의 아미노산 서열을 인간 A1M의 결정 구조(Meining and Skerra, 2012) 상에 투사하여 리포칼린 루프 내의 또는 포켓의 내면 또는 외면 상의 개별 아미노산 측쇄의 위치를 식별함으로써 그의 제안된 3D 구조를 모델링하였다. 이러한 결과를 하기에 기술된 바와 같은 A1M-기능에 영향을 주는 점 돌연변이의 작제를 위해서 사용하였다. 최종 11개의 동족체(표 2 참조)의 선택에 대한 근거는 널리 퍼진 진화 표면, 방법론적 실행 가능성, 종의 서식지에서 가능하게 증가된 환경적 산화 스트레스, A1M-특이적 작용기의 유무, 글리코실화의 결핍의 조합이었다. 점 돌연변이를 갖는 15개의 A1M-변이체를 하기와 같이 선택하였다. 변이체 중 8개는 기능적 특성을 위해서 전략적인 아미노산에서 돌연변이되었고, 7개의 변이체는 노출된 위치에서 안정성/용해도를 개선시키기 위함이다(표 2). 8개의 기능적 돌연변이가 선택되었는데, 그 이유는 그것이 1) A1M의 기능에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 3D 구조 모델(상기 참조)에서의 위치에서 다른 종에서 발생하였고/거나, 2) 시스테인 34의 pKa를 잠재적으로 낮출 수 있고/있거나, 3) 여분의 라디칼 트랩핑 부위를 이론적으로 제공할 것이기 때문이다. 모든 변이체에 대해서 예측된 데이터는 http://www.alphalyse.com/gpmaw_lite.html 툴(표 3)을 사용하여 계산하였다.
단계 I
변이체를 평행 진탕-플라스크에서 발현시켰다. 발현 수준에서 변이가 존재하였고, 소수의 A1M-변이체의 경우 발현은 타당한 단백질 양을 수득하기 위해서 수회 반복되어야 했다. 양호한 발현 및 정제 후 상대적으로 많은 양이(10㎎/L 배양물 초과) 마우스, 다람쥐 원숭이, 바다코끼리, 오랑우탄, M41K, R66H, T75Y, M99K, N17,96D, T45K 및 V148D에 대해서 수득되었다. 정제된 단백질의 발현 및 양은 유사한 조건 하에서 발현 및 정제된 인간 wt A1M에 대한 이전 수율(12㎎/L)과 유사하였다. 더 낮은 수율(1 내지 10㎎/L)을 초래하는 더 낮은 발현 수준을 갖는 변이체는 벌거숭이 두더지쥐, 개구리, 토끼, 매너티, P35K, T75K, S101Y, L89T, V170S 및 G172Q였다. 닭, 넙치 및 실러캔스 A1M은 1㎎/L 배양물 미만의 정제 수율을 초래하는 최적보다 낮은 발현 수준을 나타내었다. 4중 인간 돌연변이체 K69,92,118,130R를 웰에서 발현시켰지만, 성공적으로 재폴딩시키는 것은 불가능하였다. 또한, T75K-A1M은 정제 동안 증가된 침전 경향성을 나타내었다.
95% 순도로 정제된 닭 및 실러캔스 A1M을 제외하고, 모든 변이체를 SDS-PAGE에 따라서 99% 초과의 순도로 정제하였다. SDS-PAGE에 따라서, 모든 변이체는 최대 0.5%의 공유 이량체를 함유하였고, 변이체 간에 주요 차이가 없었다. 원편광 이색성은 주요 차이 없이 모든 변이체에 대해서 약 2% 알파 헬릭스 및 40% β-시트 구조를 나타내었는데, 이는 A1M에 대해서 예측된 값이다(Kwasek et al., 2007). 정제 후, 모든 변이체를 표 4에 요약된 바와 같이 분석하였다. 먼저, 안정성 및 용해도를 분석하였다. 새로 동결되고, 스트레스 받지 않은 0.1mM 단백질 용액의 응집 경향성 및 열안정성을 동적 광 산란(DLS), PAGE(응집) 및 시차 주사 형광측정법(DSF)(열안정성)에 의해서 분석하였다. 또한, 전단력 및 1mM로의 농축에 대한 반응에 대한 응집물의 경항성을 조사하였다. 인간 wt A1M은 이들 검정에서 비교적 잘 분석되었지만(표 4), 일부 변이체는 안정성/용해도 특성에서 보다 양호하게 분석되었다: 닭 A1M, 매너티 A1M 및 N17,96D-A1M. 닭 및 매너티 A1M은 너무 많은 위치에서 인간 wt A1M과 상이하여 인간 A1M에 이로운 개별 아미노산에 대해서 추정할 수 없어서, 추가 연구에서 사용하지 않았다. 기능적 특성을 조사하는 경우, M41K 및 R66H는 동일한 기능(R66H) 또는 개선된(M41K) 기능을 갖는 것을 발견하였다. 이들 변이체는 또한 대부분의 다른 변이체보다 더 높은 열안정성 및 응집에 대한 단지 약간 높은 경향성을 가졌기 때문에, 이들을 추가 연구를 위해서 선택하였다. 따라서, N17,96D-A1M, M41K-A1M 및 R66H-A1M을 프로젝트의 단계 II에서 계속 사용하였다.
단계 II
본 프로젝트의 단계 II의 목적은, 이로운 돌연변이(M41K, R66H 및 N17,96D)를 조합하여 유사하거나 개선된 기능을 갖는 보다 더 안정적인 변이체가 작제될 수 있는지를 조사하는 것이었다. 또한, 인간 wt A1M에 대해서 사용된 동일한 N-말단 태그(M8H4DK)를 도입하였다(표 5). 따라서, 새로 조합된 M8H4DK-변이체를 M8H4DK-인간 wt와 비교하였다.
모든 4개의 새로운 변이체(M8H4DK-M41K+R66H, M8H4DK-M41K+N17,96D, M8H4DK-R66H+N17,96D 및 M8H4DK-M41K+R66H+N17,96D)는 매우 잘 발현되었고, 29, 13, 37 및 15㎎의 순수한 단백질/L의 수율을 달성하였다. 4개의 새로운 변이체를 SDS-PAGE에 따라서 99% 초과의 순도로 정제하였고, 이들은 대략 2%의 공유 이량체를 나타낸 M8H4DK-M41K+R66H를 제외하고는 동일하거나 더 낮은 백분율의 공유 이량체를 나타내었다.
가용화/안정성 특성을 분석하였다(표 6a). 데이터는 M41K와 R66H의 조합물이 열안정성에 대해서 최적보다 낮았음을 나타내었다. 다른 한편, N17,96D 돌연변이는 일반적으로 가용화 및 안정성에 이로웠고, R66H를 갖는 조합물(즉, M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M)은 보다 더 양호한 가용화 및 안정성을 나타내었다.
기능성 특성을 분석하였다(표 6b). 데이터는, M41K 돌연변이가 증가된 헴 환원 능력을 갖지만, 헴 결합을 감소시켰다는 것을 나타내었다. 그러나, M41K 돌연변이가 N17,96D와 조합되는 경우, 그것은 헴-유도된 세포사로부터 세포를 구조할 가능성이 더 낮다는 것을 나타내었다. R66H+N17,96D 조합물은 조사된 모든 기능적 양상에서 wt-A1M과 비교할 때 유사한 결과를 산출하였다. 따라서, M8H4DK-태깅된 R66H+N17,96D A1M은 단계 II 이후에 유망한 후보자이지만, M41K-돌연변이는 덜 유용하다.
[표 6a]
[표 6b]
단계 III
단계 III의 첫 번째 목적은, 동일한 조건 하에서 동시에 발현되는 경우, M8H4DK-태깅된 R66H+N17,96D-A1M을 wt-A1M 및 단계 I 및 II의 유망한 M8H4DK-태깅된 단일 돌연변이와 비교하는 것이었다. 두 번째 목적은 안정성, 용해도 및 기능에 대한 태그의 영향을 조사하는 것이었다. 인간 wt A1M(M8H4DK)의 N-말단 태그는 8개의 히스티딘 태그, 그 다음 엔테로키나제 절단 부위로 이루어진다. 절단 부위는 발현 및 정제 이후에 히스티딘 태그의 절단을 가능하게 한다. 따라서, N-말단 M8H4DK- 및 M8H-태그를 갖거나 태그를 갖지 않게 wt-A1M 및 R66H+N17,96D-A1M을 발현시켰다. 세 번째 목적은 M8H4DK-wt A1M(Wt-A1M) 및 M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M(35-A1M)의 특성을 보다 상세하게 비교하는 것이었다. 예측된 데이터와 함께 단계 III의 모든 발현된 변이체를 표 7에 나타낸다.
평행 발현 및 정제는 발현 수준 및 정제 수율의 보다 정확한 비교를 가능하게 하였다. 모든 A1M 변이체 발현 박테리아는 동일한 속도로(도시되지 않음) 그리고 동일한 비교적 양호한 수율(도 2)로 성장한다는 것을 발견하였다. 유일한 차이는 다른 것과 비교할 때 비태깅된 변이체(#60 및 #42)의 더 느린 발현이었다. 2x750㎖ 발현물로부터, 20 내지 60㎎의 각각의 변이체를 정제하는 것이 가능하였다(도 3a). 모든 히스티딘-태깅된 변이체는 99% 초과 순도로 정제되었고, 비태깅된 변이체(#61 및 #42)는 다소 더 낮은 순도(대략 90%)를 나타내었다(도 3b). 모두는 적은 양의 공유 이량체를 나타내었다. PAGE 분석은 M8H-wt(40) 및 비태깅된 wt-A1M(#61)을 제외한 모든 변이체의 1 내지 2% 미만의 큰 응집물을 나타내었다(도 3c). 따라서, 모든 단일 및 다중 M8H4DK-태깅된, M8H-태깅된 및 비태깅된 A1M 변이체를 생산할 수 있었다.
100μM 용액의 응집 및 열안정성을 역상 HPLC, 동적 광 산란 및 시차 주사 형광측정법에 의해서 분석하였다(표 8). M8H4DK-태깅된 변이체를 주 피크에서 단백질의 87 내지 90%의 단백질을 갖는, 대략 12분에서 RP-HPLC에서 용리시켰다. 유일한 예외는, 9.8분의 체류 시간에서 주 피크에서 단백질의 80% 만을 나타낸 M8H4DK-M41K였다. 데이터는 M41K 돌연변이가 A1M의 예상치 못한 단백질 특성을 산출하고, 최적보다 낮다는 것을 다시 한번 나타낸다. 태그를 M8H로 변경하거나 태그를 완전히 제거하는 것은, 체류 시간을 각각 12.2분 및 12.9분으로 증가시켰는데, 이는 예상된 바와 같이 더 소수성인 분자를 나타낸다. M8H-wt 및 두 비태깅된 변이체 모두에 대해서 주 피크에서 더 적은 단백질이 나타났는데, 이는 가능하게는 이들 변이체의 SDS-PAGE에서 인지된 약간 더 낮은 순도를 반영한다. DLS-데이터는 모든 변이체 중 대략 3개의 평균 반경을 나타내었으며, 모든 6개의 기록으로부터의 데이터를 수집할 가능성을 나타내었다. 모든 변이체는 M8H4DK-wt A1M과 동일하거나 더 높은 열안정성을 가졌다. N17,96D 돌연변이를 보유한 모든 변이체에 대해서 더 높은 안정성이 인지되었다.
좁은 피펫 팁에서 80회의 피펫팅에 의한 전단력에 단계 III의 변이체를 노출시켰다. 전단-스트레스 유도된 응집을 DLS로 분석하였다. 일반적으로, N17,96D 돌연변이를 갖는 모든 변이체는 M8H-태깅된 R66H+N1796D 변이체(#41)를 제외하고, 전단 스트레스에 대해서 높은 용인성을 나타내었다(표 9). 또한, 상이한 완충액 중에서 1mM까지의 농축에 의해서 유도된 스트레스에 대한 용인성을 조사하였다. 모든 변이체를 20mM 트리스-HCl + 0.125M NaCl pH 8.0 또는 7.4 중에서 1mM로 농축하고, PAGE에 의해서 즉시 분석하였다(도 4a, 표 10). 0.1mM 및 1mM 샘플을 또한 트리스-완충액 또는 PBS 중에서 단일 동결-해동 사이클 이후에 PAGE로 분석하였다(도 4b, 표 10). M8H4DK-태깅된 변이체 중에서 N17,96D-보유 돌연변이 모두는 wt A1M에 비해서 농축, 동결-해동, pH 감소 및 (PBS로의) 완충액-변화에 대해서 증가된 용인성을 나타내었다. R66H 돌연변이의 첨가는 안정성 및 용해도를 보다 더 추가로 개선시켰다. R66H 돌연변이 단독은 wt A1M과 대략 동일한 용인성을 가졌지만, M41K 돌연변이는 상당히 더 낮은 용인성을 가졌다. N-말단 태그의 단축 또는 제거는 용인성에 부정적인 효과를 가졌는데, 이는 상응하는 R66H+N17,96D 변이체에 비해서 wt A1M에 대해서 더 두드러졌다.
모든 단계 III 변이체의 기능적 활성도를 확대 프로그램으로 조사하여 공지된 A1M 기능의 모든 가능한 양상을 포괄하였다. 비-헴 관련된 환원 능력을 합성 ABTS 라디칼 상에서 그리고 상업적으로 입수 가능한 산소 라디칼 항산화제 능력 (ORAC) 검정으로 조사하였다(도 5). M8H4DK-태깅된 N17,96D-A1M 및 R66H+N17,96D-A1M은 wt A1M과 유사한 환원 능력을 나타낸 반면, M8H4DK-태깅된 M41K-A1M 및 R66H-A1M은 약간 더 낮은 ABTS 환원 능력을 나타내었다(도 5A). 태그의 단축 및 제거는 거의 효과를 갖지 않았지만, R66H-N17,96D 변이체는 M8H-태깅되거나 비태깅된 경우 wt A1M보다 더 높은 환원 능력에 대한 경향성을 나타낸다. ORAC 검정에서의 M8H4DK-태깅된 wt A1M의 성능을 100%로 설정하고, 다른 변이체를 이것과 관련하여 비교하였다. 모든 M8H4DK-변이체는, 상당히 더 높은 능력을 갖는 M8H4DK-R66H+N17,96D을 제외하고는, M8H4DK-wt와 ORAC에서 동일한 결과를 나타내었다(도 5B). 또한 M8H-태깅된 R66H+N17,96D-A1M 및 비태깅된 R66H+N17,96D-A1M은 wt-A1M보다 약간 더 높은 ORAC 능력을 나타내었다. 환원 능력을 또한 사이토크롬 c 환원 검정에서 조사하였다(도 6). 대부분의 변이체는 wt-A1M에 비해서, 더 낮은 농도에서 약간 더 낮은 환원 능력을 나타내었고, N17,96D 및 R66H+N17,96D의 경우, 이것은 상당하였다(0.3 내지 0.6μM에서)(도 6A). 이의 중요성은 이해되지 않는다. 태그의 단축 및 제거는 이러한 특성에 영향이 없었다.
헴-결합을 유리 헴 혼입 검정 및 헴-아가로스 결합 검정으로 조사하였다(도 6). 유리 헴의 혼입 및 연계는 대략 410 내지 415㎜에서 흡광도 피크, 소위 소렛 밴드의 출현으로서 나타난다(Karnaukhova et al., 2014; Rutardottir et al, 2016). 헴은 일반적으로 대략 380 내지 390㎜의 흡광도 피크를 갖고, 이는 그것이 단독으로 용해되거나 또는 비-결합 대조군 단백질, 예컨대 오브알부민과의 혼합 및 인큐베이션 시에 인지될 수 있다. 그러나, 헴이 wt A1M과 혼합되는 경우, 흡광도 피크는 410 내지 415㎜에서 형성되는데, 이는 소위 적색 이동(즉, 더 높은 파장으로의 피크의 이동), 및 증가된 Abs(413/386) 비를 산출한다. 그것은 적색-이동 정도 및 Abs(413/386) 비가 A1M의 헴-결합 기능에 연관된다는 것을 나타낸다(Rutardottir et al, 2016). 따라서 이들 특성을 단계 III에서 모든 변이체에 대해서 비교하였다(도 6B). M8H4DK-태깅된 변이체 중에서 모두는, 더 강한 이동을 갖는 M41K 변이체를 제외하고는, wt A1M과 대략 동일한 적색-이동을 나타내었다. 흥미롭게도, M8H에 대한 태그를 단축시키는 것은 적색-이동을 증가시킨 반면, 태그의 제거는 적색-이동을 감소시켰다. 명백하게, 태그는 이러한 특성에 강한 영향을 가졌다. A1M에 대한 헴의 결합을 대조군 아가로스에 대한 결합과 비교하여 헴-아가로스에 대한 A1M의 희석물 시리즈의 결합으로서 조사하였다. 전형적으로, 대조군 단백질, 예컨대, 오브알부민은 대조군 아가로스에 대한 배경 결합을 초과하게 헴-아가로스에 대한 결합을 나타내지 않는다(도 6C). 전형적으로, 첨가된 M8H4DK-wt A1M(35-A1M) 중 70 내지 80%는 헴 아가로스에 결합한 반면, 대조군 아가로스에 대해서는 어떠한 결합도 인지되지 않았다. 단계 III에서 모든 변이체에 대해서 결합을 비교하였다. 모두는 헴-아가로스에 대해서 유사한 결합 정도를 나타내었지만(66-72%), 오브알부민은 결합을 나타내지 않았다.
M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)의 헴 결합을 이송 이동 및 형광 분석의 조합을 사용하여 추가로 분석하였다(도 11)(Karnaukhova et al. 2014). 헴-혼입의 결과로서, 네이티브 PAGE 분석에서 wt-A1M 및 35-A1M의 이송은 1 미만의 헴:단백질 비에서 더 느렸고, 1 초과의 헴:단백질 비에서 더 빨랐는데, 이는 헴-농도에 대한 동일한 의존성을 나타낸다(도 11A 및 B). 높은 헴 농도에서, 두 변이체 모두는 올리고머에 대한 경향성을 나타내었는데, 이는 wt-A1M에 대한 이전 발견을 뒷받침한다(Karanaukhova et al. 2014). 마찬가지로, 헴-혼입은 wt-A1M 및 35-A1M에서, 유사한 속도론으로 트립토판 형광의 켄칭을 유도하였다(도 11B). A1M에서 헴의 연계는 415㎜에서의 UV-흡광도 피크의 형성을 유도한다고 이미 밝혀져 있다(Ruttarsdottir et al., 2016; karnaukhova et al., 2014). wt-A1M- 및 35-A1M/헴 복합체의 유사한 UV-흡광도 패턴이 인지되었지만(도 11C), 단지 35-A1M 피크의 작은 적색-이동을 갖는다(415→417㎜).
wt-A1M 및 35-A1M의 ABTS-라디칼의 환원 속도를 조사하였고[10], 스트레스 받지 않은 새로 제조된 단백질을 사용하면 wt-A1M 및 35-A1M에 대해서 유사하였다(도 12A). 7일 동안의 저장 후, wt-A1M은 22℃에서 1mM로의 농축 후에 더 느린 환원 속도를 나타내었는데(도 12B), 이는 이들 조건에서 나타난 응집에 더하여 단백질의 활성도 손실을 시사한다(표 11). 사이토크롬 c-환원(Allhorn et al., 2005)은 35-A1M의 경우 더 느린 반면(도 12C), ORAC 검정에 의해서 측정된 항산화 능력은 35-A1M의 경우 다소 더 높았다(도 12D).
헴-유도된 세포사로부터 K562 세포를 구조하는 A1M 변이체의 능력을 조사한 생물학적 검정(도 7). 락테이트 데하이드로게나제 방출에 따라서, 헴과 함께 그리고 A1M 없이 인큐베이션된 세포에 대해서 세포사의 정도를 100%로 설정하였다. wt-A1M을 비롯한, 모든 M8H4DK-태깅된 변이체는 변이체들 간에 상당한 차이 없이, 10μM에서 거의 100% 구조를 나타내었다(도 7). M8H-태깅된 변이체는 거의 동일한 구조 가능성을 나타낸 반면, 비태깅된 변이체의 경우 약간 더 낮은 가능성이 관찰되었다.
M8H4DK-wt A1M(35-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(wt-A1M)의 세포 보호 능력
두 A1M-변이체의 세포 보호 특성을, 유리 헴 및 유리 철에 노출된, K562 세포 및 인간 신장 근위 세관 상피 세포주(HK-2)에서 시험하였다. 도 12는, A1M-변이체 둘 모두가 시토졸 마커 LDH의 세포외 방출에 의해서 측정되는, 0.1mM 헴에 노출된 K562-세포의 세포사를 완전히 저해하였음을 나타낸다. wt-A1M 및 35-A1M의 용량-반응 곡선은 거의 완전히 중첩되는데, 이는 유사한 세포-보호 능력을 시사한다.
HK-2 세포의 보호를 도 14에 나타낸다. 첫 번째로, 하이드록시 라디칼을 생성하는 유리 철, 아스코르베이트 및 과산화수소의 혼합물인, 펜톤 반응에 의해서 세포 손상을 유도하였다. WST-1 검정에 의해서 측정되는, 세포 생존력은 중첩된 용량-반응 곡선에 따라서, 두 A1M-변이체 모두에 의해서 회복되었다(도 14A). 산화성 스트레스-반응의 널리 문헌화된 바이오마커인, 헴 옥시게나제-1(HO-1)의 상향 조절(Alam et al., 1999)은, 유사한 정도로 wt-A1M 및 35-A1M에 의해서 상당히 억제되었다(도 14B). HK-2 세포의 세포 손상이 헴과의 인큐베이션에 의해서 유도되었고, 두 A1M-변이체 모두에 의해서 저해될 수 있었다(도 14C 및 D). 다시, WST-1 검정에 의해서 측정된 세포 생존력은 두 헴 농도, 10 및 30μM를 사용하여, 두 단백질에 의해서 유사한 정도로 회복되었다(도 14C). HO-1 및 또 다른 세포 스트레스 반응 유전자인 Hsp70의 상항조절은 두 A1M-변이체 모두에 의해서 유사한 정도로 저해되었다(도 14D).
마우스에서 M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-1M(35-A1M)의 생체내 분포
정맥내 주사된 A1M은 혈액으로부터 신속하게 클리어링되고, 래트 및 마우스에서 신장 및 간에 주로 국지화되는 것이 이미 밝혀져 있다(Larsson et al., 2001; Ahlstedt et al., 2015). 본 발명자들은 wt-A1M 및 35-A1M의 혈액 중에서의 클리어런스 속도 및 기관 중의 분포를 비교하였다(도 15). 유사한 턴오버 속도가 첫 번째 60분 동안 인지되었고, 35-A1M은 1시간 후에 보다 신속하게 클리어링되었다. 10분 및 30분 후 조사된 기관에서 A1M의 분포는 두 단백질 간에 어떠한 유의한 차이도 나타내지 않았다. wt-A1M 및 35-A1M 둘 모두는 신장에서 주로 발견되었고, 심장, 간, 폐, 피부 및 비장에서 더 적은 양으로 인지되었고, 뇌에서는 무시할 만한 양으로 발견되었다.
M8H4DK-wt A1M(wt-A1M) 및 M8H4DK-35-A1M(35-A1M)에 의한 신장의 생체내 보호
이미, A1M은 헴- 및 산화성 스트레스-관련된 신장 손상이 유도된 동물 모델에서 생체내에서 치료 효과가 밝혀져 있다
. 여기서, 본 발명자들은 미오글로빈, 유리 헴, 라디칼 및 다른 조직 성분의 방출로 인한 근육 파열의 결과로서 급성 신장 손상(AKI)이 발생한 글리세롤-주사 횡문근융해증 모델에서 두 A1M-변이체의 생체내 보호 효과를 조사하였다. 글리세롤-주사는 세포 스트레스의 2가지 바이오마커인, HO-1 및 Hsp70 유전자의 상당한 상향조절을 초래하였고(도 16A 및 B), 상향조절 대부분은 wt-A1M 또는 35-A1M의 동시 주사에 의해서 저해되었다. 적용된 용량(7㎎/㎏ 동물 체중)에서 두 A1M-변이체 간에 어떠한 유의한 차이도 인지되지 않았다.
요약하면, 단계 III에서의 조사는, N17,96D-함유 A1M-돌연변이가 A1M 분자에 상당한 안정성을 추가하였는데, 이는 R66H 돌연변이가 첨가된 경우 추가로 개선되었다. 추가로, M8H4DK-태깅된 A1M 변이체는 더 짧은 태그를 갖거나 또는 태그를 갖지 않는 변이체보다 더 안정적이었다. 따라서, 태그는 정제 툴로서 역할을 할 뿐만 아니라 증가된 안정성 및 안정성을 갖는 A1M을 제공하고, 기능을 방해하지 않는다. M8H4DK-R66H+N1796D(35-A1M) 분자는 가능하게는 사이토크롬 c 환원을 제외하고, 동일하거나 또는 더 양호한 기능적 특성을 나타낸다. 결론적으로, 안정성/용해도 및 기능성 연구는, M8H4DK-R66H+N17,96D(35-A1M)가 M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)에 비해서 개선된 분자 특성을 갖고, Wt-A1M 및 35-A1M 둘 모두는 급성 신장 손상의 횡문근융해증 글리세롤-주사 모델을 사용하여 생체내에서 신장에 대한 보호 효과를 나타낸다는 것을 시사한다.
M8H4DK-R66H+N1796D 대 M8H4DK-wt에 대한 추가
안정성 연구
M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M 및 wt-A1M을 추가로 비교하기 위해서, 동결-해동 사이클 및 +4℃ 및 실온에서의 저장 후에 SEC-FPLC 및 ABTS 환원 검정으로 응집 및 기능을 시험하였다(도 8). wt-A1M 및 R66H+N17,96D-A1M 둘 모두의 샘플(100μM)은 5x 동결-해동 사이클을 매우 잘 용인하였다. 이미 나타낸 바와 같이, wt-A1M은 1mM로의 농축 후에 R66H+N17,96D-A1M보다 더 많은 응집을 나타내었고, 하룻밤 동안의 결과와 비교할 때 1주일 동안의 저장 후에 유사한 결과가 인지되었다. wt-A1M의 증가된 응집은 2μM-샘플의 ABTS 환원 활성도에 영향을 주지 않았다. 육안 조사는 동결-해동, 농축 및 +4℃에서 1주일 동안의 저장 후에 두 변이체 모두의 완전히 투명한 용액을 나타낸다. 스트레스를 주기 위해서, A1M 용액, 추가로 100μM 및 1mM 용액을 실온에서 1주일 동안 저장하였다. 100μM 용액의 육안 조사는 wt-A1M이 약간의 탁하다는 것을 나타내었지만, R66H+N17,96D-A1M 용액은 투명하게 유지되었다. SEC-FPLC는 wt-A1M의 곡선하 면적이 출발 물질의 80%로 감소되었음을 나타내었는데, 이는 wt-A1M의 손실을 나타내지만, 큰 응집물의 증가는 인지되지 않았다. 이러한 손실은 단백질의 침전 및 FPLC-실시 전 여과에 의한 제거에 의해서 주로 유발될 것이다. R66H+N17,96D-A1M의 경우, 약간 증가된 응집이 인지될 수 있지만, 100μM에서 실온에서 1주일 동안의 저장 후 단백질은 손실되지 않았다. ABTS 검정에서, R66H+N17,96D-A1M은 완전한 활성도를 여전히 나타내었지만, wt-A1M의 경우에는 작은 감소가 인지되었다. 1주일 동안 저장된 1mM 용액의 육안 관찰은, 두 변이체 모두가 탁하다는 것을 나타내었지만, wt-A1M 용액은 더 심해 보였다. 용액을 SEC 상의 적재를 위해서 10배 희석한 경우, R66H+N17,96D-A1M의 침전은 해결되었지만, wt-A1M의 침전은 해결되지 않았다. SEC에서, 매우 적은 응집물이 인지되었지만, wt-A1M 출발 물질의 44% 만이 남아있었다. 이에 반해서, R66H+N17,96D-A1M 중 100%가 남아있었다. ABTS 검정에서, wt-A1M은 심각하게 감소된 활성도를 갖는 반면, R66H+N17,96D-A1M의 활성도는 동일하게 유지되었다. 이러한 연구는 M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M이 실온에서 높은 농도에서의 저장을 용인할 수 있는 반면, wt-A1M은 이를 용인할 수 없다는 것을 보여준다.
37℃에서 1mM 용액의 안정성을 조사하였다. 샘플을 1.5, 2.5 및 4.5시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 육안으로 조사하고, SEC-FPLC 및 ABTS 환원 검정에 의해서 분석하였다(도 9). 1.5시간 인큐베이션 후, 두 용액은 육안으로 조사할 때 여전히 투명하였지만, SEC-FPLC는 R66H+N17,96D-A1M 용액(28%)과 비교할 때 wt-A1M 용액 중에 더 많은 응집물(53%)이 존재함을 보여주었다. 곡선하 면적에 의해서 추산되는 경우, 출발 물질 중 단지 67%가 wt-A1M의 SEC 상에 용리되었지만, R66H+N17,96D-A1M 중 100%가 용리되었다. 두 변이체 모두는 ABTS 검정에서 완전 활성도를 나타내었다. 2.5시간의 인큐베이션 후, wt-A1M 용액은 분석이 불가능한 침전물로 탁해졌다. 출발 물질 중 40%가 SEC 상에서 발견되었고, ABTS 활성도는 상당히 감소되었다. R66H+N17,96D-A1M 용액은 여전히 투명하였고, ABTS 검정에서 완전 활성도를 나타내었지만, 큰 응집물이 SEC-FPLC에서 28에서 38%로 증가되었다. 4.5시간 후, wt-A1M은 피펫팅이 불가능한 걸쭉한 물질이 되었다. 따라서, 그것을 추가로 분석하지 않았다. R66H+N17,96D-A1M은 탁해졌지만, 피펫팅이 여전히 가능하였다. 일부 침전이 희석 후에 남아있었다. SEC 상에 용리된 단백질의 양은 출발 물질의 44%였고, ABTS 검정에서 감소된 활성도가 인지되었다. 이 연구는, +37℃에서 인큐베이션 이후, A1M은 먼저 용해될 수 있는 응집물을 형성하고, 이어서 비가역적인 응집물을 형성하여, ABTS 검정에서 활성도가 손실된다는 것을 시사한다. wt-A1M의 완전 비가역적 침전은 2.5시간의 인큐베이션 이후에 인지되었고, 부분적인 비가역적 침전은 M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M의 경우 4.5시간 이후에만 인지되었다. 따라서, M8H4DK-R66H+N17,96D-A1M은 M8H4DK-wt-A1M보다 +37℃에서의 저장에 더 저항성이다.
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115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Y1
<400> 11
Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Y2
<400> 12
Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr
1 5 10 15
Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile
20
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Y3
<400> 13
Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu
1 5 10 15
Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr
20
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Y4
<400> 14
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
1 5 10 15
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp
20 25
<210> 15
<211> 87
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Y5
<400> 15
Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala
1 5 10 15
Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr
20 25 30
Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln
35 40 45
Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile
50 55 60
Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro
65 70 75 80
Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
85
<210> 16
<211> 83
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Y5
<400> 16
Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala
1 5 10 15
Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr
20 25 30
Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln
35 40 45
Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile
50 55 60
Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro
65 70 75 80
Glu Pro Ile
<210> 17
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Met or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Met or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = His or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 31
<223> Xaa = Asn or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> 55
<223> Xaa = Met or Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> 80
<223> Xaa = Arg or His
<220>
<221> VARIANT
<222> 110
<223> Xaa = Asn or Asp
<400> 17
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Xaa Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Xaa Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Xaa
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Xaa Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile
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<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> hA1M, No tag, N-terminal Met, N17,96D; R66H; truncated
<400> 18
Met Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn
1 5 10 15
Phe Asp Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser
35 40 45
Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr
50 55 60
Ser Thr His Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp
85 90 95
Asp Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr
100 105 110
Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile
115 120 125
Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu
130 135 140
Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser
145 150 155 160
Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu
165 170 175
Pro Glu Pro Ile
180
<210> 19
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> hA1M, not tag, N-terminal Met, M41K; truncated
<400> 19
Met Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn
1 5 10 15
Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Arg Met Thr Val Ser
35 40 45
Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr
50 55 60
Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp
85 90 95
Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr
100 105 110
Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile
115 120 125
Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu
130 135 140
Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser
145 150 155 160
Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu
165 170 175
Pro Glu Pro Ile
180
<210> 20
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 6His, N17,96D; R66H; truncated
<400> 20
Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Val Pro
1 5 10 15
Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile Ser Arg
20 25 30
Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys Pro Trp
35 40 45
Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val Leu Gly
50 55 60
Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His Trp Arg
65 70 75 80
Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr Asp Thr
85 90 95
Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr Met Glu
100 105 110
Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe Leu Thr
115 120 125
Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys Leu Tyr
130 135 140
Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe Arg Val
145 150 155 160
Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr Met Ala
165 170 175
Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro Ile
180 185 190
<210> 21
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> hA1M, 6His, M41K; truncated
<400> 21
Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Val Pro
1 5 10 15
Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asn Ile Ser Arg
20 25 30
Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys Pro Trp
35 40 45
Leu Lys Lys Ile Lys Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val Leu Gly
50 55 60
Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Arg Trp Arg
65 70 75 80
Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr Asp Thr
85 90 95
Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn Ile Thr Met Glu
100 105 110
Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe Leu Thr
115 120 125
Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys Leu Tyr
130 135 140
Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe Arg Val
145 150 155 160
Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr Met Ala
165 170 175
Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro Ile
180 185 190
<210> 22
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 8His, N17,96D; R66H; truncated
<400> 22
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile
<210> 23
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> hA1M, 8His, M41K; truncated
<400> 23
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asn Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Arg
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile
<210> 24
<211> 200
<212> PRT
<213> Mus <mouse, genus>
<220>
<223> 1.M8H5GIEGR-Mouse
<400> 24
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Asp Pro Ala Ser Thr Leu Pro Asp Ile Gln Val Gln Glu Asn
20 25 30
Phe Ser Glu Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Val Gly
35 40 45
Ser Thr Cys Pro Trp Leu Ser Arg Ile Lys Asp Lys Met Ser Val Gln
50 55 60
Thr Leu Val Leu Gln Glu Gly Ala Thr Glu Thr Glu Ile Ser Met Thr
65 70 75 80
Ser Thr Arg Trp Arg Arg Gly Val Cys Glu Glu Ile Thr Gly Ala Tyr
85 90 95
Gln Lys Thr Asp Ile Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp
100 105 110
Asn Ile Thr Leu Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr
115 120 125
Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Ser Ser His His His Gly Leu Thr Ile
130 135 140
Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Glu Pro Gln Leu Arg Asp Ser Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Phe Lys Asp Val Ala Leu Asn Val Gly Ile Ser Glu Asn Ser
165 170 175
Ile Ile Phe Met Pro Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Asp Arg Glu
180 185 190
Val Glu Pro Thr Ser Ile Ala Arg
195 200
<210> 25
<211> 201
<212> PRT
<213> Heterocephalus glaber
<220>
<223> 2. M8H5GIEGR-Naked Mole rat
<400> 25
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Asn Pro Val Pro Met Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asp Glu Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Phe Asn Leu Ala Thr
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Arg Ile Lys Asp Arg Leu Ser Val
50 55 60
Ser Thr Met Val Leu Gly Lys Gly Thr Thr Glu Thr Gln Ile Ser Thr
65 70 75 80
Thr His Thr His Trp Arg Gln Gly Val Cys Gln Glu Thr Ser Gly Val
85 90 95
Tyr Lys Lys Thr Asp Thr Ala Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys
100 105 110
Trp Asn Val Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Ile Leu Thr Lys Lys Phe Ser His His His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Glu Pro Arg Leu Arg Asp Ser Leu
145 150 155 160
Leu Gln Glu Phe Arg Glu Met Ala Leu Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp
165 170 175
Ser Ile Phe Thr Met Ala Asn Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Asp Gln
180 185 190
Ala Pro Glu Ser Thr Pro Ala Pro Arg
195 200
<210> 26
<211> 197
<212> PRT
<213> Anura
<220>
<223> 3. M8H5GIEGR-Frog
<400> 26
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Cys Ser Pro Ile Gln Pro Glu Asp Asn Ile Gln Ile Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asp Leu Gln Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asp Ile Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Lys Trp Leu Lys His His Lys Glu Lys Phe Asn Met
50 55 60
Gly Thr Leu Glu Leu Ser Asp Gly Glu Thr Asp Gly Glu Val Arg Ile
65 70 75 80
Val Asn Thr Arg Met Arg His Gly Thr Cys Ser Gln Ile Val Gly Ser
85 90 95
Tyr Gln Lys Thr Glu Thr Pro Gly Lys Phe Asp Tyr Phe Asn Ala Arg
100 105 110
Trp Gly Thr Thr Ile Gln Asn Tyr Ile Val Phe Thr Asn Tyr Asn Glu
115 120 125
Tyr Val Ile Met Gln Met Arg Lys Lys Lys Gly Ser Glu Thr Thr Thr
130 135 140
Thr Val Lys Leu Tyr Gly Arg Ser Pro Asp Leu Arg Pro Thr Leu Val
145 150 155 160
Asp Glu Phe Arg Gln Phe Ala Leu Ala Gln Gly Ile Pro Glu Asp Ser
165 170 175
Ile Val Met Leu Pro Asn Asn Gly Glu Cys Ser Pro Gly Glu Ile Glu
180 185 190
Val Arg Pro Arg Arg
195
<210> 27
<211> 197
<212> PRT
<213> Gallus
<220>
<223> 4. M8H5GIEGR-Chicken
<400> 27
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Thr Pro Val Gly Asp Gln Asp Glu Asp Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Glu Pro Glu Arg Met Tyr Gly Lys Trp Tyr Asp Val Ala Val
35 40 45
Gly Thr Thr Cys Lys Trp Met Lys Asn Tyr Lys Glu Lys Phe Ser Met
50 55 60
Gly Thr Leu Val Leu Gly Pro Gly Pro Ser Ala Asp Gln Ile Ser Thr
65 70 75 80
Ile Ser Thr Arg Leu Arg Gln Gly Asp Cys Lys Arg Val Ser Gly Glu
85 90 95
Tyr Gln Lys Thr Asp Thr Pro Gly Lys Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Lys
100 105 110
Trp Asp Val Ser Ile Lys Ser Tyr Val Leu Arg Thr Asn Tyr Glu Glu
115 120 125
Tyr Ala Val Ile Leu Met Lys Lys Thr Ser Asn Phe Gly Pro Thr Thr
130 135 140
Thr Leu Lys Leu Tyr Gly Arg Ser Pro Glu Leu Arg Glu Glu Leu Thr
145 150 155 160
Glu Ala Phe Gln Gln Leu Ala Leu Glu Met Gly Ile Pro Ala Asp Ser
165 170 175
Val Phe Ile Leu Ala Asn Lys Gly Glu Cys Val Pro Gln Glu Thr Ala
180 185 190
Thr Ala Pro Glu Arg
195
<210> 28
<211> 201
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<220>
<223> 5. M8H5GIEGR-Rabbit
<400> 28
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Asp Pro Val Pro Thr Leu Pro Asp Asp Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Glu Leu Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Val
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Arg Ile Lys Asp Arg Met Ala Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Thr Ser Glu Thr Glu Ile Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr His Trp Arg Arg Gly Val Cys Glu Glu Ile Ser Gly Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ala Lys
100 105 110
Trp Asn Leu Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg Arg His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Glu Pro Gln Leu Arg Glu Ser Leu
145 150 155 160
Leu Gln Glu Phe Arg Glu Val Ala Leu Gly Val Gly Ile Pro Glu Asn
165 170 175
Ser Ile Phe Thr Met Ile Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Gln Gln
180 185 190
Glu Pro Lys Pro Ala Pro Val Leu Arg
195 200
<210> 29
<211> 201
<212> PRT
<213> Saimiri
<220>
<223> 6. M8H5GIEGR-SQ Monkey
<400> 29
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Ser Pro Val Pro Thr Pro Pro Glu Gly Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asn Leu Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Leu Lys Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Glu Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Phe Cys Glu Gln Thr Ser Trp Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Glu Pro Lys
100 105 110
Trp Asn Val Thr Met Glu Ser Tyr Val Ala His Thr Asn Tyr Glu Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Glu Pro Gln Leu Arg Glu Ser Leu
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Ser Ile Phe Thr Met Ala Asn Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln
180 185 190
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<211> 201
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<213> Odobenus
<220>
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130 135 140
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Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala
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Gly Arg Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu
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<220>
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Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
195 200
<210> 45
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 23. M8H5GIEGR-Human T45K
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<220>
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Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln
180 185 190
Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
195 200
<210> 47
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 25. M8H5GIEGR-Human V170S
<400> 47
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys
100 105 110
Trp Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu
145 150 155 160
Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp
165 170 175
Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Ser Pro Gly Glu Gln
180 185 190
Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
195 200
<210> 48
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 26. M8H5GIEGR-Human
<400> 48
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys
100 105 110
Trp Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu
145 150 155 160
Leu Gln Asp Phe Arg Asp Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp
165 170 175
Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln
180 185 190
Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
195 200
<210> 49
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 27. M8H5GIEGR-Human G172Q
<400> 49
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys
100 105 110
Trp Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu
145 150 155 160
Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp
165 170 175
Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gln Glu Gln
180 185 190
Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
195 200
<210> 50
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 33. M8H4DK-Human M41K+
<400> 50
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asn Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 51
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 34. M8H4DK-Human M41K+N1796D 34
<400> 51
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Arg
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 52
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 35. M8H4DK-Human R66H+N1796D
<400> 52
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 53
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 36. M8H4DK-Human M41K+R66H+N1796D
<400> 53
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 54
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 38. M8H4DK-Human R66H
<400> 54
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asn Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 55
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 39.M8H4DK-Human
<400> 55
Met His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile
20 25 30
Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys
35 40 45
Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val
50 55 60
Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Arg
65 70 75 80
Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr
85 90 95
Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr
100 105 110
Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys
130 135 140
Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe
145 150 155 160
Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr
165 170 175
Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Leu Ile Pro Arg
195
<210> 56
<211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 40. M8H-Human wt
<400> 56
Met His His His His His His His His Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro
1 5 10 15
Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly
20 25 30
Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala
50 55 60
Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val
65 70 75 80
Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys
85 90 95
Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val
100 105 110
Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe
115 120 125
Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala
130 135 140
Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln
145 150 155 160
Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly
165 170 175
Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
180 185 190
<210> 57
<211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 41. M8H-Human R66H+N1796D
<400> 57
Met His His His His His His His His Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro
1 5 10 15
Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe Asp Ile Ser Arg Ile Tyr Gly
20 25 30
Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala
50 55 60
Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr His Trp Arg Lys Gly Val
65 70 75 80
Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys
85 90 95
Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asp Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val
100 105 110
Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe
115 120 125
Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala
130 135 140
Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln
145 150 155 160
Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly
165 170 175
Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
180 185 190
<210> 58
<211> 594
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 60. M8H4DK-Human wt
<400> 58
atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc aatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcatggacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcgt 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatggaac ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
agagtggttg cccagggtgt gggcatccct gaggactcca tcttcaccat ggctgaccga 540
ggtgaatgtg tccctgggga gcaggaacca gagcccatct taatcccgag atga 594
<210> 59
<211> 603
<212> DNA
<213> Mus <mouse, genus>
<220>
<223> 1.M8H5GIEGR-Mouse
<400> 59
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcgaccct 60
gcgtcaacac tgccagatat ccaggttcag gagaacttca gtgagtcccg gatctatgga 120
aaatggtaca acctggcggt gggatccacc tgcccgtggc tgagccgcat taaggacaag 180
atgagcgtga gcacgctggt gctgcaggag ggggcgacag aaacagagat cagcatgacc 240
agtactcgat ggcggagagg tgtctgtgag gagatcactg gggcgtacca gaagacggac 300
atcgatggaa agttcctcta ccacaaatcc aaatggaaca taaccttgga atcctatgtg 360
gtccacacca actatgacga atatgccatt ttccttacca agaagtccag ccaccaccac 420
gggctcacca tcactgccaa gctctatggt cgggagccac agctgaggga cagccttctg 480
caggagttca aggatgtggc cctgaatgtg ggcatctctg agaactccat catttttatg 540
cctgacagag gggaatgtgt ccctggggat cgggaggtgg agcccacatc aattgccaga 600
tga 603
<210> 60
<211> 606
<212> DNA
<213> Heterocephalus glaber
<220>
<223> 2. M8H5GIEGR-Naked Mole
<400> 60
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcaatcct 60
gtgccgatgc cgccagacaa catccaagtg caggagaact ttgatgaatc ccggatctat 120
gggaaatggt tcaacctggc tacgggctcc acgtgcccgt ggctgaagag gatcaaagac 180
aggctgagtg tgagcacaat ggtgctgggc aaggggacca cggagacaca gatcagcaca 240
acccacaccc actggcggca aggggtgtgc caggagacct caggggttta caagaaaaca 300
gacacggctg ggaagttcct ctaccacaag tccaaatgga atgtaaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc atcattctaa ctaagaagtt cagccaccac 420
catggaccga ccattactgc caagctctat gggagagagc cgcggctgag agacagcctc 480
ctgcaggaat tcagggagat ggccctgggc gtaggcatcc ccgaggattc catcttcaca 540
atggccaaca gaggggaatg tgtccctggt gaccaggcac cagagtccac cccagccccg 600
aggtga 606
<210> 61
<211> 594
<212> DNA
<213> Anura
<220>
<223> 3. M8H5GIEGR-Frog
<400> 61
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgctgcagc 60
ccaatccagc cagaggacaa tatccagatc caggagaact ttgatctcca gaggatttat 120
ggcaaatggt acgacattgc catcggctcc acctgcaaat ggctgaagca ccacaaggaa 180
aagttcaaca tggggacact ggagcttagc gatggggaga ccgacgggga ggtgcggatt 240
gtgaacacaa ggatgaggca cggaacctgc tctcagattg ttgggtccta tcagaagaca 300
gagaccccag ggaagttcga ctatttcaac gcacggtggg gaaccacgat ccaaaactac 360
attgtcttca ctaactacaa tgagtatgtc atcatgcaga tgaggaagaa gaagggatcg 420
gagaccacca cgaccgtcaa gctgtatggg cggagcccag acttgcgtcc gaccctcgtt 480
gatgaattca ggcagtttgc cttggctcag ggcattcctg aagactccat cgtgatgcta 540
cctaacaatg gtgagtgctc tccaggggaa atagaagtga gaccacggag atga 594
<210> 62
<211> 594
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<220>
<223> 4. M8H5GIEGR-Chicken
<400> 62
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcacgcct 60
gttggggacc aggatgagga cattcaagtg caagagaatt ttgagcctga gcggatgtat 120
gggaaatggt atgacgtagc tgttggcacc acctgcaagt ggatgaagaa ctacaaggag 180
aagttcagca tgggcacact ggtgctgggc cccggcccca gcgctgacca gatcagtacc 240
atcagcacca ggctgcggca aggtgactgc aaacgtgtct caggagagta ccagaaaact 300
gacacccctg gcaaatacac ctactataac cccaagtggg atgtgtctat caagtcctac 360
gtgcttcgca ccaactatga agaatacgca gtcattctga tgaagaagac aagtaatttt 420
ggcccaacca ccacactgaa gctgtatggg agaagcccag agctgcggga agagctcacc 480
gaggctttcc agcagctggc tctggagatg ggcatccctg cagattccgt cttcatcctg 540
gccaacaaag gtgaatgtgt cccacaggag actgccactg cccctgagag gtga 594
<210> 63
<211> 606
<212> DNA
<213> Oryctolagus
<220>
<223> 5. M8H5GIEGR-Rabbit
<400> 63
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcgacccc 60
gtgcccaccc tgccggacga catccaagtg caggagaact tcgagctctc tcggatctac 120
gggaaatggt acaacctggc tgtggggtcc acctgcccgt ggctgaagag gatcaaggac 180
aggatggccg tgagcacgct ggtgctggga gaggggacga gcgagacgga gatcagcatg 240
accagcacgc actggcggag gggcgtctgt gaggagatct ccggggccta tgagaaaacg 300
gacactgacg ggaagttcct gtaccacaaa gccaaatgga acttaaccat ggagtcctac 360
gtggtgcaca ccaactacga tgagtatgcc atttttctca ccaagaaatt cagccgccgc 420
cacggcccca ccatcaccgc caagctctat gggcgggagc cgcagctgag ggagagcctc 480
ctgcaggagt tcagggaggt ggctctcggg gtggggatcc ccgagaactc catcttcacc 540
atgatcgaca gaggggaatg tgtgcccggg cagcaggaac caaagcctgc ccccgtgttg 600
agatga 606
<210> 64
<211> 606
<212> DNA
<213> Saimiri
<220>
<223> 6. M8H5GIEGR-SQ Monkey
<400> 64
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcagccca 60
gtgccgacgc cgcccgaagg cattcaagtg caggaaaact tcaatctctc tcggatctac 120
ggcaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctaaagaa gatcatggac 180
aggttgaaag tgagcacgct ggtgctggaa gagggcgcca cggaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gctggcggaa aggtttctgt gagcagacct cttgggctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacgaa cccaaatgga acgtaaccat ggagtcctat 360
gtggcccaca ccaactatga ggagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctat gggcgggagc cacagctgag ggaaagcctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggattc catcttcacc 540
atggctaacc gaggtgaatg cgtccctggg gagcaggaac cacagcccat cctacaccgg 600
agatga 606
<210> 65
<211> 606
<212> DNA
<213> Odobenus
<220>
<223> 7. M8H5GIEGR-Walrus
<400> 65
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcagtccc 60
gtgctgacgc cgcctgacgc catccaagtg caagagaact tcgacatctc tcggatctac 120
gggaagtggt ttcatgtggc catgggctcc acctgcccgt ggctgaagaa gttcatggac 180
aggatgtcca tgagcacgct ggtgctgggc gagggggcga cggatgggga gatcagcatg 240
accagcacac gttggcggag aggcacctgt gaggagatct ctggggctta tgagaaaacc 300
agcactaacg gaaagttcct ctatcataat cccaaatgga acatcaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccgactatga tgagtacgcc atctttctga ccaagaaatt cagccgccac 420
catgggccca ccattactgc caagctctat gggcgacagc cgcagcttcg agaaagcctg 480
ctggaggagt tcagggagct tgccttgggt gtgggcatcc ccgaggactc catcttcacc 540
atggccaaca aaggtgagtg tgtccctggg gagcaggaac cagagccctc tccacacatg 600
aggtga 606
<210> 66
<211> 603
<212> DNA
<213> Trichechus
<220>
<223> 8. M8H5GIEGR-Manatee
<400> 66
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcagccca 60
gtgaaaacac cactcaacga catccaagtg caggagaact ttgacctccc tcggatctac 120
gggaaatggt tcaacatagc cattggctcc acctgccaat ggctgaagag gttgaaggcc 180
gggccgacca tgagcaccct ggtcctggga gagggagcta cagacacaga gatcagcaca 240
accagcactc gttggcggaa aggcttctgt gaggagatct ctggggcata tgagaaaaca 300
gacacagctg ggaagttcct ttatcacgga tccaaatgga atgtaacctt ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtacgcc atttttctga ccaagaaatt cagccgctat 420
ggactcacca ttactgctaa gctctatggg cggcagcctc aggtgaggga gagcctcctg 480
gaggagttca gggaatttgc cctgggtgtg ggcatccctg aggattccat cttcaccacg 540
gccgacaaag gtgagtgtgt ccctggagag caggagccag aacccaccgc agccctgaga 600
tga 603
<210> 67
<211> 609
<212> DNA
<213> Pleuronectes platessa
<220>
<223> 9. M8H5GIEGR-Plaice
<400> 67
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcctccct 60
gtgctccctg aacctcttta cccgacacag gagaactttg atctgacccg gtttgtgggg 120
acatggcacg atgttgcctt gacgagcagc tgcccccata tgcagcgtaa cagggcggat 180
gcagccattg gtaaactggt tctggagaaa gacactggaa acaaactcaa ggtgacacga 240
actagactca gacatggaac atgtgtggag atgtctggag aatatgagtt aaccagcaca 300
ccaggacgaa tcttctacca tattgacagg tgggatgcag acgtggacgc ctacgtggtt 360
cacaccaact acgacgagta cgcaattata ataatgagca aacagaaaac atcgggggag 420
aacagcacct cactcaagct gtacagtcgg acgatgtctg tgagagacac tgtgctggat 480
gacttcaaaa ctctggtcag acatcaggga atgagtgacg acaccattat catcaagcag 540
aacaaaggtg actgtattcc tggagagcag gtggaagaag caccatctca gccagagccc 600
aagcggtga 609
<210> 68
<211> 606
<212> DNA
<213> Pongo
<220>
<223> 10. M8H5GIEGR-Orangutan
<400> 68
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccgacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcaccct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacat ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccgt 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaaccctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gaacaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 69
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 11. M8H5GIEGR-Human P35K
<400> 69
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcaaat ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 70
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 12. M8H5GIEGR-Human M41K
<400> 70
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcaaagac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 71
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 13. M8H5GIEGR-Human R66H
<400> 71
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc attggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 72
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 14. M8H5GIEGR-Human T75K
<400> 72
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagaaat ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 73
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 15. M8H5GIEGR-Human T75Y
<400> 73
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagtatt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 74
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 16. M8H5GIEGR-Human M99K
<400> 74
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccaa agagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 75
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 17. M8H5GIEGR-Human S101Y
<400> 75
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtattat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 76
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 18. M8H5GIEGR-Human K69.92.118.
<400> 76
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggcg tggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcaccgt tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagcgttt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc ccgtctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 77
<211> 597
<212> DNA
<213> Latimeria
<220>
<223> 19. M8H5GIEGR-Coelacanth
<400> 77
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggaagt 60
ccccttcgag atgaagacat ccaagtgcag gagaactttg accttcccag gatttatgga 120
aaatggtacg aaattgcaat cgcttcgacc tgtccctggg tgaagaatca caaggataag 180
atgttcatgg gaactatggt gctacaagag ggagagcaga gtgaccggat cagtaccacc 240
tccacccgaa tcagggatgg aacctgctca cagatcactg gatattacac gttaaccaca 300
acacctggga agttcgctta tcacaattct aaatggaact tggatgtcaa cagttatgtt 360
gttcacacta actatgacga atactcgatt gtgatgatgc agaaatacaa aagctctaac 420
tctaccacta cagtccgact ctatggaaga actcaagagc tacgagacag cttgcatgcc 480
gagttcaaaa agtttgctct ggatcaggga atagatgagg actccattta cattctgcca 540
aaaagagatg aatgtgtacc tggtgaacct aaagcagaat ctctcatggc acgttga 597
<210> 78
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 21. M8H5GIEGR-Human L89T
<400> 78
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttac ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 79
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 22. M8H5GIEGR-Human N1796D
<400> 79
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcgatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatggg atataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 80
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 23. M8H5GIEGR-Human T45K
<400> 80
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgaaag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 81
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 24. M8H5GIEGR-Human A135E
<400> 81
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggaac cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 82
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 25. M8H5GIEGR-Human V170S
<400> 82
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg ttctcctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 83
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 26. M8H5GIEGR-Human V148D
<400> 83
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagatgt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 84
<211> 606
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 27. M8H5GIEGR-Human G172Q
<400> 84
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaagtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccaactatga tgagtatgcc attttcctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctcag gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
agatga 606
<210> 85
<211> 594
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 33. M8H4DK-Human M41K+R66H
<400> 85
atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc aatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcaaagacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcat 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatggaac ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
agagtggttg cccagggtgt gggcatccct gaggactcca tcttcaccat ggctgaccga 540
ggtgaatgtg tccctgggga gcaggaacca gagcccatct taatcccgag atga 594
<210> 86
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<220>
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<400> 86
atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc gatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcaaagacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcgt 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatgggat ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
agagtggttg cccagggtgt gggcatccct gaggactcca tcttcaccat ggctgaccga 540
ggtgaatgtg tccctgggga gcaggaacca gagcccatct taatcccgag atga 594
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<211> 594
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<400> 87
atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc gatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcatggacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcat 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatgggat ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
agagtggttg cccagggtgt gggcatccct gaggactcca tcttcaccat ggctgaccga 540
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<213> Homo sapiens
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atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc gatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcaaagacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcat 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatgggat ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
agagtggttg cccagggtgt gggcatccct gaggactcca tcttcaccat ggctgaccga 540
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<213> Homo sapiens
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cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc aatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcaaagacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcgt 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatggaac ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
agagtggttg cccagggtgt gggcatccct gaggactcca tcttcaccat ggctgaccga 540
ggtgaatgtg tccctgggga gcaggaacca gagcccatct taatcccgag atga 594
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<400> 90
atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc aatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcatggacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcat 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatggaac ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 39. M8H4DK-Human N1796D
<400> 91
atgcatcacc atcaccatca ccatcacgat gacgatgaca agggccctgt gccaacgccg 60
cccgacaaca tccaagtgca ggaaaacttc gatatctctc ggatctatgg gaagtggtac 120
aacctggcca tcggttccac ctgcccctgg ctgaagaaga tcatggacag gatgacagtg 180
agcacgctgg tgctgggaga gggcgctaca gaggcggaga tcagcatgac cagcactcgt 240
tggcggaaag gtgtctgtga ggagacgtct ggagcttatg agaaaacaga tactgatggg 300
aagtttctct atcacaaatc caaatgggat ataaccatgg agtcctatgt ggtccacacc 360
aactatgatg agtatgccat tttcctgacc aagaaattca gccgccatca tggacccacc 420
attactgcca agctctacgg gcgggcgccg cagctgaggg aaactctcct gcaggacttc 480
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ggtgaatgtg tccctgggga gcaggaacca gagcccatct taatcccgag atga 594
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 40. M8H-Human wt
<400> 92
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggc cctgtgccaa cgccgcccga caacatccaa 60
gtgcaggaaa acttcaatat ctctcggatc tatgggaagt ggtacaacct ggccatcggt 120
tccacctgcc cctggctgaa gaagatcatg gacaggatga cagtgagcac gctggtgctg 180
ggagagggcg ctacagaggc ggagatcagc atgaccagca ctcgttggcg gaaaggtgtc 240
tgtgaggaga cgtctggagc ttatgagaaa acagatactg atgggaagtt tctctatcac 300
aaatccaaat ggaacataac catggagtcc tatgtggtcc acaccaacta tgatgagtat 360
gccattttcc tgaccaagaa attcagccgc catcatggac ccaccattac tgccaagctc 420
tacgggcggg cgccgcagct gagggaaact ctcctgcagg acttcagagt ggttgcccag 480
ggtgtgggca tccctgagga ctccatcttc accatggctg accgaggtga atgtgtccct 540
ggggagcagg aaccagagcc catcttaatc ccgagatga 579
<210> 93
<211> 579
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 41. M8H-Human R66H+N1796D
<400> 93
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggc cctgtgccaa cgccgcccga caacatccaa 60
gtgcaggaaa acttcgatat ctctcggatc tatgggaagt ggtacaacct ggccatcggt 120
tccacctgcc cctggctgaa gaagatcatg gacaggatga cagtgagcac gctggtgctg 180
ggagagggcg ctacagaggc ggagatcagc atgaccagca ctcattggcg gaaaggtgtc 240
tgtgaggaga cgtctggagc ttatgagaaa acagatactg atgggaagtt tctctatcac 300
aaatccaaat gggatataac catggagtcc tatgtggtcc acaccaacta tgatgagtat 360
gccattttcc tgaccaagaa attcagccgc catcatggac ccaccattac tgccaagctc 420
tacgggcggg cgccgcagct gagggaaact ctcctgcagg acttcagagt ggttgcccag 480
ggtgtgggca tccctgagga ctccatcttc accatggctg accgaggtga atgtgtccct 540
ggggagcagg aaccagagcc catcttaatc ccgagatga 579
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 42. untagged-Human R66H+N1796D
<400> 94
atgggccctg tgccaacgcc gcccgacaac atccaagtgc aggaaaactt cgatatctct 60
cggatctatg ggaagtggta caacctggcc atcggttcca cctgcccctg gctgaagaag 120
atcatggaca ggatgacagt gagcacgctg gtgctgggag agggcgctac agaggcggag 180
atcagcatga ccagcactca ttggcggaaa ggtgtctgtg aggagacgtc tggagcttat 240
gagaaaacag atactgatgg gaagtttctc tatcacaaat ccaaatggga tataaccatg 300
gagtcctatg tggtccacac caactatgat gagtatgcca ttttcctgac caagaaattc 360
agccgccatc atggacccac cattactgcc aagctctacg ggcgggcgcc gcagctgagg 420
gaaactctcc tgcaggactt cagagtggtt gcccagggtg tgggcatccc tgaggactcc 480
atcttcacca tggctgaccg aggtgaatgt gtccctgggg agcaggaacc agagcccatc 540
ttaatcccga gatga 555
<210> 95
<211> 555
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 61. untagged-Human wt
<400> 95
atgggccctg tgccaacgcc gcccgacaac atccaagtgc aggaaaactt caatatctct 60
cggatctatg ggaagtggta caacctggcc atcggttcca cctgcccctg gctgaagaag 120
atcatggaca ggatgacagt gagcacgctg gtgctgggag agggcgctac agaggcggag 180
atcagcatga ccagcactcg ttggcggaaa ggtgtctgtg aggagacgtc tggagcttat 240
gagaaaacag atactgatgg gaagtttctc tatcacaaat ccaaatggaa cataaccatg 300
gagtcctatg tggtccacac caactatgat gagtatgcca ttttcctgac caagaaattc 360
agccgccatc atggacccac cattactgcc aagctctacg ggcgggcgcc gcagctgagg 420
gaaactctcc tgcaggactt cagagtggtt gcccagggtg tgggcatccc tgaggactcc 480
atcttcacca tggctgaccg aggtgaatgt gtccctgggg agcaggaacc agagcccatc 540
ttaatcccga gatga 555
Claims (24)
- 하기 구조식 I 또는 하기 구조식 II의 아미노산 서열로 이루어지는 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질은 서열번호 1의 인간 야생형 알파-1-마이크로글로불린과 비교하여 개선된 열안정성을 갖는 것인, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
식 중, X1 내지 X14 중 적어도 하나가 존재하고,
X1은 존재하지 않거나 또는 Met 또는 N-포르밀 Met을 나타내고;
X2는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X3은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X4는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X5는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X6은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X7은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X8은 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X9는 존재하지 않거나 또는 His을 나타내고;
X10은 존재하지 않거나 또는 Asp, Glu, Lys 또는 Arg으로부터 선택되고,
X11은 존재하지 않거나 또는 Asp, Glu, Lys 또는 Arg으로부터 선택되고,
X12는 존재하지 않거나 또는 Asp, Glu, Lys 또는 Arg으로부터 선택되고,
X13은 존재하지 않거나 또는 Asp, Glu, Lys 또는 Arg으로부터 선택되고,
X14는 존재하지 않거나 또는 Asp, Glu, Lys 또는 Arg으로부터 선택되고,
X15는 Asp을 나타내고;
X16은 Met 또는 Lys 또는 Arg을 나타내고;
X17은 Arg 또는 His 또는 Lys을 나타내고;
X18은 Asp을 나타낸다. - 제1항에 있어서,
X1은 Met 또는 N-포르밀 Met이고,
X2, X3, X4, X5, X6, X7은 His이고,
X8 및 X9는 존재하지 않고,
X10, X11, X12 및 X13은 Asp이고,
X14는 Lys이고,
X15 내지 X18은 상기에 정의된 바와 같거나;
또는
X1은 Met 또는 N-포르밀 Met이고,
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 및 X9는 His이고,
X10, X11, X12 및 X13은 Asp이고,
X14는 Lys이고,
X15 내지 X18은 상기에 정의된 바와 같거나;
또는
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12, X13 및 X14는 존재하지 않고,
X15 내지 X18은 상기에 정의된 바와 같은, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질. - 제1항에 있어서,
X1은 Met이고,
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12, X13 및 X14는 존재하지 않고,
X15는 Asp이고,
X16은 Met이고,
X17은 His이고,
X18은 Asp인, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질. - 제3항에 있어서, 서열번호 3 또는 서열번호 18에 상응하는 아미노산 서열로 이루어지는, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질.
- 제1항에 있어서,
X1은 Met 또는 N-포르밀 Met이고,
X2, X3, X4, X5, X6, X7은 His이고,
X8 및 X9는 존재하지 않고,
X10, X11, X12 및 X13은 Asp이고,
X14는 Lys이고,
X15는 Asp이고,
X16은 Met이고,
X17은 His이고,
X18은 Asp이거나;
또는
X1은 Met 또는 N-포르밀 Met이고,
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 및 X9는 His이고,
X10, X11, X12 및 X13은 Asp이고,
X14는 Lys이고,
X15는 Asp이고,
X16은 Met이고,
X17은 His이고,
X18은 Asp인, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질. - 제5항에 있어서, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 20 또는 서열번호 22 에 상응하는 아미노산 서열로 이루어지는, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항산화제인, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헴(heme)에 결합하는, 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 알파-1-마이크로글로불린 유래 단백질 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 산화성 스트레스-연관 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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