KR102435274B1 - 약물전달시스템으로서의 안구 주입형 마이크로젤 및 이를 포함하는 하이드로젤 - Google Patents

약물전달시스템으로서의 안구 주입형 마이크로젤 및 이를 포함하는 하이드로젤 Download PDF

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Abstract

인체에 안전하고 안구 내에서 오랜 기간 동안 약물 방출이 가능한 안구 주입형 마이크로젤 및 하이드로젤이 제공된다. 이 안구 주입형 마이크로젤은 w/o 에멀젼 방식을 통해 히알루론산 공중합체를 가교반응시켜 생성한 히알루론산 마이크로젤에 약물이 탑재된 형태를 가질 수 있다.

Description

약물전달시스템으로서의 안구 주입형 마이크로젤 및 이를 포함하는 하이드로젤{Eye-injecting microgel as drug delivery system and eye-injecting hydrogel having the same}
본 발명은 약물전달시스템에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 안구 주입형 마이크로젤, 이를 포함하는 안구 주입형 하이드로젤 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
하이드로젤(hydrogel)은 분산매가 물이거나 물이 기본 성분으로 들어 있는 젤리 형태의 물질로서, 친수성이 우수하여 물을 쉽게 흡수할 수 있을 뿐만 아니라 강도, 모양 등을 쉽게 바꿀 수 있어 조직공학용 지지체 또는 약물전달 등에 사용되고 있다. 하이드로젤은 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 또는 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하여 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로젤이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것이 특징이다.
한편, 안과 질환 중 황반변성, 당뇨황반변증에 사용되는 VEGF 길항제(anti-VEGF agent)의 경우, 안구 내 반감기가 짧아서 지속기간이 짧은 것으로 알려져 있다. 따라서 VEGF 길항제의 최대 효과를 얻기 위해서는 자주 안구에 주사를 해야 하는데, 이는 환자에게 많은 불편을 야기시킬 뿐만 아니라 경제적으로도 큰 부담으로 작용한다.
이에 본 발명자들은 오랜 연구와 노력을 기울인 끝에, 안과 질환 치료를 위한 단백질 치료제제의 안구 주입용 약물전달시스템으로서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
대한민국 특허 공개공보 제10-2011-0002741호
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 인체에 안전하고 안구 내에서 오랜 기간 동안 약물 방출이 가능한 안구 주입형 마이크로젤 및 그 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 이러한 마이크로젤을 포함하는 안구 주입형 하이드로젤 및 그 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 안구 주입형 마이크로젤의 제조방법은, w/o 에멀젼 방식을 통해 히알루론산 공중합체를 가교반응시켜 히알루론산 마이크로젤을 생성하는 단계; 및 상기 히알루론산 마이크로젤에 약물을 탑재하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 마이크로젤을 생성하는 단계는, 디비닐설폰(DVS)과 히알루론산(HA)의 결합반응으로 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체를 합성하는 단계; 및 상기 합성된 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체와 디티오트레이톨(DTT)의 티올-엔 가교반응 시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 마이크로젤을 생성하는 단계는, 히알루론산-(N-하이드록시숙신이미드)(HA-NHS)와 히알루론산-아민(HA-NH2)을 NHS-NH2 가교반응 시키는 단계일 수 있다.
상기 히알루론산 마이크로젤을 생성하는 단계는, 히알루론산-티라민(HA-TA)에 호스래디시 과산화효소(HRP)와 과산화수소(H2O2)를 첨가하여 효소가교반응 시키는 단계일 수 있다.
상기 히알루론산 마이크로젤을 생성하는 단계는, 히알루론산 비닐설폰(HA-VS)과 히알루론산 티올(HA-SH)의 티올-엔 가교반응 시키는 단계일 수 있다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 안구 주입형 마이크로젤은, 하기 화학식 (1-1) 내지 화학식 (1-6)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나로 표시되는 가교기에 의해 가교된 히알루론산 공중합체로 이루어진 히알루론산 마이크로젤; 및 상기 히알루론산 마이크로젤에 탑재된 약물을 포함할 수 있다.
화학식 (1-1)
Figure 112019108602663-pat00001
화학식 (1-2)
Figure 112019108602663-pat00002
화학식 (1-3)
Figure 112019108602663-pat00003
화학식 (1-4)
Figure 112019108602663-pat00004
화학식 (1-5)
Figure 112019108602663-pat00005
화학식 (1-6)
Figure 112019108602663-pat00006
상기 히알루론산 공중합체는, 히알루론산 비닐설폰(HA-VS), 히알루론산-(N-하이드록시숙신이미드)(HA-NHS), 히알루론산-티라민(HA-TA) 및 히알루론산-말레이미드(HA-Mal)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
상기 약물은 안구 주입 가능한 단백질 치료제제, 화학약물, 저분자 치료제, 유전자 또는 세포에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 안구 주입형 마이크로젤의 평균 크기는 30 내지 160 μm일 수 있다.
상기 다른 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 안구 주입형 하이드로젤은, 상기 안구 주입형 마이크로젤이 하이드로젤 내에 분포되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 하이드로젤은 하기 화학식 (2-1) 내지 화학식 (2-3)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나로 표시되는 가교기에 의해 가교될 수 있다.
화학식 (2-1)
Figure 112019108602663-pat00007
화학식 (2-2)
Figure 112019108602663-pat00008
화학식 (2-3)
Figure 112019108602663-pat00009
상기 다른 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 안구 주입형 하이드로젤의 제조방법은, 상기 제조방법에 따라 안구 주입형 마이크로젤을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 안구 주입형 마이크로젤을 하이드로젤 내에 분포시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 안구 주입형 하이드로젤의 제조방법은, 젤라틴-폴리에틸렌글리콜-티라민(GPT) 공중합체에 호스래디시 과산화효소(HRP)와 과산화수소를 첨가하여 상기 GPT 공중합체 내 페놀 유도체를 서로 가교시켜 GPT 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 GPT 하이드로젤에 상기 안구 주입형 마이크로젤을 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 안구 주입형 하이드로젤의 제조방법은, 젤라틴-하이드록시페닐아세트산(GH) 공중합체에 호스래디시 과산화효소(HRP)와 과산화수소를 첨가하여 상기 GH 공중합체 내 페놀 유도체를 서로 가교시켜 GH 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 GH 하이드로젤에 상기 안구 주입형 마이크로젤을 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 안구 주입형 하이드로젤의 제조방법은, 히알루론산 티올(HA-SH)과 히알루론산 비닐설폰(HA-VS)을 혼합하여 HA-VS의 비닐기와 HA-SH의 티올기의 티올-엔 반응을 통해 서로 가교시켜 HA-VS/HA-SH 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 HA-VS/HA-SH 하이드로젤에 상기 안구 주입형 마이크로젤을 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 안구 주입형 마이크로젤은 히알루론산 마이크로젤에 약물이 탑재된 구조를 가지는데, 체내 안정성이 높으며 탑재된 약물이 30일 이상 서방형으로 방출되기 때문에 주사를 맞는 환자의 불편을 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명의 안구 주입형 하이드로젤은 GPT 하이드로젤 내부에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 구조를 가지는데, 마찬가지로 체내 안정성이 높으며 탑재된 약물이 긴 기간에 걸쳐 서서히 방출되는 것이 확인되었다. 나아가 안구 주입형 하이드로젤은 호스래디시 과산화효소 또는 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화시간 또는 기계적 강도를 조절할 수 있다.
도 1은 히알루론산(HA)과 디비닐설폰(DVS)의 합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 HA-VS 및 DTT를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 히알루론산 마이크로젤의 CLSM 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다.
도 6은 실험군과 대조군의 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 7은 실험군과 대조군의 망막에 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 8은 실험군과 대조군의 전방에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 9는 실험군과 대조군의 혈장에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 10a는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 1일차를 나타낸 것이다.
도 10b는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 3일차를 나타낸 것이다.
도 11은 유리액 조직의 염증임자 ELISA 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 HA-NHS 및 HA-NH2를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 12b는 HA-TA를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 12c는 HA-Mal 및 HA-SH를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 12d는 HA-VS 및 HA-SH를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 13은 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다.
도 14는 GPT 공중합체 합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 15a는 GPT 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다.
도 15b는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 GPT 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 16은 GPT 공중합체의 1H NMR 스펙트럼과 UV분석결과를 나타낸 것이다.
도 17은 HRP 농도 변화에 따른 GPT 하이드로젤의 젤화시간 변화를 나타낸 것이다.
도 18은 GPT 하이드로젤의 시간 경과에 따른 기계적 강도를 측정한 그래프이다.
도 19는 GPT 하이드로젤의 내부 구조를 나타내는 SEM 이미지이다.
도 20은 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 담지된 GPT 하이드로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다.
도 21은 실험군과 대조군의 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 22는 실험군과 대조군의 망막에 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 23은 실험군과 대조군의 전방에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 24는 실험군과 대조군의 혈장에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다.
도 25a는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 1일차를 나타낸 것이다.
도 25b는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 3일차를 나타낸 것이다.
도 26은 유리액 조직의 염증임자 ELISA 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 27a는 GH 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다.
도 27b는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 GH 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 28은 GH 공중합체의 1H NMR 스펙트럼과 UV분석결과를 나타낸 것이다.
도 29는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 담지된 GH 하이드로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다.
도 30a는 HA-VS/HA-SH 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다.
도 30b는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 HA-VS/HA-SH 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 31은 HA-SH 공중합체의 1H NMR 스펙트럼과 UV분석결과를 나타낸 것이다.
도 32는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 담지된 HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명은 안구 질환 치료를 위한 단백질 치료제제 또는 약물의 안구 주입용 약물전달시스템에 관한 것으로, 마이크로젤과 이를 포함하는 하이드로젤로 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용가능한 약물로는, 안구 주입 가능한 단백질 치료제제, 화학약물, 저분자 치료제(small molecule), 유전자 또는 세포에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 여기서 단백질 치료제제는 황반변성, 당뇨망막병증 등에 사용되는 항 혈관내피세포 성장인자, 즉 anti-VEGF(ranibizumab, aflibercept, bevacizumab, brolucizumab 등), rituximab 또는 infliximab 등으로 이루어질 수 있고, 화학약물은 dexamethasone, triamcinolone, ganciclovir, methotrexate 또는 vancomycin 등으로 이루어질 수 있고, 저분자 치료제는 sugars, lipids, amino acids, fatty acids, phenolic compounds 또는 alkaloids 등으로 이루어질 수 있고, 유전자는 siRNA(anti-VEGF) 등으로 이루어질 수 있고, 세포는 RPE, photoreceptor 등과 같은 망막 및 안구내세포, 줄기세표(stem cell) 등으로 이루어질 수 있다. 이하 약물로서 라니비주맙(ranibizumab)을 이용한 실시예를 들어 설명하고 있으나, 본 발명은 이러한 약물 종류에 한정되지 않으며 임의의 안과 단백질 치료제제, 화학약물, 저분자 치료제, 유전자 또는 세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 안구 주입형 마이크로젤은, w/o 에멀젼 방식을 통해 히알루론산 공중합체를 가교반응시켜 생성한 히알루론산 마이크로젤에 약물이 탑재된 형태로 이루어질 수 있다. 여기서, 히알루론산 공중합체는, 히알루론산 비닐설폰(HA-VS), 히알루론산-(N-하이드록시숙신이미드)(HA-NHS), 히알루론산-티라민(HA-TA) 및 히알루론산-말레이미드(HA-Mal)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
또한 본 발명의 안구 주입형 하이드로젤은, 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포되어 있는 임의의 하이드로젤로 구성될 수 있다. 본 발명에서는 안구 주입형 하이드로젤로서 GPT 하이드로젤, GH 하이드로젤, HA-VA/HA-SH 하이드로젤을 예로 들어 설명하고 있으나 본 발명은 이러한 하이드로젤의 종류에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루론산 마이크로젤 합성
<1-1> 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체의 합성
디비닐설폰(divinylsulfone, DVS) 70 mmol을 4 kDa 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 1g을 0.1M 수산화나트륨 용액 100 mL에서 혼합한 0.1 mmol/ml의 -OH를 갖는 용액에 추가하여 10분동안 반응을 시킨다. 디비닐설폰(DVS)의 비닐기와 히알루론산(HA)의 하이드록시기의 결합반응을 이용하여, 비닐설폰(vinylsulfone, VS)이 히알루론산(HA)에 결합된 히알루론산 비닐설폰(hyaluronic acid-vinylsulfone, HA-VS) 공중합체를 합성한다. 디비닐설폰 : 히알루론산의 OH 몰비율은 7:1이다. 합성 후 5M HCl을 이용하여 pH 5로 적정하여 반응을 종료한다. 멤브레인 투석(6000-8000 Da 분자량 차단)을 3일간 진행한 후 동결건조를 통해 히알루론산 비닐설폰(HA-VA) 공중합체를 수득하였다. 도 1은 히알루론산(HA)과 디비닐설폰(DVS)의 합성 모식도를 나타낸 것이다.
<1-2> 히알루론산 마이크로젤(HA microgel)의 제조
8 wt%의 합성된 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체와 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)은 티올-엔(thiol-ene) 반응을 통해 가교되며, 유중수형(w/o, water in oil) 에멀젼 방식을 통해 미네랄오일 50 ml에 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체, 디티오트레이톨(DTT) 및 약물(10배 농축 ranibizumab)을 혼합하여 넣어준 후 유화제(Span 80) 2 ml를 이용하여 히알루론산 마이크로젤(HA microgel)로 분산시킨 후 24시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 이소프로필알콜 100 ml에 넣고 미네랄 오일층을 제거한 후 원심분리를 통해 마이크로젤을 분리한다. 분리한 후 DIW에 재분산 시킨 후 동결건조를 통해 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤(HA microgel)을 얻었다. 도 2는 HA-VS 및 DTT를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다. 도 2에 도시된 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 공중합체가 하기 화학식 (1-1)로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (1-1)
Figure 112019108602663-pat00010
실험예 1. 히알루론산 마이크로젤의 물성 평가
<1-1> 1 H NMR을 통한 HA-VS 공중합체의 화학적 구조 및 비닐설폰(VS) 도입량의 분석
도 3은 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 비닐설폰(VS) 치환물의 특성 최고점인 a 및 b를 확인함으로써 합성이 잘 수행되었음을 확인하였다. 비닐설폰(VS)의 치환도(DS)는 48%로 확인되었다.
<1-2> 히알루론산 마이크로젤의 크기 분석
공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)을 이용하여 히알루론산 마이크로젤을 분석한 결과 마이크로젤의 평균 크기는 30 내지 160 μm인 것으로 확인되었다. 도 4는 히알루론산 마이크로젤의 CLSM 이미지를 나타낸 것이다.
<1-3> 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동 평가
약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤 8mg을 DPBS에서 약물방출을 유도하였다. 방출시간 간격은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 30일로 진행하였고, 방출된 약물은 효소면역분석법(ELISA)를 통해 정량하였다. 도 5는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다. 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동은 30일 이상 서방형으로 방출됨을 확인하였다.
<1-4> 동물실험을 통한 체내 약동학 평가
약물(10배 농축 라니비주맙)이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을 토끼 안구에 주입한 실험군에 대해 약동학을 평가하였다. 또한 히알루론산 마이크로젤 전달체를 이용하지 않고 약물을 토끼 안구에 주입하여 대조군으로 평가하였다. 대조군은 약물로 라니비주맙을 주입한 대조군 1과 약물로 10배 농축 라니비주맙을 주입한 대조군 2로 구성하였다. 체내 약동학 평가는 다음과 같은 방식으로 수행되었다.
마취제로 zoletil(0.3 cc/kg)과 rompun(0.25 cc/kg)을 섞은 후 근육주사하여 토끼를 마취시킨 후, 히알루론산 마이크로젤과 대조군 약물을 30-50μl 범위에서 토끼 안구에 주입하였다. 계획한 기간별로(1시간, 1일, 4일, 8일, 14일, 30일, 60일, 90일) 동일 방식으로 마취시킨 후 혈액을 채취하였고, 토끼를 희생시킨 후 안구를 적출하여 동결 보관하였다. 채취된 혈액은 원심분리하여 혈장(plasma) 샘플을 수득해 동결 보관하였다.
적출된 안구는 전방(anterior chamber), 유리액(vitreous humor) 및 망막(retina) 조직으로 분리 후 lysis buffer 처리를 통해 용해물(lysate)을 준비하였다. 혈장과 안구 내 조직들은 희석배수를 설정하고 라니비주맙 정량 효소면역분석법(ELISA)을 통해 조직 내 라니비주맙 농도를 측정하였다.
도 6은 실험군과 대조군의 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 7은 실험군과 대조군의 망막에 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 8은 실험군과 대조군의 전방에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 9는 실험군과 대조군의 혈장에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 6 내지 도 9에 나타난 바와 같이, ELISA 분석 결과 유리액, 망막, 전방 및 혈장에서 히알루론산 마이크로젤을 주입한 실험군이 대조군에 비해 긴 기간의 방출 거동을 가지는 것이 확인되었다.
<1-5> 약물 및 제형의 체내 안전성 평가(박테리아 감염평가 및 감염인자 정량평가)
안구 내 주입한 히알루론산 마이크로젤 제형의 감염, 염증 여부를 확인하기 위해, 대조군 1(라니비주맙 주입군), 대조군 2(10배 농축 라니비주맙 주입군) 및 실험군(히알루론산 마이크로젤 주입군)에 대하여 LB 배지에서 박테리아를 배양하고 유리액 조직에 대해 1일차, 3일차의 염증인자(MIP-3α, IL-2β) 정량 ELISA를 진행하였다. 도 10a는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 1일차를 나타낸 것이고, 도 10b는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 3일차를 나타낸 것이다(왼쪽부터 대조군 1, 대조군 2 및 실험군을 나타냄). 도 11은 유리액 조직의 염증임자 ELISA 정량 결과를 나타낸 것이다(왼쪽=MIP-3α, 오른쪽=IL-2β, A=대조군 1, B=대조군 2, C=실험군).
도 10a 내지 도 11에 도시된 바와 같이, 두 실험에서 감염 및 염증은 나타나지 않았다.
실시예 2. 다른 가교 방식을 이용한 히알루론산 마이크로젤의 제조 및 평가
실시예 1에서 설명한 방식 이외에, 8 wt%의 히알루론산-(N-하이드록시숙신이미드)(HA-NHS)/히알루론산-아민(HA-NH2)의 NHS-NH2 가교반응, 히알루론산-티라민(HA-TA)의 효소가교반응(HRP/H2O2), 히알루론산-말레이미드(HA-Mal)/히알루론산-티올(HA-SH)의 티올-말레이미드 가교반응, 히알루론산 비닐설폰(HA-VS)/히알루론산 티올(HA-SH)의 티올-엔 반응을 통해 가교되며, 유중수형(w/o, water in oil) 에멀젼 방식을 통해 약물이 담지된 히알루론산 마이크로젤을 제조하였다.
도 12a는 HA-NHS 및 HA-NH2를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다. 도 12a에 도시된 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 공중합체가 하기 화학식 (1-2)로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (1-2)
Figure 112019108602663-pat00011
도 12b는 HA-TA를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다. 도 12b에 도시된 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 공중합체가 하기 화학식 (1-3) 및/또는 화학식 (1-4)로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (1-3)
Figure 112019108602663-pat00012
화학식 (1-4)
Figure 112019108602663-pat00013
도 12c는 HA-Mal 및 HA-SH를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다. 도 12c에 도시된 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 공중합체가 하기 화학식 (1-5)로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (1-5)
Figure 112019108602663-pat00014
도 12d는 HA-VS 및 HA-SH를 이용한 히알루론산 마이크로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다. 도 12d에 도시된 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 공중합체가 하기 화학식 (1-6)으로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (1-6)
Figure 112019108602663-pat00015
이들 다른 가교방식을 통해 제조된 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동을 살펴보았다. 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤 8mg을 DPBS에서 약물방출을 유도하였다. 방출시간 간격은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 30일로 진행하였고, 방출된 약물은 효소면역분석법(ELISA)를 통해 정량하였다. 도 13은 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다. 각 가교방식에 따라 제조된 히알루론산 마이크로젤의 약물 방출거동은 30일 이상 서방형으로 방출됨을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 히알루론산 마이크로젤을 제조하기 위해 다양한 가교방식이 적용될 수 있다. 다만 본 발명은 이에 한정되지 않으며 그 외에 다른 가교반응을 통해서도 히알루론산 마이크로젤을 형성할 수도 있다.
실시예 3. GPT 하이드로젤 합성
<3-1> GPT 공중합체의 합성
(a) 폴리에틸렌글리콜-4-니트로페닐클로로포메이트(PEG-PNC) 합성
폴리에틸렌글리콜(PEG) 10 g (2.9 mmol)을 메틸렌클로라이드(MC) 100 mL에 용해시킨 후, 이 용액에 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 0.779 g (6.38 mmol)과 트리에틸아민(TEA) 0.645 g (6.38 mmol)을 메틸렌클로라이드(MC) 10mL에 용해시킨 용액과 4-니트로페닐클로로포메이트(PNC) 1.286 g (6.38 mmol)을 메틸렌클로라이드(MC) 50 mL에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합하였다. 이때 PEG : DMAP : TEA : PNC의 몰비율은 1 : 2.2 : 2.2 : 2.2 이었고, 반응온도는 30℃이며, 질소 분위기에서 24시간동안 반응을 진행하였다.
반응종료 후 여과기를 이용하여 용액에 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액을 농축시켰다. 농축 용액을 차가운 에테르 1800mL에 한 방울씩 떨어뜨려 침전을 생성시키고, 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득하였다. 수득된 생성물은 잔여 유기 용매를 제거하기 위해 진공오븐에서 24시간 방치한 후 결과적으로 백색의 분말형태의 생성물인 폴리에틸렌글리콜-4-니트로페닐클로로포메이트(PEG-PNC)을 수득하였다.
(b) GPT 공중합체 합성
앞서 준비된 PEG-PNC 5 g (1.471 mmol)을 디메틸설폭사이드(DMSO) 100ml에 용해시킨 용액에 티라민(TA) 0.202 g (1.471 mmol)을 DMSO 50 ml에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행하였다. PEG-PNC : TA의 몰비율은 1 : 1 이었다. 반응 온도는 30℃이며, 질소 부위기에서 6시간 반응을 진행하였다. 반응 후 젤라틴 용액(1g/200 ml in DMSO)을 혼합하여 40℃, 질소 분위기에서 24시간 반응을 진행하였다.
반응종료 후 반응용액을 증류수를 이용하여 멤브레인 투석(6000-8000 Da 분자량 차단)을 통하여 미반응 PEG-TA를 제거하였다. 투석이 완료된 후, 용액을 동결 건조하여 젤라틴-폴리에틸렌글리콜-티라민(gelatin-PEG-TA, GPT) 공중합체를 수득하였다.
도 14는 GPT 공중합체 합성 모식도를 나타낸 것이다.
<3-2> GPT 하이드로젤의 제조
합성된 젤라틴 유도체, 즉 GPT 공중합체에 호스래디시 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)와 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)를 첨가하여 GPT 공중합체 내 페놀 유도체를 서로 가교시켜서 GPT 하이드로젤을 형성한다. 여기서 GPT 하이드로젤은 호스래디시 과산화효소(HRP) 및 과산화수소의 농도를 조절하여, 젤화 시간 또는 기계적 강도의 조절이 가능하다. 도 15a는 GPT 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다. 도 15a에 도시된 하이드로젤은 하기 화학식 (2-1) 및/또는 화학식 (2-2)로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (2-1)
Figure 112019108602663-pat00016
화학식 (2-2)
Figure 112019108602663-pat00017
약물(10배 농축 라니비주맙)이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을, 호스래디시 과산화효소(HRP) 용액에 녹인 GPT 공중합체 150 μL와 과산화수소 용액에 녹인 GPT 공중합체 150 μL에 섞어서 GPT 하이드로젤 내에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포되어 있는 복합제형, 즉 안구 주입형 하이드로젤을 제조한다. 도 15b는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 GPT 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
실험예 3. GPT 하이드로젤의 물성 평가
<3-1> 1 H NMR을 통한 GPT 공중합체의 화학적 구조 분석
도 16은 GPT 공중합체의 1H NMR 스펙트럼과 UV분석결과를 나타낸 것이다. GPT 공중합체의 특성 최고점인 a, b, c를 확인함으로써 합성이 잘 수행되었음을 확인하였고, 가교분자인 페놀이 젤라틴 유도체 g당 280.17 μmol 도입된 것을 확인하였다.
<3-2> GPT 하이드로젤의 젤화시간 및 기계적 강도 조절
GPT 하이드로젤은 호스래디시 과산화효소(HRP) 및 과산화수소의 농도에 따라 젤화시간의 조절이 가능하다. 또한 각 요소에 따라 젤화시간을 최소 2초에서 최대 2분까지 조절 가능하다. 즉, HRP의 농도가 증가함에 따라 젤화시간이 짧아지고, HRP의농도가 증가할수록 과산화수소의 분해가 촉진되어 결국 라디칼의 생성속도가 빨라지게 된다. 따라서 생성된 라디칼에 의하여 젤이 형성되기 때문에 젤화시간이 빨라진다. 도 17은 HRP 농도(mg/ml) 변화에 따른 GPT 하이드로젤의 젤화시간 변화를 나타낸 것이다.
과산화수소의 농도에 따라 기계적 강도의 조절이가능하다. 과산화수소의 농도를 0.15 wt%에서 0.2 wt%까지 조절하면 기계적강도가 800 Pa에서 7000 Pa까지 조절된다. 기계적 강도의 조절은 하이드로젤의 가교 밀도가 조절되며 생기는 현상으로 하이드로젤 내부의 약물이 가교밀도가 높아질수록 천천히 방출되며 이를 레오미터를 이용해 확인했다. 도 18은 GPT 하이드로젤의 시간 경과에 따른 기계적 강도를 측정한 그래프이다.
<3-3> SEM 분석을 통한 GPT 하이드로젤의 내부 구조 분석
도 19는 GPT 하이드로젤의 내부 구조를 나타내는 SEM 이미지이다. GPT 하이드로젤 내에 히알루론산 마이크로젤이 잘 분포되어 있는 것을 확인하였다.
<3-4> GPT 하이드로젤의 약물 방출거동 평가
GPT 하이드로젤에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을 담지하여 복합제형을 제조한 후, DPBS에서 약물 방출을 유도하였다. 방출시간 간격은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 30일로 진행하였고, 방출된 약물은 ELISA를 통해 정량하였다. 도 20은 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 담지된 GPT 하이드로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다. GPT 하이드로젤의 약물 방출거동은 30일 이상 서서히 방출됨을 확인하였다.
<3-5> 동물실험을 통한 체내 약동학 평가
약물(10배 농축 라니비주맙)이 탑재된 히알루론산 마이크로젤과 GPT 하이드로젤로 구성된 복합제형을 토끼 안구에 주입한 실험군에 대해 약동학을 평가하였다. 또한 히알루론산 마이크로젤/GPT 하이드로젤 복합제형을 이용하지 않고 약물을 토끼 안구에 주입하여 대조군으로 평가하였다. 대조군은 약물로 라니비주맙을 주입한 대조군 1과 약물로 10배 농축 라니비주맙을 주입한 대조군 2로 구성하였다. 체내 약동학 평가는 다음과 같은 방식으로 수행되었다.
마취제로 zoletil(0.3 cc/kg)과 rompun(0.25 cc/kg)을 섞은 후 근육주사하여 토끼를 마취시킨 후, 복합제형과 대조군 약물을 30-50μl 범위에서 토끼 안구에 주입하였다. 계획한 기간별로(1시간, 1일, 4일, 8일, 14일, 30일, 60일, 90일) 동일 방식으로 마취시킨 후 혈액을 채취하였고, 토끼를 희생시킨 후 안구를 적출하여 동결 보관하였다. 채취된 혈액은 원심분리하여 혈장(plasma) 샘플을 수득해 동결 보관하였다.
적출된 안구는 전방(anterior chamber), 유리액(vitreous humor) 및 망막(retina) 조직으로 분리 후 lysis buffer 처리를 통해 용해물(lysate)을 준비하였다. 혈장과 안구 내 조직들은 희석배수를 설정하고 라니비주맙 정량 효소면역분석법(ELISA)을 통해 조직 내 라니비주맙 농도를 측정하였다.
도 21은 실험군과 대조군의 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 22는 실험군과 대조군의 망막에 유리액에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 23은 실험군과 대조군의 전방에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 24는 실험군과 대조군의 혈장에 대한 라니비주맙의 농도변화를 측정한 것이다. 도 21 내지 도 24에 나타난 바와 같이, ELISA 분석 결과 유리액, 망막, 전방 및 혈장에서 히알루론산 마이크로젤/GPT 하이드로젤 복합제형을 주입한 실험군이 대조군에 비해 긴 기간의 방출 거동을 가지는 것이 확인되었다.
<3-6> 약물 및 제형의 채내 안정성 평가(박테리아 감염평가 및 감염인자 정량평가)
안구 내 주입한 히알루론산 마이크로젤/GPT 하이드로젤 복합제형의 감염, 염증 여부를 확인하기 위해, 대조군 1(라니비주맙 주입군), 대조군 2(10배 농축 라니비주맙 주입군) 및 실험군(복합제형 주입군)에 대하여 LB 배지에서 박테리아를 배양하고 유리액 조직에 대해 1일차, 3일차의 염증인자(MIP-3α, IL-2β) 정량 ELISA를 진행하였다. 도 25a는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 1일차를 나타낸 것이고, 도 25b는 실험군과 대조군들에 대해 LB 배지 박테리아 배양 3일차를 나타낸 것이다(왼쪽부터 대조군 1, 대조군 2 및 실험군을 나타냄). 도 26은 유리액 조직의 염증임자 ELISA 정량 결과를 나타낸 것이다(왼쪽=MIP-3α, 오른쪽=IL-2β, A=대조군 1, B=대조군 2, C=실험군).
도 25a 내지 도 26에 도시된 바와 같이, 두 실험에서 감염 및 염증은 나타나지 않았다.
실시예 4. GH 하이드로젤 합성
<4-1> GH 공중합체의 합성
10 g의 젤라틴을 0.1M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 200 ml에 용해시켰다(용액 A). 4-하이드록시페닐아세트산(HPA) 0.609 g (4 mmol)을 0.1 M MES 50 ml에 용해시켰다(용액 B). 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 0.92 g(4.8 mmol)과 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 0.276 g(2.4 mmol)을 각각 5 ml의0.1 M MES에 용해시켰다. 그 후, EDC 용액과 NHS 용액을 용액 B에 15분 간격으로 순차적으로 가하였다. EDC/NHS로 활성화된 용액 B를 용액 A에 혼합하여 반응을 시작하였다. 이때 반응온도는 40
Figure 112019108602663-pat00018
이며, 반응시간은 24 시간이었다.
반응 종료 후, 반응용액을 주사기 필터(450 nm)를 사용하여 여과하였다. 그 후 증류수에서 멤브레인 투석(3500 da 분자량 차단)을 시행하였다. 투석이 완료된 용액을 동결 건조하여 GH(젤라틴-하이드록시페닐아세트산) 공중합체를 수득하였다.
<4-2> GH 하이드로젤의 제조
합성된 GH 공중합체에 HRP와 H2O2를 첨가하여 GH 공중합체 내 페놀 유도체를 서로 가교시켜 GH 하이드로젤을 형성한다. 도 27a는 GH 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다. 도 27a에 도시된 하이드로젤은 하기 화학식 (2-1) 및/또는 화학식 (2-2)로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (2-1)
Figure 112019108602663-pat00019
화학식 (2-2)
Figure 112019108602663-pat00020
약물(10배 농축 라이비주맙)이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을, HRP 용액에 녹인 GH 공중합체 150 μL와 과산화수소 용액에 녹인 GH 공중합체 150 μL에 섞어 GH 하이드로젤 내에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포되어 있는 복합 제형, 즉 안구 주입형 하이드로젤을 제조한다. 도 27b는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 GH 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
실험예 4. GH 하이드로젤의 물성 평가
<4-1> 1 H NMR을 통한 GH 공중합체의 화학적 구조 분석
도 28은 GH 공중합체의 1H NMR 스펙트럼과 UV분석결과를 나타낸 것이다. GH 공중합체의 특성 최고점인 a, b를 확인함으로써 합성이 잘 수행되었음을 확인하였고, 가교분자인 페놀이 GH g당 153.8 μmol 도입된 것을 확인하였다.
<4-2> GH 하이드로젤의 약물 방출거동 평가
GH 하이드로젤에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을 담지하여 복합제형을 제조한 후, DPBS에서 약물 방출을 유도하였다. 방출시간 간격은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 30일로 진행하였고, 방출된 약물은 ELISA를 통해 정량하였다. 도 29는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 담지된 GH 하이드로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다. GH 하이드로젤의 약물 방출거동은 30일 이상 서서히 방출됨을 확인하였다.
실시예 5. HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 합성
<5-1> HA-SH 공중합체의 합성
히알루론산(HA) 1g을 MES buffer 80 ml (pH 5)에 용해시켰다. EDC 1.63 g (10.5 mmol)과 NHS 1.812 g (15.75 mmol)을 각각 20 ml의 MES buffer에 용해시켰다. EDC용액과 NHS 용액을 히알루론산 용액에 15분 간격으로 순차적으로 가하였다. EDC/NHS로 활성화된 히알루론산 용액에 Cysteamine HCL 1.193 g (10.5 mmol)을 추가하여 반응을 시작하였다. 이때 반응온도는 실온이며 반응시간은 24 시간이었다.
반응 종료 후, 반응용액을 멤브레인 투석 (6000-8000 Da 분자량 차단)을 시행하였다. 투석이 완료된 용액을 동결 건조하여 티올기를 갖는 히알루론산 유도체(HA-SH, thiolated hyaluronic acid)를 수득하였다.
<5-2> HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 제조
합성된 HA-VS와 HA-SH를 혼합하여 HA-VS의 비닐기와 HA-SH의 티올기의 티올-엔(thiol-ene) 반응을 통해 서로 가교시켜 HA-VS/HA-SH 하이드로젤을 형성한다. 도 30a는 HA-VS/HA-SH 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다. 도 30a에 도시된 하이드로젤은 하기 화학식 (2-3)으로 표시되는 가교기에 의해 가교된 구조를 가진다.
화학식 (2-3)
Figure 112019108602663-pat00021
약물(10배 농축 라니비주맙)이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을, HA-SH 용액 150 μL에 섞어 HA-VS 용액 150 μL와 혼합하여 HA-VS/HA-SH 하이드로젤 내에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포되어 있는 복합 제형, 즉 안구 주입형 하이드로젤을 제조한다. 도 30b는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 HA-VS/HA-SH 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸 것이다.
실험예 5. HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 물성 평가
<5-1> 1 H NMR을 통한 HA-SH 공중합체의 화학적 구조 분석
도 31은 HA-SH 공중합체의 1H NMR 스펙트럼과 UV분석결과를 나타낸 것이다. HA-SH 공중합체의 특성 최고점인 a, b를 확인함으로써 합성이 잘 수행되었음을 확인하였고, 가교분자인 티올이 HA-SH g당 230.5 μmol 도입된 것을 확인하였다.
<5-2> HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 약물 방출거동 평가
HA-VS/HA-SH 하이드로젤에 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤을 담지하여 복합제형을 제조한 후, DPBS에서 약물 방출을 유도하였다. 방출시간 간격은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 30일로 진행하였고, 방출된 약물은 ELISA를 통해 정량하였다. 도 32는 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤이 담지된 HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 약물 방출거동을 측정한 그래프이다. HA-VS/HA-SH 하이드로젤의 약물 방출거동은 30일 이상 서서히 방출됨을 확인하였다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (15)

  1. 약물이 탑재된 구형의 히알루론산 마이크로젤이 분포되어 있는 하이드로젤로서,
    상기 마이크로젤은 히알루론산 공중합체 및 약물의 혼합액을 w/o 에멀젼 방식으로 분산시키고 가교반응하여 생성된 것이고,
    상기 하이드로젤은 젤라틴-폴리에틸렌글리콜-티라민 공중합체가 가교된 것이고,
    상기 약물은 단백질 제제인,
    안구 주입형 하이드로젤.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 비닐설폰(HA-VS) 공중합체가 디티오트레이톨(DTT)에 의해 가교된 것인,
    안구 주입형 하이드로젤.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산-(N-하이드록시숙신이미드)(HA-NHS) 및 히알루론산-아민(HA-NH2)이 가교된 것인,
    안구 주입형 하이드로젤.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산-티라민(HA-TA)이 호스래디시 과산화효소(HRP)와 과산화수소(H2O2)에 의해 가교된 것인,
    안구 주입형 하이드로젤.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 마이크로젤은 히알루론산 비닐설폰(HA-VS)과 히알루론산 티올(HA-SH)이 가교된 것인,
    안구 주입형 하이드로젤.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 마이크로젤은 하기 화학식 (1-1) 내지 화학식 (1-6)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나로 표시되는 가교기에 의해 가교된 히알루론산 공중합체를 포함하는,
    안구 주입형 하이드로젤.
    화학식 (1-1)
    Figure 112021049906151-pat00022

    화학식 (1-2)
    Figure 112021049906151-pat00023

    화학식 (1-3)
    Figure 112021049906151-pat00024

    화학식 (1-4)
    Figure 112021049906151-pat00025

    화학식 (1-5)
    Figure 112021049906151-pat00026

    화학식 (1-6)
    Figure 112021049906151-pat00027
  7. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 공중합체는, 히알루론산 비닐설폰(HA-VS), 히알루론산-(N-하이드록시숙신이미드)(HA-NHS), 히알루론산-티라민(HA-TA) 및 히알루론산-말레이미드(HA-Mal)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나를 포함하는,
    안구 주입형 하이드로젤.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 구형의 히알루론산 마이크로젤의 평균 직경은 30 내지 160 μm인,
    안구 주입형 하이드로젤.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은 하기 화학식 (2-1) 내지 화학식 (2-3)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나로 표시되는 가교기에 의해 가교되는 것을 특징으로 하는 안구 주입형 하이드로젤.
    화학식 (2-1)
    Figure 112021049906151-pat00028

    화학식 (2-2)
    Figure 112021049906151-pat00029

    화학식 (2-3)
    Figure 112021049906151-pat00030
  12. 약물이 탑재된 구형의 히알루론산 마이크로젤을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 히알루론산 마이크로젤이 분포된 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 마이크로젤을 제조하는 단계는 히알루론산 공중합체 및 약물의 혼합액을 w/o 에멀젼 방식으로 분산시키고 가교반응하여 제조하는 것이고,
    상기 하이드로젤은 젤라틴-폴리에틸렌글리콜-티라민 공중합체가 가교된 것이고,
    상기 약물은 단백질 제제인,
    안구 주입형 하이드로젤의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 하이드로젤을 제조하는 단계는,
    상기 약물이 탑재된 히알루론산 마이크로젤, 젤라틴 폴리에틸렌글리콜 티라민(GPT) 공중합체를 포함하는 호스래디쉬 과산화효소(HRP) 용액, 및 젤라틴 폴리에틸렌글리콜 티라민(GPT) 공중합체를 포함하는 과산화수소 용액을 혼합하여 제조하는 것인,
    안구 주입형 하이드로젤의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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