KR102421630B1 - 해죽순 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치약 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 치약 조성물 및 이의 제조방법으로서, 유효성분의 작용에 의해 IκB 분해에 의한 NF-κB의 전사를 완화함으로써 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키고, ERK1/2, JNK1/2 및 p38의 인산화를 유의하게 하향 조절함으로써 항염 효과를 제공하여 구강 질환 및 잇몸 질환에 대한 항염성을 강화시키는 치약 조성물 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

해죽순 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치약 조성물 및 이의 제조방법{Toothpaste composition comprising a fraction of nypa fruticans wurmb extract as an active ingredient and method for preparing the same}

본 발명은 해죽순 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 대식세포에서 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 통해 항염 효과를 발휘하는 해죽순 추출물의 분획물을 포함한 치약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

여기서는, 본 개시에 관한 배경기술이 제공되며, 이들이 반드시 공지기술을 의미하는 것은 아니다.

치약은 칫솔에 묻혀 양치질 할 때 사용하는 구강 청결용품으로서, 치약의 성분은 연마제, 불소, 감미료와 향료, 보존제로 이루어져 있다. 연마제는 치아에 붙은 프라그와 이물질을 떼어내며, 불소는 치아 표면의 소독 및 방어막을 형성해준다. 보존제는 방부 효과가 있어 제품을 장기간 보존시키는 역할을 한다. 가장 안전한 방부제로 평가받는 파라벤이 자주 사용되지만 공포 마케팅으로 인한 온갖 유해성 논란과 함께 소아에게 검출된다는 이야기 때문에 무파라벤 치약도 만들어지고 있다.

근자에는 다양한 기능성 치약이 많이 개발되어 시판되고 있는데, 그중 하나가 치아의 미백을 좋게 하기 위하여 개발한 미백 치약이 있고, 다른 종류로는 구강 질환 예방과 아울러 충치, 잇몸질환, 치주 및 치은염 예방을 위하여 약리 기능을 강화시킨 치약이 시판되고 있음은 익히 잘 알려져 있다. 이와 관련한 특허로서 국내 특허 제10-877981호(페이스트상의 미백용 치약조성물) 및 국내 특허 제0138244(생약 추출물을 함유한 치약조성물)등이 있다.

한편, 대식세포의 염증 반응은 면역 방어 시스템에서 중요한 역할을 한다. 대식세포는 지질다당류(LPS)에 의해 활성화되고, 염증 반응 시 전사인자인 NF-κB를 활성화시켜 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생산을 증가시킨다. 또한 염증성 효소인 iNOS와 COX-2의 발현을 유도하여 NO와 PGE2를 생성한다. NO의 생성은 대식세포 활성화의 지표이기도하며, 미생물이나 사이토카인의 영향을 받아 대식세포에서 생성되는 반응질소 중간체이다.

iNOS는 염증의 대표적인 매개인자인 NO를 생성하는 염증성 사이토카인으로 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나, 염증을 통해 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성한다고 한다. 따라서 iNOS의 억제는 과한 NO의 생성을 억제하는 것으로, 항염증의 효과를 기대할 수 있다.

NF-κB는 DNA의 전사과정, 사이토카인(cytokine, 세포들간의 의사전달물질)의 생성에 관여하는 단백질의 복합체로 여러 상황에서 세포의 유전자 발현을 조절하는데 이용되는 조절인자라고 하며, 염증 반응에서도 중요한 역할을 수행한다. κB는 세포질에서 불활성화의 상태로 존재하는데, 스트레스 또는 사이토카인, 바이러스, 항원 등에 영향을 받아 활성화되어 NF-κB로 변한다. 이와 같은 기전에 의해 κB가 세포질에서 핵 속으로 들어가 DNA를 만나서 mRNA를 만들어주는 전사를 일으켜 염증성 사이토카인을 만들어준다.

NF-κB 신호전달은 만성염증 유발인자의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 의도적인 LPS 처리와 같은 외부자극은 IκB-α의 분해를 유도하여 p65의 핵 내 전이를 유도하고, 핵 내 p65는 만성염증 유발인자 관련 DNA와 결합하여 만성염증 유발인자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다.

MAPK(Mitogen-activated protein kinases)는 인산화 효소로서 세포간의 신호전달과 경로에 매우 중요한 역할을 한다. MAPK를 통해 ERK 신호전달, JNK 신호전달(암, 당뇨병, 염증성 질환과 관련), p38 신호전달 등이 활성화된다. 이러한 경로의 인산화는 NF-κB를 추가로 활성화하고, 이러한 경로의 손상은 암 및 염증을 포함한 다양한 면역 질환을 유발하는 원인이 될 수 있다.

또한 최근 연구에서 phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI3K/Akt)는 세포 생존, 세포 주기 조절 및 NF-κB 활성화를 포함한 다양한 과정에서 중요한 역할을 한다는 것이 알려졌다. 또한 MAPK 신호 전달 경로(ERK1/2, JNK1/2, p38)는 면역 반응과 관련된 다양한 세포 및 생물학적 과정을 매개하는데, 이러한 경로의 인산화는 NF-κB를 추가로 활성화한다. 이러한 경로의 손상은 암 및 염증을 포함한 다양한 면역 질환을 유발하는 원인이 될 수 있기 때문에 NF-κB 및 MAPK PI3K/Akt는 다양한 염증성 질환을 완화시키는 주요 표적이다.

한편, 니파야자(Nypa fruticans Wurmb)는 발아 후 3~4년 후에 꽃대가 돋아나는데 이 모습이 죽순을 닮았다고 하여 우리나라에서는 해죽순으로 불린다. 인도, 말레이시아를 비롯한 동남아시아 및 오스트레일리아가 원산지이며 맹그로브 지대 등의 습지에서 자란다. 열매는 식용하고, 꽃자루를 절단해서 얻은 유즙은 그냥 마시거나 설탕 및 알코올을 넣어 음료로 만든다. 잎은 열대 지방의 전통 가옥 지붕을 만드는 데 쓰인다. 어린 잎은 담배를 싸는 데 쓰이기도 한다.

본 발명은 해죽순(Nypa fruticans wurmb, 니파야자 꽃대) 추출물의 분획물을 포함하여 구강 질환 및 잇몸 질환에 대한 항염성을 강화시킨 치약 조성물과 그 제조방법을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명의 목적들은 상기에 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 치약 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 해죽순을 메탄올로 추출하여 얻어지는 해죽순 추출물을 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 차례로 분획하여 얻어지는 분획물을 유효성분으로 포함하는 치약 조성물을 제공한다.

또한 상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 지질다당질로 자극된 대식세포에서 용량 의존적으로 NO 생성을 유의하게 억제하며, 지질다당질에 의해 유발된 염증 유발 사이토카인의 발현을 유의하게 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 해죽순을 메탄올을 이용하여 6 내지 8일 동안 추출하여 해죽순 추출물을 얻는 단계; 상기 해죽순 추출물을 석유 에테르 및 에틸아세테이트로 차례로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및 상기 분획물을 회전감압농축 및 동결건조한 후 분말화하여 연마제, 발포제, 습윤제, 점결제, 보존제 및 정제수와 혼합하는 단계;를 포함하는 치약 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 상기 해죽순 추출물을 얻는 단계는 해죽순 100 g에 대하여 80% 메탄올 기준 800 내지 900 ml 사용하여 추출하는 단계인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 해죽순 추출물의 분획물은 IκB 분해에 의한 NF-κB의 전사를 완화함으로써 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키고, ERK1/2, JNK1/2 및 p38의 인산화를 유의하게 하향 조절함으로써 항염 효과를 제공하여 치약 조성물로 포함됨으로써 구강 질환 및 잇몸 질환에 대한 항염성을 강화시키는 효과를 제공한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 대식세포에 대한 산화질소 생성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 단백질 수준에서 측정된 iNOS 및 COX-2 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 mRNA 수준에서 측정된 iNOS 및 COX-2 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 mRNA 수준에서 측정된 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 염증 반응 억제에서 IκB/NF-κB 신호 전달 경로에 대한 효과를 입증하기 위한 면역 블롯팅 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 분획물의 LPS에 의해 유도된 ERK1/2, JNK1/2 및 p38 인산화 수준이 억제되는 효과를 입증하기 위한 면역 블롯팅 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 해죽순 추출물의 LPS 자극 시 p65 및 IκB-α의 국소화를 시각화하기 위해 면역형광을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 또한 본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.

이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다.

한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.

본 발명은 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 치약 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것으로서, 구강 질환 및 잇몸 질환에 대한 항염성을 강화시키는 효과를 제공한다. 상기 치약 조성물은 해죽순을 메탄올로 추출하여 얻어지는 해죽순 추출물을 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 차례로 분획하여 얻어지는 분획물을 유효성분으로 포함한다.

상기 치약 조성물은 상기 유효성분 이외에 연마제, 발포제, 습윤제, 점결제, 보존제 및 정제수를 포함하고, 선택적으로 미백제, 감미제 및 착향제 중 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 해죽순 추출물의 분획물을 포함하는 유효성분은 1.0 wt% 내지 3.0 wt% 포함된다. 1.0 wt% 미만으로 포함되면 상기와 같은 효능을 발휘하는 약리 기능이 떨어질 문제가 있고, 3.0 wt% 초과하면 효능은 상승하지만 함께 첨가되는 연마제, 발포제, 습윤제, 점결제, 미백제, 보존제, 감미제, 착향제 등의 기능을 약화시킬 문제가 있다.

상기 연마제는 치아에 부착된 치구, 치석 등을 제거하여 치아면에 본래의 광택을 주는 작용을 하는 성분으로서, 탄산칼슘, 실리카 및 인산일수소 칼슘 중 1종 이상을 포함하고, 0.1 wt% 내지 10 wt% 포함된다.

상기 발포제는 계면 작용을 저하시켜 칫솔질 효과를 높이고 배합되어 있는 유효성분의 분산, 침투성을 돕는 성분으로서, 라우릴황산나트륨을 포함하고, 0.1 wt% 내지 2.0 wt% 포함된다.

상기 습윤제는 치약이 공기중에 접촉하여 고체화하는 것을 방지하는 성분으로서, 폴리에틸렌글리콜디소르비, 디솔비톨액 및 농글리세린 중 1종 이상을 포함하고, 0.1 wt% 내지 20 wt% 포함된다.

상기 점결제는 치약에 첨가되는 고체성분(연마제 등)과 액체 성분(습윤제 등)의 분리를 방지하기 위하여 첨가되는 성분으로서, 카르복실메칠셀룰로오스나트륨을 포함하고, 0.1 wt% 내지 1.0 wt% 포함된다.

상기 보존제는 치약의 변질 없이 형태를 유지하기 위한 성분으로서, 벤조산 나트륨을 포함하고, 0.01 wt% 내지 0.2 wt% 포함된다.

상기 미백제는 과산화수소, 하이드록시아파타이트, 상치 및 백반 중 1종 이상을 포함하고 0.1 wt% 내지 10 wt% 포함된다. 상기 감미제는 사카린나트륨 및 자일리톨 중 1종 이상을 포함하고 0.01 wt% 내지 0.3 wt% 포함된다. 상기 착향제는 멘톨을 포함하고 0.01 wt% 내지 1.5 wt% 포함된다.

상기 정제수는 상기 치약 조성물의 함량의 100 wt% 를 채우기 위한 잔량으로 포함된다.

상기 해죽순 추출물은 해죽순, 즉 건조된 나파야자의 꽃대를 메탄올을 이용하여 6 내지 8일 동안 추출하여 얻어진다. 이 때 해죽순 100 g에 대하여 80% 메탄올 기준 800 내지 900 ml 사용하여 실온에서 방치하여 추출한다.

상기 해죽순 추출물의 분획물은 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 차례로 분획하여 얻어지는데, 상기 해죽순 추출물을 감압회전농축기를 이용하여 40℃하에서 1/4 내지 1/2 정도까지 농축하여 대부분의 메탄올이 제거되고 거의 증류수만 남아 농축된 해죽순 추출물을 얻는다.

상기 농축된 해죽순 추출물 100 중량부에 대하여 석유에테르 40 내지 60 중량부를 혼합하여 액체-액체 분획한다. 분획 후 상층의 석유에테르층은 제거하고 하층의 수성용매층(유효성분을 포함하는 분획물층)을 회수한다. 동일한 방법으로 석유에테르를 이용한 분획을 2회 더 실시하여 수성 분획물을 얻는다.

상기 수성 분획물을 에틸아세테이트를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 액체-액체 분획한다. 더욱 구체적으로 상기 수성 분획물 100 중량부에 대하여 에틸아세테이트 40 내지 60 중량부를 혼합하여 액체-액체 분획 후 상층의 수성용매층은 제거하고 하층의 에틸아세테이트층(유효성분을 포함하는 분획물층)을 회수한다. 동일한 방법으로 에틸아세테이트를 이용한 분획을 2회 더 실시하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는다.

본 발명의 유효성분이 포함된 에틸아세테이트를 분획물을 회수하여 회전감압농축기를 이용하여 용매를 제거하고, 동결건조를 통해 분말화한 다음 최종적으로 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 획득한다.

상기 해죽순 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 DPPH 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값은 4.9 μg/mL 및 ABTS 소거 활성의 IC₅₀ 값은 3.9 ± 0.1 μg/mL으로 다른 약용 식물에 비해 항산화 활성 값이 높다.

상기 해죽순 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 LPS로 자극된 대식세포에서 용량 의존적으로 NO 생성을 유의하게 억제하는데, NO 생산 수준은 iNOS 및 COX-2의 발현과 관련이 있으며, 상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 iNOS 및 COX-2 발현을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의한 NO 방출 억제가 iNOS 및 COX-2의 억제 때문임을 알 수 있다.

또한, 상기 해죽순 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 LPS에 의해 유발된 염증 유발 사이토카인의 발현을 유의하게 억제하여 내독소 유발 염증에 항염 효과를 가질 수 있다. 또한 LPS로 자극된 대식세포에서 NF-κB p65 인산화와 핵 전위를 억제한다. 따라서 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 MAPK 및 Akt 신호 전달 경로에 의해 매개될 수 있는 NF-κB 비활성화를 통해 LPS 유도 대식세포 활성화를 억제한다.

결론적으로, 해죽순 추출물의 에틸 아세테이트 분획물의 항염증 효과는 NF-κB 경로를 중심으로 조절되며, 항염증제에 도움이 되는 천연자원으로서 월등한 가치를 갖는다.

실시예 - 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물 제조

해죽순(484.0g)을 80% 메탄올(4.2L)에서 7일 동안 추출하여 추출물을 얻었다. 추출물을 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 차례로 3회씩 분획하여 얻어진 분획물(ENF)을 4℃에서 보관하였다.

실험예

(1) 총 플라보노이드 화합물(total flavonoid compound; TFC) 분석

ENF(4 mg/mL) 100 μL를 900 μL의 H₂O 및 1 mL의 10% AlCl₃과 혼합했다. 실온에서 30분 후, 자외선(UV)/가시광선 분광광도계(Xma-3000PC, 휴먼코퍼레이션)를 이용하여 420 nm에서 혼합물을 측정하였다. TFC는 루틴의 표준 곡선(y = 0.001x + 0.0433, R² = 0.9974)과 비교하여 결정되었다. ENF의 총 플라보노이드 함량은 85.3 mg/g 이었다.

(2) 항산화 능력(Antioxidant capacity) 평가

라디칼 소거 활성은 DPPH 또는 ABTS의 흡광도 감소로 측정하였다. 라디칼 감소율은 다음 공식을 사용하여 계산되었다.

The radical scavenging activity (%) = [1 (A_Sample-A_Blank)/A_Control] x 100 (%)

A_Sample = Absorbance values of radicals following treatment with sample

A_Blank = Absorbance values of ethanol or distilled water

A_Control = Absorbance values of radicals

DPPH 용액은 에탄올에 300 μM 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl(DPPH)을 준비했다. ABTS 용액은 증류수에 7.4mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt 및 2.6mM potassium persulfate 을 준비하였다. DPPH 용액 및 ABTS 용액을 각각 515 nm, 732 nm에서 흡광도 값 1.00으로 조정했다. 40μl 부피의 ENF(25~400 μg/mL)을 760μl의 DPPH 용액 및 ABTS 용액과 혼합한 다음 25℃의 암실에서 20분 동안 반응시켰다.

분석 결과 ENF는 용량 의존적으로 DPPH, ABTS 라디칼을 제거했다.

도 1에 나타난 것과 같이 ABTS는 ENF 농도 200 μg/mL에서 최대 억제(99.6 ± 0.1%)를 보였다. ABTS 라디칼의 50%(IC₅₀)를 제거하는 데 필요한 ENF의 농도는 3.9 ± 0.1 μg/mL 이었다. 도 2에 나타난 것과 같이 DPPH는 ENF 농도 200 μg/mL에서 최대 억제(93.6 ± 0.1%)를 보였다. DPPH 라디칼의 IC₅₀은 4.9 μg/mL 이었다.

또한 ENF의 환원력은 L-ascorbic acid와 비교하였으며, 시료 농도 200 μg/mL 을 100으로 하여 상대적인 값으로 표현하였다. 도 1 및 도 2에 나타난 것과 같이 ENF 와 L-ascorbic acid는 용량 의존적으로 라디칼을 소거했다. L-ascorbic acid의 IC₅₀ 값은 ABTS와 DPPH 라디칼에서 2.4 ± 0.1 μg/mL 및 2.7 μg/mL 이었다.

(3) 세포 생존율(Cell viability)

본 발명에 사용되어진 대식세포(RAW 264.7)는 ATCC(ATCC^ㄾ CRL-2278^™, VA, USA)에서 구입했으며, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 DMEM에서 배양되었다. 또한 0.2% plasmocin prophylactic을 사용하여 마이코플라스마의 증식을 억제하였다. 그런 다음 RAW 264.7 세포를 가습 인큐베이터(5% CO₂, 37℃)에서 유지하였다.

세포 생존율(Cell viability) 에 대한 ENF의 효과를 측정하기 위하여 배양된 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 인큐베이션 하였다. ENF(25~400 μg/mL)를 24시간 동안 처리하고 시약과 함께 37℃ 및 5% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션 했다. 그 다음, 세포 생존율은 490 nm에서 microplate reader(ELX808, BioTek, Colmar, France)를 사용하여 측정하였다.

도 3에 나타난 것과 같이 400 ㎍/mL 이하의 농도에서 ENF의 독성이 확인되지 않았고 세포 성장을 유의하게 억제하지 않았다.

(4) 산화질소(NO) 생성

RAW 264.7 세포를 2시간 동안 ENF로 전처리한 후, 24시간 동안 LPS(1㎍/mL)로 처리하였다. Griess A 시약은 5%(v/v) 인산에 1%(w/v) 설파닐아미드를 함유하고, Griess B 시약은 증류수에 0.1% N-(1-Naphthyl) 에틸렌디아민 디히드로클로라이드를 함유한다. 동일한 부피의 상청액과 Griess 시약을 10분 동안 혼합했다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.

도 4에 나타난 것과 같이 LPS 처리에 의해 증가된 NO(1509.4 ± 71.5%)는 대조군(100%)에 비해 ENF 처리된 시료에 의해 농도의존적으로 감소하였다. 특히 50(875.4 ± 28.1%) 및 100 μg/mL(488.9 ± 21.2%)에서 유의하게 감소되었다.

(5) iNOS, COX-2 및 사이토카인 발현에 대한 ENF의 효과

iNOS 및 COX-2의 발현은 단백질 및 mRNA 수준에서 측정되었다

도 5에 나타난 것과 같이 단백질 수준에서 측정된 iNOS 및 COX-2 웨스턴 블롯팅 분석 결과는 LPS 자극 단백질 발현이 유의하게 상향 조절되었음을 알 수 있다. ENF는 용량 의존적 방식으로 발현을 억제한다.

또한 도 6에 나타난 것과 같이 RT-PCR 분석은 iNOS 및 COX-2 mRNA 수준이 단백질 수준과 상관관계가 있음을 보여주었다. 유의하게 증가된 iNOS(11.20 ± 0.07-fold) mRNA 발현은 대조군과 비교할 때 ENF 처리(50에서 6.74 ± 0.13-fold 및 100μg/mL에서 3.88 ± 0.18-fold) 후 감쇠되었다. RT-qPCR에 의해 검출된 바와 같이, iNOS의 발현 수준은 RT-PCR과 유사한 패턴을 따랐다. 더욱이, 유의하게 증가된 COX-2(10.87 ± 0.92-fold) mRNA 발현은 ENF 처리(50에서 4.70 ± 0.50-fold 및 100μg/mL에서 3.29 ± 0.40-fold) 후에 감쇠되었다. RT-qPCR에 의해 검출된 COX-2 발현 수준은 유사한 패턴을 따랐다.

또한 도 7에 나타난 것과 같이 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) mRNA 수준의 발현은 모든 처리군에서 용량 의존적으로 억제되었다. 유의하게 증가된 사이토카인(18.66 ± 1.91-fold, 13.48 ± 0.18-fold, 5.37 ± 0.03-fold) mRNA 발현은 ENF 처리(3.75 ± 0.27-fold, 6.85 ± 0.15-fold, 2.300μg에서 2.30μg)를 약화시켰다. 대조군과 비교할 때. RT-qPCR에 의해 검출된 바와 같이, 사이토카인의 발현 수준은 RT-PCR과 유사한 패턴을 따랐다.

(6) NF-κB 신호 전달 경로에 대한 ENF의 효과

염증 반응 억제에서 IκB/NF-κB 신호 전달 경로에 대한 ENF의 효과를 입증하기 위해 면역 블롯팅을 수행하였다. 도 8에 나타난 것과 같이 ENF는 농도 의존적 방식으로 IκB-α의 분해를 유의하게 차단했다. 또한, ENF는 p65의 총 수준을 변경하지 않고 p-p65를 유의하게 감쇠시켰다. 이 결과는 ENF가 IκB-α의 인산화를 억제함으로써 NF-κB 신호 전달 메커니즘을 억제한다는 것을 보여준다.

(7) MAPK 및 PI3K/Akt 활성화에 대한 ENF의 효과

NF-κB 신호 전달 경로를 매개하고 시작하려면 MAPK(ERK1/2, JNK1/2 및 p38)와 Akt 신호 전달 분자의 활성화가 중요하다. 따라서 ENF가 염증 매개체의 생산을 감소시키는 작용 기전을 확인하였다. 도 8에 나타난 것과 같이 LPS 유도는 Akt 인산화를 상당히 증가시켰다. 이 강화된 인산화는 ENF에 의해 억제되었다. 또한, ENF는 도 9에 나타난 것과 같이 LPS에 의해 유도된 ERK1/2, JNK1/2 및 p38 인산화 수준이 용량 의존적 방식으로 유의하게 억제됨을 보여주었다.

(8) 면역형광(Immunofluorescence) 분석

LPS 자극 시 p65 및 IκB-α의 국소화를 시각화하기 위해 면역형광을 수행했다. p65와 IκB-α의 핵 전위를 Immunofluorescence를 통해 확인하였다. 도 10에 나타난 것과 같이 LPS를 처리함으로써 p65가 핵 안으로 이동하고, 시료를 처리하였을 때 p65가 핵 밖으로 이동한 것을 알 수 있다. IκB-α는 반대양상을 보인다.

종합적으로, 상기의 결과는 ENF가 LPS 활성화 NF-κB, ERK, JNK, p38 MAPK 및 Akt 신호 전달 경로를 하향 조절함으로써 NO 생성, iNOS 및 COX-2 발현을 감소시켰음을 알 수 있다.

제조예 - 치약 조성물

ENF 동결건조 분말, 연마제, 습윤제, 점결제, 미백제, 감미제, 보존제를 교반 탱크에 정제수와 같이 투입하여 1시간 이상 진공 분위기에서 균질하게 혼합하는 1차 혼합을 실시한다. 여기에 발포제를 투입하여 1차 혼합과 동일한 조건으로 균질하게 혼합하는 2차 혼합을 실시한다. 여기에 착향제를 투입하고 1차 및 2차 혼합과 동일한 조건으로 균질하게 혼합하는 3차 혼합을 실시하여 최종의 페이스트상의 치아 미백용 치약 조성물을 얻는다.

치주염, 치통, 구취, 충치 등의 증상을 호소하거나 진단되는 성인남녀 50명을 대상으로 상기 실시 예에서 수득한 치약을 하루 3번씩 30일간 계속 사용하도록 하고, 설문조사에 의해 효과를 평가하였다. 그 결과는 하기 표 1과 같다.

	효과 없음	효과 있음	상당한 효과
치통	1	4	9
치주염	0	10	16
구취	1	4	2
충치예방	2	1	0

전술한 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

1. 해죽순 100g 에 대하여 80% 메탄올 기준 800 내지 900ml 을 사용하여 6 내지 8일 동안 추출하여 해죽순 추출물을 얻는 단계; 및
   상기 해죽순 추출물을 석유 에테르 및 에틸아세테이트로 차례로 3회씩 분획하여 분획물을 얻는 단계;를 포함하여 제조되는 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하며,
   상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 상기 해죽순을 484.0g 추출 및 분획 시 총 플라보노이드 함량이 85.3mg/g 이고,
   상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 200 μg/mL 농도로 포함되어 ABTS 라디칼을 99.6 ± 0.1% 억제하고, DPPH 라디칼을 93.6 ± 0.1% 억제하며,
   상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 LPS 처리에 의해 증가된 NO에 대하여 50 μg/mL 농도로 포함되어 875.4 ± 28.1% 감소시키고, 100 μg/mL 농도로 포함되어 488.9 ± 21.2% 감소시켜 NO 생성을 억제하고,
   상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 IκB 분해에 의한 NF-κB의 전사를 완화함으로써 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키고, ERK1/2, JNK1/2 및 p38의 인산화를 하향 조절하는 치약 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 해죽순 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 회전감압농축 및 동결건조한 후 분말화하여 연마제, 발포제, 습윤제, 점결제, 보존제 및 정제수와 혼합하는 단계;를 더 포함하여 제조되는 치약 조성물.
   
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