KR102420088B1

KR102420088B1 - 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 포함하는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102420088B1
Application number: KR1020200031067A
Authority: KR
Inventors: 노유헌; 이지원
Original assignee: 주식회사 파미니티
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2022-07-12
Also published as: KR20210115380A; WO2021182662A1

Abstract

본 발명은 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 포함하는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하여 항균, 항염, 항바이러스 활성을 나타내는 동시에, 면역 기능 개선 효과를 나타낼 수 있어, 복용량 및 복용기간이 증가하여도 부작용의 문제가 없는 면역 기능 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 포함하는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물{ANTIMICROBIAL, ANTI-INFLAMMATORY, ANTIVIRAL AND IMMUNOLOGICALLY ENHANCING COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF NEW GREEN AND CIRSIUM JAPONICUM}

본 발명은 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 포함하는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하여 항균, 항염, 항바이러스 활성 및 면역 기능 개선 효과를 나타내는 것으로, 복용량 및 복용기간이 증가하여도 부작용의 문제가 없는 면역 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

우리나라에서 하절기에 많이 발생되는 질병 중 하나인 식중독은 주로 주요 식중독균인 황색포도상구균, 바실 러스 세레우스, 살모넬라, 대장균, 리스테리아 등의 세균에 의하여 오염된 식품을 섭취하여 발생한다. 식중독 균에 감염될 경우 경미한 경우라면 자연스럽게 치유될 수도 있으나, 증세가 심한 경우 항생제 처방이 필요하다.

일반적으로 황색포도상구균의 중증 감염증을 치료하기 위하여, 현재까지 개발된 항생제 가운데 가장 강력한 항생제 중 하나인 반코마이신(vancomycin)이 사용되기도 한다.

그러나, 이러한 화합물들은 장기간 사용시 내성이 생기는 단점이 있다. 예를 들어, 1996년 반코마이신에 강한 내성을 보이는 반코마이신내성 황색포도상구 균(Vancomycin Resistant Staphylococcus Aureus, VRSA)이 발견되었고, 이외에도 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus, MRSA), 카바페넴내성 아시네토박터(Carbapenem Resistant Acinetobacter Baumanii, CRAB) 등 다제내성균이 상당수 발견되면서 이러한 항생제 내성균을 사멸시키기 위하여 합성 항생제를 대체할 수 있는 새로운 대안에 대한 요구가 증대되고 있다.

이러한 슈퍼박테리아 출현의 문제점은 새로운 항생제를 개발하는 시간보다 세균들이 항생제에 저항할 수 있는 내성을 획득하는 시간이 비교할 수 없을 정도로 빠르다는 점이다. 내성균은 다양한 방법으로 동, 식물 전반에 빠르게 전파되어 소비자가 내성균을 지닌 식품을 섭취하여 잠재적으로 내성균을 보유하게 된다.

따라서, 이러한 항생제에 대한 내성을 갖는 다제내성균의 출현과 항생제의 부작용 등을 고려하여, 입수가 용이하고 상대적으로 내성 등의 부작용이 적어 장기간 사용할 수 있는 천연 식물 유래의 항균 물질에 대한 관심이 증대되고 있다.

천연 식물 유래의 항균 물질과 관련하여, 한국 특허 공개 제2006-119406호는 은행잎을 유기 용매로 추출한 은행잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 개시하고 있고, 한국 특허 공개 제2010-20123호는 락토바실러스 플랜타룸 등의 김치 유산균의 복합 균주로 발효된 콩 발효물을 유효성분으로 함유하는 식중독 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있다.

그러나, 이들 조성물은 항균 효과가 그다지 크지 않아, 항생제 내성이 있는 슈퍼박테리아에 대한 항균 효과를 기대할 수는 없었다.

면역(Immune)이란, 인간 및 동물의 체내에서 외래성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하여 배제하고, 항상성을 유지시키기 위한 기작을 일컫는다. 여기에서 이물질을 항원(antigen)이라고 하며, 이를 제거하는 과정에 수 많은 종류의 백혈구 세포와 단백질이 관여한다. 면역은 크게 태어날 때부터 지니고 있는 선천면역과 후천적으로 생활 등에 적응되어 얻어지는 획득면역으로 구분된다.

선천면역(innate immunity)은 자연면역, 자연저항이라고도 한다. 항원에 대해 비특이적으로 반응하며 특별한 기억작용은 없다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부·점액조직, 상산성의 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등이 있다. 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 K세포 등이 있다. 또한, 대식세포에 의해 생산되는 사이토카인(cytokine)이 있다. 실제로 대부분의 감염은 상기 선천면역에 의해 방어된다. 획득면역(acquired immunity)은 선천면역을 보강하는 역할을 하며 후천면역, 적응면역(adaptive immunuty)이라고도 한다. 항원이 체내에 침입하면 림프구에 의한 면역반응이 일어나 항원에 대한 강한 저항성이 기억되어 다시 항원이 침입할 때 특이적으로 반응하여 효과적으로 항원을 제거할 수 있다. 여기에서 림프구 (lymphocytes)는 척추동물 및 포유류에서 면역 반응을 맡고 있는 백혈구 가운데 하나로 전체 백혈구 중 약 25% 정도를 차지하고 있으며, 흉선(thymus)에서 성숙되고 변형되어 면역항체를 보유하고 있어서 항원이 체내에 침입하면 그 항원이 몸 안에서 해로운 반응을 하지 못하도록 인체의 면역반응에 일차적으로 반응하는 세포이다.

획득면역에는 두 종류의 림프구가 있는데 세포성 면역(cellular immunity)을 담당하는 T세포와 체액성 면역(humoral immunity)을 담당하는 B세포로 크게 구분된다. T세포는 가슴샘의 상피세포에서 특수한 내부 환경과 흉선의 액성인자에 의해 림프구로 분화하는 세포로, B세포에 항체생산 자극을 주고 종양 세포 등의 항원을 직접 공격한다. B세포는 가슴샘과는 독립되어 골수에서 림프구로 분화하는 세포로, 항원자극 및 T세포를 매개로 한 자극에 따라 항체생산세포로 성숙하여 IgM, IgG, IgA, IgE의 항체를 생산하고 분비한다.

항원 감염에 대한 최초의 인식은 주로 대식세포(macrophage)가 수행한다. 대식세포가 항원을 탐식하는 과정에서 면역반응을 매개하는 사이토카인(cytokine)이 생산된다.

사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로 사용되는 당단백질로 면역, 감염병, 조혈기능, 조직회복, 세포의 발전 및 성장에 중요한 기능을 한다. 사이토카인은 국소부위에 염증을 유발함으로서 면역세포가 감염부위에 모이게 하는 기능을 가지고 있어, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)이라 불리기도 한다. 가장 중요한 면역기능은 인터루킨(Interleukin-1,-6,-12), 인터페론 감마(IFN-γ), 종양괴사인자(TNF)로 알려진 사이토카인의 집단에 의해 수행된다.

인터루킨(Interleukin)은 면역반응이 일어나는 여러 단계에 작용하여 면역반응을 조절함으로써 인체의 방어작용에 중요한 역할을 하는 물질로, 그 종류는 IL-1,6,12 등이 있다. 이 중 IL-12는 p35와 p40 단백질로 구성된 사이토카인으로, 선천면역과 획득면역을 서로 연결시키는 매우 중요한 면역학적 기능을 하며, 내인성 항원의 제거에 관여하는 여러 가지 작동세포 즉, 대식세표(macrophage), NK 세포 및 T-세포의 활성화를 유도한다.

IL-12의 자극에 의하여 활성화된 NK 세포 및 T-세포는 IFN-γ의 생산을 자극함으로서 초기 선천면역반응을 매개하는 주요 인자로의 특성을 가진다. 또한 T-세포의 면역기구를 주로 Th-1 성향이 되도록 유도하기 때문에 가장 중요한 세포성 면역 매개자이다.

IFN-γ(interferon gamma)는 T 림프구와 대과립구에서 생산되는 것으로 포식된 미생물이나 항원의 살해를 유도하는 물질이다. 또한, 다양한 면역조절작용을 하며, 대식세포를 활성화시킨다.

종양괴사인자인 TNF(tumor necrosis factor)는 세균벽에서 나오는 내독소인 지다당체에 의해 T세포에서 분비되는 종양을 괴사시키는 물질을 말하는 것으로, 가장 중요한 염증인자이며 때때로 중증의 전신적 염증을 유발하기도 한다. 그러나 면역학적 측면에서 TNF는 감염부위로 혈액 내 백혈구인 호중구 및 단핵구를 집합시키고 감염세포의 살해능을 가지는 작동세포로의 분화 및 활성화를 유도하는 것으로 보고 있다. 이러한 TNF의 기능은 화학주성을 가지는 사이토카인의 생산 유도능과 함께 혈관내피세포 및 백혈구 간의 부착분자(adhesionmolecule)의 친화력을 높이는 기능에 의한다.

이와 같이 면역기능은 대식세포, 림프구(T세포, B세포) 등의 매우 다양한 세포와 인터루킨, TNF 등의 사이토카인과 같은 단백질의 작용에 의해 이루어진다.

인체의 면역반응은 건강한 삶을 위해 반드시 필요한 요소이며, 현대인들은 다양한 면역 기능 증진 보조제 및 면역 기능 증진에 효과적인 식품에 대한 관심이 높다. 그러나, 면역 기능을 증진시킬 수 있는 건강기능 식품은 매우 부진한 실정이다.

본 발명의 목적은 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 포함하는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하여 항균, 항염, 항바이러스 활성을 및 면역 기능 개선 효과를 나타내며, 복용량 및 복용기간이 증가하여도 부작용이 없고, 내성 등의 부작용이 없는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물은 뉴그린 추출물, 엉겅퀴 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 조성물은 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 대장균(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 프세우도모나스(Pseudomonas) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 포도상구균(Staphylococcus) 속, 칸디다(Candida) 속, 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 누룩곰팡이(Aspergillus) 속, 클라도스포륨(Cladosporium) 속, 패실로마이세스(Paecilomyces) 속, 푸른곰팡이(Penicillium) 속, 트리코테시움(Trichothecium) 속 및 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)종으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물에 대한 항균 효과가 우수한 것이다.

상기 조성물은 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 허피스 바이러스(Herpes Virus, HSV), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory Syncytial Virus. RSV) 및 리노바이러스(Rhinovirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항바이러스 효과가 우수한 것이다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 추출 용매를 이용하여 추출된다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 상기 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 식물 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한 외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 식물 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "면역질환"이란 인체 내 면역체계의 과도한 반응으로 일어나는 질환을 뜻하며, 대표적으로 알러지 질환 등이 있다. 그러나 염증 반응이란 결국 생체 내 면역체계의 반응으로 인해 일어나게 되는 것이므로, 염증질환과 면역질환은 크게 볼 때 유사한 범위를 지칭하는 용어로 사용될 수 있는 바, 본 명세서 내에서는 뚜렷하게 구별되는 용어로 사용하지 않고, 혼용하도록 하겠다.

본 발명에 사용된 용어 "염증질환"은 외부물질 또는 내부물질이 유래하는 염증반응으로 인해 일어나는 질환으로 대표적으로 신경염증질환, 관절염 등이 있다.

뉴그린(Brassica oleracea var. botrytis aut italiana L.)은 십자화과의 브로콜리 종류로, 토스카노(Toscano)라고도 한다. 브로콜리는 꽃봉오리와 꽃대를 식용으로 하지만 뉴그린은 잎을 식용으로 하는 것이 차이점이다. 잎은 긴 타원형으로 짙은 녹색을 띠며, 앞면에 올록볼록한 요철이 있는 것이 특징이다. 추위와 습기, 병해에 강한 뉴그린은 샐러드, 쌈채, 무침, 녹즙 등 주로 생으로 먹는 것이 일반적이지만 국으로 끓여 먹거나 살짝 데쳐 초장에 찍어 먹어도 새로운 맛을 즐길 수 있다. 녹색 채소 중에서도 영양가가 높은 채소로 인정받는 뉴그린은 수분(86.4%) 외에 탄수화물(6.7%), 단백질(4.7%), 지질, 다량의 무기질과 비타민 등으로 구성되어 있다. 특히 비타민 C와 베타카로틴, 칼륨, 칼슘, 인은 보통 채소의 2배에 달할 정도로 높은 영양가를 함유하고 있다.

엉겅퀴(Cirsium japonicum var. maackii (Maxim))는 국화과에 속하는 여러해살이풀로, 한국, 일본, 중국 북동부에 분포하며, 가시나물 혹은 항가새라고도 한다. 높이 50 내지 100 ㎝이고 전체에 흰털과 더불어 거미줄과 같은 털이 있다. 뿌리 잎은 꽃필 때까지 남아있고 줄기 잎보다 크다. 줄기 잎은 피침상 타원형으로 깃처럼 갈라지고 밑은 원대를 감싸며 갈라진 가장자기가 다시 갈라지고 결각상의 톱니와 더불어 가시가 있다. 꽃은 6~8월에 피고 자주색에서 적색이다. 총포의 포편은 7~8열로 배열하고 안쪽일수록 길어진다. 열매는 수과이며 관모는 길 이 16 내지 19 ㎜이다. 잎이 좁고 녹색이며 가시가 다소 많은 것을 좁은 잎 엉겅퀴, 가시가 많은 것을 가시엉겅퀴라 한다.

이러한 엉겅퀴는 약재로서는 대계라고 불리며 양혈지혈(凉血止血), 활혈해독(活血解毒) 및 소염의 효능이 있는 것으로 알려진 바 있다(육창수 외, 1998; 박종희 외, 2000). 특히 엉겅퀴는 지혈작용이 우수한 것으로 알려져 있는데 지혈작용을 나타내는 주성분은 펙토리나린(pectolinarin)이라는 성분인데 마우스를 이용한 실험에서 용량 의존적으로 출혈시간의 단축이 관찰된다는 내용이 보고되었다(Ishida et al., 1987). 또한, 엉겅퀴는 림프구의 증식을 촉진시킴과 동시에 NK 세포의 활성을 증가시키고 종양을 억제하는 활성이 있어 항암 및 면역 증강 효과를 가지고 있는 것으로 여겨지며(Liu et al., 2006), 이 외에도 감기, 백일해, 장염, 신장염, 토혈, 혈뇨, 혈변 또는 산후에 출혈이 멎지 않을 때나 대하증 및 종기와 같은 증상의 치료에도 사용된다고 알려진 바 있다(Lee, 2002; Kim, 1997).

상기 조성물은 TNF-α, 및 IL-12의 사이토카인 생성을 증가시키는 것으로 우수한 면역 반응을 나타내는 것이다.

사이토카인(cytokine)은 면역세포로부터 분비되는 단백질 면역조절제로서 자가분비형 신호전달(autocrine signaling), 측분비 신호전달(paracrine signaling), 내분비 신호전달(endocrine signaling) 과정에서 특정 수용체와 결합하여 면역반응에 관여한다. 세포의 증식, 분화, 세포사멸 또는 상처 치료 등에 관여하는 다양한 종류의 사이토카인이 존재하며, 특히 면역과 염증에 관여하는 것이 많다.

이 중 가장 중요한 면역기능은 인터루킨(Interleukin-1,-6,-12), 인터페론 감마(IFN-γ), 종양괴사인자(TNF)로 알려진 사이토카인의 집단에 의해 수행된다.

인터루킨(interleukin, IL)은 백혈구에서 분비되어 면역계 조절 기능에 관여하며 현재 30종류 이상이 알려져 있다. 인터루킨은 면역반응이 일어나는 여러 단계에 작용하여 면역반응을 조절함으로써 인체의 방어작용에 중요한 역할을 하는 물질로, 그 종류는 IL-1,6,12 등이 있다.

이 중 IL-12는 p35와 p40 단백질로 구성된 사이토카인으로, 선천면역과 획득면역을 서로 연결시키는 매우 중요한 면역학적 기능을 하며, 내인성 항원의 제거에 관여하는 여러 가지 작동세포 즉, 대식세표(macrophage), NK 세포 및 T-세포의 활성화를 유도한다. IL-12의 자극에 의하여 활성화된 NK 세포 및 T-세포는 IFN-γ의 생산을 자극함으로서 초기 선천면역반응을 매개하는 주요 인자로의 특성을 가진다. 또한 T-세포의 면역기구를 주로 Th-1 성향이 되도록 유도하기 때문에 가장 중요한 세포성 면역 매개자이다.

인터페론(interferon, IFN)은 바이러스의 증식 방지나 세포 증식 제어의 기능을 하며 면역 체계에서도 중요한 기능을 한다. 인터페론은 알파(α), 베타(β), 감마(γ), 그리고 오메가(ω)형이 있다. 인터페론-α는 주로 대식세포에 의해 분비되고 인터페론-β는 섬유아세포(fibroblasts)에서 주로 분비된다. 인터페론-γ는 Th1 세포와 NK세포에 의해 분비되고, 인터페론-ω는 영양포 또는 영양아층(Trophoblast)에 의해 주로 분비된다. 특히, 인터페론-γ(IFN-γ)는 T 림프구와 대과립구에서 생산되는 것으로 포식된 미생물이나 항원의 살해를 유도하는 물질이다. 또한, 다양한 면역조절작용을 하며, 대식세포를 활성화시킨다.

종양괴사인자인 TNF(tumor necrosis factor)는 염증반응과 관련된 세포 신호전달 단백질로서, 급성기반응을 유도하는 사이토카인이다. 종양괴사인자는 종양괴사인자-α(TNF-α)와 림포독소(lymphotoxin)라 불리는 종양괴사인자-β(TNF-β)로 나뉘지만, 일반적으로 종양괴사인자는 종양괴사인자-α를 가르킨다.

따라서, 본 발명의 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물에 의한 면역 기능 향상 효과에 경우, 인체 독성과 부작용 문제가 없는 천연물을 사용하여, 면역반응을 활성화시키는 TNF-α 및 IL-12의 사이토카인 생성을 증가시키는 것이다.

상기 조성물은 알레르기, 염증질환 및 면역질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환을 예방하는 것이다.

알레르기(Allergy)는 대부분의 사람에게서는 특별한 문제가 되지 않는 물질에 대한 면역계의 과민반응에 의해서 나타나는 여러 증상을 일컫는다. 이에는 꽃가루병, 음식 알레르기, 아토피성 피부염, 천식 및 그 외의 과민증 등을 포함하고, 안구 충혈, 가려운 피부 발진, 콧물, 호흡곤란 및 부종 등의 증세를 나타낸다.

염증(inflammation)은 특정 조직의 손상 또는 감염에 대한 일종의 생체 내 반응이며, 주요 매개체는 면역세포로, 조직의 손상된 부위나 감염 부위에 따라 급성 염증(acute inflammation)과 만성 염증(chronic inflammation)으로 나뉜다. 조직의 손상된 부위나 감염 부위가 작거나 일시적 일 때는 급성염증에 의해 해결되지만, 염증 부위가 크거나 만성적 감염 상태일 때는 급성염증에 의해 해결되지 않으며, 만성염증으로 진행된다. 만성염증의 경우는 고질적인 염증성질환으로 진행될 수 있다.

면역질환은 특정 면역 반응이 일어날 경우 문제가 되는 질환을 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 자가면역질환, 이식거부, 이식편대숙주병 일 수 있으며, 자가면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염 등일 수 있다.

상기 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물은 난티나무 추출물, 개새비 나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군을 추가로 포함한다.

바람직하게 상기 조성물은 난티나무 (Ulmus laciniata(Trautv.) mayr) 추출물, 개새비나무(Callicarpa shiraswana Makino) 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함한다.

난티나무 (Ulmus laciniata(Trautv.) mayr)는 쌍떡잎식물 이판화군 쐐기풀목 느릅나무과 낙엽활엽 교목으로, 산허리 밑의 골짜기에서 자란다. 높이는 20m, 지름 1m 정도이고 작은가지는 연한 갈색이다. 잎은 어긋나고 긴 타원형 또는 거꾸로 세운 달걀 모양으로 넓으며 가장자리가 3군데 깊이 패였으며 급히 뾰족해진다. 또한 길이 10∼20cm이고 가장자리에 예리한 겹톱니가 있으며 표면은 거칠고 털이 있으며 뒷면은 연한 녹색이다. 꽃은 양성(兩性)으로 4∼5월에 피는데, 화피(花被)가 5∼6개로 갈라진다. 5∼6개의 수술은 자홍색이며 암술대가 두 개로 갈라진다. 열매는 시과(翅果)이고 편평하며 길이 1.5cm로 넓은 달걀 모양이고 5∼6월에 익는다. 기구재나 땔감 등으로 사용되고, 나무껍질은 약용재료로 사용한다.

개새비나무(Callicarpa shiraswana Makino)는 우리나라 남해안 도서지방 산록의 수림에서 자라며, 내한성은 약하나 내음력이 강해 바닷가에서 잘자란다. 잎은 마주나기하며 달걀모양, 타원형 또는 타원상 피침형이고 점첨두이며 원저 또는 예저이고 길이 3~12cm, 폭 2.5~5cm로서 양면에 잔 선점이 있으며 표면에 짧은 털이 있고 뒷면에 성모가 밀생하며 가장자리에 예리한 톱니가 있고 엽병은 길이 5~10mm로서 성모가 밀생한다. 꽃은 8월에 피며 취산꽃차례는 액생하고 성모가 밀생하며 꽃받침은 5개로 깊게 갈라지고 성모 또는 우상의 털이 밀생한다. 꽃부리는 길이 4~5mm로서 연한 자주색이며 판통은 꽃받침과 길이가 거의 같고 수술은 화관과 길이가 같다.

상기 조성물은 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물에 더하여, 난티나무 추출물, 개새비나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하여 사용하며, 복합 추출물로 사용 시, 항균, 항염, 항바이러스 활성 및 면역 기능 개선 효과가 우수하게 나타날 수 있다.

또한, 난티나무 추출물, 개새비나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하여 사용할 경우, 복합 추출물로 구성함에 따라, 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물만을 혼합으로 사용하는 경우에 비해, TNF-α 및 IL-12의 사이토카인 생성을 증가시키는 것으로 우수한 면역 반응을 나타낼 수 있으며, 나아가 기호성 높은 스트레스 완화 및 피로 회복용 조성물로 제공을 가능하게 한다.

바람직하게 본 발명의 조성물은 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물 100 중량부에 대해, 난티나무 추출물 40 내지 60 중량부, 개새비나무 추출물 40 내지 60 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서 복합 추출물로 사용하는 경우, 각 성분 간의 복합 작용으로 인해 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선 효과가 더욱 상승하게 된다.

상기 추출물을 분쇄한 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 6의 알코올과 같은 극성 용매 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 보다 상세하게는 추출 용매로 물을 이용할 수 있다. 이때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 추출한 추출물일 수 있다.

상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 상세하게는 1 내지 24시간 동안 방치될 수 있다.

여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.

구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선 효과를 증강시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성 이온음료, 기능성이온음료, 주스(예를 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 면역치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 또는 미용액 등이 있다. 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클 렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 포함하는 항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물에 의하면 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하여 항균, 항염, 항바이러스 활성 및 면역 기능 개선 효과를 갖는 동시에 복용량 및 복용기간이 증가하여도 부작용의 문제가 없는 면역 기능 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 의한 항균 효과 실험을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 의한 항균 효과를 Time kill 방법을 통해서 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 의한 항바이러스 효과 실험을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 의한 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 의한 산화질소(NO) 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물로 처리된 배양액 내에 존재하는 TNF-α 농도를 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물로 처리된 배양액 내에 존재하는 인터루킨-12 농도를 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 추출물의 제조]

1. 뉴그린 에탄올 추출물의 제조

먼저 엉겅퀴 세척하고 건조한 뒤 이를 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 에탄올에 혼합하고 이를 2시간 추출하고, 이를 냉각시킨 뒤 와트만 여과지로 여과하여 그 여액을 수득하여 뉴그린 에탄올 추출물(NEE)로 제조하였다.

2. 뉴그린 열수 추출물의 제조

세척한 엉겅퀴를 건조한 뒤 이를 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 정수된 물에 넣어 130℃의 온도에서 5시간 동안 열수 추출하여 여과포를 이용해 뉴그린 열수 추출물(NHE)을 제조하였다.

3. 엉겅퀴 추출물의 제조

상기 뉴그린 에탄올 추출물(NEE) 및 뉴그린 열수 추출물(NHE)과 동일한 방법으로 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE) 및 엉겅퀴 열수 추출물(JHE)을 제조하였다.

4. 기타 에탄올 추출물의 제조

상기 뉴그린 추출물(NEE)과 동일한 방법으로, 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 제조하였다.

5. 복합 추출물의 제조

상기 뉴그린 에탄올 추출물(NEE), 뉴그린 열수 추출물(NHE), 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE), 엉겅퀴 열수 추출물(JHE), 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 하기 표 1과 같은 함량 범위로 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.

	MX1	MX2	MX3	MX4	MX5	MX6	MX7	MX8	MX9	MX10	MX11	MX12
NEE	100	-	100	100	100	100	100	-	-	-	-	-
JEE	100	-	100	100	100	100	100	-	-	-	-	-
NHE	-	100	-	-	-	-	-	100	100	100	100	100
JHE	-	100	-	-	-	-	-	100	100	100	100	100
UEE	-	-	30	40	50	60	70	30	40	50	60	70
CEE	-	-	30	40	50	60	70	30	40	50	60	70

(단위: 중량부)

[실험예 1: 항균 효과]

상기 뉴그린 추출물(NEE, NHE) 및 엉겅퀴 추출물(JEE, JHE)의 항균 효과를 알아보기 위해 항미생물 활성 실험을 진행하였다. 영양 한천 (NA) 배지에 확산 된 108 CFU / ml의 박테리아를 함유하는 100 ㎕의 현탁액을 사용하여 디스크 확산 시험을 진행하였다.

멸균 6mm 직경의 여과지 디스크에 300 ㎍의 모든 멸균 시험 물질을 함침시키고 영양 한천에 두었다. 뉴그린 추출물(NEE, NHE) 및 엉겅퀴 추출물(JEE, JHE)을 용해시키기 위해 사용된 것과 동일한 용매를 사용하여 음성 대조군으로 제조하였다.

NV30 (30μg novobiocin/disc), SAM20 (10μg sulbactam + 10μg ampicillin/disc), CC2 (2μg clindamycin/disc), OFX10 (10 μg ofloxacin/disc), AMC30 (20μg amoxicillin+ 10μg clavulanic asit/disc), KF30 (30 μg cephalothin/disc), TE30 (30μg tetracycline/disc), AZM15 (15 μg azithromycin/disc), AMP20 (20 μg/disk Amphotericin) 은 테스트된 각 박테리아 종에서 하나의 균주의 감도를 결정하기 위해 양성 기준 표준으로 사용하였다.

박테리아가 접종된 플레이트를 27 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 항균 활성은 명확한 성장 억제 영역의 직경 (mm)으로서 측정되었다. 플레이트 당 5 개의 디스크 및 3 개의 플레이트가 사용되었고, 각 테스트는 3 회 실행하였다.

그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.

	뉴그린 추출물		엉겅퀴 추출물		뉴그린과 엉겅퀴 혼합 추출물		Positive control
	에탄올 추출물 (NEE)	열수추출 (NHE)	에탄올 추출물 (JEE)	열수추출 (JHE)	에탄올 추출물 (MX1)	열수추출 (MX2)	Positive control
Acinetobacter lwoffi 2819	3	-	-	-	8	-	18(AMC30)
Alcaligenes feacalis 0452	-	-	2	-	3	-	8(SAM20)
Bacillus cereus 6230	1	-	3	1	4	2	12 (CC 2)
Bacillus subtilis ATCC 6633	-	-	-	-	-	-	15 (NV 30)
Enterobacter cloacae 7418	-	-	-	-	-	-	13(OFX10)
Escherichia coli 1328	5	-	-	-	9	-	17 (CC 2)
Escherichia coli 1402	-	-	2	-	6	2	18 (CC 2)
Klebsiella pneumonia subsp. ozanae 5713	-	-	-	-	-	-	18 (CC 2)
Klebsiella pneumonia subsp. pneumonia 2124	-	-	-	-	-	-	15(OFX10)
Listeria monocytogenes 8353	3	-	3	-	7	-	22 (TE 30)
Proteus mirabilis 3242	-	1	-	-	3	1	13(OFX10)
Proteus vulgaris KUKEM 1329	-	-	-	-	-	-	17(AMC30)
Providencia alcaliaciens 3215	-	1	-	-	-	1	12(AZM15)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027	2	-	-	-	4	-	30 (TE 30)
Pseudomonas aeruginosa 3428	-	-	1	-	-	-	30 (TE 30)
Pseudomonas fluorescens 7324	-	-	-	-	-	-	29(OFX 10)
Pseudomonas pseudoalcaligenes 3445	3	-	13	1	16	3	26(OFX 10)
Pseudomonas putida 1617	-	-	-	-	-	-	18 (TE 30)
Salmonella typmiruim RSSK 95091	-	-	-	-	3	-	11(OFX 10)
Staphylococcus aureus 7231	-	1	-	1	-	4	19 (KF 30)
Staphylococcus hominis 3221	-	-	5	-	8	-	22 (KF 30)
Streptococcus pyogenes ATCC 176	-	-	-	-	-	-	28 (NV 5)
Candida albicans ATCC 1223	-	-	2	2	14	-	13(AMP20)
Saccharomyces boulardii 6128	-	-	-	-	-	-	13(AMP20)
Saccharomyces cereviciae 6541	-	-	-	-	11	-	10(AMP20)
Aspergillus niger BC 102	2	-	11	-	15	-	28(AMP20)
Cladosporium herbarum	-	-	-	-	-	-	14(AMP20)
Paecilomyces variotii 108	-	-	-	-	-	-	22(AMP20)
Penicillium brevicompactum	-	-	-	-	-	1	18(AMP20)
Penicillium roquefortii BC 111	1	-	2	2	10	-	9 (AMP 20)
Penicillium roquefortii BC 113	-	-	-	-	2	-	10(AMP20)
Trichothecium roseum	-	-	-	-	-	-	29(AMP20)

(단위: mm)

표 1에 나타낸 바와 같이, 총 32종의 미생물을 대상으로 확인한 결과, 뉴그린 추출물은 열수 추출(NHE)과 에탄올 추출(NEE)에서 각각 32종의 미생물중 3종, 8종에서 항균효과가 있었다.

엉겅퀴 추출물은 열수 추출(JHE)과 에탄올 추출(JEE)에서 각각 32종의 미생물 중 5종, 10종에서 항균효과가 있었다.

그리고 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물은 열수 추출(MX2)과 에탄올 추출(MX1)에서 각각 32종의 미생물중 7종, 16종에서 항균효과가 있었다.

특히, 에탄올을 이용한 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)은 항균구역이 16 mm까지 나타나고 전반적으로 다른 물질들에 비해서 항균구역이 크게 나타는 것을 확인할 수 있었다. 일부 미생물에서는 positive control 사용된 항생제 보다 더 넓은 항균구역을 보이는 만큼 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출은 매우 높은 항균 효과를 보였다.

TKC (Time killing curve) 방법

TKC (Time killing curve) 방법은 임상 실험실 표준 국가위원회 방법 (NCCLS, 1999)에 따라 실행하였다. 항균 효과를 TKC (Time killing curve) 방법을 통해서 확인하기 위해, 임상 균주에 대해 1 × MIC를 테스트함으로써. TKC는 뉴그린 추출물(NEE, NHE) 및 엉겅퀴 추출물(JEE, JHE)의 평균 콜로니 수 (log cfu / ml)를 단독으로 그리고 항생제와 함께 시간에 대해 플롯팅하여 구축하였다. 6 개의 다른 임상 분리 물의 박테리아 현탁액을 37 ℃에서 부드럽게 진탕하면서 항 미생물제 또는 이들의 조합과 함께 배양하고, 생존 가능한 박테리아 수를 0, 2, 4, 7, 24 시간의 배양 후에 수행하였다. 이를 위해, 1 밀리리터의 현탁액을 제거하고 멸균 식염수로 연속 희석하였다.

이어서, 100 ㎕의 박테리아 현탁액 또는 희석액을 TSA 플레이트에 스팟팅하고, 37 ℃에서 플레이트를 밤새 인큐베이션 한 후 cfu를 결정하였다. 항생제-비 함유 대조군을 각 균주에 대해 포함시켰다. 타임 킬 분석에 대한 검출의 최저 한계는 1 log cfu / ml이었다. 항생제 이월은 NCCLS 지침에 따라 초기 행진의 측면에서 식민지 성장의 억제에 의해 제어되었다. 결과는 가장 활성제 단독의 효과와 비교하여 조합의 효과에 의해 해석되었다. 상승 작용 및 길항 작용은 각각 24 시간에 콜로니 수에서 2 log cfu / ml 감소 및 증가로 정의되었다. 살균 활성은 초기 접종원으로부터 ≥ 3 log cfu / ml 감소로 정의되었다.

그 결과를 하기 도 2에 나타내었으며, 뉴그린과 엉겅퀴 복합 추출물(MX1, MX2)을 처리했을때 단독 처리에 비해서 오랜 시간 동안 항균 효과를 보이는 것을 확인하였다.

특히, 에탄올을 이용한 뉴그린과 엉겅퀴 복합 추출물(MX2)을 처리했을 때 더욱 오랜 시간 동안 항균 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

[실험예 2: 항바이러스 효과]

세포 독성

상기 실험예 1에서 우수한 항균 효과를 나타낸 뉴그린 에탄올 추출물(NEE), 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE) 또는 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1)을 사용하여 세포 독성을 측정하였다. 세포 병리학적 효과는 3 일의 배양 후 육안 검사에 의해 평가하였다. 세포 독성 및 바이러스 유발 세포 병증 효과는 분석에 의해 측정하였다. 50 % 세포 독성 농도 (CC 50) 값은 RAW 264.7 세포에 24 시간 동안 처리하여 다양한 용량의 각 추출물로 측정한 후에 측정하였다. 각 추출물을 멸균 PBS에 3000 μg / mL의 농도로 용해시키고 여과 (0.2-μ m 기공 크기 막)로 멸균 한 다음 무균상태로 200, 500, 1000, 1500 및 2000 μg /mL 농도로 멸균 PBS로 희석하였다.

용량 의존성을 평가하기 위해, 동일한 부피의 뉴그린 추출물(NEE), 엉겅퀴 추출물(JEE) 또는 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1) 제거 성분물을 동일한 부피의 MNV-1에 첨가하여 8.09 log10 PFU / mL 또는 4.38 log10 PFU / mL의 역가를 생성하고 30분 동안 배양 실온에서 분석하였다. 이 연구에서, 50 % 유효 농도 (EC 50) 값은 MNV-1에 의해 유발된 세포 병원성 효과의 50 %에만 도달하는데 필요한 각 추출물들의 농도인 것으로 간주되었다.

선택성 지수는 MNV-1- 유도 세포 사멸을 억제하는 효과 (CC 50 / EC 50)에 의해 결정되었다.

시간의존성 분석을 위해 뉴그린 추출물(NEE), 엉겅퀴 추출물(JEE) 또는 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1)의 각각 농도 (250 μg / mL)를 동일한 부피의 MNV-1에 첨가하고 0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 분 동안 배양 실온에서 2-thiouridine 을 양성 대조군으로 사용하였다. 처리되지 않은 대조군을 위해, 우리는 PBS와 혼합된 개별 바이러스를 사용했다. 배양 후, PBS를 첨가하여 각 혼합물의 반응을 종결시켰다.

그 결과를 도 3에 나타내었으며, 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1)이 바이러스로 인해 유발되는 세포 독성으로부터 세포들을 보호할 수 있다는 것을 확인하였다.

MOCK 세포에 Influenza A/WSN/33 virus를 0.05 MOI로 처리한 결과 24시간 후 세포의 약 62% 가량의 세포 사멸을 확인하였다. 그러나, 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1)을 처리한 경우 세포를 대조군과 유사한 정도로 세포 생존율을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

항바이러스 활성

추출물의 항바이러스 효과를 확인하기 위하여 각 추출물의 시간 의존적인 바이러스 역가 (Murine Norovirus titer) 감소를 확인하였다. 250 μg / mL 농도의 뉴그린 추출물(NEE), 엉겅퀴 추출물(JEE) 또는 뉴그린과 엉겅퀴 복합추출물(MX1)을 각각 8 log10 PFU/mL의 동일 바이러스 농도와 섞어서 60 분간 실온에서 인큐베이션하였다.

각 바이러스는 10분 단위로 회수되었고 표준화된 플라크 회수 분석방법을 사용해서 감염율을 확인했다. 각각 실험조건은 3회 반복실험하였으며 평균값으로 나타냈다. 대조군과 비교하여 통계학적 차이를 보이는 것은 * 표시로 나타냈으며 p ≤ 0.05로 지정되었다.

그 결과를 도 4에 나타내었으며, 뉴그린과 엉겅퀴 추출물들은 항바이러스 효과를 보였다.

[실험예 3: 복합 추출물의 항균 및 항바이러스 효과]

상기 실험예 1 내지 2에 나타낸 뉴그린 추출물(NEE, NHE), 엉겅퀴 추출물(JEE,JHE), 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1, MX2)의 실험 방법과 동일한 방법으로 나머지 복합 추출물 MX3 내지 MX12의 효과를 비교하여 나타내었다.

그 결과를 하기 표 3에 종합적으로 나타내었으며, 객관적인 비교를 위하여, MX1의 효과를 지수 5로 나타내었으며, 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 우수한 것이다.

하기의 평가 지수는 1 내지 10의 지수로 변환하여 나타내었다.

	NX1	NX3	NX4	NX5	NX6	NX7	NX8	NX9	NX10	NX11	NX12
항균 효과	5	6	8	9	10	8	6	6	7	7	6
항바이러스 효과	5	7	8	8	9	7	5	6	6	7	6

(단위: 지수)

상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 더 포함하는 MX3 내지 MX12에 의하는 경우 우수한 항균 및 항바이러스의 활성을 나타냈으며, 특히, 뉴그린 에탄올 추출물(NEE) 및 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE)에 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 더 포함하는 NX4 내지 NX6에 의하는 경우 항균 및 항바이러스의 활성을 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다.

[실험예 4: 면역증진 능력]

산화질소(NO) 생성량 측정

뉴그린 에탄올 추출물(NEE), 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE) 및 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)의 면역증진 능력을 확인하기 위하여 griess reagent[1% (w/v) sulfanilamide in 5%(v/v) 인산(phosphoric acid)과 0.1% (w/v) 나프틸에틸렌다이아민-염산(naphtylethylenediamine-HCl)]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO^2-의 생성농도를 측정하였다.

상기 산화질소의 생성은 면역계에서 종양세포나 세포 내 감염된 미생물에 대한 방어 작용을 하는 중요한 신호전달 물질로 알려져 있다.

실험방법은 RAW 264.7 세포를 6-well plate에 5X10⁵ cell/well의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후에 뉴그린 에탄올 추출물(NEE), 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE) 및 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)을 농도별(30, 50, 150, 200 ug/mL)로 각각 처리하였으며, 정상 대조군으로 상기 시료를 0 ug/mL로 처리하고, 양성 대조군으로 지방질 다당류를 1 ug/mL로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 세포 배양액의 상층액과 동량의 griess reagent를 혼합하여 상온에서 15분 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아질산소듐(sodium nitrite)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 산화질소 농도를 구하여 환산하였다.

그 결과를 하기 도 5에 나타내었으며, 도 5에 나타낸 바와 같이, 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)에 의하는 경우 정상 대조군(CON)에 비하여 150 ug/mL와 200 ug/mL의 농도에서 유의적인 증가가 나타났으며, 양성 대조군(LPS)에 비해 유의적인 수준의 산화질소를 생성하는 것을 확인하였다.

상기 산화질소의 과량 생성은 전신적 염증을 유발하여 생체에 여러 부정적인 영향을 미치지만 적정량의 산화질소의 생성은 선천성 면역의 중요한 인자로써 여겨지므로 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)에 의하는 경우 면역기능 활성이 우수한 것을 확인하였다.

TNF-α 및 IL-12 생성능 측정

세포배양액 내의 TNF-α 및 IL-12의 분비량은 ELISA kit(BD Bioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 capture antibody(anti-mouse TNF-α 및 IL-12)를 각각 분주하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 이를 washing buffer(0.05% Tween-20이 포함된 PBS)로 세척한 후 10% FBS가 함유된 phosphate-buffered saline(PBS)으로 1시간 동안 blocking한 뒤 washing buffer로 세척하였다. 각 microplate 에는 산화질소를 측정하였던 것과 동일한 세포배양액의 상층액을 100 uL씩 분주하여 실온에서 2시간 반응시킨 후 washing buffer로 세척하였다. 희석한 각각의 biotinylated anti-mouse TNF-α 및 인터루킨-6 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate 용액을 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응시킨 plate를 washing buffer로 세척한 후 tetramethylbenzidine(TMB) substrate solution을 첨가하여 암실에서 30분 동안 발색시킨 다음 1 M 인산을 첨가하여 발색반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 하기 도 6에 나타내었으며, 도 6에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성능에 대한 면역활성을 검토한 결과, 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)에 의하는 경우 큰포식세포(macrophage) 자극에 의한 TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)에서 면역매개인자인 IL-12의 생성을 농도 의존적으로 증가시켰으며 150 및 200 ug/mL농도에서 높은 생성농도를 확인하였다. 이는 뉴그린과 엉겅퀴의 복합 추출물(MX1)이 인터루킨-6의 생성량을 증가시켜 B 림프구를 분화시킴으로써 면역반응에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.

[실험예 5: 복합 추출물의 효과]

상기 실험예 3 내지 4에 나타낸 뉴그린 추출물(NEE), 엉겅퀴 추출물(JEE), 뉴그린 및 엉겅퀴 복합 추출물(MX1)의 실험 방법과 동일한 방법으로 나머지 복합 추출물 MX3 내지 MX12의 효과를 비교하여 나타내었다.

그 결과를 하기 표 4에 종합적으로 나타내었으며, 객관적인 비교를 위하여, MX1의 효과를 지수 5로 나타내었으며, 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 우수한 것이다.

	NX1	NX3	NX4	NX5	NX6	NX7	NX8	NX9	NX10	NX11	NX12
면역 증진력	5	6	8	9	9	8	6	6	7	7	6

(단위: 지수)

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 더 포함하는 MX3 내지 MX12에 의하는 경우 산화질소, TNF-α 및 IL-12 생성의 우수한 활성을 나타내 면역 증진 효과가 우수함을 확인하였다.

특히, 뉴그린 에탄올 추출물(NEE) 및 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE)에 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 더 포함하는 NX4 내지 NX6에 의하는 경우 면역 증진 효과를 더욱 증가시키는 것을 확인하였다.

따라서, NX4 내지 NX6에 의하는 경우, 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 나타내는 동시에 면역반응에 중요한 역할을 하는 것을 의미한다.

[실험예 6: 기호성 평가]

상기 NX1 내지 NX12에 대해 기호성 평가를 진행하였다. NX1 내지 NX12를 차로 제조한 이후, 성인남녀 20명에게 제공한 이후, 맛 및 향에 대한 평가를 요청하였다.

평가 점수는 각 항목 당 1 내지 10점으로 평가를 요청하였으며, 평가 결과는 평균 점수로 환산하여 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 기호도가 높은 것이다.

	NX1	NX2	NX3	NX4	NX5	NX6	NX7	NX8	NX9	NX10	NX11	NX12
맛	5	4	6	7	8	7	7	4	6	7	7	6
향	6	4	6	7	7	7	6	5	6	6	7	6
종합기호도(평균)	5	4	5	6	7	7	5	5	5	6	7	6

(단위: 지수)

상기 표 5를 참조하면, NX2에서는 NX1에서 보다 엉겅퀴 특유의 맛과 향으로 인해 기호도가 떨어짐을 확인하였다. 그러나 NX3 내지 NX12의 다른 천연 추출물들을 혼합 사용하는 경우, 기호도가 우수함을 확인하였다. 특히, 뉴그린 에탄올 추출물(NEE) 및 엉겅퀴 에탄올 추출물(JEE)에 난티나무 추출물(UEE) 및 개새비나무 추출물(CEE)을 더 포함하는 NX4 내지 NX6에 의하는 경우에는 상대적으로 우수한 맛과 향을 나타내는 것으로 확인되어, 기호도가 높은 식품 조성물로의 제공이 가능함을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

뉴그린 추출물(Brassica oleracea var. botrytis aut italiana L.), 엉겅퀴 추출물(Cirsium japonicum var. maackii (Maxim)), 난티나무(Ulmus laciniata(Trautv.) mayr) 추출물 및 개시비나무(Callicarpa shiraswana Makino) 추출물을 포함하여,
항균 및 항바이러스 효과를 나타내는
면역 기능 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 대장균(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 프세우도모나스(Pseudomonas) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 포도상구균(Staphylococcus) 속, 칸디다(Candida) 속, 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 누룩곰팡이(Aspergillus) 속, 클라도스포륨(Cladosporium) 속, 패실로마이세스(Paecilomyces) 속, 푸른곰팡이(Penicillium) 속, 트리코테시움(Trichothecium) 속 및 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)종으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물에 대한 항균 효과가 우수한
면역 기능 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 허피스 바이러스(Herpes Virus, HSV), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory Syncytial Virus. RSV) 및 리노바이러스(Rhinovirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항바이러스 효과가 우수한
면역 기능 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 추출 용매를 이용하여 추출된
면역 기능 개선용 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 식품 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 뉴그린 추출물 및 엉겅퀴 추출물 100 중량부에 대해, 상기 난티나무 추출물을 40 내지 60 중량부, 상기 개새비나무 추출물을 40 내지 60 중량부로 포함하는,
항균, 항염, 항바이러스 및 면역 기능 개선용 조성물.