KR102419992B1

KR102419992B1 - 인산화된 폴리(에스테르-우레아) 기반 분해 가능한 뼈 접착제

Info

Publication number: KR102419992B1
Application number: KR1020187034392A
Authority: KR
Inventors: 매튜 벡커; 브루샬리 딘칼 바갓
Original assignee: 더 유니버시티 오브 아크론
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2022-07-14
Also published as: CN109561953B; EP3448307B1; AU2017257659A1; BR112018072006A2; CN109561953A; US11103613B2; US20190167838A1; JP2019520432A; AU2017257659B2; KR20190013781A; JP7006944B2; CA3022412A1; EP3448307A4; EP3448307A1; WO2017189534A1

Abstract

다양한 양태에서, 본 발명은 분해성이고 재흡수성인 신규한 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제 및 그것의 합성과 사용에 대한 관련된 방법을 제공한다. 이들 접착제는 하나 이상의 2가 금속 가교결합제를 사용하여 가교결합된 포스페이트 작용화된 PEU 폴리머 및 코폴리머로부터 형성된다. 본 발명의 다양한 구현예의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제는 뼈 또는 금속 중 어느 하나에 뼈를 접합하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌고, 그리고 상당하고 상업적으로 입수가능한 폴리(메틸 메타크릴레이트) 뼈 시멘트에 비교할만한 뼈 샘플에 대한 실증된 접착제 강도를 가진다.

Description

인산화된 폴리(에스테르-우레아) 기반 분해성 뼈 접착제

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 2016년 4월 28일 출원되고, 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입되는, "인산화된 폴리(에스테르-우레아) 기반 분해성 뼈 접착제"의 명칭을 갖는 미국 특허 가출원 일련 번호 62/328,653의 이점을 주장한다.

연방 지원 연구 또는 개발 지원에 관한 서술

본 발명은 국립 과학 재단에 의해 수여된 계약 번호 DMR-1507420 및 DMR-1359321과 국방부 의료 연구 개발 프로그램 부서인 전투 사상자 관리로부터 계약 번호 W81XWH-15-1-0718 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명의 하나 이상의 구현예는 분해성 및 재흡수성 의료 및 생물학적 접착제에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 특히 뼈 접착제로서 유용한, 분해성 및 재흡수성 접착제에 기초되는 인산화된 폴리(에스테르-우레아) (PEU)에 관한 것이다.

뼈 및 조직 접착제는 상처 치유, 지혈, 조직 재건 및 약물 전달에서 그것의 지원을 위한 수술에서 필수적이다. 뼈 수술에서 고전적 구조적 대안은 지지 매체로서 금속 플레이트, 핀 및 나사의 사용을 포함한다. 이들 선택은 안전하고 실용적이지만 느슨한 무균성, 뼈에 대한 열악한 정착으로부터 고통을 당하고, 인접하는 연조직에 자극을 야기하고, 환자에게 불편을 야기하고 그리고 뼈 재생 후에 대체 또는 제거될 필요가 있다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA) 뼈 시멘트가 또한 통상적으로 뼈 수술에 사용되지만 상당한 단점을 가진다. 특히, PMMA 뼈 시멘트는 그 특성상 접착성이 아니고, 화학적 상호작용을 결하며, 상당한 열 발생을 야기할 수 있고 수축하는 경향이 있다. 뼈 접착제로서 시아노아크릴레이트 같은 합성 아교, 폴리우레탄, 에폭시 수지 및 칼슘 또는 마그네슘 포스페이트 세라믹 뼈 시멘트를 사용하려는 시도는 뼈 표면과의 상호작용의 결여 또는 열악한 강도에 기인하여 실패하였다. 대안적으로, 분해성 특성 및 높은 접착 강도를 갖는 뼈 접착제가 현재로 매력적인 임상 목표이다.

포스페이트 기반 화합물은 수십 년간 수중 코팅물, 치과 적용, 뼈 이식물, 충진제 및 금속 기질에서 접착 촉진제로 사용되어 왔다. 몇 개의 연구는 뼈 접합에서 상당한 개선을 나타내는 포스페이트 작용화된 폴리머 골이식의 골전도성 잠재력과 접착 또는 결합 강도를 실증하였다. 홍합, 조개 삿갓, 불가사리, 모래 뭉치 벌레 및 날도래류와 같은 특정 해양 유기체는 그들 자신을 수중에서 강한 접합 특징을 갖는 접착제를 합성하도록 진화되어 왔다. 날도래류 접착성 실크에 대한 연구는 (SX)₄　모티프의 형태로 포스포세린 (pSer) 잔기의 존재를 확인하였고, 여기서 S는 세린이고 X는 일반적으로 발린 또는 이소류신이다. 원소 분석은 또한 섬유에 강도를 부여하도록 pSer에서 포스페이트 기와 강한 정전 상호작용을 받는 Ca² ⁺및 Mg² ⁺와 같은 2가 양이온의 존재를 나타냈다. 날도래류의 접착 특성은 접착성 필라멘트에서 과하게 인산화된 영역에 기인한다.

폴리 (에스테르 우레아) (PEU)는 대사성 성분으로의 분해, 조절가능 기계적 특성, 시험관내 및 생체내에서 광범위한 기능성 및 비독성을 포함하는 그것의 매력적인 특성 때문에 생체적합물질 적용에 아주 적합한 부류의 폴리머이다. 당해 분야에서 필요한 것은 날도래류 접착성 실크에서 나타나는 접착 특성과 PEU 폴리머에서 나타나는 유익한 특성을 갖는 뼈와 함께 사용하기 위한 접착제이다.

다양한 양태에서, 본 발명은 분해성 및 재흡수성 신규한 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제 및 그것의 합성과 사용에 대해 관련된 방법을 제공한다. 이들 접착제는 하나 이상의 2가 금속 가교결합제를 사용하여 가교결합된 포스페이트 작용화된 PEU 폴리머 및 코폴리머로부터 형성되고 날도래류 접착제 실크의 특성에 흡사하도록 설계되고 제조되었다. 본 발명의 다양한 구현예의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제는 뼈 또는 금속 중 어느 하나에 뼈를 접합하는데 특히 효과적인 것으로 발견되었고, 그리고 상당하고 (439 ± 203 KPa) 상업적으로 입수가능한 폴리(메틸 메타크릴레이트) 뼈 시멘트 (530 ± 133 KPa)에 비교할만한 뼈 샘플에 대한 접착 강도를 실증하였다. 이들 포스페이트 작용화된 PEU 폴리머 및 코폴리머는 OGP 또는 BMP-2 같은 성장 펩타이드의 존재에서 척수 손상 및 정형외과의 치료를 위한 정형외과의 접착제, 스캐폴드 물질로서 상당한 잠재력을 가지고 시험관내 및 생체내에서 분해성인 것으로 여겨진다.

제1 양태에서, 본 발명은 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄 및 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제를 갖는 PEU 폴리머 백본을 포함하는 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제에 대한 것이다. 일부 구현예에서, PEU 폴리머 사슬은 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산의 잔기를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 상기 PEU 폴리머 사슬은 하나 이상의 인산화된 L-세린 분자의 잔기를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머 백본은: 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 인산화된 아미노산을 포함하는 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머의 잔기; 및 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 아미노산을 포함하는 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머의 잔기를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 2개의 인산화된 L-세린 분자를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 하기 식을 가지고:

식 중, a는 약 1 내지 약 20의 정수이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp -W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V)으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 아미노산을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 발린 또는 이소류신을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 하기 식을 가지고:

또는

식 중, R은 -CH₃, H, -CH(CH₃)CH CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂P -, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, -CH(CH₃)₂이고 그리고 a는 1 내지 20의 정수이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 하기 식을 갖는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고:

또는

식 중, R은 -CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, -CH(CH₃)₂이고; a는 1 내지 20의 정수이고; m은 약 1% 내지 약 20%의 몰 퍼센트이고; 그리고 n은 약 80% 내지 약 99%의 몰 퍼센트이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 가교결합제는 칼슘, 마그네슘, 스트론튬, 바륨, 아연, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 금속의 2가 염이다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제1 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 가교결합제는 PEU계 접착제의 약 1 몰 퍼센트 내지 약 20 몰 퍼센트를 포함한다.

제2 양태에서, 본 발명은: 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머를 제조하는 단계; 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제를 부가하는 단계를 포함하는 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제를 제조하는 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머 대 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제의 몰비는 약 1:1 내지 약 10:1이다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제2 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머는 상기 식 V 또는 VI을 갖는다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제2 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 PEU 폴리머를 제조하는 단계는: 1 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 인산화된 아미노산을 포함하는 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머를 제조하는 단계; 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 아미노산을 포함하는 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머를 제조하는 단계; 포스겐, 디포스겐 또는 트리포스겐으로 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머와 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머를 반응시켜 제1 및 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 사이와 이들 중에 우레아 결합을 도입하여 PEU 폴리머를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제2 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 인산화된 세린 분자를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제2 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된, 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp -W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V)으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 아미노산을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제는 본 발명의 제2 양태의 상기 언급된 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하고 여기서 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 발린 또는 이소류신 분자를 포함한다.

제3 양태에서, 본 발명은: 연결되어 지는 제1 표면 및 제2 표면을 제조하는 단계; 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머를 제조하는 단계; 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제를 형성하기 위해 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제를 PEU 폴리머 안으로 혼합하는 단계; PEU 폴리머/가교결합제 혼합물을 연결되어 지는 제1 및 제2 표면 중 하나 또는 둘 모두에 적용하는 단계; 연결되어 지는 제1 및 제2 표면이 서로 접촉되게 위치시키는 단계; 및 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제가 가교결합되도록 하는 단계, 그렇게 함으로써 제1 표면과 제2 표면 사이에 결합을 형성하는 단계를 포함하는 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제를 사용하여 뼈에 뼈를 또는 금속에 뼈를 접합하는 방법에 대한 것이다.

본 발명의 특징 및 이점의 보다 완전한 이해를 위해, 이제 첨부하는 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명에 대해 참조로 한다.
도 1은 폴리(pSer-co-Val) 상의 포스페이트 기 (

)가 어떻게 뼈 표면상에서 양전하와 상호작용하여 뼈에 대한 접착을 증진하는가를 나타내는 개략도이다. 칼슘 아이오다이드 (가교결합제)로부터의 Ca² ⁺은 폴리머의 벌크 내 포스페이트 기와 상호작용하여 응집력을 불러 일으킨다.
도 2A-B는, 외부 표준으로 85% H₃P0₄를 참고로, 5% 폴리(SerDPP-co-Val) (상부) 및 5% 폴리(pSer-co-Val) (하부)의 ¹H NMR 스펙트럼 (도 2A) 및　 5% 폴리(SerDPP-co-Val) (상부) 및 5% 폴리(pSer-co-Val) (하부)의 ³¹P NMR 스펙트럼 (도 2B)을 도시하는 도표이다. (도 2A)에서 삽입물은 ¹H NMR 스펙트럼의 δ = 7.1-7.3 ppm으로부터의 배율을 나타내고; 디페닐 보호 기의 특징적인 피크는 탈보호 후 그리고 δ = 4.0 - 4.5 ppm에서 사라진다. δ = ~ 4.37 ppm에서 삼중항은 탈보호 전에 두드러지지 않은 탈보호된 포스페이트 기에 부착된 메틸렌 기 상의 양성자 환경의 특징이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 3은 5% 폴리(SerDPP-co-Val)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 4는 5% 폴리(pSer-co-Val)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 5는 강조되고 표지된 P=0 (1040 cm^-1) 및 P-0 스트레칭 (710 - 675 cm^-1)에 상응하는 피크를 갖는 폴리(l,8-Val), 폴리(SerDPP-co-Val) 및 폴리(pSer-co-Val)의 ATR-IR 스펙트럼을 도시하는 도식이다.
도 6은 2% 폴리(SerDPP-co-Val)의 ¹H NMR 스펙트럼이다. R 기는 디페닐 보호된 포스페이트 기를 표시한다. 삽입물은 디페닐 보호 기로부터 방향족 피크를 도시한다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 7은 2% 폴리(pSer-co-Val)의 ¹H NMR 스펙트럼이다. R'은 탈보호된 포스페이트 기를 표시한다. 삽입물 (a)는 7.0 - 7.25 ppm 사이의 방향족 피크의 사라짐을 나타내어 디페닐 기의 탈보호를 확인하고; 그리고 삽입물 (b)는 탈보호된 포스페이트 기에 부착된 메틸렌 기상의 양성자 환경에 상응하는, 4.36 ppm 주변에서 삼중항의 존재를 나타낸다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 8은 2% 폴리(SerDPP-co-Val)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 9는 2% 폴리(pSer-co-Val)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 10은　2% 폴리(SerDPP-co-Val)의 ³¹P NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 11은 2% 폴리(pSer-co-Val)의 ³¹P NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 12는 폴리(l,8-Val), 5% 폴리(SerDPP-co-Val), 2% 폴리(SerDPP-co-Val), 5% 폴리(pSer-co-Val) 및 2% 폴리(pSer-co-Val)의 유리전이 온도 (T _g)를 결정하기 위해 사용된 DSC 곡선을 도시하는 그래프이다. 포스페이트 작용화된 폴리머의 T _g는 폴리머 주쇄상의 낮은 기능성때문에 탈보호 후 유의미한 변화를 나타내지 않는다.
도 13은 폴리(l,8-Val), 5% 폴리(SerDPP-co-Val), 2% 폴리(SerDPP-co-Val), 5% 폴리(pSer-co-Val) 및 2% 폴리(pSer-co-Val)의 분해 온도 (T _d)를 결정하기 위해 사용된 열중량측정 분석 곡선을 도시하는 그래프이다. 분해 온도에서의 약간의 감소가 디페닐 기의 탈보호 후에 관측된다.
도 14A-G는 실온에서 알루미늄 피착체에 대해 수행된 중첩 전단 접착 연구의 결과를 도시한다. 도 14A는 Val - 폴리(l-Val-8); 각각 2% 및 5% pSer - 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val); 2% 및 5% 가교결합 - 0.3 당량의 Ca² ⁺와 가교결합된 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val) 및 상업적으로 입수가능한 뼈 시멘트 (단순 P)에 대한 접착 강도를 나타내는 그래프이다. 접착 강도는 평균 10회 반복 (n = 10)에서 계산되었고 표준 오차로 보고되었다. 알루미늄 피착체는 모든 샘플에 응집 파괴를 나타낸다: 폴리(l-Val-8) (도 14B), 2% 폴리(pSer-co-Val) (도 14C), 5% 폴리(pSer-co-Val) (도 14D), 0.3 당량 Ca² ⁺와 가교결합된 2% 폴리(pSer-co-Val)　(도 14E), 0.3 당량 Ca²⁺와 가교결합된 5% 폴리(pSer-co-Val) (도 14F), 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) 뼈 시멘트 (도 14G).
도 15A-C는 실온에서 소의 뼈에 대한 말단 간 접착을 측정하는 비교 접착 강도 측정에 관한 것이다. 도 15A는 Val - 폴리(l-Val-8); 각각 2% 및 5% pSer - 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val); 2% 및 5% 가교결합 - 0.3 당량의 Ca² ⁺와 가교결합된 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val) 및 시멘트 - 상업적으로 입수가능한 PMMA 뼈 시멘트 (단순 P)를 사용하여 실온에서 소의 뼈에 수행된 종단 간 접착 시험의 결과를 보여주는 그래프이고 (접착 강도는 평균 3회 반복 (n = 3)에서 계산되었고 표준 오차로 보고되었음); 도 15B는 소의 뼈 샘플에 대한 말단간 접착을 도시하는 도식 (좌측) 및 텍스처 분석기 상에 설정된 말단간 접착 시험을 도시하는 이미지 (우측)이고; 그리고 도 15C는 0.3 당량의 Ca² ⁺와 가교결합된 5% 폴리(pSer-co-Val)의 응집 파괴를 나타내는 이미지이다.
도 16은 폴리머 상의 MC3T3 세포의 정규화된 세포 생존력을 나타내는 그래프이다.
도 17은 상이한 폴리머에 대한 비교 종횡비를 나타내는 그래프이다. MC3T3 세포는 모든 샘플 상에서 유사한 분산 행동을 나타낸다.
도 18은 비스(L-발린)-l,8-옥타닐 디에스테르의 디-p-톨루엔설폰산성 염 (Ml)의 ¹H NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 300 MHz, 30℃).
도 19는 (a) 비스-N-boc-0-벤질(l-세린)-l,8-옥타닐 디에스테르 (M2), (b) 비스-N-boc(l -세린)-l,8-옥타닐 디에스테르 (M3), (c) 비스-N-boc-0-디페닐포스페이트(l -세린)-l,8-옥타닐 디에스테르 (M4), (d) 비스-O-디페닐포스페이트(l -세린)-l,8-옥타닐 디에스테르의 디하이드로클로라이드 염 (M5)에 대한 포스포세린 모노머 합성의 1H NMR 스펙트럼을 도시하는 그래픽 비교이다 (DMSO-d₆, 300 MHz, 30℃).
도 20은 비스-O-디페닐포스페이트(L-세린)-l,8-옥타닐 디에스테르의 디하이드로클로라이드 염 (M5)의 ¹H NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 300 MHz, 30℃).
도 21은 비스-O-디페닐포스페이트(L-세린)-l,8-옥타닐 디에스테르의 디하이드로클로라이드 염 (M5)의 ESI-질량 스펙트럼이다
도 22는 폴리(l-Val-8)의 ¹H NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 23은　폴리(l-Val-8)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 300 MHz, 30℃).
도 24는 5% 폴리(SerDPP-co-Val)의 ¹H NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 25는 5% 폴리(SerDPP-co-Val)의 ³¹P NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 26은 5% 폴리(pSer-co-Val)의 ¹H NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).
도 27은 5% 폴리(pSer-co-Val)의 ³¹P NMR 스펙트럼이다 (DMSO-d₆, 500 MHz, 30℃).

다양한 양태에서, 본 발명은 강하고, 분해성이고, 재흡수성인 신규한 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제뿐만 아니라 그것의 합성 및 그것의 사용에 대하여 관련된 방법을 제공한다. 상기에 제시된 바와 같이, 이들 접착제는 하나 이상의 2가 금속 가교결합제를 사용하여 가교결합된 포스페이트 작용화된, 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머로부터 형성된다. 이들은 뼈 또는 금속 중 어느 하나에 뼈를 접합하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌고 그리고 상당하고 (439 ± 203 KPa) 상업적으로 입수가능한 폴리(메틸 메타크릴레이트) 뼈 시멘트 (530 ± 133 KPa)에 비교할만한 뼈 샘플에 대한 접착 강도를 실증하였다. 이들 포스페이트 작용화된 PEU 폴리머 및 코폴리머는 OGP 또는 BMP-2 같은 성장 펩타이드의 존재에서 척수 손상 및 정형외과의 치료를 위한 정형외과의 접착제, 스캐폴드 물질로서 상당한 잠재력을 가지고 시험관내 및 생체내에서 분해성인 것으로 여겨진다.

제1 양태에서, 본 발명은 가교결합제와 포스페이트 작용기를 갖는 하나 이상의 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머로부터 형성된 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제에 대한 것이다. 이들 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머는 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머 백본을 가지고, 그리고 약 1 내지 약 60개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개 또는 3개 아미노산의 잔기를 각각 포함하고 서로에 대해서 우레아 결합으로 연결된, 다양한 아미노 산-기반 폴리에스테르 분절로 구성된다.

일부 구현예에서, 이들 폴리에스테르 모노머 분절은 각각 길이에서 2 내지 약 20개 탄소의 선형 탄소 사슬 또는 길이에서 2 내지 약 60개 탄소 원자의 분지형 탄소 사슬에 의해 분리된 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 세린 (ser -S), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 및 발린 (val - V)으로부터 선택된 2종 이상의 아미노산의 잔기를 함유할 것이다. 일부 구현예에서, 각각의 이들 폴리에스테르 모노머 분절은 2개의 동일한 아미노산을 가질 수 있지만, 일부 다른 구현예에서, 이들 폴리에스테르 모노머 분절의 일부 또는 모두는 2개의 상이한 아미노 산을 가질 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 이들 폴리에스테르 모노머 분절의 적어도 일부는 약 2 내지 약 20개 탄소 원자로 분리된 하나 이상의 인산화된 L-세린, 트레오닌, 또는 티로신 분자의 잔기를 포함할 것이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 이들 폴리에스테르 모노머 분절은 약 2 내지 약 20개 탄소 원자로 분리된 2개의 발린 또는 이소류신 분자의 잔기를 포함할 것이다.

상기에 제시된 바와 같이, 일부 구현예에서, 폴리에스테르 모노머 분절을 형성하는 아미노산 잔기는 약 2 내지 약 20개 탄소 원자의 선형 탄소 사슬 또는 약 2 내지 약 60개 탄소 원자의 분지형 탄소 사슬로 분리된다. 일부 구현예에서, 폴리에스테르 모노머 분절을 형성하는 아미노산 잔기는 약 3 내지 약 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 4 내지 약 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 6 내지 약 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 8 내지 약 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 10 내지 약 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 18 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 16개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 14개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자의 선형 탄소 사슬로 분리된다. 일부 구현예에서, 폴리에스테르 모노머 분절을 형성하는 아미노산 잔기는 약 5 내지 약 60개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 10 내지 약 60개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 15 내지 약 60개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 8 내지 약 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 20 내지 약 60개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 50개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 40개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 30개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자의 분지형 탄소 사슬로 분리된다. 일부 구현예에서, 폴리에스테르 모노머 분절을 형성하는 아미노산 잔기는 8 탄소 원자로 분리된다.

하나 이상의 구현예에서, 폴리에스테르 모노머 분절의 일부는 하기 식을 가진다:

식 중, R은 -CH₃, -H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-()H, -CH(CH₃)₂이고; 그리고 a는 1 내지 20의 정수이다.

식 중, a는 1 내지 20의 정수이다. 이들 구현예 중 하나 이상에서 a는 7이다.

하나 이상의 구현예에서, 폴리에스테르 모노머 분절의 일부는 하기 식을 가질 수 있다:

식 중, a는 1 내지 20의 정수이다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 형성하는 폴리에스테르 모노머 분절의 약 1 몰 퍼센트 내지 약 30 몰 퍼센트는 적어도 하나의 포스페이트 측쇄를 가질 것이다. 일부 구현예에서, 약 2 몰 퍼센트 내지 약 25 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 2 몰 퍼센트 내지 약 20 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 2 몰 퍼센트 내지 약 15 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 2 몰 퍼센트 내지 약 12 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 2 몰 퍼센트 내지 약 10 몰 퍼센트의 본 발명의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 형성하는 폴리에스테르 모노머 분절이 적어도 하나의 포스페이트 측쇄를 가질 것이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제는 적어도 하나의 포스페이트 측쇄를 갖는 하나 이상의 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절 및 포스페이트 측쇄를 가지지 않는 상기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절을 포함하는 코폴리머이다. 이들 구현예 중 하나 이상에서, 본 발명의 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자의 선형 탄소 사슬로 분리된 2개의 인산화된 L-세린 분자의 잔기를 포함할 것이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 본 발명의 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 상기에서 나타낸 바와 같은 식 IX를 가질 것이다.

이들 구현예들 중 일부에서, 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 상기에 기재된 바와 같이 길이에서 2 내지 약 20개 탄소의 탄소 사슬로 분리된 2개의 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly -G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe -F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V) 분자의 잔기를 포함할 것이다. 이들 구현예 중 다른 일부에서, 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 상기에 기재된 바와 같이 길이에서 3 내지 약 60개 탄소의 분지형 탄소 사슬로 분리된 3개 또는 4개의 이들 아미노산 분자의 잔기를 포함할 것이다. 다양한 구현예에서, 이들 분절은 상기의 식 VII 또는 VIII을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 상기에 기재된 바와 같이 길이에서 1 내지 20개 탄소 원자로 분리된 2개 발린 또는 2개 이소류신 분자의 잔기를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 제2 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 8개 탄소 원자로 분리된 2개 발린 분자의 잔기를 포함할 것이다.

분명하게 되는 바와 같이, 제1 및 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 서로에 대해서 우레아 결합에 의해 연결된다. 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 약 0.5 몰 퍼센트 내지 약 20 몰 퍼센트의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 코폴리머를 포함할 것으로 기대된다. 일부 구현예에서, 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머 분절은 약 1 몰 퍼센트 내지 약 20 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 2 몰 퍼센트 내지 약 20 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 4 몰 퍼센트 내지 약 20 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 1 몰 퍼센트 내지 약 15 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 1 몰 퍼센트 내지 약 10 몰 퍼센트, 다른 구현예에서, 약 2 몰 퍼센트 내지 약 8 몰 퍼센트의 본 발명의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 코폴리머를 포함할 것이다.

다양한 구현예에서, 이들 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 코폴리머는 하기 식을 가질 것이다:

또는

일부 이들 구현예에서, a는 2 내지 20, 다른 구현예에서 2 내지 20, 다른 구현예에서 4 내지 20, 다른 구현예에서 6 내지 20, 다른 구현예에서 8 내지 20, 다른 구현예에서 2 내지 18, 다른 구현예에서 2 내지 14, 그리고 다른 구현예에서 2 내지 10의 정수이다. 일부 이들 구현예에서, m은 2% 내지 20%, 다른 구현예에서, 4 내지 20, 다른 구현예에서, 6 내지 20, 다른 구현예에서, 8 내지 20, 다른 구현예에서, 2 내지 16, 다른 구현예에서, 2 내지 14, 그리고 다른 구현예에서, 2 내지 12의 몰 퍼센트이다. 일부 이들 구현예에서, n은 84 내지 99, 다른 구현예에서 88 내지 99, 다른 구현예에서, 92 내지 99, 다른 구현예에서, 96 내지 99, 다른 구현예에서, 80 내지 97, 다른 구현예에서, 80 내지 93, 다른 구현예에서, 80 내지 90, 그리고 다른 구현예에서, 80 내지 85의 몰 퍼센트이다.

상기에 제시된 바와 같이, 본 발명의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제는 2가 금속 가교결합제의 잔기를 더 포함한다. (도 1 참조). 가교결합제에 대해 본 명세서에서 적용된 용어 "금속"은 칼슘 및 마그네슘 같은 알칼리 토금속을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 적합한 2가 금속은, 비제한적으로, 칼슘, 마그네슘, 스트론튬, 바륨, 아연 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 폴리머 및/또는 코폴리머 대 접착제를 가교결합하는 2가 금속 이온의 몰비는 약 1:1 내지 약 10:1이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 폴리머 또는 코폴리머 대 2가 금속 이온의 몰비는 약 2:1 내지 약 10:1, 다른 구현예에서, 약 4:1 내지 약 10:1, 다른 구현예에서, 약 6:1 내지 약 10:1, 다른 구현예에서, 약 1:1 내지 약 8:1, 다른 구현예에서, 약 1:1 내지 약 6:1, 다른 구현예에서, 약 1:1 내지 약 4:1, 다른 구현예에서, 약 2:1 내지 약 8:1, 그리고 다른 구현예에서, 약 3:1 내지 약 7:1이다.

제2 양태에서, 본 발명은 위에 기재된 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 제조하는 방법에 대한 것이다. 일반적인 개요에서, 본 방법은 그것의 적어도 일부가 포스페이트 측면 기를 가지는 여러 가지의 폴리에스테르 모노머로부터 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머를 형성하는 단계, 및 이것을 2가 금속 염을 함유하는 가교결합제와 배합시켜 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 형성하는 단계를 포함한다.

상기에 제시된 바와 같이, 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머를 형성하기 위해 사용된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머의 일부는 길이에서 1 내지 약 20개 탄소의 탄소 사슬로 분리된 2개의 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V) 분자로 구성된다. 일부 구현예에서, 이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 2개의 동일한 아미노산을 가질 것이지만, 그러나 이것은 요구되지 않고 2개의 상이한 아미노산을 갖는 구현예가 가능하고 본 발명의 범위 내에 있다. 다양한 구현예에서, 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머를 형성하기 위해 사용된 이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머를 형성하는 아미노산은 상기에 기재된 바와 같이, 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자의 선형 탄소 사슬 또는 약 2 내지 약 60개의 탄소 원자의 분지형 탄소 사슬로 분리된다. 이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 위에 기재된 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 형성하기 위해 사용된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머의 일부를 형성하지만, 접착성 포스페이트 측쇄를 포함하지 않는다.

하나 이상의 구현예에서, 이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자로 분리된 2개의 발린 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 하기 식을 가질 수 있다:

또는

식 중, R은 -CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, -CH(CH₃)₂이고 a는 1 내지 20의 정수이다.

다양한 구현예에서, 이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 반응식 1에서 나타낸 바와 같이 폴리올과 선택된 아미노산의 반응으로부터 형성될 수 있다.

반응식 1

반응식 1에 나타난 구현예에서, 선택된 아미노산은 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및/또는 발린이고 (R=-CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, 또는 -CH(CH₃)₂), C₁-C₂₀　디올과 반응되지만, 그러나 본 발명은 여기에 제한되지 않는다. 다양한 구현예에서, 선택된 아미노산은 2 내지 60개 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 폴리올과 반응될 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리올은 디올, 트리올, 또는 테트라올일 수 있다. 위의 반응식 1에 나타난 폴리올은 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 디올이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 폴리올은 2 내지 17 탄소 원자, 다른 구현예에서, 2 내지 13 탄소 원자, 다른 구현예에서, 2 내지 10개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 디올이다. 적합한 폴리올은, 비제한적으로, 1,6-헥산디올, 1,8-옥탄디올, 1,9-노난디올, 1,10-데칸디올, 1,11-운데칸디올, 1,12-도데칸디올, 1,13-트리데칸디올, 1,14-테트라데칸디올, 1,15-펜타데칸디올, 1,16-헥사데칸디올, 1,17-헵타데칸디올 1,18-옥타데칸디올, 1,19-노나데칸디올, 1,20-이코산디올, 2-부텐-l,4-디올, 3,4-디하이드록시-l-부텐, 7-옥텐-l,2-디올, 3-헥센-l,6-디올, 1,4-부틴디올, 트리메틸올프로판 알릴 에테르, 3-알릴옥시-l,2-프로핀디올, 2,4-헥사디이네-1,6-디올, 2-하이드록시메틸-l,3-프로판디올, l,l,l-트리스(하이드록시메틸)프로판, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸) 에탄, 펜타에리트리톨, 디(트리메틸올프로판) 디펜타에리트리톨 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 구현예에서, 폴리올은 1,6-헥산디올일 수 있고 Sigma Aldrich Company LLC (미조리주 세인트루이스 소재) 또는 Alfa Aesar (매사추세츠주 워드 힐 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다.

이들 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머를 제조하기 위한 아미노산과 폴리올의 반응은 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지된 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 일반적으로, 수산기에 비해 약간의 몰 과잉 (∼ 2.1 당량)의 산을 포함하는 물의 비등점을 초과하는 온도에서의 축합 반응은 반응을 진행시키기에 충분하다.

반응식 1에 나타난 반응에서, 아미노산 개시 물질 및 폴리올은 적합한 산을 갖는 적합한 용매에 용해시키고 110℃ 내지 약 114℃의 온도로 가열하고 그리고 약 20시간 내지 약 48시간 동안 환류시켜, 사용된 폴리올에 따라 약 2 내지 약 60개의 탄소 원자로 분리된 2종 이상의 아미노산 잔기를 갖는 모노머의 염을 형성한다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험과정 없이 적합한 산을 선택할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 사용된 산은 p-톨루엔 설폰산 일수화물일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 또한 과도한 실험과정 없이 적합한 용매를 선택할 수 있을 것이다. 적합한 용매는 비제한적으로, 톨루엔, 디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 사용된 용매는 톨루엔이다.

당해 분야의 숙련가에게 분명하게 되는 바와 같이, 트랜스아미드화를 방지하기 위해 모노머 중간체 상의 아민 기를 보호하기 위한 단계가 취해져야 한다. 반응식 1의 반응에서, 톨루엔 술폰산 (pTSA)의 존재는 아미노산 상의 아민을 양성자화시키고 트랜스아미드화 반응이 더 높은 전환율에서 일어나지 않도록 보장하기 위해 필요하다. 그러나, 본 발명은 반응식 1에 나타난 방법에 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험과정 없이 트랜스 아미드화를 방지하기 위해 적합한 반대 이온을 선택할 수 있을 것이다. 적합한 보호 반대 이온을 생성할 수 있는 물질은 비제한적으로, p-톨루엔 설폰산 일수화물, 염화물, 브로마이드, 아세테이트, 트리플로로아세테이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 반응식 1에 나타난 반응의 조 생성물은 그 목적을 위해 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 조 생성물은 잔존 용매를 제거하기 위해 조 생성물을 먼저 진공 여과하고 활성탄에서 탈색시킴에 의해 임의의 잔존 염 또는 미반응된 모노머를 제거함으로써 정제된다. 그런 다음 이것은 끓는 물 또는 물과 알코올의 1:1 혼합물로부터 1 내지 10회 재결정하여 정제된 제품을 생산한다.

상기에 제시된 바와 같이, 본 발명의 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 형성하는 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머는 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머의 잔기를 더 포함한다. 이들 모노머는 전반적인 구조에서 위에 기재된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머에 유사하지만 그러나 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 아미노산 분자를 함유하는 대신에 (또는 여기에 부가하여), 상기 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 보호된 포스페이트 기로 작용화된 하나 이상의 세린, 트레오닌, 또는 티로신 분자를 함유한다.

하나 이상의 구현예에서, 이들 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 하기 식을 가질 수 있다:

식 중, a는 상기에 제시된 바와 같이 약 1 내지 약 60의 정수이다. 상기 기재된 비-인산화된 아미노 산-기반 모노머와 같이, 트랜스아미드화를 방지하기 위해 모노머 상의 아민 기를 보호하기 위한 단계가 취해져야 한다. 다시, 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험과정 없이 트랜스 아미드화를 방지하기 위해 적합한 반대 이온을 선택할 수 있을 것이다. 적합한 보호 반대 이온을 생성할 수 있는 물질은 비제한적으로, p-톨루엔 설폰산 일수화물, 염화물, 브로마이드, 아세테이트, 트리플로로아세테이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

또한, 이들 OH 기에서 부반응을 방지하기 위해 포스페이트 기 상의 OH 기를 보호하기 위한 단계가 취해져야 한다. 당해 분야의 통상적인 기술자는 이들 부반응을 방지하기 위해 보호기를 부착하는 방법을 알 것이다. 일부 구현예에서, 페닐 기는 식 I에서 나타낸 바와 같은 보호기로서 사용되지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고 다른 적합한 보호 기가 사용될 수 있다.

하나 이상의 구현예에서, 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 보호된 세린, 트레오닌, 또는 티로신 분자와 비-인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머에 관하여 상기에 확인된 임의의 폴리올 사이의 축합 반응과, 이어서 보호된 포스페이트 기의 첨가를 통해 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 아래 반응식 2에서 나타낸 바와 같이 Boc 및 벤질 보호된 세린 분자와 C₂-C₂₀　디올로부터 형성될 수 있다.

반응식 2

식 중, a는 1 내지 19의 정수이다.

반응식 2에 나타난 구현예에서, 개시 물질 (XI), (XII) 및 피리디늄 4-톨루엔설포네이트 (DPTS)와 같은 활성화제를 불활성 분위기 하에서 적합한 반응 용기에서 적합한 용매 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 디옥산에 용해시킨다. 용액을 그런 다음 약 -20℃ 내지 약 20℃의 온도로 냉각시키고 커플링 예컨대 N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC)를 첨가했다. 이 반응은 Boc 및 벤질 보호된 세린-기반 폴리에스테르 중간체 (XIII)를 생성한다. 반응식 2에 나타난 제2 반응에서, 이 Boc 및 벤질 보호된 세린-기반 폴리에스테르 중간체 (XIII)를 수소화 병 및 탄소상 팔라듐 촉매를 사용하여 양성자화된 에탄올 이소프로판올과 같은 적합한 용매에 용해시켜 비스-N-boc(l-세린) 폴리에스테르 중간체 (XIV)를 형성한다. 제3 반응에서, 보호된 포스페이트 기를 적합한 용매, 예컨대 피리딘에 용해시키고 이것을 디페닐포스포릴 염화물 (XV)과 반응시킴에 의해 t 비스-N-boc(l-세린) 폴리에스테르 중간체 (XIV)에 첨가하여 비스-N-boc-O-디페닐포스페이트(l-세린) 폴리에스테르 중간체 (XVI)를 생성하였다. 마지막으로, 비스-N-boc-O-디페닐포스페이트(l-세린) 폴리에스테르 중간체 (XVI)를 산, 예컨대 트리플루오로아세트산 또는 황산을 사용하여 탈보호하고 양성자화하여 상응하는 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머 (I)를 생성한다.

상기에 제시된 바와 같이, 적어도 일부가 페닐 보호된 포스페이트 기를 함유하는 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머는 PEU 형성 화합물과 반응하여 본 발명의 아미노 산-기반 PEU 폴리머 접착제에 사용된 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머를 생성한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "PEU 형성 화합물"은 2개의 아민기 사이에 카복실기를 위치시키고, 그렇게 함으로써 우레아 결합을 형성할 수 있는 화합물을 지칭하고, 비제한적으로, 트리포스겐, 디포스겐, 또는 포스겐을 포함한다. 상기에 제시된 바와 같이, 디포스겐 (액체) 및 트리포스겐 (고형 결정)은 이들이 일반적으로 독성 가스인 포스겐에 대해 더 안전한 대체물로 인정되기 때문에 포스겐보다 더 적합한 것으로 이해된다. 아미노 산-기반 PEU 폴리머 또는 코폴리머를 생성하기 위한 트리포스겐, 디포스겐 또는 포스겐과 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머의 반응은 또한 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지된 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 아미노 산-기반 PEU 폴리머 접착제에 사용된 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머는 아래 반응식 3에서 나타낸 바와 같이 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머 및 비-인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머로부터 형성될 수 있다.

반응식 3

여기서 R=-CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C-CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, 또는 -CH(CH₃)₂; R'는 디페닐포스포릴 기이고; 각각의 a는 1 내지 20의 정수이고; m은 약 1% 내지 약 20%의 몰 퍼센트이고; 그리고 n은 약 80% 내지 약 99%의 몰 퍼센트이다.

다양한 구현예에서, 보호된 폴리에스테르 모노머 (I, II)는 약 1:99 내지 약 1:5, 다른 구현예에서, 약 1:80 내지 약 1:70, 다른 구현예에서, 약 1:60 내지 약 1:50, 다른 구현예에서, 약 1:40 내지 약 1:30, 다른 구현예에서, 약 1:20 내지 약 1:15, 그리고 다른 구현예에서, 약 1:10 내지 약 1:8의 인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머 (II) 대 비-인산화된 아미노 산-기반 폴리에스테르 모노머 (I)의 몰비로 조합된다.

반응식 3의 단계 (a)에서, 보호된 폴리에스테르 모노머 (I, II)는 계면 중합 방법을 사용하여 중합되어 디페닐포스포릴 측면 기를 갖는 아미노 산-기반 PEU 코폴리머 (XVIII)를 형성한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 계면 중합은 2개의 불혼화성 유체의 계면 경계 또는 그 근처에서 발생하는 중합을 지칭한다. 이들 구현예에서, 보호된 폴리에스테르 모노머 (I, II)는 적합한 유기 수용성 염기 예컨대 트리에틸아민, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산나트륨, 또는 중탄산칼륨의 제1 분획과 원하는 몰비로 조합되고 기계적 교반 및 온수 배쓰 (대략 35℃)를 사용하여 물에 용해된다. 하나 이상의 이들 구현예에서, 상기 반응물을 그런 다음 약 -10℃ 내지 약 2℃의 온도로 냉각시키고 유기 수용성 염기 예컨대 탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산나트륨, 또는 중탄산칼륨의 추가의 분획을 물에 용해시키고 그 다음 반응 혼합물에 첨가했다. 반응물은, 비제한적으로, 빙욕, 수조, 또는 재순환 냉각기를 포함하여, 그 목적을 위해 당해 분야에서 공지된 임의의 수단에 의해 냉각될 수 있다.

다음으로, PEU 형성 화합물 예컨대 트리포스겐 (XVII) 디포스겐 또는 포스겐의 제1 분획을 적합한 용매, 예컨대 증류된 클로로포름 또는 디클로로메탄에 용해시키고 그 다음 반응 혼합물에 첨가했다. 반응식 3의 단계 (a)에서, PEU 형성 화합물은 디포스겐이다. 숙련가는 과도한 실험과정 없이 PEU 형성 화합물에 대한 적합한 용매를 선택할 수 있을 것이다. 약 2 내지 약 60분의 기간 후, PEU 형성 화합물 (예컨대 트리포스겐, 디포스겐 또는 포스겐)의 제2 분획을 적합한 용매, 예컨대 증류된 클로로포름 또는 디클로로메탄에 용해시키고, 그리고 약 0.5 내지 약 6시간의 기간에 걸쳐 반응 혼합물에 적가하여 디페닐포스포릴 측면 기를 갖는 분절 및 비-인산화된 PEU 분절을 갖는 미정제 PEU 코폴리머를 생성한다. 반응식 3의 단계 (a)의 조 생성물은 그 목적을 위해 당해 분야에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응식 3의 단계 (a)의 조 생성물은 이것을 분별 깔때기로 옮기고 끓는 물에서 침전시킴에 의해 정제될 수 있다.

반응식 3의 단계 (b)에서, 디페닐포스포릴 측면 기를 갖는 아미노 산-기반 PEU 코폴리머 (XVIII) 상의 디페닐 보호 기는 금속 촉매, 예컨대 Pt0₂의 존재에서 수소화분해에 의해 탈보호되어 본 발명의 아미노 산-기반 PEU 폴리머 접착제에 사용된 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머 (V)를 형성한다. 반응식 3의 단계 (b)에 나타낸 반응에서, 디페닐포스포릴 측면 기를 갖는 아미노 산-기반 PEU 코폴리머 (XVIII)를 적합한 용매 예컨대 디클로로메탄 및 트리플루오로아세트산(TFA)/아세트산 (AcOH)에 용해시킨다. 금속 촉매, 예컨대 Pt0₂를 그런 다음 H₂　(60psi)의 존재에서 수소화 폭발 반응기에서 폴리머 용액에 첨가하여 본 발명의 아미노 산-기반 PEU 폴리머 접착제에서 사용된 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머 (V)를 생성한다. 반응식 3의 단계 (b)의 조 생성물은 그 목적을 위해 당해 분야에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응식 3의 단계 (b)의 조 생성물은 이것을 분별 깔때기로 옮기고 끓는 물에서 침전시킴에 의해 정제될 수 있다. (일반적으로, 실시예 7-12 참조)

본 발명의 아미노 산-기반 PEU 폴리머 접착제를 형성하기 위해, 위에 기재된 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머는 결합되는 표면에 적용하기 바로 전에 가교결합제와 조합시켜야 한다. 상기에 제시된 바와 같이, 적합한 가교결합제는 2가 금속 이온을 함유하는 용액을 포함할 것이다. (도 1 참조). 적합한 2가 금속은, 비제한적으로, 칼슘, 마그네슘, 스트론튬, 바륨, 아연, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 가교결합제는 칼슘 또는 마그네슘의 2가 이온을 함유하는 용액을 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 가교결합제에서 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 폴리머 및/또는 코폴리머 대 2가 금속 이온의 몰비는 약 1:1 내지 약 10:1이다. 일부 구현예에서, 가교결합제에서 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 폴리머 또는 코폴리머 대 2가 금속 이온의 몰비는 약 2:1 내지 약 10:1, 다른 구현예에서, 약 4:1 내지 약 10:1, 다른 구현예에서, 약 6:1 내지 약 10:1, 다른 구현예에서, 약 1:1 내지 약 8:1, 다른 구현예에서, 약 1:1 내지 약 6:1, 다른 구현예에서, 약 1:1 내지 약 4:1, 다른 구현예에서, 약 2:1 내지 약 8:1, 그리고 다른 구현예에서, 약 3:1 내지 약 7:1이다.

제3 양태에서, 본 발명은 위에 기재된 포스페이트 작용화된 아미노 산-기반 폴리(에스테르 우레아) 접착제를 사용하여 뼈에 뼈를 또는 금속에 뼈를 접합하는 방법에 대한 것이다. 이들 구현예에서, 뼈 및/또는 금속 표면을 임의의 적용 가능한 방법을 사용하여 먼저 세척하고 제조한다. 다음으로, 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머를 상기에 제시된 바와 같이 제조한다. 표면이 결합되기 바로 전에, 상기에 기재된 바와 같은 양의 가교결합제를 인산화된 아미노 산-기반 PEU 폴리머 및/또는 코폴리머에 혼합하여 가교결합 반응을 개시한다. 그런 다음 혼합물을 결합되는 표면 중 하나 이상에 적용하고, 폴리머가 가교결합을 계속하면서 표면을 함께 가압하여 원위치에 유지한다. 폴리머가 완전히 가교결합됨에 따라, 표면은 서로에 대해서 완전하게 부착될 것이다.

실험

인산화된 세린 (pSer) 및 발린 아미노산에 기반한 PEU 코폴리머를 합성하고 그것의 물리적 특성에 대해 특성규명하였다. 코폴리머 내에 함입된 pSer 함량은 2% 및 5%였다. 에탄올에서의 이들 폴리머의 용해도는 이들을 더욱 임상적으로 관련있게 하며, 그리고 뼈 접착제로서의 추가의 발전에 대해 강한 가능성을 나타낸다. 그것의 접착 강도는 알루미늄 기판상의 중첩 전단 접착과 소의 뼈 기질에 대한 말단간 접착에 의해 Ca² ⁺와 가교결합 전후에 연구되었다.

반응식 4는 이들 실험에 사용된 폴리(pSer-co-Val)의 합성을 나타낸다. 폴리머 합성의 제1 단계는 폴리(세린 디페닐포스페이트-co-발린) (폴리(SerDPP-co-Val))을 생산하기 위해 비스 (L- 발린)-1,8-옥타닐 디에스테르 (l-Val-8) 모노머의 디-p-톨루엔설폰산성 염과 디페닐 보호된 포스포세린 모노머의 용액 중합을 포함했다. 제2 단계는 포스페이트 작용화된 코폴리머인 폴리(포스포세린-co-발린) (폴리(pSer-co-Val))을 얻기 위해 폴리(SerDPP-co-Val)의 수소화분해 탈보호를 포함했다.

반응식 4

이들 실험에서, 2% 및 5% pSer 함량을 갖는 코폴리머가 합성되었고 2% 폴리(pSer-co-Val) 및 5% 폴리(pSer-co-Val)로 각각 표시되었다. 폴리머 안으로 함입된 세린 모노머의 실제 양은 ¹H NMR 분광법에 의해 측정된 바와 같이 공급된 양보다 적은 것으로 밝혀졌다. 타당한 정당화는 모노머에 4개의 큰 부피의 페닐기의 존재이다. 이는 세린 모노머의 반응성을 낮추는 경향이 있어 세린 함량의 낮은 함입을 초해한다. 5% 폴리(pSer-co-Val)의 ¹NMR 스펙트럼으로부터, 페닐 보호기는 방향족 영역 δ = 7.06-7.34 ppm에서 피크를 나타낸다. 수소화분해 후 이들 페닐기의 성공적인 탈보호는 방향족 피크의 손실에 의해 확인되었다. 보호된 포스페이트 기에 직접적으로 부착된 메틸렌 상의 양성자 환경은 δ = 4.0 ppm 부근에서 공명성을 가지며 이는 탈보호 후에 δ = 4.37 ppm으로 약간 하방으로 전이한다 (도 2A). 보호 페닐기의 제거는 또한　¹³C NMR 스펙트럼으로부터 확인되었다. 5% 폴리(SerDPP-co-Val)에서 δ = ∼ 120-130 ppm에서의 방향족 피크는 5% 폴리(pSer-co-Val)에서 탈보호 후 사라졌다 (도 3 및 4).　³¹P NMR 스펙트럼은 또한 페닐기의 완전한 탈보호를 확인한다. 5% 폴리(SerDPP-co-Val)는 δ = -11.58 ppm에서 특징적인 인 피크를 가지며 이는 탈보호 후에 δ = -1.20 ppm으로 전이한다. (도 2B).

약화된 총 내부 반사 적외선 분광법 (ATR-IR)은 디페닐기의 탈보호 전후 포스페이트 기의 존재 및 보존을 나타낸다. P-O-H 결합은 700-500 cm^-1의 범위에서 특징적인 IR 피크를 가지는 반면 P=0 결합은 1200-1100 cm^-1 사이에서 특징적인 피크를 가진다. 폴리(SerDPP-co-Val)에 대한 P-0 특징적인 피크는 탈보호 후 ∼710 cm^- ¹으로 약간의 전이를 나타내는 ∼675 cm^-1 주위에서 보여진다. P=0 결합은 탈보호 전후 ∼1040 cm^-1에서 특징적인 피크를 나타낸다. 이들 2개의 특징적인 포스페이트 스트레칭 피크 중 어느 것도 l-Val-8 폴리머 (폴리(l-Val-8))에서 두드러지지 않는다 (도 5). 2% 코폴리머에 대한 ¹H NMR 스펙트럼은 적분 값이 상이한 것을 제외하고 5% 코폴리머의 것에 유사하다 (도 6 및 7). 2% 코폴리머에 대한 ¹³C 및　³¹P NMR 스펙트럼은 또한 5% 코폴리머의 것과 유사한 δ (ppm)를 갖는다 (도 8-11).

PEU는 열중량측정 분석 (TGA)에 의한 분해 온도 (T _d ), 시차 주사 열량측정 (DSC)에 의한 유리전이 온도 (T _g ), 수 평균 분자량 (M _n ), 중량 평균 분자량 (M _w ) 및 SEC에 의한 다분산도 (Ð _M ) 같은 그것의 물리적 특성을 결정하기 위해 특성규명되었다. 이들 폴리머의 표면 에너지는 하기 방정식에 의해 폴리머 표면 에너지의 극성 및 분산성 성분을 계산하기 위해 공지된 표면 에너지의 5 상이한 액체의 접촉각으로부터 결정되었다²⁹'³⁰　(그것의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입되는, 문헌 [Stakleff, K. S.; Lin, F.; Smith Callahan, L. A.; Wade, M. B.; Esterle, A.; Miller, J.; Graham, M.; Becker, M. L., Resorbable, amino acid-based poly(ester urea)s crosslinked with osteogenic growth peptide with enhanced mechanical properties and bioactivity. Acta Biomater 2013, 9, (2), 5132-42]; 및 문헌 [Yu, J. Y.; Lin, F.; Lin, P. P.; Gao, Y. H.; Becker, M. L., Phenylalanine-Based Poly(ester urea): Synthesis, Characterization, and in vitro Degradation. Macromolecules 2014, 47, (1), 121-129] 참조).

(방정식 1)　　

여기서, θ _LP　- 폴리머와 액체 사이의 접촉각;

　- 액체 표면 장력;

- 액체 표면 장력의 분산성 성분;

- 액체 표면 장력의 극성 성분;

- 폴리머 표면 에너지의 극성 성분;

- 폴리머 표면 에너지의 분산성 성분. 폴리머의 총 표면 에너지

　(mJ m^-2)는 방정식 1로부터 계산된 극성 및 분산성 성분의 합이다. 표 1은 폴리머의 물리적 특성을 요약하고 있다. 폴리(pSer-co-Val)의 분자량은 폴리머의 접착 특성으로 인해 SEC 컬럼의 블로킹을 방지하기 위해 결정되지 않았다. Pt0₂　촉매의 존재에서 수소화분해 반응은 매우 선택적이며 부위 특이성이 있으므로 이 반응 동안 폴리머 분해가 일어날 것으로 기대되지 않는다.

[표 1]

폴리 (에스테르 우레아 )의 물리적 특성

a) DSC에 의해 결정된 T _g ; b) 물에 침전에 의한 정제 후 SEC로부터 결정된 D _M ; c) 폴리머 필름 상에 5 상이한 액체의 접촉각으로부터 OwensAV endt 방법에 의해 결정된 표면 에너지.

폴리(pSer-co-Val)은 폴리(SerDPP-co-Val)보다 약간 낮은 유리전이 온도를 나타낸다. 보호된 폴리머 상의 큰 부피의 페닐기의 존재는 사슬을 뻣뻣하게 하고 그것의 운동을 방해하는 반면 탈보호 후에는 사슬이 보다 유연해지고 자유롭게 유동하여 각각의 T _g 에서 약간의 하락을 나타낸다 (도 12). 보호 및 탈보호된 폴리머 둘 모두는 150℃ 이상의 분해 온도를 갖는다 (도 13). 모든 폴리머의 분자량은 비교할만하여 분자량 효과로 인한 접착 강도에서의 편차를 회피한다. 분자량 분포 (Ð _M )는 정제 과정에서 폴리머가 분별화되어 Ð _M 을 좁혀지기 때문에 폴리(SerDPP-co-Val)에 대한 단계 성장 중합 반응에서 기대되는 것보다 약간 낮다. 그것의 극성 및 분산성 성분과 함께 폴리머의 총 표면 에너지는 표 2에 표로 작성되어 있다.

[표 2]

폴리머 표면 에너지

2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val) 양자는 표면 에너지에 대해 극성 및 분산성 성분을 갖는다. 극성 성분의 존재는 표면 접착에서 상당한 역할을 하는 표면 극성기를 나타낸다. 2% 및 5% 폴리머의 표면 에너지는 서로 비교가능하며 폴리(1-Val-8)보다 더 높다. 폴리머 상의 작용기의 백분율이 작기 때문에 2% 및 5% 작용화 사이의 표면 에너지에서 주목할 만한 변화는 관찰되지 않았다.

알루미늄 기판상의 중첩 전단 접착 시험.

중첩 전단 접착은 접착 물질의 강도 및 그것의 파괴 방식을 결정하기 위해 사용되는 일반적인 방법이다. (실시예 14 참조). 폴리머의 접착 강도는 알루미늄 피착체에 실온에서 중첩 전단 배치형태 하에서 연구되었다. 중첩 전단 접착 시험은 Ca²⁺와 가교결합 유무에 관계없이 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val)에서 수행되었다. 접착에서 포스페이트 기의 유의성을 입증하기 위해 폴리(l-Val-8)을 대조군의 하나로 사용하였다. 상업적으로 입수가능한 PMMA 뼈 시멘트는 폴리(pSer-co-Val)과 비교를 위해 또 다른 대조군으로 사용하였다. 중첩 전단 접착 시험의 결과는 도 14A에 요약되어 있다.

폴리(l-Val-8)의 접착 강도는 0.04 ± 0.16 MPa였고 PMMA 뼈 시멘트는 0.04 ± 0.01 MPa였다. 폴리(메틸 메타크릴레이트)가 접착제 특성을 가지지 않기 때문에 뼈 시멘트에 대해 낮은 접착 강도가 기대된다. PMMA 뼈 시멘트는 높은 모듈러스를 가지고 뼈 및 치아에 대한 충전제로 본질적으로 사용된다. 폴리(pSer-co-Val)은 포스페이트 기와 알루미늄 표면 사이에 정전기 또는 수소 결합 상호작용을 일으킬 수 있는 대조군 샘플에 비교하여 개선된 접착 강도를 나타낸다. 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val)의 접착 강도는 각각 0.92 ± 0.18 MPa 및 0.77 ± 0.09 MPa이다 (도 14A). 날도래류 실크에 대한 이전의 연구는 Ca² ⁺와 가교결합이 섬유에 강도를 부여한다는 것과 2가 양이온이 제거되면 결정성 β-시트 구조 붕괴가 일어나 시스템 내 Ca² ⁺의 유의성을 시사한다는 것을 보여주었다. (그 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입되는, 문헌 [Addison, J. B.; Ashton, N. N.; Weber, W. S.; Stewart, R. J.; Holland, G. P.; Yarger, J. L., beta-Sheet nanocrystalline domains formed from phosphorylated serine-rich motifs in caddisfly larval silk: a solid state NMR and XRD study. Biomacromolecules 2013, 14, (4), 1140-8]; 문헌 [Addison, J. B.; Weber, W. S.; Mou, Q.; Ashton, N. N.; Stewart, R. J.; Holland, G. P.; Yarger, J. L., Reversible assembly of beta-sheet nanocrystals within caddisfly silk. Biomacromolecules 2014, 15, (4), 1269-75] 참조. 우리의 가설은 폴리머 주쇄 상의 포스페이트 기가 가교결합제 중의 Ca² ⁺와 상호작용하여, 그것의 비가교결합된 대응물에 비교하여 접착제 강도를 더 증가시키는 폴리머 벌크 내의 응집력을 개선시키게 될 물리적 가교결합을 야기한다는 것이다 (도 1). 접착 강도는 시스템 내에서 접착력과 응집력 둘 모두의 조합된 효과의 결과이다. 우리의 가설을 시험하기 위해 우리는 우리 시스템에 Ca² ⁺의 공급원으로 칼슘 아이오다이드를 선택했다.

2% 및 5% Ca² ⁺　가교결합된 폴리(pSer-co-Val) 둘 모두는 그것의 비가교결합된 대응물에 비교하여 접착 강도에서의 증가를 나타냈다. 가교결합된 2% 폴리(pSer-co-Val) 및 가교결합된 5% 폴리(pSer-co-Val)의 접착 강도는 각각 1.17 ± 0.19 MPa 및 1.14 ± 0.02 MPa였다 (도 14A). 본 발명자들의 결과는 알루미늄 기판 상의 포스페이트 작용화된 폴리머의 강한 친화성을 입증한다. 응집 파괴는 접착제가 파단 후에 피착체 양자에 달라붙는 경우이다. 접착제가 하나의 피착체로부터 깨끗하게 분리되고 파단 후에 다른 피착체에 달라붙는 경우, 이를 접착제 파단이라고 불린다. 파단의 방식은 접착제의 상업적 잠재성을 결정하는 데 중요하다. 대부분의 접착제에 대해, 응집 파괴가 바람직하다. 흥미롭게도, 모든 샘플은 접착식으로 파단한 뼈 시멘트를 제외하고 응집 파괴를 나타낸다 (도 14B-G). 이 결과는 본질적으로 뼈 시멘트가 접착성이 아니고 단지 뼈의 지지체로 역할을 한다는 사실을 고려할 때 놀라운 일은 아니다. 금속에 대한 접착 연구의 결과는 폴리머 백본에 적은 백분율의 포스페이트 기의 혼입에도 금속 기질에 대한 접착 강도에서 상당한 개선을 보인다는 것을 시사한다. 또한, 2가 양이온과 포스페이트 기의 가교결합은 정전기적 상호작용을 통해 접착 강도를 더욱 향상시킨다.

소의 뼈에 대한 말단간 접착 시험

소의 뼈 샘플에 대한 폴리(pSer-co-Val)의 접착 강도가 또한 뼈 접착제로서 그것의 잠재적인 적용을 입증하기 위해 시험되었다. (실시예 15 참조). 뼈는 표면에 다수의 양전하와 음전하를 가지고 있다. 뼈의 기본적인 구성 블록은 Ca₅(P0₄)₃(OH)의 화학 구조를 가진 수산화인회석이다. 도 15A는 소의 뼈에 대한 폴리머의 접착 강도를 요약한다. 이 연구에 대한 대조군은 금속 기질의 것과 동일하다. 폴리(l-Val-8)은 뼈 표면에 절대적으로 접착력이 없다. 시험을 수행하기 전에 모든 샘플이 파단했다. 폴리(pSer-co-Val)은 폴리(l-Val-8) 대조군에 비해 증가된 접착 강도를 나타낸다. 2% 폴리(pSer-co-Val)은 190 ± 70 KPa의 접착 강도를 보였으며 5% 폴리(pSer-co-Val)은 399 ± 101 KPa의 접착 강도를 나타냈다.

접착 강도에서의 증가는 가교결합제로서 0.3 당량의 Ca² ⁺의 부가 후에 관측되었다. 가교결합된 2% 폴리(pSer-co-Val)의 접착 강도는 211 ± 77 KPa로 증가되었고 반면 가교결합된 5% 폴리(pSer-co-Val)의 접착 강도는 439 ± 203 KPa로 증가되었다. 대조군의 접착 강도에서의 증가에 비교하여 포스페이트 작용화된 폴리머의 접착 강도의 증가는 포스페이트 기의 존재의 유의성을 제공한다. 포스페이트 작용기의 작은 백분율의 함입은 접착에서 주목할 만한 변화를 가져온다는 것은 또한 주목할 만하다. 5% 폴리(pSer-co-Val)의 접착 강도는 상업적으로 입수가능한 뼈 시멘트 (530 ± 133 KPa)에 비교할만하여 폴리(pSer-co-Val)은 뼈 접착제에서 추가의 전개를 위해 강한 잠재성을 가진다는 것을 시사한다. 모든 샘플은 접착 파괴를 나타낸 뼈 시멘트를 제외하고 응집 파괴를 나타냈다.

시험관내 세포 생존력 및 퍼짐성 검정

MC3T3 세포의 세포 생존력은 각각의 샘플에 대해 적어도 40 이미지를 사용하여 계산되었고 2% 폴리(pSer-co-Val)에 대해 정규화되었다. (실시예 16 및 17 참조). 유리, 폴리(l-Val-8), 2% 및 5% 폴리(pSer-co-Val), 2% 및 5% 가교결합된 폴리(pSer-co-Val) 상에서 세포의 생존력은 각각 (84 ± 9)%, (94 ± 8)%, (100 ± 3)%, (97 ± 5)%, (97 ± 7)% 및 (98 ± 4)%였다 (도 16 참조). 유리 상의 낮은 세포 생존력은 취급 및 씨딩 실수에 기인될 수 있었다. 작용화된 폴리머 상의 높은 세포 생존력 (>95%)은 포스페이트 작용기가 세포에 무독성이다는 것을 입증한다. 모든 샘플 상의 MC3T3 세포의 세포골격 구조 또는 퍼짐성 행동은 유사하였다. 세포는 핵에 대해 청색 (DAPI), 국부 점착 점에 대해 녹색 (Alexa Fluor 488) 그리고 액틴 필라멘트에 대해 로다민 팔로이딘 (레드)으로 염색되었다. 모든 샘플에 대한 세포의 종횡비는 상당히 밀접하여 (∼ 2-3), 작용화된 폴리머가 대조군에 유사하게 행동했다는 것을 입증한다 (도 17).

포스페이트 작용화된 PEU 코폴리머는 날도래류 접착제 실크의 특성에 유사하도록 설계되고 제조되었다. 이들 코폴리머는 적합한 전달 기전을 제공하고 이들을 의료 응용에 적합하게 하는 에탄올 가용성이다. 코폴리머는 Ca² ⁺로 가교결합 후 금속 기질에 대해 1.17 ± 0.19 MPa의 최대 접착 강도를 나타냈다. 뼈 샘플에 대한 코폴리머의 접착제 강도는 상당하고 (439 ± 203 KPa), 그리고 상업적으로 입수가능한 폴리(메틸 메타크릴레이트) 뼈 시멘트 (530 ± 133 KPa)에 비교할만하다. 포스페이트 작용화된 코폴리머는 발린 폴리머 유사체에 비교하여 개선되고 상당한 접착 강도를 실증하여 포스페이트 기가 접착을 증진하는데 핵심 역할을 한다는 것을 실증한다. 모든 경우에 코폴리머는 응집 파괴를 나타냈다. 포스페이트 작용화된 코폴리머는 OGP 또는 BMP-2 같은 성장 펩타이드의 존재에서 척수 손상 및 정형외과의 치료를 위한 정형외과의 접착제, 스캐폴드 물질로서 상당한 잠재력을 가진다. PEU는 시험관내 및 생체내에서 분해성이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되나, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 일부의 실시예는 본 발명이 기능할 수 있는 방법에 대한 결론을 포함할 수 있지만, 본 발명자는 이들 결론에 구속되는 의도는 없지만 단지 가능한 설명으로만 제시한다. 또한, 과거 시제의 사용에 의해 표시되지 않는 한, 예의 제시는 실험 또는 절차가 수행되었거나 또는 수행되지 않았거나, 결과가 또는 실제로 얻어졌거나 또는 얻어지지 않았음을 의미하지는 않는다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 존재할 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량 부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 또는 대기압 근처이다.

물질 및 방법

L-발린, p-톨루엔 설폰산 일수화물, 톨루엔, 1,8-옥탄디올, 무수 디클로로메탄 (DCM), Pd/C, Pt0₂, 에탄올, 디페닐포스포릴 염화물 (99%), 무수 피리딘, 4M HCl/디옥산 용액, 클로로포름, 트리메틸아민 및 아세트산은 Sigma Aldrich로부터 구매하였다. N-Boc-O-Bzl- _L -세린은 Ark Pharm, Inc로부터 구매하였다. N,N-디이소프로필 카보디이미드 (DIC)는 Oakwood Chemicals로부터 구매하였다. 트리포스겐은 TCI America로부터 구매하였다. 4-(디메틸 아미노) 피리디늄 4-톨루엔설포네이트 (DPTS)는 문헌 절차에 따라 합성하였다. 클로로포름은 CaH₂　상에서 밤새 건조시키고, 증류시켜 사용 전에 암소에 저장하였다. 모든 화학물질은 달리 명시되지 않는 한 수령한 채로 사용하였다.

모노머 및 폴리머의 ¹H,　¹³C 및　³¹P NMR 스펙트럼은 Varian NMR 분광측정기 (각각 300 MHz 및 500 MHz) 상에 기록되었다. 화학적 전이 (δ)는 ppm으로 보고되었으며 잔존 용매 공명을 참조하였다 (¹H NMR, DMSO-d ₆ : δ = 2.50 ppm 및　¹³C NMR, DMSO-d ₆ : δ = 39.50 ppm). 다중도의 약어는 s-단일항, d-이중항, m-다중항, q-사중항, dd -이중 이중항, td -삼중 이중항으로 표시된다. 폴리머의 약화된 총 내부 반사 적외선 (ATR-IR) 스펙트럼은 석영 결정 윈도우가 구비된 Shimadzu Miracle 10 ATR-FTIR 상에 기록되었다. 측정을 위해 결정 윈도우를 덮기에 충분한 작은 조각의 폴리머가 사용되었다. 모노머의 전기분무 이온화 질량 스펙트럼 (ESI-MS)은 ESI 공급원이 구비된 Bruker HCTultra II 사중극자 이온 트랩 (QIT) 질량 분광분석기 (메사추세츠주 빌레리카 소재) 상에 기록되었다. 폴리머의 분자량 및 PDI (Ð _M )는 굴절률 검출기가 구비된 50℃에서 0.5 mL/min의 유량에서의 용출물로 DMF (0.1 M LiBr 염 용액)를 사용한 TOSOH ECOSEC HLC-8320GPC 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정되었다. 폴리머의 유리전이 온도 (T _g )는 -50℃ 내지 60℃의 5 사이클 동안 10℃/min의 스캐닝 속도에서 시차 주사 열량측정 (DSC, TA Q200)에 의해 결정되었다. 폴리머의 분해 온도 (T _d )는 25℃ 내지 600℃의 10℃/min의 가열 속도에서 열중량측정 분석 (TGA, TA Q500)을 사용하여 결정되었다.

실시예 1

비스 (l-발린)- l,8 - 옥타닐 디에스테르의 디-p-톨루엔설폰산성 염 (Ml)의 합성

L-발린 (27.5 gm, 0.234 mol), 1,8-옥탄디올 (15 gm, 0.102 mol), p-톨루엔설폰산 일수화물 (46.57 gm, 0.190 mol)을 틴 스탁 트랩, 콘덴서 및 자석 교반 막대가 구비된 500ml 둥근바닥 플라스크에 톨루엔과 함께 칭량하였다. 용액을 교반하에서 48h 동안 가열 환류하였다. 생성물을 주위 온도로 냉각한 후 열수에 용해시키고 카본블랙으로 교반하여 임의의 착색된 불순물을 제거하였다. 모노머를 물에서 3회 재결정화를 추가로 거치게 하여 순수한 생성물로서 백색 분말 40gm (수율 = 65%)을 얻었다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ) : 0.95 (dd, J = 6.96 Hz, 10.48 Hz, 12H; CH3), 1.21 (d, J = 45.71 Hz, 8H; CH₂), 1.54 (m, 4H, CH₂), 2.02-2.20 (m, 2H, CH), 2.31 (d, J = 19.91 Hz, 6H; CH₃), 3.90 (d, J = 4.56 Hz, 2H; CH), 3.98-4.40 (m, J = 6.53 Hz, 10.83 Hz, 17.18 Hz, 4H; CH₂), 7.29 (dd, J = 7.97 Hz, 110.42 Hz, 4H; CH), 8.23 (br s, 6H, NH). 도 18 참고.

실시예 2

비스 -N- boc -0- 벤질 (l-세린)- l,8 - 옥타닐 디에스테르의 합성 (M2)

N-boc-O-벤질-l-세린 (15 gm, 50.79 mmol), 1,8-옥탄디올 (3.09 gm, 21.16 mmol) 및 DPTS (1.06 gm, 4.23 mmol)을 N₂ 하에서 30 mL의 무수 DCM에 용해시켰다. 반응 플라스크를 그 다음 빙욕에 액침시키고 DIC (7.62 ml, 48.67 mmol)를 0℃에서 N₂ 하에서 플라스크에 빠르게 주입하였다. 온도를 서서히 실온으로 증가시키면서 반응물을 불활성 분위기 하에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 여과하여 우레아 결정을 제거하고 진공 하에서 농축하였다. 유성 생성물은 CHC13에 용해시키고 5% HCl 용액으로 2회 그리고 DI 수로 1회 세정하고, 무수 Na₂S0₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 밝은 황색 착색된 오일 (13.38 gm, 수율 = 89%)을 용출물로서 헥산/에틸 아세테이트 (2.65/1, v/v)로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ) : 1.20 (s, 4H, CH₂), 1.37 (s, 22H, CH₃), 1.50 (m, 4H, CH₂), 3.53-3.77 (m, 4H, CH₂), 3.85-4.13 (m, 4H, CH₂), 4.24 (dd, J = 5.55 Hz, 12.80 Hz, 2H; CH), 4.46 (s, 4H, CH₂), 7.09 (d, J = 7.92Hz, 2H; CH), 7.19-7.40 (m, 12H, Ar H). 도 19 참고.

실시예 3

비스 -N- boc (l-세린)- l,8 - 옥타닐 디에스테르 (M3)의 합성

M2 (11 gm, 15.69 mmol)을 수소화 병에서 30 mL의 에탄올에 용해시켰다. 1.3 gm의 Pd/C 촉매를 폴리머 용액에 첨가하고 48시간 동안 약간의 가열 (∼35℃)로 60 psi H2 압력 하에서 수소화분해를 거치게 했다. 용액을 30분 동안 5000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 여과하고, 농축시키고 진공 하에서 건조시켜 생성물로 무색 오일을 얻었다 (8.5 gm, 수율 = 77%). ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ) : 1.20 (s, 4H, CH2), 1.37 (s, 22H, CH₃), 1.53 (m, 4H, CH2), 3.65 (t, J = 5.44 Hz, 4; CH2), 3.8-4.19 (m, 4H, CH2), 6.91 (d, J = 8.02 Hz, 2H; CH). 도 19 참고.

실시예 4

비스 -N- boc -0- 디페닐포스페이트 (l-세린)- l,8 - 옥타닐 디에스테르 (M4)의 합성

M3 (9 gm, 3.40 mmol)을 질소 하에서 약 15 mL의 피리딘에 용해시키고 15분 동안 빙욕에 액침하였다. 디페닐포스포릴 염화물 (10.21 gm, 8 ml, 6.72 mmol)을 질소 하에서 반응 용액에 느리게 첨가하였다. 반응 온도를 서서히 실온으로 증가시키면서 반응물을 밤새 교반하였다. 약 30 mL의 CHC13을 반응 플라스크에 첨가하여 생성물을 용해시켰다. 용액을 100 mL의 DI 수, 100 mL의 1M HC1 그리고 마지막으로 2x 100 mL의 DI 수로 한번 세정하였다. 유기상을 무수 Na2S04 상에서 건조시키고 그리고 황색계 고형 생성물이 수득될 때까지 추가로 진공 하에서 건조시켰다. 황색 고체를 이소프로판올에서 3회 후속적으로 재결정화하여 순수한 생성물로 백색 분말을 얻었다 (8.8 gm, 수율 = 52%) . ¹H NMR (300 MHz; DMSO-d6, δ) : 1.17 (s, 4H, CH2), 1.35 (s, 22H, CH₃), 1.47 (m, 4H, CH2), 3.99 (t, J = 6.36 Hz, 6H; CH2), 4.42 (d, J = 6.11 Hz, 4H; CH2), 7.23 (dd, J = 7.61 Hz, 15 Hz, 8H; Ar H), 7.4 (t, J = 7.85Hz, 12H; Ar H). 도 19 참고.

실시예 5

비스 -0- 디페닐포스페이트 (l-세린)- l,8 - 옥타닐 디에스테르의

디하이드로클로라이드 염 (M5)의 합성

4M HCl/디옥산 용액 (40 ml)을 M4 (8.8 gm)에 첨가하고 질소 하에서 밤새 교반하였다. 용액을 농축시키고 냉동건조시켜 용매를 제거하였다. 냉동 건조 후 수득된 밝은 황색 고체를 에틸 아세테이트로 세정하고 건조시켜 밝은 황색 분말을 순수한 생성물로 취했다 (8.8 gm, 수율 = 100%). ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ) : 1.16 (t, J = 7.05 Hz, 4H; CH₂), 1.43 (m, 4H, CH₂), 4.02 (t, J = 6.20 Hz, 4H; CH₂), 4.68 (s, 6H, CH₂), 7.24 (dd, J = 7.94 Hz, 15.66 Hz, 8H, Ar H), 7.41 (t, J = 7.29 Hz, 12H; Ar H), 8.96 (br s, 6H, NH). 도 19 및 20 참고. ESI-MS (m/z) : 이론치: 784.74; 계산치: [M + H] + = 785.2. 도 21 참고.

실시예 6

1,8- 옥탄디올 -l-발린 폴리 (에스테르 우레아 ) ( 폴리 (l -Val-8))의 합성:

자석 교반 막대 및 균압 투입 깔때기가 구비된 500 mL 3구 둥근바닥 플라스크에 40 mL의 클로로포름 내에 비스(L-발린)-l,8-옥타닐-디에스테르의 디-p-톨루엔설폰산성 염 (Ml) (13.74 g, 20 mmol, 1 eq.) 및 트리에틸아민 (12.55 ml, 90 mmol, 4.5 eq.)을 용해시킴에 의해 용액 중합을 수행하였다. 트리포스겐 (2.37 g, 8 mmol, 0.4 eq.)을 그런 다음 15 mL의 새롭게 증류된 클로로포름에 용해시키고 질소 하에서 실온에서 적가하였다. 15 mL의 클로로포름에 용해시킨 추가 분취액의 트리포스겐 (0.45 g, 1.5 mmol, 0.08 eq.)을 플라스크에 적가한 후 반응을 12시간 동안 계속했다. 반응물을 추가의 8시간 동안 교반시켰다. 폴리머는 열수에 침전함에 의해 정제되고 진공 하에서 건조되었다.　¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δ) : 0.86 (m, 12H, CH₃), 1.26 (s, 8H, CH₂), 1.54 (s, 4H, CH₂), 1.98 (dd, J = 6.69 Hz, 11.73 Hz, 2H; CH), 3.78-4.21 (m, 6H, CH₂　CH), 6.37 (d, J = 8.89 Hz, 2H; NH) . 13.9 KDa. 도 22 참고.　¹³C NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δ) : 19.39 (C4), 25.69 (C2), 28.55 (C2), 28.97 (C2), 30.91 (C2), 58.13 (C2), 64.52 (C2), 157.96 (NH-C=0), 172.84 (0-C=0). ATR-IR (v) : 1650-1690 cm^-1　(s, C=0 우레아 거리), 1735-1750 cm^-1　(s, C=0 에스테르 거리), 3300-3500 cm^-1　(m, N-H 우레아 거리). Ð _M 　= 3.2, M _n 　= 4.3 KDa, M _w 　= 13.9 KDa. 도 23 참고.

실시예 7

폴리 (세린 디페닐포스페이트 -co-발린) ( 폴리(SerDPP-co-Val)의 합성:

P(l-Val-8)에 유사한 용액 중합을 통하여 코폴리머를 합성하였다. 전형적으로, 모노머 (20 mmol, 1 eq.) 및 트리에틸아민 (90 mmol, 4.5 eq.) 둘 모두를 자석 교반기가 구비된 500 mL 3구 둥근바닥 플라스크에서 N₂ 하에서 40 mL의 새롭게 증류된 CHC1₃에 용해시켰다. 트리포스겐 (8 mmol, 0.4 eq.)을 15 mL의 증류된 클로로포름에 용해시키고 질소 하에서 실온에서 플라스크에 적가하였다. 반응을 12시간 동안 지속하고 그 다음 추가 분취액의 트리포스겐 (1.5 mmol, 10 mL의 클로로포름 내 0.075 eq.)을 플라스크에 적가하였다. 반응 용액을 분별 깔때기로 전달하고 열수에 적가 침전시킨 후 또 다른 8시간 동안 반응을 지속했다. 물을 주위 온도로 냉각시킨 후, 폴리머를 실온에서 물에서 밤새 세정하고 마지막으로 진공 하에서 건조시켜 생성물로 백색 폴리머를 얻었다.

실시예 8

5% 폴리(SerDPP-co-Val)의 합성

이론적 모노머 공급 비- pSer/Val (M5/M1) = 15/85: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δ) : 실제의 모노머 비 = 5/95, δ = 0.85 (dd, J = 6.76 Hz, 13.63 Hz, 195H; CH₃), 1.26 (d, J = 11.12 Hz, 154H; CH₂), 1.54 (m, 72H, CH₂), 1.98 (dd, J = 6.56 Hz, 12.58 Hz, 31H; CH), 3.93-4.14 (m, 137H, CH_¾CH), 6.37 (d, J = 8.91 Hz, 38H; NH), 7.06-7.18 (m, 26H, Ar H), 7.19-7.34 (m, 12H, Ar H) .　¹³C NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δ) : 19.4 (C4), 25.69 (C4), 28.55 (C4), 30.90 (C2), 58.15 (C4), 64.53 (C4), 120.34 (Ar C), 123.08 (Ar C), 129.31 (Ar C), 157.97 (NH-C=0), 172.85 (0-C=0). 도 24 참고.　³¹P NMR (500 MHz, DMSO-d₆, 85% H₃P0₄　외부 참조, δ) : 11.58 ppm. ATR-IR (v): 1650-1690 cm^-1　(s, C=0 우레아 거리), 1735-1750 cm^-1　(s, C=0 에스테르 거리), 3300-3500 cm^-1　(m, N-H 우레아 거리), ∼1040 cm^-1　(w, P=0 거리), ∼675 cm　¹　(w, P-0 거리). Ð _M 　= 1.4, M _n 　= 7.7 KDa, M _w 　= 10.5 KDa. 도 25 참고.

실시예 9

2% 폴리(SerDPP-co-Val)의 합성

이론적 모노머 공급 비- pSer/Val (M5/M1) = 10/90: ¹H NMR 스펙트럼 공명은 상이한 적분 값을 갖는 5% P(SerDPP-co-Val)에 유사하다. 도 6, 24 참고. 실제의 모노머 비 = 2/98.　¹³C 및　³¹P NMR 스펙트럼 및 ATR-IR 스펙트럼은 5% 폴리(SerDPP-co-Val)의 것과 상응한다. Ð _M 　= 1.4, M _n 　= 6.5 KDa, M _w 　= 9.3 KDa. 도 3, 6, 8, 및 24 참고.

실시예 10

폴리 ( 포스포 세린-co-발린) ( 폴리(pSer-co-Val)의 합성:

디페닐 보호 기는 Pt0₂ 촉매의 존재에서 수소화분해에 의해 탈보호되어 날도래류 실크의 모방체로 포스페이트 작용화된 코폴리머를 합성하였다. 전형적으로, 폴리(SerDPP-co-Val) (1.00 g)을 50 mL CHC1₃: 40% TFA/AcOH (4:1) 용액에 용해시켰다. 촉매로서 Pt0₂　(SerDPP의 1.1 eq.)를 수소화 폭발 반응기에서 폴리머 용액에 첨가하고 반응을 실온에서 2시간 동안 H₂　(60 psi)의 존재에서 수행하였다. 용액을 여과하고 진공 하에서 농축하였다. 열수에서 침전 후 순수한 폴리머를 백색 고체로서 수득하고 진공 하에서 건조시켰다.

실시예 11

5% 폴리 ( pSer -co-Val):

0.9 g, 수율 = 90%. ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δ) : 0.85 (dd, J = 6.76 Hz, 13.61 Hz, 194H; CH₃), 1.26 (s, 155H, CH₂), 1.54 (m, 72H, CH₂), 1.98 (td, J = 6.72 Hz, 13.39 Hz, 35H; CH), 3.87-4.18 (m, 102H, CH₂, CH), 4.37 (t, J = 6.48 Hz, 2H; CH₂), 6.37 (d, J = 8.91 Hz, 26H, NH).　¹³C NMR (500 MHz, DMSO-d_6>δ) : 19.4 (C4), 25.69 (C4), 28.55 (C4), 30.90 (C2), 58.15 (C4), 64.53 (C4), 157.97 (NH-C=0), 172.85 (0-C=0). 도 26 참고.　³¹P NMR (500 MHz, DMSO-d₆, 85% H₃P0₄　외부 참조, δ) : -1.20 ppm. 도 27 참고. ATR-IR (v) : 1650-1690 cm^-1　(s, C=0 우레아 거리), 1735-1750 cm^-1　(s, C=0 에스테르 거리), 3300-3500 cm^-1　(m, N-H 우레아 거리), ∼ 1040 cm^-1　(w, P=0 거리), ∼710 cm^-1　(w, P-0 거리). 도 5 참고.

실시예 12

2% 폴리 ( pSer -co-Val):

1 g, 수율 = 100%. ¹H NMR 스펙트럼 공명은 상이한 적분 값을 갖는 5% 폴리(pSer-co-Val)에 유사하다.　¹³C 및　³¹P NMR 스펙트럼 및 ATR-IR 스펙트럼은 5% 폴리(pSer-co-Val)의 것에 상응한다. 도 4, 7, 9, 및 26 참고.

실시예 13

표면 에너지 측정.

5개의 상이한 액체의 접촉각을 측정하여 Owens/Wendt 방법을 사용하여 각각의 폴리머에 대한 각각의 표면 에너지를 계산하였다. 접촉각 측정을 위해 공지된 표면 장력의 액체 (물, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 포름아미드)를 사용했다.³⁰ 폴리머 박막을 에탄올 내 폴리머의 1% (w/v) 용액을 사용하여 2000 rpm에서 1분 동안 오존 처리된 실리콘 웨이퍼 상에서 회전 코팅했다. 샘플을 진공하에 70℃에서 밤새 건조시켰다. 각각의 샘플에 대해 실온에서 측정 (n = 3)을 수행하였고, 평균의 표준 편차는 독립적인 측정으로부터 계산하였다. 결과는 상기 표 1 및 2에 보고되어있다.

실시예 14

알루미늄 기판 상의 중첩 전단 접착 시험.

중첩 전단 접착 시험을 ASTM D1002 표준에 따라 알루미늄 기재 상에서 수행하였다. 두께 1.6mm의 알루미늄 피착체를 각각의 피착체 내에 일 단부로부터 12.5mm에 드릴로 구멍을 낸 직경 6.5mm의 구멍을 갖는 길이 75mm × 폭 12.5mm의 직사각형 기판으로 절단하였다. 접착 시험을 위해, 에탄올 내 폴리머 용액 (30 μL, 1 mL 에탄올 내 300 mg)을 피착체의 일 말단에 적용하였다. 또 다른 피착체는 1.56㎠의 중첩 영역을 갖는 중첩 전단 배치형태로 그 위에 배치되었다. 가교결합제가 이용될 때, 폴리머 용액 (25 μL, 1 mL 에탄올 내 300 mg) 및 가교결합제 용액 (5 μL, 1 mL 아세톤 내 pSer 기 당 0.3 eq.)을 혼합하고 피착체의 일 말단에 적용하였다. 피착제를 함께 가압하고, 그리고 시험하기 전에 실온에서 1시간 동안 그리고 75℃에서 24시간 동안 그리고 실온에서 1시간 동안 경화되도록 하였다. 중첩 전단 접착은 1000 N의 하중 셀을 갖는 Instron 5567 기기를 사용하여 수행하였다. 피착체는 파단이 발생할 때까지 1.3 mm/분의 속도로 당겨졌다. 접착 강도 (Pa)는 파단시 최대 하중 (N)을 접착 면적 (㎡)으로 나눔으로써 수득된다. 결과는 도 2A-G에 보고되어 있다.

실시예 15

소의 뼈 기질에 대한 말단간 접착 시험.

폴리(pSer-co-Val)의 접착 특징을 연구하기 위해, 우리는 피질 소 뼈에 대한 말단간 접착 실험을 수행하였다. 소 뼈 샘플은 지역 식료품점에서 수득하였다. 뼈를 뼈 톱에서 길이 ∼2cm × 폭 0.6cm × 두께 0.4cm의 직사각형 조각으로 절단하였다. 후속적으로, 320 그릿 사포 (3M Pro Grade Precision, X-fine)를 사용하여 뼈 샘플의 시험 단부를 샌딩하고 뼈를 접착제 적용 1시간 전에 PBS 용액에 보관했다. 폴리머 용액 (30 μL, 1 mL 에탄올 내 300 mg)을 뼈의 일 말단 상에 적용하고 제2 뼈는 그 위에 말단간으로 배치했다. 가교결합된 시료를 위해, 폴리머 용액 (25 μL, 1 mL 에탄올 내 300 mg) 및 가교결합제 용액 (5 μL, 1 mL 아세톤 내 pSer 기 당 0.3 eq.)을 하나의 뼈에 적용하고 제2 뼈는 말단간 배치형태로 배치하였다. 뼈 샘플을 함께 클리핑하고 24시간 동안 PBS 침지된 거즈로 랩핑하였다. 그 다음 샘플을 접착 시험 전에 2시간 동안 37℃, 95% 습도 및 5% C0₂에서 인큐베이터에 두었다. 접착 시험은 5kg 하중 셀이 구비된 텍스처 분석기 (TA.XT.Plus)에서 수행하였다. 뼈 샘플은 파단이 발생할 때까지 1.3 mm/분의 속도로 당겨졌다. 접착 강도 (Pa)는 파단시 최대 하중 (N)을 접착 면적 (㎡)으로 나눔으로써 수득된다. 결과는 도 15A-C에 보고되어 있다.

실시예 16

시험관내 세포 생존력 연구.

MC3T3 세포의 세포 생존력 및 퍼짐성은 씨딩 후 각각 1일 및 3일에 포스페이트 작용화된 폴리머 상에서 연구되었다. 폴리머 필름을 에탄올 내 3% (w/v) 용액으로부터 2000 rpm으로 1분 동안 12 mm 유리 커버슬립 상에 회전 코팅하였다. 필름을 진공하에서 80℃에서 밤새 건조시키고 주의하여 12 웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 37℃, 95% 습도, 5% C0₂에서 5분 동안 lmL의 0.05% 트립신/EDTA 용액으로 떼어 내기 전에 PBS로 린스하였다. 트립신/EDTA 용액을 5 mL의 배지를 첨가하여 탈활성화시키고 세포를 4℃, 3000 rpm에서 1분간 원심분리하여 수집하였다. 배지/트립신 용액을 세포 펠릿을 방해하지 않고 흡인하고, 세포를 5 mL의 새로운 배지에 재현탁시켰다. 세포 밀도는 트립판 블루 염색으로 혈구계를 사용하여 계수하였다. 세포를 6000 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. 배양 전에 샘플 위에 세포의 고른 분포를 공고히 하기 위해 웰 플레이트를 가볍게 진탕하였다.

세포 생존력은 라이브/데드 검정 (Life Technologies)에 의해 평가하였다. 약 5 μL의 칼세인 AM (4 mM)과 10 μL의 에티듐 호모다이머를 10 mL의 DPBS에 첨가하여 염색 용액을 준비했다. 배지를 모든 샘플로부터 흡인시키고 DPBS로 린스하여 각 웰에 0.5 mL의 염색 용액을 첨가하였다. 웰 플레이트를 알루미늄 포일로 덮고 이미지형성 전에 37℃에서 10분간 배양하였다. 이미지를 Hamamatsu orca R2CCD 카메라, FITC 및 TRITC 필터가 구비된 올림푸스 형광 현미경으로 CellSENS 소프트웨어를 사용하여 4X 배율로 촬영했다. 녹색으로 염색된 세포는 살아있는 것으로 간주되었고 빨간색으로 염색된 세포는 죽은 것으로 간주되었다. 세포는 세포 계수기 플러그인을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 계수했다. 결과는 도 16에 보고되어 있다.

실시예 17

세포 퍼짐성 검정.

퍼짐성 연구를 위해, 세포를 건조 블록 상에서 37℃에서 5분 동안 CS 완충 용액 내 1 mL 배지와 1 mL 3.7% 파라포름알데하이드 (PFA)에 미리 고정시켰다. 흡인 후, 세포를 37℃에서 5분 동안 CS 완충 용액 내 2% 3.7% PFA 용액에 고정시켰다. 그 다음 샘플을 2 mL CS 완충액으로 3회 린스하고 이어서 37℃에서 10분 동안 세포를 투과시키도록 각각의 웰에 CS 완충액 내 1.5 mL의 트리톤 X-100 (0.5% v/v)을 첨가하였다. 샘플을 CS 완충액으로 3회 린스하였다. CS 완충액 내에 새로 제조된 0.1 wt% NaBH₄　2 mL를 그 다음 각 웰에 10분 동안 및 실온으로 첨가하여 알데하이드 형광을 켄칭한 후, 이어서 5% 당나귀 혈청에서 20분 동안 실온에서 흡인 및 배양하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 흡인 후 샘플을 4℃에서 밤새 CS 완충액 내 300 μL 빈쿨린 1차 항체 마우스 (v/v 1 :200)에서 배양했다. 그 다음 샘플을 1% 당나귀 혈청으로 3회 린스하고 그리고 암실에서 실온에서 1시간 동안 왁스 종이 상에 50 μL 로다민 팔로이딘 (v/v 1:40) 및 Alexa Fluor 488 2차 항체 마우스 (v/v 1:200) 용액으로 염색하였다. 샘플을 CS 완충액으로 3회 세정한 후, 핵을 CS 완충액 내 DAPI (6 μL/10 mL)를 사용하여 암실에서 실온에서 20분 동안 염색하였다. 샘플을 CS 완충액으로 3회 린스하여 과잉의 염색을 제거하고 FITC, TRITC 및 DAPI 필터를 갖는 Hamamatsu orca R2CCD 카메라가 구비된 올림푸스 형광 현미경 하에서 20X 배율로 관찰하였다. 결과는 도 17에 보고되어 있다.

전술한 내용에 비추어, 본 발명은 구조적으로 그리고 기능적으로 여러 가지 면에서 개선된 신규한 분해성이고 재흡수성인 인산화된 폴리(에스테르-우레아) (PEU)계 접착제 (및 이를 제조하고 사용하는 관련된 방법)를 제공함에 의해 기술을 상당히 진보시켰다는 것이 인정되어야 한다. 본 발명의 특정 구현예가 본 명세서에 상세하게 개시되었지만, 본 발명은 여기에 제한되지 않고, 또는 그렇게 함으로써 본 명세서에서 본 발명에 대한 변형이 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 인정될 수 있을 것이다는 것이 인정되어야 한다. 본 발명의 범위는 이하의 청구항들로부터 인정될 것이다.

Claims

포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머 백본; 및
2가 금속 염을 포함하는 가교결합제를 포함하고,
상기 포스페이트 기는 하나 이상의 탄소 원자를 통해 상기 하나 이상의 측쇄에 공유결합되는 것인,
폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제.
청구항 1에 있어서, 상기 PEU 폴리머 백본은 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산의 잔기를 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 1에 있어서, 상기 PEU 폴리머 백본은 하나 이상의 인산화된 L-세린 분자의 잔기를 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 1에 있어서, 상기 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머 백본은:
2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 인산화된 아미노산을 포함하는 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머의 잔기; 및
2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 아미노산을 포함하는 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머의 잔기를 더 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 4에 있어서, 상기 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 2개의 인산화된 L-세린 분자를 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 4에 있어서, 상기 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 하기 식을 갖는, PEU계 접착제:

식 중, a는 1 내지 20의 정수임.
청구항 4에 있어서, 상기 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V)으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 아미노산을 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 4에 있어서, 상기 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 발린 또는 이소류신을 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 4에 있어서, 상기 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 하기 식을 갖는, PEU계 접착제:

또는

식 중, R은 -CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃₅　-CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, -CH(CH₃)₂이고 a는 1 내지 20의 정수임.
청구항 1 또는 4 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식을 갖는, PEU계 접착제:

또는

식 중, R은 -CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, -CH(CH₃)₂이고; a는 1 내지 20의 정수이고; m은 1% 내지 20%의 몰 퍼센트이고; 그리고 n은 80% 내지 99%의 몰 퍼센트임.
청구항 1에 있어서, 상기 가교결합제는 칼슘, 마그네슘, 스트론튬, 바륨, 아연, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 금속의 2가 염인, PEU계 접착제.
청구항 1에 있어서, 상기 가교결합제는 상기 PEU계 접착제의 1 몰 퍼센트 내지 20 몰 퍼센트를 포함하는, PEU계 접착제.
청구항 1의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
A. 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머를 제조하는 단계, 여기서 상기 포스페이트 기는 하나 이상의 탄소 원자를 통해 상기 하나 이상의 측쇄에 공유결합되고;
B. 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제를 부가하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머 대 상기 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제의 몰비는 1:1 내지 10:1인, 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머는 하기 식을 갖는, 방법:

또는

식 중, R은 -CH₃, H, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂SCH₃, -CH₂Ph-, -CH(OH)CH₃, -CH₂-C=CH-NH-Ph, -CH₂-Ph-OH, -CH(CH₃)₂이고; a는 1 내지 20의 정수이고; m은 1% 내지 20%의 몰 퍼센트이고; 그리고 n은 80% 내지 99%의 몰 퍼센트임.
청구항 13에 있어서, PEU 폴리머를 제조하는 단계 (단계 A)는:
1. 1 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 인산화된 아미노산을 포함하는 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머를 제조하는 단계;
2. 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 아미노산을 포함하는 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머를 제조하는 단계;
3. 상기 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머와 상기 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머를 포스겐, 디포스겐 또는 트리포스겐으로 반응시켜 상기 제1 및 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머 사이에 그리고 그 중에 우레아 결합을 도입하여 단계 A의 PEU 폴리머를 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 제1 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 인산화된 세린 분자를 포함하는, 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 2 내지 20개의 탄소 원자에 의해 분리된, 알라닌 (ala - A), 글리신 (gly - G), 이소류신 (ile - I), 류신 (leu - L), 메티오닌 (met - M), 페닐알라닌 (phe - F), 트레오닌 (thr - T), 트립토판 (trp - W), 티로신 (tyr - Y), 또는 발린 (val - V)으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 아미노산을 포함하는, 방법.
청구항 16 또는 18에 있어서, 상기 제2 아미노산계 폴리에스테르 모노머는 발린 또는 이소류신 분자를 포함하는, 방법.
청구항 1의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제를 사용하여 뼈에 뼈를 또는 금속에 뼈를 접합하는 방법으로서, 상기 방법은:
A. 연결되어 지는 제1 표면과 제2 표면을 준비하는 단계;
B. 포스페이트 기를 포함하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 PEU 폴리머를 준비하는 단계, 여기서 상기 포스페이트 기는 하나 이상의 탄소 원자를 통해 상기 하나 이상의 측쇄에 공유결합되고;
C. 단계 A의 PEU 폴리머 안으로 2가 금속 염을 포함하는 가교결합제를 혼합하여 청구항 1의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제를 형성하는 단계;
D. 단계 C의 PEU 폴리머/가교결합제 혼합물을 연결되어 지는 상기 제1 및 제2 표면 중 하나 또는 둘 모두에 적용하는 단계;
E. 연결되어 지는 상기 제1 및 제2 표면이 서로 접촉하게 배치하는 단계; 및
F. 청구항 1의 폴리(에스테르 우레아) (PEU)계 접착제가 가교결합되도록 하여, 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 결합을 형성시키는 단계를 포함하는, 방법.