CN109561953B - 基于磷酸化聚(酯-脲)的可降解骨粘合剂 - Google Patents

基于磷酸化聚(酯-脲)的可降解骨粘合剂 Download PDF

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Abstract

在各个方面，本发明提供了一种可降解且可吸收的新颖的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂及其合成和使用的相关方法。这些粘合剂由使用一种或多种二价金属交联剂交联的磷酸基官能化的PEU聚合物和共聚物形成。已发现本发明各实施方式的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂在将骨与骨或金属粘结方面特别有效，并且其已显示出显著的且与市售聚(甲基丙烯酸甲酯)骨接合剂相当的对骨样品的粘合强度。

Description

基于磷酸化聚(酯-脲)的可降解骨粘合剂
相关申请的引用
本申请要求于2016年4月28日递交的题为“基于磷酸化聚(酯-脲)的可降解骨粘合剂(Phosphorylated Poly(ester-urea)Based Degradable Bone Adhesives)”的美国临时专利申请序列号62/328,653的权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
关于联邦政府赞助的研究或开发支持的声明
本发明是在国家科学基金会授予的合同号DMR-1507420和DMR-1359321以及来自国防医学研究和发展计划的作战伤员救护部(Department of Defense Medical Researchand Development Program,Combat Casualty Care)的合同号W81XWH-15-1-0718下在政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明的一个或多个实施方式涉及可降解且可再吸收的医学和生物学粘合剂。在某些实施方式中，本发明涉及基于磷酸化聚(酯-脲)(PEU)的可降解且可再吸收的粘合剂，特别地可用作骨粘合剂。
背景技术
骨粘合剂和组织粘合剂在手术中是必不可少的，因为它们帮助创伤愈合、止血、组织重建和药物递送。骨手术中的经典结构可替选方案包括使用金属板、销和螺钉作为支撑介质。这些选择虽然安全且耐用，但却遭受：无菌性松动，与骨的锚定不良，对邻近的软组织造成刺激，引起患者的不适并且需要在骨再生后更换或移除。聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)骨接合剂也常用于骨手术中，但具有明显的缺点。特别地，PMMA骨接合剂本质上不是粘合剂，缺乏化学相互作用，可导致显著的发热并且易于收缩。尝试使用合成胶(如氰基丙烯酸酯、聚氨酯、环氧树脂和磷酸钙或磷酸镁陶瓷骨接合剂)作为骨粘合剂由于缺乏与骨表面的相互作用或强度差而失败。具有可降解性质和高粘合强度的替代性骨粘合剂目前是有吸引力的临床目标。
几十年来，基于磷酸盐的化合物已被用作水下涂料、牙科应用、骨植入物、填料和金属基材中的粘合促进剂。许多研究已表明：磷酸基官能化(phosphate functionalized)的聚合物骨移植物的粘合或粘结强度和骨引导潜能显示出骨粘结方面的显著改善。某些海生生物(如贻贝、藤壶、海星、沙堡蠕虫和切翅泥苞虫)已逐步形成用于合成他们自己的具有强粘结特性的水下粘合剂。对切翅泥苞虫粘性丝的研究已证实了存在(SX)4基序形式的磷酸丝氨酸(pSer)残基，其中S是丝氨酸，X通常是缬氨酸或异亮氨酸。元素分析还显示出存在二价阳离子如Ca2+和Mg2+，其与pSer中的磷酸基团具有强静电相互作用以赋予纤维强度。切翅泥苞虫的粘合性质归因于粘性丝中的大量磷酸化区域。
聚(酯脲)(PEU)是一类非常适合生物材料应用的聚合物，因为它们具有有吸引力的性质，包括降解成代谢组分、可调节的机械性质、广泛的功能性以及在体外和体内均无毒性。本领域需要的是与骨一起使用的粘合剂，其具有在切翅泥苞虫粘性丝中所见的粘合性质和在PEU聚合物中所见的有益性质。
发明内容
在各个方面，本发明提供了一种可降解且可吸收的新颖的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂及其合成和使用的相关方法。这些粘合剂由使用一种或多种二价金属交联剂交联的磷酸基官能化的PEU聚合物和共聚物形成，其被设计和制造以模拟切翅泥苞虫粘性丝的性质。已发现本发明的各种实施方式的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂在将骨与骨或金属粘结方面特别有效，并且其已显示出显著的(439±203KPa)且与市售聚(甲基丙烯酸甲酯)骨接合剂(530±133KPa)相当的对骨样品的粘合强度。据认为，这些磷酸基官能化的PEU聚合物和共聚物在生长肽(如OGP或BMP-2)存在的情况下具有作为用于脊髓损伤和矫形修复的支架材料、矫形粘合剂的极大潜能，并且在体外和体内均可降解。
在第一方面，本发明涉及一种聚(酯脲)(PEU)系粘合剂，所述粘合剂包含：PEU聚合物骨架，其具有一个或多个包含磷酸基团的侧链；和包含二价金属盐的交联剂。在一些实施方式中，PEU聚合物链包含选自由以下组成的组中的氨基酸的残基：丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly-G)、异亮氨酸(ile-I)、亮氨酸(leu-L)、甲硫氨酸(met-M)、苯丙氨酸(phe-F)、苏氨酸(thr-T)、色氨酸(trp-W)、酪氨酸(tyr-Y)或缬氨酸(val-V)。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中PEU聚合物链包含一个或多个磷酸化L-丝氨酸分子的残基。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物骨架还包含：第一氨基酸系聚酯单体的残基，该第一氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个磷酸化氨基酸；和第二氨基酸系聚酯单体的残基，该第二氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个氨基酸。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第一氨基酸系聚酯单体包含两个磷酸化的L-丝氨酸分子。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第一氨基酸系聚酯单体具有式：
Figure GDA0002784372840000031
其中a是约1至约20的整数。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第二氨基酸系聚酯单体包含两个选自以下所组成的组中的氨基酸：丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly-G)、异亮氨酸(ile-I)、亮氨酸(leu-L)、甲硫氨酸(met-M)、苯丙氨酸(phe-F)、苏氨酸(thr-T)、色氨酸(trp-W)、酪氨酸(tyr-Y)或缬氨酸(val-V)。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU) 系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第二氨基酸系聚酯单体包含缬氨酸或异亮氨酸。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第二氨基酸系聚酯单体具有式：
Figure GDA0002784372840000032
Figure GDA0002784372840000041
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2且a为1至20的整数。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其具有式：
Figure GDA0002784372840000042
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2；a是1至20的整数； m是约1％至约20％的摩尔百分比；n是约80％至约99％的摩尔百分比。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中交联剂是选自由以下组成的组中的金属的二价盐：钙、镁、锶、钡、锌及其组合。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲) (PEU)系粘合剂包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中交联剂占PEU系粘合剂的约1摩尔％至约20摩尔％。
在第二方面，本发明涉及制备聚(酯脲)(PEU)系粘合剂的方法，所述方法包括：制备具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物；添加包含二价金属盐的交联剂。在一些实施方式中，具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物与包含二价金属盐的交联剂的摩尔比为约1:1至约10:1。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲) (PEU)系粘合剂包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物具有上述式V或VI。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中制备PEU聚合物的步骤还包括：制备第一氨基酸系聚酯单体，其包含被1-20个碳原子隔开的两个磷酸化氨基酸；制备第二氨基酸系聚酯单体，其包含被2-20个碳原子隔开的两个氨基酸；使所述第一氨基酸系聚酯单体和所述第二氨基酸系聚酯单体与光气、双光气或三光气反应，以在所述第一氨基酸系聚酯单体和所述第二氨基酸系聚酯单体之间和之中引入脲键，以形成PEU聚合物。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第一氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个磷酸化的丝氨酸分子。
在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第二氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个氨基酸，所述两个氨基酸选自由丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly-G)、异亮氨酸(ile-I)、亮氨酸(leu-L)、甲硫氨酸(met-M)、苯丙氨酸(phe-F)、苏氨酸(thr-T)、色氨酸(trp-W)、酪氨酸(tyr-Y)或缬氨酸(val-V)所组成的组。在一个或多个实施方式中，本发明的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任何一个或多个，其中第二氨基酸系聚酯单体包含缬氨酸或异亮氨酸分子。
在第三方面，本发明涉及使用聚(酯脲)(PEU)系粘合剂将骨与骨或骨与金属粘结的方法，所述方法包括：制备待连接的第一表面和第二表面；制备具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物；将包含二价金属盐的交联剂混合到PEU聚合物中以形成聚(酯脲)(PEU)系粘合剂；将PEU聚合物/交联剂混合物施加到所述待连接的第一表面和第二表面中的一个或两个上；将所述待连接的第一表面和第二表面放置成彼此接触；并使所述聚(酯脲)(PEU)系粘合剂交联，从而在所述第一表面和所述第二表面之间形成粘结。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图。
图1是示出了聚(pSer-共聚-Val)上的磷酸基团
Figure GDA0002784372840000051
如何与骨表面上的正电荷相互作用从而促进与骨的粘合的示意图。来自碘化钙(交联剂)的Ca2+与聚合物大分子中的磷酸基团相互作用，从而产生内聚力。
图2A-图2B是参考85％H3PO4作为外标示出了5％聚(SerDPP-共聚-Val)(上)和5％聚(pSer-共聚-Val)(下)的1H NMR谱(图2A)以及5％聚(SerDPP-共聚-Val)(上)和5％聚(pSer-共聚-Val)(下)的31P NMR谱的图表(图2B)。(图2A)中的插图示出了以下部分的放大：1H NMR谱的δ＝7.1-7.3ppm；脱保护后，二苯基保护基团的特征峰消失和δ＝ 4.0–4.5ppm。δ＝～4.37ppm处的三重态是与脱保护的磷酸基团连接的亚甲基上的质子环境的特征，其在脱保护之前不突出(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图3是5％聚(SerDPP-共聚-Val)的13C NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图4是5％聚(pSer-共聚-Val)的13C NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图5是示出了聚(1,8-Val)、聚(SerDPP-共聚-Val)和聚(pSer-共聚-Val)的ATR-IR谱的示意图，其中对应于P＝O(1040cm-1)和P-O伸展(710-675cm-1)的峰被突出显示并标记。
图6是2％聚(SerDPP-共聚-Val)的1H NMR谱。R基团表示二苯基保护的磷酸基团。插图示出了来自二苯基保护基团的芳族峰(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图7是2％聚(pSer-共聚-Val)的1H NMR谱。R'表示脱保护的磷酸基团。插图(a) 示出了7.0–7.25ppm之间的芳族峰消失，从而证实了二苯基的脱保护；插图(b)示出了4.36ppm附近存在三重态，对应于与脱保护的磷酸基团连接的亚甲基上的质子环境 (DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图8是2％聚(SerDPP-共聚-Val)的13C NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图9是2％聚(pSer-共聚-Val)的13C NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图10是2％聚(SerDPP-共聚-Val)的31P NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图11是2％聚(pSer-共聚-Val)的31P NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图12是示出了用于确定聚(1,8-Val)、5％聚(SerDPP-共聚-Val)、2％聚(SerDPP-共聚 -Val)、5％聚(pSer-共聚-Val)和2％聚(pSer-共聚-Val)的玻璃化转变温度(Tg)的DSC曲线的图。脱保护后，磷酸基官能化聚合物的Tg没有显示出显著变化，这归因于聚合物骨架链上的低官能度。
图13是示出了用于确定聚(1,8-Val)、5％聚(SerDPP-共聚-Val)、2％聚(SerDPP-共聚 -Val)、5％聚(pSer-共聚-Val)和2％聚(pSer-共聚-Val)的分解温度(Td)的热重分析曲线的图。在二苯基脱保护后，观察到了分解温度的略微降低。
图14A-图14G示出了在室温下对铝粘附体进行的搭接剪切(lap sheer)粘合研究的结果。图14A是示出了Val–聚(1-Val-8)；2％和5％pSer–2％和5％聚(pSer-共聚-Val)(分别)；2％和5％交联物-与0.3当量Ca2+交联的2％和5％聚(pSer-共聚-Val)以及市售的骨接合剂(Simplex P)的粘合强度的图。从10次重复(n＝10)的平均值计算粘合强度，并与标准误差一起报告。铝粘附体显示出对于所有样品的内聚失效：聚(1-Val-8)(图14B)， 2％聚(pSer-共聚-Val)(图14C)，5％聚(pSer-共聚-Val)(图14D)，与0.3当量Ca2+交联的2％聚(pSer-共聚-Val)(图14E)，与0.3当量Ca2+交联的5％聚(pSer-共聚-Val)(图14F) 以及聚(甲基丙烯酸甲酯)骨接合剂(图14G)。
图15A-图15C涉及在室温下测量牛骨上的端对端粘合的比较粘合强度测量值。图15A是示出了使用Val–聚(1-Val-8)；2％和5％pSer–2％和5％聚(pSer-共聚-Val)(分别)；2％和5％交联物-与0.3当量Ca2+交联的2％和5％聚(pSer-共聚-Val)以及接合剂–市售的PMMA骨接合剂(Simplex P)在室温下对牛骨进行的端对端粘合试验的结果的图(粘合强度由3次重复(n＝3)的平均值计算并与标准误差一起报告)；图15B是示出了牛骨样品上的端对端粘合的示意图(左)和示出了质构分析仪上的端对端粘合试验机构的图像 (右)；图15C是示出了与0.3当量的Ca2+交联的5％聚(pSer-共聚-Val)的内聚失效的图像。
图16是示出了MC3T3细胞对聚合物的归一化细胞活力的图。
图17是示出了对不同聚合物的比较纵横比的图。MC3T3细胞对所有样品显示出类似的扩散性能。
图18是双(L-缬氨酸)-1,8-辛基二酯的二对甲苯磺酸盐(M1)的1H NMR谱(DMSO-d6,300MHz,30℃)
图19是示出了(a)双-N-boc-O-苄基(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯(M2)、(b)双-N-boc(l- 丝氨酸)-1,8-辛基二酯(M3)、(c)双-N-boc-O-二苯基磷酸基(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯(M4)、 (d)双-O-二苯基磷酸基(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯的二盐酸盐(M5)的磷酸丝氨酸单体合成的1H NMR谱(DMSO-d6,300MHz,30℃)的图示比较。
图20是双-O-二苯基磷酸基(L-丝氨酸)-1,8-辛基二酯的二盐酸盐(M5)的1H NMR谱(DMSO-d6,300MHz,30℃)。
图21是双-O-二苯基磷酸基(L-丝氨酸)-1,8-辛基二酯的二盐酸盐(M5)的ESI-质谱。
图22是聚(1-Val-8)的1H NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图23是聚(1-Val-8)的13C NMR(DMSO-d6,300MHz,30℃)。
图24是5％聚(SerDPP-共聚-Val)的1H NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图25是5％聚(SerDPP-共聚-Val)的31P NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图26是5％聚(pSer-共聚-Val)的1H NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
图27是5％聚(pSer-共聚-Val)的31P NMR谱(DMSO-d6,500MHz,30℃)。
具体实施方式
在各个方面，本发明提供了一种牢固的、可降解的且可吸收的新颖的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂，以及其合成和其使用的相关方法。如上所述，这些粘合剂由使用一种或多种二价金属交联剂交联的磷酸基官能化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物形成。已发现它们在将骨与骨或金属粘结方面特别有效，并且已显示出显著的(439±203KPa)且与市售聚(甲基丙烯酸甲酯)骨接合剂(530±133KPa)相当的对骨样品的粘合强度。据认为，这些磷酸基官能化的PEU聚合物和共聚物在生长肽(如OGP或BMP-2) 存在的情况下具有作为用于脊髓损伤和矫形修复的支架材料、矫形粘合剂的极大潜能，并且在体外和体内均可降解。
在第一方面，本发明涉及磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂，其由一种或多种具有磷酸基官能团的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物，以及交联剂形成。这些氨基酸基 PEU聚合物和/或共聚物具有PEU聚合物骨架(其具有一个或多个包含磷酸基团的侧链)，并且由各种氨基酸系聚酯链段组成，每个所述链段包含被约1至约60个碳原子隔开并通过脲键彼此连接的两个或三个氨基酸的残基。
在一些实施方式中，这些聚酯单体链段各自含有被长度为2至约20个碳原子的直链碳链或长度为约2至约60个碳原子的支链碳链隔开的两个或更多个氨基酸的残基，所述氨基酸选自：丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly–G)、异亮氨酸(ile–I)、亮氨酸(leu–L)、甲硫氨酸(met–M)、苯丙氨酸(phe–F)、丝氨酸(ser–S)、苏氨酸(thr–T)、色氨酸 (trp–W)、酪氨酸(tyr–Y)和缬氨酸(val-V)。在一些实施方式中，这些聚酯单体链段中的每一个均可具有两个相同的氨基酸，但在一些其他实施方式中，这些聚酯单体链段中的一些或全部可具有两个不同的氨基酸。在这些实施方式中的一些中，这些聚酯单体链段中的至少一些包含被约2至约20个碳原子隔开的一个或多个磷酸化L-丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸分子的残基。在这些实施方式中的一些中，这些聚酯单体链段包含被约2 至约20个碳原子隔开的两个缬氨酸或异亮氨酸分子的残基。
如上所述，在一些实施方式中，形成聚酯单体链段的氨基酸残基被约2至约20个碳原子的直链碳链或约2至约60个碳原子的支链碳链隔开。在一些实施方式中，形成聚酯单体链段的氨基酸残基被约3至约20个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约4至约20个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约6至约20个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约8至约20个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约10至约20个碳原子的直链碳链隔开；在其它实施方式中，被约2至约 18个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约2至约16个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约2至约14个碳原子的直链碳链隔开；在其他实施方式中，被约2至约12个碳原子的直链碳链隔开。在一些实施方式中，形成聚酯单体链段的氨基酸残基被约5至约60个碳原子的支链碳链隔开；在其他实施方式中，被约10至约60个碳原子的支链碳链隔开；在其他实施方式中，被约15至约60个碳原子的支链碳链隔开；在其它实施方式中，被约8至约20个碳原子的支链碳链隔开；在其他实施方式中，被约 20至约60个碳原子的支链碳链隔开；在其他实施方式中，被约2至约50个碳原子的支链碳链隔开；在其它实施方式中，被约2至约40个碳原子的支链碳链隔开；在其他实施方式中，被约2至约30个碳原子的支链碳链隔开；在其他实施方式中，被约2至约20 个碳原子的支链碳链隔开。在一些实施方式中，形成聚酯单体链段的氨基酸残基被8个碳原子隔开。
在一个或多个实施方式中，一些聚酯单体链段具有式：
Figure GDA0002784372840000091
其中R是–CH3、–H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2；且a是1至20的整数。
在一个或多个实施方式中，一些聚酯单体链段具有式：
Figure GDA0002784372840000092
其中a是1至20的整数。在这些实施方式中的一个或多个中，a是7。
在一个或多个实施方式中，一些聚酯单体链段具有式：
Figure GDA0002784372840000093
其中a是1至20的整数。
在各种实施方式中，形成本发明的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂的聚酯单体链段的约1摩尔％至约30摩尔％具有至少一个磷酸根侧链。在一些实施方式中，形成本发明的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂的聚酯单体链段的约2摩尔％至约25摩尔％；在其它实施方式中，约2摩尔％至约20摩尔％；在其它实施方式中，约2摩尔％至约15摩尔％；在其他实施方式中，约2摩尔％至约12摩尔％；在其他实施方式中，约 2摩尔％至约10摩尔％具有至少一个磷酸根侧链。
在一个或多个实施方式中，本发明的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂是共聚物，所述共聚物包含一个或多个第一氨基酸系聚酯单体链段，所述聚酯单体链段具有至少一个磷酸根侧链；和一个或多个如上所述的第二氨基酸系聚酯单体链段，其不具有磷酸根侧链。在这些实施方式中的一个或多个中，本发明的第一氨基酸系聚酯单体链段包含被约1至约20个碳原子的直链碳链隔开的两个磷酸化L-丝氨酸分子的残基。在这些实施方式中的一些中，本发明的第一氨基酸系聚酯单体链段具有如上所示的式IX。
在这些实施方式中的一些中，如上所述，第二氨基酸系聚酯单体链段包含被长度为2 至约20个碳的碳链隔开的两个丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly–G)、异亮氨酸(ile–I)、亮氨酸(leu–L)、甲硫氨酸(met–M)、苯丙氨酸(phe–F)、苏氨酸(thr–T)、色氨酸(trp–W)、酪氨酸(tyr–Y)或缬氨酸(val-V)分子的残基。在这些实施方式中的一些其它实施方式中，如上所述，第二氨基酸系聚酯单体链段包含被长度为3至约60个碳的支链碳链隔开的这些氨基酸分子中的三个或四个的残基。在各种实施方式中，这些链段可具有上述式VII或VIII。在一些实施方式中，如上所述，第二氨基酸系聚酯单体链段包含被1-20个碳原子隔开的两个缬氨酸或两个异亮氨酸分子的残基。在一些实施方式中，第二第一氨基酸系聚酯单体链段包含被八个碳原子隔开的两个缬氨酸分子的残基。
明显的是，第一氨基酸系聚酯单体链段和第二氨基酸系聚酯单体链段通过脲键彼此连接。预期第一氨基酸系聚酯单体链段包含约0.5摩尔％至约20摩尔％的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)共聚物。在一些实施方式中，第一氨基酸系聚酯单体链段包含约1 摩尔％至约20摩尔％；在其它实施方式中，约2摩尔％至约20摩尔％；在其他实施方式中，约4摩尔％至约20摩尔％；在其他实施方式中，约1摩尔％至约15摩尔％；在其它实施方式中，约1摩尔％至约10摩尔％；在其它实施方式中，约2摩尔％至约8摩尔％的本发明的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)共聚物。
在各种实施方式中，这些磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)共聚物具有式：
Figure GDA0002784372840000101
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2；a是1至20的整数； m是约1％至约20％的摩尔百分比；n是约80％至约99％的摩尔百分比。
在一些这些实施方式中，a是2至20的整数；在其他实施方式中，a是2至20的整数；在其他实施方式中，a是4至20的整数；在其他实施方式中，a是6至20的整数；在其他实施方式中，a是8至20的整数；在其他实施方式中，a是2至18的整数；在其他实施方式中，a是2至14的整数；在其他实施方式中，a是2至10的整数。在一些这些实施方式中，m是2％-20％的摩尔百分比；在其他实施方式中，m是4％-20％的摩尔百分比；在其他实施方式中，m是6％-20％的摩尔百分比；在其他实施方式中，m是8％-20％的摩尔百分比；在其他实施方式中，m是2％-16％的摩尔百分比；在其他实施方式中，m 是2％-14％的摩尔百分比；在其他实施方式中，m是2％-12％的摩尔百分比。在一些这些实施方式中，n是84至99的摩尔百分比；在其他实施方式中，n是88至99的摩尔百分比；在其他实施方式中，n是92至99的摩尔百分比；在其他实施方式中，n是96至99 的摩尔百分比；在其他实施方式中，n是80至97的摩尔百分比；在其他实施方式中，n 是80至93的摩尔百分比；在其他实施方式中，n是80至90的摩尔百分比；在其他实施方式中，n是80至85的摩尔百分比。
如上所述，本发明的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂还包含二价金属交联剂的残基。(参见图1)。本文应用于交联剂的术语“金属”应被理解为包括碱土金属如钙和镁。合适的二价金属可包括但不限于钙、镁、锶、钡、锌及其组合。
在各种实施方式中，磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)聚合物和/或共聚物与交联粘合剂的二价金属离子的摩尔比为约1:1至约10:1。在一些实施方式中，磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)聚合物或共聚物与二价金属离子的摩尔比为约2:1至约10:1；在其他实施方式中，为约4:1至约10:1；在其他实施方式中，为约6:1至约10:1；在其他实施方式中，为约1:1至约8:1；在其他实施方式中，为约1:1至约6:1；在其他实施方式中，为约 1:1至约4:1；在其他实施方式中，为约2:1至约8:1；在其他实施方式中，为约3:1至约 7:1。
在第二方面，本发明涉及制备上述磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂的方法。总的来说，该方法包括：由各种聚酯单体(其中至少一些具有磷酸根侧基)形成氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物，并将其与含有二价金属盐的交联剂组合以形成磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂。
如上所述，用于形成氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物的一些氨基酸系聚酯单体包含被长度为1至约20个碳的碳链隔开的两个丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly–G)、异亮氨酸(ile–I)、亮氨酸(leu–L)、甲硫氨酸(met–M)、苯丙氨酸(phe–F)、苏氨酸(thr– T)、色氨酸(trp–W)、酪氨酸(tyr–Y)或缬氨酸(val-V)分子。在一些实施方式中，这些氨基酸系聚酯单体具有两个相同的氨基酸，但这不是必需的；具有两个不同氨基酸的实施方式是可以的并且在本发明的范围内。在各种实施方式中，如上所述，形成用于形成氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物的这些氨基酸系聚酯单体的氨基酸被约2至约20 个碳原子的直链碳链或约2至约60个碳原子的支链碳链隔开。这些氨基酸系聚酯单体形成用于形成上述磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物的部分，但不包括粘合剂磷酸根侧链。
在一个或多个实施方式中，这些氨基酸系聚酯单体可包含被约1至约20个碳原子隔开的两个缬氨酸分子。在一些实施方式中，这些氨基酸系聚酯单体可具有式：
Figure GDA0002784372840000121
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2且a为1至20的整数。
在各种实施方式中，这些氨基酸系聚酯单体可以由所选氨基酸与多元醇的反应形成，如方案1中所示。
方案1
Figure GDA0002784372840000122
在方案1中所示的实施方式中，所选氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸(R＝–CH3,H,–CH(CH3)CH2CH3, –CH2CH(CH3)2,–(CH2)2SCH3,–CH2Ph-,–CH(OH)CH3,–CH2–C＝CH–NH–Ph,–CH2–Ph–OH, 或–CH(CH3)2)，其与C1-C20二醇反应，但本发明不限于此。在各种实施方式中，所选氨基酸可与具有2-60个碳原子的直链或支链多元醇反应。在各种实施方式中，多元醇可以是二醇、三醇或四醇。以上方案1中所示的多元醇是具有2-20个碳原子的二醇。在这些实施方式中的一些中，多元醇是具有2至17个碳原子的二醇；在其他实施方式中，多元醇是具有2至13个碳原子的二醇；在其他实施方式中，多元醇是具有2至10个碳原子的二醇；在其他实施方式中，多元醇是具有10至20个碳原子的二醇。合适的多元醇可包括但不限于1,6-己二醇、1,8-辛二醇、1,9-壬二醇、1,10-癸二醇、1,11-十一烷二醇、1,12- 十二烷二醇、1,13-十三烷二醇、1,14-十四烷二醇、1,15-十五烷二醇、1,16-十六烷二醇、 1,17-十七烷二醇、1,18-十八烷二醇、1,19-十九烷二醇、1,20-二十烷二醇、2-丁烯-1,4-二醇、3,4-二羟基-1-丁烯、7-辛烯-1,2-二醇、3-己烯-1,6-二醇、1,4-丁炔二醇、三羟甲基丙烷烯丙基醚、3-烯丙氧基-1,2-丙二醇、2,4-己二炔-1,6-二醇、2-羟甲基-1,3-丙二醇、1,1,1- 三(羟甲基)丙烷、1,1,1-三(羟甲基)乙烷、季戊四醇、二(三羟甲基丙烷)二季戊四醇及其组合。在实施方式中，多元醇可以是1,6-己二醇，并且可以从Sigma Aldrich Company LLC (St.Louis,Missouri)或Alfa Aesar(Ward Hill,Massachusetts)商购获得。
多元醇与氨基酸反应以产生这些氨基酸系聚酯单体可以通过本领域技术人员通常已知的许多方式实现。通常，涉及酸相对于羟基略微摩尔过量(～2.1当量)的在超过水的沸点的温度下的缩合反应足以使得反应能够进行。
在方案1中所示的反应中，将氨基酸起始材料和多元醇溶解在含有合适的酸的合适溶剂中并加热至110℃至约114℃的温度并回流约20小时至约48小时，以形成具有两个或多个氨基酸残基的单体的盐，所述氨基酸残基被约2至约60个碳原子隔开，这取决于所用的多元醇。本领域普通技术人员能够选择合适的酸而无需过度的实验。在一些实施方式中，所用的酸可以是对甲苯磺酸一水合物。本领域普通技术人员还能够选择合适的溶剂而无需过度的实验。合适的溶剂包括但不限于甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺(DMF)或其组合。在一些实施方式中，所用的溶剂是甲苯。
对于本领域技术人员而言明显的是，应采取措施保护单体中间体上的胺基以防止转酰胺作用。在方案1的反应中，甲苯磺酸(pTSA)的存在对于使氨基酸上的胺质子化以及确保在较高转化率下不发生转酰胺反应是必要的。然而，本发明不限于方案1中所示的方法，并且本领域普通技术人员能够选择合适的反离子来防止转酰胺作用而无需过度的实验。能够产生合适的保护性反离子的物质可包括但不限于对甲苯磺酸一水合物、氯化物、溴化物、乙酸盐、三氟乙酸盐或其组合。
在一些实施方式中，方案1中所示的反应的粗产物可以使用本领域已知的用于该目的的任何方法进行纯化。在一些实施方式中，通过下述方法来纯化粗产物：首先真空过滤粗产物以除去残留溶剂，并将其在活性炭中脱色以除去任何残留的盐或未反应的单体。然后将其从沸水或1:1的水和醇的混合物中重结晶1至10次，以产生纯化的产物。
如上所述，形成本发明的磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂的氨基酸基PEU 聚合物和/或共聚物还包含磷酸化的氨基酸系聚酯单体的残基。这些单体的整体结构与上述氨基酸系聚酯单体的整体结构相似，但替代(或除了)含有丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸氨基酸分子，磷酸化的氨基酸系聚酯单体含有一个或多个已用保护的磷酸基团官能化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸分子。
在一个或多个实施方式中，这些磷酸化的氨基酸系聚酯单体可具有式：
Figure GDA0002784372840000141
其中a是约1至约60的整数，如上所述。与上述非磷酸化的氨基酸基单体一样，应采取措施保护单体上的胺基以防止转酰胺作用。再次，本领域普通技术人员能够选择合适的反离子来防止转酰胺作用而无需过度的实验。能够产生合适的保护性反离子的物质可包括但不限于对甲苯磺酸一水合物、氯化物、溴化物、乙酸盐、三氟乙酸盐或其组合。
此外，应采取措施保护磷酸基团上的OH基团，以防止这些OH基团上的副反应。本领域普通技术人员知道如何连接保护基团来防止这些副反应。在一些实施方式中，如式I中所示，苯基被用作保护基，但本发明不限于此，可以使用其他合适的保护基。
在一个或多个实施方式中，磷酸化的氨基酸系聚酯单体可以通过受保护的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸分子与上文关于非磷酸化的氨基酸系聚酯单体确定的任何多元醇之间的缩合反应形成，然后添加受保护的磷酸基团。在一些实施方式中，磷酸化的氨基酸系聚酯单体可以由Boc和苄基保护的丝氨酸分子与C2-C20二醇形成，如以下方案2中所示。
方案2
Figure GDA0002784372840000151
其中a是1至19的整数。
在方案2中所示的实施方式中，在惰性气氛中，将起始材料(XI)、(XII)和活化剂如4-甲苯磺酸吡啶鎓(DPTS)溶解在合适反应容器中的合适溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、二恶烷)中。然后将溶液冷却至约-20℃至约20℃的温度并加入偶联剂例如N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。该反应产生Boc和苄基保护的丝氨酸基聚酯中间体(XIII)。在方案 2中所示的第二反应中，将该Boc和苄基保护的丝氨酸基聚酯中间体(XIII)溶解在合适的溶剂(例如使用氢化瓶和碳负载钯催化剂质子化的乙醇异丙醇)中以形成双-N-boc(l- 丝氨酸)聚酯中间体(XIV)。在第三反应中，通过下述方法将受保护的磷酸基团添加到双 -N-boc(l-丝氨酸)聚酯中间体(XIV)上：将其溶解在合适的溶剂(例如吡啶)中并使其与二苯基磷酰氯(XV)反应以产生双-N-boc-O-二苯基磷酸基(l-丝氨酸)聚酯中间体(XVI)。最后，将双-N-boc-O-二苯基磷酸基(l-丝氨酸)聚酯中间体(XVI)脱保护并使用酸(例如三氟乙酸或硫酸)质子化以产生相应的磷酸化氨基酸系聚酯单体(I)。
如上所述，使氨基酸系聚酯单体(其中至少一些含有苯基保护的磷酸基团)与形成PEU的化合物反应，以产生本发明的氨基酸基PEU聚合物粘合剂中使用的磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物。在本文中使用时，术语“形成PEU的化合物”是指能够在两个胺基之间放置羧基从而形成脲键的化合物，包括但不限于三光气、双光气或光气。如上所述，双光气(液体)和三光气(固态晶体)被理解为比光气更合适，因为它们通常被认为是光气的更安全的替代物，而光气是有毒气体。氨基酸系聚酯单体与三光气、双光气或光气反应以产生氨基酸基PEU聚合物或共聚物也可以通过本领域技术人员通常已知的许多方式实现。
在一些实施方式中，本发明的氨基酸基PEU聚合物粘合剂中使用的磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物可以从磷酸化的氨基酸系聚酯单体和非磷酸化的氨基酸系聚酯单体形成，如以下方案3中所示。
方案3
Figure GDA0002784372840000161
其中R＝–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、– CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH或–CH(CH3)2；R'是二苯基磷酰基；每个a均是1至20的整数；m是约1％至约20％的摩尔百分比；n是约80％至约99％的摩尔百分比。
在各种实施方式中，受保护的聚酯单体(I，II)以磷酸化的氨基酸系聚酯单体(II)与非磷酸化的氨基酸系聚酯单体(I)的摩尔比为约1:99至约1:5组合；在其他实施方式中，所述摩尔比为约1:80至约1:70；在其他实施方式中，所述摩尔比为约1:60至约1:50；在其他实施方式中，所述摩尔比为约1:40至约1:30；在其他实施方式中，所述摩尔比为约1:20至约1:15；在其他实施方式中，所述摩尔比为约1:10至约1:8。
在方案3的步骤(a)中，使用界面聚合方法使受保护的聚酯单体(I，II)聚合，以形成具有二苯基磷酰基侧基的氨基酸基PEU共聚物(XVIII)。在本文中使用时，界面聚合是指在两种不混溶流体的界面边界处或附近发生的聚合。在这些实施方式中，将受保护的聚酯单体(I，II)以期望的摩尔比与第一部分合适的有机水溶性碱(例如三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾)组合并使用机械搅拌和温水浴(约35℃)使其溶解在水中。在一个或多个这些实施方式中，然后将反应冷却至约-10℃至约2℃的温度，将另外一部分有机水溶性碱(例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾)溶解在水中，然后加入反应混合物中。可以通过本领域已知的用于该目的的任何方法冷却反应，包括但不限于冰浴、水浴或再循环冷却器。
接下来，将第一部分形成PEU的化合物(例如三光气(XVII)、双光气或光气)溶解在合适的溶剂(例如蒸馏的氯仿或二氯甲烷)中，然后加入反应混合物中。在方案3 的步骤(a)中，形成PEU的化合物是双光气。本领域普通技术人员能够为形成PEU的化合物选择合适的溶剂而无需过度的实验。在约2分钟至约60分钟的时间段后，将第二部分形成PEU的化合物(例如三光气、双光气或光气)溶解在合适的溶剂(例如蒸馏的氯仿或二氯甲烷)中，并经约0.5小时至约6小时的时间逐滴加入反应混合物中，以产生含有非磷酸化PEU链段和具有二苯基磷酰基侧基的链段的粗制PEU共聚物。方案3的步骤(a)的粗产物可以使用本领域已知的用于该目的的任何方法纯化。在一些实施方式中，方案3的步骤(a)的粗产物可以通过如下来纯化：将其转移到分液漏斗中并使其在沸水中沉淀。
在方案3的步骤(b)中，通过在金属催化剂(例如PtO2)的存在下氢解而使具有二苯基磷酰基侧基的氨基酸基PEU共聚物(XVIII)上的二苯基保护基团脱保护，以形成本发明的氨基酸基PEU聚合物粘合剂中使用的磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物(V)。在方案3的步骤(b)所示的反应中，将具有二苯基磷酰基侧基的氨基酸基PEU 共聚物(XVIII)溶解在合适的溶剂例如二氯甲烷和三氟乙酸(TFA)/乙酸(AcOH)中。然后在H2(60psi)存在下将金属催化剂(例如PtO2)加入氢化弹反应器中的聚合物溶液中以形成本发明的氨基酸基PEU聚合物粘合剂中使用的磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物(V)。方案3的步骤(b)的粗产物可以使用本领域已知的用于该目的的任何方法纯化。在一些实施方式中，方案3的步骤(b)的粗产物可以通过如下来纯化：将其转移到分液漏斗中并使其在沸水中沉淀(一般地，参见实施例7-12)。
为了形成本发明的氨基酸基PEU聚合物粘合剂，上述磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物必须在施加到待粘结的表面之前不久与交联剂组合。如上所述，合适的交联剂包括含有二价金属离子的溶液。(参见图1)。合适的二价金属可包括但不限于钙、镁、锶、钡、锌及其组合。在各种实施方式中，交联剂可包括含有钙或镁二价离子的溶液。
在各种实施方式中，磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)聚合物和/或共聚物与交联剂中的二价金属离子的摩尔比为约1:1至约10:1。在一些实施方式中，磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)聚合物或共聚物与交联剂中的二价金属离子的摩尔比为约2:1至约10:1；在其他实施方式中，为约4:1至约10:1；在其他实施方式中，为约6:1至约10:1；在其他实施方式中，为约1:1至约8:1；在其他实施方式中，为约1:1至约6:1；在其他实施方式中，为约1:1至约4:1；在其他实施方式中，为约2:1至约8:1；在其他实施方式中，为约 3:1至约7:1。
在第三方面，本发明涉及使用上述磷酸基官能化的氨基酸系聚(酯脲)粘合剂将骨与骨或骨与金属粘结的方法。在这些实施方式中，首先使用任何适用的方法清洁并制备骨和/ 或金属表面。接下来，如上所述制备磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和/或共聚物。在要粘结表面之前不久，将一定量的如上所述的交联剂混合到磷酸化的氨基酸基PEU聚合物和 /或共聚物中以开始交联反应。然后将混合物施加到一个或多个待粘结的表面上，随后将表面压在一起并随着聚合物继续交联而保持在适当的位置。当聚合物完全交联时，表面会完全彼此粘附。
实验
合成基于磷酸化的丝氨酸(pSer)和缬氨酸氨基酸的PEU共聚物并表征它们的物理性质。掺入共聚物中的pSer含量为2％和5％。这些聚合物在乙醇中的溶解性使它们更具临床意义，并显示出进一步开发成为骨粘合剂的极大可能性。通过在铝基材上的搭接剪切粘合和在牛骨基材上的端对端粘合，在与Ca2+交联之前和之后研究它们的粘合强度。
方案4代表用于这些实验的聚(pSer-共聚-Val)的合成。聚合物合成的第一步涉及双(L- 缬氨酸)-1,8-辛基二酯(1-Val-8)单体的二对甲苯磺酸盐和二苯基保护的磷酸丝氨酸单体的溶液聚合，以产生聚(丝氨酸二苯基磷酸基-共聚-缬氨酸)(聚(SerDPP-共聚-Val))。第二步涉及聚(SerDPP-共聚-Val)的氢解脱保护以获得磷酸基官能化的共聚物：聚(磷酸丝氨酸- 共聚-缬氨酸)(聚(pSer-共聚-Val))。
方案4
Figure GDA0002784372840000181
在这些实验中，合成具有2％和5％pSer含量的共聚物，分别记为2％聚(pSer-共聚-Val)和5％聚(pSer-共聚-Val)。发现掺入聚合物中的丝氨酸单体的实际量小于通过1HNMR谱学测量的进料量。合理的理由是单体上存在四个大分子的苯基。这倾向于降低丝氨酸单体的反应性，从而导致丝氨酸含量的低掺入。根据5％聚(pSer-共聚-Val)的1H NMR 谱，苯基保护基团在芳族区域δ＝7.06-7.34ppm处显示出峰。通过芳族峰的丢失证实了氢解后这些苯基的成功脱保护。直接连接到受保护的磷酸基团上的亚甲基上的质子环境具有在δ＝4.0ppm周围的共振，其在脱保护后略微向前移动至δ＝4.37ppm(图2A)。从13C NMR谱也证实了保护苯基的移除。在5％聚(pSer-共聚-Val)中脱保护后，5％聚 (SerDPP-共聚-Val)中δ＝～120-130ppm处的芳族峰消失(图3和4)。31P NMR谱也核实了苯基的完全脱保护。5％聚(SerDPP-共聚-Val)在δ＝-11.58ppm处具有特征性磷峰，其在脱保护后移动到δ＝-1.20ppm(图2B)。
衰减全内反射红外光谱法(ATR-IR)显示了二苯基脱保护之前和之后磷酸基团的存在和保持。P-O-H键具有700–500cm-1范围内的特征性IR峰，而P＝O键具有介于1200–1100cm-1之间的特征峰。在约～675cm-1处观察到了聚(SerDPP-共聚-Val)的P-O特征峰，其在脱保护后显示出略微移动至～710cm-1。在脱保护之前和之后P＝O键显示出～1040cm-1处的特征峰。这两个特征性磷酸基伸展峰在1-Val-8聚合物(聚(1-Val-8))中都是不突出的(图5)。2％共聚物的1H NMR谱类似于5％共聚物的1H NMR谱，但积分值不同(图 6和7)。2％共聚物的13C和31P NMR谱还与5％共聚物的13C和31P NMR谱具有相似的δ (ppm)(图8-11)。
对PEU进行表征，以通过热重分析(TGA)确定其物理性质如分解温度(Td)，通过差示扫描量热法(DSC)确定其玻璃化转变温度(Tg)，通过SEC确定其数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和多分散性(DM)。根据已知表面能的5种不同液体的接触角确定这些聚合物的表面能，以通过以下等式29,30计算聚合物表面能的极性分量和分散分量(参见，Stakleff,K.S.；Lin,F.；Smith Callahan,L.A.；Wade,M.B.；Esterle,A.；Miller,J.；Graham, M.；Becker,M.L.,Resorbable,amino acid-based poly(ester urea)s crosslinked withosteogenic growth peptide with enhanced mechanical properties andbioactivity.Acta Biomater 2013,9, (2),5132-42；和Yu,J.Y.；Lin,F.；Lin,P.P.；Gao,Y.H.；Becker,M.L.,Phenylalanine-Based Poly(ester urea):Synthesis,Characterization,and in vitro Degradation.Macromolecules 2014, 47,(1),121-129，其公开内容通过引用整体并入本文)，
Figure GDA0002784372840000191
其中，θLP–聚合物与液体的接触角；γL–液体表面张力；
Figure GDA0002784372840000192
–液体表面张力的分散分量；
Figure GDA0002784372840000193
–液体表面张力的极性分量；
Figure GDA0002784372840000194
–聚合物表面能的极性分量；
Figure GDA0002784372840000195
–聚合物表面能的分散分量。聚合物的总表面能γP(mJ m-2)是由等式1计算的极性分量和分散分量的总和。表1总结了聚合物的物理性质。由于聚合物的粘合性质，未确定聚(pSer-共聚 -Val)的分子质量以防止SEC柱阻塞。PtO2催化剂存在下的氢解反应具有高选择性和位点特异性，因此预期在该反应过程中不会发生聚合物降解。
表1.
聚(酯脲)的物理性质
Figure GDA0002784372840000201
a)通过DSC确定的Tg；b)通过在水中沉淀而纯化后由SEC确定的DM；c)根据聚合物膜上5种不同液体的接触角通过Owens/Wendt方法确定的表面能。
聚(pSer-共聚-Val)显示出比聚(SerDPP-共聚-Val)略低的玻璃化转变温度。受保护的聚合物上存在大分子苯基使链僵硬并阻碍它们的运动，而在脱保护后，链变得更柔性并且自由流动，显示出相应的Tg略微降低(图12)。受保护的聚合物和脱保护的聚合物都具有高于150℃的分解温度(图13)。所有聚合物的分子质量是相当的，这避免了由于分子质量效应导致的粘合强度的偏差。分子质量分布(Dm)略低于聚(SerDPP-共聚-Val)的逐步增长聚合反应的预期，因为在纯化过程中，聚合物经历分馏，从而使Dm变窄。聚合物的总表面能以及它们的极性分量和分散分量列于表2中。
表2.
聚合物的表面能
Figure GDA0002784372840000202
2％聚(pSer-共聚-Val)和5％聚(pSer-共聚-Val)都具有表面能的极性分量和分散分量。极性分量的存在表明表面极性基团在表面粘合中起重要作用。2％和5％聚合物的表面能彼此相当，并且高于聚(1-Val-8)。由于聚合物上官能团的百分比小，因此我们没有看到 2％和5％官能化之间可感知的表面能变化。
铝基材上的搭接剪切粘合试验
搭接剪切粘合是用于确定粘合材料的强度及其失效模式的常用方法(参见实施例14)。在铝粘附体上在室温下在搭接剪切构型下研究聚合物的粘合强度。对与或未与Ca2+交联的2％和5％的聚(pSer-共聚-Val)进行搭接剪切粘合试验。聚(1-Val-8)被用作对照之一以证明磷酸基团在粘合中的重要性。市售PMMA骨接合剂被用作另一对照以与聚(pSer-共聚-Val)比较。搭接剪切粘合试验的结果总结在图14A中。
聚(1-Val-8)的粘合强度为0.04±0.16MPa，PMMA骨接合剂的粘合强度为0.04±0.01 MPa。由于聚(甲基丙烯酸甲酯)不具有粘合性，因此预期骨接合剂的粘合强度低。PMMA骨接合剂具有高模量并且基本上被用作骨和牙齿的填充物。与对照样品相比，聚(pSer- 共聚-Val)显示出改善的粘合强度，这可由磷酸基团和铝表面之间的静电或氢键相互作用而引起。2％和5％聚(pSer-共聚-Val)的粘合强度分别为0.92±0.18Mpa和0.77±0.09MPa 图14A)。以前对切翅泥苞虫丝的研究显示：与Ca2+交联赋予纤维强度，如果去除二价阳离子，则结晶β-片层结构会塌陷，揭示了Ca2+在体系中的重要性。(参见，Addison,J.B.； Ashton,N.N.；Weber,W.S.；Stewart,R.J.；Holland,G.P.；Yarger,J.L.,beta-Sheetnanocrystalline domains formed from phosphorylated serine-rich motifs incaddisfly larval silk: a solid state NMR and XRD study.Biomacromolecules2013,14,(4),1140-8；Addison,J.B.； Weber,W.S.；Mou,Q.；Ashton,N.N.；Stewart,R.J.；Holland,G.P.；Yarger,J.L.,Reversible assembly of beta-sheet nanocrystalswithin caddisfly silk.Biomacromolecules 2014,15,(4), 1269-75，其公开内容通过引用整体并入本文)。我们的假说是：聚合物骨架链上的磷酸基团会与交联剂中的Ca2+相互作用，从而导致物理交联，与它们的未交联的对应物相比，这会改善聚合物本体内的内聚力，进一步增加粘合强度(图1)。粘合强度是体系内的粘合力和内聚力的联合效应的结果。为了检验我们的假说，我们选择碘化钙作为我们体系的Ca2+来源。
与未交联的对应物相比，Ca2+交联的2％和5％聚(pSer-co-Val)均显示出粘合强度增加。交联的2％聚(pSer-共聚-Val)和交联的5％聚(pSer-共聚-Val)的粘合强度分别为1.17± 0.19Mpa和1.14±0.02MPa(图14A)。我们的结果证明了磷酸基官能化聚合物对铝基材的强亲和力。内聚失效是指失效后粘合剂粘到两个粘附体上。如果失效后粘合剂与一个粘附体完全地分离并粘到另一个粘附体上，则称为粘合失效。失效模式对于决定粘合剂的商业潜力是重要的。对于大多数粘合剂，期望内聚失效。有趣的是，除粘合失效的骨接合剂之外，所有样品都展示出内聚失效(图14B-图14G)。考虑到骨接合剂本质上不是粘合剂而只是用作骨的支撑介质这一事实，该结果并不令人惊讶。对金属的粘合研究的结果暗示：即使在聚合物骨架上掺入低百分比的磷酸基团也显示出对金属基材的粘合强度的显著改善。而且，磷酸基团与二价阳离子的交联通过静电相互作用进一步提高了粘合强度。
牛骨上的端对端粘合试验
还检测了聚(pSer-共聚-Val)对牛骨样品的粘合强度，以证明其作为骨粘合剂的潜在应用(参见实施例15)。骨表面上具有大量正电荷和负电荷。骨的基本结构单元是化学结构为Ca5(PO4)3(OH)的羟基磷灰石。图15A总结了聚合物对牛骨的粘合强度。该研究的对照与金属基材的对照相同。聚(1-Val-8)对骨表面完全没有粘合力。在进行试验之前，所有样品都失效了。与聚(1-Val-8)对照相比，聚(pSer-共聚-Val)显示出增加的粘合强度。2％聚(pSer-共聚-Val)显示出190±70KPa的粘合强度，5％聚(pSer-共聚-Val)显示出399±101KPa的粘合强度。
添加0.3当量Ca2+作为交联剂后，观察到了粘合强度增加。交联的2％聚(pSer-共聚-Val)的粘合强度增加至211±77KPa，而交联的5％聚(pSer-共聚-Val)的粘合强度增加至439±203KPa。与对照聚合物的粘合强度增加相比，磷酸基官能化聚合物的粘合强度增加证明了磷酸基团存在的重要性。还值得注意的是，掺入低百分比的磷酸基官能团会带来明显的粘合变化。5％聚(pSer-共聚-Val)的粘合强度与市售骨接合剂的粘合强度(530±133KPa)相当，这揭示：聚(pSer-共聚-Val)具有进一步开发成为骨粘合剂的极大潜力。除了骨接合剂显示出粘合失效之外，所有样品均显示出内聚失效。
体外细胞活力和扩散检定
对于每个样品使用至少40个图像来计算MC3T3细胞的细胞活力，并将其归一化到2％聚(pSer-共聚-Val)(参见实施例16和17)。细胞对玻璃、聚(1-Val-8)、2％和5％聚(pSer- 共聚-Val)、2％和5％交联的聚(pSer-共聚-Val)上的活力分别为(84±9)％、(94±8)％、(100 ±3)％、(97±5)％、(97±7)％和(98±4)％(参见图16)。在玻璃上的细胞活力低可归因于处理和接种错误。对官能化聚合物的高细胞活力(>95％)证明磷酸基官能团对细胞无毒性。MC3T3细胞对所有样品的细胞骨架结构或扩散性能相似。将细胞核染成蓝色(DAPI)，将细胞的焦点粘连点染成绿色(Alexa Fluor 488)，将细胞的肌动蛋白丝染成红色(罗丹明鬼笔环肽)。所有样品上的细胞的纵横比非常接近(～2-3)，这证明官能化聚合物的性能与对照的性能相似(图17)。
设计并制造磷酸基官能化的PEU共聚物以模拟切翅泥苞虫粘性丝的性质。这些共聚物可溶于乙醇，从而提供了合适的递送机制并使其适用于医学应用。在与Ca2+交联后，共聚物在金属基材上显示出1.17±0.19MPa的最大粘合强度。共聚物对骨样品的粘合强度是显著的(439±203KPa)并且与市售聚(甲基丙烯酸甲酯)骨接合剂的粘合强度(530±133KPa)相当。与缬氨酸聚合物类似物相比，磷酸基官能化共聚物显示出改善的且显著的粘合强度，从而证明磷酸基团在促进粘合方面起关键作用。在所有情况下，共聚物都显示出内聚失效。磷酸基官能化共聚物在生长肽(如OGP或BMP-2)存在的情况下具有作为用于脊髓损伤和矫形修复的支架材料、矫形粘合剂的极大潜能。PEU在体外和体内均可降解。
实施例
提供以下实施例是为了更充分地阐释本发明，但不应将其解释为限制本发明的范围。此外，虽然一些实施例可包括关于本发明可以起作用的方式的总结，但是发明人不旨在受这些总结的约束，而是仅将它们作为可能的解释来提出。此外，除非已有用途明确指出，否则实例的展示并不意味着是否进行了实验或过程，或是否实际获得了结果。虽然已经尽力确保所使用的数字(例如，量、温度)的准确性，但仍然可能存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
材料和方法
L-缬氨酸、对甲苯磺酸一水合物、甲苯、1,8-辛二醇、无水二氯甲烷(DCM)、Pd/C、PtO2、乙醇、二苯基磷酰氯(99％)、无水吡啶、4M HCl/二恶烷溶液、氯仿、三甲胺和乙酸购自Sigma Aldrich。N-Boc-O-Bzl-l-丝氨酸购自Ark Pharm,Inc.。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)购自Oakwood Chemicals。三光气购自TCI America。根据文献过程合成4-(二甲基氨基)吡啶鎓4-甲苯磺酸酯(DPTS)。使用前，将氯仿经CaH2干燥过夜，蒸馏并储存在暗处。除非另有说明，否则所有化学品均按原样使用。
在Varian NMR分光光度计上记录单体和聚合物的1H、13C和31P NMR谱(分别为300MHz和500MHz)。化学位移(δ)以ppm报告并参考残余溶剂共振(1H NMR,DMSO-d6: δ＝2.50ppm和13C NMR,DMSO-d6:δ＝39.50ppm)。多重性的缩写被表示为s-单重态、 d-双重态、m-多重态、q-四重态、dd-双重双重态、td-三重双重态。在配备有石英晶体窗口的ShimadzuMiracle 10ATR-FTIR上记录聚合物的衰减全内反射红外(ATR-IR)谱。使用足以覆盖晶体窗口的小块聚合物进行测量。在配备有ESI源的Bruker HCTultra II四极离子阱(QIT)质谱仪(Billerica，MA)上记录单体的电喷射离子化质谱(ESI-MS)。在50℃下，在配备有折射率检测器的TOSOH ECOSEC HLC-8320GPC上通过尺寸排阻色谱法测定聚合物的分子量和PDI(DM)，其中使用DMF(0.1M LiBr盐溶液)作为洗脱剂，流速为0.5mL/min。通过差示扫描量热法(DSC，TA Q200)测定聚合物的玻璃化转变温度(Tg)，其中扫描速率为10℃/min，从-50℃至60℃进行5个循环。使用热重分析 (TGA，TAQ500)以10℃/min的加热速率从25℃至600℃测定聚合物的分解温度(Td)。
实施例1
合成双(l-缬氨酸)-1,8-辛基二酯的二对甲苯磺酸盐(M1)
在配备有迪安斯塔克分水器(dean stark trap)、冷凝器和磁力搅拌棒的含有甲苯的500 ml圆底烧瓶中称量L-缬氨酸(27.5gm,0.234mol)、1,8-辛二醇(15gm,0.102mol)、对甲苯磺酸一水合物(46.57gm,0.190mol)。在搅拌条件下，将溶液加热回流48小时。将产物冷却至环境温度后，将其溶解在热水中并与炭黑一起搅拌以除去任何有色杂质。对单体进一步进行3次在水中的重结晶，得到了40gm(产率＝65％)白色粉末，为纯产物。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,δ):0.95(dd,J＝6.96Hz,10.48Hz,12H；CH3),1.21(d,J ＝45.71Hz,8H；CH2),1.54(m,4H,CH2),2.02-2.20(m,2H,CH),2.31(d,J＝19.91Hz,6H； CH3),3.90(d,J＝4.56Hz,2H；CH),3.98-4.40(m,J＝6.53Hz,10.83Hz,17.18Hz,4H；CH2),7.29(dd,J＝7.97Hz,110.42Hz,4H；CH),8.23(br s,6H,NH)。参见图18。
实施例2
合成双-N-boc-O-苄基(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯(M2)
在N2中，将N-boc-O-苄基-1-丝氨酸(15gm,50.79mmol)、1,8-辛二醇(3.09gm,21.16 mmol)和DPTS(1.06gm,4.23mmol)溶解在30ml无水DCM中。然后将反应烧瓶浸入冰浴中，在0℃下，在N2中，将DIC(7.62ml,48.67mmol)快速注入烧瓶中。使反应在惰性气氛中搅拌过夜，同时将温度逐渐升至室温。将反应溶液过滤以除去脲晶体并真空浓缩。将油状产物溶解在CHCl3中，用5％HCl溶液洗涤两次，用去离子水洗涤一次，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过使用己烷/乙酸乙酯(2.65/1，v/v)作为洗脱剂的硅胶柱色谱法，得到了浅黄色油状物(13.38gm，产率＝89％)。1H NMR(300MHz, DMSO-d6,δ):1.20(s,4H,CH2),1.37(s,22H,CH3),1.50(m,4H,CH2),3.53-3.77(m,4H, CH2),3.85-4.13(m,4H,CH2),4.24(dd,J＝5.55Hz,12.80Hz,2H；CH),4.46(s,4H,CH2), 7.09(d,J＝7.92Hz,2H；CH),7.19-7.40(m,12H,Ar H)。参见图19。
实施例3
合成双-N-boc(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯(M3)
将M2(11gm,15.69mmol)溶解在氢化瓶中的30ml乙醇中。将1.3gm Pd/C催化剂加入聚合物溶液中，并在60psi H2压力下进行氢解，同时略微加热(～35℃)48小时。将溶液以5000rpm离心30分钟。将上清液过滤，浓缩并真空干燥，得到了无色油状物作为产物(8.5gm，产率＝77％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,δ):1.20(s,4H,CH2),1.37 (s,22H,CH3),1.53(m,4H,CH2),3.65(t,J＝5.44Hz,4；CH2),3.8-4.19(m,4H,CH2),6.91 (d,J＝8.02Hz,2H；CH)。参见图19。
实施例4
合成双-N-boc-O-二苯基磷酸基(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯(M4)
在氮气中，将M3(9gm,3.40mmol)溶解在约15ml吡啶中，并浸入冰浴中15分钟。在氮气中，将二苯基磷酰氯(10.21gm,8ml,6.72mmol)缓慢加入反应溶液中。将反应搅拌过夜，同时将反应温度逐渐升至室温。向反应烧瓶中加入约30ml CHCl3以溶解产物。将溶液用100ml去离子水洗涤一次，然后用100ml 1M HCl洗涤，最后用2× 100ml去离子水洗涤。将有机相经无水Na2SO4干燥，并进一步真空干燥，直至获得淡黄色固体产物。随后将黄色固体在异丙醇中重结晶3次，得到了白色粉末，为纯产物(8.8 gm，产率＝52％)。1H NMR(300MHz；DMSO-d6,δ):1.17(s,4H,CH2),1.35(s,22H,CH3), 1.47(m,4H,CH2),3.99(t,J＝6.36Hz,6H；CH2),4.42(d,J＝6.11Hz,4H；CH2),7.23(dd,J ＝7.61Hz,15Hz,8H；Ar H),7.4(t,J＝7.85Hz,12H；Ar H)。参见图19。
实施例5
合成双-O-二苯基磷酸基(l-丝氨酸)-1,8-辛基二酯的二盐酸盐(M5)
将4M HCl/二恶烷溶液(40ml)加入M4(8.8gm)中并在氮气中搅拌过夜。将溶液浓缩并冷冻干燥以除去溶剂。将冷冻干燥后得到的浅黄色固体用乙酸乙酯洗涤并干燥，得到了浅黄色粉末，为纯产物(8.8gm，产率＝100％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,δ): 1.16(t,J＝7.05Hz,4H；CH2),1.43(m,4H,CH2),4.02(t,J＝6.20Hz,4H；CH2),4.68(s,6H, CH2),7.24(dd,J＝7.94Hz,15.66Hz,8H,Ar H),7.41(t,J＝7.29Hz,12H；Ar H),8.96(br s, 6H,NH)。参见图19和20。ESI-MS(m/z)：理论值：784.74；计算值：[M+H]+＝785.2。参见图21。
实施例6
合成1,8-辛二醇-1-缬氨酸聚(酯脲)(聚(1-Val-8))：
通过下述方式进行溶液聚合：在配备有磁力搅拌棒和均压加料漏斗的500mL三颈圆底烧瓶中将双(L-缬氨酸)-1,8-辛基-二酯的二对甲苯磺酸盐(M1)(13.74g,20mmol,1当量)和三乙胺(12.55ml,90mmol,4.5当量)溶解在40mL氯仿中。然后将三光气(2.37 g,8mmol,0.4当量)溶解在15mL新蒸馏的氯仿中，并在室温下在氮气中逐滴加入。反应持续12小时，然后将溶解在15mL氯仿中的另外份的三光气(0.45g,1.5mmol,0.08 当量)逐滴加入烧瓶中。将反应搅拌另外8小时。通过在热水中沉淀来纯化聚合物，然后真空干燥。1H NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):0.86(m,12H,CH3),1.26(s,8H,CH2),1.54 (s,4H,CH2),1.98(dd,J＝6.69Hz,11.73Hz,2H；CH),3.78-4.21(m,6H,CH2,CH),6.37(d,J ＝8.89Hz,2H；NH).13.9KDa。参见图22。13C NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):19.39(C4), 25.69(C2),28.55(C2),28.97(C2),30.91(C2),58.13(C2),64.52(C2),157.96(NH-C＝O), 172.84(O-C＝O).ATR-IR(ν):1650-1690cm-1(s,C＝O脲伸展),1735-1750cm-1(s,C＝O酯伸展),3300-3500cm-1(m,N-H脲伸展).DM＝3.2,Mn＝4.3KDa,Mw＝13.9KDa。参见图23。
实施例7
合成聚(丝氨酸二苯基磷酸基-共聚-缬氨酸)(聚(SerDPP-共聚-Val))：
通过类似于P(1-Val-8)的溶液聚合来合成共聚物。通常，在N2中，将单体(20mmol,1当量)和三乙胺(90mmol,4.5当量)溶解在配备有磁力搅拌器的500mL三颈圆底烧瓶中的40mL新蒸馏的CHCl3中。将三光气(8mmol,0.4当量)溶解在15mL蒸馏的氯仿中，并在室温下在氮气中逐滴加入烧瓶中。反应持续12小时，然后将另外份的三光气 (1.5mmol,0.075当量，在10mL氯仿中)逐滴加入烧瓶中。继续反应另外8小时，然后将反应溶液转移到分液漏斗中并在热水中逐滴沉淀。在水冷却至环境温度后，将聚合物在室温下在水中洗涤过夜，最后真空干燥，得到了白色聚合物作为产物。
实施例8
合成5％聚(SerDPP-共聚-Val)
理论单体进料比-pSer/Val(M5/M1)＝15/85:1H NMR(500MHz,DMSO-d6,δ)：实际单体比＝5/95,δ＝0.85(dd,J＝6.76Hz,13.63Hz,195H；CH3),1.26(d,J＝11.12Hz,154H；CH2),1.54(m,72H,CH2),1.98(dd,J＝6.56Hz,12.58Hz,31H；CH),3.93-4.14(m,137H, CH2,CH),6.37(d,J＝8.91Hz,38H；NH),7.06-7.18(m,26H,Ar H),7.19-7.34(m,12H,Ar H). 13C NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):19.4(C4),25.69(C4),28.55(C4),30.90(C2),58.15(C4), 64.53(C4),120.34(Ar C),123.08(Ar C),129.31(Ar C),157.97(NH-C＝O),172.85(O-C＝O)。参见图24。31P NMR(500MHz,DMSO-d6,85％H3PO4外参考,δ):11.58ppm.ATR-IR(ν): 1650-1690cm-1(s,C＝O脲伸展),1735-1750cm-1(s,C＝O酯伸展),3300-3500cm-1(m,N-H 脲伸展),～1040cm-1(w,P＝O伸展),～675cm-1(w,P-O伸展).DM＝1.4,Mn＝7.7KDa,Mw＝ 10.5KDa。参见图25。
实施例9
合成2％聚(SerDPP-共聚-Val)
理论单体进料比-pSer/Val(M5/M1)＝10/90：1H NMR谱共振类似于具有不同积分值的5％P(SerDPP-共聚-Val)。参见图6、图24。实际单体比＝2/98。13C和31P NMR谱以及ATR-IR谱对应于5％聚(SerDPP-共聚-Val)的那些。DM＝1.4,Mn＝6.5KDa,Mw＝9.3 KDa。参见图3、图6、图8和图24。
实施例10
合成聚(磷酸丝氨酸-共聚-缬氨酸)(聚(pSer-共聚-Val))：
在PtO2催化剂存在下，通过氢解使二苯基保护基脱保护，以合成磷酸基官能化共聚物作为切翅泥苞虫丝的模拟物。通常，将聚(SerDPP-共聚-Val)(1.00g)溶解在50mLCHCl3: 40％TFA/AcOH(4:1)溶液中。将作为催化剂的PtO2(1.1当量SerDPP)加入氢化弹反应器中的聚合物溶液中，并在室温下在H2(60psi)存在下进行反应2小时。将溶液过滤并真空浓缩。在热水中沉淀后，获得了作为白色固体的纯聚合物，并真空干燥。
实施例11
5％聚(pSer-共聚-Val)：
0.9g，产率＝90％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):0.85(dd,J＝6.76Hz,13.61Hz,194H；CH3),1.26(s,155H,CH2),1.54(m,72H,CH2),1.98(td,J＝6.72Hz,13.39Hz,35H； CH),3.87-4.18(m,102H,CH2,CH),4.37(t,J＝6.48Hz,2H；CH2),6.37(d,J＝8.91Hz,26H, NH).13C NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):19.4(C4),25.69(C4),28.55(C4),30.90(C2),58.15 (C4),64.53(C4),157.97(NH-C＝O),172.85(O-C＝O)。参见图26。31P NMR(500MHz, DMSO-d6,85％H3PO4外参考,δ):-1.20ppm。参见图27。ATR-IR(ν):1650-1690cm-1(s, C＝O脲伸展),1735-1750cm-1(s,C＝O酯伸展),3300-3500cm-1(m,N-H脲伸展),～1040cm-1 (w,P＝O伸展),～710cm-1(w,P-O伸展)。参见图5。
实施例12
2％聚(pSer-共聚-Val)：
1g，产率＝100％。1H NMR谱共振类似于具有不同积分值的5％聚(pSer-共聚-Val)。13C和31P NMR谱以及ATR-IR谱对应于5％聚(pSer-共聚-Val)的那些。参见图4、图7、图9和图26。
实施例13
表面能测量
测量五种不同液体的接触角，以使用Owens/Wendt方法计算每种聚合物各自的表面能。使用已知表面张力的液体(水、甘油、乙二醇、丙二醇和甲酰胺)进行接触角测量。30使用聚合物在乙醇中的1％(w/v)溶液以2000rpm将聚合物薄膜旋涂在经臭氧处理的硅片上，进行1分钟。将样品在70℃下真空干燥过夜。对于每个样品，在室温下进行测量(n＝3)，并由独立测量计算平均值的标准偏差。结果报告在上面的表1和表2中。
实施例14
铝基材上的搭接剪切粘合试验
根据ASTM D1002标准在铝基材上进行搭接剪切粘合试验。将厚度为1.6mm的铝粘附体切割成75mm长×12.5mm宽的矩形基材，其中在每个粘附体中距离一端12.5mm 钻直径为6.5mm的孔。对于粘合试验，将聚合物在乙醇中的溶液(30μL,300mg在1mL 乙醇中)施加到粘附体的一端。将另一个粘附体以搭接剪切构型置于其上，交叠面积为 1.56cm2。使用交联剂时，将聚合物溶液(25μL,300mg在1mL乙醇中)和交联剂溶液 (5μL,每个pSer基团0.3当量，在1mL丙酮中)混合并施加到粘附体的一端。将粘附体压在一起并在室温下固化1小时，在75℃下固化24小时，在室温下固化1小时，然后进行试验。使用具有1000N负荷传感器的Instron 5567仪器进行搭接剪切粘合。以1.3 mm/min的速度将粘附体拉开直至发生失效。通过将失效时的最大负荷(N)除以粘合面积(m2)来得到粘合强度(Pa)。结果报告于图14A-图14G中。
实施例15
牛骨基材上的端对端粘合试验
为了研究聚(pSer-共聚-Val)的粘合特性，我们在皮层牛骨上进行了端对端粘合实验。牛骨样品获自当地的杂货店。在骨锯上将骨切成～2cm长×0.6cm宽×0.4cm厚的矩形块。随后，使用320粒度(grit)砂纸(3M Pro Grade Precision，X-fine)对骨样品的检测端进行砂磨，并且在施加粘合剂之前将骨保持在PBS溶液中1小时。将聚合物溶液(30 μL,300mg在1mL乙醇中)施加在骨的一端，并将第二骨端对端放置在其上。对于交联样本，将聚合物溶液(25μL,300mg在1mL乙醇中)和交联剂溶液(5μL,每个pSer 基团0.3当量，在1mL丙酮中)施加到一个骨上，并将第二个骨以端对端构型放置。将骨样品夹在一起并包在浸透PBS的纱布中24小时。然后将样品置于37℃、95％湿度和 5％CO2的培养箱中2小时，然后进行粘合试验。在配备有5kg负荷传感器的质构分析仪 (TA.XT.Plus)上进行粘合试验。以1.3mm/min的速度将骨样品拉开直至发生失效。通过将失效时的最大负荷(N)除以粘合面积(m2)来得到粘合强度(Pa)。结果报告于图15A-图15C中。
实施例16
体外细胞活力研究
分别在接种后的第1天和第3天，在磷酸基官能化聚合物上研究MC3T3细胞的细胞活力和扩散。将聚合物膜从在乙醇中的3％(w/v)溶液以2000rpm旋涂在12mm玻璃玻片上，进行1分钟。将膜在80℃下真空干燥过夜，并小心地转移到12孔板中。将细胞用 PBS冲洗，然后在37℃、95％湿度、5％CO2的条件下用1mL 0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液分离5分钟。通过加入5mL培养基使胰蛋白酶/EDTA溶液失活，并通过在4℃、3000rpm 下离心1分钟来收集细胞。在不扰动细胞团块的情况下吸出培养基/胰蛋白酶溶液，并将细胞重悬于5mL新鲜培养基中。利用台盼蓝染色，使用血细胞计数器计数细胞密度。以 6000个细胞/cm2的密度接种细胞。温和地摇动孔板以确保在孵育之前细胞均匀分布在样品上。
通过活/死检定(Life Technologies)评价细胞活力。将约5μL钙黄绿素AM(4mM)和10μL乙啡啶同型二聚体加入10mL DPBS中以制备染色溶液。从所有样品中吸出培养基并用DPBS冲洗，然后向每个孔中加入0.5mL染色溶液。将孔板用铝箔覆盖，并在37℃下孵育10分钟，然后成像。使用CellSENS软件在配备有Hamamatsu orca R2CCD相机、 FITC和TRITC滤光片的Olympus荧光显微镜上以4X放大率拍摄图像。染成绿色的细胞被认为是活的，染成红色的细胞被认为是死的。使用细胞计数器插件在ImageJ软件中对细胞计数。结果报告在图16中。
实施例17
细胞扩散检定
对于扩散研究，将细胞在1mL培养基和1mL在CS缓冲溶液中的3.7％多聚甲醛(PFA)中于37℃下在干块(dry block)上预固定5分钟。抽吸后，将细胞在2mL在 CS缓冲液中的3.7％PFA溶液中于37℃下固定5分钟。然后用2mL CS缓冲液冲洗样品 3次，接着于37℃下在每个孔中加入1.5mL在CS缓冲液中的Triton X-100(0.5％v/v)，以使细胞透化10分钟。用CS缓冲液冲洗样品3次。然后向每个孔中加入2mL新制备的在CS缓冲液中的0.1wt％NaBH4，在室温下持续10分钟，以淬灭醛荧光，随后抽吸并在室温下在5％驴血清中孵育20分钟以阻断非特异性结合。抽吸后，将样品于4℃下在 300μL在CS缓冲液中的小鼠黏着斑蛋白一抗(v/v＝1:200)中孵育过夜。然后将样品用 1％驴血清冲洗3次，并用50μL罗丹明鬼笔环肽(v/v＝1:40)和小鼠Alexa Fluor 488二抗(v/v＝1:200)溶液于暗处在室温下在蜡纸上染色1小时。用CS缓冲液洗涤样品3次后，使用在CS缓冲液中的DAPI(6μL/10mL)于暗处在室温下对细胞核染色20分钟。将样品用CS缓冲液冲洗3次以除去过量的染色，并在配备有带有FITC、TRITC和DAPI 滤光片的Hamamatsu orca R2CCD相机的Olympus荧光显微镜下以20X放大率观察。结果报告在图17中。
根据前述内容，应当理解，本发明通过提供在结构上和功能上以多种方式得到改善的新颖的可降解且可吸收的磷酸化聚(酯-脲)(PEU)基粘合剂(及其制备和使用其相关方法)而使本领域显著先进。虽然本文已经详细公开了本发明的特定实施方式，但是应该理解，本发明不限于此，或者由此本领域的普通技术人员将容易理解本发明的变型。应当根据所附权利要求理解本发明的范围。

Claims (20)

1.一种聚(酯脲)(PEU)系粘合剂，所述粘合剂包含：
PEU聚合物骨架，所述PEU聚合物骨架具有一个或多个包含磷酸基团的侧链，其中所述磷酸基团通过至少一个碳原子与所述一个或多个侧链共价键合；和
包含二价金属盐的交联剂。
2.根据权利要求1所述的PEU系粘合剂，其中所述PEU聚合物骨架包含选自由以下所组成的组中的氨基酸的残基：丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly-G)、异亮氨酸(ile-I)、亮氨酸(leu-L)、甲硫氨酸(met-M)、苯丙氨酸(phe-F)、苏氨酸(thr-T)、色氨酸(trp-W)、酪氨酸(tyr-Y)或缬氨酸(val-V)。
3.根据权利要求1所述的PEU系粘合剂，其中所述PEU聚合物骨架包含一个或多个磷酸化L-丝氨酸分子的残基。
4.根据权利要求1所述的PEU系粘合剂，其中所述具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物骨架还包含：
第一氨基酸系聚酯单体的残基，所述第一氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个磷酸化氨基酸；和
第二氨基酸系聚酯单体的残基，所述第二氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个氨基酸。
5.根据权利要求4所述的PEU系粘合剂，其中所述第一氨基酸系聚酯单体包含两个磷酸化的L-丝氨酸分子。
6.根据权利要求4所述的PEU系粘合剂，其中所述第一氨基酸系聚酯单体具有下式：
Figure FDA0003095129780000011
其中a是1至20的整数。
7.根据权利要求4所述的PEU系粘合剂，其中所述第二氨基酸系聚酯单体包含两个选自由以下所组成的组中的氨基酸：丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly-G)、异亮氨酸(ile-I)、亮氨酸(leu-L)、甲硫氨酸(met-M)、苯丙氨酸(phe-F)、苏氨酸(thr-T)、色氨酸(trp-W)、酪氨酸(tyr-Y)或缬氨酸(val-V)。
8.根据权利要求4所述的PEU系粘合剂，其中所述第二氨基酸系聚酯单体包含缬氨酸或异亮氨酸。
9.根据权利要求4所述的PEU系粘合剂，其中所述第二氨基酸系聚酯单体具有下式：
Figure FDA0003095129780000021
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2且a为1至20的整数。
10.根据权利要求1或4所述的PEU系粘合剂，其具有下式：
Figure FDA0003095129780000031
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2；a是1至20的整数；m是1％至20％的摩尔百分比；且n是80％至99％的摩尔百分比。
11.根据权利要求1所述的PEU系粘合剂，其中所述交联剂是选自由钙、镁、锶、钡、锌及其组合所组成的组中的金属的二价盐。
12.根据权利要求1所述的PEU系粘合剂，其中所述交联剂占所述PEU系粘合剂的1摩尔％至20摩尔％。
13.一种制备根据权利要求1所述的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂的方法，所述方法包括：
A.制备具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物，其中所述磷酸基团通过至少一个碳原子与所述一个或多个侧链共价键合；
B.添加包含二价金属盐的交联剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物与所述包含二价金属盐的交联剂的摩尔比为1:1至10:1。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物具有下式：
Figure FDA0003095129780000041
其中R是–CH3、H、–CH(CH3)CH2CH3、–CH2CH(CH3)2、–(CH2)2SCH3、–CH2Ph-、–CH(OH)CH3、–CH2–C＝CH–NH–Ph、–CH2–Ph–OH、–CH(CH3)2；a是1至20的整数；m是1％至20％的摩尔百分比；且n是80％至99％的摩尔百分比。
16.根据权利要求13所述的方法，其中制备PEU聚合物的步骤还包括：
1.制备第一氨基酸系聚酯单体，所述第一氨基酸系聚酯单体包含被1-20个碳原子隔开的两个磷酸化氨基酸；
2.制备第二氨基酸系聚酯单体，所述第二氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个氨基酸；
3.使所述第一氨基酸系聚酯单体和所述第二氨基酸系聚酯单体与光气、双光气或三光气反应，以在所述第一氨基酸系聚酯单体和所述第二氨基酸系聚酯单体之间和当中引入脲键，以形成步骤A的所述PEU聚合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个磷酸化的丝氨酸分子。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二氨基酸系聚酯单体包含被2-20个碳原子隔开的两个氨基酸，所述氨基酸选自由丙氨酸(ala-A)、甘氨酸(gly-G)、异亮氨酸(ile-I)、亮氨酸(leu-L)、甲硫氨酸(met-M)、苯丙氨酸(phe-F)、苏氨酸(thr-T)、色氨酸(trp-W)、酪氨酸(tyr-Y)或缬氨酸(val-V)所组成的组。
19.根据权利要求16或18所述的方法，其中所述第二氨基酸系聚酯单体包含缬氨酸或异亮氨酸分子。
20.一种使用根据权利要求1所述的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂将骨与骨或骨与金属粘结的方法，所述方法包括：
A.制备待连接的第一表面和第二表面；
B.制备具有一个或多个包含磷酸基团的侧链的PEU聚合物，其中所述磷酸基团通过至少一个碳原子与所述一个或多个侧链共价键合；
C.将包含二价金属盐的交联剂混合到步骤B的所述PEU聚合物中以形成根据权利要求1所述的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂；
D.将步骤C的所述PEU聚合物/交联剂混合物施加到所述待连接的第一表面和第二表面中的一个或两个上；
E.将所述待连接的第一表面和第二表面放置成彼此接触；以及
F.使根据权利要求1所述的聚(酯脲)(PEU)系粘合剂交联，从而在所述第一表面和所述第二表面之间形成粘结。
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