JP7006944B2

JP7006944B2 - リン酸化ポリ（エステル－尿素）ベースの分解性骨接着剤

Info

Publication number: JP7006944B2
Application number: JP2018556457A
Authority: JP
Inventors: ベッカー，マシュー; ヴルシャリディンカーバガット，
Original assignee: University of Akron
Current assignee: University of Akron
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2022-02-10
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN109561953B; EP3448307B1; AU2017257659A1; BR112018072006A2; CN109561953A; US11103613B2; US20190167838A1; JP2019520432A; AU2017257659B2; KR20190013781A; KR102419992B1; CA3022412A1; EP3448307A4; EP3448307A1; WO2017189534A1

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月２８日に出願され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６２／３２８，６５３号発明の名称「リン酸化されたポリ（エステル－尿素）ベースの分解性骨接着剤」の利益を主張する。
連邦支援研究に関する声明または開発支援

本発明は、国家科学財団によって授与された契約番号ＤＭＲ－１５０７４２０およびＤＭＲ－１３５９３２１および国防総省医療研究開発プログラムのＣｏｍｂａｔＣａｓｕａｌｔｙＣａｒｅからの契約番号Ｗ８１ＸＷＨ－１５－１－０７１８による政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

本発明の１つまたは複数の実施形態は、分解性および再吸収性の医学的および生物学的接着剤に関する。特定の実施形態では、本発明は、骨接着剤として特に有用な、リン酸化ポリ（エステル－尿素）（ＰＥＵ）をベースとした分解性および再吸収性接着剤に関する。

骨および組織接着剤は、創傷治癒、止血、組織再建および薬物送達における、外科手術内でそれらを補助するために不可欠である。骨外科手術における古典的な構造的選択肢としては、支持体としての金属板、ピンおよびねじの使用が挙げられる。これらの選択肢は、安全かつ使用可能である一方で、ａｓｅｐｔｉｃｌｏｏｓｅｎｉｎｇ（無菌性のゆるみ）、骨への不十分な固定に悩まされ、隣接する軟部組織への刺激を引き起こし、患者に不快感を与え、骨再生後に交換または除去する必要がある。ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）骨セメントもまた、骨外科手術において一般に使用されるが、重大な欠点を有する。特に、ＰＭＭＡ骨セメントは本質的に接着性ではなく、化学的相互作用を有さず、著しい発熱を引き起こす可能性があり、収縮しやすい。シアノアクリレート、ポリウレタン、エポキシ樹脂およびリン酸カルシウムまたはリン酸マグネシウムセラミック骨セメントのような合成グルーを骨接着剤として使用しようとする試みは、骨表面との相互作用の欠如または強度の不足のために奏功していない。分解性および高い接着強度を有する代替的な骨接着剤は、現在、関心のある臨床標的である。

リン酸塩ベースの化合物は、水中コーティング、歯科用途、骨インプラント、フィラーおよび金属基材において、数十年にわたって接着促進剤として使用されている。いくつかの研究では、骨結合の有意な改善を示すリン酸官能基化重合体骨移植片の接着または結合強度および骨伝導能が実証されている。ムラサキイガイ、フジツボ、ヒトデ、サンドキャッスルワーム、トビケラなどの特定の海洋生物は、強い結合特性を有する自身の水中接着剤を合成するように進化している。トビケラ接着性シルクに関する研究では、（ＳＸ）₄モチーフの形態のホスホセリン（ｐＳｅｒ）残基の存在が確認されている（式中、Ｓはセリンであり、Ｘが通常バリンまたはイソロイシンである）。元素分析はまた、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺などの二価陽イオンの存在を示し、これは、ｐＳｅｒ中のリン酸基との強い静電相互作用を受けて、繊維に強度を付与した。トビケラ接着性は、接着フィラメントの著しくリン酸化された領域から生じるものである。

ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）は、代謝成分への分解、調節可能な機械的特性、インビトロおよびインビボでの広範な機能性および無毒性など、それらの魅力的な性質のために、生体材料用途に適したポリマーのクラスである。当業界で必要とされているのは、トビケラ接着性シルクに見られる接着特性およびＰＥＵポリマーに見られる有益な特性を有する、骨に使用するための接着剤である。

様々な態様において、本発明は、分解可能であり、再吸収可能な新規リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤、ならびにその合成および使用のための関連方法を提供する。これらの接着剤は、１種以上の二価金属架橋剤を用いて架橋されたリン酸官能基化ＰＥＵポリマーおよびコポリマーから形成され、トビケラ接着性シルクの特性を模倣するように設計され作製された。本発明の様々な実施形態のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤は、骨または金属のいずれかに骨を結合させるのに特に有効であることが見出されており、骨サンプルにおいて有意（４３９±２０３ＫＰａ）であり、市販のポリ（メチルメタクリレート）骨セメント（５３０±１３３ＫＰａ）と同程度の接着強度を示している。これらのリン酸官能基化ＰＥＵポリマーおよびコポリマーは、ＯＧＰまたはＢＭＰ－２などの成長ペプチドの存在下で、整形外科用接着剤、脊髄損傷のための足場材料および整形外科修復物として有意な潜在力を有し、インビトロおよびインビボで分解可能であると考えられている。

第１の態様では、本発明は、リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマー主鎖と、二価の金属の塩を含む架橋剤と、を含むポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤に関する。いくつかの実施形態では、ＰＥＵポリマー鎖は、アラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択されるアミノ酸の残基を含む。１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、ＰＥＵポリマー鎖が、１つ以上のリン酸化されたＬ－セリン分子の残基を含む、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、ＰＥＵポリマー主鎖が、２～２０個の炭素原子によって分離された２個のリン酸化アミノ酸を含む第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーの残基、および２～２０個の炭素原子によって分離された２個のアミノ酸を含む第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーの残基をさらに含むリン酸基を含む１つ以上の側鎖を有する、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、２個のリン酸化Ｌ－セリン分子を含む、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、次式：

（式中、ａは約１～約２０の整数である）を有する、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、アラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択される２個のアミノ酸を含む、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、バリンまたはイソロイシンを含む、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤は、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、次式：

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～２０の整数である）を有する、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、次式：

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～２０の整数であり、ｍは約１％～約２０％のモル％であり、ｎは、約８０％～約９９％のモル％である）を有する本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、架橋剤が、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される二価の金属の塩である、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。１つ以上の実施形態において、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤は、架橋剤が、ＰＥＵベースの接着剤の約１モル％～約２０モル％である、本発明の第１の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

第２の態様では、本発明は、リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマーを調製することと、二価の金属の塩を含む架橋剤を添加することと、を含む、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマーと二価の金属の塩を含む架橋剤とのモル比は、約１：１～約１０：１である。１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマーが上記の式ＶまたはＶＩを有する、本発明の第２の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、本発明の第２の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられ、ＰＥＵポリマーを調製するステップは、１～２０個の炭素原子によって分離された２個のリン酸化アミノ酸を含む第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーを調製することと、２～２０個の炭素原子によって分離された２個のアミノ酸を含む第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーを調製することと、第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーおよび第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーをホスゲン、ジホスゲンまたはトリホスゲンと反応させて、第１および第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマー間に尿素結合を導入してＰＥＵポリマーを形成することと、をさらに含む。１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、２～２０個の炭素原子によって分離された２個のリン酸化セリン分子を含む、本発明の第２の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、アラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択される２個のアミノ酸を含み、２個のアミノ酸は、２～２０個の炭素原子によって分離されている、本発明の第２の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。１つ以上の実施形態では、本発明のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤としては、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、バリンまたはイソロイシン分子を含む、本発明の第２の態様の上記で言及した実施形態のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。

第３の態様では、本発明は、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を使用して骨を骨に、または骨を金属に結合する方法に関し、本方法は、接合される第１の表面および第２の表面を調製することと、リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマーを調製することと、ＰＥＵポリマーに二価の金属の塩を含む架橋剤を混合して、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を形成することと、ＰＥＵポリマー／架橋剤混合物を、接合する第１および第２の表面の一方または両方に塗布することと、接合する第１の表面および第２の表面を互いに接触させることと、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を架橋させ、これにより第１の表面と第２の表面との間に結合を形成することができることと、を含む。

本発明の特徴および利点のより完全な理解のために、ここで添付図面とともに本発明の詳細な説明を参照する。
ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）のリン酸基

が、骨への接着を促進する骨表面の正電荷とどのように相互作用するかを示す概略図である。ヨウ化カルシウム由来のＣａ²⁺（架橋剤）は、ポリマーのバルク中のリン酸基と相互作用して凝集力を生じさせる。
５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）（上段）および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（下段）の¹ＨＮＭＲスペクトル（図２Ａ）、ならびに５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）（上段）および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（下段）の³¹ＰＮＭＲスペクトルを示すチャートであり、外部標準として８５％Ｈ₃ＰＯ₄を基準とした（図２Ｂ）。挿入図（図２Ａ）は、¹ＨＮＭＲスペクトルのδ＝７．１～７．３ｐｐｍからの倍率を示す。ジフェニル保護基の特徴的なピークは、脱保護後に消失し、δ＝４．０～４．５ｐｐｍである。δ＝約４．３７ｐｐｍのトリプレットは、脱保護リン酸基に付着したメチレン基のプロトン環境の特徴である。これは、脱保護前には顕著ではない（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）。５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹³ＣＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹³ＣＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。Ｐ＝Ｏ（１０４０ｃｍ^-1）に対応するピークを有するポリ（１，８－Ｖａｌ）、ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）およびポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）のＡＴＲ－ＩＲスペクトルを示し、ＰＯストレッチ（７１０～６７５ｃｍ^-1）が強調表示され、ラベル付けされている図である。２％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹ＨＮＭＲスペクトルである。Ｒ基はジフェニル保護ホスフェート基を示す。挿入図は、ジフェニル保護基の芳香族ピークを示す（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）。２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹ＨＮＭＲスペクトルである。Ｒ’は、脱保護されたリン酸基を示す。挿入図（ａ）は、７．０～７．２５ｐｐｍの間での芳香族ピークの消失を示し、ジフェニル基の脱保護が確認される。挿入図（ｂ）は、脱保護されたリン酸基に付着したメチレン基のプロトン環境に対応する４．３６ｐｐｍ付近にトリプレットの存在を示す（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）。２％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹³ＣＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹³ＣＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。２％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の³¹ＰＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の³¹ＰＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。ポリ（１，８－Ｖａｌ）、５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）、２％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、および２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）のガラス転移温度（Ｔ_g）を決定するために使用したＤＳＣ曲線を示すグラフである。リン酸官能基化ポリマーのＴ_gは、ポリマー骨格鎖の官能性が低いため、脱保護後に有意な変化を示すことはない。ポリ（１，８－Ｖａｌ）、５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）、２％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）および２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の分解温度（Ｔ_d）を決定するために使用した熱重量分析曲線を示すグラフである。ジフェニル基の脱保護後、分解温度のわずかな低下が観察される。室温でアルミニウム被着体に対して実施された重ね剪断接着研究の結果を示す。図１４Ａは、Ｖａｌ－ポリ（１－Ｖａｌ－８）、それぞれ、２％および５％ｐＳｅｒ－２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、２％および５％の架橋剤－０．３当量のＣａ²⁺で架橋した架橋剤２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、ならびに市販の骨セメント（ＳｉｍｐｌｅｘＰ）の接着強度を示すグラフである。接着強度は平均１０回（ｎ＝１０）繰り返して計算し、標準誤差と共に記録した。アルミニウム被着体は、すべてのサンプルにおいて接着不良を示している：ポリ（１－Ｖａｌ－８）（図１４Ｂ）、２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｃ）、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｄ）、０．３当量のＣａ²⁺で架橋した２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｅ）、０．３当量のＣａ²⁺で架橋した５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｆ）、およびポリ（メチルメタクリレート）骨セメント（図１４Ｇ）。室温でアルミニウム被着体に対して実施された重ね剪断接着研究の結果を示す。図１４Ａは、Ｖａｌ－ポリ（１－Ｖａｌ－８）、それぞれ、２％および５％ｐＳｅｒ－２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、２％および５％の架橋剤－０．３当量のＣａ²⁺で架橋した架橋剤２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、ならびに市販の骨セメント（ＳｉｍｐｌｅｘＰ）の接着強度を示すグラフである。接着強度は平均１０回（ｎ＝１０）繰り返して計算し、標準誤差と共に記録した。アルミニウム被着体は、すべてのサンプルにおいて接着不良を示している：ポリ（１－Ｖａｌ－８）（図１４Ｂ）、２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｃ）、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｄ）、０．３当量のＣａ²⁺で架橋した２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｅ）、０．３当量のＣａ²⁺で架橋した５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）（図１４Ｆ）、およびポリ（メチルメタクリレート）骨セメント（図１４Ｇ）。室温でのウシ骨の端々接着を測定する比較による接着強度測定に関する図である。図１５Ａは、Ｖａｌ－ポリ（１－Ｖａｌ－８）、それぞれ、２％および５％ｐＳｅｒ－２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、２％および５％の架橋剤－０．３当量のＣａ²⁺で架橋した２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、ならびにセメント－市販のＰＭＭＡ骨セメント（ＳｉｍｐｌｅｘＰ）を用いた室温でのウシ骨に対して行った端々接着試験の結果を示すグラフである（接着強度は３回繰り返しの平均（ｎ＝３）から計算し、標準誤差と共に報告している）。図１５Ｂは、ウシの骨サンプル（左）の端々接着およびテクスチャーアナライザー（右）の端々接着検査設定を示す画像を示す概略図である。図１５Ｃは、０．３当量のＣａ²⁺で架橋した５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の凝集不良を示す画像である。ポリマーでのＭＣ３Ｔ３細胞の標準化された細胞生存率を示すグラフである。異なるポリマーでのアスペクト比の比較を示すグラフである。ＭＣ３Ｔ３細胞は、すべてのサンプルにおいて同様の拡散挙動を示す。ビス（Ｌ－バリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ１）のジ－ｐ－トルエンスルホン酸の塩の¹ＨＮＭＲスペクトルを示す図である（ＤＭＳＯ－ｄ₆，３００ＭＨｚ，３０℃）。（ａ）ビス－Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ベンジル（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ２）、（ｂ）ビス－Ｎ－ｂｏｃ（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ３）、（ｃ）ビス－Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ４）、（ｄ）ビス－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ５）の二塩酸塩のホスホセリンモノマー合成の¹ＨＮＭＲスペクトルの比較を示すグラフである（ＤＭＳＯ－ｄ₆，３００ＭＨｚ，３０℃）。ビス－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ５）の二塩酸塩の¹ＨＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，３００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。ビス－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ５）の二塩酸塩のＥＳＩ－マススペクトルを示す図である。ポリ（１－Ｖａｌ－８）の¹ＨＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。は、ポリ（１－Ｖａｌ－８）の¹³ＣＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，３００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。は、５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹ＨＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。は、５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の³¹ＰＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。は、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹ＨＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。は、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の³¹ＰＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ－ｄ₆，５００ＭＨｚ，３０℃）を示す図である。

様々な態様において、本発明は、強力で、分解可能であり、再吸収可能な新規リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤、ならびにその合成およびその使用のための関連する方法を提供する。上記のように、これらの接着剤は、１種以上の二価の金属架橋剤を用いて架橋されたリン酸官能基化アミノ酸ベースＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーから形成される。これらは、骨または金属のいずれかに骨を結合させるのに特に有効であることが見出され、かつ骨サンプルへの有意である接着強度（４３９±２０３ＫＰａ）、および市販のポリ（メタクリル酸メチル）骨セメントと同程度である接着強度（５３０±１３３ＫＰａ）を実証している。これらのリン酸官能基化ＰＥＵポリマーおよびコポリマーは、ＯＧＰまたはＢＭＰ－２などの成長ペプチドの存在下で、整形外科用接着剤、脊髄損傷のための足場材料および整形外科修復物として有意な潜在力を有し、インビトロおよびインビボで分解可能であると考えられている。

第１の態様では、本発明は、リン酸官能基を有する１つ以上のアミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマー、ならびに架橋剤から形成されたリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤に関する。これらのアミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーは、リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマー主鎖を有し、これらは、様々なまたはアミノ酸ベースのポリエステルセグメントから構成され、それぞれが約１～約６０個の炭素原子によって分離された２つまたは３つの残基を含み、尿素結合によって互いに結合している。

いくつかの実施形態では、これらのポリエステルモノマーセグメントは、それぞれ、約２～約２０個の炭素の長さの直鎖炭素鎖、または約２～約６０個の炭素原子の長さの分岐炭素鎖によって分離されたアラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン、（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、セリン（ｓｅｒ－Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸の残基を含む。いくつかの実施形態では、これらのポリエステルモノマーセグメントのそれぞれは、同じアミノ酸を２つ有し得るが、いくつかの他の実施形態では、これらのポリエステルモノマーセグメントの一部またはすべてが２つの異なるアミノ酸を有し得る。これらの実施形態の一部では、これらのポリエステルモノマーセグメントの少なくとも一部は、約２～約２０個の炭素原子によって分離された１つ以上のリン酸化Ｌ－セリン、スレオニンまたはチロシン分子の残基を含む。これらの実施形態の一部では、これらのポリエステルモノマーセグメントは、約２～約２０個の炭素原子によって分離された２つのバリンまたはイソロイシン分子の残基を含む。

上述のように、いくつかの実施形態では、ポリエステルモノマーセグメントを形成するアミノ酸残基は、約２～約２０個の炭素原子の直鎖炭素鎖または約２～約６０個の炭素原子の分岐炭素鎖によって分離される。いくつかの実施形態では、ポリエステルモノマーセグメントを形成するアミノ酸残基は、約３～約２０個の炭素原子、他の実施形態では約４～約２０個の炭素原子、他の実施形態では約６～約２０個の炭素原子、他の実施形態では約８～約２０個の炭素原子、他の実施形態では約１０～約２０個の炭素原子、他の実施形態では約２～約１８個の炭素原子、他の実施形態では約２～約１６個の炭素原子、他の実施形態では約２～約１４個の炭素原子、他の実施形態では約２～約１２個の炭素原子の直鎖炭素鎖によって分離される。いくつかの実施形態では、ポリエステルモノマーセグメントを形成するアミノ酸残基は、約５～約６０個の炭素原子、他の実施形態では約１０～約６０個の炭素原子、他の実施形態では約１５～約６０個の炭素原子、他の実施形態では約８～約２０個の炭素原子、他の実施形態では約２０～約６０個の炭素原子、他の実施形態では約２～約５０個の炭素原子、他の実施形態では約２～約４０個の炭素原子、他の実施形態では約２～約３０個の炭素原子、他の実施形態では約２～約２０個の炭素原子の分岐炭素鎖によって分離されている。いくつかの実施形態において、ポリエステルモノマーセグメントを形成するアミノ酸残基は、８個の炭素原子によって分離されている。

１つ以上の実施形態において、ポリエステルモノマーセグメントのいくつかは、
式：

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～２０の整数である）を有する。

（式中、ａは１～２０の整数である）を有する。これらの実施形態の１つ以上において、ａは７である。

（式中、ａは１～２０の整数である）を有してもよい。

様々な実施形態において、本発明のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤を形成するポリエステルモノマーセグメントの約１モル％～約３０モル％は、少なくとも１つのリン酸側鎖を有する。いくつかの実施形態では、本発明のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤を形成するポリエステルモノマーセグメントの約２モル％～約２５モル％、他の実施形態では約２モル％～約２０モル％、他の実施形態では約２モル％～約１５モル％、他の実施形態では約２モル％～約１２モル％、他の実施形態では約２モル％～約１０モル％は、少なくとも１つのリン酸側鎖を有する。

１つ以上の実施形態において、本発明のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤は、少なくとも１つのリン酸側鎖を有する１つ以上の第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントと、リン酸側鎖を有さない上記の１つ以上の第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントと、を含むコポリマーである。これらの実施形態の１つ以上において、本発明の第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、約１～約２０個の炭素原子の直鎖炭素鎖によって分離された２個のリン酸化Ｌ－セリン分子の残基を含む。これらの実施形態のいくつかでは、本発明の第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、上に示した式ＩＸを有する。

これらの実施形態のいくつかでは、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、上記のように約２～約２０個の炭素の長さの炭素鎖によって分離された２つのアラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）分子の残基を含む。これらの実施形態の他のいくつかでは、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、上記のように３～約６０個の炭素の長さの分岐炭素鎖によって分離されたこれらのアミノ酸分子の３つまたは４つの残基を含む。様々な実施形態において、これらのセグメントは、上記の式ＶＩＩまたはＶＩＩＩを有することができる。いくつかの実施形態では、第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、上記のように、１～２０個の炭素原子によって分離された２個のバリンまたは２個のイソロイシン分子の残基を含む。いくつかの実施形態では、第２の第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、８個の炭素原子によって分離された２つのバリン分子の残基を含む。

明らかなように、第１および第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、尿素結合によって互いに連結されている。第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、約０．５モル％～約２０モル％のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）コポリマーを含むことが予想される。いくつかの実施形態では、第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーセグメントは、約１モル％～約２０モル％、他の実施形態では約２モル％～約２０モル％、他の実施形態では約４モル％～約２０モル％、他の実施形態では約１モル％～約１５モル％、他の実施形態では約１モル％～約１０モル％、他の実施形態では約２モル％～約８モル％の本発明のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）コポリマーを含む。

様々な実施形態において、これらのリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）コポリマーは、式：

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～２０の整数であり、ｍは約１％～約２０％のモル％であり、ｎは、約８０％～約９９％のモル％である）を有する。

いくつかのこれらの実施形態では、ａは２～２０の整数、他の実施形態では２～２０、他の実施形態では４～２０、他の実施形態では６～２０、他の実施形態では８～２０、他の実施形態では２～１８、他の実施形態では２～１４、他の実施形態では２～１０の整数である。これらの実施形態のいくつかでは、ｍは２％から２０％のモル％、他の実施形態では４モル％から２０モル％、他の実施形態では６モル％から２０モル％、他の実施形態では８モル％から２０モル％、他の実施形態では２モル％～１６モル％、他の実施形態では２モル％～１４モル％、他の実施形態では２モル％～１２モル％である。いくつかのこれらの実施形態では、ｎは８４モル％～９９モル％、他の実施形態では８８モル％～９９モル％、他の実施形態では９２モル％～９９モル％、他の実施形態では９６モル％～９９モル％、他の実施形態では８０モル％～９７モル％、他の実施形態では８０モル％から９３モル％、他の実施形態では８０モル％から９０モル％、他の実施形態では８０モル％から８５モル％である。

上記のように、本発明のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤は、二価の金属架橋剤の残基をさらに含む（図１を参照されたい）。本明細書において架橋剤に適用される用語「金属」は、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属を含むと理解すべきである。好適な二価の金属としては、これらに限定されないが、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛及びこれらの組み合わせを挙げることができる。

様々な実施形態において、リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）ポリマーおよび／またはコポリマー対の接着剤を架橋する二価の金属イオンのモル比は、約１：１～約１０：１である。いくつかの実施形態では、リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）ポリマーまたはコポリマー対二価の金属イオンのモル比は、約２：１～約１０：１、他の実施形態では約４：１～約１０：１、他の実施形態では約６：１から約１０：１、他の実施形態では約１：１から約８：１、他の実施形態では約１：１から約６：１、他の実施形態では約１：１～約４：１、他の実施形態では約２：１～約８：１、および他の実施形態では約３：１～約７：１である。

第２の態様において、本発明は、上記リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤の製造方法に関する。一般的概要において、この方法は、少なくともいくつかがリン酸側基を有する様々なポリエステルモノマーからアミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーを形成することと、それを二価の金属の塩を含む架橋剤と組み合わせて、リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤を形成することと、を伴う。

上記のように、アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーを形成するために使用されるアミノ酸ベースのポリエステルモノマーのいくつかは、長さが１～約２０個炭素の炭素鎖によって分離された２つのアラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）分子から構成される。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは同じアミノ酸を２つ有するが、これは必須ではなく、２つの異なるアミノ酸を有する実施形態が可能であり、本発明の範囲内である。様々な実施形態において、アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーを形成するために使用されるこれらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーを形成するアミノ酸は、上記のとおり、約２～約２０個の炭素原子の直鎖炭素鎖または約２～約６０個の炭素原子の分岐炭素鎖によって分離される。これらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、上記リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤を形成するために使用されるアミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーの一部を形成するが、接着性リン酸側鎖は含まない。

１つ以上の実施形態において、これらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、約１～約２０個の炭素原子によって分離された２つのバリン分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、
式：

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～２０の整数である）を有してもよい。

様々な実施形態において、これらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、スキーム１に示されるように、選択されたアミノ酸とポリオールとの反応から形成され得る。
スキーム１

スキーム１に示される実施形態において、選択されるアミノ酸は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、および／またはバリン（Ｒ＝－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、または－ＣＨ（ＣＨ₃）₂）であり、Ｃ₁～Ｃ₂₀ジオールと反応させるが、本発明はそれに限定されない。様々な実施形態において、選択されたアミノ酸は、２～６０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のポリオールと反応させることができる。様々な実施形態において、ポリオールは、ジオール、トリオール、またはテトラオールであり得る。上記スキーム１に示されるポリオールは、２～２０個の炭素原子を有するジオールである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリオールは、２～１７個の炭素原子、他の実施形態では２～１３個の炭素原子、他の実施形態では２～１０個の炭素原子、他の実施形態では１０～２０個の炭素原子を有するジオールである。好適なポリオールは、これらに限定されないが、１，６－ヘキサンジオール、１，８－オクタンジオール、１，９－ノナンジオール、１，１０－デカンジオール、１，１１－ウンデカンジオール、１，１２－ドデカンジオール、１，１３－トリデカンジオール、１，１４－テトラデカンジオール１，１５－ペンタデカンジオール、１，１６－ヘキサデカンジオール、１，１７－ヘプタデカンジオール、１，１８－オクタデカンジオール、１，１９－ノナデカンジオール、１，２０－イコサンジオール、２－ブテン－１，４－ジオール、３，４－ジヒドロキシ－１－ブテン、７－オクテン－１，２－ジオール、３－ヘキセン－１，６－ジオール、１，４－ブチンジオール、トリメチロールプロパンアリルエーテル、３－アリルオキシ－１，２－ジオール、２，４－ヘキサジイン－１，６－ジオール、２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール、１，１，１－トリス（ヒドロキシメチル）プロパン、１，１，１－トリス（ヒドロキシメチル）エタン、ペンタエリスリトール、ジ（トリメチロールプロパン）ジペンタエリスリトール、およびこれらの組み合わせを挙げることができる。実施形態において、ポリオールは、１，６－ヘキサンジオールであってもよく、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｏｍｐａｎｙＬＬＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＡｌｆａＡｅｓａｒ（ＷａｒｄＨｉｌｌ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）より入手可能である。

これらのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーを生成するためのポリオールとアミノ酸との反応は、当業者に一般的に公知である任意の数の方法で達成することができる。一般に、ヒドキシ基に対してわずかなモル過剰（約２．１当量）の酸を伴う水の沸点を超える温度での縮合反応は、反応を進行させるのに十分である。

スキーム１に示される反応において、アミノ酸出発物質およびポリオールは、好適な酸を用いて好適な溶媒に溶解され、１１０℃～約１１４℃の温度まで加熱され、約２０時間から約４８時間還流させて、使用されるポリオールに依存して約２～約６０個の炭素原子によって分離された２つ以上のアミノ酸残基を有するモノマーの塩を形成する。当業者は、過度の実験をすることなく好適な酸を選択することができるであろう。いくつかの実施形態では、使用される酸は、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物であってもよい。当業者は、過度の実験をすることなく好適な溶媒を選択することもできるであろう。好適な溶媒としては、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、使用される溶媒はトルエンである。

当業者には明らかであるように、モノマー中間体のアミン基を保護して、アミノ基転移を防ぐためのステップとするべきである。スキーム１の反応において、アミノ酸のアミンをプロトン化し、より高い転化率でアミノ基転移反応が確実に起こらないようにするためには、トルエンスルホン酸（ｐＴＳＡ）の存在が必要である。しかし、本発明は、スキーム１に示される方法に限定されず、当業者は、過度の実験を行うことなくアミノ基転移を防ぐのに適した対イオンを選択することができるであろう。好適な保護対イオンを生成することができる物質としては、これらに限定されないが、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物、塩化物、臭化物、酢酸塩、トリクロロアセテート、またはこれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施形態において、スキーム１に示される反応の粗生成物は、その目的のために当該分野で公知の任意の手段を用いて精製され得る。いくつかの実施形態では、粗生成物を最初に真空濾過して残留溶媒を除去し、活性炭中で脱色して残留塩または未反応モノマーを除去することによって精製する。その後、沸騰水または水とアルコールとの１：１の混合物から１～１０回再結晶して精製生成物を生成する。

上記のように、本発明のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤を形成するアミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーは、リン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマーの残基をさらに含む。これらのモノマーは、上記のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーと全体的な構造が類似しているが、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンアミノ酸分子を含有する代わりに（または加えて）、リン酸化されたアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、保護されたリン酸基で官能基化された１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン分子を含有する。

１つ以上の実施形態において、これらのリン酸化されたアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、式：

（式中、上記のとおりａは約１～約６０の整数である）を有し得る。上述の非リン酸化アミノ酸ベースのモノマーと同様に、アミド基転移を防ぐためにモノマーのアミン基を保護するためのステップを講じなければならない。ここでも、当業者は、過度の実験をすることなくアミド基転移を防ぐのに適した対イオンを選択することができるであろう。好適な保護対イオンを生成することができる物質としては、これらに限定されないが、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物、塩化物、臭化物、酢酸塩、トリクロロアセテート、またはこれらの組み合わせが挙げられる。

さらに、これらのＯＨ基における副反応を防止するために、リン酸基のＯＨ基を保護するためのステップを講じなければならない。当業者は、これらの副反応を防止するために保護基を結合する方法を知っているであろう。いくつかの実施形態において、フェニル基は、式Ｉに示されるような保護基として使用されるが、本発明はこれに限定されず、他の適切な保護基を使用してもよい。

１つ以上の実施形態では、リン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、保護されたセリン、スレオニンまたはチロシン分子と、非リン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマーに関して上記で同定されたポリオールのいずれかとの間の縮合反応が行われ、次いで、保護されたリン酸基を付加することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、リン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、以下のスキーム２に示すように、Ｂｏｃおよびベンジル保護セリン分子およびＣ₂～Ｃ₂₀ジオールから形成され得る。
スキーム２

式中、ａは１～１９の整数である。

スキーム２に示す実施態様では、出発物質（ＸＩ）、（ＸＩＩ）およびピリジニウム４－トルエンスルホネート（ＤＰＴＳ）などの活性化剤は、不活性雰囲気下において好適な反応容器内で、ジクロロメタン、クロロホルム、ジオキサンなどの好適な溶媒に溶解させる。次に溶液を約－２０℃～約２０℃の温度に冷却し、Ｎ，Ｎ‘－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカップリングを加える。この反応は、Ｂｏｃおよびベンジルで保護されたセリンベースのポリエステル中間体（ＸＩＩＩ）を生成する。スキーム２に示す第２の反応では、このＢｏｃおよびベンジルで保護されたセリンベースのポリエステル中間体（ＸＩＩＩ）を、水素化瓶およびパラジウム炭素触媒を用いてプロトン化したエタノールイソプロパノールなどの好適な溶媒に溶解させて、ビス－Ｎ－ｂｏｃ（Ｌ－セリン）ポリエステル中間体（ＸＩＶ）を形成する。第３の反応において、保護されたリン酸基は、ピリジンなどの好適な溶媒に溶解させて、ジフェニルホスホリルクロリド（ＸＶ）と反応させることによって、ｔビス－Ｎ－ｂｏｃ（Ｌ－セリン）ポリエステル中間体（ＸＩＶ）に添加し、ビス－Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）ポリエステル中間体（ＸＶＩ）を生成する。最後に、ビス－Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）ポリエステル中間体（ＸＶＩ）を脱保護し、トリフルオロ酢酸または硫酸などの酸を用いてプロトン化し、対応するリン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマー（Ｉ）を生成する。

上述したように、少なくとも一部がフェニル保護されたリン酸基を含むアミノ酸ベースのポリエステルモノマーは、ＰＥＵ形成化合物と反応させて、本発明のアミノ酸ベースのＰＥＵポリマー接着剤に使用されるリン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／コポリマーを生成する。本明細書で使用される場合、用語「ＰＥＵ形成化合物」は、２つのアミン基の間にカルボキシル基を配置し、これにより尿素結合を形成することができる化合物を指し、これらに限定するものではないが、トリホスゲン、ジホスゲン、またはホスゲンが挙げられる。上述したように、ジホスゲン（液体）およびトリホスゲン（固体結晶）は、ホスゲンよりも適切であると理解される。これは、トリホスゲンが有毒ガスであるホスゲンのより安全な代替物として一般に認識されているためである。アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーまたはコポリマーを生成するためのアミノ酸ベースのポリエステルモノマーとトリホスゲン、ジホスゲン、またはホスゲンとの反応は、当業者に一般的に公知である任意の数の方法で達成することができる。

いくつかの実施形態では、本発明のアミノ酸ベースのＰＥＵポリマー接着剤に使用されるリン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーは、以下のスキーム３に示すリン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマーおよび非リン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマーから形成され得る。
スキーム３

（式中、Ｒ＝－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、Ｒ’は、ジフェニルホスホリル基であり、ａは１～２０の整数であり、ｍは約１％～約２０％のモル％であり、ｎは、約８０％～約９９％のモル％である）。

様々な実施形態において、保護されたポリエステルモノマー（Ｉ、ＩＩ）は、リン酸化されたアミノ酸ベースのポリエステルモノマー（ＩＩ）対非リン酸化アミノ酸ベースのポリエステルモノマー（Ｉ）のモル比が約１：９９～約１：５であり、他の実施形態では約１：８０から約１：７０であり、他の実施形態では約１：６０から約１：５０であり、他の実施形態では約１：４０から約１：３０であり、他の実施形態では約１：２０から約１：１５であり、他の実施形態では約１：１０から約１：８である。

スキーム３のステップ（ａ）において、保護されたポリエステルモノマー（Ｉ、ＩＩ）は、界面重合法を用いて重合され、ジフェニルホスホリル側基を有するアミノ酸ベースのＰＥＵコポリマー（ＸＶＩＩＩ）を形成する。本明細書で使用される場合、界面重合とは、２つの非混和性流体の界面境界でまたはその近くで行われる重合を指す。これらの実施形態では、保護されたポリエステルモノマー（Ｉ、ＩＩ）は、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムなどの好適な有機水溶性塩基の第１の画分と所望のモル比で混合させ、機械的撹拌および温水浴（約３５℃）を用いて水に溶解させる。これらの実施形態の１つ以上において、反応物は、約－１０℃～約２℃の温度まで冷却され、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、または重炭酸カリウムなどの有機水溶性塩基の追加の画分を水に溶解させ、次いで反応混合物に加える。反応物は、これらに限定されないが、氷浴、水浴または再循環冷却器など、その目的のための当技術分野で公知の任意の手段によって冷却することができる。

次に、トリホスゲン（ＸＶＩＩ）ジホスゲンまたはホスゲンなどのＰＥＵ形成化合物の第１の画分を、蒸留クロロホルムまたはジクロロメタンなどの好適な溶媒に溶解させて、次いで反応混合物に加える。スキーム３のステップ（ａ）において、ＰＥＵ形成化合物はジホスゲンである。当業者は、過度の実験をすることなく、ＰＥＵ形成化合物に適した溶媒を選択することができるであろう。約２分～約６０分後、ＰＥＵ形成化合物の第２の画分（トリホスゲン、ジホスゲン、またはホスゲンなど）を蒸留クロロホルムまたはジクロロメタンなどの好適な溶媒に溶解させて、約０．５～約６時間かけて反応混合物に滴下し、ジフェニルホスホリル側基を有するセグメントおよび非リン酸化ＰＥＵセグメントを含有する粗ＰＥＵコポリマーを生成する。スキーム３のステップ（ａ）の粗生成物は、その目的のために当該分野で公知の任意の手段を用いて精製することができる。いくつかの実施形態において、スキーム３のステップ（ａ）の粗生成物は、分液漏斗に移し、それを沸騰水中に沈殿させることによって精製してもよい。

スキーム３のステップ（ｂ）において、ジフェニルホスホリル側基を有するアミノ酸ベースのＰＥＵコポリマー（ＸＶＩＩＩ）のジフェニル保護基は、ＰｔＯ₂などの金属触媒の存在下で水素化分解によって脱保護されて、本発明のアミノ酸ベースのＰＥＵポリマー接着剤に使用されるリン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマー（Ｖ）を形成する。スキーム３のステップ（ｂ）に示す反応では、ジフェニルホスホリル側基を有するアミノ酸ベースのＰＥＵコポリマー（ＸＶＩＩＩ）を、ジクロロメタンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／酢酸（ＡｃＯＨ）などの好適な溶媒に溶解した。その後、ＰｔＯ₂などの金属触媒をＨ₂（６０ｐｓｉ）の存在下で水素化ボンベ反応器中のポリマー溶液に添加して、本発明のアミノ酸ベースのＰＥＵポリマー接着剤に使用されるリン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマー（Ｖ）を形成する。スキーム３のステップ（ｂ）の粗生成物は、その目的のために当該分野で公知の任意の手段を用いて精製することができる。いくつかの実施形態において、スキーム３のステップ（ｂ）の粗生成物は、分液漏斗に移し、それを沸騰水中に沈殿させることによって精製してもよい（一般的に、実施例７～１２を参照されたい）。

本発明のアミノ酸ベースのＰＥＵポリマー接着剤を形成するには、上記のリン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーを、結合される表面に塗布する直前に架橋剤と組み合わせなければならない。上記のように、好適な架橋剤は、二価の金属イオンを含む溶液を含む（図１を参照されたい）。好適な二価の金属としては、これらに限定されないが、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛及びこれらの組み合わせを挙げることができる。様々な実施形態において、架橋剤は、カルシウムまたはマグネシウムの二価のイオンを含む溶液を含み得る。

様々な実施形態において、リン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）ポリマーおよび／またはコポリマー対架橋剤中の二価の金属イオンのモル比は、約１：１～約１０：１である。いくつかの実施形態では、架橋剤におけるリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）ポリマーまたはコポリマーの二価の金属イオンに対するモル比は、約２：１～約１０：１、他の実施形態では約４：１～約１０：１、他の実施形態では約６：１から約１０：１、他の実施形態では約１：１から約８：１、他の実施形態では約１：１から約６：１、他の実施形態では約１：１～約４：１、他の実施形態では約２：１～約８：１、および他の実施形態では約３：１～約７：１である。

第３の態様において、本発明は、上記のリン酸官能基化アミノ酸ベースのポリ（エステル尿素）接着剤を使用して骨を骨にまたは骨を金属に結合させるための方法に関する。これらの実施形態では、最初に、骨および／または金属表面の汚れを取り除き、任意の適用可能な方法を使用して調製する。次に、リン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーを上記のように調製する。表面が結合される直前に、上記の、ある量の架橋剤をリン酸化アミノ酸ベースのＰＥＵポリマーおよび／またはコポリマーに混合して、架橋反応を開始させる。次いで、混合物は、結合させる表面の１つ以上に塗布され、表面は一緒にプレスされ、ポリマーが架橋し続けるときに所定の位置に保持される。ポリマーが完全に架橋するにつれて、表面は互いに完全に接着するようになる。
実験

リン酸化セリン（ｐＳｅｒ）およびバリンアミノ酸ベースのＰＥＵコポリマーを合成し、それらの物理的性質の特徴を明らかにした。コポリマー中に組み込まれたｐＳｅｒ含量は２％および５％であった。これらのポリマーのエタノールへの溶解性により、それらはより臨床的に関連があるようになり、骨接着剤としてのさらなる開発の強い可能性を示す。それらの接着強度は、Ｃａ²⁺による架橋の前後に、アルミニウム基材での重ね剪断接着およびウシ骨基材での端々接着により調べた。

スキーム４は、これらの実験に用いたポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の合成を表す。ポリマー合成の第一ステップは、ビス（Ｌ－バリン）－１，８－オクタニルジエステル（１－Ｖａｌ－８）モノマーのジ－ｐ－トルエンスルホン酸の塩とジフェニル保護ホスホセリンモノマーの溶液重合を伴い、ポリ（セリンジフェニルホスフェート－ｃｏ－バリン）（ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ））を生成する。第２ステップでは、ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の水素化分解脱保護を伴って、リン酸官能基化コポリマー、ポリ（ホスホセリン－コ－バリン）（ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ））を得る。
スキーム４

これらの実験では、２％および５％のｐＳｅｒ含量を有するコポリマーが合成されており、それぞれ、２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）として示した。ポリマーに取り込まれたセリンモノマーの実際の量は、¹ＨＮＭＲ分光法によって測定された供給量よりも少ないことが分かった。理にかなった根拠としては、モノマーに４つの嵩高いフェニル基が存在することであり、これにより、セリンモノマーの反応性が低下し、セリン含量の取り込みを低下させる傾向がある。５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の¹ＨＮＭＲスペクトルでは、フェニル保護基は芳香族領域にピークを示すδ＝７．０６～７．３４ｐｐｍ。水素化分解後のこれらのフェニル基の脱保護の成功は、芳香族ピークの損失によって確認された。保護されたリン酸基に直接接着したメチレンでのプロトン環境は、約δ＝４．０ｐｐｍの共鳴を有し、脱保護後にはわずかに下降してδ＝４．３７ｐｐｍとなる（図２Ａ）。保護フェニル基の除去は、¹³ＣＮＭＲスペクトルからも確認された。５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）中の芳香族ピーク（δ＝約１２０～１３０ｐｐｍ）は、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の脱保護後には消失している（図３および４）。³¹ＰＮＭＲスペクトルでは、フェニル基の完全脱保護も確認する。５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、δ＝－１１．５８ｐｐｍに特徴的なリンピークを有し、脱保護後にはδ＝－１．２０ｐｐｍにシフトしている（図２Ｂ）。

減衰全反射赤外分光法（ＡＴＲ－ＩＲ）は、ジフェニル基の脱保護の前後にリン酸基の存在および保存を示す。Ｐ－Ｏ－Ｈ結合は７００～５００ｃｍ^-1の範囲に特徴的なＩＲピークを有し、Ｐ＝Ｏ結合は１２００～１１００ｃｍ^-1の間に特徴的なピークを有する。ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）のＰ－Ｏ特性ピークは約６７５ｃｍ^-1付近に見られ、これは脱保護後の約７１０ｃｍ^-1へのわずかなシフトを示す。Ｐ＝Ｏ結合は、脱保護の前後に特徴的なピーク約１０４０ｃｍ^-1を示す。これらの２つの特徴的なリン酸塩伸長ピークはいずれも、１－Ｖａｌ－８ポリマー（ポリ（１－Ｖａｌ－８））においては顕著ではない（図５）。２％コポリマーの¹ＨＮＭＲスペクトルは、積分値が異なること以外は５％コポリマーのものと類似している（図６および７）。２％コポリマーの¹³Ｃおよび³¹ＰＮＭＲスペクトルも、５％コポリマーと同様のδ（ｐｐｍ）を有する（図８～１１）。

ＰＥＵの特徴を明らかにし、熱重量分析（ＴＧＡ）による分解温度（Ｔ_d）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるガラス転移温度（Ｔ_g）、ＳＥＣによる数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍ_w）、および多分散性（Ｄ_M）などの物理的特性を決定した。これらのポリマーの表面エネルギーは、既知の表面エネルギーの５つの異なる液体の接触角から決定され、次式によってポリマー表面エネルギーの極性および分散成分を計算した^29、30（Ｓｔａｋｌｅｆｆ，Ｋ．Ｓ．；Ｌｉｎ，Ｆ．；ＳｍｉｔｈＣａｌｌａｈａｎ，Ｌ．Ａ．；Ｗａｄｅ，Ｍ．Ｂ．；Ｅｓｔｅｒｌｅ，Ａ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ，ａｍｉｎｏａｃｉｄ－ｂａｓｅｄｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒｕｒｅａ）ｓｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄｗｉｔｈｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｇｒｏｗｔｈｐｅｐｔｉｄｅｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡｃｔａＢｉｏｍａｔｅｒ２０１３，９，（２），５１３２－４２；およびＹｕ，Ｊ．Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｆ．；Ｌｉｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｇａｏ，Ｙ．Ｈ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ－ＢａｓｅｄＰｏｌｙ（ｅｓｔｅｒｕｒｅａ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｖｉｔｒｏＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１４年，４７，（１），１２１－１２９（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

ポリマーの全表面エネルギーγ_p（ｍＪｍ^-2）は、式１から計算された極性成分と分散成分の和である。表１は、ポリマーの物理的特性をまとめたものである。ポリマーの接着性が原因によるＳＥＣカラムのブロッキングを防ぐために、ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の分子量を求めることはなかった。ＰｔＯ₂触媒の存在下での水素化分解反応は、選択性が高く、部位特異的であるため、この反応中にポリマーの分解が起こることは予想されなかった。

ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）よりわずかに低いガラス転移温度を示す。保護されたポリマーに嵩高いフェニル基が存在することにより、鎖を堅くし、それらの動きを妨害し、その一方で、脱保護後、鎖はより柔軟になり、自由に流動し、それぞれのＴ_gのわずかな低下を示す（図１２）。保護されたポリマーおよび脱保護されたポリマーは双方とも１５０℃を超える分解温度を有する（図１３）。すべてのポリマーの分子量は同等であり、分子量効果による接着強度の逸脱が回避される。

２％および５％の両方のポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、表面エネルギーの極性および分散成分を有する。極性成分が存在することは、表面接着において重要な役割を果たす表面極性基を示す。２％および５％ポリマーの表面エネルギーは、互いに同程度であり、ポリ（１－Ｖａｌ－８）のものよりも高い。ポリマーの官能基の割合が小さいことから、２％と５％の官能基化の間の表面エネルギーの認識可能な変化は見られなかった。
アルミニウム基材での重ね剪断接着試験

重ね剪断接着は、接着材料の強度およびそれらの不良様式を決定するために使用される一般的な方法である。（実施例１４参照）。ポリマーの接着強度は、室温におけるアルミニウム被着体での重ね剪断構造下で調べた。重ね剪断接着試験は、Ｃａ²⁺による架橋の有無にかかわらず、２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）に対して行った。ポリ（１－Ｖａｌ－８）は、接着におけるリン酸基の重要性を証明するための対照の１つとして用いた。市販のＰＭＭＡ骨セメントは、ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）との比較のための別の対照として用いた。重ね剪断接着試験の結果を図１４Ａにまとめる。

ポリ（１－Ｖａｌ－８）の接着強度は０．０４±０．１６ＭＰａ、ＰＭＭＡ骨セメントは０．０４±０．０１ＭＰａであった。ポリ（メタクリル酸メチル）は接着性を有していないため、骨セメントの接着強度は低いと予想される。ＰＭＭＡ骨セメントは高弾性率を有しており、本質的に骨および歯のフィラーとして使用される。ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、対照サンプルと比較して改善された接着強度を示す。これは、リン酸基とアルミニウム表面との間の静電的または水素結合相互作用から生じ得る。２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着強度は、それぞれ０．９２±０．１８ＭＰａおよび０．７７±０．０９ＭＰａである（図１４Ａ）。トビケラシルクに関するこれまでの研究では、二価カチオンが除去されている場合には、Ｃａ²⁺による架橋は繊維に強度を与え、結晶性β－シート構造が崩壊することを示しており、系中のＣａ²⁺の重要性を示唆している（Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．；Ａｓｈｔｏｎ，Ｎ．Ｎ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．Ｓ．；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．Ｊ．；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｇ．Ｐ．；Ｙａｒｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ｂｅｔａ－Ｓｈｅｅｔｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｄｏｍａｉｎｓｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｓｅｒｉｎｅ－ｒｉｃｈｍｏｔｉｆｓｉｎｃａｄｄｉｓｆｌｙｌａｒｖａｌｓｉｌｋ：ａｓｏｌｉｄｓｔａｔｅＮＭＲａｎｄＸＲＤｓｔｕｄｙ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１３年，１４，（４），１１４０－８；Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．Ｓ．；Ｍｏｕ，Ｑ．；Ａｓｈｔｏｎ，Ｎ．Ｎ．；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．Ｊ．；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｇ．Ｐ．；Ｙａｒｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｂｅｔａ－ｓｈｅｅｔｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓｗｉｔｈｉｎｃａｄｄｉｓｆｌｙｓｉｌｋ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１４年，１５，（４），１２６９－７５を参照されたい（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。本発明者らの仮説では、ポリマー骨格鎖のリン酸基が架橋剤中のＣａ²⁺と相互作用して、物理的架橋を生じ、架橋していない対応物と比較して、接着剤強度をさらに上昇させるポリマーバルク内の凝集力を改善する（図１）。接着強度は、系内での接着力と凝集力の両方の効果を組み合わせた結果である。発明者らの仮説を検証するために、本発明の系のＣａ²⁺源としてヨウ化カルシウムを選択した。

２％および５％のＣａ²⁺架橋ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は両方とも、未架橋の対応物と比較して接着強度の上昇を示した。架橋した２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）および架橋した５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着強度は、それぞれ１．１７±０．１９ＭＰａおよび１．１４±０．０２ＭＰａである（図１４Ａ）。発明者らの結果は、アルミニウム基材におけるリン酸官能基化ポリマーの強い親和性を示している。凝集不良は、接着剤が不良後に両方の被着体に付着した場合である。接着剤が一方の被着体からきれいに離脱し、不良後、他方の被着体に粘着した場合は、接着不良と呼ばれる。不良モードは、接着剤の商業的可能性を決定する際に重要である。ほとんどの接着剤では、凝集不良が望ましい。興味深いことに、接着していない骨セメントを除いて、すべてのサンプルが凝集不良を示している（図１４Ｂ～Ｇ）。骨セメントは本質的に接着性ではなく、骨の支持媒体として役立つのみであるという事実を考慮すると、この結果は驚くべきことではない。金属に対する接着調査の結果は、わずかな割合でポリマー骨格のリン酸基が取り込まれることで、金属基材での接着強度の有意な改善が示されることを示唆している。また、二価カチオンによるリン酸基の架橋は、静電的相互作用を介して接着強度をさらに高める。
ウシ骨の端々接着試験

ウシ骨サンプルでのポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着強度の試験も行い、骨接着剤としてのその潜在的な適用を実証した。（実施例１５参照）。骨は、表面に正と負の電荷の配列を有する。骨の基本構成ブロックは、化学構造Ｃａ₅（ＰＯ₄）₃（ＯＨ）を有するヒドロキシアパタイトである。図１５Ａは、ポリマーのウシ骨への接着強度をまとめたものである。この調査の対照は、金属基材の対照と同じであった。ポリ（１－Ｖａｌ－８）は骨表面に全く接着しなかった。試験を実施する前に、すべてのサンプルが接着しなかった。ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、ポリ（１－Ｖａｌ－８）対照と比較して接着強度が上昇していることを示している。２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、１９０ＫＰａ±７０ＫＰａの接着強度を示し、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）は、３９９±１０１ＫＰａの接着強度を示した。

０．３当量のＣａ²⁺を架橋剤として添加した後に接着強度の上昇が観察された。架橋された２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着強度は２１１±７７ＫＰａに上昇し、架橋した５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着強度は４３９±２０３ＫＰａに上昇した。対照ポリマーの場合と比較して、リン酸官能基化ポリマーの接着強度が上昇していることは、リン酸基の存在が重要であることを証明している。また、少ない割合でのリン酸官能基の取り込みが、接着の認識可能な変化をもたらすことは注目に値する。５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着強度は、市販の骨セメント（５３０±１３３ＫＰａ）と同程度であり、これは、ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）が骨接着剤へのさらなる発展の可能性が高いことを示唆している。接着不良を示した骨セメントを除いて、すべてのサンプルが凝集不良を示した。
インビトロ細胞生存率および拡散アッセイ

ＭＣ３Ｔ３細胞の細胞生存率は、各サンプルについて少なくとも４０の画像を用いて計算し、２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）に標準化した。（図１６および図１７を参照されたい）。ガラス、ポリ（１－Ｖａｌ－８）、２％および５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）、２％および５％架橋ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）での細胞生存率は、それぞれ（８４±９）％、（９４±８）％、（１００±３）％、（９７±５）％、（９７±７）％、および（９８±４）％であった（図１６を参照されたい）。ガラス上での細胞の生存率が低いことは、取り扱い誤差および播種誤差に起因し得る。官能基化ポリマーの細胞生存率が高い（＞９５％）のは、リン酸官能基が細胞に対して無毒であることを証明している。いずれのサンプルにおいても、ＭＣ３Ｔ３細胞の細胞骨格構造または拡散挙動は類似していた。細胞は核については青色（ＤＡＰＩ）、焦点接着点については緑色（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）、アクチンフィラメントについてはローダミンファロイジン（赤色）に染色された。全てのサンプルの細胞のアスペクト比はかなり近く（約２～３）であり、官能基化ポリマーが対照と同様に挙動することが証明された（図１７）。

リン酸官能基化ＰＥＵコポリマーは、トビケラ接着性シルクの特性を模倣するように設計され作製された。これらのコポリマーはエタノール可溶性であり、これにより好適な送達機構となり、それらを医療用途に適したものにする。コポリマーは、Ｃａ²⁺で架橋した後、金属基材において１．１７±０．１９ＭＰａの最大接着強度を示した。骨サンプルでのコポリマーの接着強度は有意であり（４３９±２０３ＫＰａ）、市販のポリメタクリル酸メチル骨セメント（５３０±１３３ＫＰａ）と同程度であった。リン酸官能基化コポリマーは、バリンポリマー類似体と比較して、改善された有意な接着強度を示した。これは、リン酸基が接着を促進する上で重要な役割を果たすことを示している。すべての場合において、コポリマーは凝集不良を示した。リン酸官能基化コポリマーは、ＯＧＰまたはＢＭＰ－２のような成長ペプチドの存在下で、整形外科用接着剤、脊髄損傷のための足場材料、および整形外科修復物として有意な潜在能力を有する。ＰＥＵはインビトロおよびインビボで分解可能である。
実施例

以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、いくつかの実施例は、本発明が機能し得る方法についての結論を含み得るが、発明者はこれらの結論に拘束されることを意図するものではなく、可能な説明としてのみ提示する。さらに、過去の時制の使用によって示されない限り、実施例の提示は、実験または手順が実施されたか否か、または結果が実際に得られたか否かを意味するものではない。使用される数（例えば、量、温度）に関して正確さを保つための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差が存在する可能性はある。他に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
材料および方法

Ｌ－バリン、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物、トルエン、１，８－オクタンジオール、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｐｄ／Ｃ、ＰｔＯ₂、エタノール、ジフェニルホスホリルリド（９９％）、無水ピリジン、４ＭＨＣｌ／ジオキサン溶液、クロロホルム、トリメチルアミン、および酢酸は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｎ－Ｂｏｃ－Ｏ－Ｂｚｌ－Ｌ－セリンはＡｒｋＰｈａｒｍ、Ｉｎｃ．から購入した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）はＯａｋｗｏｏｄＣｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。トリホスゲンは、ＴＣＩＡｍｅｒｉｃａから購入した。４－（ジメチルアミノ）ピリジニウム４－トルエンスルホネート（ＤＰＴＳ）を文献の手順に従って合成した。クロロホルムをＣａＨ₂で一晩乾燥させ、蒸留し、使用前に暗所で保存した。別段の記載がない限り、すべての化学物質は受領したまま使用した。

モノマーおよびポリマーの¹Ｈ、¹³Ｃおよび³¹ＰＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎ，ＮＭＲ分光光度計（それぞれ３００ＭＨｚおよび５００ＭＨｚ）で記録した。化学シフト（δ）はｐｐｍ単位で報告され、残留溶媒共鳴（¹ＨＮＭＲ，ＤＭＳＯ－ｄ₆：δ＝２．５０ｐｐｍ、および¹³ＣＮＭＲ，ＤＭＳＯ－ｄ₆：δ＝３９．５０ｐｐｍ）を基準とした。多重度の略語は、ｓ－シングレット、ｄ－ダブレット、ｍ－マルチプレット、ｑ－カルテット、ｄｄ－ダブルダブレット、ｔｄ－トリプルダブレットとして示す。ポリマーの減衰全内部反射分光（ＡＴＲ－ＩＲ）スペクトルを、水晶窓を備えたＳｈｉｍａｄｚｕＭｉｒａｃｌｅ１０ＡＴＲ－ＦＴＩＲで記録した。測定には、水晶窓を十分覆う小さいポリマー片を使用した。モノマーのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ－ＭＳ）は、ＥＳＩ供給源を備えたＢｒｕｋｅｒＨＣＴｕｌｔｒａＩＩ四重極イオントラップ（ＱＩＴ）質量分析計（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で記録した。ポリマーの分子量およびＰＤＩ（ＤＭ）は、溶離剤としてＤＭＦ（０．１ＭＬｉＢｒ塩溶液）を使用し、流速０．５ｍＬ／分、５０℃で、屈折率検出器を備えた、ＴＯＳＯＨＥＣＯＳＥＣＨＬＣ－８３２０ＧＰＣによるサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。ポリマーのガラス転移温度（Ｔ_g）は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ、ＴＡＱ２００）により、－５０℃～６０℃、走査速度１０℃／分で５サイクル行って測定した。ポリマーの分解温度（Ｔ_d）は、熱重量分析（ＴＧＡ、ＴＡＱ５００）を用いて、２５℃～６００℃で、加熱速度１０℃／分として測定した。
実施例１
ビス（Ｌ－バリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ１）のジ－ｐ－トルエンスルホン酸の塩の合成

トルエンの入ったディーン・スターク・トラップ、コンデンサー、電磁攪拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコで、Ｌ－バリン（２７．５ｇｍ、０．２３４ｍｏｌ）、１，８－オクタンジオール（１５ｇｍ、０．１０２ｍｏｌ）、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（４６．５７ｇｍ、０．１９０ｍｏｌ）を秤量した。この溶液を撹拌しながら４８時間加熱還流した。生成物を周囲温度まで冷却させた後、それを熱水に溶解し、カーボンブラックと一緒に撹拌して着色不純物をいずれも除去した。モノマーをさらに水中で３回再結晶化し、純粋な生成物として４０ｇｍ（収率＝６５％）の白色粉末を得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δ）：０．９５（ｄｄ，Ｊ＝６．９６Ｈｚ，１０．４８Ｈｚ，１２Ｈ；ＣＨ３），１．２１（ｄ，Ｊ＝４５．７１Ｈｚ，８Ｈ；ＣＨ₂），１．５４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂），２．０２－２．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ），２．３１（ｄ，Ｊ＝１９．９１Ｈｚ，６Ｈ；ＣＨ₃），３．９０（ｄ，Ｊ＝４．５６Ｈｚ，２Ｈ；ＣＨ），３．９８－４．４０（ｍ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，１０．８３Ｈｚ，１７．１８Ｈｚ，４Ｈ；ＣＨ₂），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝７．９７Ｈｚ，１１０．４２Ｈｚ，４Ｈ；ＣＨ），８．２３（ｂｒｓ，６Ｈ，ＮＨ）。図１８を参照されたい。
実施例２
ビス－Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ベンジル（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ２）の合成

Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ベンジル－Ｌ－セリン（１５ｇｍ、５０．７９ｍｍｏｌ）、１，８－オクタンジオール（３．０９ｇｍ、２１．１６ｍｍｏｌ）およびＤＰＴＳ（１．０６ｇｍ、４．２３ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水ＤＣＭにＮ₂下で溶解した。次いで反応フラスコを氷浴に浸し、ＤＩＣ（７．６２ｍｌ、４８．６７ｍｍｏｌ）を０℃、Ｎ₂下で、フラスコに迅速に注入した。温度を室温まで徐々に上昇させながら反応物を不活性雰囲気下で一晩撹拌させた。反応溶液を濾過して尿素結晶を除去し、真空濃縮した。油状生成物をＣＨＣｌ₃に溶解し、５％ＨＣｌ溶液で２回、脱イオン水で１回洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。ヘキサン／酢酸エチル（２．６５／１、ｖ／ｖ）を溶離剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、淡黄色の油状物（１３．３８ｇｍ、収率＝８９％）を得た。
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δ）：１．２０（ｓ，４Ｈ，ＣＨ₂），１．３７（ｓ，２２Ｈ，ＣＨ₃），１．５０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂），３．５３－３．７７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂），３．８５－４．１３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝５．５５Ｈｚ，１２．８０Ｈｚ，２Ｈ；ＣＨ），４．４６（ｓ，４Ｈ，ＣＨ₂），７．０９（ｄ，Ｊ＝７．９２Ｈｚ，２Ｈ；ＣＨ），７．１９－７．４０（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＨ）。図１９を参照されたい。
実施例３
ビス－Ｎ－ｂｏｃ（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ３）の合成

Ｍ２（１１ｇｍ、１５．６９ｍｍｏｌ）を水素化瓶中でエタノール３０ｍｌに溶解した。１．３ｇｍのＰｄ／Ｃ触媒をポリマー溶液に加え、軽度の加熱（約３５℃）、４８時間、６０ｐｓｉのＨ２圧下で水素化分解に付した。溶液を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を濾過し、濃縮し、真空乾燥させて、無色の油状物を生成物として得た（８．５ｇｍ、収率＝７７％）。
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δ）：１．２０（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），１．３７（ｓ，２２Ｈ，ＣＨ₃），１．５３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２），３．６５（ｔ，Ｊ＝５．４４Ｈｚ，４；ＣＨ２），３．８－４．１９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．０２Ｈｚ，２Ｈ；ＣＨ）。図１９を参照されたい。
実施例４
ビス－Ｎ－ｂｏｃ－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ４）の合成

Ｍ３（９ｇｍ、３．４０ｍｍｏｌ）を窒素下で約１５ｍｌのピリジンに溶解し、氷浴に１５分間浸漬した。塩化ジフェニルホスホリル（１０．２１ｇｍ、８ｍｌ、６．７２ｍｍｏｌ）を窒素下で反応溶液にゆっくり加えた。反応温度を室温まで徐々に上昇させながら、反応物を一晩攪拌した。約３０ｍｌのＣＨＣｌ₃を反応フラスコに加えて生成物を溶解させた。溶液を１００ｍｌの脱イオン水、１００ｍｌの１ＭＨＣｌで１回洗浄し、最後に１００ｍｌの脱イオン水で２回洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、黄色がかった固体生成物が得られるまでさらに真空乾燥させた。続いて、黄色固体をイソプロパノール中で３回再結晶化させて、純粋な生成物として白色粉末を得た（８．８ｇｍ、収率＝５２％）。
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ－ｄ６，δ）：１．１７（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），１．３５（ｓ，２２Ｈ，ＣＨ₃），１．４７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２），３．９９（ｔ，Ｊ＝６．３６Ｈｚ，６Ｈ；ＣＨ２），４．４２（ｄ，Ｊ＝６．１１Ｈｚ，４Ｈ；ＣＨ２），７．２３（ｄｄ，Ｊ＝７．６１Ｈｚ，１５Ｈｚ，８Ｈ；ＡｒＨ），７．４（ｔ，Ｊ＝７．８５Ｈｚ，１２Ｈ；ＡｒＨ）。図１９を参照されたい。
実施例５
ビス－Ｏ－ジフェニルホスフェート（Ｌ－セリン）－１，８－オクタニルジエステル（Ｍ５）の二塩酸塩の合成

４ＭＨＣｌ／ジオキサン溶液（４０ｍｌ）をＭ４（８．８ｇｍ）に加え、窒素下で一晩攪拌した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて溶媒を除去した。凍結乾燥後に得られた淡黄色固体を酢酸エチルで洗浄し、乾燥させて、純粋な生成物として淡黄色粉末を得た（８．８ｇｍ、収率＝１００％）。
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δ）：１．１６（ｔ，Ｊ＝７．０５Ｈｚ，４Ｈ；ＣＨ₂），１．４３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂），４．０２（ｔ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，４Ｈ；ＣＨ₂），４．６８（ｓ，６Ｈ，ＣＨ₂），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝７．９４Ｈｚ，１５．６６Ｈｚ，８Ｈ，ＡｒＨ），７．４１（ｔ，Ｊ＝７．２９Ｈｚ，１２Ｈ；ＡｒＨ），８．９６（ｂｒｓ，６Ｈ，ＮＨ）。図１９および図２０を参照されたい。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：理論値：７８４．７４；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝７８５．２。図２１を参照されたい。
実施例６
１，８－オクタンジオール－Ｌ－バリンポリ（エステル尿素）（ポリ（Ｌ－Ｖａｌ－８））の合成：

ビス（Ｌ－バリン）－１，８－オクタニル－ジエステル（Ｍ１）のジ－ｐ－トルエンスルホン酸塩（１３．７４ｇ、２０ｍｍｏｌ、１当量）およびトリエチルアミン（１２．５５ｍｌ、９０ｍｍｏｌ、４．５当量）を、電磁攪拌棒および圧力均等化添加漏斗を備えた５００ｍＬ３つ口丸底フラスコ中で４０ｍＬのクロロホルムに溶解させて溶液重合を行った。次いで、トリホスゲン（２．３７ｇ、８ｍｍｏｌ、０．４当量）を新たに蒸留したクロロホルム１５ｍＬに溶解し、窒素下、室温で滴下した。反応を１２時間続け、その後、１５ｍＬのクロロホルムに溶解したトリホスゲン（０．４５ｇ、１．５ｍｍｏｌ、０．０８当量）のさらなるアリコートをフラスコに滴下した。反応物をさらに８時間撹拌した。ポリマーを熱水中で沈殿させて精製し、真空乾燥させた。

実施例７
ポリ（セリンジフェニルホスフェート－ｃｏ－バリン）（ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の合成：

コポリマーは、Ｐ（１－Ｖａｌ－８）と同様の溶液重合によって合成した。典型的には、電磁攪拌棒を備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコ中で、Ｎ₂下で４０ｍＬの新たに蒸留したＣＨＣｌ₃にモノマー（２０ｍｍｏｌ、１当量）およびトリエチルアミン（９０ｍｍｏｌ、４．５当量）を両方とも溶解させた。トリホスゲン（８ｍｍｏｌ、０．４当量）を１５ｍＬの蒸留クロロホルムに溶解し、室温、窒素下でフラスコに滴下した。反応を１２時間続けた後、トリホスゲンのさらなるアリコート（１０ｍＬのクロロホルム中１．５ｍｍｏｌ、０．０７５当量）をフラスコに滴下した。反応をさらに８時間続け、その後、反応溶液を分液漏斗に移し、熱水中に滴下して沈殿させた。水を周囲温度まで冷却させた後、ポリマーを室温にて水中で一晩洗浄し、最後に真空乾燥させて生成物としての白色ポリマーを得た。
実施例８
５％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の合成

理論的モノマー供給比－ｐＳｅｒ／Ｖａｌ（Ｍ５／Ｍ１）＝１５／８５：¹H ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆，δ）：実際のモノマー比＝５／９５，δ＝０．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．７６Ｈｚ，１３．６３Ｈｚ，１９５Ｈ；ＣＨ₃），１．２６（ｄ，Ｊ＝１１．１２Ｈｚ，１５４Ｈ；ＣＨ₂），１．５４（ｍ，７２Ｈ，ＣＨ₂），１．９８（ｄｄ，Ｊ＝６．５６Ｈｚ，１２．５８Ｈｚ，３１Ｈ；ＣＨ），３．９３－４．１４（ｍ，１３７Ｈ，ＣＨ_2,ＣＨ），６．３７（ｄ，Ｊ＝８．９１Ｈｚ，３８Ｈ；ＮＨ），７．０６－７．１８（ｍ，２６Ｈ，ＡｒＨ），７．１９－７．３４（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＨ）。¹³ＣＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆，δ）：１９．４（Ｃ４），２５．６９（Ｃ４），２８．５５（Ｃ４），３０．９０（Ｃ２），５８．１５（Ｃ４），６４．５３（Ｃ４），１２０．３４（ＡｒＣ），１２３．０８（ＡｒＣ），１２９．３１（ＡｒＣ），１５７．９７（ＮＨ－Ｃ＝Ｏ），１７２．８５（Ｏ－Ｃ＝Ｏ）。図２４を参照されたい。³¹ＰＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆，８５％Ｈ₃ＰＯ₄外部標準，δ）：１１．５８ｐｐｍ。ＡＴＲ－ＩＲ（ν）：１６５０－１６９０ｃｍ^-1（ｓ，Ｃ＝Ｏ尿素ストレッチ），１７３５－１７５０ｃｍ^-1（ｓ，Ｃ＝Ｏエステルストレッチ），３３００－３５００ｃｍ^-1（ｍ，Ｎ－Ｈ尿素ストレッチ），約１０４０ｃｍ^-1（ｗ，Ｐ＝Ｏストレッチ），約６７５ｃｍ^-1（ｗ，Ｐ－Ｏストレッチ）。

図２５を参照されたい。
実施例９
２％ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）の合成

理論的モノマー供給比－ｐＳｅｒ／Ｖａｌ（Ｍ５／Ｍ１）＝１０／９０：¹ＨＮＭＲスペクトル共鳴は、異なる積分値を有する５％Ｐ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）に類似している。図６、２４を参照されたい。実際のモノマー比＝２／９８。¹³Ｃおよび³¹ＰＮＭＲスペクトルおよびＡＴＲ－ＩＲスペクトルは、

実施例１０
ポリ（ホスホセリン－ｃｏ－バリン）（ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の合成：

ジフェニル保護基を、ＰｔＯ₂触媒の存在下で水素化分解により脱保護して、トビケラシルクの模倣物としてリン酸官能基化コポリマーを合成した。典型的には、ポリ（ＳｅｒＤＰＰ－ｃｏ－Ｖａｌ）（１．００ｇ）をＣＨＣｌ₃：４０％ＴＦＡ／ＡｃＯＨ（４：１）溶液５０ｍＬに溶解した。触媒としてのＰｔＯ₂（１．１当量のＳｅｒＤＰＰ）を水素化ボンベ反応器中のポリマー溶液に加え、反応をＨ₂（６０ｐｓｉ）の存在下、室温で２時間行った。溶液を濾過し、真空濃縮させた。熱水中で沈殿させた後、純粋なポリマーを白色固体として得て、真空乾燥させた。
実施例１１
５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）：

０．９ｇ、収率＝９０％。¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆，δ）：０．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．７６Ｈｚ，１３．６１Ｈｚ，１９４Ｈ；ＣＨ₃），１．２６（ｓ，１５５Ｈ，ＣＨ₂），１．５４（ｍ，７２Ｈ，ＣＨ₂），１．９８（ｔｄ，Ｊ＝６．７２Ｈｚ，１３．３９Ｈｚ，３５Ｈ；ＣＨ），３．８７－４．１８（ｍ，１０２Ｈ，ＣＨ₂，ＣＨ），４．３７（ｔ，Ｊ＝６．４８Ｈｚ，２Ｈ；ＣＨ₂），６．３７（ｄ，Ｊ＝８．９１Ｈｚ，２６Ｈ，ＮＨ）。¹³ＣＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_6,δ）：１９．４（Ｃ４），２５．６９（Ｃ４），２８．５５（Ｃ４），３０．９０（Ｃ２），５８．１５（Ｃ４），６４．５３（Ｃ４），１５７．９７（ＮＨ－Ｃ＝Ｏ），１７２．８５（Ｏ－Ｃ＝Ｏ）。図２６を参照されたい。³¹ＰＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆，８５％Ｈ₃ＰＯ₄外部標準，δ）：－１．２０ｐｐｍ。図２７を参照されたい。ＡＴＲ－ＩＲ（ν）：１６５０－１６９０ｃｍ^-1（ｓ，Ｃ＝Ｏ尿素ストレッチ），１７３５－１７５０ｃｍ^-1（ｓ，Ｃ＝Ｏエステルストレッチ），３３００－３５００ｃｍ^-1（ｍ，Ｎ－Ｈ尿素ストレッチ），約１０４０ｃｍ^-1（ｗ，Ｐ＝Ｏストレッチ），約７１０ｃｍ^-1（ｗ，Ｐ－Ｏストレッチ）。図５を参照されたい。
実施例１２
２％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）：

１ｇ、収率＝１００％。¹ＨＮＭＲスペクトル共鳴は、異なる積分値を有する５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）に類似している。¹³Ｃおよび³¹ＰＮＭＲスペクトルおよびＡＴＲ－ＩＲスペクトルは、５％ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）のそれぞれに対応する。図４、図７、図９および図２６を参照されたい。
実施例１３
表面エネルギー測定。

５つの異なる液体の接触角を測定して、Ｏｗｅｎｓ／Ｗｅｎｄｔ法を用いて各ポリマーのそれぞれの表面エネルギーを計算した。接触角測定には、既知の表面張力の液体（水、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ホルムアミド）を使用した³⁰。ポリマー薄膜は、ポリマーの入った１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を用いて、オゾン処理したシリコンウェーハ上に、２０００ｒｐｍで１分間、スピンコーティングした。サンプルを一晩、７０℃で真空乾燥させた。各サンプルについて測定（ｎ＝３）を室温で行い、平均の標準偏差を独立した測定値から計算した。結果を上記の表１および２に報告する。
実施例１４
アルミニウム基材での重ね剪断接着試験。

重ね剪断接着試験は、ＡＳＴＭＤ１００２規格に従ってアルミニウム基材で行った。厚さ１．６ｍｍのアルミニウム被着体を、一方の端部から各被着体に１２．５ｍｍ穿孔された直径６．５ｍｍの穴を有する長さ７５ｍｍ×幅１２．５ｍｍの長方形の基材に切断した。接着試験のために、ポリマーの入ったエタノール溶液（３０μＬ、１ｍＬエタノール中３００ｍｇ）を被着体の一端に塗布した。別の被着体を重なり面積が１．５６ｃｍ²である重ね剪断形状でその上に置いた。架橋剤を使用する場合、ポリマー溶液（２５μＬ、エタノール１ｍＬ中３００ｍｇ）および架橋剤溶液（５μＬ、１ｍＬアセトン中に０．３当量／ｐＳｅｒ群）を混合し、被着体の一端に塗布した。被着体を一緒にプレスし、試験前に室温で１時間、７５℃で２４時間、室温で１時間硬化させた。重ね剪断接着は、１０００Ｎのロードセルを備えたＩｎｓｔｒｏｎ５５６７装置を用いて行った。被着体は、不良が発生するまで、１．３ｍｍ／分の速度で引き離した。密着強度（Ｐａ）は、不良時の最大荷重（Ｎ）を接着面積（ｍ²）で割ったものである。結果を図２Ａ～Ｇに報告する。
実施例１５
ウシ骨基材への端々接着試験

ポリ（ｐＳｅｒ－ｃｏ－Ｖａｌ）の接着特性を調べるために、本発明らは皮質ウシ骨に対する端々接着実験を行った。ウシ骨サンプルは、地元の食料品店から入手した。これらの骨を、骨鋸で長さ約２ｃｍ×幅０．６ｃｍ×厚さ０．４ｃｍの長方形の断片に切断した。続いて、３２０粒のサンドペーパー（３ＭＰｒｏＧｒａｄｅＰｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｘ－ｆｉｎｅ）を用いて骨サンプルの試験端を研磨し、接着剤塗布の１時間前に骨をＰＢＳ溶液中に保持した。ポリマー溶液（３０μＬ、エタノール１ｍＬ中３００ｍｇ）を骨の一端に塗布し、第２の骨をその上に端から端に配置した。架橋した試験片については、１本目の骨にポリマー溶液（２５μＬ、エタノール１ｍＬ中３００ｍｇ）および架橋剤溶液（５μＬ、１ｍＬアセトン中０．３当量／ｐＳｅｒ群）を塗布し、２本目の骨を、端々構成に配置した。骨サンプルを一緒に切り取り、ＰＢＳ浸漬したガーゼで２４時間包んだ。次いで、接着試験前に、サンプルを３７℃、湿度９５％、および５％ＣＯ₂で、インキュベーター中に２時間置いた。接着試験は、５ｋｇのロードセルを備えたテクスチャーアナライザー（ＴＡ．ＸＴ．Ｐｌｕｓ）で行った。骨サンプルを、不良が発生するまで１．３ｍｍ／分の速度で引き離した。密着強度（Ｐａ）は、不良時の最大荷重（Ｎ）を接着面積（ｍ²）で割ったものである。結果を図１５Ａ～図１５Ｃに報告する。
実施例１６
インビトロ細胞生存率試験

播種後１日目および３日目にリン酸官能基化ポリマーについてＭＣ３Ｔ３細胞の細胞生存率および伝播を調べた。ポリマー膜を、１２ｍｍガラスカバースリップ上で、２０００ｒｐｍで１分間３％（ｗ／ｖ）エタノール溶液からスピンコートした。膜を８０℃で一晩真空乾燥させ、注意深く１２ウェルプレートに移した。細胞をＰＢＳですすぎ、その後３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ₂で、５分間、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液１ｍにより脱着させた。５ｍＬの培地を添加することによってトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を失活させ、細胞を４℃、３０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離によって収集した。細胞ペレットを乱すことなく培地／トリプシン溶液を吸引し、細胞を５ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。細胞密度を、トリパンブルー染色を用いて、血球計算盤により計数した。細胞を６０００細胞／ｃｍ²の密度で播種した。ウェルプレートは、インキュベーション前にサンプル上に細胞が確実に均一に分布するように、穏やかに攪拌した。

細胞生存率は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄａｓｓａｙ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価した。約５μＬのカルセインＡＭ（４ｍＭ）と１０μＬのエチジウムホモ二量体を１０ｍＬのＤＰＢＳに添加して染色溶液を調製した。各サンプルから培地を吸引し、ＤＰＢＳですすいだ後、０．５ｍＬの染色溶液を各ウェルに添加した。ウェルプレートをアルミニウム箔で覆い、イメージングする前に３７℃で１０分間インキュベートした。ＨａｍａｍａｔｓｕｏｒｃａＲ２ＣＣＤカメラ、ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣフィルターを備えたＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡で、ＣｅｌｌＳＥＮＳソフトウェアを用いて４倍に拡大して画像を撮影した。緑色に染色された細胞は生存していると考えられ、赤く染色された細胞は死滅したと考えられた。細胞カウンタープラグインを使用してＩｍａｇｅＪソフトウェアで細胞を計数した。結果を図１６に報告する。
実施例１７
細胞拡散アッセイ

拡散試験のために、１ｍＬの培地に細胞を前固定し、ＣＳ緩衝溶液中の３．７％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）１ｍＬを３７℃で５分間、乾燥ブロックで播種させた。吸引後、細胞を３７℃で５分間、３．７％ＰＦＡ溶液の入ったＣＳ緩衝液２ｍＬに５℃で固定した。次いで、サンプルをＣＳ緩衝液２ｍＬで３回すすぎ、続いて１．５ｍＬのＴｒｉｔｏｎＸ－１００の入ったＣＳ緩衝液（０．５％ｖ／ｖ）を各ウェルに添加して、３７℃で１０分間細胞を透過化処理した。サンプルをＣＳ緩衝液で３回すすいだ。次いで、新たに調製した０．１重量％のＮａＢＨ₄の入ったＣＳ緩衝液２ｍＬを各ウェルに１０分間、室温で添加して、アルデヒド蛍光を消光させ、その後、吸引し、５％ロバ血清中において室温で２０分間インキュベートして、非特異的結合を阻止した。吸引後、サンプルを３００μＬビンキュリン一次抗体マウスの入ったＣＳ緩衝液（ｖ／ｖ１：２００）中において、４℃で一晩インキュベートした。次に、サンプルを１％ロバ血清で３回すすぎ、ろう紙上、暗所、室温で、５０μＬのローダミンファロイジン（ｖ／ｖ１：４０）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体マウス（ｖ／ｖ１：２００）溶液により１時間染色した。サンプルをＣＳ緩衝液で３回洗浄後、核をＤＡＰＩの入ったＣＳ緩衝液（６μＬ／１０ｍＬ）を用いて暗所、室温で２０分間染色した。サンプルをＣＳ緩衝液で３回洗浄して余分な染色を除去し、２０倍の倍率でＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＤＡＰＩフィルターを備えたＨａｍａｍａｔｓｕｏｒｃａＲ２ＣＣＤカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡下で観察した。結果を図１７に報告する。

上記に照らして、本発明は、分解可能かつ再吸収可能な新規リン酸化ポリ（エステル－尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤（および関連する製造方法および使用方法）を提供することにより、本発明は、技術を著しく進歩させ、これにより構造的および機能的には多くの点で改善されることを理解されたい。本発明の特定の実施形態を本明細書で詳細に開示したが、本発明はこれらに限定されず、したがって本発明の変形形態が当業者には容易に理解されるであろうことを理解されたい。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲から理解されるであろう。

Claims

少なくとも１つの炭素原子を介して１つ以上の側鎖に共有結合するリン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマー骨格と、
二価の金属の塩を含む架橋剤と、を含む、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤。
前記ＰＥＵポリマー骨格は、アラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択されるアミノ酸の残基を含む、請求項１に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記ＰＥＵポリマー骨格が、１つ以上のリン酸化Ｌ－セリン分子の残基を含む、請求項１に記載のＰＥＵベースの接着剤。
リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有する前記ＰＥＵポリマー骨格が、
２～２０個の炭素原子によって分離された２個のリン酸化アミノ酸を含む第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーの残基と、
２～２０個の炭素原子によって分離された２個のアミノ酸を含む第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーの残基と、をさらに含む、請求項１に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが２個のリン酸化Ｌ－セリン分子を含む、請求項４に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが次式

（式中、ａは１～１９の整数である）を有する、請求項４に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、アラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択される２個のアミノ酸を含む、請求項４に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、バリンまたはイソロイシンを含む、請求項４に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが次式

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～１９の整数である）を有する、請求項４に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記ＰＥＵポリマー骨格が次式

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～１９の整数であり、ｍは１％～２０％のモル％であり、ｎは、８０％～９９％のモル％である）を有する、請求項１または４に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記架橋剤が、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛およびこれらの組み合わせからなる群から選択される二価の金属の塩である、請求項１に記載のＰＥＵベースの接着剤。
前記架橋剤を１モル％～２０モル％含む、請求項１に記載のＰＥＵベースの接着剤。
請求項１に記載のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を製造する方法であって、
Ａ．少なくとも１つの炭素原子を介して１つ以上の側鎖に共有結合するリン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマーを調製することと、
Ｂ．二価の金属の塩からなる架橋剤を添加することと、を含む、方法。
リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有する前記ＰＥＵポリマーと二価の金属の塩を含む前記架橋剤とのモル比が、１：１～１０：１である、請求項１３に記載の方法。
リン酸基を含む１つ以上の側鎖を有する前記ＰＥＵポリマーが、次式

（式中、Ｒは－ＣＨ₃、Ｈ、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、－（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｐｈ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｃ＝ＣＨ－ＮＨ－Ｐｈ、－ＣＨ₂－Ｐｈ－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、ａは１～１９の整数であり、ｍは１％～２０％のモル％であり、ｎは、８０％～９９％のモル％である）を有する、請求項１３に記載の方法。
ＰＥＵポリマーを調製するステップ（ステップＡ）が、
１．１～２０個の炭素原子によって分離された２個のリン酸化アミノ酸を含む第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーを調製するステップと、
２．２～２０個の炭素原子によって分離された２個のアミノ酸を含む第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーを調製するステップと、
３．前記第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーおよび前記第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーをホスゲン、ジホスゲンまたはトリホスゲンと反応させて、前記第１および第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーの間に尿素結合を導入してステップＡの前記ＰＥＵポリマーを形成するステップと、をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
前記第１のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、２～２０個の炭素原子によって分離された２個のリン酸化セリン分子を含む、請求項１６に記載の方法。
前記第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、アラニン（ａｌａ－Ａ）、グリシン（ｇｌｙ－Ｇ）、イソロイシン（ｉｌｅ－Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ－Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ－Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ－Ｆ）、スレオニン（ｔｈｒ－Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ－Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ－Ｙ）、またはバリン（ｖａｌ－Ｖ）からなる群から選択され、２～２０個の炭素原子によって分離された２個のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の方法。
前記第２のアミノ酸ベースのポリエステルモノマーが、バリンまたはイソロイシン分子を含む、請求項１６または１８に記載の方法。
請求項１に記載のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を使用して骨を骨に、または骨を金属に結合する方法であって、
Ａ．接合される第１の表面と第２の表面とを調製するステップと、
Ｂ．少なくとも１つの炭素原子を介して１つ以上の側鎖に共有結合するリン酸基を含む１つ以上の側鎖を有するＰＥＵポリマーを調製するステップと、
Ｃ．ステップＡの前記ＰＥＵポリマーに二価の金属の塩を含む架橋剤を混合して、請求項１に記載のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を形成するステップと、
Ｄ．ステップＣの前記ＰＥＵポリマー／架橋剤混合物を、接合される前記第１および第２の表面の一方または両方に塗布するステップと、
Ｅ．前記第１の表面と前記第２の表面とを互いに接合させて配置するステップと、
Ｆ．請求項１に記載のポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ベースの接着剤を架橋させ、前記第１の表面と前記第２の表面との間に結合を形成させるステップと、を含む、方法。