KR102418854B1 - 프로폴리스를 포함하는 신경세포분화 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로폴리스를 포함하는 신경세포분화 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 고가의 다른 성장인자의 추가 없이도 신경세포의 분화를 촉진할 수 있어 경제적인 장점이 있다.

Description

프로폴리스를 포함하는 신경세포분화 촉진용 조성물 {Composition for stimulation of differentiation of nerve cell comprising propolis}

본 발명은 프로폴리스를 포함하는 신경세포분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

신경조직은 다른 조직과 달리 발생과정 중에서 분열, 분화 및 시냅스 형성 등의 일련의 과정이 전부 이루어지는 조직으로 알려졌으며, 출생 후에는 거의 분화가 이루어지지 않는 것으로 알려졌다.

뉴런 유사 PC-12 세포는 신경모세포로부터 유래한 것으로, 교감신경-유사 세포로 분화되는 능력을 지녀, 신경분화 및 모폴로지 발생과 관련된 분자 프로세스의 연구를 위한 유용한 도구로 여겨지고 있다. 신경분화는 보통 신경돌기(neurite)의 발생과 관계되며, 신경돌기는 다른 뉴런과 기능성 연결을 형성하는 축색돌기 및 수상돌기가 된다.

PC-12 세포에서 신경분화를 촉진하기 위한 통상적인 접근법은 신경성장인자(NGF)의 보충, 혈청 기아(serum starvation) 및 세포 부착을 위한 라미닌-풍부 기질 또는 콜라겐 IV-풍부 기질을 첨가하는 것이다. PC-12 세포의 신경분화를 위해 상기한 물질을 처리하면 신경돌기의 발생과 함께 모폴로지가 변하고, 세포가 세포 주기의 G1 상(Phase)에 축적되어 PC-12 세포의 증식 속도가 감소한다. 또한, 신경성장인자로 더욱 처리하면 PC-12 세포가 G1 상에서 정지하고, G2/M 상의 비율도 증가한다. 신경성장인자에 장기간 노출된 후, 최종 분화가 유도되고, PC-12 세포는 다중 신경돌기의 발생을 포함하여 교감신경의 여러 특성을 획득하게 된다.

향신경성 인자들은 신경세포의 분화유도 및 신경세포의 실체와 생존 유지에 관여하는 단백질 화합물이다. 신경성장인자는 이러한 화합물들의 대표적인 것들로서 알려졌다. 이것은, 신경성장인자가 중추 및 말초 신경계에서 신경세포의 분화, 생존유지 및 회복에 깊이 개입하고 있음을 나타내는 것이다.

그러나 이들 신경성장인자는 고가로 신경세포 분화를 기초로 한 연구를 수행함에 있어 경제적 부담이 큰 문제가 있다. 이에, 경제적 부담을 줄이면서도 효과적으로 신경세포 분화를 유도할 수 있는 대체제 마련의 필요성이 대두되는 실정이다.

한국공개특허 제10-2009-0055455호(2009.06.02.) 한국공개특허 제10-2018-0101228호(2018.09.12.)

본 발명은 프로폴리스를 이용함으로써, 고가의 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)의 처리없이도 신경세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 프로폴리스를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경세포 분화 촉진방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 프로폴리스를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 신경세포 분화 촉진용 조성물은, 바람직하게 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 미포함하는 것이 좋다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진용 조성물에 있어, 상기 신경세포는, 일 예로 PC-12 세포 또는 SH-SY5Y 세포일 수 있다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진용 조성물에 있어, 상기 프로폴리스는, 바람직하게 10~25㎍/㎖ 첨가되는 것이 좋다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진용 조성물에 있어, 상기 조성물은, 바람직하게 배지 조성물인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 인체 외(in vitro)에서 신경세포에 프로폴리스를 처리하는 단계;를 포함하는 신경세포 분화 촉진방법을 제공한다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법에 있어, 상기 신경세포는, 일 예로 PC-12 세포 또는 SH-SY5Y 세포일 수 있다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법에 있어, 상기 프로폴리스는, 바람직하게 10~25㎍/㎖ 첨가되는 것이 좋다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법에 있어, 상기 신경세포는, 바람직하게 프로폴리스 처리 일주일 이내에 신경세포로 분화가 완료되는 것이 좋다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법은, 바람직하게 프로폴리스 외 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 미처리하는 것이 좋다.

본 발명의 조성물은 고가의 다른 성장인자의 추가 없이도 신경세포의 분화를 촉진할 수 있어 경제적인 장점이 있다.

도 1은 SH-SY5Y 세포의 분열된 신경세포와 분화된 신경세포의 모폴로지(morphology)를 나타낸 도이다.
도 2는 10% FBS가 첨가된 EMEM 배지를 처리한 SH-SY5Y 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 3은 99.99%(v/v) 에탄올(Ethanol; EtOH)을 0.1% 농도로 처리한 SH-SY5Y 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 4는 1㎍/㎖의 프로폴리스(propolis)를 처리한 SH-SY5Y 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 5는 10㎍/㎖의 프로폴리스(propolis)를 처리한 SH-SY5Y 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 6은 25㎍/㎖의 프로폴리스(propolis)를 처리한 SH-SY5Y 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 7은 PC-12 세포의 분열된 신경세포와 분화된 신경세포의 모폴로지(morphology)를 나타낸 도이다.
도 8은 10% FBS가 첨가된 EMEM 배지를 처리한 PC-12 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 9는 99.99%(v/v) 에탄올(Ethanol; EtOH)을 0.1% 농도로 처리한 PC-12 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 10은 1㎍/㎖의 프로폴리스(propolis)를 처리한 PC-12 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 11은 10㎍/㎖의 프로폴리스(propolis)를 처리한 PC-12 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.
도 12는 25㎍/㎖의 프로폴리스(propolis)를 처리한 PC-12 세포의 모폴로지(morphology)를 비교한 도이다.

본 발명은 프로폴리스를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 신경세포 분화 촉진용 조성물은, 바람직하게 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 미포함하는 것이 좋다. 본 발명의 일 구현예에서는 신경성장인자의 처리 없이도, 프로폴리스의 처리만으로 신경세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있었다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진용 조성물에 있어, 상기 신경세포는, 일 예로 PC-12 세포 또는 SH-SY5Y 세포일 수 있다.

PC-12 세포주(cell line)은 래트(rat)의 부신 수질(adrenal medulla)에 발생한 크롬친화 세포종(phromocytoma)에 유래된 세포주이며, 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 처리하면 신경세포로 최종 분화의 특성을 가져, 일반적으로 신경분화 연구의 모델로 유용하게 사용되는 세포주이다.

SY5Y 세포는 1970년 4세 여아의 신경모세포종의 골수전이 병소에서 추출한 SK-N-SH 세포를 친주로 하여 3회의 서브클로닝을 거쳐 수립한 주화세포이다. 모폴로지는 짧은 세포돌기를 갖는 비교적 균일한 섬유모세포모양이지만 일부 상피유사세포가 확률적으로 출현한다. 신경성장인자(nerve growth factor; NGF) 레티노인산, 디부티릴 cAMP 등에 의해서 분화를 유도하며 카테콜아민 작동성 신경세포의 모형으로서 연구되고 있다. 분화유도 후에는 DNA 중합효소 저해제인 아피디콜린을 배양액 중에 첨가함으로써 상피유사세포의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진용 조성물에 있어, 상기 프로폴리스는, 바람직하게 10~25㎍/㎖ 첨가되는 것이 좋다. 본 발명의 일 구현예에서는 10~25㎍/㎖ 농도에서 PC-12 세포 및 SH-SY5Y 세포 모두 신경세포로의 분화를 나타내었다. 그 중 SY5Y세포에서 프로폴리스 처리에 의한 신경세포로의 분화효과가 더욱 우수하게 나타났다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진용 조성물에 있어, 상기 조성물은, 바람직하게 배지 조성물인 것이 좋다.

본 발명의 배지조성물은 프로폴리스를 단독으로 사용할 수도 있으나, EMEM과 같은 세포배양에 사용되는 기본배지에 프로폴리스를 포함한 것일 수 있으며, 필요한 경우 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등의 혼합물인 영양혼합물(Nutrient Mixture)은 물론 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G),인슐린트랜스페린-셀레늄, 인간혈청 등과 같이 사용목적에 따라 배양배지에 허용 가능한 각종 유무기성분을 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명은 인체 외(in vitro)에서 신경세포에 프로폴리스를 처리하는 단계;를 포함하는 신경세포 분화 촉진방법을 제공한다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법에 있어, 상기 신경세포는, 일 예로 PC-12 세포 또는 SH-SY5Y 세포일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 특히 SH-SY5Y 세포의 신경세포 분화를 더욱 효과적으로 유도할 수 있었다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법에 있어, 상기 프로폴리스는, 바람직하게 10~25㎍/㎖ 첨가되는 것이 좋고, 바람직하게 프로폴리스 처리 일주일 이내에 신경세포로 분화가 완료되는 것이 좋다.

본 발명의 신경세포 분화 촉진방법은, 바람직하게 프로폴리스 외 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 미처리하는 것이 좋다.

본 발명의 일 구현예에서는, 신경성장인자를 처리하지 않고도 프로폴리스 처리만으로 PC-12 세포 및 SH-SY5Y 세포의 신경세포 분화를 효과적으로 유도할 수 있었다. 또한, 프로폴리스는 10~25㎍/㎖ 첨가군에서 신경세포로의 분화를 일주일 이내에 유도할 수 있었다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 프로폴리스 처리에 의한 SH - SY5Y 세포의 신경세포 분화 유도]

프로폴리스의 신경세포 분화 유도 효과를 확인하기 위하여, 1×10⁶ cells/dish로 SH-SY5Y 세포를 씨딩(seeding)하고, 10% FBS가 첨가된 EMEM 배지에서 24시간 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 이후, 1, 10, 25㎍/㎖의 프로폴리스(propolis) 에탄올 추출물을 각각 처리한 후 세포를 7일간 인큐베이션하였다. 배지는 2일마다 교환하였고, 세포의 모폴로지를 각각 1일, 2일 4일 7일 째되는 날 확인하였다.

무첨가군으로는 10% FBS가 첨가된 EMEM 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포를 이용하였고(도 2), 대조군으로는 프로폴리스 대신 99.99%(v/v) 에탄올(Ethanol; EtOH)을 0.1% 농도로 처리하여 배양된 SH-SY5Y 세포를 이용하였다(도 3).

도 1에 나타낸 분열과 분화에 따른 SH-SY5Y 세포의 모폴로지에 의하면, 분화되지 않은 신경세포의 경우 세포분열이 왕성하게 이루어지며, 납작한 형태의 세포가 주로 관찰되고, 분화가 이루어진 신경세포는 세포의 분열 속도가 느려지고, 신경 축삭 말단과 같은 방추(spindle) 형태의 구조가 관찰된다.

이에 의하면, 도 2 내지 4에 나타낸 바와 같이 무첨가군, 대조군 및 1㎍/㎖의 프로폴리스 처리군은 세포가 분열할 뿐, 신경세포로의 분화를 나타내지 않았다.

하지만, 도 5 내지 6에 나타낸 바와 같이, 10 및 25㎍/㎖의 프로폴리스 처리군은 신경세포로의 분화가 나타났으며, 25㎍/㎖의 프로폴리스 처리군에서 더욱 우수한 신경세포 분화 효과를 나타내었다.

[ 실시예 2: 프로폴리스 처리에 의한 PC-12 세포의 신경세포 분화 유도]

프로폴리스의 신경세포 분화 유도 효과를 확인하기 위하여, 1×10⁶ cells/dish로 PC-12 세포를 씨딩(seeding)하고, 10% FBS가 첨가된 EMEM 배지에서 24시간 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 이후, 1, 10, 25㎍/㎖의 프로폴리스(propolis) 에탄올 추출물을 각각 처리한 후 세포를 7일간 인큐베이션하였다. 배지는 2일마다 교환하였고, 세포의 모폴로지를 각각 1일, 2일 4일 7일 째되는 날 확인하였다.

무첨가군으로는 10% FBS가 첨가된 EMEM 배지에서 배양된 PC-12 세포를 이용하였고(도 8), 대조군으로는 프로폴리스 대신 99.99%(v/v) 에탄올(Ethanol; EtOH)을 0.1% 농도로 처리하여 배양된 PC-12 세포를 이용하였다(도 9).

도 7에 나타낸 분열과 분화에 따른 PC-12 세포의 모폴로지에 의하면, 분화되지 않은 PC-12 세포는 세포분열만 일어나며, 세포의 형태는 둥글고 납작한 모양을 띤다. 또한, 세포가 성장할 때도 세포간에 뭉쳐서 자라는게 특징이다. 반면, 신경세포로 분화된 PC-12 세포는 세포분열의 속도가 느려지고, 신경 축삭 말단과 같은 방추(spindle) 형태의 구조가 관찰된다.

이에 의하면, 도 8 내지 10에 나타낸 바와 같이 무첨가군, 대조군 및 1㎍/㎖의 프로폴리스 처리군은 세포가 분열할 뿐, 신경세포로의 분화를 나타내지 않았다.

하지만, 도 11 내지 12에 나타낸 바와 같이, 10 및 25㎍/㎖의 프로폴리스 처리군은 신경세포로의 분화가 나타났으며, 25㎍/㎖의 프로폴리스 처리군에서 더욱 우수한 신경세포 분화 효과를 나타내었다.

Claims (10)

1. 프로폴리스 에탄올 추출물을 포함하는 SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진용 조성물로,
   상기 프로폴리스 에탄올 추출물은 10~25㎍/㎖ 포함되는 것을 특징으로 하는, SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 신경세포 분화 촉진용 조성물은,
   신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 미포함하는 것을 특징으로 하는 SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진용 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은,
   배지 조성물인 것을 특징으로 하는 SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진용 조성물.
   
6. 인체 외(in vitro)에서 SH-SY5Y 신경세포에 프로폴리스 에탄올 추출물을 10~25㎍/㎖ 처리하는 단계;를 포함하는 SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진방법.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제6항에 있어서,
   상기 신경세포는,
   프로폴리스 에탄올 추출물 처리 일주일 이내에 신경세포로 분화가 완료되는 것을 특징으로 하는 SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진방법.
   
10. 제6항에 있어서,
    상기 신경세포 분화 촉진방법은,
    프로폴리스 에탄올 추출물 외 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 미처리하는 것을 특징으로 하는 SH-SY5Y 신경세포 분화 촉진방법.

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