KR102407845B1 - 고감도 당 측정 센서 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전기화학적 고감도 당 측정 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 전극, 상기 전극 상에 적층되고 효소를 포함하는 활성층 및 상기 활성층 상에 적층되고 하기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리머를 포함하는 폴리머층을 포함하며, 상기 폴리머층에 의해 당이 포함된 시료에서 당을 제외한 방해 물질들의 유입을 차단시켜, 선택적으로 당만을 검출할 수 있고, 이의 정량적인 측정이 가능한 것을 특징으로 한다.
<구조식 1>

상기 구조식 1에서, n은 양의 정수이다.

Description

고감도 당 측정 센서 및 이의 제조 방법{HIGH SENSITIVE SENSOR FOR MEASURING GLUCOSE AND METHOD OF THE SAME}

본 발명은 당 측정 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소변에서 당을 선택적으로 측정할 수 있는 당 측정 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린 작용 이상 또는 인슐린 분비 결함 등에 의해 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 당뇨병으로 인하여 급성 합병증 또는 인체조직의 손상과 관련된 만성 합병증을 유발한다. 최근 우리나라에서도 당뇨병 환자가 증가추세에 있으며, 국민건강보험공단이 진료비 자료를 분석한 결과, 당뇨 환자는 2006년 163만 명에서 2010년 202만 명으로 23.9% 증가했으며, 2015년도에 발표된 국민건강영양조사 자료에 의하면 30세 이상의 성인 10명중 1명이 당뇨병 질환이 있는 것으로 분석되었다.

당뇨병을 관리 및 치료하는데 매우 중요한 요소는 주기적으로 혈당을 측정하여 모니터링 함으로써 혈당 관리를 하는 것이다. 혈당 관리를 위한 현재 시판되는 대표적인 혈당기는 혈당정보를 나타내 주는 혈당기기, 혈액을 올려놓는 검사지 및 혈액을 채취할 때 쓰이는 채혈기로 구성되어 있다. 혈당기의 혈당기기는 오래 사용할 수 있으나, 혈당을 측정하기 위해 혈액을 검출하는 부분인 혈당 스트립(검사지)과 채혈기는 한번 사용하고 버려야 한다는 단점이 있다.

혈당을 측정하기 위해 일반적으로 쓰이는 방법으로는 손가락 끝 모세혈관에서 적은 양의 혈액을 채취하여 검사지에 혈액을 묻혀 측정을 하는 방법이 있다. 검사지, 즉 혈당 스트립에는 혈액 내 혈당과 반응하는 효소를 포함하며 이를 이용한 전기화학적 반응을 통해 혈당을 검출하게 된다. 하지만 혈당 관리를 위해 손가락 끝에서 적은 양의 혈액을 채취하기 위한 채혈 방법은 환자들에게 공포감 및 손가락 끝의 통증을 쉽게 느끼는 부작용들로 인해 꺼려지고 있다. 또한, 의학적으로도 감염의 위험이 있기 때문에 혈액 채취를 통한 혈당 측정 방법이 아닌 무 채혈 혈당 측정에 대한 연구를 오래 전부터 많은 연구진이 연구를 진행 중에 있다.

그 중 무 채혈 혈당 측정에 대표적인 방법인 소변을 이용하는 방법은, 당 측정은 스트립 기반의 뇨당 센서를 사용하여 수행될 수 있다. 그러나 뇨당 센서는 색 변화를 표준색과의 비교로 정량을 추정하는 단순한 형태의 센서로, 실제 배뇨 중의 당의 정량적 농도에 대한 정보가 부재하며 정확한 정량치 확보가 어렵다는 문제점이 있다.

일본 특허공보 특허 제 3214561호(2001.10.02.)

본 발명의 일 목적은 소변 내의 당을 제외한 다른 물질을 차단시킬 수 있는 부재를 포함하여, 소변 내의 당만을 선택적으로 측정할 수 있는 고감도 당 측정 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 당의 정량적인 측정이 가능한 고감도 당 측정 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 당을 선택적으로 측정할 수 있도록 소변 내의 당을 제외한 다른 물질을 차단시킬 수 있는 층을 포함하는 고감도 당 측정 센서의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적을 위한 고감도 당 측정 센서는 전극, 상기 전극 상에 적층되고 효소를 포함하는 활성층, 및 상기 활성층 상에 적층되고 하기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리머를 포함하는 폴리머층을 포함한다:

<구조식 1>

상기 구조식 1에서, n은 양의 정수이다.

일 실시예에 있어서, 상기 폴리머는 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 메타크릴레이트(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl polyacrylate, PDA) 및 사이클로헥실 메타크릴레이트(cyclohexyl methacrylate, CHMA)가 결합된 중합체일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 효소는 글루코스산화효소일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 활성층은 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 활성층은 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 위한 고감도 당 측정 센서의 제조 방법은 전극 상에 효소를 포함하는 활성용액을 도포하여 활성층을 형성하는 제1 단계, 용매에 개시제, 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 메타크릴레이트(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl polyacrylate, PDA) 및 사이클로헥실 메타크릴레이트(cyclohexyl methacrylate, CHMA)를 첨가하고 중합시켜 하기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리머를 합성하는 제2 단계, 및 상기 활성층 상에 상기 합성된 폴리머를 도포하여 폴리머층을 형성하는 제3 단계를 포함한다:

<구조식 1>

상기 구조식 1에서, n은 양의 정수이다.

일 실시예에 있어서, 상기 효소는 글루코스산화효소(glucose oxidase)일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 활성층은 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 활성층은 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 개시제는 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile, AIBN)일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 용매는 트리플루오로톨루엔(α,α,α-trifluorotoluene, TFT)일 수 있다.

본 발명에 따르면, 당 외의 다른 물질의 차단시킬 수 있는 폴리머층을 적용함으로써 배뇨 속의 포도당만을 선별적으로 검출할 수 있고, 검출된 당의 정량적인 측정이 가능하여 높은 정확도를 가질 수 있으며, 센서의 손상을 방지하여 센서의 수명을 연장시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 세척이 용이하여 당 측정 센서의 감염 및 오염의 위험이 적고, 반복하여 재사용할 수 있으며, 연속적인 측정을 가능하게 하여 매우 경제적이며, 보관이 매우 용이한 장점이 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 폴리머층 합성을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 활성층의 포도당 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 폴리머층을 포함하는 센서의 과산화수소(H₂O₂) 반복 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 당 측정 센서를 이용한 포도당 농도에 따른 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 당 측정 센서를 이용한 보관 기간에 따른 안정성 실험 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명은 소변 내에 존재하는 포도당(글루코스, glucose)만을 선택적으로 측정할 수 있는 전기화학적 바이오 센서인 당 측정 센서에 관한 것으로, 소변 내에 포도당을 제외한 아스코르브산(ascorbic acid), 요산(uric acid) 등과 같은 다른 물질들을 차단할 수 있는 층을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 고감도 당 측정 센서 및 이의 제조 방법은 전극, 상기 전극 상에 형성된 활성층 및 상기 활성층 상에 형성되고, 당 이외에 불순물이 전극으로 진입하는 것을 차단할 수 있는 폴리머층을 포함할 수 있다.

상기 전극은 전류를 측정할 수 있도록 전기전도성이 충분하게 확보된 물질로 형성된 것이라면, 상기 전극을 형성하는 물질의 종류에 대한 특별한 제한은 없다. 바람직하게는, 상기 전극은 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag), 구리(Cu) 등의 금속 물질, 전도성 고분자, 탄소를 포함하는 탄소 전극(흑연 전극, CNT 전극 등) 등으로 형성될 수 있다.

상기 활성층은 포도당을 산화시킬 수 있는 층으로, 상기 전극 상에 적층될 수 있다. 상기 활성층은 포도당을 산화시키기 위해 효소(Enzyem)를 포함하는 물질로 형성될 수 있으며, 예를 들면, 상기 효소는 글루코스산화효소(glucose oxidase)일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 활성층은 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)를 포함할 수 있다. 상기 글루타알데히드는 가교제(crosslinker)로써 활성층에 포함되는 효소를 상호 간 결합시켜 효소 고정화량을 극대화시킬 수 있다.

또한, 상기 활성층은 글루타알데히드와 함께 추가적으로 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질은 상기 단백질은 알부민(Bovine serum albumin, BSA), 오브알부민(ovalbumin) 등과 같은 단백질일 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 활성층은 글루타알데히드 및 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 포함할 수 있다. 상기 알부민(Bovine serum albumin, BSA)은 효소의 안정성을 증가시킬 수 있다.

상기 글루코스산화효소는 포도당이 글루콘산이 되는 반응을 촉매하는 효소로, 포도당이 글루코스산화효소에 노출되는 경우, 포도당은 글루코스산화효소에 의해 산화되어 글루콘산(gluconic acid)을 생성할 수 있다. 이 때, 산소는 높은 환원력 때문에 과산화수소(H₂O₂)로 쉽게 환원될 수 있다. 정리하면, 포도당은 글루코스산화효소와 반응하는 동안, 포도당의 산화와 산소의 환원이 동시에 일어나 글루콘산(gluconic acid)과 과산화수소(H₂O₂)를 생성할 수 있다. 일반적으로 대부분의 당 측정 센서는 반응을 통해 생성된 과산화수소(H₂O₂)의 양을 측정하거나 소모되는 산소의 양을 측정함으로써 포도당을 측정할 수 있다.

본 발명에서는 글루코스산화효소가 포도당의 반응에서 산화 및 환원 형태로 가역적으로 변화되면서 반응의 촉매 역할만 수행한 후, 다시 원상태로 회복되는 과정에서 전자의 이동을 수반한다는 점을 이용하여, 상기 전자의 이동을 통해 전하의 양을 측정함으로써 포도당을 정량화하여 측정할 수 있다.

상기 활성층은 상기 전극 상에 효소를 포함하는 활성용액을 도포함으로써 적층될 수 있다. 상기 활성용액은 겔화가 진행되고 있는 용액일 수 있다. 상기 활성용액을 이용한 활성층의 형성은 스핀 코터를 이용하여 형성할 수 있다. 그러나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 활성층의 두께는 특별히 한정하지는 않으며, 필요한 상황에 알맞은 두께로 조절할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 활성용액은 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)를 포함할 수 있다. 상기 글루타알데히드는 가교제(crosslinker)로써 활성층에 포함되는 효소의 고정화를 위해 첨가되는 것일 수 있다.

또한, 상기 글루타알데히드를 포함하는 활성용액은 추가적으로 단백질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질은 알부민(Bovine serum albumin, BSA), 오브알부민(ovalbumin) 등과 같은 물질일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 활성용액은 글루타알데히드 및 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 포함할 수 있다. 상기 알부민(Bovine serum albumin, BSA)은 효소의 안정성을 증가시키기 위해 첨가되는 것일 수 있다.

상기 폴리머층은 소변 내의 당을 제외한 모든 물질을 차단하는 역할을 하는 층으로, 상기 활성층 상에 적층될 수 있다. 상기 폴리머층은 하기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리머를 포함하여 제조될 수 있다.

<구조식 1>

상기 구조식 1에서, n은 양의 정수이다.

상기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리머는 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 메타크릴레이트(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl polyacrylate, PDA) 및 사이클로헥실 메타크릴레이트(cyclohexyl methacrylate, CHMA)를 중합시켜 제조될 수 있다.

이하에서는, 상기 폴리머의 합성 및 폴리머층의 합성을 위한 퍼플루오로데실 메타크릴레이트의 구조를 나타내는 도 1 및 2를 참조하여 더욱 자세하게 설명한다.

도 1 및 2를 참조하면, 일 실시예에서, 상기 폴리머는 용매에 개시제, 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 메타크릴레이트(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl polyacrylate, PDA) 및 사이클로헥실 메타크릴레이트(cyclohexyl methacrylate, CHMA)를 첨가하고 중합시켜 제조될 수 있다.

상기 개시제는 중합 반응의 개시제(Initiator)로, 중합하고자 하는 단량체에 라디칼을 처음 형성시킬 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들면, 상기 개시제는 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile, AIBN)일 수 있다.

상기 용매는 중합 반응을 위한 물질들을 용해시킬 수 있는 물질을 의미하며, 예를 들면, 상기 용매는 상기 용매는 트리플루오로톨루엔(α,α,α-trifluorotoluene, TFT)일 수 있다.

상기 폴리머의 중합은 폴리머 중합이 충분하게 이루어질 수 있는 조건이면 특별히 제한하지는 않으며, 일 실시예에서, 상기 중합은 6시간 동안 약 72℃에서 수행될 수 있다.

상기 폴리머층은 상기 중합된 폴리머를 유기용매에 용해시킨 용해액을 이용하여 형성될 수 있다. 상기 유기용매는 상기 중합된 폴리머를 녹일 수 있는 유기 용매이면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들어 아세톤, 알코올 등을 사용할 수 있다. 상기 폴리머층의 형성은 스핀코터를 이용하여 수행될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 상기 활성층 상에 상기 폴리머층을 코팅시킬 수 있는 방법이면 모두 가능하다.

본 발명에 따르면, 소변 내에서 당 이외의 물질이 센서 내부로 진입하는 것을 차한달 수 있는 폴리머층을 구비함으로써, 센서의 손상을 방지하며 선택적으로 당만을 검출하여 측정함으로써 높은 감도를 가진 센서를 제공할 수 있다.

이하에서, 구체적인 실시예를 통해서 본 발명의 고감도 당 측정 센서 및 이의 제조 방법에 대해서 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 일부 실시 형태에 불과한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

전극/활성층 제조

포도당을 검출하기 위한 포도당 검출 층인 활성층을 전극 상에 적층시켰다. 먼저, 글루타알데히드 (Glutaraldehyde, GA)용액과 효소(Enzyem)와 알부민(Bovine serum albumin, BSA)용액을 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 일정 시간 경과 후 상기 혼합용액이 겔(gel)-화 되는 현상을 이용하여 제작하였다. 상기 혼합용액의 제조 후, 약 1분 후에 겔-화가 진행되는 상기 혼합용액을 스핀 코터를 이용하여 전극 전면에 일정한 두께를 가지도록 도포하여 적층하였고, 그 결과 전극 상에 포도당 검출 층인 활성층이 적층된 구조물(전극/활성층)을 제조하였다.

상기에서 제조된 구조물(전극/활성층)을 이용하여 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000mg/dl의 농도를 갖는 포도당을 전기화학적 방법으로 검출하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3을 참조하면, 상기 활성층에 의해 농도에 따른 포도당 검출이 가능함을 확인할 수 있다.

전극/폴리머층 제조

소변(배뇨)속의 당을 제외한 방해물질들을 차단하기 위한 폴리머층을 전극 상에 적층시켰다. 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 메타크릴레이트(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl polyacrylate, PDA), 사이클로헥실 메타크릴레이트(cyclohexyl methacrylate, CHMA), 트리플루오로톨루엔(α,α,α-trifluorotoluene, TFT) 및 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile, AIBN)을 혼합하고, 6시간 동안 72℃에서 중합을 시켜 P(FDA-r-CHMA)를 합성하였다. 상기 합성된 P(FDA-r-CHMA)를 유기 용매로 용해시켜 스핀 코터를 이용하여 전극 전면에 도포한 후 30분 동안의 고정화를 통해, 전극 상에 P(FDA-r-CHMA)폴리머층이 적층된 구조물(전극/폴리머층)을 제조하였다.

상기에서 제조된 구조물(전극/폴리머층)을 이용하여 포도당과 글루코스산화효소(glucose oxidase)반응 후의 반응물인 과산화수소(H₂O₂)의 반복 측정 능력을 평가하였다. 그 결과를 도 4에 나타냈다.

도 4를 참조하면, 반복 측정시에도 P(FDA-r-CHMA) 폴리머층은 사라지지 않고 유지가 되는 것을 확인 하였으며, 또한 반응물인 과산화수소(H₂O₂)의 반응만 측정이 가능한 것을 확인할 수 있다.

전극/활성층/폴리머층 제조

상기에서 제조한 구조물(전극/활성층) 상에 상기 구조물(전극/폴리머층)의 제조에서 폴리머층을 적층한 공정과 동일한 공정을 수행하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 고 감도 당 측정 센서(전극/활성층/폴리머층)를 제조하였다.

상기 당 측정 센서의 선택적 포도당 검출 테스트를 위해 각각 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000mg/dl의 포도당 농도를 갖는 소변을 이용하여, 포도당 검출 능력을 테스트 하였고, 그 결과를 도 5에 나타냈다.

도 5를 참조하면, 상기 센서는 소변 내 각각의 포도당 농도에 따른 포도당을 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있다.

또한, 고 감도 당 측정 센서(전극/활성층/폴리머층)를 일반 수돗물에 7일 동안 보관함으로써 상기 센서의 보관 기간에 따른 안정성 능력을 평가하였고, 그 결과를 도 6에 나타냈다.

도 6을 참조하면, 본 발명의 센서는 7일이 지난 후에도 포도당 측정이 가능함을 확인할 수 있다.상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 전극 상에 효소를 포함하는 활성용액을 도포하여 활성층을 형성하는 제1 단계;
   트리플루오로톨루엔(α,α,α-trifluorotoluene, TFT) 용매에 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile, AIBN) 개시제, 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 메타크릴레이트(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl polyacrylate, PDA) 및 사이클로헥실 메타크릴레이트(cyclohexyl methacrylate, CHMA)를 첨가하고 6시간 동안 72℃에서 중합시켜 하기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리머를 합성하는 제2 단계; 및
   상기 활성층 상에 상기 합성된 폴리머를 도포한 후 30분 동안의 고정화를 통해 폴리머층을 형성하는 제3 단계;를 포함하고,
   상기 효소는 글루코스산화효소(glucose oxidase)이고,
   상기 활성층은 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA) 및 알부민(Bovine serum albumin , BSA)을 포함하는 것인,
   고감도 당 측정 센서의 제조 방법:
   <구조식 1>
   

   

   
   상기 구조식 1에서, n은 양의 정수이다.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

Images