KR102400211B1

KR102400211B1 - 형광단백질로 표지된 사이토크롬 p450 으로 형질전환된 인간유도 만능줄기 세포주 및 이를 이용한 ahr 조절제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102400211B1
Application number: KR1020200075214A
Authority: KR
Inventors: 박한진; 김지우; 임일균; 김혜민
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-05-19
Also published as: US20230235294A1; WO2021256668A1; KR20210157208A; CN116802272A

Abstract

본 발명은 형광단백질로 표지된 CYP1A1 단백질로 형질전환된 인간유도 만능줄기 세포주 및 이를 이용한 AHR 조절제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 사이토크롬 P450 1A1(CYP1A1) 단백질이 그 단백질 고유의 기능에 저해됨이 없이 형광단백질과 융합되어 있는 상태로 발현되도록 유전자를 편집한 인간 유도만능 줄기세포주(hiPSC line; human induced pluripotent stem cell line)를 제작하고, 상기 세포주 유래 간세포에서 세포가 살아있는 상태에서 스크리닝하여 기존의 hPH 세포나 HepG2 세포를 이용하는 경우보다 더 우수하게 AHR 조절제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명의 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주는 AHR 조절 화합물을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 으로 형질전환된 인간유도 만능줄기 세포주 및 이를 이용한 AHR 조절제 스크리닝 방법{fluorescent protein-tagged cytochrome P450 transformed human induced pluripotent stem cells and screening method of AHR regulator using the same}

본 발명은 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 으로 형질전환된 인간유도 만능줄기 세포주 및 이를 이용한 AHR 조절제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC; Human induced pluripotent stem cells) 기술은 새로운 약물 발견 및 재생 의학 분야에서 많은 가능성을 제공한다. 자기 재생(self-renewal) 및 전분화능(pluripotency)과 같은 특성을 지닌 hiPSC의 이점은 hiPSC 기반 임상 적용 및 질병 모델링의 촉진을 가능하게 해주었다. 최근에는 줄기 세포 분화 및 게놈 편집 기술의 발전 및 개선이 질병 모델링뿐만 아니라 효능 및 잠재적 독성에 대한 약물 스크리닝에서도 hiPSC 유래 세포의 사용 가능성이 입증되었다(Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., and Daley, G. Q. (2011) Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nat Rev Drug Discov 10, 915-929).

hESC 및 hiPSC 라인을 모두 지칭하는 유전자 변형된 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC; human pluripotent stem cell) 라인은 표적화된 리포터 또는 선택 가능한 마커를 포함하며, 세포 계통 결정을 수반하는 기본 메커니즘을 밝히고, 분화 프로토콜을 최적화하여 원하는 세포 유형을 도출하고, 기본 및 임상 적용을 위해 순수한 세포 집단을 분리할 수 있다. 상동 재조합 (HR; homologous recombination) 경로에 기초한 통상적인 유전자 표적화 기술을 채택하는 몇몇 초기 접근법이 hPSC에 성공적으로 사용되었다 (Zwaka, T. P., and Thomson, J. A. (2003) Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 21, 319-321). 그러나, HR의 낮은 표적화 효율(~ 1 %)은 hPSC에서의 유전자 변형이 광범위하게 적용되는 것을 방해하는 한계가 된다.

이러한 한계는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 극복될 수 있다. CRISPR-Cas9 시스템에서 유전자좌의 표적화는 표적 DNA 서열을 인식하는 20 개 염기로 구성된 가이드 RNA 및 DNA 절단에 관여하는 Cas9 단백질에 의해 매개된다. CRISPR-Cas9 시스템은 관심있는 위치에서 DNA 이중 가닥 절단(DSBs; DNA double-strand breaks)의 표적 도입을 가능하게 하여 상동 재조합 (HR; homologous recombination)을 촉진하고 표적 효율을 향상시킨다. 높은 타겟팅 효율성과 단순성으로 인해 CRISPR-Cas9 시스템은 hPSC에서 대상 리포터 라인을 빠르게(> 8 %) 생성하는 것이 가능하여졌다.

한편, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR; aryl hydrocarbon receptor)는 세포 외 신호 및 환경 리간드의 센서로서 기능할 뿐만 아니라 다양한 환경 생체 이물(xenobiotics)과 관련된 수많은 독성학적 결과를 매개하는 리간드 활성화 전사 인자이다. 2,3,7,8- 테트라 클로로 디 벤조-p-디옥신 (TCDD; 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)과 같은 리간드의 결합에서, 활성화된 AHR은 핵으로 이동하고 AHR nuclear translocator (ARNT)와 이종 이량체를 형성하여 발암 물질의 활성화에 중요한 역할을 하는 여러 사이토크롬 P450 효소의 전사 유도를 초래한다. 생화학 반응에서 AHR 활성화의 중요성은 지난 30년 동안 선택된 생체 이물(xenobiotics)에 의한 독성 효과의 매개 및 악성 종양의 개시에 관한 관심을 끌었다. 그러나 최근의 연구는 환경 생체 이물(xenobiotics)이 없는 경우에도 암 진행뿐만 아니라 생리학적 및 발달 과정에서 AHR에 대한 중요한 조절 역할을 보고하였다(Barouki, R., Coumoul, X., and Fernandez-Salguero, P. M. (2007) The aryl hydrocarbon receptor, more than a xenobiotic-interacting protein. FEBS Lett 581, 3608-3615). AHR- 결핍 마우스를 포함하는 몇몇 독립적인 연구는 내인성 리간드에 대한 반응에서 AHR 활성화가 정상적인 세포 항상성, 세포 분화 및 면역 반응에 중요한 다양한 신호 전달 경로에 관여한다는 것을 밝혀냈다. 실제로, AHR 신호 전달 경로는 T 및 B 세포뿐만 아니라 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원-제시 세포를 포함하는 면역 세포의 발달 및 분화에 관련되어 있다고 알려져 있다. 또한, 암 진행에서 AHR의 의미 및 작용 또는 길항 활성을 갖는 선택적 AHR 조절제의 치료 가능성에 대한 증거가 축적되어, AHR을 암 요법의 신규 약물 표적으로서의 가능성이 확인되었다(Kolluri, S. K., Jin, U. H., and Safe, S. (2017) Role of the aryl hydrocarbon receptor in carcinogenesis and potential as an anti-cancer drug target. Arch Toxicol 91, 2497-2513).

이에, AHR 조절제를 스크리닝할 수 있는 세포주에 대한 필요성이 대두되고 있으며, AHR 조절제를 스크리닝할 수 있는 세포주 관련 종래기술로는 AHR-반응성 프로모터의 제어하에 EGFP(Enhanced GFP)를 발현하는 마우스 간암 세포주가 보고되었다(Nagy, S R, Sanborn, J R, Hammock, B D, and Denison, M S (2002) Development of a green fluorescent protein-based cell bioassay for the rapid and inexpensive detection and characterization of ah receptor agonists Toxicol Sci 65, 200-210).

그러나, 인간의 AHR과 마우스의 AHR은 구조적 차이가 있으며, 열 충격 단백질 90(HSP90) 및 다른 보조 인자와의 상이한 상호 작용을 나타낸다. 이것은 인간 AHR에 비해 TCDD와 함께 마우스 AHR의 10 배 높은 친화성을 초래하고, 인체에의 적용에서 약물 반응의 과대 평가를 초래할 수 있다는 단점이 있다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0092898호에서는 사이토크롬 P450을 유도만능줄기세포에 도입한 형질전환 세포주를 개시하고 있으나, 이는 세포를 죽여서 그후 사이토크롬 P450을 측정하여야 하므로 정확한 데이터를 얻기가 힘들었다. 지금까지는 형광단백질을 사이토크롬 P450에 접합하여 도입한 살아있는 인간 유도만능 줄기세포를 이용하여 AHR 조절제를 선별할 수 있는 스크리닝하는 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 살아있는 세포 타입에서 live-cell 이미징을 통한 AHR(Aryl hydrocarbon receptor) 스크리닝을 수행하기 위해, 사이토크롬 P450 단백질을 코딩하는 유전자에 형광단백질 유전자를 융합하여 사이토크롬 P450 1A1 단백질이 그 단백질 고유의 기능에 저해됨이 없이 형광단백질과 융합되어 있는 상태로 발현되도록 유전자를 편집한 인간 유도만능 줄기세포주(hiPSC line; human induced pluripotent stem cell line)를 제작하고, 상기 세포주 유래 간세포에서 세포가 살아있는 상태에서 AHR 조절제를 스크리닝할 수 있음을 확인하여 본발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AHR(aryl hydrocarbon receptor) 조절하는 물질을 스크리닝하기 위하여 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 으로 형질전환된 인간유도 만능줄기 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 인간유도 만능 줄기 세포주를 이용하여 AHR 조절제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 으로 형질전환된 것을 특징으로 하는 AHR(aryl hydrocarbon receptor) 조절하는 물질 스크리닝용 인간 유도만능 줄기세포주(human induced pluripotent stem cell line; hiPSC line)를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;

2) 상기 시험물질을 접촉한 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주에서 형광단백질의 신호 세기를 측정하는 단계; 및

3) 대조구 시료와 비교하여 상기 형광단백질의 신호 세기가 변화된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 AHR 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 으로 형질전환된 인간유도 만능줄기세포주 및 이를 이용한 AHR 조절제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 사이토크롬 P450 단백질이 그 단백질 고유의 기능에 저해됨이 없이 형광단백질과 융합되어 있는 상태로 발현되도록 유전자를 편집한 인간 유도만능 줄기세포주(hiPSC line; human induced pluripotent stem cell line)를 제작하고, 상기 세포주 유래 간세포에서 세포가 살아있는 상태에서 세포독성과 암발생에 관여하는 AHR 조절제를 스크리닝할 수 있고, 기존의 hPH 세포나 HepG2 세포를 이용하는 경우보다 더 우수하게 AHR 조절제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명의 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간유도 만능줄기세포주는 AHR 조절 화합물을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주를 만들기 위해 사용한 벡터 모식도를 나타낸 도이다.
도 1b는 CYP1A1-mCherry를 녹-인하기 위해 사용된 3개의 단일-가이드 RNA(sgRNA)의 표적 위치를 나타낸 도이다.
도 1c는 3가지 sgRNA의 효율을 T7 엔도뉴클레아제 I 분석에 의해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 mCherry 녹-인 벡터가 hiPSC 세포에 형질감염되었는지 확인하기 위해 PCR 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주에서 CYP1A1과 mCherry 사이 및 PGKneo와 CYP1A1 사이의 접합 부위를 시퀀싱한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 형광면역염색법을 이용하여 NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60 및 TRA-1-81과 같은 hiPSC 표지 인자 발현 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 hiPSC를 배아 삼배엽에 해당하는 다양한 세포로 분화시킨 후, 3 개의 배엽 마커 단백질의 mRNA 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 hiPSC를 배아 삼배엽에 해당하는 다양한 세포로 분화시킨 후, 3 개의 배엽 마커 단백질 발현을 형광면역염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2d는 mCherry DNA 도입으로 인해 세포의 전체적인 염색체에 이상이 생겼는지 핵형 분석을 통해 검사한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주를 간세포로 분화시키기 위한 단계적 직접 분화 프로토콜을 나타낸 도이다.
도 4a는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포의 형태를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포에서 ALB, AAT, TDO2, HNF4A, G6Pase, TAT, TTR 및 AFP와 같은 간세포 특이적 마커 유전자의 mRNA 발현을 확인한 도이다.
도 4c는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포에서 간세포 특이적 단백질인 ALB, AAT, AFP 및 HNF4A 의 발현을 면역 세포 화학 분석으로 확인한 도이다.
도 4d는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포에서 유세포 분석법으로 알부민-발현 세포의 비율을 확인한 도이다.
도 4e는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포에서 혈장으로의 알부민 분비 수준을 확인한 도이다.
도 4f는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포에서 저밀도 지단백질(LDL)-흡수 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4g는 CYP1A1-mCherry hiPSC 세포주로부터 분화된 간세포에서 CYP1A1 유도제인 Bap 및 TCDD의 선량-반응 곡선을 나타낸 도이다.
도 5a는 CYP1A1-mCherry hiPSC로부터 분화시킨 간세포(CYP1A1-mCherry HLCs)의 0일차 및 17일차에서 CYP1A1 및 mCherry의 mRNA의 발현량을 확인한 도이다(N = 6, *** p <0.001).
도 5b는 CYP1A1 유도제의 부재 하에서 CYP1A1-mCherry hiPSC로부터 분화시킨 17일차 간세포에서 CYP1A1 및 mCherry의 공동-국소화(co-localized)되는 것을 확인한 도이다(스케일바 = 200 μm).
도 5c는 mCherry가 CYP1A1가 주로 존재하는 위치인 핵 주위 소포체(ER)에서 발현되는 것을 확인한 도이다(스케일바 = 20 μm).
도 6a는 CYP1A1-mCherry HLC에 BaP 및 TCDD 처리 후 mCherry 강도의 시간 의존적 증가를 확인한 도이다(N = 4, * p <0.05, *** p <0.001).
도 6b는 CYP1A1-mCherry HLC에 AHR 작용제인 BaP 및 TCDD을 15분 동안 처리에 의한 CYP1A1 활성을 확인한 도이다(N = 4. *** p <0.001).
도 6c는 대조군인 CYP1A1-mCherry를 도입하지 않은 hiPSC로부터 유도된 HLC 에 AHR 작용제인 BaP 및 TCDD을 15분 동안 처리에 의한 CYP1A1 활성을 확인한 도이다(N = 4. *** p <0.001).
도 7a는 CYP1A1-mCherry HLC에 AHR 작용제 (BaP 및 TCDD) 및 길항제 (CH223191)의 공동 처리한 후 mCherry 발현을 HCS 영상화 (왼쪽) 및 강도 정량화 (오른쪽)에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다(N = 4, *** p <0.001, 스케일 바 = 200 μm).
도 7b는 CYP1A1-mCherry HLC에 AHR 작용제 (BaP 및 TCDD) 및 길항제 (CH223191)의 공동 처리한 후 CYP1A1 및 mCherry의 mRNA 발현을 확인한 도이다(N = 3, ** p <0.01, *** p <0.001).
도 7c는 YP1A1-mCherry HLC에 AHR 작용제 (BaP 및 TCDD) 및 길항제 (CH223191)의 공동 처리한 후 CYP1A1의 활성 변화를 확인한 도이다(N = 2).
도 8a는 HCS(High-Content Screening) 및 CYP1A1-mCherry hiPSC 기반 스크리닝 시스템의 흐름의 개략도를 나타낸 도이다.
도 8b는 24 시간 또는 48 시간 처리된 CYP1A1-mCherry HLC에서 시판되는 라이브러리로부터 241 가지 화학 물질로 스크리닝 결과를 나타낸 도이다. 두 개의 수평선은 적중 선택에 대한 컷오프 임계값을 나타낸다(비 처리 대조군과 비교하여30 % 상향 또는 하향 조정, N = 6).
도 9a는 24 시간 또는 48 시간 처리된 CYP1A1-mCherry HLC에서 mCherry 강도가 30 % 이상 상승시키는 선별된 화학 물질 17 개의 mCherry 강도(intencity)를 나타낸 도이다(N = 6).
도 9b는 17개의 화합물과 AHR 길항제(CH223191)와 병용 처리한 후 mCherry 강도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(N = 6).
도 9c는 파파베린 하이드로클로라이드(papaverine hydrochloride), 노르디하이드로구아이아레트 산(nordihydroguaiaretic acid) 및 글라페닌(glafenine)에 대한 용량-반응 곡선을 나타낸 도이다(N = 3).
도 10a는 24 시간 또는 48 시간 처리된 CYP1A1-mCherry HLC에서 mCherry 강도가 70 % 이상 하향시키는 선별된 화학 물질 6 종의 mCherry 강도(intencity)를 나타낸 도이다(N = 6, 점선은 처리되지 않은 대조군 수준을 나타냄).
도 10b는 스크리닝 결과 선별된 CYP1A1 하향 조절 물질인 3-D02, 2-C08, 2-E05 및 2-E06으로 처리된 CYP1A1-mCherry HLC의 세포 생존력을 측정한 결과를 나타낸 도이다(N = 3).
도 10c는 CYP1A1-mCherry HLC에 공지된 AHR 길항제(CH223191 및 TMF)로 처리 및 스크리닝 결과 선별된 CYP1A1 하향 조절 물질 6 종을 처리한 결과 mCherry 강도(intencity) 변화를 확인한 도이다(N = 6).
도 10d는 스크리닝 결과 선별된 CYP1A1 하향 조절 물질 6 종과 기존에 알려진 CYP1A1 발현 감소 물질들(CH223191, TMF)과의 CYP1A1 활성도 감소량 비교한 도이다.
도 10e는 CH223191, 2-E05 및 2-E06에 의한 TCDD에 의해 유도된 mCherry의 발현 억제 효과를 확인한 도이다(스케일 바 = 200 μm).
도 11은 hiPSC-HLC, hPH 및 HepG2 세포를 주성분 분석으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 유전자 온톨로지 및 KEGG-경로 분석을 통한 hiPSC-HLC(a), hPH(b), HepG2(c)의 상위 25 개의 기능적 주석을 나타낸 도로, 빨간색 별표는 약물 대사 및 BaP 관련 용어를 나타낸다(세로 회색 선은 p 값 = 0.05를 나타냄).
도 13a는 KEGG 경로: hsa00980 에서 유전자의 평균 z-점수를 나타낸 도이다. BaP 처리는 hiPSC-HLC 및 hPH에서 관련 유전자 발현을 증가시켰고, HepG2 세포에서 동일하게 감소시켰다.
도 13b는 HepG2, hiPSCHLC 및 hPH에서 BaP 처리에 의한 AHR-반응성 유전자 유도에 대한 히트 맵을 나타낸 도이다. BaP 처리는 hiPSC-HLC 및 hPH에서 모든 AHR-반응성 유전자를 증가시켰다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 AHR(aryl hydrocarbon receptor) 조절하는 물질 스크리닝용 인간 유도만능 줄기세포주(human induced pluripotent stem cell line; hiPSC line)를 제공한다.

본 발명에 있어서 "유도만능 줄기세포"는 배아줄기세포처럼 오랜 기간 배양될 수 있고, 다양한 체세포로 분화될 수 있으며, 이 중 약물대사 및 효능·독성 검사에 중요하게 이용되는 신경세포, 간세포, 심장세포 등이 포함된다.

상기 인간 유도만능 줄기세포주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 14186BP로 기탁되었다.

상기 인간 유도만능 줄기세포는 인간 피부 섬유 아세포 유래 유도만능 줄기세포일 수 있다.

상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(DsRed)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 적생형광단백질(DsRed)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 mCherry 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서 "사이토크롬 P450 단백질(cytochrome P450, CYP)"는 약물, 발암원 및 환경적 오염원 같은 외래물질과 스테로이드, 지방산 및 비타민과 같은 내부 기질의 산화를 촉진하는 헴(heme)단백질의 일원으로, 간을 포함하여 신장, 장관 및 폐와 같은 기관에서 다양한 아형이 발견되었다. 약물 산화대사의 약 80%를 담당하고 있는 슈퍼패밀리 CYP 효소는 인체에서만 현재 11가지의 패밀리가 알려져 있는데, 이 중 약물대사에는 1~4가지 패밀리가 관여하고 있으며, 30가지 이상의 동효소(isozymes)가 알려져 있다. AHR에 의해 조절되는 것으로 알려진 CYP 동효소는 CYP1A1, CYP1A2 및 CYP1B1 세 가지가 있다.

상기 사이토크롬 P450은 CYP1A1, CYP1A2 및 CYP1B1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 CYP1A1이다. CYP1A2는 통상 체내의 성숙한 성인의 간에서만 발현되는 것으로 알려져 있고, 줄기세포에서 분화시킨 세포에서는 발현이 거의 되지 않아 스크리닝용으로 적합하지 않으며, CYP1B1은 간세포보다 혈액세포 등에서 발현량이 높은 것으로 알려져 있어 약물의 효능이나 독성 시험에는 적합하지 아니하다.

본 발명에서 용어, "형질전환(transfection)"은 배양동물세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법으로서, 일반적으로 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 방법을 사용한다. 상기 형질전환은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 그 예로 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법, 전기천공법, 재분포법 등이 있다.

상기 표적화 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 표적화 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 표적화 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 상기 표적화 벡터는 pMCDT-A 벡터를 이용하여 형질감염하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 인간 유도만능 줄기세포주는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 유전자를 표적으로 하는 sgRNA로 형광단백질을 삽입한 벡터로 형질감염하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 섬유 아세포 유래 인간 유도만능 줄기세포에 형광단백질을 사이토크롬 P450 유전자좌에 녹-인되도록 표적화 벡터를 설계하고, 3개의 단일-가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 표적화 벡터를 제조하여 인간 유도만능 줄기세포주에 형질감염시켜 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주 클론을 확립하였다(도 1 참조). 상기 확립된 형질전환 인간 유도만능 줄기세포주가 인간 유도만능 줄기세포의 특성을 유지하는지 확인한 결과, 인간 유도만능 줄기세포에서 전분화능 마커들인 NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60 및 TRA-1-81 마커가 정상적으로 발현되는 것을 확인하였으며(도 2a 참조), EB 형성 분석을 통해 3개의 배엽으로의 세포 분화 가능성을 확인하였다(도 2b 및 도 2c 참조). 또한, 제조된 형질전환 인간 유도만능 줄기세포주의 핵형 분석 결과, 핵형이 정상임을 확인하였다(도 2d 참조).

따라서, 본 발명의 실시예에서 제조된 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주가 인간 유도만능 줄기세포의 특성을 그대로 유지하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 실시예에서 제조된 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주로부터 분화된 간세포의 기능을 확인한 결과, 간세포 특이적 마커 유전자의 mRNA 발현 증가 및 단백질 발현 증가를 확인하였으며(도 4a 내지 도 4c), 알부민 양성 간세포가 96% 이상이고, 알부민 분비 검출 및 저밀도 지단백질-흡수 분석을 통해 간세포로 성공적으로 분화하였음을 확인하였다(도 4d 내지 도 4g).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 실시예에서 제조된 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주로부터 분화된 간세포에서 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질 발현을 확인한 결과, 형광단백질과 사이토크롬 P450 이 유사한 수준으로 발현되고, 동일한 위치에서 발현됨을 확인하였다(도 5 참조).

본 발명자들은 형광단백질의 신호가 AHR 작용제에 의해 유도될 수 있는지 확인한 결과, 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주로부터 분화된 간세포에 공지된 AHR 작용제를 처리한 경우, 형광단백질의 강도는 사이토크롬 P450의 활성에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주로부터 분화된 간세포가 AHR 조절제 스크리닝에 이용될 수 있음을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;

상기 단계 3)의 대조구 시료는 BaP 또는 TCDD인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 AHR 조절제 스크리닝 방법은 대량분석시스템(High Content Screening; HCS)에서 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 제조된 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주로부터 유도한 간세포를 이용하여 HCS (High-Content Screening) 장치를 사용한 자동 분석 프로토콜을 설정한 후 AHR 조절제를 스크리닝한 결과, 형광단백질 발현을 증가시키는 화합물 3 종과 형광 단백질 발현을 감소시키는 화합물 2종을 선별하였다(도 8 내지 도 10 참조).

또한, 본 발명자들은 제조된 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주 유래 간세포와 hPH 및 HepG2 세포주의 비교한 결과, 제조된 형광단백질로 표지된 사이토크롬 P450 단백질로 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주 유래 간세포가 살아있는 세포를 이용할 수 있어, hPH 및 HepG2 세포보다 AHR 스크리닝 방법에 더 우수하다는 것을 확인하였다(도 11 내지 도 13 참조).

현재 상업적으로 사용가능한 AHR 리포터 세포주는 주로, 간암 세포인 HepG2 및 결직장 선암종 HT29 세포와 같은 몇몇 악성 세포주에서 CYP1A1 프로모터의 제어 하에 루시퍼라제 리포터 시스템에 기초한다. HepG2 세포에 BaP처리는 바람직하지 않은 유전자의 상승 및 경로 활성화를 야기한다. hPH(human primary hepatocytes cells)는 BaP에 대한 반응 측면에서 우수한 효과를 보여 주나, 세포가 더 이상 분열하지 않아 세포 공급이 한정적이다. 이에 반해, 본 발명의 형질전환된 인간 유도만능 줄기세포주 유래 간세포는 향후 세포 분화 가능성이 있는 세포 공급 및 다양한 세포 유형을 제공할 수 있는 유도만능 줄기세포 자체의 장점을 그대로 갖는다.

루시퍼라제-기반 AHR 리포터 인간 유도만능 줄기세포주(hiPSC)도 보고되었지만 (Smith, B W, Stanford, E A, Sherr, D H, and Murphy, G J (2016) Genome Editing of the CYP1A1 Locus in iPSCs as a Platform to Map AHR Expression throughout Human Development Stem Cells Int 2016, 2574152), 루시퍼라제 리포터 시스템은 AHR 활성을 조사하기 위해 세포의 희생을 수반하는 반면, 본 발명의 리포터 시스템은 CYP1A1-mCherry의 형광 수준을 통해 살아있는 세포에서 AHR 활성을 나타내는 장점이 있다. 결과적으로 이를 통해, 약물의 농도 뿐 만 아니라 동일 세포에서 약물 처리 시간의 경과에 따른 반응 동역학(kinetics)을 추적할 수 있어 약물의 기전을 파악하는 데 추가적인 정보를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 인간유도 만능줄기 세포의 배양 및 간세포로의 분화

인간 피부 섬유 아세포 유래 인간유도 만능줄기 세포(hiPSC)를 녹-인 실험 및 대조군 인간유도 만능줄기 세포(hiPSC)로서 사용하였다.

먼저 인간 피부 섬유 아세포 유래 인간유도 만능줄기 세포를 Vitronectin XF™(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) 를 함유하는 mTeSR-E8 배지에서 유지시키고 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)에서 0.5 mM EDTA를 사용하여 3일 또는 4일마다 해리시켰다.

상기 배양된 hiPSC를 간세포로 분화시키기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, hiPSC를 Matrigel®(Corning, Tewksbury, MA, USA) 코팅 접시에 플레이팅하고 1일 동안 mTeSR ™-E8 ™(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다. 내배엽 (DE; Definitive endoderm)분화를 위해, hiPSC를 0.5 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA), 2 % B27(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 50ng/ml 액티빈 A(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 1 mM 부티르산 나트륨(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 을 함유하는 RPMI-1640에서 1일 동안 배양하였고, 그런 다음, 부티르산 나르튬의 농도가 감소된 동일한 배지에서 4일 동안 세포 배양을 계속하였다. 다음으로, 5 일 동안 0.5 mg/ml BSA, 2 % B27, 10 ng/ml 섬유 모세포 성장 인자(FGF4; fibroblast growth factor 4, Peprotech) 및 10 ng/ml 간세포 성장 인자(HGF; hepatocyte growth factor, Peprotech) 를 함유하는 RPMI-1640에서 배양함으로써 DE 세포를 간 내배엽 세포로 분화시켰다. 간 성숙은 7일 동안 10 ng/ml의 FGF4, 10 n /ml HGF, 10 ng/ml 온코스타틴 M(Peprotech) 및 0.1 μM 덱사메타손 (Sigma-Aldrich)이 보충된 간세포 배양 배지(HCM; Lonza, Basel, Switzerland) 에서 세포를 배양함으로써 유도되었다. 배양 배지는 매일 교체하였다.

배상체(EB; embryoid body) 형성을 위해, CYP1A1-mCherry hiPSC를 0.5 mM EDTA와 해리하고, AggreWell ™ 800 플레이트 (Stem Cell Technologies)에 시딩하였다. 다음날, 세포 응집물을 mTeSR ™ -E8 ™ 배지에서 저부착 플레이트로 옮기고 7일 동안 배양하였다. 형성된 배상체를 분석 전에 추가로 7일 동안 Matrigel®-코팅된 플레이트에서 배양하였다.

인간 일차 간세포(Corning, Donor No. 303)를 제조사의 지시에 따라 Gentest™High Viability CryoHepatocyte Recovery kit (Corning)를 사용하여 콜라겐 I- 코팅된 배양 플레이트에 플레이팅하고, 24 시간 후에 실험을 수행하였다. HepG2 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS; Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 Eagle 's Minimum Essential Medium (EMEM; 프랑스 Nuaille, Biowest)에서 배양하였다.

2. CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 mCherry 녹-인

인간 코돈-최적화된 SpCas9 및 키메라 가이드 RNA 발현 플라스미드(pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9; Addgene, Watertown, MA, USA)를 사용하여 벡터 구축을 표적화하는데 사용하였다. 표적 유전자의 인트론 부위에서 온라인 CRISPR 설계 도구 (http://crispr.mit.edu)를 사용하여 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 구축하였다. 가장 낮은 표적 외 효과를 사용하여 sgRNA를 선택하였다. 3개의 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 표적 서열은 하기 표 1에 나타내었다. Zhang 실험실의 표적 서열 클로닝 프로토콜에 따라 다음의 실험을 수행하였다.

Locus	sgRNA	Score	Target site		PCR analysis colony	동결	서열번호
E6-E7_intron	Guide #1	78	GCATTGATCCTCCTGTCCAT	GGG	6 /13	5	1
E4-E5_intron	Guide #4-2	73	TAGGTAGTGGCTCCCTTCAA	AGG	12 /29	9	2
E4-E5_intron	Guide #5_Reverse	73	CTGGCACTGACCCCTTTGAA	GGG	4 /9	3	3

pMCDT-A 벡터를 표적화 벡터의 골격으로 사용하였다. 인간 CYP1A1 유전자는 hiPSC로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되었다. 5 '및 3' homologous arms는 각각 CYP1A1에서 정지 코돈의 1.2kb 상류 및 0.93kb 하류를 표적으로 하였다. mCherry 및 PGKneo는 이들을 함유하는 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 서열 확인 후 T4 DNA 리가제(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 각 단편을 결찰하였다. 5 ' homologous arms, mCherry, PGKneo 및 3' homologous arms을 각각 SmaI, HindIII 및 SalI를 사용하여 결찰시켰다. 생성된 최종 단편을 NotI 및 XhoI를 사용하여 pMCDT-A 벡터에 삽입하였다.

형질 감염을 위해, 계대 28에서의 hiPSC를 DPBS에서 0.5 mM EDTA와의 해리시켜 단일 세포(2.5 x 10⁷ 세포/ml)로서 제조하였다. 4 ㎍의 표적화 벡터 및 1 ㎍의 Cas9 벡터를 세포 현탁액에 첨가하고 NEON®(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 형질 감염 시스템을 사용하여 1600 V, 20 ms, 1 펄스 조건 하에서 전기 천공시켰다. 전기 천공 후, 세포를 Matrigel®-코팅된 48-웰 플레이트에 웰당 1,000 개의 살아있는 세포로 시딩하였다. 세포를 48 시간 동안 확장시킨 후 2 주 동안 50 μg/ml 게네티신(G418 sulfate, Gibco)으로 선택하였다. 그런 다음, 약물 내성 클론을 수동으로 선택하여 확장 및 추가 실험을 수행하였다. 본 발명의 분석을 위해, 29 내지 40의 계대에서 CYP1A1-mCherry hiPSC를 사용하였다.

3. CYP1A1-mCherry hiPSC 라인의 특성 분석

게놈 표적화 효율을 확인하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 T7 엔도뉴클레아제 I 분석을 수행하였다.

구체적으로, G-spin ™Total Genomic DNA Extraction Kit (Intron Biotechnology, Gyeonggi, Korea)를 사용하여 sgRNA가 있거나 sgRNA가 없이 형질 감염된 hiPSC로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 이어서, sgRNA 결합 부위를 포함하는 500 bp 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. MEGAquick-spin ™Plus Total Fragment DNA 정제 키트 (Intron Biotechnology)를 사용하여 PCR 산물을 정제한 후, 산물을 변성 및 어닐링한 다음 T7 엔도뉴클레아제 I (NEB, Ipswich, MA, USA)로 분해시켰다. 분해된 DNA 단편은 아가로스겔 전기 영동으로 분석하였다. 녹-인(kcock-in)은 표적화 된 통합 부위의 PCR 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. G-DEX 게놈 DNA 추출 키트 (Intron Biotechnology)를 사용하여 약물 내성 클론에서 게놈 DNA를 분리하고, 표 2에 나열된 프라이머를 사용하여 EX Taq®중합 효소(Takara Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 50ng의 분리된 DNA를 증폭시켰다.

CYP1A1-mCherry hiPSC의 핵형을 분석하기 위하여, 20개의 단일 클론에 대하여 550의 밴드 분해능으로 G-밴딩 핵형 분석(GenDix, Seoul, Korea)을 수행하였다.

프라이머명	서열(5'→3')	서열번호
CYP1A1 forward	AGGCTTTTACATCCCCAAGG	4
CYP1A1 reverse	TTGTCGATAGCACCATCAGG	5
mCherry forward	GTGAGCACTTCCAAATGCAGC	6
mCherry reverse	CCTTGAAGCGCATGAACTCCT	7
PAX6 forward	GTGTCCAACGGATGTGTGAG	8
PAX6 reverse	CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC	9
OTX2 forward	TGCAGGGGTTCTTCTGTGAT	10
OTX2 reverse	AGGGTCAGAGCAATTGACCA	11
α-SMA forward	TGCTCTGGGTTCGTCAGAGTC	12
α-SMA reverse	CAGGCAAGTCACTGTGTGGC	13
EOMES forward	AGGCGCAAATAACAACAACAC	14
EOMES reverse	ATTCAAGTCCTCCACGCCATC	15
Brachyury forward	GCGGGAAAGAGCCTGCAGTA	16
Brachyury reverse	TTCCCCGTTCACGTACTTCC	17
FOXA2 forward	ATGCACTCGGCTTCCAGTAT	18
FOXA2 reverse	CACGTACGACGACATGTTCA	19
GATA4 forward	TCCAAACCAGAAAACGGAAG	20
GATA4 reverse	CTGTGCCCGTAGTGAGATGA	21
SOX17 forward	CAGAATCCAGACCTGCACAA	22
SOX17 reverse	GCGGCCGGTACTTGTAGTT	23
ALB forward	GAGACCAGAGGTTGATGTGATG	24
ALB reverse	AGTTCCGGGGCATAAAAGTAAG	25
AAT forward	GAAGTCAAGGACACCGAGGA	26
AAT reverse	GCTGGCAGACCTTCTGTCTT	27
TDO2 forward	CAAATCCTCTGGGAGTTGGA	28
TDO2 reverse	GTCCAAGGCTGTCATCGTCT	29
HNF4A forward	CGAGCAGATCCAGTTCATCA	30
HNF4A reverse	TCACACATCTGTCCGTTGCT	31
G6Pase forward	TCAACCTCGTCTTTAAGTGGATTCT	32
G6Pase reverse	AGTATACACCTGCTGTGCCC	33
TAT forward	GCTTCCTCAAGTCCAATGCT	34
TAT reverse	CTGTGATGACCACTCGGATG	35
TTR forward	ACCGGTGAATCCAAGTGTCC	36
TTR reverse	GGTTTTCCCAGAGGCAAATGG	37
AFP forward	AGCTTGGTGGTGGATGAA	38
AFP reverse	TCTGCAATGACAGCCTCAAG	39

4. 유세포 분석(Flow cytometry)

CYP1A1-mCherry hiPSC 유래 HLC를 0.5 mM EDTA로 해리시키고, 10 % FBS를 함유하는 DPBS로 세척하였다. 해리된 세포를 고정하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 Foxp3 고정/투과 용액 (eBioscience, San Diego, CA, USA)으로 투과시킨 후, 1 μg의 마우스 항-ALB 1차 항체 (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음 얼음상에서 1시간 동안 플루오레세인이 접합된 이차 항체로 표지하였다. FACSCalibur ™유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석을 수행하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.

5. 간 기능 검사(Hepatic functional tests)

효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)의 경우, 배지를 교체하고 24 시간 후 배양 상청액을 수집하고 분비된 알부민의 양을 제조사의 프로토콜에 따라 휴먼 알부민 ELISA 정량 키트 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)를 사용하여 측정하였다. 분비된 알부민의 양은 독립적인 배양 접시로부터 100 ㎕의 배양 상청액을 사용하여 측정하고, 각 표준 곡선에 따라 계산한 후 단백질 함량으로 정규화하였다. 단백질 함량은 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정하였다. 아세틸화된 저밀도 지단백질(Ac-LDL; acetylated-low density lipoprotein) 흡수 분석을 위해, 세포를 10 μg/ml 1, 1'-다이옥타데실-3, 3, 3', 3'-테트라메틸인도카르보시아닌-표지된 Ac-LDL(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)과 함께 5시간 동안 배양하였다. 적색 형광은 형광 현미경으로 시각화하였다.

6. 면역세포화학 분석

세포를 실온에서 30 분 동안 4 % 포름 알데히드 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 고정시킨 후, 0.1 % 트윈 20 (PBST)을 함유하는 PBS에서 10 분 동안 3 회 세척하였다. 이어서, 샘플을 0.1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS에서 15 분 동안 투과시키고, 4 % 정상 염소 혈청 serum (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)을 RT에서 1시간 동안 차단시켰다. 세포를 4 % 정상 양 혈청 (SOX17의 경우) 또는 정상 염소 혈청 (기타의 경우)을 함유하는 PBS에 희석한 다음 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다 : 토끼 항-CYP1A1 (1:200; Abcam, Cambridge, UK), 마우스 항-mCherry (1:200), 토끼 항-AAT (1:200), 마우스 항 -HNF4A (1:200; Abcam), 토끼 항-ALB (1:50), 토끼 항-AFP (1:200; Dako, Glostrup, Denmark), 토끼 항-OCT4 (1:400), 토끼 항-NANOG (1:400; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 마우스 항-SOX2 (1:50; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 마우스 항-TRA-1-60 (1:100), 마우스 항-TRA-1-81 (1:100), 마우스 항-Nestin (1:200), 토끼 항-Desmin (1:50; Millipore, Burlington, MA, USA), 마우스 항-SMA (1:500; Sigma-Aldrich), 염소 항-SOX17 (1:50; R & D Systems) 및 토끼 항-TUBB3 (1:1000; BioLegend, San Diego, CA, USA). 세포를 각각 10 분 동안 PBST에서 6 회 세척하고, 세포를 다음과 같이 PBST에 희석된 적절한 이차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다 : Alexa Fluor 488, 594 염소 항-마우스 IgG, Alexa Fluor 594 염소 항-토끼 IgG 또는 Alexa Fluor 488 닭 항 염소 IgG (1:200; Thermo Fisher Scientific). 그런 다음, 세포를 PBST로 세척하고 핵의 시각화를 위해 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 4'-6-diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich)로 염색했다. 소포체(ER)는 제조사의 프로토콜에 따라 ER Tracker ™Green (Invitrogen)을 사용하여 표시하였다.

7. Ethoxyresorufin-O-deetylase (EROD) 분석

CYP1A1 활성을 측정하기 위해, 세포를 처리하기 전에 무 혈청 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 7.5, 15, 30 및 60 분 동안 HBSS에서 억제제 10 μM 디쿠마롤(dicumarol)의 존재 또는 부재하에 7.5 μM 에톡시레소루핀(ethoxyresorufin)으로 처리하고, 100 μl의 배지를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 제거하였다. 제거된 배지에 동량(100 ㎕)의 빙냉 아세토니트릴-메탄올을 첨가한 후, 4 ℃에서 5 분 동안 16,000 Х g에서 짧게 볼텍싱 및 원심분리하였다. 상청액을 하기 분석에 사용하였다. 대사체 레조루핀(resorufin)의 수준을 Luna C18 컬럼 (4.6 Х 150 mm, 5 μm; Phenomenex, Seoul, Korea)을 갖는 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)로 측정하였다. 이동상은 20 mM 포스페이트 완충제-메탄올-아세토 니트릴 (52:45:3, v/v/v)로 구성되었고, 유속은 0.8 ml/분이었다. 여기에 대해서는 560 nm, 방출에 대해서는 585 nm의 파장에서 형광 측정을 수행하였다. BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정된 전체 세포 단백질 함량에 의해 정규화된 레조루핀(resorufin)에 대한 표준 곡선을 사용하여 농도를 계산하였다.

8. 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR)

NucleoZOL 시약 (Macherey-Nagel, Duren, Germany)을 사용하여 각 샘플로부터 총 RNA를 분리하고 제조사의 프로토콜에 따라 GoScript ™역전사 믹스 (Promega)를 사용하여 역전사하였다. RT-qPCR은 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)로 수행되었다. 각 샘플에 대해 3 중 PCR 증폭을 수행 하였다. PCR 결과는 글리세르 알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)로 정규화 한 후 대조군 세포와 비교하여 상대적 배수 변화로 표현하였다.△Ct(S△Ct값은 GAPDH에 대해 얻어진 Ct 값과 표적 유전자의 차이로 계산하였다. 대조군 세포의 △Ct값을 대조군 △Ct(C△Ct)값으로 사용하였다. 상대 유전자 발현 수준은 화학식 2- (S△Ct-C△Ct)를 사용하여 결정되었다. 상기 실험에 사용된 프라이머는 표 2에 나타냈다.

9. 화학물 처리 및 고용량 스크리닝(HCS; High-content screening)

HCS를 수행하기 위하여, 10 일째 분화된 세포를 해리시키고, Matrigel®-코팅된 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 성숙을 위해 배양하였다. 분화가 완료된 다음 24 시간 후, 세포를 간독성 라이브러리 (SCREEN-WELL® Hepatotoxicity library; Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) 및 핵 수용체 리간드(SCREEN-WELL® Nuclear Receptor Ligands Library; Enzo Life Sciences)를 포함하는 241 가지 화학 물질 및 양성 대조군으로서 AHR 작용제 (2,3,7,8- 테트라클로로디벤조-p-디옥신 (TCDD) 및 벤조[a]피렌 (BaP))을 24 시간 및 48시간 동안 처리하였다. 비히클 대조군(vehicle control)으로서 DMSO를 사용하였다. 살아있는 세포 핵의 염색을 위해, 세포를 2 μg/ml Hoechst 33342 (Life Technologies)에서 10 분 동안 배양하였다. 염색된 세포는 ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System (Molecular Devices, San Jose, CA, USA)을 사용하여 이미지화하였다. 획득된 이미지는 공개된 방법에 따라 MetaXpress High-Content Image Acquisition and Analysis Software (Molecular Devices)를 사용하여 분석하였다. 분석은 먼저 Hoechst 염색을 사용하여 세포를 식별하고 CYP1A1 발현을 측정하기 위해 mCherry 강도를 검출하였다. 스크리닝에 사용된 모든 화학 물질 농도는 TCDD (10 nM), BaP (1 μM) 및 H01 (3- 메틸콜란트렌; 1 μM)을 제외하고 10 μM이었다.

10. 선량-반응 곡선(Dose-response curve)

선량-반응 곡선을 측정하기 위해, 샘플을 TCDD, BaP, 파파베린 하이드로클로라이드, 노르디하이드로구아레트 산 및 글라페닌과 함께 24시간 동안 개별 농도(0.1, 1, 10, 및 50 μM 농도의 TCDD와 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 및 100 μM 농도의 다른 화합물)로 배양하였다. RNA 추출을 위해 세포를 준비한 후, 상기 절차에 따라 CYP1A1 mRNA 발현에 대한 RT-qPCR 분석을 수행하였다. 최소-제곱 피팅 방법으로 GraphPad Prism 5 (GraphPad, SanDiego, CA, USA)를 사용하여 선량-반응 곡선을 작성하였다. 세포 사멸로 인한 낮은 RNA 농도 (<50 μg/ml)를 갖는 샘플은 회수하였다.

11. 세포 생존력 분석

세포 생존력을 분석하기 위해, 세포 생존력 분석 수행 전에 표적 화학 물질 (10 μM)을 24 시간 동안 처리하였다. 이어서, 100 ㎕의 배지에 대한 10 ㎕의 세포 계수 키트-8(Dojindo, Kumamoto, Japan)을 첨가하고, 2시간 동안 배양하였다. iMark ™마이크로 플레이트 흡광도 판독기 (Bio-Rad)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 다음 공식을 사용하여 계산하였다:

12. 마이크로 어레이 분석

마이크로 어레이 분석을 위해, hiPSC- 유래 간세포, 및 1 μM BaP 처리가 있거나 없는 HepG2 및 인간 1 차 간세포(hPH; human primary hepatocytes)의 중복된 총 RNA 샘플을 TRIzol 시약을 사용하여 제조하였다. 마이크로 어레이 분석은 서비스 제공 업체(eBiogen, Seoul, Korea)에 의해 Agilent Human GE 4 X 44 V2 칩 (Agilent, Santa Clara, USA)을 사용하여 수행되었다.

유전자 온톨로지 및 KEGG 경로 분석은 유전자 온톨로지(Biological process, Molecular function, and Cellular components) 및 KEGG 경로의 선택과 함께 DAVID를 사용하여 수행하였다. 주성분 분석(PCA), 평균 Z-점수 계산, R-제곱 및 상관도를 수행하고, R (v.3.6.1)을 사용하여 시각화하였다.

13. 통계 분석 및 시각화

RT-qPCR, CYP1A1 활성 및 mCherry 측정에 관한 그래프 시각화 및 통계 분석은 GraphPad Prism 5 및 Microsoft Excel (Redmond, WA, USA)을 사용하여 수행하였다. 화학 구조는 MarvinSketch (v20.6; ChemAxon, Budapest, Hungary)를 사용하여 그렸다.

<실시예 1> CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 mCherry 녹-인 벡터의 제조

hiPSC에서 AHR 활성의 라이브 모니터링 시스템을 확립하기 위해 AHR에 의해 전사적으로 조절되는 CYP1A1을 표적화하였다. 형광 마커 삽입의 표적 외 효과를 최소화하기 위해, <실험방법> 2.에 기재된 방법으로 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 표적 유전자 좌에서 HR-매개 녹-인을 유도하였다. 정상적인 섬유 아세포에서 유래한 사전 확립된 hiPSC에서 mCherry를 CYP1A1 유전자좌에 녹-인되도록 표적화 벡터를 설계하였다(도 1a). mCherry cDNA를 정지 코돈의 결실과 함께 CYP1A1의 마지막 엑손의 끝에 삽입하였다. 포스포 글리세레이트 키나제 (PGK)-네오 및 디프테리아 독소 A (DT-A)를 각각 양성 및 음성 선택을 위한 표적화 벡터에 포함시켰다. 3개의 단일-가이드 RNA(sgRNA)가 엑손 4 - 엑손 5 (E4-E5) 또는 엑손 6 - 엑손 7 (E6-E7) 인트론을 표적으로 하도록 지정하였다(도 1b). sgRNA의 효율은 T7 엔도뉴클레아제 I 분석에 의해 조사하였고, 모든 sgRNA는 효과적으로 DNA의 절단을 유도하여 50 % 초과의 인델을 생성하였음을 확인하였다(도 1c).

Cas9 및 개별 sgRNA를 함유하는 표적화 벡터로 hiPSC를 형질감염시켰다. 양성 선별을 위해, 형질감염된 hiPSC를 G418로 처리한 후 단일 세포 클론 확장이 이어졌다. 클론 확장 동안 증식 세포에서 표적 유전자좌의 변형은 도 1a에 제시된 프라이머 세트를 갖는 PCR로 확인하였다(도 1d). 지정된 부위에서 카세트의 통합을 확인하기 위해, CYP1A1과 mCherry 사이 및 PGKneo와 CYP1A1 사이의 접합 부위를 시퀀싱한 결과를 도 1e에 나타내었다(도 1 e).

상기와 같은 실험 결과, mCherry-융합 CYP1A1을 발현하는 hiPSC 라인의 6 개의 클론(# 1-2, # 1-7, # 1-8, # 1-9, # 4-13 및 # 5-2)을 확립하였으며, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 14186BP 로 기탁하였다.

<실험예 1> CYP1A1-mCherry hiPSC이 hiPSC의 특성 유지하는지 여부 확인

CYP1A1-mCherry hiPSC이 hiPSC의 특성 유지하는지 여부 확인을 위한 실험에 사용할 라인으로 #1-8 라인을 선택하였다. CRISPR-Cas9-매개 유전자 편집이 hiPSC의 특성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, <실험방법> 3.에 기재된 방법으로 CYP1A1-mCherry hiPSC에서 전분화능 및 게놈 안정성 특성을 조사하였다.

그 결과 도 2a에 나타난 바와 같이, NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60 및 TRA-1-81과 같은 전분화능 마커는 # 1-8 라인에서 발현되었다(도 2a). 3 개의 배엽으로의 세포 분화 가능성은 EB 형성 분석을 통해 확인하였다. EB는 mRNA(도 2b) 및 단백질(도 2c) 수준에서 3 개의 배엽 마커를 모두 발현시켰다. 또한, CYP1A1-mCherry hiPSC의 핵형을 확인한 결과, hiPSC의 핵형은 정상임을 확인하였다(도 2d).

상기와 같은 결과를 통해, CRISPR-Cas9 시스템에 의해 유도된 mCherry 녹-인 과정이 CYP1A1-mCherry hiPSC 의 전분화능에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

<실험예 2> CYP1A1-mCherry hiPSC로부터 분화된 간세포의 기능 확인

CYP1A1 및 그것의 상류 조절자(upstream regulator)인 아릴 탄화수소 수용체(AHR; Aryl hydrocarbon receptor)는 간에서 단계 I 생체이물(xenobiotic) 및 약물 대사에 관여한다. CYP1A1-mCherry hiPSC 라인은 간세포 분화를 통한 화합물 및 약물 스크리닝에 사용될 수 있을 것으로 예측하여 도 3에 나타낸 단계적 직접 분화 프로토콜에 의해 CYP1A1-mCherry hiPSC 을 간세포로 분화시켰다(도 3). 그런 다음, <실험방법> 4, 5 및 6의 방법으로 분화된 간세포의 기능을 확인하였다.

먼저, 세포의 형태를 관찰한 결과 도 4a에 나타난 바와 같이, 분화의 각 단계에서 다음과 같이 변경되었다: 5일에 결정적인 내배엽, 10일에 간 전구체 및 17일에 간세포(도 4a).

ALB, AAT, TDO2, HNF4A, G6Pase, TAT, TTR 및 AFP와 같은 간세포 특이적 마커 유전자의 전사 발현은 분화와 함께 증가함을 확인하였다(도 4b).

면역 세포 화학 분석 결과 도 4c에 나타난 바와 같이, 분화된 간세포에서 간세포 특이적 단백질인 ALB, AAT, AFP 및 HNF4A 의 발현을 확인하였다(도 4c).

또한, 알부민-발현 세포의 비율을 <실험방법> 4의 유세포 분석법으로 조사하였고, 17 일째에 세포의 96 % 이상이 알부민 양성 HLC임을 확인하였다(도 4d).

분화된 HLC의 기능은 혈장으로의 알부민 분비의 검출(도 4e) 및 저밀도 지단백질 (LDL)-흡수 분석 (도 4f)에 의해 확인되었다.

알려진 CYP1A1 유도제 (benzo [a] pyrene (BaP) 및 TCDD)의 선량-반응 곡선은 분화된 HLC가 이들 화학 물질에 의해 다른 모델과 유사한 약물 반응을 나타냄을 나타낸 것이다(도 4g).

상기와 같은 결과를 통해, CYP1A1-mCherry hiPSC 라인은 필수 간 마커와 기능을 정상적으로 표현하여 HLC로 성공적으로 분화된 것임을 확인할 수 있다.

<실험예 3> CYP1A1-mCherry hiPSC로부터 분화된 간세포에서의 CYP1A1-mCherry 융합 단백질의 발현 확인

CYP1A1-mCherry hiPSC로부터 분화된 간세포(CYP1A1-mCherry HLCs)에서 CYP1A1과 mCherry의 결합과 발현을 확인했다.

CYP1A1 및 mCherry의 mRNA는 유사한 수준으로 발현되었고 (도 5a), CYP1A1 유도제의 부재 하에 17일차 CYP1A1-mCherry hiPSC로부터 분화된 HLC에서 CYP1A1 및 mCherry가 공동-국소화(co-localized)됨을 확인하였다(도 5b). 또한, mCherry는 CYP1A1가 주로 존재하는 위치인 핵 주위 소포체(ER)에서 발현됨을 확인하였다(도 5c).

다음으로, 본 발명자들은 mCherry 신호가 AHR 작용제에 의해 유도될 수 있는지 확인하기 위해, 분화된 CYP1A1-mCherry HLC를 공지된 AHR 작용제인 BaP 및 TCDD로 처리하였다.

그 결과, CYP1A1-mCherry HLC에서 AHR 작용제로 처리한 경우 mCherry의 강도(intensity)가 증가됨을 확인하였다 (도 6a). 또한, BaP- 및 TCDD- 처리된 CYP1A1-mCherry HLC에서 CYP1A1의 활성 증가를 나타냈으며(도 6b), 이는 대조군 hiPSC- 유도된 HLC와 유사함을 확인하였다(도 6c).

CYP1A1의 유도가 AHR에 의해 매개되는지 여부를 확인하기 위해, CYP1A1-mCherry 간세포에서 BaP 및 TCDD와 AHR 길항제인 CH223191을 병용처리하였다.

그 결과, CH223191은 BaP- 및 TCDD- 처리된 그룹 모두에서 mCherry의 강도를 유의하게 억제 하였다(도 7a). CYP1A1 및 mCherry 전사 발현 수준은 CH223191 처리에 의해 감소되었다(도 7b). 또한 CH223191와 BaP 또는 TCDD를 병용처리하면 CYP1A1 활성이 감소하였다(도 7c).

이 결과는 본 발명의 CYP1A1-mCherry hiPSC 유도 HLCs가 AHR-CYP1A1 축의 약물 검사에 사용될 수 있음을 나타냈다.

<실험예 4> CYP1A1-mCherry 간세포를 이용한 간독성 화학 물질 스크리닝

스크리닝을 위해 HCS (High-Content Screening) 장치를 사용한 자동 분석 프로토콜을 설정하였다(도 8a). 이 모듈을 사용하여 24시간 또는 48시간 처리된 CYP1A1-mCherry HLC에서 양성 대조군으로서 BaP 및 TCDD뿐만 아니라 간독성 제제(210 개 화합물) 및 핵 수용체 조절제(29 개 화합물)용 상용 라이브러리를 포함하여 총 241 가지 화학 물질을 선별하였다(도 8b).

4-1. mCherry 발현을 증가시키는 화합 물질의 선별

mCherry 발현을 증가시키는 화합 물질을 선별한 결과, 먼저 처리되지 않은 대조군보다 mCherry 강도가 30 % 이상 상승시키는 화학 물질 17 종을 선별하였다(도 9a). 그 중에서 10 종의 화합물은 CYP1A1 또는 AHR을 직간접적으로 유도하는 약물로 알려져 있었고, 다른 7 종의 화합물은 현재까지 AHR 또는 CYP1A1의 잠재적 활성화제로서 알려져 있지 않았다.

육안으로 세포의 사멸이 감지되지 않았음에도 불구하고, 검출된 mCherry 신호 강도의 상향 조절은 세포 사멸 또는 다른 이유로 야기된 자가 형광일 수 있다. 따라서, 17 종의 화합물과 CYP1A1-조절제 및 AHR 길항제와 병용 처리하여 mCherry 활성을 측정하였다. 대부분의 CYP1A1-조절제 및 AHR의 길항제인 CH223191의 병용 처리는 CYP1A1-mCherry HLC에서 mCherry 강도를 감소시킴을 확인하였다(도 9b).

확인된 AHR 조절제 후보물질 중에서, 파파베린 하이드로클로라이드(papaverine hydrochloride), 노르디하이드로구아이아레트 산(nordihydroguaiaretic acid) 및 글라페닌(glafenine)은 CH223191 노출에 의한 mCherry 강도의 측면에서 유의한 차이를 나타냈다. 이들 화학 물질의 영향을 선량에 따라 확인하였다(도 9c). 파파베린 하이드로클로라이드(papaverine hydrochloride)와 글라페닌(glafenine)은 스크리닝에 사용된 농도에서 6 ~ 7 배 증가와 최대 유도를 보였다. 노르디하이드로구아이아레트 산(nordihydroguaiaretic acid)은 다른 두 화학 물질보다 낮은 효과(~ 2 배)를 나타냈다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명자는 mCherry 기반 HCS에 의해 3 종의 새로운 AHR 발현을 억제하는 AHR 작용제를 선별하였다.

4-2. mCherry 발현을 감소시키는 화합 물질의 선별

mCherry 발현을 감소시키는 화합 물질을 선별한 결과, 먼저 처리되지 않은 대조군보다 mCherry 강도가 70 % 이상 하향시키는 화학 물질 6 종을 선별하였다(도 10a). 이들 화학 물질 중 어느 것도 HR 길항제 또는 CYP1A1 억제제로 보고된 바 없었다.

CYP1A1의 감소가 해당 화학 물질의 간독성으로 인한 것인지 여부를 검증하기 위해, 해당 화합물 처리 후 <실험방법> 11.에 기재된 방법으로 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, 이들 화합물 중 어느 것도 작업 농도(working comcentration, 10 μM)로 세포 사멸을 유도하지 않았다(도 10b).

TCDD, 3-D02, 2-E05, 2-E06 및 2-C08에 대한 공지된 AHR 길항제의 억제 효과를 비교한 결과, CH223191 및 TMF와 비교하여 mCherry 강도의 현저한 감소를 나타냈다(도 10c). 특히, 2-E05(yangonin) 및 2-E06(desmethoxyyangonin)은 CYP1A1-mCherry HLC에서 세포 사멸없이 비 처리 대조군 및 CH223191 처리 수준으로 CYP1A1 활성 및 mCherry 발현에 대한 TCDD의 효과를 억제함을 확인하였다(도 10d 및 도 10e).

<실험예 4-1>에서 확인된 17 종의 CYP1A1 발현 증가 물질과 상기 두 가지 화학 물질을 병용 처리한 결과, CYP1A1 발현 수준 감소를 나타냄을 확인하였다(도 10f). 또한, CH223191 및 TMF와의 비교는 스크리닝에 의해 확인된 TCDD 및 다른 상향 조절제의 상향 조절 효과를 억제하는 동등한 능력을 보여주었다.

상기와 같은 결과를 통해, CYP1A1-mCherry hiPSC 라인을 사용하여 CYP1A1 발현을 조절하는 새로운 화학 물질을 선별할 수 있으며, HCS 시스템에서 선별한 화합물의 유용성을 입증하였다.

<실험예 5> CYP1A1-mCherry 간세포와 hPH 및 HepG2 세포주의 비교

라이브 스크리닝의 장점에도 불구하고, hiPSC- 유래 HLC의 미성숙은 간독성 시험 결과의 신뢰성에 대한 문제를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 hiPSC-HLC를 hPH 및 간독성 시험에 가장 일반적으로 사용되는 HepG2 세포와 비교하였다. 이들 사이의 세포 유사성을 조사하기 위해, BaP 처리가 있거나 없는 hiPSC 유래 HLC, hPH 및 HepG2 세포의 전사체 프로파일을 마이크로 어레이로 분석하였다.

그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 주성분 분석(PCA; Principle component analysis)에서 세 가지 세포 유형이 전체적으로 뚜렷한 세포 특성을 보였으며, 처리 그룹이 아닌 세포 유형별로 그룹화되었다. 주성분(PC) 1 및 2는 일반적인 세포 과정에 관여하는 유전자를 포함하는 반면, 주성분(PC) 3은 3 가지 세포 유형에서 약물 대사와 관련된 유전자를 포함하였다(도 11).

BaP 처리에 의해 상향 조절된 상위 100 개의 유전자를 포함하는 유전자 온톨로지를 기반 기능 주석 분석 및 KEGG 경로 조사 결과, hiPSC-HLC 및 hPH에서 약물 대사 효소 관련 용어가 풍부해진 반면, HepG2 세포에서는 약물 대사 관련 용어가 증가되지 않는 것으로 나타났다(p < 0.05) (도 12a 내지 도 12c). 사이토크롬 P450 (KEGG- 경로: hsa00980)에 의한 이종 생물학의 대사에 포함된 유전자는 hiPSC-HLC 및 hPH에서 BaP 처리에 고도로 발현되고 반응하였다. 그러나, 이들 유전자는 HepG2 세포에서 BaP 처리 후 감소된 발현을 나타냈다(도 13a). 특히, 모든 AHR-반응성 유전자 (CYP1A1, CYP1A2 및 CYP1B1)는 hiPSC-HLC 및 hPH에서의 BaP 처리에 의해 향상되었으며, CYP1A2 및 CYP1B1은 HepG2에서의 BaP 처리에 의해 유도되지 않았다(도 13b).

상기와 같은 결과는 hiPSC-HLC가 hPH에 훨씬 더 가까우며, HepG2 세포보다 약물 대사 및 독성 시험에 대한 더 우수한 세포 모델을 나타낸다는 것을 의미한다.

<110> Korea Institute of Toxicology <120> fluorescent protein-tagged cytochrome P450 transformed human induced pluripotent stem cells and screening method of AHR regulator using the same <130> 2020P-05-018 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA 1 <400> 1 gcattgatcc tcctgtccat ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA 4 <400> 2 taggtagtgg ctcccttcaa agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA 5 <400> 3 ctggcactga cccctttgaa ggg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP1A1 forward <400> 4 aggcttttac atccccaagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP1A1 reverse <400> 5 ttgtcgatag caccatcagg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry forward <400> 6 gtgagcactt ccaaatgcag c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry reverse <400> 7 ccttgaagcg catgaactcc t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6 forward <400> 8 gtgtccaacg gatgtgtgag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6 reverse <400> 9 ctagccaggt tgcgaagaac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2 forward <400> 10 tgcaggggtt cttctgtgat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2 reverse <400> 11 agggtcagag caattgacca 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha SMA forward <400> 12 tgctctgggt tcgtcagagt c 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha SMA reverse <400> 13 caggcaagtc actgtgtggc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EOMES forward <400> 14 aggcgcaaat aacaacaaca c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EOMES reverse <400> 15 attcaagtcc tccacgccat c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury forward <400> 16 gcgggaaaga gcctgcagta 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury reverse <400> 17 ttccccgttc acgtacttcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2 forward <400> 18 atgcactcgg cttccagtat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2 reverse <400> 19 cacgtacgac gacatgttca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4 forward <400> 20 tccaaaccag aaaacggaag 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4 reverse <400> 21 ctgtgcccgt agtgagatga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17 forward <400> 22 cagaatccag acctgcacaa 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17 reverse <400> 23 gcggccggta cttgtagtt 19 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB forward <400> 24 gagaccagag gttgatgtga tg 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB reverse <400> 25 agttccgggg cataaaagta ag 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT forward <400> 26 gaagtcaagg acaccgagga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT reverse <400> 27 gctggcagac cttctgtctt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDO2 forward <400> 28 caaatcctct gggagttgga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDO2 reverse <400> 29 gtccaaggct gtcatcgtct 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A forward <400> 30 cgagcagatc cagttcatca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A reverse <400> 31 tcacacatct gtccgttgct 20 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6Pase forward <400> 32 tcaacctcgt ctttaagtgg attct 25 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6Pase reverse <400> 33 agtatacacc tgctgtgccc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT forward <400> 34 gcttcctcaa gtccaatgct 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT reverse <400> 35 ctgtgatgac cactcggatg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTR forward <400> 36 accggtgaat ccaagtgtcc 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTR reverse <400> 37 ggttttccca gaggcaaatg g 21 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP forward <400> 38 agcttggtgg tggatgaa 18 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP reverse <400> 39 tctgcaatga cagcctcaag 20

Claims

형광단백질이 융합된 사이토크롬 P450 (cytochrome P450)이 발현되도록 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 유전자를 표적으로 하는 단일가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 표적화 벡터로 형질감염되고, 수탁번호 KCTC 14186BP로 기탁된 것을 특징으로 하는, AHR(aryl hydrocarbon receptor) 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주(human induced pluripotent stem cell line; hiPSC line).
삭제
제1항에 있어서,
상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(DsRed)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주.
제1항에 있어서,
상기 형광단백질은 mCherry인 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주.
제1항에 있어서,
상기 사이토크롬 P450은 CYP1A1, CYP1A2 및 CYP1B1로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 인간 유도만능 줄기 세포 주는 표적화 벡터로 pMCDT-A 벡터를 이용하여 형질감염하여 제조된 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주.
제1항에 있어서,
상기 인간 유도만능 줄기 세포 주는 NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60 및 TRA-1-81 마커가 발현되는 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주.
제1항에 있어서,
상기 인간 유도만능 줄기 세포 주는 삼배엽으로 분화시 Pax6, Otx2, alpha-SMA, EOMES, Brachyury, FOXA2, GATA4 및 Sox17이 발현되는 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝용 인간 유도만능 줄기 세포 주.
1) 제1항의 인간 유도만능 줄기 세포 주(human induced pluripotent stem cell line; hiPSC line)에 시험물질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 시험물질을 접촉한 인간 유도만능 줄기 세포 주에서 발현된 형광단백질의 신호 세기를 측정하는 단계; 및
3) 대조구 시료와 비교하여 상기 형광단백질의 신호 세기가 변화된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 3)의 대조구 시료는 BaP 또는 TCDD인 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝 방법.
제10항에 있어서,
상기 스크리닝 방법은 대량분석시스템(High Content Screening; HCS)으로 수행하는 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝 방법.
제12항에 있어서,
상기 스크리닝 방법은 세포가 살아있는 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AHR 조절제는 파파베린 하이드로클로라이드(papaverine hydrochloride), 노르디하이드로구아이아레트 산(nordihydroguaiaretic acid), 글라페닌(glafenine), 양오닌(yangonin) 및 데스메톡시양오닌(desmethoxyyangonin)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, AHR 조절제 스크리닝 방법.