JP6063383B2 - インビトロでの肝臓への分化 - Google Patents
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Description
肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:
(i)人工多能性幹(iPS)細胞の集団を提供するステップ;
(ii)前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体(anterior definitive)内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記内胚葉誘導培地は、
以下の性質を持つ所定の化学培地である:
線維芽細胞成長因子活性を有し、
SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路、並びにSMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激し、並びに
ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)を阻害する)
(iii)ADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である)。
(iv)前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地(肝臓性細胞へと成熟させる培地)中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。
4ng/mlのFGF2を添加したKnockout(KS)培地;
Knockoutダルベッコ改変イーグル培地(KO−DMEM)(添加物として、 20%の血清置換物、1%の非必須アミノ酸、1mMのL−グルタミン、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、及び4ng/ml〜10ng/mlのヒトFGF2); 並びに
DMEM/F12(添加物として、20%のKnockout血清置換物(KSR)、 6ng/mlのFGF2(PeproTech)、1mMのL−Gln、100μMの非必須アミノ酸、100μMの2−メルカプトエタノール、50U/mlのペニシリン及び50mg/mlのストレプトマイシン)。
(i)SMAD1、SMAD2、SMAD3、及びSMAD5が介するシグナリング経路を刺激する;
(ii)ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)を阻害する;及び
(iii)線維芽細胞成長因子(FGF)活性を有する。
(a)iPSC(iPS細胞)の集団を内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば12〜36時間、好ましくは約24時間培養するステップ;
(b)更に、前記集団を、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β阻害剤が存在しない内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば12〜36時間、好ましくは約24時間培養するステップ;並びに
(c)更に、前記集団を、ADE誘導培地中で培養するステップであって、該培地は、SMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激し、線維芽細胞成長因子活性を有し、例えば12〜36時間、好ましくは約24時間培養し、前方胚体内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ。
上述したように、ds−iPS細胞の集団をインビトロで肝臓へ分化することを誘導するステップ。
これにより、病理を有する肝細胞の集団を生成するステップ。
上述したように生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。
上述の方法によって生成される肝細胞の集団を、試験化合物に接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する試験化合物の効果、及び/又は、試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。
上述した方法で生成された(病気の表現型を示す)肝細胞の集団を、試験化合物と接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップ。
hiPSC派生物及び培養物
倫理的な承認と患者の同意を適切に得た後、8mmの皮膚パンチの生体検査材料を、Addenbrooke病院のボランティア患者から得た(Ethics ref number 08/H0311/201; R&D No: A091485)。標準化された屋内(in house)プロトコルを用いて、GMP条件で、提供された組織から線維芽細胞を生成した。そして、標準的な線維芽細胞培養培地中で増殖させた。更なる線維芽細胞サンプルをINSERM(フランス)及びCoriell Biorepositoryから得た。全部で5つの異なる病気サンプルを、7人の異なる患者から得た。詳細を表1に示す。モロニーマウス白血病ウイルス由来のベクター(該ベクターは、4種類のヒト遺伝子Oct−4、Sox2、c−Myc及びKlf4のうち1つのコーディング配列をそれぞれ含有する)と、対応するウィルス性粒子とをVectalys社(Toulouse, フランス)が生成した。そして、感染効率(multiple of infectivity)を10にして、線維芽細胞に感染させるために使用した。これらの技術については、山中氏及び共同研究者が当初記載した通りであり、また、本発明者が近年記載したとおりである[29]。一旦誘導されると、hiPSCは、放射状マウス供給物(feeders)を含有するプレート上で、そして、標準的なhESC培養条件(Knockout [KSR], (Gibco) + FGF2 (4ng/ml; R&D systems Inc., ミネアポリス))で培養される。
hiPSC、又はこれらから分化した前駆細胞は、4%パラホルムアルデヒド中で、20分間、4℃で固定した。その後、PBSで3回洗浄した。10%のロバ血清(Serotec Ltd.)を含有するPBS中で、20分間室温で細胞をインキュベートした。続いて、1%のロバ血清を含有するPBS中で希釈した一次抗体を用いて一晩4℃でインキュベートした。用いた抗体(及び希釈率)は下記の通り:Oct−4 (1:100; Abcam ab18976 [ケンブリッジ, U.K.] Sox2 (1:100; Abcam ab15830), Brachyury (1:100; Abcam ab20680 or R&D systems Inc.), Sox17 (R&D systems Inc.), foxA2 (1:50; Abcam ab5074), GATA4 (1:250; Santa Cruz Biotechnology Inc.), GATA6 (1:200; Abcam ab22600 or Santa Cruz Biotechnology Inc.), CXCR4 (1:100; R&D systems Inc. 又は BD Pharmingen), CK18 (1:50, Dako) CK19 (1:50, Dako), アルブミン (1:100; R&D1455 ), α−フェトプロテイン (1:300, Dako A008 ), α1−アンチトリプシン (1:100, Sigma A0608)。その後細胞はPBSで三回洗浄した。そして、以下の物と結合したTexas Red又はフルオレセインイソチオシアネート結合抗体を用いて2時間室温でインキュベートした:マウス IgG (Sigma−Aldrich; 1%のロバ血清を含有したPBSで1:200で希釈)、又はウサギ IgG (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME; ロバ血清を含有したPBSで1:400で希釈) 又はヤギ IgG (Jackson Laboratory;ロバ血清を含有したPBSで1:400で希釈)。結合しなかった二次抗体は、PBSで三回洗浄して除去した。Hoechst 33258を最初の洗浄液に添加した(Sigma−Aldrich; 1:10,000)。脂質を視覚化するために、脂質特異的な染色であるBODIPY (ボロン−ジピロメテン; BODIPY(登録商標) 493/503 Invitrogen.D−3922)を用いた。
hiPSCは、移植する直前に回収した。約106個の細胞を、8週齢のC.B.−17/GbmsTac−scidbgDFN7雄マウス(Taconic M&B, ejby, Denmark)の精嚢(testicular capsule)の下に接種した。該マウスは、ケージに入れ、温度を20℃−24℃、50%の室内湿度、14時間と10時間との明暗サイクル、適宜飼料と水を与えて、維持した。60日後にマウスを犠牲にし、接種をした精巣をレーザーブレードで均等な切片にカットした。材料を4%中性緩衝性のホルムアルデヒドで一晩固定し、アルコールからキシレンへの一連の段階処理を通して脱水化した。前記組織をパラフィン中に包埋し、5μmの連続切片とした。その後、H&E染色を行い、特徴について分析した。ヒト由来のエリアを選択するに当たっては、蛍光性のin situ ハイブリダイゼーションによって確認した(ヒト−特異的なプローブ, CEP XY; Vysis Inc.,Downers Grove, IL)。実験は、動物実験に関する地域委員会(Regional Committee for Animal Experimentation )(Stockholm,スウェーデン; Dnr N107/06)からの許可の下行った。
hiPSCは、10cmディッシュ上でコンフルエントになるまで増殖させた。その後、ディッシュを回収し、中期スプレッド(metaphase spread)を、ケンブリッジ大学病院細胞遺伝学診断用研究室によって得た。
hiPSCは、5mg/mlのコラゲナーゼIV/ディスパーゼ(0.1%, Gibco)(比率1:1 (v/v))の混合液を用いて継代した。その後、過去の文献に記載の通り([16])、CDM−PVA中でウシ胎児血清(FBS)で予め被覆したプレート上に、又はヒト・フィブロネクチンで予め被覆したプレート内に移した。その翌日の間(For the first following day)、細胞は、CDM−PVA中で以下の物を添加して増殖させた:CHIR99021 (3 μM, Stemgent), LY294002 (10 μM, Calbiochem), アクチビン (100 ng/ml, R&D systems), FGF2 (40 ng/ml, R&D systems)、及びBMP4 (10 ng/ml,R&D systems)。そして、hiPSCから原始線条様の細胞への分化を誘導した。翌日、得られた細胞は、CDM−PVA中で以下の物を添加して増殖させた:LY294002 (10 μM, Calbiochem), アクチビン (100 ng/ml), FGF2 (40 ng/ml, R&D systems)、及びBMP4 (10 ng/ml, R&D systems)。そして、決定的な内胚葉への分化を誘導した。3日目には、基礎培地をRPMI(Gibco 1640)に変更し、アクチビン(100 ng/ml, R&D systems),FGF2(40 ng/ml, R&D systems)及びB27を添加した。そして、前方胚体内胚葉細胞(ADE)を得た。その後、肝臓性内胚葉を誘導するために、RPMI(Gibco 1640)(添加物として、アクチビン(50 ng/ml, R&D systems))の存在下でADE細胞を5日間培養した。最後に、得られた肝臓性前駆細胞を成熟させるために、細胞を、CMRL/Hepatozyme(Invitrogen)基礎培地(添加物として、HGF(20μg/ml, PeproTech)及びオンコスタチン−M(10μg/ml,R&D))中で増殖させた。
アルブミン陽性細胞を検出するため、肝細胞分化プロトコルの最後で、接着細胞をPBSで二回洗浄した。細胞分離バッファ(Invitrogen, Carlsbad, CA)中37℃で20分間インキュベートした。細胞は、穏やかにピペッティングすることによって分離した。そして、約0.1〜1×105細胞/mLの密度で、PBS+3%正常ヤギ血清(NGS)(含有物として、0.1%アジド(Serotec Ltd., Oxford, U.K.)及び0.1%Triton−X)中で再懸濁した。その後、一次マウス抗ヒトアルブミン抗体(R&D 1455;100分の1に希釈)、又はマウスIgGアイソタイプ コントロール(BD Pharmingen)で、細胞を40分間4℃でインキュベートした。そして、細胞を、FACS Calibur machine(BD Biosciences, San Jose, California, USA)で分析した。アルブミン陽性細胞の数は、3つの独立した実験からの平均値として記録した。
dhiPSC由来の肝細胞を6ウェルプレート中で増殖させ、セルスクレイパーで回収した。そして、ボール・ベアリング・ホモジェナイザーを繰り返し通すことによって機械的に破壊した。細胞懸濁液を5分間(4℃)かつ3000Gで遠心した。上澄みを、希釈して、最終濃度35%のOptiPrep液とし、新たな遠心管に移した。前記上澄みの上に、2mlの30%OptiPrepと、1mlの0%OptiPrepを慎重に連続して層を重ね、遠心管を2時間(4℃)70,000Gで回転させた。2つの下層の間に形成された液体中間層を、注意深く吸引して、再度、45分間(4℃)100,000Gで回転させた。形成された連続ペレットを50μlの緩衝剤で再懸濁した。そして、ミクロソーム・画分としてラベルした。エンドグリコシダーゼH[EC 3.2.1.96, グリコペプチド−D−マンノシル−N4−(N−アセチル−D−グルコサミニル)2−アスパラギン 1,4−N−アセチル−b−グルコサミノヒドロラーゼ]で消化するため、ミクロソーム細胞画分は、500ユニットのEndoH酵素(Boehringher Mannheim, Mannheim, Germany)で、3時間37℃で消化した。そして、後述の通り分析を行った。
サンプル30μlを、10μlの4xローディング・バッファ(含有物として、10%(v/v)β−メルカプトエタノール及び4%(w/v) SDS)と混合し、8%(w/v)のアクリルアミドSDS−PAGEで分析した。ウェスタンブロット分析を行うため、200mAで2時間、前記蛋白質を、前記ゲルから、イモビロンPメンブレン(Millipore Corp., Bedford, MA)へとブロット(トランスファー)した。ブロット用のバッファーには、20%(v/v)メタノールを加えた。ブロット後、メンブレンをPBT(PBSに0.1%(v/v)のTween 20をプラスした物)で洗浄した。更に、PBTに5%(w/v)の乾燥スキムミルク粉末を添加した物を用いて、一晩ブロッキングを行った。翌日、前記メンブレンを、PBTミルク中で1:10,000で希釈した抗−α1−アンチトリプシン抗体で1時間インキュベートした。PBTで5分間の洗浄を6回行った。次に、PBTミルク中1:100,000で希釈した抗マウスIgG−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抗体で1時間インキュベートした。メンブレンについては、PBTでの5分間の洗浄と、PBSでの15分間の洗浄とを更に6回行った。その後、ECL Super Signal West Femto maximum sensitivity substrate(Pierce)を使用し、メンブレンをフィルムに曝して現像作業を行った。
α1−アンチトリプシンに対するアフィニティ精製ウサギポリクローナル抗体(Abcam 31657, ケンブリッジ, UK)を、炭酸/重炭酸バッファ(Na2CO3/NaHCO3、pH 9.5)中2μg/mlの濃度で用いて、高結合表面COSTAR96ウェルプレート(Corning, NY, USA)を一晩コーティングした。洗浄(0.9% w/v NaCl, 0.05% v/v Tween 20)後、ブロッキング・バッファ(PBS, 0.25% w/v BSA,0.05% v/v Tween 20)で、前記プレートを2時間ブロッキングした。サンプルとしては:培養培地;又は、50μlのNonidet溶解バッファ(150mM NaCl, 50mM トリス−Cl, pH 7.5, 1% (v/v) Nonidet P−40)で溶解させた細胞;、及び標準液(血漿精製したM型又はZ型のα1−アンチトリプシン)を用いた。そして、これらをブロッキングバッファで希釈し、各ウェルに50μl加えて、2時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、9C5又は2C1モノクローナル抗体(1μg/ml、ブロッキングバッファで希釈)のいずれかで2時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体は、ウサギ抗−マウスIgG HRPラベル抗体(Sigma Aldrich, Haverhill, UK, 1:20,000)を1時間用いて検出した。TMB液体基質(Sigma Aldrich, Haverhill, UK)を用いて10分間暗所で反応を進め、該反応を1MのH2SO4で停止させた。Thermo−max microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)を用いて、450nmの波長で吸光度を測定した。プロテオソーム・ブロッキング・アッセイを行うため、細胞は、回収する前に16時間(一晩)、6ウェルプレート中で増殖させ、10,000分の1に希釈したMG132(AG Scientific, USA)を培養培地に添加した。コントロール・サンプルには、等しい体積量のPBSを加えた。
細胞培養培地は24時間にわたって収集し、ケンブリッジ大学病院生物化学診断用研究室(ラボ)にて、屋内用ヒトアルブミン特異的ELISAキット(BioSupply UK)を用いて、トリプリケートで分析を行った。値は、培養培地1mlの100万個の細胞あたりのngとして表した。
Cyp3A4活性アッセイについては、P450−Gloアッセイキット(Promega)を製造業者の指示に従って使用して、トリプリケートで行った。そして、シトクローム活性は、P450−GloMax 96マイクロプレート・ルミノメーターを使用して分析した。
製造業者の指示のガイダンスの下、キット(Sigma 395B − 1KT)を使用して、トリプリケートで細胞に対してPAS染色を行った。続いてジアスターゼ消化を行い、陽性染色の原因がグリコーゲンの存在であることを確かめた。
細胞を0.9%NaCl溶液で短時間リンスし、温度4℃で4%グルタルアルデヒドで2時間固定した。そして、固定したプレートから、細胞をかきとり、0.1MのPIPESでリンスすることによって再懸濁した。分析はTEMで行った。
Dil−LDL染色キットを提供元から(Stoughton,MA)から購入した。アッセイは、提供元の指示に従って行った。FACS分析は、FH病特有のhiPSC肝細胞中のDil取込と、コントロール(HepG2細胞)中のDil取込とを比べて行った。
細胞は、過去の文献に記載されているように[16]、APOA−II−GFPレンチウイルスベクターを用いて形質転換し、顕微鏡で検証を行った。
dhiPSC由来の肝細胞は、無血清の高グルコースDMEM培地で6時間培養した(培地への添加物として、2mMのL−グルタミン、100U/lのペニシリン、100ug/mlのストレプトマイシン、及び0.5%のウシ血清アルブミン(全て、Sigma−Aldrichより入手)を添加した)。細胞を、100nMのグルカゴン23塩酸(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)又はPBS(Sigma−Aldrich)(ネガティブ・コントロールとして)で刺激した。刺激して0、1、2、3時間後に、RNeasy Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用してトータルRNAを回収した。そして、製造業者のガイドラインに従って精製した。逆転写については、製造業者のガイドラインに従って、1ugのRNAに対して、25μlの反応混合物中で行った。反応混合物は、200Uのモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、500ngのランダムプライマー、及び0.5mMのデオキシヌクレオチド三燐酸(全て、Promega(Wisconsin, MA)から入手)を含有する。cDNAについては、以下の物を用いてリアルタイム定量PCRを行った:ABI7900 detection システム (Applied Biosystems, Foster City, CA);Taqman PCR Mastermix (Applied Biosystems)、及び遺伝子特異的なフォワード及びリバースプライマー、並びに蛍光発生プローブ。全ての結果については、ヒト36B4を参照遺伝子として標準化させた。PEPCK(Hs00159918_m1)、G6P(Hs00609178_m1)、及びIGFBP1(Hs00426285_m1)に関するプライマー及びプローブは、Applied Biosystemsから、予め製造済みのストックとして購入した。36B4に関するオリゴヌクレオチドは、本発明者側で設計し、Sigma−Aldrich社が合成した(フォワード 5’−GCAGATCCGCATGTCCCTT−3’; リバース, 5’−TGTTTTCCAGGTGCCCTCG−3’; プローブ, 5’−[JOEE]AGGCTGTGGTGCTGATG[TAMRA]−3’)。
A1ATD−hiPSCについては、上記説明の通りである。
2×106のhiPSCをZFN発現ベクター及びドナー・テンプレートでコトランスフェクトした。そして、トランスフェクションから4日後、ピューロマイシン選択(1μg・ml-1)を開始した。トランスポゾンを除去するため、標的細胞にpCMV−yPBase(Yusa, K., et al PNAS U S A 108, 1531−1536 (2011))をトランスフェクトし、4日間培養した。そして、別の培養環境に移し、250nMの1−(2−デオキシ−2−フルオロ−β−D−アラビノフラノシル)−5−インドウラシル (FIAU)で、セレクションをかけた。コロニー形成能力を増加させるために、分離する4時間前、且つプレートにまいて24時間後に、細胞をROCK阻害剤26、Y−27632(10μM)で、処理を行った。得られたコロニーを2週間後に拾い、PCRで分析し、更にサザンブロット分析で確認を行った。
全てのマウスは、感染源のない屋内に収容した。動物を使った研究については、パスツール研究所の動物実験に関する委員会、及びフランス農務省の承認を得た。分化した細胞(50μlのDMEM中5×105細胞/動物)を、3〜4週齢のALB−uPA+/+;Rag2−/−;Il2rg−/−マウス(n=7)の脾臓に注射した。組織学的分析を行うために移植から2週間後にレシピエント・マウスを犠牲にした。血液サンプルを収集し、血漿中のヒトアルブミンの定量をELISA(Bethy Laboratories)で行った。ヒトアルブミン(Dako)又はヒトA1AT(Dako)特異的な抗体を用いて免疫蛍光を行うことにより凍結肝臓切片を分析した。移植を行っていないマウスをコントロールとして用いた。
罹患した患者からのhiPSC由来肝細胞の5例については、関連する病気で見られる細胞病理の鍵となる特徴(例えば、ミスフォールドされた突然変異体α1−アンチトリプシンが小胞体に蓄積すること;LDL受容体を介したコレステロール取り込みの欠損;、並びに細胞脂質及びグリコーゲン蓄積の上昇)を再現することに成功した。hiPSCが、成人細胞における種々の範囲の遺伝性疾患のモデルとして使用できることを示したのは、これらのデータが初めてである。
ある範囲のIMDを有する7人の個体及び3人の健常なコントロールからの皮膚生検試料から皮膚の線維芽細胞を得た(20個のhiPSC株、7人の患者、5種類の病気、表1参照)。Yamanakaらによって開発された4種類の因子を用いたアプローチ([13])を用いて、これらの体細胞を多能性幹細胞へと再プログラムした。hiPSC誘導の成功率は、個体ごとに0.01%〜0.1%の範囲で極端に変動した。このことは、異なる年齢及び性別の患者から得た皮膚の線維芽細胞において再プログラムする能力が変動することがあること裏付ける。可能である場合には、同一の個体から生じた株の間で存在する分化能力の保存された多様性を決定するために、更なる分析を目的として、1個体につき3つのhiPSC株を連続して用いた。得られたhiPSC株のライブラリ(10人の個体からの20種類の株)は、以下の事柄で特徴づけた:これらの株の形態、多能性マーカーの発現、三胚葉への誘導物をインビボ及びインビトロで形成する能力、正常の核型、並びに内因性及び外因性の多能性遺伝子の発現プロファイル。
近年、本発明者らは、ヒトES及び正常hiPSCを肝細胞に分化させるための確実性の高いプロトコルを開発した([16])。本発明の培養システムは、患者特有のhiPSC用いて使用するのに最も適した、新規な分化方法の基礎を提供する。本発明者らの主要な目的は、幅広い数のhiPSC株を肝細胞へ効果的に分化させることができる簡潔な方法を開発することであった。健常な個体に由来するhiPSC株(n=6;2つの異なる被験体)、及びα1−アンチトリプシン欠損を有する個体に由来するhiPSC株(n=6;3つの異なる患者)を使用して、広い範囲の培養条件で経験則的にスクリーニングを行った。
肝臓病をインビトロでモデリングするための、本発明者らのアプローチの有効性については、病気特有のhiPSC(dhiPSC)由来の肝細胞が、該肝細胞の由来元となった病気の鍵となる特徴を再現できるかどうかを調べることで評価した。本発明者らは、まずα1−アンチトリプシン欠損dhiPSCに着目した。これまでの研究によれば、Z型の対立遺伝子(Glu342Lys)の結果として、ER内に保持されるα1−アンチトリプシンが秩序だったポリマー形態で形成されることが示されている([17])。これらのポリマーは、肝細胞内に蓄積し、ヘテロ接合体を、新生児の肝炎、肝硬変及び肝臓細胞の癌へとかかりやすくさせる([18])。こうしたα1−アンチトリプシン・ポリマー化の経路は、臨床上の表現型の中心的なものとなる([17])。そこで、本発明者らは、2C1ポリマー特異的モノクローナル抗体([30])を使用し、α1−アンチトリプシン欠損型のdhiPSC由来の肝細胞内でのポリマーを検出した。ポリマーは、免疫染色(図8)及びELISA(図10)分析で検出した。これらのデータが示すところによれば、α1−アンチトリプシン・ポリマーの蓄積は、α1−アンチトリプシン欠損を有する個体から得たdhiPSC由来の肝細胞でのみ発生した。コントロール被験体から得たhiPSC由来の肝細胞内では、ポリマーは存在しなかった。前記ポリマーの細胞内の局在については、以下の手順で確認した、即ち、細胞の細胞内画分を得て、その後、エンドグリコシダーゼH(図9)で消化した。該酵素は、高マンノースER形態であるN−結合型グリカンを除去し、且つゴルジ体内でシアル酸付加した後の多糖類鎖に影響しない酵素である。
本発明者らの培養システムが臨床上の病気をモデリングする能力を確認すること、他の細胞内の局在に特有の病気プロセスを検証できる可能性について調査することを目的として、家族性高コレステロール血症(FH)を有する1人の個体から得たdhiPSC由来の肝細胞の特徴を分析した。FHにおける原始的な欠陥は、LDL受容体の機能が損なわれることにある。この結果として、血漿でのLDLが過剰となり、未成熟なアテローマとなる([19])。FHを有する個体から生成したdhiPSC株は、肝細胞へと分化して、典型的な機能的特徴を示す(図11)。分化した細胞をウェスタンブロット法で分析したところ、LDL受容体が欠損していることを確認した。
最後に、本発明者らは、サイトゾルでの代謝の欠損を表す病状のモデリングを行うためのアプローチを用いた。GSD−1aは、グルコース−6−ホスファターゼの欠陥によって引き起こされる。該酵素は、グルコース−6−リン酸をグルコースとリン酸とに加水分解する反応を触媒する主な酵素であり、該反応は、糖新生及びグリコーゲン分解の最終ステップである。GSD−1aを有する個体は、グルコースのホメオスタシスを維持することができず、以下のような症状を経験することとなる:高脂質血症、乳酸アシドーシス、高尿酸血症、低血糖、肝腫脹、腎腫大、及び成長遅延([20])。1つの被験体に由来する3種類のGSD−1a株を分化させ、得られた細胞については、これらの肝細胞に類似の性質についての特徴分析を行った(図13)。
本発明者らは、次に、α1−アンチトリプシン欠損(A1ATD)を有する個体に由来するhiPSCにおいて、piggyback transposonsを用いて、変異の修復を行った(Yusa et al (2011) PNAS USA 108 1531−1536; Wang et al (2008) 105 9290−9295)。A1ATDは、北欧系において2000人に1人の割合で見られる染色体劣勢異常であり、最もありふれたものとして肝臓の遺伝的代謝疾患を代表するものである(Perlmutter, D. H. Cell Death Differ 16, 39−45 (2009); Gooptu, B. & Lomas, D. A. Annu Rev Biochem 78, 147−176 (2009))。該病気は、A1AT遺伝子の単一の点突然変異(Z型対立遺伝子;Glu342Lys)から生じる。そして、該変異により肝細胞の小胞体内で、前記蛋白質の秩序だったポリマー形成を引き起こす。結果として肝硬変を引き起こし、現在唯一の治療法は、肝臓移植のみである。主に、ドナー不足の深刻化や、免疫抑制治療による有害な効果によって、臓器移植が大きく制限されている。従って、hiPSCに基づく治療法の可能性は、大いに魅力的なものとなる。本発明者らはZFN技術を用いた。該技術は、hESC並びにhiPSCにおいて遺伝子ターゲティングを刺激する(Urnov, F. D. et al. Nat Rev Genet 11, 636−646 (2010)、Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851−857 (2009); Zou, J. et al. Cell Stem Cell 5, 97−110 (2009))。Z型変異のサイトを特異的に切断するようにZFNペアを設計した。ターゲティング・ベクターを、PGK−puroΔtkカセットに隣接するpiggyBacリピートとともに同質遺伝子型のDNAから構築した。突然変異部位と、piggyBacトランスポゾンの間の隔たり(違い)を最小限にするため、変異部位の10bp上流にあるCTGロイシン・コドンを、TTAロイシン・コドンに変更した。この結果、TTAA配列が生じた。なお、この配列は、piggyBac除去の後もゲノムの中に残る。
本発明は一側面において以下の発明を包含する。
(発明1)
肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:
(i)人工多能性幹(iPS)細胞の集団を提供するステップ;
(ii)前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体(anterior definitive)内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記内胚葉誘導培地は、以下の性質を持つ所定の化学培地である:
線維芽細胞成長因子活性を有し、
SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路、並びにSMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激し、並びに
ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)を阻害する);並びに
(iii)ADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である)。
(発明2)
発明1に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。
(発明3)
発明1又は発明2に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。
(発明4)
発明3に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。
(発明5)
発明1〜4の何れか1項に記載の方法であって、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激する第二のTGFβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。
(発明6)
発明5に記載の方法であって、前記第二のTGFβリガンドが骨形成蛋白質である該方法。
(発明7)
発明1〜6の何れか1項に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が、PI3K阻害剤及びGSK3β阻害剤を含む該方法。
(発明8)
発明7に記載の方法であって、前記PI3K阻害剤がLY294002である該方法。
(発明9)
発明7又は発明8に記載の方法であって、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である該方法。
(発明10)
発明1〜9の何れか1項に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記肝臓性誘導培地が含む該方法。
(発明11)
発明10に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。
(発明12)
発明1〜11の何れか1項に記載の方法であって、前記ステップ(ii)が、以下のサブステップを含む該方法:
(a)iPSCの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること;
(b)GSK3β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること;並びに
(c)前方胚体内胚葉(ADE)誘導培地中で前記集団を更に培養して、ADE細胞の前記集団を生成すること(ここで、該培地はSMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激し、並びに線維芽細胞成長因子活性を有する)。
(発明13)
発明12に記載の方法であって、前記ADE誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。
(発明14)
発明12又は発明13に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記AE誘導培地が含む該方法。
(発明15)
発明14に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。
(発明16)
発明12〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップa)〜c)のそれぞれにおいて24時間培養する該方法。
(発明17)
発明1〜16の何れか1項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法:
(iv)前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。
(発明18)
発明17に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団を10〜20日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップ。
(発明19)
発明17又は発明18に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び/又はα1-アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。
(発明20)
発明17〜19の何れか1項に記載の方法であって、少なくとも80%の前記肝細胞の集団がアルブミン及び/又はα1-アンチトリプシンを発現する該方法。
(発明21)
発明17〜20の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団又は肝細胞を増殖させるステップを含む該方法。
(発明22)
発明17〜21の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。
(発明23)
発明17〜22の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。
(発明24)
発明1〜23何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を、医薬的に許容可能な賦形剤と混合するステップを含む該方法。
(発明25)
発明1〜24何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞がヒトiPS細胞である該方法。
(発明26)
発明1〜25何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が継代された回数が30回以下である該方法。
(発明27)
発明1〜26何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が1の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。
(発明28)
発明1〜27何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓組織を有する1の個体から得た細胞に由来し、そして、前記集団中の前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。
(発明29)
発明28に記載の方法であって、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、前記iPS細胞において修復され、その結果、前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。
(発明30)
発明29に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常(IMD)である該方法。
(発明31)
発明30に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
(発明32)
発明29に記載の方法であって、前記遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、A1ATにおけるGlu342Lys変異であり、前記肝臓病がα1アンチトリプシン欠損である該方法。
(発明33)
発明1〜27の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の前記肝細胞が病気の表現型を示す該方法。
(発明34)
発明33に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常である該方法。
(発明35)
発明34に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
(発明36)
発明33〜35の何れか1項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における1種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。
(発明37)
発明36に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の1種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
(発明38)
発明33〜37の何れか1項に記載の方法であって、前記集団中の前記肝細胞における遺伝的変異又は遺伝的欠陥を修復して、前記肝細胞が正常な表現型を示すステップを含む該方法。
(発明39)
発明1〜35又は38の何れか1項に記載の方法によって製造され、単離された肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団であって、前記前駆細胞又は肝細胞が正常な表現型を示す該集団。
(発明40)
ヒト又は動物の身体を治療する方法において使用するための発明39に記載の集団。
(発明41)
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法において使用するための発明40に記載の集団。
(発明42)
発明36〜37の何れか1項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示す該集団。
(発明43)
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法であって、以下のステップを含む方法:
肝細胞の発明39に記載の肝細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。
(発明44)
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療で使用するための医薬の製造における発明39に記載の集団の使用。
(発明45)
化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法:
発明1〜38の何れか1項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び/又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。
(発明46)
発明45に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法(ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す)。
(発明47)
発明46に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。
(発明48)
発明47に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法:
前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び/又は
前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。
(発明49)
肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法:
発明1〜38の何れか1項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ;、及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ。
(発明50)
発明49に記載の方法であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における1種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。
(発明51)
発明50に記載の方法であって、以下の1種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
(発明52)
発明50〜51の何れか1項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、前記肝細胞における1種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
(発明53)
発明49に記載の方法であって、前記肝細胞が正常な表現型を示す方法であり、1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。
(発明54)
発明53に記載の方法であって、前記1種以上の肝細胞の機能が以下から選択される該方法:解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の生成、 トロンボポイエチンの生成、アンギオテンシノゲンの生成、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。
(発明55)
発明53〜54の何れか1項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力が増加することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
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Claims (30)
- 肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:
(i)人工多能性幹(iPS)細胞の集団を提供するステップ;
(ii)前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体(anterior definitive)内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記内胚葉誘導培地は、以下を含む所定の化学培地である:
1〜500ng/mlの線維芽細胞成長因子;
10〜1000ng/mlのSMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激するTGFβリガンド;
1〜500ng/mlの骨形成蛋白質;
1〜100μMのホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)阻害剤;及び
0.3〜30μMのグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)阻害剤);並びに
(iii)ADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する5〜500ng/mlのTGFβリガンドを含む所定の化学培地であり、前記iPS細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の肝臓性前駆細胞が病気の表現型を示す)。 - 請求項1に記載の方法であって、前記TGFβリガンドがアクチビンである該方法。
- 請求項1又は2に記載の方法であって、前記PI3K阻害剤がLY294002である該方法。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の方法であって、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である該方法。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載の方法であって、前記TGFβリガンドがアクチビンである該方法。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載の方法であって、前記ステップ(ii)が、以下のサブステップを含む該方法:
(a)iPSCの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること;
(b)GSK3β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること;並びに
(c)前方胚体内胚葉(ADE)誘導培地中で前記集団を更に培養して、ADE細胞の前記集団を生成すること(ここで、該培地はSMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激する10〜1000ng/mlのTGFβリガンド、並びに線維芽細胞成長因子を含む)。 - 請求項6に記載の方法であって、前記TGFβリガンドがアクチビンである該方法。
- 請求項6又は7に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップa)〜c)のそれぞれにおいて24時間培養する該方法。
- 請求項1〜8の何れか1項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法:
(iv)前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、病気の表現型を示す肝細胞の集団を生成するステップ。 - 請求項9に記載の方法であって、前記ステップ(iv)が、前記肝臓性前駆細胞の集団を10〜20日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップである、該方法。
- 請求項9又は請求項10に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び/又はα1-アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。
- 請求項9〜11の何れか1項に記載の方法であって、少なくとも80%の前記肝細胞の集団がアルブミン及び/又はα1-アンチトリプシンを発現する該方法。
- 請求項9〜12の何れか1項に記載の方法であって、肝細胞の集団を増殖させるステップを含む該方法。
- 請求項9〜13の何れか1項に記載の方法であって、肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。
- 請求項9〜14の何れか1項に記載の方法であって、肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。
- 請求項1〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞がヒトiPS細胞である該方法。
- 請求項1〜16の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が継代された回数が30回以下である該方法。
- 請求項1〜17の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が1の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。
- 請求項1〜18の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常(IMD)である該方法。
- 請求項19に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
- 請求項1〜20の何れか1項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における1種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。
- 請求項21に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の1種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
- 請求項9〜15の何れか1項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、成熟肝細胞のマーカーであるアルブミン(ALB)及びα1−アンチトリプシン(AAT)並びに胎児肝細胞のマーカーであるα−フェトプロテイン及びCYP3A7を発現する該集団。
- 化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法:
請求項9〜22の何れか1項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び/又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。 - 請求項24に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法(ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す)。
- 請求項24に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。
- 請求項26に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法:
前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び/又は
前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。 - 肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法:
請求項1〜22の何れか1項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ;、及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ
(ここで、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における1種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する)。 - 請求項28に記載の方法であって、以下の1種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
- 請求項28又は29に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、前記肝細胞における1種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
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