JP6063383B2 - インビトロでの肝臓への分化 - Google Patents

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Description

本発明は、多能性ヒト細胞、特にヒトiPS細胞において、肝臓への分化(肝臓性細胞への分化)をインビトロで誘導することに関する。
体細胞内で数種類の転写因子を過剰発現させるだけで、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を誘導できる可能性があり、こうした可能性は、再生医療及びインビトロでの病気のモデリングのための新たな機会を開いてきた([1])。そして、種々の病気に苦しむ患者からhiPSCが生成されてきた([2][3][4])。ここで、幾つかの群では、これらの細胞が続いて神経前駆細胞に分化したときに、病気特有の表現型が報告される([5][6])。しかし、今日までは、非神経細胞(例えば、中胚葉系統及び内胚葉系統の細胞)の病気に特有のhiPSCベースのモデルは報告されてこなかった。あるいは、完全に分化した成人細胞にのみ見られる機能を失うという結果を生じさせる病気(後期に発症する病気)に特有のhiPSCベースのモデルは報告されてこなかった。更に、再プログラミング及び分化につきまとう細胞ストレスによって、蛋白質の輸送及び活性を支配する無数の緻密な相互作用が、hiPSC由来の細胞モデルにおいて保存されない(保存が阻害される)という懸念が残っている。様々な病気のメカニズムを理解するにあたって、こうした相互作用を理解することが中心になって行われる。また該相互作用を理解することにより、同一の遺伝的背景を持つ個体間で観察され、及び現在説明の付かない臨床の表現型のバリエーションについての病識与えることができる([7][8][9])。
こうした課題は、特に肝臓病(特に肝臓の遺伝的代謝異常(IMD))に関連している。こうした群の病気は、肝細胞の鍵(キー)となる蛋白質に影響を与える遺伝的変異から生じる。こうした群の病気は、肝臓を全器官移植することによって治療することができるが、こうした手順は、相当のリスクを生じる。従って、病気のメカニズムに対する理解を深め、代替治療法を開発する必要がある([10][11])。しかし、そのための研究においては幾つかの困難が立ちふさがっており、該困難としては:肝細胞を初代培養することが困難であることや;病気の原因となる蛋白質の機能不全、ひいては細胞の欠陥を忠実に再現し、関連のあるヒト肝細胞様細胞株を提供することができない点が挙げられる([12])
本発明は、ヒトiPS細胞を肝臓性前駆細胞及び肝細胞へインビトロで高効率誘導するための方法に関する。本発明は、例えば、細胞ベースの治療法又は病気のモデリングのための肝細胞を生成する際に有用となる可能性がある。
一態様において、本発明は以下の方法を提供する。
肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:
(i)人工多能性幹(iPS)細胞の集団を提供するステップ;
(ii)前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体(anterior definitive)内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記内胚葉誘導培地は、
以下の性質を持つ所定の化学培地である:
線維芽細胞成長因子活性を有し、
SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路、並びにSMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激し、並びに
ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)を阻害する)
(iii)ADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である)。
本発明の方法は更に以下のステップを含むことができる;
(iv)前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地(肝臓性細胞へと成熟させる培地)中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。
好ましくは、 前記iPS細胞はヒトiPS細胞である。
iPS細胞は、非多能性且つ完全に分化した先祖細胞に由来する多能性細胞である。適切な先祖細胞には、成人の線維芽細胞や、末しょう血球が含まれる。通常、先祖細胞は、多能性の遺伝子又は蛋白質(例えば、Oct4、Sox2及びSox1)を細胞に導入することにより再プログラムされる。前記遺伝子又は蛋白質は、分化した細胞へ、任意の適切な技術によって導入することができる。該技術としては、プラスミド性、若しくはより好ましくは、ウィルス性のトランスフェクション、又は直接的な蛋白質の送達が含まれる。また、他の遺伝子を細胞に導入して、誘導効率を増加させても良い:例えば、Kif遺伝子(例えば、Kif−1、−2、−4及び−5);Myc遺伝子(例えば、c−Myc、L−Myc及びN−Myc);nanog;及びLin28。多能性の遺伝子又は蛋白質を導入した後、先祖細胞を培養することができる。多能性のマーカーを発現する細胞は、単離及び/又は精製を行い、iPS細胞の集団を生成することができる。iPS細胞を製造するための技術は周知である(Yamanaka et al Nature 2007; 448:313−7; Yamanaka 6 2007 Jun 7;1(1):39−49. Kim et al Nature. 2008 Jul 31;454(7204):646−50; Takahashi Cell. 2007 Nov 30;131(5):861−72. Park et al Nature. 2008 Jan 10;451(7175):141−6; Kimet al Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):472−6; Vallier, L., et al. Stem Cells, 2009. 9999(999A): p. N/A.)。
iPS細胞は、以下の多能性に関連したマーカーを1種以上発現することができる:Oct4、Sox2、アルカリ・ホスファターゼ、SSEA−3、nanog、SSEA−4、Tra−1−60、KLF−4及びc−Myc。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるiPS細胞は、1つの個体から得られた健常な細胞(例えば線維芽細胞)(即ち、病気に関連した表現型又は遺伝子型を持たない細胞)に由来する。
健常細胞に由来するiPS細胞は、本明細書に記載の通り使用して、正常な(即ち、病気に関連しない)表現型を示す肝細胞を生成することができる。
健常細胞は、正常な肝臓機能をもつ個体から得ることができる。或いは、健常細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓細胞を有する患者から得ることができる(例えば、肝臓の損傷又は病気を有する患者(例えば、肝炎(例えば、A型、B型、C型、D型、E型、G型又はK型の肝炎)、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患又は自己免疫性の肝疾患))。
幾つかの実施形態において、iPS細胞は、固有の遺伝的背景を有する個体から得られた健常細胞に由来してもよい。例えば、iPS細胞は、肝臓病を患った個体、肝臓病を患うリスクの高い個体、及び/又は 肝臓病を患うリスクの低い個体からの健常細胞から生成することができる。本明細書に記載に従って固有の遺伝的背景を有する個体から生成された肝細胞は、肝臓病のメカニズムの研究、及び治療用ターゲットの同定に有用となる可能性がある。
正常な(即ち、病気に関連しない)表現型を示す肝細胞は、後述するように、肝臓の損傷又は病気を有する患者を治療する際に有用となる可能性がある。例えば、iPS細胞の由来元となる健常細胞の供給元となった患者の治療の際に有用となる可能性がある。
他の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるiPS細胞は、1つの個体から得た細胞であって病気に関連した細胞に由来する。即ち、細胞は、肝臓病又は肝臓の機能不全に関連した表現型又は遺伝子型を示す。そして、該表現型又は遺伝子型としては、例えば、肝臓の遺伝的代謝疾患(IMD)があり、該疾患の例としては以下の物が挙げられる:α1アンチトリプシン欠損、糖原病(例えば、 糖原病1a型)、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、又は第IX因子欠損若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、又はレフサム病。前記遺伝子型(例えば遺伝的変異又は遺伝的欠陥)を有する任意の細胞は、IMD又は他の肝臓病と関連し、また、線維芽細胞のサンプル(例えば、皮膚の線維芽細胞)から適宜得ることができるが、こうした任意の細胞を使用することができる。
ある個体から得た細胞であって、病気に関連した細胞に由来するiPS細胞(即ち、病気特有のiPS細胞:ds−iPS又はdhiPS)は、本明細書に記載の通り使用して、肝臓病に関連した表現型(例えばIMD表現型)を示す肝細胞を生成することができる。通常は、前記肝細胞は、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有するであろう。こうした細胞は、上述したように、肝臓の損傷又は病気を有する患者の治療、又は肝臓病のモデリング及びスクリーニングにおいて有用となる可能性がある。
他の実施形態では、肝臓病を有する個体から得た、病気に関連した細胞に由来するiPS細胞(即ち、病気特有のiPS細胞:ds−iPS又はdhiPS)は、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有する(例えば、α1−アンチトリプシンにおけるGlu342Lysの変異であって、A1AT欠損の原因となる変異)。前記変異及び欠損は、分化する前に、iPS細胞内で、修復することができる。例えば、病気に関連した遺伝的な変異又は損傷を含むds−iPS細胞内のヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチド配列に置換することができる。遺伝的変異及び欠損を修復するための適切な方法は周知であり、本明細書以外の所でも記載されている。こうした修復された(corrected)iPS細胞(c−iPSC)は、上述したように、肝臓の損傷又は病気を有する患者の治療において有用となる可能性がある。
肝臓の病気については上述した通りであり、遺伝的代謝異常(IMD)を含めることができる。IMDは、ER内での蛋白質のミスフォールディングに関連したIMDであってもよい。例えば、以下の病気が挙げられる:α1−アンチトリプシン欠損;肝臓に関連した受容体疾患(receptoropathy)(例えば、家族性高コレステロール血症(FH));代謝異常(例えば、糖原病、例えば、GSD1a)。
肝臓病は、後期に発症する異常、又は成熟成人肝臓細胞に関連した異常であってもよい。
製造後、iPS細胞の集団は、従来の技術を用いて培養又は維持をすることができる(Vallier, L. et al Dev. Biol. 275, 403−421 (2004), Cowan, C.A. et al. N. Engl. J. Med. 350, 1353−1356 (2004), Joannides, A. et al. Stem Cells 24, 230−235 (2006) Klimanskaya, I. et al. Lancet 365, 1636−1641 (2005), Ludwig, T.E. et al. Nat. Biotechnol. 24, 185−187 (2006))。例えば、本発明の方法での使用に適したiPS細胞(特にヒトiPS細胞)は、適宜以下の条件で培養することができる:培養ディッシュ内での支持細胞(例えば、放射状マウス胚線維芽細胞(MEF))の層の上で、培地としては、例えば、Knockout(KS)培地(添加物として、4ng/mlのFGF2)で、そして、適切な密度(例えば、105〜106細胞/60mmディッシュ)で培養することができる。或いは、条件付の供給物を有する若しくは所定の培地とともに適切な基質の上で培養することができる。
好ましくは、継代数が少ないiPS細胞が本明細書に記載の方法において用いられる。継代数が少ないiPS細胞は、培養した細胞の継代数が40以下、好ましくは35以下、又は30以下である。本発明の方法において使用するためのiPS細胞は、酵素的手段又は機械的手段で継代することができる。
iPS細胞に適した培養培地には、以下の物が挙げられる:
4ng/mlのFGF2を添加したKnockout(KS)培地;
Knockoutダルベッコ改変イーグル培地(KO−DMEM)(添加物として、 20%の血清置換物、1%の非必須アミノ酸、1mMのL−グルタミン、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、及び4ng/ml〜10ng/mlのヒトFGF2); 並びに
DMEM/F12(添加物として、20%のKnockout血清置換物(KSR)、 6ng/mlのFGF2(PeproTech)、1mMのL−Gln、100μMの非必須アミノ酸、100μMの2−メルカプトエタノール、50U/mlのペニシリン及び50mg/mlのストレプトマイシン)。
培養中、細胞は、コラゲナーゼを含まない試薬(例えば、Accutase(商標)(BioWest))を用いて回収することが好ましい。
本明細書に記載の方法に従って、iPS細胞を肝細胞に分化させるには、3つの段階を経る。第1の段階では、iPS細胞の集団は、前方胚体内胚葉(ADE)細胞の集団へと分化する。第2の段階では、前記ADE細胞は、肝臓性前駆細胞に分化する。そして、随意的な第3の段階では、前記肝臓性前駆細胞は、肝細胞に分化する。これらの方法で使用される全ての培地は、所定の化学培地であり、好ましくはヒトに適応化した培地である。
ADE細胞への分化を誘導するために、前記iPS細胞の集団は、内胚葉誘導培地中で培養される。
前記内胚葉誘導培地は、所定の化学培地(CDM)であり、以下の性質を持つ:
(i)SMAD1、SMAD2、SMAD3、及びSMAD5が介するシグナリング経路を刺激する;
(ii)ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)を阻害する;及び
(iii)線維芽細胞成長因子(FGF)活性を有する。
所定の化学培地は、特定の成分のみ、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含有する、細胞培養用のための、栄養溶液である。好ましくは、前記所定の化学培地は、ヒトに適応化した培地である。ヒトに適応化した所定の化学培地は、ヒト以外の動物に由来する成分又は添加物(例えば、ウシ胎児血清(FBS)、ウシ血清アルブミン(BSA)、マウス支持細胞)を含まない。
前記内胚葉誘導培地には、所定の化学的基礎培地が含まれる。
適切な所定の化学的基礎培地では、IMDM及び/又はF12を含み、添加物としては、インシュリンを、例えば0.5μg/ml〜70μg/ml、トランスフェリンを、例えば、濃度1.5μg/ml〜150μg/ml、抗酸化剤(例えば、1−チオールグリセロール)を、例えば、濃度45μM〜4.5mM、及び脂質が挙げられる。
適切な所定の化学的基礎培地としては、Johansson and Wiles CDM (Johansson and Wiles (1995) Mol Cell Biol 15, 141−151)が挙げられ、添加物としては、ポリビニルアルコール、インシュリン、トランスフェリン及び所定の脂質を添加できる。Johansson and Wiles CDMは、以下の物から構成される:50%のIMDM(Gibco)、これに加えて、50%のF12 NUT−MIX(Gibco);7μg/mlのインシュリン;15μg/mlのトランスフェリン;1mg/mlのポリビニルアルコール(PVA);1%の所定の化学的脂質濃縮物(Invitrogen);、及び450μMの1−チオールグリセロール。
他の適切な所定の化学的基礎培地については公知である。
ウシ又はヒトの血清アルブミンの使用を避けるために、所定の化学的基礎培地は、内胚葉誘導培地の中に、ポリビニルアルコール(PVA)を0.5mg/ml〜50mg/mlの濃度で添加することができる。ポリビニルアルコールを添加した所定の化学的基礎培地は、慣用的にCDM−PVAと呼ばれる。
内胚葉誘導培地の中で、CDM−PVAは、追加因子、好ましくは組み換え型ヒト因子を添加することができ、該培地は、iPS細胞を誘導し、前方胚体内胚葉(ADE)細胞へ分化させる。
例えば、CDM−PVAは、線維芽細胞成長因子を添加する。
線維芽細胞成長因子は、蛋白質の因子であり、線維芽細胞成長因子の受容体(FGFR)へ結合することによって、細胞の成長、増殖、及び細胞の分化を刺激する。適切な線維芽細胞成長因子は、FGFファミリーの任意のメンバーが含まれる。例えば、FGF1〜FGF14及びFGF15〜FGF23のうちの任意の1つが含まれる。
前記線維芽細胞成長因子は、以下の物であることが好ましい:FGF2(NCBI GeneID: 2247, 核酸配列 NM_002006.3 GI: 41352694, アミノ酸配列 NP_001997.4 GI: 41352695);FGF7(ケラチノサイト成長因子(又はKGF)としても知られている, NCBI GeneID: 2247, 核酸配列 NM_002006.3 GI: 41352694, アミノ酸配列 NP_001997.4 GI: 41352695);、又はFGF10(NCBI GeneID: 2247, 核酸配列 NM_002006.3 GI: 41352694, アミノ酸配列 NP_001997.4 GI: 41352695)。
最も好ましくは、線維芽細胞成長因子は、FGF2である(Amit, M., et al. Developmental Biology 227:271−278 (2000))。
線維芽細胞成長因子(例えば、FGF2、FGF7及びFGF10)は、ルーチンの組み換え型技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手できる(例えば、 R&D Systems, ミネアポリス, MN; Stemgent Inc, USA)。
便宜上、内胚葉誘導培地中のFGF濃度は、1〜500ng/mlであってもよく、好ましくは約40ng/mlであってもよい。
CDM−PVAは、更に第一のTGFβリガンドを添加してもよく、該リガンドは、iPS細胞中において、SMAD2及びSMAD3を介した細胞内シグナリング経路を刺激する。
TGFβリガンドはTGFβスーパーファミリーのペプチドである。TGFβ スーパーファミリーのメンバーは、特徴的な構造を有しており、周知である。
第一のTGFβリガンドは、アクチビン(Activin)又はTGFβであってもよい。
アクチビン(アクチビンA: NCBI GeneID: 3624 核酸参照配列 NM_002192.2 GI: 62953137, アミノ酸参照配列 NP_002183.1 GI: 4504699)は、二量体性ポリペプチドであり、アクチビン/Nodal経路の刺激を介して、細胞へのある範囲の効果を及ぼす(Vallier et al., Cell Science 118:4495−4509 (2005))。アクチビンは販売元から容易に入手できる(例えば、 Stemgent Inc. MA USA)。便宜上、培地中のアクチビン濃度は、10〜1000ng/mlの範囲であってもよく、好ましくは約100ng/mlであってもよい。
TGFβ(NCBI GeneID: 7040 核酸参照配列 NM_000660.4 GI: 260655621, アミノ酸参照配列 NP_000651.3 GI: 63025222)は、ホモダイマーのポリペプチドであり、増殖及び分化を制御する(Watabe, T. et al (2009).Cell Res. 19:103−115)。組み換え型ヒトTGFβは販売元から容易にから入手できる(例えば、 Stemgent Inc. MA USA)。便宜上、培地中のTGFβ濃度は、10〜1000ng/mlであっても良く、好ましくは約100ng/mlであっても良い。
CDM−PVAは、更に第二のTGFβリガンドを添加することができ、iPS細胞中において、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介した細胞内シグナリング経路を刺激する。
第二のTGFβリガンドは、骨形成蛋白質(BMP)であってもよい。骨形成蛋白質は、骨形成蛋白質受容体(BMPR)に結合して、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介した経路を通して、細胞内シグナリングを刺激する。適切な骨形成蛋白質は、BMPファミリーの任意のメンバー(例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6又はBMP7)が挙げられる。好ましくは、第二のTGFβリガンドは以下の通りである:BMP2(NCBI GeneID: 650, 核酸配列 NM_001200.2 GI: 80861484; アミノ酸配列 NP_001191.1 GI: 4557369);、又は、BMP4(NCBI GeneID: 652, 核酸配列 NM_001202.3 GI: 157276592; アミノ酸配列 NP_001193.2 GI: 157276593)。
骨形成蛋白質は、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる(例えば、R&D, ミネアポリス, USA, Stemgent Inc, USA)。
便宜上、骨形成蛋白質の培地中の濃度(例えば、BMP2又はBMP4)は、1〜500ng/mlであってもよく、好ましくは約10ng/mlであってもよい。
したがって、内胚葉誘導培地には、所定の化学的基礎培地を含むことができ、該培地には、ポリビニルアルコール、FGF、第一の及び第二のTGFβリガンド、PI3K阻害剤、並びにGSK3β阻害剤を添加することができる。
PI3K阻害剤は、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(例えば、ホスファチジルイノシトール−4,5−ビスホスフェート 3−キナーゼ(EC2.7.1.153))の活性を阻害する。
適切なPI3K阻害剤は、以下の物が含まれる:ウォルトマンニン;LY301497(17−b−ヒドロキシウォルトマンニン);LY294002(2−モルホリン−4−イル−8−フェニルクロメン−4−オン: Maclean et al (2007) Stem Cells 25 29−38);CLB1309(KN309:(±)−2−({1−[7−メチル−2−(モルホリン−4−イル)−4−オキソ−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル]エチル}アミノ)安息香酸);PX−866((1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)− 5−(アセチルオキシ)−1−[(ジ−2−プロペン−1−イルアミノ)メチレン]−4,4a,5,6,6a,8,9,9a−オクタヒドロ−11−ヒドロキシ−4−(メトキシメチル)−4a,6a−ジメチルシクロペンタ [5,6]ナフト[1,2−c]ピラン−2,7,10(1H)−トリオン);IC87114(キノロン・ピロロピリミジン; #6 図17); GDC−0941 (#3 図17; 2−(1H−インダゾール−4−イル)−6−[[4−(メチルスルホニル)−1−ピペラジニル]メチル]−4−(4−モルホリニル)−チエノ[3,2− d]ピリミジン); TGX−221 (7−メチル−2−(4−モルホリニル)−9−[1−(フェニルアミノ)エチル]−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン), ケルセチン; BEZ235 (#4 図17); XL147 (#1 図17); Xl765 (#2 図17); PX−866 (#5 図17); ZSTK474 (2−(2−ジフルオロメチルベンジミダゾール−1−イル)4,6−ジモルホリノ−1,3,5−トリアジン); 及びSF1126 (2−[2−メトキシエチルアミノ]−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)。他のPI3K阻害剤は、当分野で入手可能である。
適切なPI3K阻害剤は、販売元から入手可能である(例えば、 Calbiochem CA USA)。
例えば、内胚葉誘導培地は、1〜100μMのPI3K阻害剤(例えば、LY294002)を含むことができ、好ましくは約10μM含むことができる。
GSK3β阻害剤は、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(Gene ID 2932: EC2.7.11.26)の活性を阻害する。適切な阻害剤には、以下の物が含まれる:CHIR99021(6−((2−((4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−メチル−1H−イミダゾール−2−イル)ピリミジン−2−イル)アミノ)エチル)アミノ)ニコチノニトリル; Ring D. B. et al., Diabetes, 52:588−595 (2003))、alsterpaullone、kenpaullone、SB216763 (3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン)、及びSB415286 (3−[(3−クロロ−4−ヒドロキシフェニル)アミノ]−4−(2−ニトロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオン)。
適切なグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β阻害剤は、販売元から入手可能である(例えば、Stemgent Inc. MA USA; Cayman Chemical Co. MI USA)。例えば、内胚葉誘導培地は、0.3〜30μMのGSK3β阻害剤(例えば、CHIR99021)を含むことができ、好ましくは約3μM含むことができる。
幾つかの実施形態において、内胚葉誘導培地は、CDM−PVA基礎培地から構成されてもよく、該培地は、アクチビン、FGF2、BMP−4、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ阻害剤(好ましくはLY294002)、及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β阻害剤(好ましくはCHIR99021)を添加してもよい。
好ましくは、内胚葉誘導培地中のアクチビン、FGF2及びBMP−4は、全て組み換え型ヒト蛋白質である。
ほ乳動物の細胞培養については周知である(例えば、以下の文献を参照されたい:Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451; Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293, Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40−52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430)。これらの培地及び成分は、販売元から入手可能である(例えば、Gibco、Roche、Sigma、Europa bioproducts、R&D systems)。標準的なほ乳動物の細胞培養条件を用いることができる。例えば、37℃、21%酸素、5%二酸化炭素といった条件を用いることができる。培地は、2日ごとに交換することが好ましく、細胞は、重力によって設置されることが好ましい。
細胞は以下の条件で培養することが好ましい:単層で、支持細胞が存在せず、血清(好ましくはヒト血清)又は細胞外マトリックス蛋白質(例えば、フィブロネクチン、ラミニン、又はコラーゲン)で被覆(コーティング)された基質上で培養。適切な培養技術は周知である。
好ましい実施形態において、iPS細胞を前方胚体内胚葉(ADE)細胞へと分化させる工程は、3つの別々のステップで行うことができる。例えば、iPS細胞の集団をADE細胞へ分化させる工程は以下のステップを含むことができる:
(a)iPSC(iPS細胞)の集団を内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば12〜36時間、好ましくは約24時間培養するステップ;
(b)更に、前記集団を、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β阻害剤が存在しない内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば12〜36時間、好ましくは約24時間培養するステップ;並びに
(c)更に、前記集団を、ADE誘導培地中で培養するステップであって、該培地は、SMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激し、線維芽細胞成長因子活性を有し、例えば12〜36時間、好ましくは約24時間培養し、前方胚体内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ。
前記ADE誘導培地は、所定の化学培地であって、所定の化学的基礎培地が含まれる。適切な所定の化学的基礎培地には、RPMI−1640が含まれる。
RPMI−1640(Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503−508)は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤及び緩衝剤(バッファ)を含有する無血清基礎培地である。RPMI−1640は周知であり、販売元から容易に入手できる(例えば、Sigma−Aldrich MI USA)。RPMI−1640培地の成分を表2に示す。
所定の化学的基礎培地は、無血清培地添加物を添加することができる。適切な無血清培地添加物には、B27(Brewer et al J. Neurosci Res 35 567−576 (1993))及びNS21(Chen et al J. Neurosci Meths (2008) 171 239−247)が含まれる。無血清培地添加物(例えば、B27及びN21)は周知であり、幅広く市場で入手可能である(例えば、Invitrogen; Sigma Aldrich Inc)。
また、ADE誘導培地においては、所定の化学的基礎培地に、追加的因子、好ましくは組み換え型ヒト因子を添加して、前方胚体内胚葉(ADE)細胞の集団を生成する。例えば、所定の化学的基礎培地には、線維芽細胞成長因子(FGF)及び第一のTGFβリガンドを添加することができ、該リガンドは、SMAD2及びSMAD3を介する細胞内シグナリング経路を刺激する。FGF及び第一のTGFβリガンドについては、これまでの記載の所で更に詳しく述べたとおりである。
幾つかの実施形態において、ADE誘導培地は、所定の化学的基礎培地を含むことができ、該培地には以下の添加物を添加することができる:1〜1000ng/mlの第一のTGFβリガンド(例えば、アクチビン、好ましくは100ng/ml)、及び4〜400ng/mlのFGF(例えば、FGF2、好ましくは40ng/mlのFGF)。所定の化学的基礎培地は、RPMI−1640であってもよく、該培地には、B27又はNS21培地添加物を添加してもよい。
好ましくは、iPS細胞の集団は、2〜4日間、最も好ましくは3日間培養して、ADE細胞の集団を生成する。
前方胚体内胚葉(ADE)細胞は、内胚葉マーカーを発現することができ、例えば、Sox17、foxA2、GSC、Mixl1、Lhx1、CXCR4、GATA6、Eomes及びHexを発現することができる。
前方胚体内胚葉(ADE)細胞は、多能性のマーカー、又は内胚葉の若しくは中胚葉の系統と関連するマーカーの発現が欠損してもよい。例えば、ADE細胞は、以下のマーカを、検出可能なレベルで、1種以上、好ましくは全て発現しなくてもよい:Oct4、Sox2、アルカリ・ホスファターゼ、SSEA−3、nanog、SSEA−4、Tra−1−60及びKLF−4。
1種以上のADE細胞マーカー、及び/又は1種以上の多能性細胞マーカーの発現は、分化している細胞集団中でモニター及び/又は検出することができる。これにより前記細胞集団に対してどの程度分化又は内胚葉誘導が成されているかを決定することができる。
分化した後、ADE細胞の集団は、実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、培地で培養した後、前記集団は、ADE細胞を85%以上、90%以上、95%以上又は98%以上含むことができる。好ましくは、ADE細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、ADE細胞の集団は、任意の便宜的な技術(例えば、FACS)によって精製することができる。
幾つかの実施形態において、ADE細胞の集団は、肝臓性の系統へ更に分化させる前に増殖させることができる。ADE細胞は、任意の便宜的な技術によって増殖させることができ、例えば、上述したように、FGFを添加した培地(例えば、ADE誘導培地)内で増殖させることができる。
肝臓性前駆細胞への分化を誘導するために、ADE細胞の集団は、肝臓性誘導培地中で培養する。前記肝臓性誘導培地は、所定の化学培地(CDM)であり、該培地は、SMAD2及びSMAD3を介するシグナリング経路を刺激し、肝臓性の系統への分化を誘導する。
肝臓性誘導培地は、所定の化学的基礎培地が含まれ、該培地には、1種以上の追加的因子、好ましくは組み換え型ヒト因子が添加され、ADE細胞が肝臓性前駆細胞に分化することを誘導する。
適切な所定の化学的基礎培地(CDM)には、上述したRPMI−1640が含まれる。前記CDMは、第一のTGFβリガンド(例えば、上述したように、TGFβ又はアクチビン)を添加することができ、該リガンドは、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激することができる。前記培地には、5〜500ng/mlの第一のTGFβリガンド(例えば、アクチビン、好ましくは約50ng/ml)を添加することが好ましい。
ADE細胞の集団は、4〜6日間、好ましくは約5日間培養することができ、肝臓性前駆細胞の集団を生成することができる。
分化している細胞の集団において、1種以上の肝臓性前駆細胞マーカー及び/又は1種以上のADE細胞マーカーの発現を、モニター及び/又は検出を行うことができる。これにより、培養時の分化の度合い(程度)を測定することが可能となる。
肝臓性前駆細胞は、肝細胞、又は胆管細胞(cholangiocytes)のいずれかへ分化する能力があり、両方の系統のマーカーを発現する。肝臓性前駆細胞は、以下の1種以上を発現することができる:α−フェトプロテイン(AFP)、サイトケラチン18(CK18)、サイトケラチン19(CK19)、 肝細胞核因子4(HNF4)、及び肝細胞核因子6(HNF6)。1種以上のこれらのマーカーが検出されれば、それは、肝臓性の系統へ分化したことを示す。
肝臓性前駆細胞の集団は、実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、前記集団は、培地中で培養した後、80%以上、85%以上、90%以上又は95%以上の肝臓性前駆細胞を含むことができる。
好ましくは、肝臓性前駆細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、前記肝臓性前駆細胞の集団は、任意の便宜的な技術によって精製することができる。
上述したように倍地中で培養した後、肝臓性前駆細胞の集団は、培地から単離及び/又は除去することができる。そのための適切な技術については、周知である。
肝臓性前駆細胞は、従来の技術を用いて、増殖させたり、培養中で維持したり、保存したり(例えば凍結保存)することができる。あるいは、肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載したように、治療又は他の応用において使用することができる。
例えば、肝臓性前駆細胞は、後述するように細胞ベースの治療法において使用することができる。
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、肝臓性前駆細胞を肝細胞に分化するように誘導するステップを含むことができる。分化を誘導するために、肝臓性前駆細胞の集団は、肝臓性成熟培地中で培養する。該培地は、所定の化学的基礎培地(CDM)から構成され、追加的因子(好ましくは組み換え型ヒト因子)が添加されている。培養の結果、肝臓性前駆細胞は、誘導されて、肝細胞(hepatic progenitor cells)へと成熟する。
適切な所定の化学的基礎培地(CDM)には、CMRL及びHepatozyme SFMが含まれる(Gibco(商標);Invitrogen Inc)。
CMRL基礎培地は、無血清基礎培地であり、該培地は周知であり、販売元から容易に入手できる(例えば、 Cat No: 11530037 Invitrogen; Product #C0422 Sigma)。CMRL培地の組成は、表3に示す。
Hepatozyme SFMは、無血清基礎培地であり、該培地は販売元から入手できる(例えば、 Cat No 17705; Invitrogen)。
所定の化学培地(CDM)培地は、1種以上の因子を添加してもよく、該因子とは、肝芽細胞又は肝臓性前駆細胞から肝細胞への分化又は成熟を誘導する因子である。例えば、基礎培地には、肝細胞成長因子(HGF)又は上皮成長因子(EGF)を添加することができる。
肝細胞成長因子(HGF)(NCBI GeneID: 3082, 核酸配列 NM_000601.4 GI: 58533168, アミノ酸配列 NP_000592.3 GI: 33859835)は、S1ペプチダーゼのプラスミノーゲン・サブファミリーのメンバーである間充織由来の分裂促進因子である。HGFは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる(例えば、 PeproTech Inc NJ USA)。便宜上、培地中のHGFの濃度は、2〜200μg/mlであってもよく、好ましくは約20μg/mlであってもよい。
上皮成長因子(EGF)(NCBI GeneID: 1950, 核酸配列 NM_001178130.1 GI: 296011012 アミノ酸配列 NP_001171601.1 GI: 296011013; Reynolds, B. A. et al. J. Neurosci. 12: 4565−4574 (1992))は、成長因子であり、該因子の受容体(EGFR)への結合を通して増殖及び分化を制御することができる。EGFは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる(例えば、 PeproTech Inc NJ USA, Stemgent Inc USA)。便宜上、培地中のEGFの濃度は、2〜200μg/mlであってもよく、好ましくは約20μg/mlであってもよい。
また、所定の化学培地(CDM)培地は、1種以上の因子を添加してもよく、該因子は、肝細胞の分化及び成熟を誘導し、例えば、オンコスタチン−M等が挙げられる。オンコスタチン−M(NCBI GeneID: 5008, 核酸配列 NM_020530.3 GI: 28178862, アミノ酸配列 NP_065391.1 GI: 10092621)は、IL−6ファミリーのサイトカインである。オンコスタチン−Mは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる(例えば、 R&D systems, MN USA; Abcam Ltd, UK)。便宜上、培地中のオンコスタチン−Mの濃度は、1〜100μg/mlであってもよく、好ましくは約10μg/mlであってもよい。
肝臓性前駆細胞の集団は、10〜40日間、好ましくは約25日間培養することができ、肝細胞の集団を生成することができる。
肝細胞は、以下の1種以上を発現することができる:アルブミン(Albumin)、α1−アンチトリプシン(AAT)、シトクロームP450(CYP)(例えば、Cyp3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9及びCYP2D6)、第IX因子、アポリポプロテインA2(apopoliprotein)、CEBPα及びトランスチレチン。
幾つかの実施形態において、肝細胞は、1種以上の前駆細胞マーカー(例えば、AFP、CK18及びSox17)を発現しなくともよい。
前記細胞集団内で、1種以上の肝臓性前駆細胞マーカー及び/又は1種以上の肝細胞マーカーの発現は、モニター及び/又は検出を行うことができる。例えば、肝細胞の集団による、アルブミン及び/又はα1−アンチトリプシンの発現又は製造を測定することができる。これにより、培養集団中での分化の度合いを測定又は及び/又はモニターすることが可能となる。細胞マーカーの発現は、任意の適切な技術によって、測定することができ、該技術としては、免疫細胞化学、免疫蛍光、RT−PCR、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、及び酵素的分析が含まれる。
集団において、1種以上の肝細胞の機能を実践する細胞の能力を、モニター及び/又は測定することができる。例えば、以下の1種以上を行う細胞の能力をモニター及び/又は測定することができる:解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換(尿素サイクル)、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。
肝細胞の集団は実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、前記集団は、培地中で培養した後、肝細胞を、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上含むことができる。集団中の肝細胞の存在又は割合は、上述したように、アルブミン及び/又はα1−アンチトリプシンの発現を通して測定することができる。
好ましくは、肝細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、肝細胞の集団は、FACSを含む任意の便宜的な技術によって精製することができる。
本明細書に記載の方法において任意の段階で生成されたADE細胞、肝臓性前駆細胞、及び/又は肝細胞は、単離及び/又は精製することができる。細胞は、当業者に知られた任意の技術を用いて、集団中の他の細胞種から分離することができる。該技術としては、後述するが以下に基づいたものが含まれる:抗体による細胞外エピトープの認識、及び磁気ビーズ又は蛍光活性化セルソーティング(FACS、細胞外領域の特徴的マーカーに対する抗体を使用することを含む)。
本明細書に記載の方法で生成された肝細胞の集団は、標準的なほ乳動物の細胞培養技術を用いて、増殖、培養、又は維持することができる。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で生成された肝細胞の集団は、保存することができ、例えば、凍結乾燥及び/又は凍結保存などがある。
肝細胞の集団は、他の試薬と混合してもよく、例えば、緩衝剤、キャリア、希釈剤、保存薬(防腐剤)又は医薬的に適用可能な賦形剤が挙げられる。適切な試薬については、後で更に詳述する。
上述したように、病気特有のiPS細胞を用いて肝細胞を生成することができ、生成された細胞は、肝臓病に関連した表現型(例えば、IMD)を示す。病気に関連した表現型を有する肝細胞は、病気に関連した1種以上の病理を示すことができる。
本明細書に記載の方法は、肝細胞の集団において、1種以上の病理を検出又は測定するステップを含むことができる。
病理には以下の1種以上の事象を含めることができる:異常な成長、アポトーシスの上昇、異常な遺伝子発現;グルカゴン刺激に対する異常な応答;蛋白質の凝集又は重合化(ポリマー化);ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;乳酸の生成;、及び前記肝細胞の集団における上述した1種以上の肝細胞の機能の欠陥。
病理を有する肝細胞を生成する方法は以下のステップを含むことができる:
上述したように、ds−iPS細胞の集団をインビトロで肝臓へ分化することを誘導するステップ。
これにより、病理を有する肝細胞の集団を生成するステップ。
ds−iPS細胞からの分化を開始した後、ds−iPS細胞由来の肝細胞は、10日、20日、40日、又は複数日以内に病理を示すことができる。
一旦生成されると、病気の表現型(例えば、IMD表現型)を有する肝細胞は、例えば、スクリーニングにおいて使用するために、培養、増殖、及び維持することができる。上述したように、病気の表現型を有する肝細胞を維持する方法は、次のステップを含むことができる:病気の表現型有し、且つds−iPS細胞に由来する肝細胞の集団を培養するステップ。
本発明の別態様は、上述した方法によって生成され、そして単離された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を提供することである。
前記集団は、肝細胞又は肝臓性前駆細胞を80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上含むことができる。
本明細書に記載の方法で生成された肝細胞は、成熟肝細胞に特有の1種以上の機能、又は機能的特徴を示すことができる。例えば、肝細胞は、グリコーゲン及びLDL、分泌AAT及び/又はアルブミンを蓄えることができ、CytP450経路を介して薬剤を代謝することができ、並びに、肝細胞特有のApoAIIプロモーターを制御してGFP蛋白質を発現することができる。肝細胞は、胆汁、トロンボポイエチン、アンギオテンシノゲン、尿素及びコレステロールを1種以上生成することができ;、並びに、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成及び脂質生成のうち1種以上を行うことができる。
幾つかの実施形態において、肝細胞は、成熟した成人肝細胞に完全に分化しなくともよい。そして、肝細胞は、1種以上の前駆細胞マーカー(例えば、AFP)を発現し続けてもよく、減少したレベルでALBを発現してもよく、及び/又は成熟成人肝細胞と比べると低いCyp3A4活性を示してもよい。
肝細胞は、以下の特徴を1種以上随時示すことができる:二核性;グリコーゲン貯蔵;頂部の微小突起(apical microprotrusions);粗面小胞体及び滑面小胞体(ER)、並びに顕著な(prominent)ゴルジ体。
本明細書に記載の方法で生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、iPS細胞を生成するために使用した外因性の再プログラミング因子を発現しない(レトロウイルス性の転移遺伝子として、細胞内に依然として存在している可能性があるが)。
肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団は、ヒト又は動物の身体の治療(例えば、損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療)の方法において使用することができる。また、前記集団は、損傷した又は機能不全の肝臓性組織の治療において使用するための医薬の製造において使用することができる。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する個体は、以下の症状を有してもよい:肝炎(例えば、A型、B型、C型、D型、E型、G型又はK型の肝炎)、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患、自己免疫性の肝疾患若しくは遺伝的代謝異常(例えば、α1アンチトリプシン欠損)、糖原病(例えば糖原病1a型)、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、又は第IX因子欠損若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。治療への応用を目的として、肝細胞は、臨床のグレードの肝細胞であることが好ましい。
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法は以下のステップを含むことができる:
上述したように生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。
前記肝細胞の集団は、移植することもでき、注入することもでき、或いは、個体の臓器に投与することもできる。これらのための適切な技術は周知である。
肝細胞の集団は、前記個体から得た細胞に由来するiPS細胞から生成することができる。幾つかの実施形態において、iPS細胞における病気に関連した変異又は遺伝的欠損は、上述したように、肝細胞又は肝臓性前駆細胞へ分化する前に、修復することができる。
また、本発明の態様は、医薬組成物、医薬、薬剤、又は他の組成物にも拡張され、これらは、本明細書に記載の方法で生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞を含む。また、本発明の方法では、上述したように、例えば、損傷した又は機能不全の肝臓性組織を治療(予防的な治療も含めることができる)を目的として、こうした肝細胞又は肝臓性前駆細胞を患者に投与するステップを含む。そして、医薬組成物を製造するための本発明の方法は、医薬的に適用可能な賦形剤、ビヒクル又はキャリア、そして、随意的に1種以上の他の成分を、こうした肝細胞又は肝臓性前駆細胞と混合するステップを含む。
個体に投与される肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、遺伝的に操作して、治療用分子(例えば、薬剤又は成長因子)を生成することができる(Behrstock S et al, Gene Ther 2006 Mar;13(5):379−88, Klein SM et al, Hum Gene Ther 2005 Apr;16(4):509−21)。
本発明は、本発明に従い生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞と、1種以上の追加的成分とを含有する組成物を提供する。本発明に従った医薬組成物、及び本発明に従った使用を目的とする医薬組成物は、前記肝細胞のほかに以下の物を含むことができる:医薬的に適用可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、保存薬(防腐剤)、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者に周知の他の物質。こうした物質は、毒性を持たない物にすべきであり、前記肝細胞の活性と干渉しない物にすべきである。キャリア、又は他の物質の正確な特性は、投与経路に依存するであろう。
液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物性油若しくは植物性油、鉱物油、又は合成油などの液体キャリアが含まれる。また、以下の物も含めることができる:生理食塩水溶液、組織培地若しくは細胞培養培地、デキストロース又は他の糖類溶液、グリコール(例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール)。
組成物は、非経口的に許容可能な水性溶液の形態であってもよく、感染源を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する。当分野の関係者であれば、例えば、等張性のビヒクル(例えば、塩化ナトリウム、リンゲル液、乳酸リンゲル液)を用いて適切な溶液を調製することは十分可能である。組成物は、人工的な脳脊髄液を用いて調製することができる。
肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、任意の公知技術によって、患者に移植することができる(例えば、 Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83−7; Freed, C.R., et al., (1997) Cell Transplant, 6, 201−202; Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118−1124; Freed, C.R.,(1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549−1555, Le Blanc et al, Lancet 2004 May 1;363(9419):1439−41)。特に、細胞懸濁液は、患者の門脈に注入することができる。
本発明に従った組成物の投与は、「予防としての有効量」又は「治療としての有効量」であることが好ましい(場合によっては、予防を治療とみなすこともできるかもしれないが)。そして、該量とは、個体に対して利点を示すのに十分な量である。実際の投与する量、割合、及び時間変化は、治療対象の性質や深刻度によるだろう。治療の処方箋(例えば、投与量等の決定)については、一般的に実践する者、又は他の医療ドクターの責任の範囲内である。
組成物は、治療する症状に応じて、単独で投与することもでき、又は他の治療と組み合わせて同時に若しくは連続のいずれかで投与することができる。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で生成された集団中における肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、正常な表現型を示すことができる。例えば、細胞は、肝臓の損傷又は機能不全を有する個体から得ることができ、iPS細胞を生成するために使用することができる。幾つかの実施形態において、iPS細胞は、変異や遺伝的な欠陥を含んでいてもよい。また、該変異又は欠陥は、従来の組み換え技術を用いて修復し、正常な表現型を有するiPS細胞を生成することができる。正常な表現型を有する肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載のように、これらのiPS細胞から生成することができる。そして、患者に移植して、肝臓の損傷又は機能不全を修復又は改善することができる。
他の実施形態では、本明細書に記載の方法で生成された集団中の肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、病気の表現型を示しても良い。例えば、細胞は、肝臓の損傷又は機能不全を有する個体から得ることができ、病気特有のiPS(ds−iPS)細胞を生成するために使用することができる。病気の表現型を有する肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載のように、これらのiPS細胞から生成することができる。そして、これらの細胞は、正常な表現型を取り戻すために処理することができる。例えば、病気の表現型の原因となる遺伝的変異又は遺伝的欠陥は、インビトロで修復することができる。単離したほ乳動物の細胞内で、遺伝的変異又は欠陥を修復するための様々な技術が利用可能である。一旦、欠陥又は変異が修復され、正常な表現型を取り戻すと、肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、患者に移植することができ、肝臓の損傷又は機能不全を修復又は改善することができる。
上述した方法で生成された肝細胞の集団は、試験化合物と肝臓細胞との相互作用をモデリングする際に有用となる可能性ある(例えば、毒性スクリーニングにおける、肝臓病のモデリング、及び潜在的な治療用効果を有する化合物のためのスクリーニング)。
化合物をスクリーニングする方法は、以下のステップを含むことができる:
上述の方法によって生成される肝細胞の集団を、試験化合物に接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する試験化合物の効果、及び/又は、試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。
肝細胞は、正常の又は病気の表現型を示すことができる。
試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの肝細胞の成長又は生存率を測定することができる。成長又は生存率が低下することは、化合物が肝臓毒性の効果があることを示す。
試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの遺伝子発現を測定できる。例えば、以下の遺伝子の発現を測定することができる:アルブミン、α1−アンチトリプシン(AAT)、シトクロームP450酵素(例えば、Cyp3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9及びCYP2D6)、第IX因子、アポリポプロテインA2、CEBPα及び/又はトランスチレチン。発現が低下することは、化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。遺伝子発現は、核酸レベルについて、例えばRT−PCRによって、測定することができる。蛋白質レベルについてであれば、免疫学的な技術(例えば、ELISA)又は、活性アッセイによって、測定することができる。シトクロームP450アッセイ(例えば、ルミネッセンスのアッセイ、蛍光性のアッセイ、発色性のアッセイ)は周知であり、販売元から入手できる。
肝細胞による試験化合物の代謝、変性、又は分解を測定することができる。幾つかの実施形態において、前記試験化合物の量若しくは濃度、及び/又は前記試験化合物の代謝産物における変化は、ある時間の範囲にわたって、連続的又は1以上の時間ポイントのいずれかで、決定又は測定することができる。例えば、前記試験化合物の量又は濃度の減少、及び/又は前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加を、決定又は測定することができる。幾つかの実施形態において、前記試験化合物の量若しくは濃度、及び/又は代謝産物における変化速度を決定(測定)することができる。試験化合物又は代謝産物の量を測定するための適切な技術として、質量分析法が挙げられる。
該方法は、試験化合物についての、インビボ半減期、毒性、効能、又は他のインビボ特性を測定する際に、有用となる可能性がある。
試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときとで、肝細胞の1種以上の機能を決定及び/又は測定することができる。例えば、以下の1種以上の事を行うための肝細胞の機能を決定及び/又は測定することができる:有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。
試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときで、1種以上のこれらの機能を実行するための肝細胞の能力が低下した場合、それは、化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。
肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法は、以下のステップを含むことができる:
上述した方法で生成された(病気の表現型を示す)肝細胞の集団を、試験化合物と接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップ。
前記肝細胞は、病気の表現型を示すことができる。肝細胞において、1種以上の病理に対する試験化合物の効果を決定することができる。例えば、以下の1種以上の事象に対する試験化合物の効果を決定することができる:細胞の成長、遺伝子発現、蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
そのための適切な技術は周知であり、免疫染色、質量分析法、ウェスタンブロット法、及び酵素的アッセイが挙げられる。
試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときで、肝細胞中の1種以上の病理が減少又は改善された場合、それは、肝臓病の治療(例えば遺伝的代謝異常)において、試験化合物が有用となる可能性があることを示すことができる。遺伝的代謝異常の具体例については、既に述べた通りである。
本明細書に記載の方法は、肝細胞における1種以上の病理(例えばIMD病理)を減少又は改善させる試験化合物を特定するステップを含むことができる。病理を減少させる化合物は、肝臓病の治療のための治療薬の開発において有用となる可能性がある。
他の実施形態では、肝細胞は、正常な表現型を示すことができる。また、該肝細胞は、一般的な集団と比べて、例えば、肝臓病に対するリスクが高い、又は肝臓病の影響を非常に受けやすい個体に由来する物であっても良い。以下の1種以上の事象に対する試験化合物の効果を測定することができる:細胞の成長、又は遺伝子発現(例えば、シトクロームP450(CYP)の発現(例えば、Cyp3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、及びCYP2D6)。肝細胞の1種以上の機能に対する試験化合物の効果を測定することができる。例えば、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときとで、以下の1種以上を行う肝細胞の機能について、決定及び/又は測定することができる:有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。
試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときに、遺伝子発現、成長及び/又は1種以上の機能が増加した場合には、前記化合物が肝臓病(例えば、肝炎(例えば、A型、B型、C型、D型、E型、G型又はK型の肝炎)、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患、又は自己免疫性の肝疾患)の治療において有用である可能性を示す。
肝細胞において1種以上の病理を減少又は改善する化合物を同定した後、前記化合物は、該化合物の医薬的特性を最適化するために改変することができる。こうした改変は、周知のモデリング技術を用いて行うことができる。
肝細胞において1種以上の病理(例えば、IMD病理)を減少又は改善する能力を有する物として、1種以上の初期スクリーニングを用いて同定された試験化合物は、1種以上の2次スクリーニングを用いて更に評価することができる。
2次スクリーニングでは、インビトロ及び/又はインビボ(例えば、動物モデルにて)での生物学的機能又は活性を試験することを含むことができる。例えば、病気の動物モデルにおいて、肝臓病に関連する1種以上の症状又は病理を減少又は改善するための試験化合物の能力を測定することができる。
肝細胞において、1種以上の病理を減少又は改善する試験化合物を同定した後、前記化合物を単離及び/又は精製することができる。或いは、組み換え発現又は化学合成等の従来の技術を用いて、合成することができる。更に、化合物は、組成物(例えば、医薬、医薬組成物又は薬剤)の調製(即ち、製造又は配合)において製造又は使用することができる。これらの組成物は肝臓病の治療を目的として個体に投与することができる。
本明細書に開示した内容を参照すれば、本発明に係る更なる様々な態様及び実施形態があることが当業者にとって明らかであろう。
本明細書で記述した全ての文献は、参照により、その内容全体を本明細書に組み込む。
本明細書で使用する「及び/又は」という表現(該表現において、「及び」を「並びに」に置き換えた場合や、「又は」を「若しくは」に置き換えた場合も同様)は、特定の二つの特性又は成分のうちのそれぞれであって、他方の要素を伴うもの、又は伴わないものである旨を特定して開示するものとして解釈すべきものである。例えば、「A及び/又はB」という表現は、(i)A、(ii)B、及び(iii)AとB、のそれぞれが、ちょうど本明細書において個別に列挙されたかのように、特定して開示するものとして解釈すべきものである。
特記しない限り、上述した特徴に関する記載や定義は、本発明のあらゆる特定の態様や実施形態に限定されない。そして、記載した全ての態様及び実施形態に等しくあてはまるものである。
本発明の特定の態様及び実施形態については、後述する図面及び表を参照しながら、例示的な意味合いで以下述べることとする。
図1〜5は、病気特有のhiPSC(dhiPSC)からの肝細胞の生成を表す。図1は、dhiPSCライブラリーを肝細胞へ分化させるために使用されるプロトコルの概要を表したフロー図を示す。 肝細胞の発生の鍵となる段階を表す(マーカーとなる)特定の蛋白質の発現を分析した免疫染色を示す(4日目 内胚葉:CXCR4、Sox17及びfoxA2;20日目 肝臓性前駆細胞 CK18、CK19及びα−フェトプロテイン(AFP);25日目 胎児の肝細胞:アルブミン(ALB、albumin)、AFP及びα1−アンチトリプシン(AAT)。 dhiPSCが肝細胞へと分化する鍵となる段階のマーカーとなる遺伝子の発現に関するリアルタイムPCR分析を表す。 図4A〜Fは、hESC由来の決定的な内胚葉が胎児の肝細胞へ所定の培養条件で分化することを示す。図4Aは、肝臓への分化を誘導するための条件において、25日間、DE細胞を増殖させた際の肝細胞マーカーの発現を示す。 図4Bは、FACS分析を示しており、hESC由来の胎児肝細胞(25日目)において、アルブミン(ALB)、α−1−アンチトリプシン(AAT)、及びα−1−フェトプロテイン(AFP)が共発現していることを表している。 図4Cは、hESC由来の胎児肝細胞(25日目)において、アルブミン(ALB)、サイトケラチン(Cyokeratin)18(CK18)、及びα−1−アンチトリプシン(AAT)の発現を免疫染色分析したものを示す。スケールバーは50μmである。 図4Dは、ELISA分析を示しており、hESC由来の胎児肝細胞の培養培地中でのα1−アンチトリプシン(AAT)及びアルブミンの分泌(Secretion)を示す。 図4Eは、hESC由来の胎児肝細胞での、デキサメタゾン(DEX)によるCyp3A4の誘導活性(Inducible Cyp3A4 Activity)を示す。 図4Fは、hESC由来の胎児肝細胞中において、コレステロールの取り込みを示すDILアッセイ、及びグリコーゲン貯蓄を示すPAS染色を示す。スケールバーは50μmである。 図5は、FACS分析を示したものであるが、肝臓への分化25日後でのアルブミンを発現する細胞の割合を表す。 dhiPSC由来の肝細胞(25日目)を透過型電子顕微鏡によって形態学的に分析したものを示し、該分析は、(1)頂側微絨毛(apical microvilli)及び(2)グリコーゲン・ロゼット(rosettes)の存在を示す。ここに示した本データは、1つの系統(line)(1患者;1系統)から採取したものであるが、同様の特徴を持つ全ての系統を代表するものである。 図7〜10は、dhiPSCを用いたα1−アンチトリプシン欠損(A1ATD)のインビトロ・モデリングを示す。図7は、1ATD−dhiPSCから分化した肝細胞(hepatocyte)が、初期のヒト肝細胞に特徴的な機能的活性を示すことを表した図であり、該特徴としては、以下のものが含まれる:細胞内アルブミン(Albumin)の存在、過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)で示されるグリコーゲン貯蓄(グリコーゲン,Glycogen)、蛍光標識低密度リポ蛋白質(DIL)取込によって示される低密度リポ蛋白質コレステロール取り込み(LDL取込、LDL Incorporation)、アルブミン分泌(Albumin Secretion、単位としてng/ml/日/100万細胞)、及び活性を有するCytP450代謝(Cyp3A4活性、Cyp3A4 Activity、単位としてRLU/ml/100万細胞)。 免疫染色分析を示し、ミスフォールドされたポリマー性α1−アンチトリプシン(Polymeric AAT)の発現について示している。該分析では、以下の抗体を用いた:ポリマー特有の2C1抗体(中央パネル、緑色蛍光);又は、α1−アンチトリプシンの全ての形態(All AAT)を検出する抗体(左側パネル、赤色蛍光)。該図で示しているのは、患者特有の肝細胞(A1ATD、上段)及びコントロールのhiPSC由来の肝細胞(コントロール、下段パネル)である。 A1ATDであるdhiPSC由来の肝細胞でのミクロソーム細胞内(subcellular)画分のエンドグリコシダーゼH(Endo H)消化を表す。ミスフォールドされたポリマー性α1−アンチトリプシン(antitrypsin)蛋白質が小胞体内に滞在していることを裏付けている。n=3である。 ELISAを示しており、全ての(all)、及びポリマー性(Polymeric)のα1−アンチトリプシン蛋白質の細胞内発現(cells)及び分泌(medium)を評価している。該評価は、患者特有の肝細胞(A1ATD)及びコントロールのhiPSC由来の肝細胞(conrol)について、MG132で一晩プロテアソームの阻害(proteosomal inhibition)を行った後で行った。n=3である。縦軸の単位は、標準化させたスペクトル吸光度である。 図11及び12は、dhiPSCを用いた家族性高コレステロール血症のインビトロ・モデリングを示す。図11は、肝細胞(Hepatocyte)へと分化するFH−dhiPSCが初期のヒト肝細胞の機能的且つ活性的特徴を示すことを示す。該特徴としては、以下のものが含まれる:アルブミン(Albumin)の細胞内の存在、グリコーゲン貯蓄(Glycogen)、アルブミン分泌(Albumin Secretion、単位としてng/ml/日/100万細胞)、及び活性のあるCytP450代謝(Cyp3A4 Activity、単位としてRLU/ml/100万細胞)。 蛍光標識された低密度リポ蛋白質取込に関するFACS分析を示す。該分析では、ポジティブ・コントロール(control,青の曲線)と比べて、FH−dhiPSC由来の肝細胞(FH, 赤の曲線)が低密度リポ蛋白質を効率的に取り込む能力が欠如していることを裏付ける。LDL非存在下で増殖したhiPSCをネガティブ・コントロール(unstained)として使用した。 図13〜17は、dhiPSCを用いた糖原病1a型のインビトロ・モデリングを示す。図13は、肝細胞へと分化するGSD−dhiPSCが、初期のヒト肝細胞の機能的且つ活性的特徴を示すことを示す。該特徴としては、以下のものが含まれる:アルブミン(Albumin)の細胞内の存在、アルブミン分泌(Albumin Scretion、単位としてng/ml/日/100万細胞)、及び活性のあるCytP450代謝(Cyp3A4 Activity、単位としてRLU/ml/100万細胞)。 過ヨウ素酸シッフ染色を示す。コントロール被験体から生じたhiPSC由来の肝細胞(control)と比べると、GSD−dhiPSC由来の肝細胞(GSD1a)では、細胞内グリコーゲンが過剰に蓄積していることが示される。n=3である。 BODIPY染色を示す。コントロール被験体から生じたhiPSC由来の肝細胞(control)と比べると、GSD−dhiPSC由来の肝細胞(GSD1a)では、細胞内脂質が過剰に蓄積していることが示される。n=3である。 dhiPSC由来の肝細胞が、グルカゴンによって転写ターゲットを適切にアップレギュレートしていることを示す。PEPCK、G6P及びIGFBP1の発現についてのqRT−PCR分析で示す。100nMのグルカゴン塩酸で刺激した後の時間として、0、1、2及び3時間後に分析した。n=3である。 コントロール被験体から生じたhiPSC由来の肝細胞(control)と比べると、GSD−dhiPSC由来の肝細胞(GSD1a)は、より多くのラクテート(Lactate)を分泌することを示す(GSD1a)。該分泌は、細胞培養培地を24時間回収して、ELISA分析を行って評価した時に示されたものである。n=3である。 PI3K阻害剤の具体例を示す。★印は標的物理療法で用いられる旨を表す(with targeted modality)。 c−hiPSC由来肝細胞様細胞において、A1ATの回復を機能的に分析したものを示す。図19Aは、c−hiPSCから生じる肝細胞様細胞において、ポリマー性A1AT蛋白質(Polymeric A1AT)が存在しないこと示す免疫蛍光の結果を示す。全ての形態のA1AT(All A1AT)については左側パネル、ミスフォールドされたポリマー性 12 A1ATについては、中央パネルに示した。 図19B及び19Cは、ELISAのデータを示す。A1ATD−hiPSC(ZZ)、chiPSC(RR)及びコントロールhiPSC(++)に由来する肝細胞様細胞において、ポリマー性A1AT蛋白質に関する細胞内レベル(19B)及び分泌レベル(19C)を評価した。単位は、μg・mg-1である。 図19B及び19Cは、ELISAのデータを示す。A1ATD−hiPSC(ZZ)、chiPSC(RR)及びコントロールhiPSC(++)に由来する肝細胞様細胞において、ポリマー性A1AT蛋白質に関する細胞内レベル(19B)及び分泌レベル(19C)を評価した。単位は、μg・mg-1である。 図19Dは、A1ATに関するエンドグリコシダーゼH(E)消化及びペプチド:N−glycosidase(P)消化を示す。これらは、未修復(ZZ)、修復(RR)及びコントロール(++)のhiPSC由来の肝細胞様細胞(上段パネル)及び対応する培養培地(下段パネル)から免疫沈降を行った。Cellは細胞内、Mediumは培地を示す。 図19Eは、キモトリプシンELISAを示す。該図では、修復された細胞(RR)は、A1AT酵素阻害活性を有しており、該活性は未修復細胞(ZZ)よりも優れており、成人肝細胞に近いことを示している。 図19F及び19Gは、移植した肝臓片に関する免疫蛍光を示し、ヒトアルブミン(図19F)及びA1AT(図19G)を検出している。DNAは、DAPIで対照染色した。 図19F及び19Gは、移植した肝臓片に関する免疫蛍光を示し、ヒトアルブミン(図19F)及びA1AT(図19G)を検出している。DNAは、DAPIで対照染色した。 図19Hは、ELISAを示し、各マウスについて長期間にわたってマウス血清中のヒトアルブミンを測定した。アスタリスクは、マウスに対して組織分析が行われたことを示す。図19a〜h中に記載されたスケールバーは100μmである。図19のデータのB、C及びEは、平均±標準偏差(n=3)として示した。Student’s t検定を行った。NSは有意差なし(not significant)を意味する。
方法
hiPSC派生物及び培養物
倫理的な承認と患者の同意を適切に得た後、8mmの皮膚パンチの生体検査材料を、Addenbrooke病院のボランティア患者から得た(Ethics ref number 08/H0311/201; R&D No: A091485)。標準化された屋内(in house)プロトコルを用いて、GMP条件で、提供された組織から線維芽細胞を生成した。そして、標準的な線維芽細胞培養培地中で増殖させた。更なる線維芽細胞サンプルをINSERM(フランス)及びCoriell Biorepositoryから得た。全部で5つの異なる病気サンプルを、7人の異なる患者から得た。詳細を表1に示す。モロニーマウス白血病ウイルス由来のベクター(該ベクターは、4種類のヒト遺伝子Oct−4、Sox2、c−Myc及びKlf4のうち1つのコーディング配列をそれぞれ含有する)と、対応するウィルス性粒子とをVectalys社(Toulouse, フランス)が生成した。そして、感染効率(multiple of infectivity)を10にして、線維芽細胞に感染させるために使用した。これらの技術については、山中氏及び共同研究者が当初記載した通りであり、また、本発明者が近年記載したとおりである[29]。一旦誘導されると、hiPSCは、放射状マウス供給物(feeders)を含有するプレート上で、そして、標準的なhESC培養条件(Knockout [KSR], (Gibco) + FGF2 (4ng/ml; R&D systems Inc., ミネアポリス))で培養される。
RNA抽出及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、hiPSC又は分化した前駆細胞から、トータルRNAを抽出した。各サンプルは、DNAの混入をさけるため、RNase−Free DNase(Qiagen)で処理した。Superscript II 逆転写酵素(Invitrogen)を用いて、トータルRNAの各サンプル0.6μgを逆転写した。リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の反応混合物を、文献の記載に従って調製した(SensiMiX Protcol; Quantace, London)。そして、94℃で5分間変性させた。その後、94℃で30秒、60℃で30秒、そして、72℃で30秒というサイクルで反応させた。40サイクルが完了した後、続いて、72℃で10分間、最後の伸長反応を行った。プライマー配列については別途記載の通りである[16]。リアルタイムPCR反応は、Stratagene社のMx3005P(La Jolla, CA)を用いてトリプリケートで行った。そして、同一の反応実験内(the same run)で、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(PBGD)に対して標準化を行った。QPCRデータは、3件の独立した実験の平均として表され、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。リアルタイムPCR分析用に用いるプライマーは、最後のところに表として記載した。
免疫蛍光
hiPSC、又はこれらから分化した前駆細胞は、4%パラホルムアルデヒド中で、20分間、4℃で固定した。その後、PBSで3回洗浄した。10%のロバ血清(Serotec Ltd.)を含有するPBS中で、20分間室温で細胞をインキュベートした。続いて、1%のロバ血清を含有するPBS中で希釈した一次抗体を用いて一晩4℃でインキュベートした。用いた抗体(及び希釈率)は下記の通り:Oct−4 (1:100; Abcam ab18976 [ケンブリッジ, U.K.] Sox2 (1:100; Abcam ab15830), Brachyury (1:100; Abcam ab20680 or R&D systems Inc.), Sox17 (R&D systems Inc.), foxA2 (1:50; Abcam ab5074), GATA4 (1:250; Santa Cruz Biotechnology Inc.), GATA6 (1:200; Abcam ab22600 or Santa Cruz Biotechnology Inc.), CXCR4 (1:100; R&D systems Inc. 又は BD Pharmingen), CK18 (1:50, Dako) CK19 (1:50, Dako), アルブミン (1:100; R&D1455 ), α−フェトプロテイン (1:300, Dako A008 ), α1−アンチトリプシン (1:100, Sigma A0608)。その後細胞はPBSで三回洗浄した。そして、以下の物と結合したTexas Red又はフルオレセインイソチオシアネート結合抗体を用いて2時間室温でインキュベートした:マウス IgG (Sigma−Aldrich; 1%のロバ血清を含有したPBSで1:200で希釈)、又はウサギ IgG (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME; ロバ血清を含有したPBSで1:400で希釈) 又はヤギ IgG (Jackson Laboratory;ロバ血清を含有したPBSで1:400で希釈)。結合しなかった二次抗体は、PBSで三回洗浄して除去した。Hoechst 33258を最初の洗浄液に添加した(Sigma−Aldrich; 1:10,000)。脂質を視覚化するために、脂質特異的な染色であるBODIPY (ボロン−ジピロメテン; BODIPY(登録商標) 493/503 Invitrogen.D−3922)を用いた。
奇形腫
hiPSCは、移植する直前に回収した。約106個の細胞を、8週齢のC.B.−17/GbmsTac−scidbgDFN7雄マウス(Taconic M&B, ejby, Denmark)の精嚢(testicular capsule)の下に接種した。該マウスは、ケージに入れ、温度を20℃−24℃、50%の室内湿度、14時間と10時間との明暗サイクル、適宜飼料と水を与えて、維持した。60日後にマウスを犠牲にし、接種をした精巣をレーザーブレードで均等な切片にカットした。材料を4%中性緩衝性のホルムアルデヒドで一晩固定し、アルコールからキシレンへの一連の段階処理を通して脱水化した。前記組織をパラフィン中に包埋し、5μmの連続切片とした。その後、H&E染色を行い、特徴について分析した。ヒト由来のエリアを選択するに当たっては、蛍光性のin situ ハイブリダイゼーションによって確認した(ヒト−特異的なプローブ, CEP XY; Vysis Inc.,Downers Grove, IL)。実験は、動物実験に関する地域委員会(Regional Committee for Animal Experimentation )(Stockholm,スウェーデン; Dnr N107/06)からの許可の下行った。
核型分析
hiPSCは、10cmディッシュ上でコンフルエントになるまで増殖させた。その後、ディッシュを回収し、中期スプレッド(metaphase spread)を、ケンブリッジ大学病院細胞遺伝学診断用研究室によって得た。
hiPSCから肝細胞への分化
hiPSCは、5mg/mlのコラゲナーゼIV/ディスパーゼ(0.1%, Gibco)(比率1:1 (v/v))の混合液を用いて継代した。その後、過去の文献に記載の通り([16])、CDM−PVA中でウシ胎児血清(FBS)で予め被覆したプレート上に、又はヒト・フィブロネクチンで予め被覆したプレート内に移した。その翌日の間(For the first following day)、細胞は、CDM−PVA中で以下の物を添加して増殖させた:CHIR99021 (3 μM, Stemgent), LY294002 (10 μM, Calbiochem), アクチビン (100 ng/ml, R&D systems), FGF2 (40 ng/ml, R&D systems)、及びBMP4 (10 ng/ml,R&D systems)。そして、hiPSCから原始線条様の細胞への分化を誘導した。翌日、得られた細胞は、CDM−PVA中で以下の物を添加して増殖させた:LY294002 (10 μM, Calbiochem), アクチビン (100 ng/ml), FGF2 (40 ng/ml, R&D systems)、及びBMP4 (10 ng/ml, R&D systems)。そして、決定的な内胚葉への分化を誘導した。3日目には、基礎培地をRPMI(Gibco 1640)に変更し、アクチビン(100 ng/ml, R&D systems),FGF2(40 ng/ml, R&D systems)及びB27を添加した。そして、前方胚体内胚葉細胞(ADE)を得た。その後、肝臓性内胚葉を誘導するために、RPMI(Gibco 1640)(添加物として、アクチビン(50 ng/ml, R&D systems))の存在下でADE細胞を5日間培養した。最後に、得られた肝臓性前駆細胞を成熟させるために、細胞を、CMRL/Hepatozyme(Invitrogen)基礎培地(添加物として、HGF(20μg/ml, PeproTech)及びオンコスタチン−M(10μg/ml,R&D))中で増殖させた。
フローサイトメトリー
アルブミン陽性細胞を検出するため、肝細胞分化プロトコルの最後で、接着細胞をPBSで二回洗浄した。細胞分離バッファ(Invitrogen, Carlsbad, CA)中37℃で20分間インキュベートした。細胞は、穏やかにピペッティングすることによって分離した。そして、約0.1〜1×105細胞/mLの密度で、PBS+3%正常ヤギ血清(NGS)(含有物として、0.1%アジド(Serotec Ltd., Oxford, U.K.)及び0.1%Triton−X)中で再懸濁した。その後、一次マウス抗ヒトアルブミン抗体(R&D 1455;100分の1に希釈)、又はマウスIgGアイソタイプ コントロール(BD Pharmingen)で、細胞を40分間4℃でインキュベートした。そして、細胞を、FACS Calibur machine(BD Biosciences, San Jose, California, USA)で分析した。アルブミン陽性細胞の数は、3つの独立した実験からの平均値として記録した。
イオジキサノール(OptiPrep Axis Shield 2010)ステップ勾配を用いた細胞内画分、及びEndoH消化
dhiPSC由来の肝細胞を6ウェルプレート中で増殖させ、セルスクレイパーで回収した。そして、ボール・ベアリング・ホモジェナイザーを繰り返し通すことによって機械的に破壊した。細胞懸濁液を5分間(4℃)かつ3000Gで遠心した。上澄みを、希釈して、最終濃度35%のOptiPrep液とし、新たな遠心管に移した。前記上澄みの上に、2mlの30%OptiPrepと、1mlの0%OptiPrepを慎重に連続して層を重ね、遠心管を2時間(4℃)70,000Gで回転させた。2つの下層の間に形成された液体中間層を、注意深く吸引して、再度、45分間(4℃)100,000Gで回転させた。形成された連続ペレットを50μlの緩衝剤で再懸濁した。そして、ミクロソーム・画分としてラベルした。エンドグリコシダーゼH[EC 3.2.1.96, グリコペプチド−D−マンノシル−N4−(N−アセチル−D−グルコサミニル)2−アスパラギン 1,4−N−アセチル−b−グルコサミノヒドロラーゼ]で消化するため、ミクロソーム細胞画分は、500ユニットのEndoH酵素(Boehringher Mannheim, Mannheim, Germany)で、3時間37℃で消化した。そして、後述の通り分析を行った。
SDS PAGE及びウェスタンブロット法分析
サンプル30μlを、10μlの4xローディング・バッファ(含有物として、10%(v/v)β−メルカプトエタノール及び4%(w/v) SDS)と混合し、8%(w/v)のアクリルアミドSDS−PAGEで分析した。ウェスタンブロット分析を行うため、200mAで2時間、前記蛋白質を、前記ゲルから、イモビロンPメンブレン(Millipore Corp., Bedford, MA)へとブロット(トランスファー)した。ブロット用のバッファーには、20%(v/v)メタノールを加えた。ブロット後、メンブレンをPBT(PBSに0.1%(v/v)のTween 20をプラスした物)で洗浄した。更に、PBTに5%(w/v)の乾燥スキムミルク粉末を添加した物を用いて、一晩ブロッキングを行った。翌日、前記メンブレンを、PBTミルク中で1:10,000で希釈した抗−α1−アンチトリプシン抗体で1時間インキュベートした。PBTで5分間の洗浄を6回行った。次に、PBTミルク中1:100,000で希釈した抗マウスIgG−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抗体で1時間インキュベートした。メンブレンについては、PBTでの5分間の洗浄と、PBSでの15分間の洗浄とを更に6回行った。その後、ECL Super Signal West Femto maximum sensitivity substrate(Pierce)を使用し、メンブレンをフィルムに曝して現像作業を行った。
α1−アンチトリプシン用の酵素結合免疫吸着法(ELISA)
α1−アンチトリプシンに対するアフィニティ精製ウサギポリクローナル抗体(Abcam 31657, ケンブリッジ, UK)を、炭酸/重炭酸バッファ(Na2CO3/NaHCO3、pH 9.5)中2μg/mlの濃度で用いて、高結合表面COSTAR96ウェルプレート(Corning, NY, USA)を一晩コーティングした。洗浄(0.9% w/v NaCl, 0.05% v/v Tween 20)後、ブロッキング・バッファ(PBS, 0.25% w/v BSA,0.05% v/v Tween 20)で、前記プレートを2時間ブロッキングした。サンプルとしては:培養培地;又は、50μlのNonidet溶解バッファ(150mM NaCl, 50mM トリス−Cl, pH 7.5, 1% (v/v) Nonidet P−40)で溶解させた細胞;、及び標準液(血漿精製したM型又はZ型のα1−アンチトリプシン)を用いた。そして、これらをブロッキングバッファで希釈し、各ウェルに50μl加えて、2時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、9C5又は2C1モノクローナル抗体(1μg/ml、ブロッキングバッファで希釈)のいずれかで2時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体は、ウサギ抗−マウスIgG HRPラベル抗体(Sigma Aldrich, Haverhill, UK, 1:20,000)を1時間用いて検出した。TMB液体基質(Sigma Aldrich, Haverhill, UK)を用いて10分間暗所で反応を進め、該反応を1MのH2SO4で停止させた。Thermo−max microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)を用いて、450nmの波長で吸光度を測定した。プロテオソーム・ブロッキング・アッセイを行うため、細胞は、回収する前に16時間(一晩)、6ウェルプレート中で増殖させ、10,000分の1に希釈したMG132(AG Scientific, USA)を培養培地に添加した。コントロール・サンプルには、等しい体積量のPBSを加えた。
アルブミン用の酵素結合免疫吸着法(ELISA)
細胞培養培地は24時間にわたって収集し、ケンブリッジ大学病院生物化学診断用研究室(ラボ)にて、屋内用ヒトアルブミン特異的ELISAキット(BioSupply UK)を用いて、トリプリケートで分析を行った。値は、培養培地1mlの100万個の細胞あたりのngとして表した。
シトクロームP450活性
Cyp3A4活性アッセイについては、P450−Gloアッセイキット(Promega)を製造業者の指示に従って使用して、トリプリケートで行った。そして、シトクローム活性は、P450−GloMax 96マイクロプレート・ルミノメーターを使用して分析した。
過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)
製造業者の指示のガイダンスの下、キット(Sigma 395B − 1KT)を使用して、トリプリケートで細胞に対してPAS染色を行った。続いてジアスターゼ消化を行い、陽性染色の原因がグリコーゲンの存在であることを確かめた。
透過型電子顕微鏡(TEM)
細胞を0.9%NaCl溶液で短時間リンスし、温度4℃で4%グルタルアルデヒドで2時間固定した。そして、固定したプレートから、細胞をかきとり、0.1MのPIPESでリンスすることによって再懸濁した。分析はTEMで行った。
LDLの取り込み
Dil−LDL染色キットを提供元から(Stoughton,MA)から購入した。アッセイは、提供元の指示に従って行った。FACS分析は、FH病特有のhiPSC肝細胞中のDil取込と、コントロール(HepG2細胞)中のDil取込とを比べて行った。
GFPレポーター
細胞は、過去の文献に記載されているように[16]、APOA−II−GFPレンチウイルスベクターを用いて形質転換し、顕微鏡で検証を行った。
グルカゴン刺激に応答する代謝酵素
dhiPSC由来の肝細胞は、無血清の高グルコースDMEM培地で6時間培養した(培地への添加物として、2mMのL−グルタミン、100U/lのペニシリン、100ug/mlのストレプトマイシン、及び0.5%のウシ血清アルブミン(全て、Sigma−Aldrichより入手)を添加した)。細胞を、100nMのグルカゴン23塩酸(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)又はPBS(Sigma−Aldrich)(ネガティブ・コントロールとして)で刺激した。刺激して0、1、2、3時間後に、RNeasy Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用してトータルRNAを回収した。そして、製造業者のガイドラインに従って精製した。逆転写については、製造業者のガイドラインに従って、1ugのRNAに対して、25μlの反応混合物中で行った。反応混合物は、200Uのモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、500ngのランダムプライマー、及び0.5mMのデオキシヌクレオチド三燐酸(全て、Promega(Wisconsin, MA)から入手)を含有する。cDNAについては、以下の物を用いてリアルタイム定量PCRを行った:ABI7900 detection システム (Applied Biosystems, Foster City, CA);Taqman PCR Mastermix (Applied Biosystems)、及び遺伝子特異的なフォワード及びリバースプライマー、並びに蛍光発生プローブ。全ての結果については、ヒト36B4を参照遺伝子として標準化させた。PEPCK(Hs00159918_m1)、G6P(Hs00609178_m1)、及びIGFBP1(Hs00426285_m1)に関するプライマー及びプローブは、Applied Biosystemsから、予め製造済みのストックとして購入した。36B4に関するオリゴヌクレオチドは、本発明者側で設計し、Sigma−Aldrich社が合成した(フォワード 5’−GCAGATCCGCATGTCCCTT−3’; リバース, 5’−TGTTTTCCAGGTGCCCTCG−3’; プローブ, 5’−[JOEE]AGGCTGTGGTGCTGATG[TAMRA]−3’)。
A1ATD−hiPSCにおけるZ型変異の修復
A1ATD−hiPSCについては、上記説明の通りである。
2×106のhiPSCをZFN発現ベクター及びドナー・テンプレートでコトランスフェクトした。そして、トランスフェクションから4日後、ピューロマイシン選択(1μg・ml-1)を開始した。トランスポゾンを除去するため、標的細胞にpCMV−yPBase(Yusa, K., et al PNAS U S A 108, 1531−1536 (2011))をトランスフェクトし、4日間培養した。そして、別の培養環境に移し、250nMの1−(2−デオキシ−2−フルオロ−β−D−アラビノフラノシル)−5−インドウラシル (FIAU)で、セレクションをかけた。コロニー形成能力を増加させるために、分離する4時間前、且つプレートにまいて24時間後に、細胞をROCK阻害剤26、Y−27632(10μM)で、処理を行った。得られたコロニーを2週間後に拾い、PCRで分析し、更にサザンブロット分析で確認を行った。
免疫不全のuPAトランスジェニック・マウスにおけるhiPSC由来肝細胞様細胞移植
全てのマウスは、感染源のない屋内に収容した。動物を使った研究については、パスツール研究所の動物実験に関する委員会、及びフランス農務省の承認を得た。分化した細胞(50μlのDMEM中5×105細胞/動物)を、3〜4週齢のALB−uPA+/+;Rag2−/−;Il2rg−/−マウス(n=7)の脾臓に注射した。組織学的分析を行うために移植から2週間後にレシピエント・マウスを犠牲にした。血液サンプルを収集し、血漿中のヒトアルブミンの定量をELISA(Bethy Laboratories)で行った。ヒトアルブミン(Dako)又はヒトA1AT(Dako)特異的な抗体を用いて免疫蛍光を行うことにより凍結肝臓切片を分析した。移植を行っていないマウスをコントロールとして用いた。
結果
罹患した患者からのhiPSC由来肝細胞の5例については、関連する病気で見られる細胞病理の鍵となる特徴(例えば、ミスフォールドされた突然変異体α1−アンチトリプシンが小胞体に蓄積すること;LDL受容体を介したコレステロール取り込みの欠損;、並びに細胞脂質及びグリコーゲン蓄積の上昇)を再現することに成功した。hiPSCが、成人細胞における種々の範囲の遺伝性疾患のモデルとして使用できることを示したのは、これらのデータが初めてである。
肝臓の遺伝性代謝病(IMD)を患う患者からのhiPSCライブラリーの生成
ある範囲のIMDを有する7人の個体及び3人の健常なコントロールからの皮膚生検試料から皮膚の線維芽細胞を得た(20個のhiPSC株、7人の患者、5種類の病気、表1参照)。Yamanakaらによって開発された4種類の因子を用いたアプローチ([13])を用いて、これらの体細胞を多能性幹細胞へと再プログラムした。hiPSC誘導の成功率は、個体ごとに0.01%〜0.1%の範囲で極端に変動した。このことは、異なる年齢及び性別の患者から得た皮膚の線維芽細胞において再プログラムする能力が変動することがあること裏付ける。可能である場合には、同一の個体から生じた株の間で存在する分化能力の保存された多様性を決定するために、更なる分析を目的として、1個体につき3つのhiPSC株を連続して用いた。得られたhiPSC株のライブラリ(10人の個体からの20種類の株)は、以下の事柄で特徴づけた:これらの株の形態、多能性マーカーの発現、三胚葉への誘導物をインビボ及びインビトロで形成する能力、正常の核型、並びに内因性及び外因性の多能性遺伝子の発現プロファイル。
全てのhiPSCが内因性の多能性のマーカーを発現し、神経外胚葉、内胚葉及び中胚葉の細胞へと分化することができた。このことは、本発明者らが、体細胞から多能性幹細胞を生成することができたことを裏付ける。興味深いことに、1つの特定の胚葉へ分化する能力が欠如したhiPSC株は存在しなかった。このことは、本研究の為に生成したhiPSC株の分化能力において、大きな違いがなかったことを示している。更に、異常な核型は、所定の化学的条件の下で長期間(継代40回)増殖させたhiPSCでのみ観察された。このことは、ヒト胚性幹細胞(hESC)([14])についての文献に記載のごとく、hiPSCを増殖させるために使用される培養システムが、遺伝的安定性に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。そこで、「継代数が少ない」hiPSC(継代数30未満、<p30)のみを本研究に用いた。ウイルス組み込みの数は、株や患者間で変化が見られた。このことは、完全な再プログラミングは、ウイルス組み込みの特有のパターンとは関係しない([15])という過去の研究を補強するものである。
最後に、外因性導入遺伝子の異所発現は、本発明者らのhiPSC株においては、ほとんど検出されなかった。このことは、多能性幹細胞において、本発明者らのウィルス性ベクターの効率がサイレンシングを起こしたことを示している。まとめると、これらの結果は、本研究のために生成したhiPSC株は、完全に再プログラムされ、従って、IMDを有する患者に由来するhiPSC株のユニークなライブラリを代表する物であること示している。
患者特有のhiPSC由来の肝細胞を生成するための確実で簡潔な方法の開発
近年、本発明者らは、ヒトES及び正常hiPSCを肝細胞に分化させるための確実性の高いプロトコルを開発した([16])。本発明の培養システムは、患者特有のhiPSC用いて使用するのに最も適した、新規な分化方法の基礎を提供する。本発明者らの主要な目的は、幅広い数のhiPSC株を肝細胞へ効果的に分化させることができる簡潔な方法を開発することであった。健常な個体に由来するhiPSC株(n=6;2つの異なる被験体)、及びα1−アンチトリプシン欠損を有する個体に由来するhiPSC株(n=6;3つの異なる患者)を使用して、広い範囲の培養条件で経験則的にスクリーニングを行った。
得られたプロトコルを図1に記載した。肝細胞の発生の通常の経路での鍵となるステージの後で、3段階のプロトコルが続く。1番目のステップは、hiPSCを内胚葉細胞へと誘導することからなる。ここで、内胚葉細胞は、Sox17、CXCR4、foxA2及びHexを発現し、これらは、前方胚体内胚葉の特異的マーカーである。そして、前方胚体内胚葉は、肝臓細胞の生成元となるものであり(図1b及び1c)、CDM−PVA培地(添加物として、アクチビン、FGF2、BMP−4及びPI3キナーゼ阻害剤)を用いて生成される。得られた内胚葉細胞は、アクチビン及びB27添加物を用いて、肝臓性前駆細胞へと分化させる。肝臓性前駆細胞は、AFP、CK18、CK19、HNF4、及びHNF6(図2、3)を発現する。
最後に、CMRL/肝細胞培養培地混合物(添加物として肝細胞成長因子(HGF)及びオンコスタチン−M)中で成熟させる。このことにより、アルブミン及びα1−アンチトリプシンの両方を発現する肝細胞様細胞が25日目までに生じる(図2、3及び4)。FACS分析によれば、これらの培養条件で生成した80%の細胞がアルブミンを発現した(図4)。このことは、上記アプローチで生成された細胞集団が均一であることを裏付ける。25日目までに、前記細胞は、ヒト肝細胞に非常に酷似した形態を示した。そして、以下の事象をしめした:時折見られる二核性(図1);グリコーゲン貯蔵及び頂部の微小突起(図5);粗面小胞体及び滑面小胞体(ER)、並びに顕著なゴルジ体。更に、hiPSC由来の肝細胞は、生来のヒト肝細胞に類似した機能的特徴をインビトロで共有する。即ち、これらの細胞は、グリコーゲン&LDLを蓄えることができ、アルブミンを分泌することができ、CytP450経路を介して薬剤を代謝することができ(図6)、肝細胞特有のApoAIIプロモーターの制御下でGFP蛋白質を発現することができる。更に、外因性再プログラミング因子の発現は、これらの細胞で抑制されたままであり、このことは、分化した後のレトロウイルス性の導入遺伝子はサイレンシングされたままであることを裏付けている。
これらのデータは、本発明者らによる培養システムで生成した肝臓細胞の関連する機能的特徴を示す相当量の証拠を提供してはいる。しかしながら、これらの細胞が最終的に分化しているわけではないことも本発明者らは認識している。このことは、AFPの発現が持続していることによって証拠付けされる(図2及び3)。その代わり、これらの肝細胞は、胎児の胚発生の最初の三ヶ月間の終わりと、及び完全な成人細胞(α1−アンチトリプシン遺伝子発現のレベル、及びFACSで確認されるアルブミン発現細胞のパーセンテージで示される)という発生学的な両者位置の間のどこかしらに位置している可能性が高い(図1d)。
本発明者らの培養システムで生成した肝臓細胞は、肝細胞マーカーを発現する(例えば、アルブミン(ALB)、α−1−アンチトリプシン(AAT)、αAPOF、TAT、TDO2、TTR、HNF4α及びHHEX)(図4A)。また、胎児のマーカー(例えば、α−フェトプロテイン(AFP)及びCYP3A7)の発現も、分化の過程を通じて維持された。その一方で、成人シトクロームCyp3A4の発現は、比較的低いままだった(図4A)。このことは、これらの細胞が、胎児様肝細胞であることを表し、また、成人細胞を生成するために更なる成熟が必要であることを示唆している。これらの知見は、免疫染色分析及びFACS分析によって裏付けることができる。これらの分析では、ALB、サイトケラチン18、AAT及びAFPが、均質な(homogenous)共発現を示している(図4B及び4C)。しかし、これらの細胞では、肝細胞の機能的特徴も示した(例えば:(i)ALB及びAATの分泌(図4D)、(ii)デキサメタゾンにより誘導可能なCyp3A4活性(図4E)、(iii)コレステロール取り込み、及び(iv)グリコーゲン貯蓄(図4F))。
最後に、本発明者が観察したところでは、本発明の培養システムは、数多くの株に適用された(10人の個体から得た20種類のhiPSC株)。肝臓細胞に分化できなかったhiPSC株は2種類のみであった。
総合すると、これらの結果は、成熟肝細胞に特有の幾つかの機能的特徴を示す集団であり、均一に近い集団であり、そして、胎児の肝臓性細胞である集団へとhiPSCが分化することを誘導するための、本発明者らによる所定の培養条件が効率的であること示す。
患者特有のhiPSCを用いた肝臓病のインビトロ・モデリング:α1−アンチトリプシン欠損
肝臓病をインビトロでモデリングするための、本発明者らのアプローチの有効性については、病気特有のhiPSC(dhiPSC)由来の肝細胞が、該肝細胞の由来元となった病気の鍵となる特徴を再現できるかどうかを調べることで評価した。本発明者らは、まずα1−アンチトリプシン欠損dhiPSCに着目した。これまでの研究によれば、Z型の対立遺伝子(Glu342Lys)の結果として、ER内に保持されるα1−アンチトリプシンが秩序だったポリマー形態で形成されることが示されている([17])。これらのポリマーは、肝細胞内に蓄積し、ヘテロ接合体を、新生児の肝炎、肝硬変及び肝臓細胞の癌へとかかりやすくさせる([18])。こうしたα1−アンチトリプシン・ポリマー化の経路は、臨床上の表現型の中心的なものとなる([17])。そこで、本発明者らは、2C1ポリマー特異的モノクローナル抗体([30])を使用し、α1−アンチトリプシン欠損型のdhiPSC由来の肝細胞内でのポリマーを検出した。ポリマーは、免疫染色(図8)及びELISA(図10)分析で検出した。これらのデータが示すところによれば、α1−アンチトリプシン・ポリマーの蓄積は、α1−アンチトリプシン欠損を有する個体から得たdhiPSC由来の肝細胞でのみ発生した。コントロール被験体から得たhiPSC由来の肝細胞内では、ポリマーは存在しなかった。前記ポリマーの細胞内の局在については、以下の手順で確認した、即ち、細胞の細胞内画分を得て、その後、エンドグリコシダーゼH(図9)で消化した。該酵素は、高マンノースER形態であるN−結合型グリカンを除去し、且つゴルジ体内でシアル酸付加した後の多糖類鎖に影響しない酵素である。
エンドグリコシダーゼH処理により、患者特有のhiPSC由来の肝細胞における全ての細胞内α1−アンチトリプシンが、単一の50−kDaのバンドに減少(分解)した。しかし、コントロールのhiPSC由来の肝細胞では減少しなかった。このことは、こうした全ての細胞内α1−アンチトリプシンがER内に保持されたことを示している。重要なこととして、同一の患者から採取した3種類の異なるhiPSC株間では、一貫してポリマーの増加が観察された。しかし、患者が異なる場合のhiPSC株間では違いが見られた。こうした表現型の多様性は、患者の病状と相関しうるものであり、従って、該病気の臨床上の特徴を反映している可能性がある。しかし、A1ATD患者2に由来するhiPSC株について観察したところ、ポリマーの発現レベルは低かった。また、該細胞では特に内胚葉分化に対して抵抗性であった。従って、本研究において観察された病気の表現型の多様性は、肝臓への効率的な分化を達成するhiPSCの能力を主に反映している。
最後に、将来的なインビトロでの薬剤スクリーニングを目的とした、本発明の細胞株の潜在的な応用について調査するため本発明者らは、プロテアソーム阻害剤(MG132)を培地に一晩添加したことによる効果を評価した。この重要な蛋白質分解経路をブロックすることにより、α1−アンチトリプシン・ポリマーが病気特有の細胞内増加を示すことが明らかとなった(図10)。総合すると、これらの結果により、dhiPSC由来肝細胞は、インビトロにおいて、α1−アンチトリプシン欠損の病理学上の鍵となる特徴をモデリングする能力があり、また、将来的な薬剤スクリーニング・アッセイにおいて有用なものとなる可能性があることが示された。
患者特有のhiPSCを用いた肝臓病のインビトロ・モデリング:家族性高コレステロール血症
本発明者らの培養システムが臨床上の病気をモデリングする能力を確認すること、他の細胞内の局在に特有の病気プロセスを検証できる可能性について調査することを目的として、家族性高コレステロール血症(FH)を有する1人の個体から得たdhiPSC由来の肝細胞の特徴を分析した。FHにおける原始的な欠陥は、LDL受容体の機能が損なわれることにある。この結果として、血漿でのLDLが過剰となり、未成熟なアテローマとなる([19])。FHを有する個体から生成したdhiPSC株は、肝細胞へと分化して、典型的な機能的特徴を示す(図11)。分化した細胞をウェスタンブロット法で分析したところ、LDL受容体が欠損していることを確認した。
こうした受容体の欠陥によるインビボでの機能は、免疫染色及びFACS分析で示すように、本発明者らのモデルにおいても、保存されて表現されている。このことは、FH−dhiPSC由来の肝細胞は、LDLを取り込む能力が欠損していることを示す(図12)。これらの結果は、FHをモデリングためにdhiPSCを使用することに成功する可能性を示しており、従って、膜を通る蛋白質輸送や受容体機能不全に関わる他の病気のモデリングにも適している可能性があることを示している。
患者特有のhiPSCを用いた肝臓病のインビトロ・モデリング:糖原病1a型(GSD−1a)
最後に、本発明者らは、サイトゾルでの代謝の欠損を表す病状のモデリングを行うためのアプローチを用いた。GSD−1aは、グルコース−6−ホスファターゼの欠陥によって引き起こされる。該酵素は、グルコース−6−リン酸をグルコースとリン酸とに加水分解する反応を触媒する主な酵素であり、該反応は、糖新生及びグリコーゲン分解の最終ステップである。GSD−1aを有する個体は、グルコースのホメオスタシスを維持することができず、以下のような症状を経験することとなる:高脂質血症、乳酸アシドーシス、高尿酸血症、低血糖、肝腫脹、腎腫大、及び成長遅延([20])。1つの被験体に由来する3種類のGSD−1a株を分化させ、得られた細胞については、これらの肝細胞に類似の性質についての特徴分析を行った(図13)。
過ヨウ素酸シッフ染色を行ったあとで、細胞内の病気の表現型を確認した。GSD1aの病状のdhiPSC由来の肝細胞では、コントロールと比べると、細胞内グリコーゲンの蓄積量が有意に大きいことが明らかになった(図14)。更に、同細胞は、過剰な脂質蓄積(図15)、及び過剰な乳酸の製造(図17)といった、前記病気に関する他の特徴も再現した。重要なこととして、前記細胞においては、グルカゴンで刺激した後、3つの標準的なグルカゴン応答性遺伝子の発現が誘導された(図16)([21][22])。これらの結果が示すところによれば、GSD1aの鍵となる細胞の態様をインビトロでモデリングできるだけでなく、本発明者らの培養システムで生成した肝細胞は、中間代謝の鍵となるホルモンに対する少なくとも幾つかの応答を示すことができる。従って、本発明者らのアプローチは、他のより一般的な代謝異常のモデリングに応用できることを示唆している。
数多くのhiPSC株を成熟した肝臓の状態の細胞へと効率的に分化させることを可能にするシンプルな所定の化学的培養システムを開発することにより、非神経由来の病気群(該病気は表現型が成人細胞内での複雑な蛋白質調節不全の結果となる病気である)をモデリングを本発明者らは示した。本発明者がモデリングした3種類の病気は、多様な範囲の病理学上の機構を包含している(ER内での蛋白質のミスフォールディングから、細胞表面受容体機能不全まで、そして、最後は、サイトゾルの代謝の阻害)。それにより、本発明の新規のプラットフォームを他の研究領域へと開拓するための幅広い応用できる可能性が潜在することを示す。
本発明者らのモデリング・システムの可能性については、その最たる例として、一群の病気の中から最もありふれており、非常に特徴の分析が行われている病気である、α1−アンチトリプシン欠損を最初に検討する。これまでの研究では、ミスフォールディングが起こること、及びZ型ポリマーがER内にトラップされることが、臨床上の表現型のメカニズムとして存在していることが示されている([17])。しかし、同じ遺伝子型を有する個体間で示す表現型が変化することについては未だ説明がついていない。こうした変化は、ミスフォールドされた蛋白質を取り扱う能力が患者で異なることが原因となっている可能性がある([23][24][8][9,18][7])。こうした蛋白質の処理を担う、肝細胞に特異的な質的コントロールのメカニズムは、今日(こんにち)明らかになりつつある([25,26])。こうした経路の1つであるプロテオソームは、幾つかの肝臓性細胞株([27])及び肝臓外のほ乳動物の細胞株([28])において、Z型α1−アンチトリプシンを代謝する際に重要な役割を果たしている。しかし、これらのプロテオソームは、ヒト肝細胞のプロテオソームにおいて、蛋白質の取り扱いを近似できるに過ぎない。更に言えば、蛋白質分解経路に関する我々の理解が深まってきているものの、Z型のα1アンチトリプシンの蓄積がどのようにして細胞死や肝臓不全を引き起こすのかについては依然として不明である。こうした不明点に対する我々の理解や、及び類似の蛋白質のミスフォールディング異常の原因として重要となる他の関連機構とに対する我々の理解を深めることを目的として、ヒト肝細胞に特有の蛋白質分解経路を解明することは、次の段階の研究として重要である。患者特有のhiPSC由来の肝細胞であって、病気特有の蛋白質のポリマー化及びER内トラップの中核となる要素を保存することができる肝細胞を生成することによって、そして、この新規なインビトロの細胞システムを用いることによって、こうした精巧な細胞内プロセスを潜在的に研究できることを本発明者は本明細書に示している。
更に、本発明者らのデータは、高ストレス(即ち、エキソ・ビボでの再プログラミング及び分化プロトコルは細胞に対して影響を及ぼす可能性がある([8,24]))であることにも関わらず、同細胞内プロセスを正確に保存できることも示している。
続いて、本発明者らのモデリング・システムを用いて、他の2つの病気について評価したが、該評価により、肝細胞における蛋白質の機能不全の下流への影響が、dhiPSCを用いた患者特異的な態様内でも保存されていることが強く示された。まず、本発明者らは、LDL脂質を肝細胞内へ取り込むことを仲介するLDL受容体の欠損を再現することにより、家族性高コレステロール血症に関する新たな細胞モデルを確立することに成功した。前記FHモデルは、受容体機能不全(核合成から、ERを介した輸送まで、果ては細胞膜のリサイクルまで)を支配する肝細胞に特有で生来のプロセスの全体像(holistic impression)を提供するために、いかにして本発明のプラットフォームがユニークに構築されるかを示している。本発明のプラットフォームは、広範囲の肝臓に関連する受容体の病気(receptoropathies)の研究へと更にフォローアップするのに非常に適している可能性がある。
hiPSC由来の肝細胞における遺伝的欠陥の修復
本発明者らは、次に、α1−アンチトリプシン欠損(A1ATD)を有する個体に由来するhiPSCにおいて、piggyback transposonsを用いて、変異の修復を行った(Yusa et al (2011) PNAS USA 108 1531−1536; Wang et al (2008) 105 9290−9295)。A1ATDは、北欧系において2000人に1人の割合で見られる染色体劣勢異常であり、最もありふれたものとして肝臓の遺伝的代謝疾患を代表するものである(Perlmutter, D. H. Cell Death Differ 16, 39−45 (2009); Gooptu, B. & Lomas, D. A. Annu Rev Biochem 78, 147−176 (2009))。該病気は、A1AT遺伝子の単一の点突然変異(Z型対立遺伝子;Glu342Lys)から生じる。そして、該変異により肝細胞の小胞体内で、前記蛋白質の秩序だったポリマー形成を引き起こす。結果として肝硬変を引き起こし、現在唯一の治療法は、肝臓移植のみである。主に、ドナー不足の深刻化や、免疫抑制治療による有害な効果によって、臓器移植が大きく制限されている。従って、hiPSCに基づく治療法の可能性は、大いに魅力的なものとなる。本発明者らはZFN技術を用いた。該技術は、hESC並びにhiPSCにおいて遺伝子ターゲティングを刺激する(Urnov, F. D. et al. Nat Rev Genet 11, 636−646 (2010)、Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851−857 (2009); Zou, J. et al. Cell Stem Cell 5, 97−110 (2009))。Z型変異のサイトを特異的に切断するようにZFNペアを設計した。ターゲティング・ベクターを、PGK−puroΔtkカセットに隣接するpiggyBacリピートとともに同質遺伝子型のDNAから構築した。突然変異部位と、piggyBacトランスポゾンの間の隔たり(違い)を最小限にするため、変異部位の10bp上流にあるCTGロイシン・コドンを、TTAロイシン・コドンに変更した。この結果、TTAA配列が生じた。なお、この配列は、piggyBac除去の後もゲノムの中に残る。
ZFN発現ベクター及びターゲティング・ベクターをエレクトロポレーション法で共に導入し、その後、ピューロマイシン耐性hiPSCコロニーを得た。そして、PCRを用いて、ターゲット・クローンのスクリーニングを行った。3人の異なる患者に由来するA1ATD−hiPSC株を用いてテーゲット・クローンを生成した(表4)。特筆すべきこととして、54%のピューロマイシン耐性コロニーでは、対立遺伝子を片方だけターゲッティングしていた。一方で、対立遺伝子両方を同時にターゲティングしたのは4%であった。
piggyBac隣接選択カセットを、これら改変クローンから除去するため、本発明者らは、高活性形態のpiggyBacトランスポザーゼ(Yusa et al (2011) supra)を2つのホモ接合体のターゲット・クローン(B−16及びC−G4)に一時的にトランスフェクトした。そして、これらのクローンをFIAU選択にかけた。得られたFIAU耐性コロニーの遺伝子型を、PCRで分析し、サザンブロットで確認した。11%のFIAU耐性コロニーで、2対の対立遺伝子の除去が観察された(表5)。配列を分析したところ、Z型変異は、両方の対立遺伝子上で修復されており、当初の計画通り、トランスポゾン除去により、TTAA配列が生じていた。得られた修復済みのA1ATD−hiPSC(c−hiPSC)株は、20回を超える継代の間、多能性のマーカーの発現を維持した。そして、三胚葉のマーカーを発現する細胞へと分化する能力を維持していた。このことは、ゲノム改変によって、c−hiPSCの多能性が変化しなかったことを示している。
本発明者らは、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)を用いて、hiPSC株のゲノムの一貫性を分析した。A1ATD−hiPSC初期株3種のうち2種が、親の線維芽細胞とは異なっており、20kb〜1.3Mbの範囲で、増幅や欠損を示していた(hESCで頻繁に増幅が起こる領域である20q11.21でのゲインを含む)(Lefort, N. et al. Nat Biotechnol 26, 1364−1366 (2008); Spits, C. et al. Nat Biotechnol 26, 1361−1363 (2008))。株Aは、該株の親の線維芽細胞と比べると、通常のゲノム量を保持していた。ZFNがターゲティングを刺激した後、6種類のホモ接合体クローンのうち、4種類では、これらの種の親のhiPSC株と比べるとゲノムに変化がないことを本発明者は確認して安心を得た。二対立遺伝子のpiggyBac除去が行われた16種類の細胞株を、これらと対応する初期のhiPSCを比較した。そして、12種類でゲノムに変化が無かった。また、本発明者はhiPSC株をSNPアレイにより分析し、異型接合性が失われたかどうかについてチェックした。そして、分析した全ての株の全ゲノムで、異型接合性を維持していたことを見出した。こうした知見が示すこととして、二対立遺伝子の遺伝子修復は、同時に相同組換えが起こり、続いて、両方の対立遺伝子が同時に削除された結果起こったものであり、これらのプロセスにおいては有糸分裂組換は関与していなかった。
本発明者らは、修復されたB−16−C2株、及び該株の親の線維芽細胞のエクソーム解析を行った。これらのエクソームの比較により、29種類の変異を特定した。これらの変異の発生については、初期のhiPSC株と、ホモ接合体のターゲット中間体を分析して決定した。24箇所の点突然変異と、1つの1bpの欠損を、初期のhiPSC株で検出した。そして、遺伝子修復の間、4つの変異が発生した:1つは、ターゲティングの間に発生し、後の3つは、piggyBac除去の間に発生した。これらの遺伝的署名(Genomic Signature)は、ZFNのオフ−ターゲットサイト、又はpiggyBac組み込みサイトとも一致しないため、これらの変異は、明らかに培養中に発生したものである。総合すると、本発明者らは、ZFNをpiggyBacと組み合せることにより、hiPSCの基本的な特徴に影響を与えることなく、該hiPSCにおいて迅速且つクリーンに点突然変異を修復することが可能になると結論付けた。
hiPSCの遺伝的修復により、予想通りの表現型修復が得られることを確認するべく、hiPSC(これらの主な細胞種は、病気A1ATDの影響を受けている)を、インビトロで肝細胞様細胞へと分化させた。修復した株を分化させたところ、予想通り、ほぼ同質の肝細胞様集団が生じた。
特筆すべきこととして、分化細胞をCGH分析したところ、肝臓への分化によって、遺伝的な異常の数を増加させることもなく、また、異常な核型を有する細胞へと選択されることもなかった。得られた細胞は、これらのインビボでの対応物と共通する形で、鍵となる機能的属性を有していた(該属性として、グリコーゲン貯蓄、LDL−コレステロール取り込み、アルブミン分泌、及びシトクロームP450活性が挙げられる)。重要なこととして、c−hiPSC由来肝細胞様細胞において、突然変異ポリマー性A1ATが存在せず、代わりに、エンドグリコシダーゼ−H非感受性である通常のモノマーA1ATを効率的に分泌することが、免疫蛍光及びELISAの両方で示された(図19A−D)。更に言うと、分泌されたA1ATは、正常な成人肝細胞から得られた物に匹敵する酵素的阻害活性を示した(図19E)。かくして、酵素阻害活性の生理学的回復が達成できたことが示された。
最後に、ALB−uPA+/+;Rag2−/−;Il2rg−/−マウスの肝臓へ脾内注射により移植した後、c−hiPSC由来肝細胞様細胞(B−C16−2株)のインビボでの機能を評価した。注射して14日後に肝臓を回収した。そして、ヒト細胞がコロニー化しているのが見出された。これについては、ヒトアルブミン及びA1ATに特異的な抗体で特定した(図19F、G)。これらヒト肝細胞様細胞は、肝臓の各葉全体に分散していた。そして、既存のマウス柔組織に組み込まれているのが観察された(図19F、G)。更に言うと、ヒトアルブミンが、少なくとも5週間の間、移植した動物の血清中で検出された(図18H)。一方で、どのマウスでも腫瘍の形成は検出されなかった。従って、c−hiPSC由来肝細胞様細胞は、インビボ(肝臓)で、コロニーを形成することができ、ヒトESC由来の該当物に特徴的な機能的活性を示した(Touboul, T. et al. Hepatology 51, 1754−1765 (2010))。纏めると、これらの分析から、Z型変異を遺伝的に修復することにより、患者由来の細胞におけるA1ATの機能を回復させることができることが示された。
上述した実験証拠により、A1ATDの細胞ベースの治療を目的とした、患者特有のiPSCにおける遺伝的修復へ応用できる可能性が示された。
遺伝的修復は、より臨床面から関係の深い細胞において、線維芽細胞から再プログラムされた患者特有のiPSCを用いて、センダイウイルス・ベクター(組み込みを行わない方法)で繰り返し行われてきた(Fusaki, N., et al. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 85, 348−362 (2009))。CGH分析により、未修復のゲノムを有することが分かっている初期のhiPSC株は、上述した方法で修復した。最終生成物であるiPSC−3−G5−A7は、修復されたA1ATを有し、親の線維芽細胞を比べると無傷のゲノムを有しており、肝細胞様細胞へと分化した際には、通常のA1AT蛋白質を発現した。変異修復済みの患者特有のiPSCを生成できることを示したのは今回が初めてである。
修復されたiPSCは、効率的に肝細胞様細胞へと分化し、また、腫瘍を形成することなく、肝臓損傷の動物モデルへと移植された。更に言えば、異なる患者に由来するhiPSCが効果的に修復することができ、このことは、本発明の方法が多数のA1ATD−hiPSC株に適用可能であることを示している。2対の対立遺伝子の修復が4ヶ月未満で行うことができたことから、本発明者らのアプローチは、A1ATDのみならず、他の単一遺伝子性の異常についても修復された患者特有のhiPSCを大規模に生成することに適合できる可能性がある。
結論として、本研究は、幾つかの意味で、hiPSCの分野を発展させるものとなった。第一に、成人細胞に影響を及ぼす異なる病気を、単一のプラットフォームを用いて、モデリングできる可能性があることを示した。このことは、hiPSC病気のモデリングの分野において、最も差し迫った問いに対する答えの一つとなった。従って、これらの実現化により、多様な研究分野への潜在的な応用のための、確実で、容易で、再現性の高い技術的資源を提供することが可能となった。第二に、種々の遺伝的及び病理的背景を有する多数の患者から、hiPSC由来の肝細胞を生成することができることを示した。このことにより、本発明者らのシステムは、肝臓を標的とし、且つ医薬産業に潜在的に関連する化合物について、早期段階での安全性や治療用スクリーニングを行うための効率的且つ新規の方法となることが示された。最後に、そして、おそらく最も重要なこととして、細胞ベースの治療法に理想的な肝細胞であり、ある群の病気を有する多数の患者特異的な肝細胞を均一に生成する能力があることを示した。このことは、患者特有のhiPSC技術を提供するための別途重要なステップを本発明者らが再度踏み出したことを示している。
本発明は一側面において以下の発明を包含する。
(発明1)
肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:
(i)人工多能性幹(iPS)細胞の集団を提供するステップ;
(ii)前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体(anterior definitive)内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記内胚葉誘導培地は、以下の性質を持つ所定の化学培地である:
線維芽細胞成長因子活性を有し、
SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路、並びにSMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激し、並びに
ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)を阻害する);並びに
(iii)ADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
(ここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である)。
(発明2)
発明1に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。
(発明3)
発明1又は発明2に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。
(発明4)
発明3に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。
(発明5)
発明1〜4の何れか1項に記載の方法であって、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激する第二のTGFβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。
(発明6)
発明5に記載の方法であって、前記第二のTGFβリガンドが骨形成蛋白質である該方法。
(発明7)
発明1〜6の何れか1項に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が、PI3K阻害剤及びGSK3β阻害剤を含む該方法。
(発明8)
発明7に記載の方法であって、前記PI3K阻害剤がLY294002である該方法。
(発明9)
発明7又は発明8に記載の方法であって、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である該方法。
(発明10)
発明1〜9の何れか1項に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記肝臓性誘導培地が含む該方法。
(発明11)
発明10に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。
(発明12)
発明1〜11の何れか1項に記載の方法であって、前記ステップ(ii)が、以下のサブステップを含む該方法:
(a)iPSCの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること;
(b)GSK3β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること;並びに
(c)前方胚体内胚葉(ADE)誘導培地中で前記集団を更に培養して、ADE細胞の前記集団を生成すること(ここで、該培地はSMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激し、並びに線維芽細胞成長因子活性を有する)。
(発明13)
発明12に記載の方法であって、前記ADE誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。
(発明14)
発明12又は発明13に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記AE誘導培地が含む該方法。
(発明15)
発明14に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。
(発明16)
発明12〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップa)〜c)のそれぞれにおいて24時間培養する該方法。
(発明17)
発明1〜16の何れか1項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法:
(iv)前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。
(発明18)
発明17に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団を10〜20日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップ。
(発明19)
発明17又は発明18に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び/又はα1-アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。
(発明20)
発明17〜19の何れか1項に記載の方法であって、少なくとも80%の前記肝細胞の集団がアルブミン及び/又はα1-アンチトリプシンを発現する該方法。
(発明21)
発明17〜20の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団又は肝細胞を増殖させるステップを含む該方法。
(発明22)
発明17〜21の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。
(発明23)
発明17〜22の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。
(発明24)
発明1〜23何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を、医薬的に許容可能な賦形剤と混合するステップを含む該方法。
(発明25)
発明1〜24何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞がヒトiPS細胞である該方法。
(発明26)
発明1〜25何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が継代された回数が30回以下である該方法。
(発明27)
発明1〜26何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が1の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。
(発明28)
発明1〜27何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓組織を有する1の個体から得た細胞に由来し、そして、前記集団中の前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。
(発明29)
発明28に記載の方法であって、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、前記iPS細胞において修復され、その結果、前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。
(発明30)
発明29に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常(IMD)である該方法。
(発明31)
発明30に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
(発明32)
発明29に記載の方法であって、前記遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、A1ATにおけるGlu342Lys変異であり、前記肝臓病がα1アンチトリプシン欠損である該方法。
(発明33)
発明1〜27の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の前記肝細胞が病気の表現型を示す該方法。
(発明34)
発明33に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常である該方法。
(発明35)
発明34に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
(発明36)
発明33〜35の何れか1項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における1種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。
(発明37)
発明36に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の1種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
(発明38)
発明33〜37の何れか1項に記載の方法であって、前記集団中の前記肝細胞における遺伝的変異又は遺伝的欠陥を修復して、前記肝細胞が正常な表現型を示すステップを含む該方法。
(発明39)
発明1〜35又は38の何れか1項に記載の方法によって製造され、単離された肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団であって、前記前駆細胞又は肝細胞が正常な表現型を示す該集団。
(発明40)
ヒト又は動物の身体を治療する方法において使用するための発明39に記載の集団。
(発明41)
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法において使用するための発明40に記載の集団。
(発明42)
発明36〜37の何れか1項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示す該集団。
(発明43)
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法であって、以下のステップを含む方法:
肝細胞の発明39に記載の肝細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。
(発明44)
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療で使用するための医薬の製造における発明39に記載の集団の使用。
(発明45)
化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法:
発明1〜38の何れか1項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ;及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び/又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。
(発明46)
発明45に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法(ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す)。
(発明47)
発明46に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。
(発明48)
発明47に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法:
前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び/又は
前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。
(発明49)
肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法:
発明1〜38の何れか1項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ;、及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ。
(発明50)
発明49に記載の方法であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における1種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。
(発明51)
発明50に記載の方法であって、以下の1種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
(発明52)
発明50〜51の何れか1項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、前記肝細胞における1種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
(発明53)
発明49に記載の方法であって、前記肝細胞が正常な表現型を示す方法であり、1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。
(発明54)
発明53に記載の方法であって、前記1種以上の肝細胞の機能が以下から選択される該方法:解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の生成、 トロンボポイエチンの生成、アンギオテンシノゲンの生成、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。
(発明55)
発明53〜54の何れか1項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力が増加することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
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30. Miranda, E., et al., (in press − Hepatology)

Claims (30)

  1. 肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:
    (i)人工多能性幹(iPS)細胞の集団を提供するステップ;
    (ii)前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体(anterior definitive)内胚葉(ADE)細胞の集団を生成するステップ
    (ここで、前記内胚葉誘導培地は、以下を含む所定の化学培地である:
    1〜500ng/mlの線維芽細胞成長因子;
    10〜1000ng/mlのSMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激するTGFβリガンド;
    1〜500ng/mlの骨形成蛋白質;
    1〜100μMのホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)阻害剤;及び
    0.3〜30μMのグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3β(GSK3β)阻害剤);並びに
    (iii)ADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
    (ここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する5〜500ng/mlのTGFβリガンドを含む所定の化学培地であり、前記iPS細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の肝臓性前駆細胞が病気の表現型を示す)。
  2. 請求項1に記載の方法であって、前記TGFβリガンドがアクチビンである該方法。
  3. 請求項1又は2に記載の方法であって、前記PI3K阻害剤がLY294002である該方法。
  4. 請求項1〜3の何れか1項に記載の方法であって、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である該方法。
  5. 請求項1〜4の何れか1項に記載の方法であって、前記TGFβリガンドがアクチビンである該方法。
  6. 請求項1〜5の何れか1項に記載の方法であって、前記ステップ(ii)が、以下のサブステップを含む該方法:
    (a)iPSCの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること;
    (b)GSK3β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること;並びに
    (c)前方胚体内胚葉(ADE)誘導培地中で前記集団を更に培養して、ADE細胞の前記集団を生成すること(ここで、該培地はSMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激する10〜1000ng/mlのTGFβリガンド、並びに線維芽細胞成長因子を含む)。
  7. 請求項6に記載の方法であって、前記TGFβリガンドがアクチビンである該方法。
  8. 請求項6又は7に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップa)〜c)のそれぞれにおいて24時間培養する該方法。
  9. 請求項1〜8の何れか1項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法:
    (iv)前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、病気の表現型を示す肝細胞の集団を生成するステップ。
  10. 請求項9に記載の方法であって、前記ステップ(iv)が、前記肝臓性前駆細胞の集団を10〜20日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップである、該方法
  11. 請求項9又は請求項10に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び/又はα1-アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。
  12. 請求項9〜11の何れか1項に記載の方法であって、少なくとも80%の前記肝細胞の集団がアルブミン及び/又はα1-アンチトリプシンを発現する該方法。
  13. 請求項9〜12の何れか1項に記載の方法であって、肝細胞の集団を増殖させるステップを含む該方法。
  14. 請求項9〜13の何れか1項に記載の方法であって、肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。
  15. 請求項9〜14の何れか1項に記載の方法であって、肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。
  16. 請求項1〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞がヒトiPS細胞である該方法。
  17. 請求項1〜16の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が継代された回数が30回以下である該方法。
  18. 請求項1〜17の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が1の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。
  19. 請求項1〜18の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常(IMD)である該方法。
  20. 請求項19に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin−Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
  21. 請求項1〜20の何れか1項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における1種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。
  22. 請求項21に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の1種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
  23. 請求項9〜15の何れか1項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、成熟肝細胞のマーカーであるアルブミン(ALB)及びα1−アンチトリプシン(AAT)並びに胎児肝細胞のマーカーであるα−フェトプロテイン及びCYP3A7を発現する該集団。
  24. 化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法:
    請求項9〜22の何れか1項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ;及び
    前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び/又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。
  25. 請求項24に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法(ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す)。
  26. 請求項24に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。
  27. 請求項26に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法:
    前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び/又は
    前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。
  28. 肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法:
    請求項1〜22の何れか1項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ;、及び
    前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ
    (ここで、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における1種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する)。
  29. 請求項28に記載の方法であって、以下の1種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。
  30. 請求項28又は29に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、前記肝細胞における1種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
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