KR102374087B1 - 면역 컨쥬게이트 및 그의 용도 - Google Patents

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KR102374087B1
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유정수
압히나브 바이즈
이웅희
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 신규 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염, 상기 화합물-단백질 컨쥬게이트 및 상기 컨쥬게이트를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 신규 화합물을 포함하는 컨쥬게이트 및 그를 포함하는 조성물은 방사성 동위원소를 이용하여 생체 내 뚜렷한 영상을 제조할 수 있어, 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

면역 컨쥬게이트 및 그의 용도{IMMUNO-CONJUGATES AND USES THEREOF}
면역 컨쥬게이트 및 그의 영상화 또는 암 진단을 위한 용도에 관한 것이다.
단일클론항체는 항원을 특이적으로 표적할 수 있어, 일반적으로 종양학에서 진단학 및 치료학에 널리 이용되고 있다. 면역 양전자 방출 방사성 표지 항체를 사용하는 단층 촬영(Immuno-PET)은 항체의 생체 내 행동을 실시간으로 모니터링 하기 위한 핵 이미징 기술이다. 면역-PET은 종양 진단, 면역 요법 및 방사선 면역 요법에 유용한 정보를 제공한다. 최근 암 면역치료제의 성공으로 인해, 면역 PET 영상화의 중요성도 커지고 있다.
그러나 항체의 방사성 표지 과정은 정교한 과정이므로 엄격한 조건에서 항체의 취약성으로 인해 다양한 반응 매개 변수 (pH, 완충액, 온도, 시간, 유기 용제)를 고려해야 한다. 또한, 항체는 전형적으로 분해되어 40 ℃ 이상에서 면역 반응을 잃고, 극한의 pH 범위와 고농축의 유기 용매에서도 불안정하다. 또한, 항체는 방사성 분해에 대한 민감도가 높기 때문에 항체의 노출 시간은 최소화해야 한다.
방사능 표지된 항체가 생체 내 이미징을 위해 체내에 주입 될 때, 여전히 고려해야 할 사항이 있다. 첫 째는, 방사성 표지된 항체는 생체 내 혈액 순환 동안 해리 없이 항체에 단단히 연결되어야 하나, 우리 신체 시스템은 다양한 대사 메커니즘에 의해 외인성 화합물을 포획하고 분해하는데 매우 효과적이라는 점이다. 둘째, 항체 이미징을 위해서, 방사성 표지된 킬레이터의 생체 내 안정성은 중요한 이슈가 되는데, 이는 항체의 반감기가 일반적으로 더 길고, 그로 인해, 방사성 표지된 항체는 채내로부터 배출되기 전에 더 긴 시간 동안 demetallation의 기회에 노출된다는 점이다.
이에, 생체 내 안정하고 오래 잔류할 수 있고, 뚜렷한 영상화가 가능한 신규한 면역 컨쥬게이트의 개발이 요구되고 있다.
한국특허출원 제10-2019-7036943호
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure 112020040580890-pat00001
.
다른 양상은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 2]
Figure 112020040580890-pat00002
.
또 다른 양상은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물-단백질 컨쥬게이트를 제공하는 것이다:
[화학식 8]
Figure 112020040580890-pat00003
.
또 다른 양상은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 컨쥬게이트를 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 컨쥬게이트를 포함하는 질병 진단을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]
Figure 112020040580890-pat00004
상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 R1, R2 및 R'는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 R3는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬이고; 상기 R3는 H, 치환 또는 비치환된 알킬이고; 상기 R'는 치환 또는 비치환 알키닐이고; 상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
더욱 상세하게는, 상기 X는 카르복시메틸이고; 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; 상기 R3는 H이고; 상기 R'는 프로파길(propargyl)인, 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
다른 양상은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112020040580890-pat00005
상기 A는 O 또는 단일결합이고;
상기 B는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
상기 n은 1 내지 10 중 어느 하나의 정수이고;
상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 Y는 O 또는 NR6이고;
상기 Z는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질 또는 링커에 부착을 위한 적어도 하나 이상의 산소 또는 치환 가능한 질소를 포함하는 것 또는 H이고;
상기 R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 R3 및 R6는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 B는 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; 상기 n은 1 내지 5 중 어느 하나의 정수이고; 상기 R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬이고; 상기 R3 및 R6는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬이고; 상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고; 상기 Z는 H 및 하기의 화학식 3 내지 화학식 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
[화학식 3]
Figure 112020040580890-pat00006
[화학식 4]
Figure 112020040580890-pat00007
[화학식 5]
Figure 112020040580890-pat00008
[화학식 6]
Figure 112020040580890-pat00009
.
더욱 상세하게는, 상기 B는 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; 상기 n은 1 내지 5 중 어느 하나의 정수이고; 상기 X는 카르복시메틸이고; 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; 상기 R3 및 R6은 H이고; 상기 R4는 에틸이고; 상기 Z는 H 및 하기의 화학식 3 내지 화학식 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
[화학식 3]
Figure 112020040580890-pat00010
[화학식 4]
Figure 112020040580890-pat00011
[화학식 5]
Figure 112020040580890-pat00012
[화학식 6]
Figure 112020040580890-pat00013
.
일 구체예에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 방사선 동위원소가 표지된 것일 수 있다. 다양한 방사성 핵종이 방사성 컨쥬게이트된 단백질의 생성을 위해 이용가능하다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 낮은 에너지의 방사성 핵(예를 들어 진단 목적에 적합한), 예컨대　13C,　15N,　2H,　125I,　123I,　99Tc,　43K,　52Fe,　67Ga,　68Ga,　111In 등을 포함한다. 더욱 상세하게는, 방사성 핵종은 투여와 이미징 자리에 배치 사이의 경과된 시간 후 활성 및 검출을 허용하기에 적당한 반감기를 가지는 감마, 광전자 또는 양전자 방출 방사성 핵종이다. 본 발명은 또한 높은 에너지 방사성활성 핵(예를 들어, 치료적 목적을 위해), 예컨대　125I,　131I,　123I,　111In,　105Rh,　153Sm,　67Cu,　67Ga,　166Ho,　177Lu,　186Re 및　188Re을 포함한다. 이 동위원소는 전형적으로 짧은 경로 길이를 가지는 높은 에너지 α- 또는 β-입자를 생성한다. 이러한 방사성 핵종은 바로 근접한 세포, 예를 들어 컨쥬게이트가 부착되거나 도입된 신생 세포를 사멸시킨다. 그것들은 비편재화된(nonlocalized) 세포에 효과가 거의 없거나 전혀 없고, 본질적으로 비면역원성이다. 대안으로, 고에너지 동위원소는 달리 안정한 동위원소의 열적 자극, 예로서 붕소 중성자 포획 치료법(Guan et al., 1998)에 의해 만들어질 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 전구 약물의 형태로 제공될 수 있다. 전구 약물의 형태로 제공된 조성물은 생체 내에서 미리 투여된 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질과 결합하여 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 개체 내 먼저 투여된 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질과 연결되는 선표적 기법을 위한 것일 수 있고, 상기 화학식 2의 화합물과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 바로 연결되거나 링커를 통해 연결되는 것일 수 있다.
상기 화합물과 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질의 투여 간격은 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 수 있다.
본 명세서에 용어 "선표적 기법(pretargeting techonology)"에 대해 도 10 및 11을 참조하여 설명하면, 특정 이론에 제한됨이 없이, 상기 단백질이 항체일 경우, 항체를 먼저 투여하면 종양에 결합된 항체만 남고 다른 부위에서는 항체가 빠져나가게 되고, 이후에 방사선 동위원소 표지된 일 구체예에 따른 화합물을 투여하면 상기 화합물이 종양에 결합된 항체에 결합하여 컨쥬게이트를 형성하여 종양을 영상화할 수 있는 것을 의미할 수 있다. 또한, 특정 이론에 제한됨이 없이 항체는 체외로 빠져가나는데 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일이 소요되는데, 방사선 동위원소 표지된 일 구체예에 따른 화합물은 저분자로서 체외에서 상대적으로 빨리 빠져나가게 되고, 따라서 항체와 결합하지 않은 킬레이트는 수시간 내로 체외에서 빠져나갈 수 있다. 상기한 바와 같은 원리로, 일 구체예에 따른 화합물 또는 컨쥬게이트는 백그라운드를 현저하게 줄일 수 있어 깨끗한 종양 영상을 얻을 수 있는 효과가 있다. 일 구체예에 따른 컨쥬게이트에 대해서는 후술한다.
다른 양상은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물-단백질 컨쥬게이트를 제공한다:
[화학식 8]
Figure 112020040580890-pat00014
.
상기 화학식 8에서,
D는 상기 화학식 2로 표시되는 화합물이고, L은 링커이거나 단일 결합이며, P는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이고, k는 1 내지 20 사이의 정수이며, 상기 D의 Z는 링커 또는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질에의 부착을 위한 적어도 하나 이상의 산소 또는 치환 가능한 질소를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 일 구체예에 따른 화합물 D와 링커 L을 통한 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질 P의 결합은 생체 내(in vivo)에서 일어나는 것일 수 있다. 이와 같은 선표적에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질", "표적세포 인식능을 갖는 단백질", 또는 "표적 세포 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질"은 세포의 수용체 또는 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 또는 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 표적 세포 또는 표적 단백질은 또한, 암 세포 또는 암 세포에서 발현하는 단백질(수용체)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "항체(antibody)"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인　단백질　분자를 의미한다. 본 명세서의 목적상,　항체는 표적 세포 또는 표적 세포에서 발현하는 수용체에 대해 특이적으로 결합하는　항체를 의미하며, 이러한　항체는, 각　유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커　유전자에 의해 코딩되는　단백질을 얻고, 얻어진　단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기　단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 명세서의　항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날　항체, 모노클로날　항체, 인간화 항체, 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부인 항원 결합 단편도 본 명세서의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린　항체가 포함될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "애피바디 분자(affibody molecule)"는 특정 타겟 단백질(수용체)에 결합할 수 있는, 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디 분자는 20 내지 150의 아미노산 잔기로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성된 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 애피바디 분자는 항-ErbB 애피바디 분자(ab31889), HER2-특이적 애피바디 분자(ZHER2:342), 항-EFFR 애피바디 분자(ZEGFR:2377) 등을 포함할 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 세포의 특정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 분자를 모두 포함한다. 상기 애피바디 분자가 인식할 수 있는 표적 수용체 또는 표적 단백질의 예는, 아밀로이드 베타 펩티드, 시누클레인(예를 들면, 알파-시누클레인), 아포리포프로테인(예를 들면, 아포리포프로테인 A1), 보체 인자(Complement factor)(예를 들면, C5), 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)(예를 들면, CAIX), 인터루킨-2 수용체 알파 사슬(IL2RA; CD25), 세포 표면의 CD 항원(예를 들면, CD28), 또는 c-Jun, Factor VIII, 프비르노겐, GP120, H-Ras, Her2, Her3, HPV16 E7, IAPP(Human islet amyloid polypeptide), 이뮤노글로불린 A(IgA), IgE, IgM, 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-6, IL-8, IL-17), 인슐린, 스타필로코커스 단백질 A 도메인(Staphylococcal protein A domain), Raf-1, LOV 도메인(Light-oxygen-voltage-sensing domain), 또는 RSV G 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(Aptamer)"는 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 의미할 수 있다. 본 명세서의 목적상, 앱타머는 표적 세포 또는 표적 세포에서 발현하는 수용체에 대해 특이적으로 결합하는 분자를 의미하며, SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 등의 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈는 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
이하에서는 링커를 통한 화합물의 단백질과의 컨쥬게이션 방법에 대해 설명한다.
화합물을 시스테인에 컨쥬게이션하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 컨쥬게이션을 위한 시약은 전형적으로 (i) 표지된 단백질을 형성하는 시스테인의 시스테인 티올과 직접적으로, (ii) 링커-표지 중간체를 형성하는 링커 시약과, 또는 (iii) 표지된 단백질을 형성하는 링커 단백질과 반응 작용성을 함유한다. 링커의 경우에, 몇몇 경로, 사용하는 유기 화학 반응, 조건 및 시약은 당업자에게 알려져 있으며, (1) 본 발명 단백질의 시스테인 기를 링커 시약과 반응시켜 공유 결합을 통해 단백질-링커 중간체를 형성한 다음 활성화된 화합물과 반응; 및 (2) 화합물의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜 공유 결합을 통해 화합물 링커 중간체를 형성한 후 본 발명 단백질의 시스테인 기와 반응하는 것을 포함한다. 2작용성 링커가 본 발명에서 유용하다는 것은 앞서 언급한 것으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어 2작용성 링커는 시스테인 잔기(들)에 공유결합을 위한 티올 변형기 및 화합물에 공유적 또는 비공유적 결합을 위한 적어도 하나의 부착 모이어티(예를 들어, 제2 티올 변형 모이어티)를 포함한다.
다양한 단백질 및 화합물(및 링커)이 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 티올 기는 친핵성이며, 다음을 포함하는 링커 시약 또는 화합물-링커 중간체 또는 약물 상에서 친전자적 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다: (i) 활성 에스터, 예컨대　NHS　에스터, HOBt 에스터, 할로포르메이트 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물, 예컨대 할로아세트아마이드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기; 및 (iv) 설파이드 교환을 통해 피리딘 다이설파이드를 포함하는 다이설파이드. 화합물 또는 링커 상의 친핵성 기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진, 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드 기를 포함한다.
다른 작용기가 또한 사용될 수 있고, 표지 시약은, 말레이미드, 할로아세틸, 요오도아세트아미드 숙시닐이미딜 에스터, 이소티오시아네이트, 설포닐 클로라이드, 2,6-다이클로로트라이아지닐, 펜타플루오로페닐 에스터, 및 포스포르아미다이트를 포함한다.
다른 예시적인 반응성 작용기는 화합물, 예를 들어 비오틴 또는 형광 염료 또는 독소 또는 단백질의 카복실기 치환체의 N-하이드록시숙신이미딜 에스터(NHS)이다. 화합물의　NHS　에스터는 사전형성되고, 분리되고, 정제되고 및/또는 특징화될 수 있고, 또는 인시츄(in-situ)로 형성되어 단백질의 친핵성 기와 반응된다. 전형적으로, 화합물의 카복실 형태는 카보다이이미드 시약, 예를 들어 카보다이이미드 시약, 예를 들어, 다이사이클로헥실카보다이이미드, 다이아이소프로필카보다이이미드, 또는 우로늄 시약, 예를 들어, TSTU(O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU(O-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 또는 HATU (O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트),활성제, 예컨대 1-하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt), 및 N-하이드록시숙신이미드의 일부 조합과 반응에 의해 활성화되어 화합물의　NHS　에스터를 제공한다. 일부 경우에, 본 화합물 및 단백질은 화합물의 인시츄 활성화 및 단백질과 반응에 의해 커플링되어 한 단계로 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 다른 활성화 및 커플링 시약은 TBTU(2-(1H-벤조트라이아조-1-일)-1-1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TFFH(N,N',N',N'-테트라메틸우로늄 2-플루오로-헥사플루오로포스페이트), PyBOP(벤조트라이아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄헥사플루오로포스페이트, EEDQ(2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-다이하이드로-퀴놀린), DCC(다이사이클로헥실카보다이이미드); DIPCDI(다이아이소프로필카보다이이미드), MSNT(1-(메시틸렌-2-설포닐)-3-나이트로-1H-1,2,4-트라이아졸, 및 아릴 설포닐 할로겐화물, 예를 들어, 트라이아이소프로필벤젠설포닐 클로라이드를 포함한다.
추가적인 컨쥬게이션 방법은, 예를 들어 시스테인의 티올기와 반응하여 화합물과 반응성인 티오에스터를 생성하기 위한 말레이미드, 요오도아세트이미드 또는 할로아세틸/알킬 할로겐화물, 아지리딘, 아크릴로일 유도체의 사용을 포함한다.
트레오닌 또는 세린 잔기에 화합물을 컨쥬게이션하는 방법이 또한 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Zhang and Tam (1996)은 과요오드산 염에 의해 선택적으로 및 빠르게 알데하이드 형태로 변환될 수 있는 카보닐 전구체가 세린 또는 트레오닌의 1,2-아미노알코올로부터 유도되는 방법을 설명하였다. 본 발명의 단백질에 부착되는 화합물 내 시스테인의 1,2-아미노티올과 알데하이드의 반응은 안정한 티아졸리딘 생성물을 형성한다. 이 방법은 N-말단의 세린 또는 트레오닌 잔기에서 단백질 표지에 특히 유용하다.
화합물을 컨쥬게이트하기 위한, 예를 들어 PEG를 단백질에 컨쥬게이트하기 위한 다양한 방법이 또한, 알려져 있다. 예를 들어, PEG 다이클로로트라이아진 유도체를 생성하기 위해 시아누르 클로라이드를 사용하여 PEG를 활성화하였다. 이 유도체는 리신, 세린, 티로신, 시스테인 및 히스티딘과 같은 다수의 기능성 친핵성 작용기와 반응할 수 있다. 이 프로토콜의 변형된 형태는 PEG-클로로트라이아진을 만드는데, 이것은 더 낮은 반응성을 가지면 리신 또는 시스테인 잔기와 더 선택적으로 컨쥬게이션한다. 단백질과 컨쥬게이트를 위하여 사용되는 PEG의 예시는, PEG-프로피온알데하이드, 숙신이미딜 카보네이트 PEG(SC-PEG) 및 벤조트라이아졸 카보네이트 PEG를 포함할 수 있다.
또한, PEG 카복실산의 활성 에스터는 아마도 단백질 컨쥬게이션에 대해 사용될 수 있는 아실화제 중 하나이다. 활성 에스터는 생리적 조건 근처의 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드를 형성한다. 숙신이미딜 활성 에스터로 PEG-카복실산의 활성화는 PEG-카복실산을 N-하이드록시숙신이미드(NHS　또는 HOSu) 및 카보다이이미드와 반응시킴으로써 수행된다. PEG의 예시적인 카복실산 유도체는 카복시메틸화된 PEG, 부타논산 유도체 및 프로피온산 유도체를 포함한다. 메틸렌 단위의 부가에 의해 활성 에스터와 PEG 백본 사이의 거리를 변화시키는 것은 물과 아민에 대한 반응성에 극적으로 영향을 미칠 수 있다(예를 들어, 환원성 가수분해에 의함). 대안으로 또는 추가로, 가수분해는 카복실산에 α-분지 모이어티를 도입하여 환원될 수 있다.
단백질 내 유리 시스테인 잔기의 페길화는 자리 특이적 컨쥬게이션에 유용하다(예를 들어 본 명세서에 설명된 시스테인 잔기를 포함하도록 변형된 단백질을 사용). 시스테인 컨쥬게이션에 대한 예시적인 PEG 유도체는 PEG-말레이미드, PEG-비닐설폰, PEG-요오도아세트아미드 및 PEG-오르소피리딜 다이설파이드를 포함한다.
본 발명의 화학식 2의 화합물, 또는 그를 포함하는 컨쥬게이트는 연구, 진단적 및 치료적 용도를 포함하는 다양한 용도에서 유용하다. 단백질이 결합되는 항원에 따라서, 세포에 화합물을 전달하는 것 및/또는 이미징하는 것 및/또는 시험관 내 분석에 유용할 수 있다.
따라서, 다른 양상은 상기 화학식 2의 화합물 또는 상기 컨쥬게이트를 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 화학식 2의 화합물 또는 상기 컨쥬게이트를 포함하는 질병의 진단 또는 예측을 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 화학식 2의 화합물 또는 상기 컨쥬게이트를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 생체 내 영상화하는 방법 또는 질병을 진단 또는 예측하는 방법을 제공한다.
상기 조성물은 상기 화학식 2의 화합물 또는 컨쥬게이트를 50 μCi-1000 μCi/kg의 양으로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단" 및 이에 제한되는 것은 아니지만 "진단하다", "진단된" 또는 "진단하는"과 같은 그것의 변형은 재발 질병의 임상적 상태 또는 진단의 임의의 주요한 진단을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "예측", "예측하는" 및 변형은 회복 또는 재발의 가능성을 포함하는 질병의 가능성 있는 결과 또는 과정을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "투여"는 일 구체예에 따른 화합물 또는 컨쥬게이트의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 패치 또는 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 상기 투여는 링커 L이 연결된 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질 P를 투여한 후, 순차적으로 상기 화학식 2의 화합물을 투여하는 것일 수 있다. 이와 같은 선표적에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 질병은 암 또는 종양을 포함할 수 있다. 본 명세서의 컨쥬게이트는 신생물로부터 유래한 종양 또는 암을 치료 또는 인식하는 방법에서 사용될 수 있다. 신생물은 악성 또는 양성일 수 있으며, 암은 원발성 또는 전이성일 수 있고; 신생물 또는 암은 초기 또는 말기일 수 있다. 치료될 수 있는 신생물 또는 암의 비-제한적 예에는 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종 (소아 소뇌 또는 대뇌), 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌간 교종, 뇌 종양 (소뇌 별아교세포종, 대뇌 별아교세포종/악성 교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 교종), 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 (Burkitt) 림프종, 카르시노이드 종양 (소아, 위장관), 모르는 원발성 암종, 중추 신경계 림프종 (원발성), 소뇌 별아교세포종, 대뇌 별아교세포종/악성 교종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 섬유조직형성 소형 원형 세포 종양, 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 유잉 종양과의 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양 (소아), 고환외 생식 세포 종양, 간외 담관암, 안구 암 (안구내 검은색종, 망막모세포종), 담낭암, 위 (위장) 암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양, 생식 세포 종양 (소아 두개외, 고환외, 난소), 임신 융모 종양, 교종 (성인, 소아 뇌간, 소아 대뇌 별아교세포종, 소아 시각 경로 및 시상하부), 위 카르시노이드, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포 (간) 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 시상하부 및 시각 경로 교종 (소아), 안구내 검은색종, 섬세포 암종, 카포시 육종, 신장암 (신장 세포 암), 후두암, 백혈병 (급성 림프모구, 급성 골수성, 만성 림프구, 만성 골수성, 털세포), 입술 및 구강 암, 간암 (원발성), 폐암 (비소세포, 소세포), 림프종 (AIDS-관련, 버킷 (Burkitt), 피부 T-세포, 호지킨, 비-호지킨, 원발성 중추 신경계), 거대글로불린혈증 (발덴스트롬), 골의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 수모세포종 (소아), 검은색종, 안구내 검은색종, 메르켈 세포 암종, 중피종 (성인 악성, 소아), 잠재적 원발성의 전이성 두경부 편평세포암, 구강암, 다발 내분비샘 종양 증후군 (소아), 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식 질병, 골수성 백혈병 (만성), 골수성 백혈병 (성인 급성, 소아 급성), 다발성 골수종, 골수증식 장애 (만성), 비강 및 부비동 암, 코인두 암종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 입암(oral cancer), 입인두 암, 골의 골육종/악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피 암 (표면 상피-간질 종양), 난소 생식 세포 종양, 난소 저 악성 잠재성 종양, 이자 암, 이자 암 (섬세포), 부비동 및 비강암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체 별아교세포종, 송과체 종자세포종, 송과체모세포종 및 천막위 원시 신경외배엽 종양 (소아), 뇌하수체 샘종, 형질 세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선 암, 직장암, 신장 세포 암종 (신장암), 신우 및 요관 이행 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종 (소아), 침샘 암, 육종 (유잉 과의 종양, 카포시, 연조직, 난관), 세자리 증후군, 피부암 (비검은색종, 검은색종), 피부 암종 (메르켈 세포), 소세포 폐암, 소장 암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 잠재적 원발성 (전이성)의 두경부 편평세포 암, 위암, 천막위 원시 신경외배엽 종양 (소아), T-세포 림프종 (피부), 고환암, 인후암, 흉선종 (소아), 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 갑상선암 (소아), 신우 및 요관의 이행 세포 암, 융모 종양 (임신성), 모르는 원발 부위 (성인, 소아), 요관 및 신우 이행 세포 암, 요도 암, 난관 암 (자궁내막), 난관 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 교종 (소아), 외음부 암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 빌름스 종양 (소아)이 포함된다. 특정 구체예들에서, 신생물 또는 암은 검은색종, 신장 세포 암종, 폐암 및 혈액암으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 명세서의 컨쥬게이트는 영상화를 위한 조성물에 사용될 수 있다. 영상화를 위하여, 본 명세서의 컨쥬게이트는 이미징에 의해 검출 가능한 신호를 방출할 수 있는 임의의 분자 또는 작용물질일 수 있는 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 검출 가능한 표지는 단백질, 방사성 동위원소, 형광단, 가시광선 방출 형광단, 적외선 방출 형광단, 금속, 강자성 물질, 전자기 방출 물질, 특이한 MR 분광학적 시그니쳐를 가지는 물질, X-레이 흡수 또는 반사 물질 또는 사운드 변화 물질일 수 있다.
본 명세서의 컨쥬게이트는 전신적으로 또는 국소적으로 이미징되는 종양, 기관 또는 조직에 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서의 컨쥬게이트는 종양, 조직 또는 기관의 원하는 광학 이미지를 달성하는데 효과적인 용량으로 투여된다. 이러한 용량은 사용된 특정 단백질, 이미징 방법을 받는 종양, 조직 또는 기관, 사용된 이미징 장치 등에 의존하여 매우 광범위할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는, 제한되는 것은 아니지만, 종양의 이미징, 기관의 단층촬영 이미징, 기관 기능의 모니터링, 관상 동맥 혈관 촬영법, 형광 내시경 검사법, 레이저 가이드 수술, 광청각 및 음형광 방법 등을 포함하는 다양한 생의학적 용도에서 조직 및 기관들의 생체내 광학적 이미징 작용물질로서 사용된다.
이미징 방법의 예는 자기공명이미징(MRI), MR 분광기, 방사선 사진법, CT, 초음파, 평면 감마 카메라 이미징, 단일 광자 방출 단층 촬영(SPECT), 양전자 방사 단층 촬영, 다른 핵의학 기반 이미징, 가시광선을 사용하는 광학적 이미징, 루시퍼라제를 사용하는 광학적 이미징, 형광단을 사용하는 광학 이미징, 다른 광학 이미징, 근적외선을 사용하는 이미징 또는 적외선을 사용하는 이미징을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 구체예는 피험자에서 외과적 방법 동안 조직을 이미징하는 단계를 추가로 포함한다.
이미징을 위한 다양한 기술은 당업자에게 알려져 있다. 임의의 이런 기술은 검출 가능한 표지로부터 신호를 측정하는 본 발명의 이미징 방법에 적용될 수 있다. 예로서, 광학적 이미징은 특정 의학 영역에서 광범위하게 허용되는 하나의 이미징 양상이다. 예는 세포 성분의 광학적 표지화 및 플루오레세인 혈관조영법(fluorescein angiography), 형광안저혈관조영술(indocyanine green angiography)과 같은 혈관 조영술을 포함한다.
세포 생존력과 같은 세포 수준의 정보에 속하는 정보를 제공하는 이미징 양상은 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography : PET) 및 단일 광자 방출 계산된 단층촬영(single-photon emission computed tomography : SPECT)을 포함한다. PET에서, 환자는 물질이 신체를 통해 이동함에 따라 모니터링 될 수 있는 양성자들을 방출하는 방사성 물질을 흡수하거나 또는 그것과 함께 주입된다.
단일 광자 방출 계산된 단층 촬영 또는 SPECT가 PET와 밀접하게 관련되어 있다. 2가지의 주된 차이점은 양성자를 방출하는 물질 대신 SPECT는 고에너지 광자를 방출하는 방사성 추적자를 사용한다는 것이다.
PET에 대해, 본 발명의 단백질은 통상적으로　11C,　13N,　15O,　18F,　82Rb,　62Cu 및 68Ga과 같은 양성자 방출자로 표지된다. SPECT에 대해 본 발명의 단백질은　99mTc,　201Tl, 67Ga 및 111In과 같은 양성자 방출자로 표지된다.
동물 및 인간의 비침입성 형광 이미징은 또한 생체내 진단적 정보를 제공하며, 매우 다양한 임상적 전문 분야에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광단의 UV 여기에 이어 진보된 장치를 사용하는 복잡한 분광학적 이미징(예를 들어, 문헌[Andersson-Engels et al, 1997]을 참조)에 이르기까지 단순한 관찰을 포함하는 기술들이 수년에 걸쳐 개발되었다. 예를 들어, 형광단 또는 형광 단백질의 생체 내 검출을 위해 당업계에 알려진 특정 장치 또는 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 생체 내 근적위선 형광법, 생체 내 형광 이미징 시스템, 플라잉 스팟 스캐너 등을 포함한다.
광학 반응을 검출하는 다른 방법 또는 장치는, 제한 없이, 시각적 관찰, CCD 카메라, 비디오 카메라, 사진 필름, 레이저 스캐닝 장치, 형광계, 감광성 반도체 소자, 양자 계측기, 형광외 현미경, 주사형 현미경, 유세포분석기, 형광 미세 혈소판 판독기, 또는 광전자 증배관을 이용하는 신호 증폭을 포함한다.
일 양상에 따른 화합물은 신규하며, 다른 양상에 따른 상기 화합물을 포함하는 컨쥬게이트 및 그를 포함하는 조성물의 경우, 생체 내에서 방사능 동위원소를 이용하여 생체 내 뚜렷한 영상을 만들 수 있으며, 이를 통한 질병 진단이 가능한 효과가 있다. 나아가, 상기 화합물을 이용한 선표적 영상 기법을 수행하는 경우, 백그라운드 신호 없이 깨끗하게 종양만 나타난 영상을 얻을 수 있다.
도 1의 A는 tert-butyl-TE2A로부터 PCB-TE2A-alkyne의 합성 및 B는 Cu-PCB-TE2A-alkyne의 합성에 관한 개략도이다.
도 2는 구리가 돕는 azide-alkyne 고리화 첨가 반응에 의한 PCB-TE2A-alkyne (4)로부터 서로 다른 5개의 PCB-TE2A-Conjugate들(6a 내지 6e)의 합성을 나타낸 도이다.
도 3의 A)는 Cu-PCB-TE2A-tetrazine의 합성, B)는 Cu-64의 방사성 표지, C)는 Cu-PCB-TE2A-tetrazine (검정색)의 UV-HPLC 크로마토그램 (280 nm)을 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine (빨간색)의 방사성-HPLC 크로마토그램과 비교를 나타낸 도이다.
도 4는 구리 자유 클릭 반응에 의한 트라스트주맙의 변형 및 PCB-TE2A-alkyne과의 연속적인 접합을 나타낸 도로서, A)는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 합성, B)는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 합성을 나타낸 도이다.
도 5는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(n = 4) 및 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab(n = 3)의 생체 내 안정성을 나타낸 도이다.
도 6은 정상 Balb/c 쥐(n = 3)에서 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab 및 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab의 생체 분포 비교를 나타낸 도이다.
도 7은 NIH3T6.7 종양을 보유한 암컷 Balb/c 누드 쥐(n = 3)에서 주사 후 24시간 및 48시간에 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 생체 분포 데이터를 나타낸 도이다.
도 8은 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab(A 및 C) 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(B 및 D)의 주사 후 24시간 및 48시간에 NIH3T6.7 종양을 보유한 암컷 누드 쥐의 MicroPET-CT 영상을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 전체 요약을 나타낸 도이다.
도 10은 유방암 모델 쥐(MDA-MB-231)에서 선표적 영상 기법을 이용한 생체분포도로서, 구체적으로 페길화된 트랜스-사이클로옥텐(Trans-cyclooctene)이 도입된 F16 항체(hnRNP A2/B1)를 주입한 후, 48시간 뒤 구리-64가 표지된 PCB-TE2A-tetrazine를 주사한 후 4시간 및 8시간 후의 생체 분포를 나타낸 도이다.
도 11은 유방암 모델 쥐(MDA-MB-231)에서 선표적 영상 기법을 이용한 PET 영상으로서, 구체적으로 페길화된 트랜스-사이클로옥텐(Trans-cyclooctene)이 도입된 F16 항체(hnRNP A2/B1)를 주입한 후, 48시간 뒤 구리-64가 표지된 PCB-TE2A-tetrazine를 주사한 후 4시간 및 8시간 후의 PET 영상을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. di-tert-butyl 2,2'-(16-(prop-2-yn-1-yl)-1,4,8,11-tetraazabicyclo-[6.6.3]hepta-decane-4,11-diyl)diacetate (3)의 합성
무수 톨루엔(100 mL) 내 1,8-N,N-bis(carbo-tertbutoxymethyl)1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan(1, 620 mg, 1.45 mmol), 2-(prop-2-yn-1-yl)propane-1,3-diyl bis(4-methylbenzenesulfonate)(2, 628 mg, 1.48 mmol) 및 과량의 무수 K2CO3(950 mg, 6.88 mmol)의 용액은 6일 동안 환류되었다. 그 후, 반응 혼합물은 진공 증발기에서 건조시키고, CH2Cl2(100 mL)가 첨가되었다. 생성된 용액은 K2CO3를 제거하기 위해 와트만 여과 종이를 통해 여과시켰고, CH2Cl2(2 Х 30 mL)로 세척하였다. 용매는 증발되었고, 20% NaOH(20 mL) 수용액에 다시 용해되었고, 4시간 동안 교반되었다. 그 후, 용액은 CHCl3(3 Х 50 mL)로 추출되었다. 추출물은 염수로 세척하였고, MgSO4 상에서 건조시켰고, 용매는 감압 하에서 증발시켰다. 화합물은 알루미나(염기성) 및 4% CH2Cl2/methanol을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제되었고, 회백색 고체로서 순수한 생성물 3을 얻었다(404 mg, 55% 수율). 1H NMR (500 MHz, CDCl3):1.53 (s, 18H), 1.88-1.89 (m, 2H), 2.05 (s, 1H), 2.18 (d, J = 2 Hz, 2H), 2.26 (brs, 4H), 2.31-2.32 (m, 2H), 2.47 (s, 9H), 2.94 (brs, 7H), 4.03-4.05 (m, 4H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 20.29, 22.43, 24.98, 28.17, 28.25, 29.70, 32.60, 47.71, 48.94, 50.85, 51.48, 52.18, 54.44, 54.76, 56.04, 57.29, 58.83, 60.39, 61.94, 69.15, 80.46, 83.05, 170.87, 170.71 ppm. HRMS(ESI)는 C28H51N4O4에 대해 계산하였고, 507.3910 [(M + H)+]; 507.3912에서 발견되었다.
실시예 2. 2,2'-(16-(prop-2-yn-1-yl)-1,4,8,11-tetraazabicyclo[6.6.3]heptadecane-4,11-diyl)diacetic acid.2TFA (4)의 합성
화합물 3(80 mg, 0.16 mmol)은 CF3CO2H (TFA) 및 CH2Cl2 (30 mL)의 1:1(v/v) 혼합물에 용해되었고, 상온에서 24시간동안 교반되었다. 그 후, 용매는 유성 잔류물을 제공하기 위해 감압 하에서 제거되었고, Et2O로 수세하여 TFA 염으로서 회백색 고체 4를 얻었다(69 mg, 70% 수율). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 1.46 (brs, 1H), 1.71 (brs, 1H), 2.17-2.18 (m, 4H), 2.35 (brs, 4H), 2.56 (brs, 2H), 2.91-3.00 (m, 6H), 3.25-3.65 (m, 10H), 3.90 (s, 4H) ppm; 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 16.21, 19.53, 22.68, 28.79, 47.60, 48.46, 51.30, 52.69, 54.99, 55.13, 59.20, 59.91, 71.98, 80.48, 116.42 (q, J CF = 231.5 Hz, CF3COOH), 162.59 (q, J CF = 28.2 Hz, CF3COOH), 168.40, 173.78 ppm. HRMS(ESI)는 C20H35N4O4에 대해 계산하였고, 395.2658 [(M + H)+]; 395.2658에서 발견되었다.
실시예 3. Cu-PCB-TE2A-alkyne의 합성
3 mL의 메탄올 내 PCB-TE2A-alkyne(4, 28 mg, 0.07 mmol) 및 Cu(ClO4)2·6H2O (39 mg, 0.11 mmol)은 pH 8로 조정하기 위해 1 M의 NaOH 수용액을 적가하였다. 생성된 용액은 16시간 동안 환류되었고, 냉각되었고, 디에틸에터 확산시켰다. 증착된 청색 고체를 수집하고, 건조하였다(24.8 mg, 77% 수율). HRMS(FAB): C20H32CuN4O4에 대해 456.1798 [(M + H)+]로 계산되었고; 456.1801에서 발견되었다.
실시예 4. PCB-TE2A-tetrazine 유도체(6a 내지 6e)의 합성
H2O:tert-butanol:DMSO (1:1:1, 2 mL) 내 PCB-TE2A-alkyne(3.2 mg 내지 3.9 mg, 0.008 내지 0.010 mmol) 및 다른 아지드(azide)들(5a 내지 5e, 2.4 mg 내지 4.7 mg, 0.011 내지 0.016 mmol)의 혼합물에 한 꼬집 정도의 CuSO4.5H2O 및 과량의 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물들을 상온에서 16시간동안 교반하였고, 알루미나 TLC(CH2Cl2 내 20% MeOH)의 끝 부분은 새로운 물질의 형성을 나타냈다. 그 후, 혼합물들은 감압 하에 농축되었고, 물과 희석되었다. 그 후, H2S 기체를 5분 간 통과시켜 CuS를 침전시켰고, 원심분리에 의해 반응 혼합물로부터 분리하였다. 그 후, 혼합물은 과량의 아지드를 제거하기 위해 CHCl3--과 함께 진탕하였고, 수성층은 농축되었다. 그 후, 혼합물은 메탄올에 용해되었고, 아스코르브산 나트륨을 분리하기 위해 여과되었다. 감압 하 농축은 담황색 내지 갈색 고체로서 화합물 6a 내지 6e를 생성시켰다(512 μg 내지 1.8 mg, 8 내지 22% 수율). 화합물 6c 내지 6e는 HPLC 정제가 필요하였다. MS (FAB): 화합물 6a: C37H57N11O8에 대해 [M+H]+ 784.4로 계산되었고, 784.4에서 발견되었고; 화합물 6b: C35H57N9O10에 대해 [M]+ 763.4228로 계산되었고, 763.4256에서 발견되었고; 화합물 6c: C28H52N8O7에 대해 [M]+ 612.3959로 계산되었고, 612.3956에서 발견되었고; 화합물 6d: C31H55N7O10에 대해 [M+H]+ 686.4089로 계산되었고, 686.4081에서 발견되었고; 화합물 6e: C31H47N9O6에 대해 [M+Na]+ 664.3547.4089로 계산되었고, 664.3305에서 발견되었다.
실시예 5. Cu-PCB-TE2A-tetrazine의 합성
수성 NH4OAc(0.1 M, pH = 8.0, 200 μL) 내 PCB-TE2A-tetrazine(1 mg, 0.0013 mmol)의 용액에 CuCl2·2H2O(338 μg, 0.002 mmol)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물은 80℃에서 6시간동안 가열되었다. 구리 복합체의 형성은 TLC에 의해 확인되었고(C-18, MeOH: 10% NH4OAc = 1:1), HR-MS에 의해 특성화되었다. HRMS (FAB): C37H55CuN11O8에 대해 [M+H]+ 845.3609로 계산되었고; 845.3611에서 발견되었다.
실시예 6. PCB-TE2A-tetrazine의 방사성 표지
100 μL의 0.1 M NH4OAc 완충액(pH 8.0) 내 64CuCl2 (1 내지 5 mCi)를 100 μL의 0.1 M NH4OAc 완충액(pH 8.0) 내 1 내지 2 μg의 PCB-TE2A-tetrazine에 첨가하였다. 반응 혼합물은 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 반응의 진행은 방사성-TLC[Merck, 10% NH4OAc/methanol(1:1)로 전개된 C-18 TLC 플레이트]에 의해 모니터링되었고, 이러한 조건 하에서 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine은 Rf = 0.38을 나타냈다. 64Cu 표지된 킬레이트는 역상 HPLC[X-bridged C18 컬럼(5 μm, 4.6 Х 150 mm)을 이용한 물 HPLC, 0.1% TFA/H2O(용매 A) 및 0.1% TFA/acetonitrile(용매 B)로 구성된 이동상, 1 mL/min의 유속에서 5분 내에 0% B에서 20% B, 25분 내에 40% B 및 40분 내 0% B]에 의해 추가 정제되었다. 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine(머무른 시간 13.4분)은 1 내지 2 mL의 HPLC 용매에서 수집되었다. 방사화학 순도는 상기 동일한 HPLC 조건을 이용하여 확인되었다.
실시예 7. 트라스투주맙에 대한 TCO-NHS 및 TCO-PEG 4 -NHS의 접합
트라스투주맙(5 mg)이 0.1 M 보론산 나트륨 완충액 (pH 9.0, 200 μL) 내 TCO-NHS(100 μg, 0.0004 mmol) 또는 TCO-PEG4-NHS(150 μg, 0.0003 mmol)의 용액에 첨가되었다. 생성된 용액은 상온에서 부드럽게 밤새 진탕되었다. 다음 날, 혼합물은 centricon YM-50 (Millipore)으로 옮겼고, 부피를 줄이기 위해 회전시켰고, MilliQ 물로 3회 세척하였다. 농축된 접합체는 1 mL의 MilliQ 물에서 수집되었고, 동결건조하여 백색 고체를 얻었고(동결건조 후 TCO-trastuzumab에 대해서 1.73 mg 분리되었고, TCO-PEG4-trastuzumab에 대해서 1.71 mg 분리되었으며, 각각의 수율은 34% 및 33%), 최종적으로 사용 전 -20℃에서 보관하였다. NOTA-Bn-NCS와 비교하여, 접합 수율의 차이는 단순히 접합 효율에서의 차이 때문일 수 있다.
실시예 8. 트라스투주맙에 대한 NOTA-Bn-NCS의 접합
트라스투주맙(5 mg)은 0.1 M 탄산 나트륨 완충액(pH 8.5, 200 μL) 내 NOTA-Bn-NCS(102 μg, 0.0002 mmol)의 용액에 첨가되었다. 생성된 용액은 상온에서 밤새 부드럽게 진탕되었다. 다음으로, 이 용액은 centricon YM-50 (Millipore)에 옮겨졌고, 부피를 줄이기 위해 회전시켰고, MilliQ 물로 3회 세척하였다. 농축된 접합체는 1 mL의 MilliQ 물에서 수집되었고, 동결건조하여 백색 고체를 얻었고(동결건조 후에 3.3 mg 분리되었고, 분리 수율은 65%), 최종적으로 사용 전에 -20℃에서 보관되었다.
참조예
참조예 1. 실험 방법 및 재료
클릭 가능한 링커들은 Click Chemistry Tools로부터 구입하였거나 FutureChem으로부터 구입하였다. 허셉틴(트라스투주맙)은 Roche로부터 구입하였고, 사이클람(cyclam)은 CheMatech으로부터 얻었다. 달리 기재되지 않는 한, 모든 다른 화학물질들은 Sigma-Aldrich로부터 얻었고, 추가 정제 없이 받은 그대로 사용하였다. 실험에 사용된 물은 매우 순수하였다 (25℃에서 >18.2 mΩ cm-1). 구리-64는 MC50 Cyclotron을 이용한 64Ni(p,n)64Cu 핵 반응에 의해 KIRAMS에서 생산하였다.
참조예 2. MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)에 의한 트라스트주맙에 대해 접합된 킬레이터의 정도의 측정
Trastuzumab-TCO 및 trastuzumab-PEG4-TCO은 Milli Q 물을 이용한 연속적인 희석에 의해 약 10 내지 20 picomol/μL의 항체로 조정되었다. 물 내 50:50 acetonitrile/0.1% (v/v) trifluoroacetic acid 내 20 mg/mL sinapinic acid(Sigma)의 혼합물이 MALDI 매트릭스로서 사용되었다. 샘플과 매트릭스를 1:1 부피비로 혼합한 후, 혼합물의 2 μL을 표적 플레이트 상에 스폿팅하였고, 분석 이전에 공기 중에 건조시켰다. 기기는 손상되지 않은 단백질에 대해 선형 모드로 작동되었다. 외부 교정은 데이터 수집 이후에 데이터 익스플로러 소프트웨어(AB SCIEX)로 기기에 적용되었다. IgG (M+H+ = 74249, 2M+H+ = 148500)는 외부 교정으로서 이용되었다. 스펙트럼은 샘플 웰 내에서 연속 단계 모션 모드를 사용하여 평균 600회의 레이저 샷에 의해 얻었다. 질량 범위는 49 kDa 내지 180 kDa로 적용되었고, 초점은 200 kDa이었다.
참조예 3. 64 Cu-PCB-TE2A-tetrazine 및 trastuzumab-TCO 또는 trastuzumab-PEG 4 -TCO 간의 클릭 반응
정제되고, 방사성 표지된 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine(1 내지 2 mCi, 200 μL PBS, pH=7.4)에 TCO에 묶인 항체(trastuzumab-TCO 또는 trastuzumab-PEG4-TCO, 10 μL MilliQ 물 중 10 μg/mCi)가 첨가되었다. 반응 혼합물은 37℃에서 10분간 인큐베이션되었다. 반응은 10분 안에 완료되는 것으로 밝혀졌고, 방사성-TLC(C-18, 10% NH4OAc/methanol (1:1))에 의해 확인되었다. 그 후, 방사성 표지된 항체는 50 kDa 분자량 컷오프 단위를 가진 원심분리 필터(Amicon Ultra 4 Centrifugal Filtration Units, Millipore Corp.)에 넣고, 5회 세척하였고(EDTA로 2회, MilliQ 물로 3회), 식염수를 이용하여 수집하였다. 최종 방사성 표지된 생체접합체의 방사화학 순도는 방사성-TLC(C-18, 10% NH4OAc/methanol (1:1) 및 ITLC, 50 mM EDTA)로 분석하였고, 모든 제조물이 >98%임을 확인할 수 있었다. C-18, 10% NH4OAc/methanol (1:1) TLC 조건의 방사성-TLC 실험에서, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 기준선에 남아있는 반면, 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine는 0.38의 Rf 값을 나타냈고, ITLC/50 mM EDTA TLC 조건에서, 모든 방사성 면역 접합체들은 기준선에 남아있는 반면, 자유 64Cu2+ 이온들은 용매보다 앞서 용출되었다.
참조예 4. 특이 활성의 결정
PBS (pH 7.4, 200 μL) 내 정제되고, 방사성 표지된 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine (0.5-4.6 mCi)에 PBS (pH 7.4, 100 μL) 내 TCO and TCO-PEG4 (5 내지 46 μg)에 묶인 항체가 첨가되었다. 반응 혼합물은 37℃에서 10분간 인큐베이션되었다. 방사화학 수율은 순간 박층 크로마토그래피(ITLC-SG, 50 mM EDTA)로 확인되었다. 접합 수율은 60.3 내지 89.3%로 확인되었고, 특이 활성은 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab에 대해 각각 71 ± 6 μCi/μg 및 76 ± 12 μCi/μg으로 계산되었다.
참조예 5. 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab and 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab의 시험관 내 혈청 안정성
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 시험관 내 혈청 안정성은 5 μL의 방사성 면역 접합체들(500-600 μCi) 모두를 500 μL의 FBS(Fetal Bovine Serum)에 첨가함으로써 수행되었다. 용액은 37℃에서 인큐베이션되었고, 샘플들은 방사성-TLC에 의해 FBS에 적용 후 0분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 4시간, 12시간, 18시간, 36시간, 52시간, 60시간 및 76시간에 분석되었다. 혈청 안정성 연구들은 3회 수행되었다. 동일한 실험은 대조 연구로서 500 μL의 PBS로 반복되었다.
참조예 6. 생체 내 안정성 연구
1 내지 1.2 mCi의 방사성 면역 접합체들을 SD 쥐(수컷, 6주, 210 내지 220 g; 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab에 대한 n = 3; 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab에 대한 n = 4 (NOTA는 4회 수행))에 정맥주사하였다. 주사 후 1시간에, 동물들은 희생되었고, 혈액, 간 및 신장이 수집되었고, 얼음에 보관하였다. 혈액 내 생체 접합체의 안정성을 결정하기 위해 혈액 샘플들(약 100 μL)을 Sephadex G-100 컬럼(높이 12 cm, 지름 1.5 cm, 실험 전에 준비된 식염수로 평형화??)에 직접 놓았고, 식염수(30 mL)와 함께 용출되었다. 용출된 분획들을 소량으로 수집하였고, 수집된 분획의 방사능을 γ-counter로 측정하였다. 간 및 신장 내에서 64Cu-방사성 면역 접합체들의 안정성을 결정하기 위해, 수집된 장기들을 먼저 균질화하였고(얼음 냉기 하에서), 그 다음 PBS (5 mL)를 첨가하였고, 그 후, 5분 간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 균질액을 2분 간 2000 rpm에서 원심분리하여, 부피 큰 조직 덩어리로부터 분리하였다. 상청액들은 0.22 μm 필터를 통해 여과되었다. 그 후, 여과물(100 μL)은 유사한 방식으로 Sephadex G-100 컬럼에 넣었고, 식염수로 용출되었고, γ-counter로 계수되었다. 대조 실험으로서 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG*-trastuzumab (100 μL 식염수 내 약 1 내지 2 μCi)이 사용되었고, 유사한 과정을 따랐다.
참조예 7. 세포 흡수 연구
64Cu-PCB-TE2A-herceptin 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 네 개의 다른 세포 주인 NIH3T6.7, SKOV3, HEK293 및 CT26을 포함하는 플레이트 상에서 60분간 개별적으로 배양되었다. 다음으로, 세포들은 PBS(phosphate buffered saline)으로 세척되었고, trypsin-EDTA 처리하여 수확되었다. 세포 내 존재하는 활성은 γ-counter (Wallach)를 이용하여 계수되었다.
참조예 8. 동물 모델
모든 동물 실험들은 경북대학교의 동물 관리 및 이용 위원회 요구 사항(승인번호. 2016-0024)을 준수하여 수행되었다. NIH3T6.7 세포주의 이종 이식 종양 모델은 6주령 Balb/c nu/nu 암컷 누드 쥐를 이용하여 제조되었다. 생체 분포 연구를 위해, 총 5 x 106의 U87MG 세포들이 쥐의 오른쪽 어깨에 피하 접종이 된 반면(각 그룹당 n = 3), PET/CT 영상 모델은 5 x 106 및 1 x 106 세포들을 어깨들에 각각 주사함(각 그룹당 n = 3)으로써 제조되었다. 적절한 크기의 종양들은 주로 종양세포 이식 후 15일 이내에 성장되었다.
참조예 9. 정상 Balb/c 쥐 내 64 Cu-PCB-TE2A-PEG₄-trastuzumab, 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab의 생체 분포도
O2 내 1 내지 2%의 isoflurane을 이용한 마취 하에서, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab, 64Cu-PCB-TE2A-PEG₄-trastuzumab 및 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab이 정상 Balb/c 쥐(수컷, 6주, 각 그룹당 n = 3)의 꼬리 정맥을 통해 개별적으로 주사되었다(24시간, 8시간 및 72시간 동안 각 쥐당 100 μL 식염수 내 약 12 μCi, 70 μCi, 250 μCi). 동물들은 주사 후 24, 48 및 72시간에 희생되었고, 혈액, 심장, 폐, 피부, 지방, 뼈, 비장, 신장, 장 및 간이 수집되고, 중량이 측정되었고, γ-counter를 이용해 분석되었다. g당 투여량의 백분율(%ID/g)은 중량 및 계수 기준과 비교하여 계산되었다.
참조예 10. NIH3T6.7 종양을 보유한 암컷 누드 쥐 내 64 Cu-PCB-TE2A-PEG₄-trastuzumab 및 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 생체 분포도
O2 내 1 내지 2%의 isoflurane을 이용한 마취 하에서, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG₄-trastuzumab이 NIH3T6.7 종양을 보유한 Balb/c 암컷 누드 쥐의 꼬리 정맥을 통해 개별적으로 주사되었다(각 n = 3, 48시간 및 72시간 동안 각 쥐당 100 μL 식염수 내 약 250 μCi 및 380 μCi). 모든 동물들은 주사 후 24시간 및 48시간에 희생되었고, 혈액, 심장, 폐, 피부, 지방, 뼈, 비장, 신장, 장 ,간 및 종양이 수집되었고, 중량이 측정되었고, γ-counter를 이용해 분석되었다. g당 투여량의 백분율(%ID/g)은 중량 및 계수 기준과 비교하여 계산되었다.
참조예 11. NIH3T6.7 종양을 보유한 누드 쥐의 MicroPET 영상
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab(500μCi)　및　64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(650 μCi)은 꼬리 정맥을 통해 주사되었고, 영상은 주사 후 24시간 및 48시간 후에 2% isoflurane으로 쥐를 마취함으로써 종합 PET-CT 스캐너 nanoScan PET/CT(Mediso) 기기를 이용하여 기록되었다. 스캔된 PET은 주사 후 24시간에 20분간 수행되었고, PET 영상의 해부학적 기준 및 감쇠 보정을 위해 CT 스캔을 약 10분 간 수행하였다. 다음 날, 스캔 시간이 40분 증가한 것을 제외하고는 동일한 스캔 과정이 반복되었다. PET 영상 재구축은 3차원 반복 알고리즘(Tera-Tomo 3D, Mediso)을 이용하여, 상호작용의 깊이, 방사성 핵종 붕괴, 검출기 표준화, 크리스탈 데드 타임(crystal dead time), 감쇠 보정과 함께 1:5의 검출기 일치 모델, 4회 반복, 6개의 부분집합을 구함으로써 이루어졌다. PET 및 CT 영상은 자동적으로 공동등록되었다. 획득한 PET 영상 분석은 InterView Fusion (Mediso)를 이용해 수행되었다.
생체 내 방사성 표지된 모노클로날 항체(mAb)의 추적 및 정량화하는 면역-양전자 방출 단층 촬영(immuno-PET)은 종양 진단 및 면역 치료법의 내에 있어서 강력한 도구이다. 하지만, 통제된 방식으로 몇몇의 방사성 원소들의 약 150 kDa 항체에의 부착은 항상 도전적이다. 킬레이터, 접합 모드, 링커 및 방사성 표지 방법과 같은 몇몇 요인들이 주사된 방사성 표지된 mAbs의 약동학에 대해 큰 영향을 갖는다. 이상적으로, PET 스캐너는 항체가 아닌 오직 방사성 동위원소로부터 받는 신호들을 읽기 때문에, mAb에 부착된 방사성 동위원소는 분리되지 않고 신체 내에서 항체와 함께 이동할 수 있다. 그렇지 않으면, 생체 내 항체 타겟팅 효율 및 이동의 확실한 정보는 자유롭게 방출된 방사성 동위원소에 의해 오염될 수 있다.
실험예
일반적으로 '클릭 반응'으로 알려진 Cu(I)-촉매 아지드-알킨 고리첨가(Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition: CuAAC) 반응은 그의 단순함 덕분에 복잡한 분자 구조의 구축을 위한 확실한 도구가 되어왔다. 그것은 생체접합(bioconjugations), 중합체(polymer) 또는 덴드리머(dendrimer) 합성에서 광범위하게 응용되고 있고, 살아있는 세포에서도 적합하다는 것이 밝혀졌다. 구리 기반 방사성 의약품에서 이러한 클릭 반응의 응용은 문헌에서도 발견할 수 있다. Anderson 등은 거대 고리형 골격(macrocylic backbone)을 Cu-64으로 방사선 표지하기 전 또는 표지한 후에 단일 포스포네이트 교차결합된 킬레이터를 Y3-TATE에 접합시켰다. 하지만, 구리 기반 방사성 의약품에서 클릭 반응을 중개하는 구리의 응용에 대한 주요한 문제점은 거대 고리형 골격이 방사성 구리에 대한 자유 배위 부위를 남겨두지 않고 자유 Cu(I) 촉매와 배위할 수 있다는 것이다. 따라서, 클릭 반응 동안 Cu(I)와의 경쟁을 버틸 수 있을 뿐만 아니라 방사성 표지 단계 동안 방사성 구리와 선택적으로 배위할 수 있는 스마트 킬레이터 플랫폼이 필요하다. 이와 관련하여, 우리는 차세대 프로필렌 교차결합 킬레이터 PCB-TE2A-alkyne을 개발하였다(도 1). 이러한 거대 고리형 골격의 알킨(alkyne)은 변형된 또는 천연 항체와의 접합을 위해 테트라진, 말레이미드, 아민, 카르복시산 또는 옥사지리딘과 같은 일부 작용기를 부착시키는 데 이용될 수 있다. 거대 고리형 골격의 교차결합 특성으로 인해, Cu(I)와의 킬레이션은 상온에서 일어나지 않는다; 하지만 고온(80℃ 이상)에서는 Cu-64로의 정량적 방사선 표지가 가능하다.
PCB-TE2A-alkyne 분자는 도 1A에 나타난 바와 같이, tert-butyl-TE2A (1)로부터 2 단계로 합성된다. 간단히, tert-butyl-TE2A (1)는 우리의 이전 방법에 따른 위치선택적 보호, 알킬화 및 보호기 제거 전략에 의해 사이클람으로부터 먼저 합성된다. 교차 결합 반응을 위해, 프로필렌 교차 결합 전구체 2가 피리딘 존재 하에서 p-톨루엔설포닐클로라이드(p-toluenesulfonylchloride)를 이용한 토실화(tosylation)를 통해 다이올(diol) 유도체로부터 합성된다. 2개의 전구체를 성공적으로 합성한 후, 우리는 프로파르길에 맞는 프로필렌이 교차결합된 tert-butyl-TE2A(propargyl tailored propylene cross-bridged tert-butyl-TE2A)의 합성을 진행하였다(도 1A). 전구체들 모두 무수 K2CO3의 존재 하에서 무수 톨루엔에서 환류시켰다. 생성된 교차 결합된 화합물은 토실염의 형태로 존재하였고, 20% NaOH로 탈토실화되었다. 순수한 PCB-tert-butyl-TE2A-alkyne (3)은 55% 단리 수율로 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻었다. 그 후, tert-Butyl 그룹은 상온에서 TFA(trifluoroacetic acid) 및 메틸렌 디클로라이드(methylene dichloride)의 1:1 (v/v) 혼합물을 이용하여 탈보호화되었다. 회백색 고체를 얻기 위해 Et2O로 추가로 습제하였다. 또한, 구리 복합체가 또한 제조되었고(도 1B), HRMS (FAB)로 특성화되었다.
현재 접근 방식의 주요 목적은 Cu-64로 항체 영상을 위해 BFC의 일반적인 플랫폼을 구축하는 것이다. Kumar 등의 최근 보고는 항체 영상에서 노보넨(norbornene) 변형된 에틸렌 교차결합된 킬레이터 CB-EN의 적용에 대해 기술하고 있다. 저자들은 EDC 커플링에 의해 노보넨을 부착시키기 위해 킬레이터의 카복시산을 이용하였다. 그 후 킬레이터는 방사성 표지되었다. 그 후, 방사성 면역 영상을 위해 테트라진 변형 BAVI와 접합하였다. 우리의 경우, 단일 단계에서의 항체 접합을 위해 선택에 따라 다양한 연결용 팔들을 가진 다른 작용기들로 변형시키기 위해 PCB-TE2A-alkyne의 말단 3중 결합을 이용하였다(도 2). 그것은 다용도 접합 플랫폼을 개시한다. 우리는 이러한 목적을 위해, 아지드-알킨 고리화 반응에 도움되는 Cu(I)와 다른 기능화된 아지드들인 methyltetrazine-PEG4-azide (5a), azido-PEG3-maleimide (5b), azido-PEG3-amine (5c), azido-PEG4-acid (5d) 및 azido-oxaziridine (5e)을 이용하였다. 프로필렌 구멍은 공정동안 손상되지 않았고, 연속적인 방사성 표지 단계를 방해하지 않았다. 클릭 반응에 사용된 초과 구리 이온들은 H2S를 이용한 침전에 의해 간단하게 제거되었고, 모든 접합체들(6a 내지 e)은 상당히 좋은 수율로 분리되었다(각각 22%, 9%, 10%, 18% 및 12%). 거대 고리화 골격에서 테트라진(TCO 변형 항체와 접합을 위함), 말레이미드, 아민, 카복시산 및 옥사지리딘(천연 항체와 직접 접합을 위함)과 같은 다른 반응성 잔기가 각 요구 조건에 따라 항체를 표지하는 데 사용될 수 있다. 따라서 PCB-TE2A-alkyne는 방사성 면역 영상을 위한 독특한 연단 역할을 한다.
우리의 새롭게 디자인된 BFC의 실용성을 입증하기 위해, 그 후 우리는 방사성 면역 영상화를 진행하였다. 이러한 목적을 위해, 우리는 PCB-TE2A-PEG4-tetrazine (6a)을 선택하였다. 우리는 먼저 킬레이터를 방사성 구리로 방사성 표지하고, 그 후 테트라진-TCO 구리 자유 클릭 반응에 도움주는 스트레인(strain)을 이용하여 TCO 변형 항체와 접합시켰다. 유사한 전략들이 문헌들에 잘 나와있고, 18F, 64Cu 및 111In에 대해 성공적으로 수행되었다. 우리는 테트라진은 프로필렌 교차결합 킬레이터의 방사성 표지를 위해 필요한 고온을 견딜 수 있기 때문에, 메틸테트라진을 선택하였다. 반응은 고온에 항체를 노출시키지 않고 상온에서 매우 빠른 속도(K = 3.3 Х 106 M-1 s-1)를 나타냈다. 따라서, 항체의 면역 반응성이 보존되었다. 교차된 위치에서의 변형은 중앙 방사성 금속을 유지하기 위해 여분의 강성을 제공하며 그의 2개의 아세트산 펜던트 팔을 자유롭게 하고, 동시에 아마 방사성 면역 접합의 약동학적 행동을 변화시키지 않으며, 구리 복합체화 후에 중성 부분을 생성한다.
PCB-TE2A-PEG4-tetrazine (6a)의 방사성 표지는 80℃에서 수행되었고(방사성 화학적 수율 > 95%, 도 3B), 방사성 표지된 킬레이터는 HPLC에 의해 정제되었고(도 3C), 항체 접합을 위해 사용되었다. 상응하는 차가운 구리 복합체가 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine (7)의 형성을 확인하기 위해 외부 표준으로 이용되었다(도 3A)
방사성 면역 영상을 위해 우리는 모델 항체로서 트라스투주맙(trastuzumab)을 선택하였다. 그것은 다양한 인간 암 및 원발성 유방암의 20 내지 30%에서 과발현되고, 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 HER2 수용체에 대해 높은 친화력을 보이는 재조합 인체에 적응된 단일클론 항체 IgG1이다. 그것은 전이성 유방암의 치료를 위해 FDA의 승인을 받았고, 잠재적 RIT 제제로서도 이용되고 있다. 트라스투주맙은 두 개의 TCO를 함유하는 다른 결합 팔인 NHS-TCO 및 NHS-PEG4-TCO로 변형되었다(도 4). 염기성 pH(보론산 완충액, pH 9)는 TCO-NHS 에스테르와 트라스투주맙의 라이신 잔기의 빠르고 효율적인 반응을 위해 사용되었다. PEG는 그의 친수성 특성 때문에 접합체의 생체적합성을 개선시키며, 또한 문헌에 의하면, 짧은 PEG 링커가 전통적인 항체 접합체에 비해 우수한 종양-대-백그라운드(tumor-to-background) 비율을 나타낸다고 한다. 반응은 상온에서 12시간 동안 지속되었고, 생산된 항체 접합체 trastuzumab-TCO (8) 및 trastuzumab-PEG4-TCO (10)는 YM-50 원심분리형 필터에 의해 정제되었고, MiliQ 물로 수집하였고, 동결 건조하여 하얀색 고체를 얻었다.항체 접합체 8 및 10 모두 MALDI-TOF에 의해 특성화되었고, 트라스투주맙에 대한 각 TCO 및 PEG4-TCO의 수는 트라스투주맙 및 두 접합체 8 및 10(각각 147902, 148694 및 149626)의 질량 분석에서 관찰된 질량의 차이에 의해 계산되었다. 8 및 10 각각에 대해 관찰된 792 및 1724 질량 단위의 차이로부터 5.2 TCO 및 4.3 PEG4-TCO의 평균이 항체 당 접합체로 계산되었다.
그 후, 변형된 trastuzumab-TCO 및 trastuzumab-PEG4-TCO은 PBS(pH 7.4)에서 성공적으로 7과 접합되었다(도 4A 및 4B). 반응 부피는 반응 효율을 증가시키기 위한 최소로 유지되었다. 생성된 두 개의 방사성 면역 접합체들 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab (9) 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab (11)은 YM-50 원심분리형 필터로 추가 정제되었고, 식염수에 수집하였고, 생물학적 연구를 위해 사용되었다. 방사성 면역 접합체들의 비방사능(Specific activity)은 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab에 대해 각각 71 ± 6 μCi/μg 및 76 ± 12 μCi/μg로 계산되었고, 이는 64Cu-기반 면역 접합체에 비해 매우 높은 것으로 나타났다.
우리는 또한 NH2-NCS 커플링에 의한 우리의 새로이 합성된 면역 접합체 9 및 11의 생체 내 안정성 및 생체 분포 패턴의 직접 비교를 위해 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab (12)를 제조하였고, 트라스투주맙에 부착된 NOTA-Bn-NCS의 수는 MALDI-TOF 분석에 의해 2.7로 계산되었다. NOTA-Bn-NCS-trastuzumab의 정량적 방사성 표지는 NH4OAc 완충액 pH 6.8) 및 37℃에서 30분 안에 이루어졌지만, YM-50 원심분리형 필터에 의해 추가 정제되었고, 식염수에 수집되었고, 추가 연구를 위해 사용되었다.
살아있는 시스템에서 종양 영상을 위한 가장 중요한 변수들 중 하나는 면역 접합의 안정성이다. 비록, 교차 결합된 킬레이터들은 교차 결합되지 않은 대응물에 비해 매우 안정한 구리 복합체를 형성한다는 것이 잘 입증되었지만, 동물 실험을 거치기 전에는 우리는 우리의 제조된 방사성 면역 접합체 9 및 11의 시험관 내 혈청 안정성을 확인했을 뿐이다. 두 방사성 표지된 면역 접합체들 모두 37℃, PBS 및 FBS에서 심지어 3일 이상 배양한 후에도 상당한 분해율(모든 경우에서 95% 초과)을 나타내지 않았다. 다음으로, 우리는 11의 생체 내 혈액 안정성을 확인하였고 NOTA 접합체 12의 결과와 비교하였다(도 5). 실험은 Sephadex G-100 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 쥐의 혈액, 간 및 신장에서 온전한 방사성 면역 접합체(11 및 12)의 백분율의 비교 분석 데이터는 NOTA 방사성 면역 접합체 12보다 우리의 방사성 면역 접합체 11의 우수한 견고성을 명확하게 나타냈다(도 5). MALDI-TOF 분석 데이터로부터 트라스트주맙의 분자량은 약 149KDa이라는 것이 발견했고, 따라서 우리는 온전한 11 및 12는 다른 낮은 분자량 단백질 첨가물로부터 명확하게 분리될 수 있다고 생각하였다. 대조 실험에서 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab 및 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab 모두 5 내지 10 mL 머무른 부피에서 용출되었다. 같은 머무른 부피에서 피크는 쥐 혈액, 간 및 신장 분획에서 관찰되었고, 온전한 방사성 면역 접합체에 기여하였다. 간 및 신장 모두에서, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab (각각 88.2 ± 5.8 % 및 88.3 ± 2.9 % 온전함)이 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab (간 및 신장에서 각각 66.9 ± 5.6 % and 65.9 ± 7.8 % 온전함)에 비해 더 안정한 것으로 밝혀졌으나, 혈액 내에서는 두 접합체 모두 안정하다고 밝혀졌으며, 뚜렷한 탈금속화는 관찰되지 않았다. 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 이러한 구리-복합체의 높은 견고성은 Cu-64에 대해 강력한 배위를 위한 카르복실산염 펜던트 팔들의 용이성에 대한 공인을 부분적으로 받을 수 있다.
면역 접합체의 생체 내 안정성 뿐만 아니라 상당히 좋은 혈청을 얻은 후에, 우리는 항체의 면역 반응성에 대한 화학적 변형 및 방사성 표지 효과를 더 평가하였다. 9 및 11 모두 NIH3T6.7, SKOV3, HEK293, CT26 세포에서 배양되었다. 결과들은 HER2 음성 HEK293 (각각 0.6% 및 0.2%, n = 4) 및 CT26 (각각 0.36% 및 0.8%, n = 4)보다 HER2 양성 NIH3T6.7 (각각 8.5% 및 10.2%, n = 4) 및 SKOV3 (각각 7.3% 및 8%, n = 4) 세포주에서 9 및 11 모두 유의하게 높은 흡수율을 나타냈다. 이러한 결과들은 화학적 변형 후 트라스투주맙의 온전한 면역 반응성을 추가로 확인하고, 사용된 표지 조건을 유지할 수 있게 하였다.
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab 모두의 생체 내 안정성을 생체분포 연구를 통해 면밀히 조사하였고, 정상 Balb/c 쥐(각 n = 3, 도 6) 내 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab와 추가로 비교하였다. 비록, NOTA-trastuzumab 접합체 12는 9 및 11에 비해 다른 연결을 가지고 있지만, 우리는 그것이 비교차 결합 리간드 사이에서 안정한 구리 복합체를 형성한다고 알려졌기 때문에, 참조 표준으로서 선택하였고, 이 후 구리 기반 방사화학에서 광범위하게 적용되었다. 주사 후 48시간 뒤에, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 가장 높은 혈액 활성 보유력(23.52 ± 1.97% ID/g)을 나타냈고, 예측한 바와 같이, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab (20.54 ± 3.24% ID/g)가 뒤를 따랐다. 반면에, 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab는 가장 적은 혈액 활성 보유력(4.36 ± 1.59% ID/g)을 나타냈다. 72시간 시점에서도, 혈액 활성 보유력은 NOTA 접합체 12의 경우에는 개선되지 않았고, 모든 3개의 방사성 접합체에서 거의 일정하게 유지되었다(64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab는 21.97 ± 3.75% ID/g, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab는 23.97 ± 3.24% ID/g, 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab는 7.96 ± 1.50% ID/g). 두 PCB 접합체 9 및 11의 높은 혈액 보유력은 NOTA 접합체 12에 비해 보다 긴 순환 특성 및 높은 안정성을 반영한다. 유사한 추론이 도 6에서 나타나는 간 및 장 흡수 데이터로부터 얻어질 수 있다. 주사 후 48시간 뒤에, NOTA 접합체 12(각각 31.79 ± 1.44% ID/g 및 6.54 ± 0.46% ID/g)의 경우, 가장 높은 간 및 장 흡수가 관찰된 반면, 두 PCB 접합체 9(각각 22.76 ± 1.32% ID/g 및 3.75 ± 0.39% ID/g) 및 12(각각 20 ± 1.18% ID/g 및 3.34 ± 0.35% ID/g)는 48시간 시점에서 훨씬 적은 활성을 나타냈다. 비록 주사 후 72시간 뒤에, 간 및 장 활성 모두 모든 경우에 소실되었지만, NOTA 접합체 12의 간 흡수(18.98 ± 2.1% ID/g)는 여전히 두 PCB 접합체 9(14.6 ± 0.39% ID/g) 및 11(12.64 ± 1.95% ID/g) 에 비해 약 1.5배 높았고, 이는 비교차 결합된 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab보다 두 교차 결합된 방사성 면역 접합체 9 및 11의 증진된 안정성을 말한다. 페길화된(PEGylated) 접합체 11의 감소된 간 흡수는 PEG 링커의 "스텔스(stealth)" 행동에 기여할 수 있고, 이러한 전략에 의해, 간 축적을 피할 수 있고, 양 시점에서 모두 반영되는 순환 수명을 증가시킬 수 있다. 이러한 생체 분포 연구로부터 상기 논의된 모든 3개의 방사성 면역 접합체들 사이에서 페길화된 PCB 접합체 11과 백그라운드 신호 비율이 더 높아질 것으로 예상된다.
2개의 새로운 trastuzumab-PCB 접합체들의 타겟팅 효능은 HER2 양성 NIH3T6.7 종양 보유 암컷 누드 쥐 모델에서 생체 분포 연구에 의해 증명되었다(각 n = 3, 도 7). 높은 종양 흡수가 주사 후 48시간에 9 및 11 모두에서 관찰되었다. 그러나, 페길화된 접합체 11은 보다 개선된 48시간에서의 페길화되지 않은 접합체 9(16.88 ± 1.46% ID/g)에 비해 24시간에서(19.75 ± 0.83%ID/g) 더 나은 종양 흡수를 나타냈고, 11의 흡수는 9에 비해 1.4배 높은 것으로 밝혀졌다(각각 24.87 ± 0.09% ID/g 및 17.22 ± 1.64% ID/g). PEG의 "스텔스"효과는 또한 눈에 띄었으며, 11(24시간에서 18.58 ± 2.34% ID/g 및 48시간에서 9.39 ± 2.14% ID/g)은 9(24시간에서 19.82 ± 0.56% ID/g 및 48시간에서 13.39 ± 0.70% ID/g)에 비해 더 적은 간 흡수를 나타냈고, 이는 9에 대해서 24시간 및 48시간 양 시점에서 더 높은 종양 대 간의 비율(각각 0.85 ± 0.08 및 1.29 ±0.14)을 초래한 반면, 11에 대해서는 24시간 및 48시간 각각 1.06 ±0.14 및 2.65 ±0.65이었다. 신장 내 활성은 9(24시간 및 48시간에서 각각 5.79 ± 1.00% ID/g 및 5.50 ±0.60%ID/g) 및 11(24시간 및 48시간에서 각각 6.02 ± 0.51 및 4.79 ± 0.53% ID/g) 모두 유사한 것으로 발견되었고, 9(24시간 및 48시간 시점에서 각각 2.92 ± 0.56 및 3.13 ± 0.45) 및 11(24시간 및 48시간 시점에서 각각 3.28 ± 0.31 및 5.19 ± 0.57)에 대해 매우 높은 종양 대 신장 비율을 나타냈다. PCB-trastuzumab 접합체 모두 유사한 약동학을 따르고, 간쓸개의 경로 및 신장의 경로 모두에 따라 신체로부터 제거되었다. PEG의 효과는 또한 모든 시점에서 9보다 연장된 11의 혈액 반감기에서 명백하였고, 결과적으로 혈액 내 활성은 9(24시간 및 48시간에서 각각 14.00 ± 1.64% ID/g 및 12.07 ± 2.06% ID/g)보다 11(24시간 및 48시간에서 각각 18.91 ± 1.00% ID/g 및 18.72 ± 1.08% ID/g)의 경우가 더 낫다는 것이 밝혀졌다. 11에 대한 종양 대 혈액 비율은 24시간 및 48시간에서 각각 1.04 ± 0.07 및 1.33 ± 0.08로 계산된 반면, 9에 대해서는 1.21 ±0.18 및 1.42 ±0.28이었다. 다른 장기에서의 흡수는 훨씬 적은 양이며, 9 및 11의 경우는 유사한 수준이었다. 양 경우에 근육에서 매우 무시해도 될 정도의 활성이 관찰되었고, 매우 높은 종양 대 근육의 비율을 나타냈다(24시간 및 48시간에 9에 대해 각각 14.55 ± 1.31 및 13.35 ± 2.98 및 11에 대해 각각 20.15 ± 6.23 및 14.54 ± 0.60).
최종적으로, 64Cu-immuno-PET 영상은 생체 분포 프로파일을 확인하고, 실시간으로 새로운 방사성 면역 접합체로서 그들의 잠재력을 평가하기 위해 수행되었다(도 8). 각 쥐의 양 어깨들의 두 개의 종양인 NIH3T6.7 이종 이식 종양을 보유한 쥐 모델(두 개 그룹, 각 그룹의 n = 3)이 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab(도 8A 및 8B) 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(도 8C 및 8D)(각각 약 650 내지 700 μCi)의 꼬리 정맥 주사 후 24시간 및 48시간 후에 영상화되었다. 주사 후 24시간 내에 PEG의 효과가 뚜렷하였다. 비록 활성의 높은 축적이 9 및 11 모두 양 종양(왼쪽 또는 오른쪽 어깨)에서 발견되었지만, 9와 달리, 11에서는 간, 비장, 신장 등과 같은 내부 장기들에서 더 적은 흡수를 나타냈다. 결과적으로, 종양은 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab 주사 후 24시간 내에 생생하게 시각화되었다. 하지만, 혈액을 포함하는 백그라운드 소음은 두 경우 모두에서 시간이 경과함에 따라 감소하였으나, 종양 흡수는 두 경우 모두 유의하게 증가하였다. 주사 후 48시간에서, 11의 경우에 종양 흡수는 9에 비해 더 높았음이 발견되었고, 종양은 우수한 종양 대 소음 비율로 더욱 강하게 보였다. 이러한 결과들은 PCB-TE2A-alkyne은 구리 기반 방사성 면역 영상에서 잠재적인 두 개의 기능을 가진 킬레이터로서 이용될 수 있음을 나타내며, 상기 실험예의 전체 요약은 개략도로서 도 9에 나타내었다.
한편, 항체는 체내로부터 약 2 내지 3일정도면 체외로 배출되지만, 킬레이트는 분자량이 작아 일반적으로는 수 시간만에도 체외로 배출된다. 구리-64(Cu-64)의 반감기는 12.7 시간으로 비교적 장시간 영상이 가능하나, 대부분의 구리 접합체는 체내에서 탈금속화반응(Demetallation)이 진행되어 구리 이온을 잃기 때문에, 표지된 접합체의 체내 안정성이 확보되어야만 하는 단점이 있다. 이에, 매우 안정한 구리 접합체를 형성하는 프로필렌 교차결합된 킬레이트인 PCB-TE2A-tetrazine과 항체를 이용한 새로운 immuno-PET 영상기법인 선표적 영상 기법을 활용하여 극단적인 종양 대 백그라운드 비를 확보할 수 있는 종양 영상 실험을 수행하였다.
먼저, 세포외 당단백질이며, 정상 세포에 비해 종양 세포에서 과발현되는 Tenacis C를 타겟팅하는 F16 항체(hnRNP A2/B1)에 페길화된 트랜스-사이클로옥텐(Trans-cyclooctene)을 도입한 후 이를 유방암 종양 모델(MDA-MB-231)에 미리 주사하여 선표적을 수행하였다. 이 후 48시간 뒤에 구리-64가 표지된 PCB-TE2A-tetrazine를 주사한 후 시간 별로 생체분포실험을 진행하였다. 또한, 동일한 방법으로 양전자방출단층촬영(PET)도 진행하였다. PCB-TE2A-tetrazine의 구리-64 표지는 80℃에서 진행하였고, 그 방사화학 수율은 95% 이상이었다. 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine를 주사한 지 4시간과 8시간 뒤 생체분포실험 결과 종양에 대한 흡수가 모두 25 %ID/g이상으로 높은 흡수를 보였고, 특히 8 시간에 종양 대 근육 비는 558배, 종양 대 혈액 비는 128배로 종양 대 백그라운드 비가 극히 예외적으로 높았다(도 10). PET 영상에서도 백그라운드 신호는 거의 없이 종양만 선명히 영상화할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 11). 결론적으로, 항체를 먼저 쥐에게 주입하였고, 2일 후 종양에 결합된 항체 외에 종양에 결합되지 않은 항체들은 모두 체외로 배출되었고, 방사성 표지한 킬레이트가 종양 항체에 결합한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 도 8과 같이 항체와 킬레이트를 먼저 결합시킨 후 쥐에 주입한 경우와는 다르게 백그라운드 신호를 획기적으로 줄일 수 있어 아주 깨끗한 종양 영상을 얻을 수 있었다(도 11). 따라서, 진단과 치료가 어려운 triple negative한 유방암을 월등히 우수한 선명도로 진단할 수 있음을 확인하였다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 2]
    Figure 112021094642204-pat00016

    상기 A는 O 또는 단일결합이고;
    상기 B는 메틸렌, 에틸렌 및 프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 n은 1 내지 5 중 어느 하나의 정수이고;
    상기 X는 카르복시메틸이고;
    상기 Y는 O 또는 NR6이고;
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 메틸렌, 에틸렌 및 프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 R3 및 R6은 H이고;
    상기 R4는 메틸렌이고;
    상기 R5는 메틸렌 및 에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 Z는 H 및 하기의 화학식 3 내지 화학식 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 3]
    Figure 112021094642204-pat00037

    [화학식 4]
    Figure 112021094642204-pat00038

    [화학식 5]
    Figure 112021094642204-pat00039

    [화학식 6]
    Figure 112021094642204-pat00040
    .
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 방사선 동위원소가 표지된 것인, 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 개체 내 먼저 투여된 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질과 연결되는 선표적 기법을 위한 것으로서,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 바로 연결되거나 링커를 통해 연결되는 것인, 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염.
  9. 청구항 1의 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하고, 하기 화학식 8로 표시되는 화합물-단백질 컨쥬게이트;
    [화학식 8]
    Figure 112021094642204-pat00025

    D는 상기 화학식 2로 표시되는 화합물이고,
    L은 링커이거나 단일 결합이며,
    P는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이고,
    k는 1 내지 20 사이의 정수이며,
    상기 D의 Z는 링커 또는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질에의 부착을 위한 적어도 하나 이상의 산소 또는 치환 가능한 질소를 포함한다.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 링커는 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질에 연결되는 것인 컨쥬게이트.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 컨쥬게이트.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)에 특이적으로 결합하는 것인 컨쥬게이트.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)는 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 컨쥬게이트.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 L을 통한 상기 D와 P의 결합은 생체 내(in vivo)에서 일어나는 것인 컨쥬게이트.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 D는 개체 내 먼저 투여된 상기 P와 L을 통해 연결되는 선표적 기법을 위한 것인, 컨쥬게이트.
  16. 청구항 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 청구항 9의 컨쥬게이트를 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 영상화는 자기 공명 이미징(Magnetic resonance　imaging: MRI), 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography:　PET) 및 단일 광자 방출 계산된 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)을 위한 것인 조성물.
  18. 청구항 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 청구항 9의 컨쥬게이트를 포함하는 암 진단을 위한 조성물.
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