KR102362752B1

KR102362752B1 - 선충구제제의 상승작용적 칼콘 함유 조성물

Info

Publication number: KR102362752B1
Application number: KR1020197030293A
Authority: KR
Inventors: 베누 폴리네니; 알레한드로 칼데론 우레아; 글렌다 더블유 폴락
Original assignee: 텔루리스 바이오테크 인디아 프라이빗 리미티드
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-17
Publication date: 2022-02-11
Also published as: BR112019019252B1; WO2018167734A2; PH12019550165A1; AU2018235375A1; EP3609327A4; US10925286B2; CN110678074A; EP3609327A2; KR20190141143A; WO2018167734A3; NZ758221A; JP2020510094A; US20200236948A1; MX2019011034A; AU2018235375B2; BR112019019252A2; MY196400A; JP6944551B2

Abstract

본 발명은 살선충 펩티드 및 칼콘을 포함하는 선충구제제의 상승작용적 조성물을 제공하고, 여기서 살선충 펩티드인 펩티드 2, 또는 펩티드 3, 또는 펩티드 12는 CED-4 단백질 서열로부터 유래되고; 칼콘은 칼콘 17, 칼콘 25, 또는 칼콘 30이다. 살선충 펩티드 단독은 1 mg/ml의 농도에서 100% 살선충 활성을 나타내는 반면, 칼콘과 조합될 때, 상승작용적 효과를 가져 오며 100% 살선충 활성은 0.8 mg/ml만큼 낮은 농도에서 나타난다. 본 발명의 또 다른 구체예는 디메틸 설폭사이드에서 제조된 칼콘의 스톡 용액을 에탄올 및 물에 연속하여 희석함으로써 물과 같은 수성 용매에서 칼콘의 작업 용액을 제조하는 방법을 제공한다. 칼콘의 최종 농도는 살선충 조성물 중 약 10^-4-10^-5 M이다. 이 상승작용적 살선충 조성물은 환경적으로 안전하고 인간 및 동물에게 비독성이다.

Description

선충구제제의 상승작용적 칼콘 함유 조성물

발명의 분야

본 발명은 식물 기생충, 특히 선충을 사멸시키기 위한 농업 분야에서 사용되는 조성물인 선충구제제에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 CED-4 단백질로부터 유래된 살선충 펩티드 및 칼콘을 포함하는 선충구제제의 상승작용적 조성물에 관한 것이다.

발명의 배경

선충은 수확량에 큰 손실을 초래하여 유의한 방식으로 경제에 영향을 미치므로 농업 산업에 큰 위협이 된다. 선충은 곤충에 이어 두 번째로 작물, 예를 들어, 토마토 및 기타 채소, 감귤류, 감자, 쌀, 코코넛, 밀 및 기타 곡물, 관상용 식물 및 기타 식물에 심각한 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다. 선충은 단독으로 또는 다른 토양 미생물과 함께 뿌리, 줄기, 잎, 과일 및 종자를 포함하는 식물의 거의 모든 부분을 공격하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 전 세계적으로 12.3%의 예상 수확량 손실(1,570억 달러)을 초래한다. 이 중 4,030만 달러가 인도로부터 보고되었다(Singh et al., 2015).

멜로이도기네(Meloidogyne) 속에 속하는 뿌리혹선충은 원예 및 농작물에서 식물-기생충 선충의 가장 경제적으로 손해를 끼치는 3개의 속 중 하나이다. 이들은 여러 식물의 뿌리의 절대 기생충이며; 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita)는 전세계 주요 해충 중 하나이다.

선충구제제는 이들 식물 기생충인 선충을 사멸시키는데 사용되는 조성물이다. 사용되는 대부분의 선충구제제는 인간에게 매우 독성이며, 유용한 토양 박테리아에 또한 해로운 화학 조성물이다. 몇몇 선충구제제는 또한 지하수를 오염시키고, 오존층의 고갈을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 널리 공지된 선충구제제 중 하나인 메틸-브로마이드는 미국 및 인도를 포함하는 여러 국가에서 금지되어 있다. 농작물에 널리 사용되는 또 다른 매우 독성인 선충구제제는 카르보푸란(carbofuran)이며; 한 과립의 카르보푸란은 몇 분 이내에 새를 죽일 수 있다. 포레이트(phorate)와 같은 선충구제제는 토양을 통해 지하수로 용이하게 들어가, 이를 오염시킬 수 있다.

화학적 선충구제제와 관련된 심각한 결점은 선충을 방제하기 위한 새로운 기술의 개발을 필요로 한다. 하나의 상기 방법은 선충에 대한 내성을 위해 트랜스제닉 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물 계통을 생성하는 것이다. 그러나, 이는 광범위한 사전 조사 활동을 필요로 하는 시간 소모적이고 고비용인 방법이다. 인도를 포함하는 많은 국가에서, 여러 도덕적, 윤리적, 및 보이지 않는 환경 문제에 근거하여 트랜스제닉 계통의 도입에 대한 극심한 반대가 존재한다.

하나의 효과적인 방법은 환경적으로 안전하고, 비독성이며, 생성 및 사용이 용이한 선충구제제 조성물의 생성을 포함한다.

US9125413B1호에는 강력한 살선충 활성을 나타내는 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegance) CED-4 단백질로부터 유래된 펩티드가 기재되어 있다. SEQ ID NO. 1의 아미노산으로 구성된 CED-4 단백질은 아폽토시스 단백질 계열에 속한다. SEQ ID NO. 1은 하기를 포함한다:

SEQ ID NO. 1로부터 유래된 3개의 펩티드는 약 1 mg/ml의 유효 농도에서 살선충 활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 상기 펩티드는 하기 서열을 포함한다:

1) 15개의 아미노산 DLLRPVVIAPQFSRQ(99-113 아미노산 스트레치, SEQ ID NO. 2)으로 구성된 펩티드 2,

2) 19개의 아미노산 RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(112-130 아미노산 스트레치, SEQ ID NO. 3)으로 구성된 펩티드 3, 및

3) 12개의 아미노산 FPKFMQLHQKFY(529-540 아미노산 스트레치, SEQ ID NO. 4)으로 구성된 펩티드 12.

본 발명은 종래 기술의 단점을 고려하고, 비독성이며 환경적으로 안전한 항-기생충 펩티드 및 화합물의 그룹인 칼콘을 이용하여 선충을 방제하기 위한 방법을 제공한다.

발명의 목적

따라서, 본 발명의 주요 목적은 환경적으로 안전하고, 생성 및 사용이 용이한 선충구제제의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기를 포함하는 상승작용적 살선충 조성물을 제공하는 것이다:

1. CED-4 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드인 펩티드 2, 펩티드 3, 또는 펩티드 12 (여기서

a. 펩티드 2는 서열 DLLRPVVIAPQFSRQ(SEQ ID NO. 2)를 포함하는 15개 아미노산 길이의 펩티드이고,

b. 펩티드 3은 서열 RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(SEQ ID NO. 3)을 포함하는 19개 아미노산 길이이고,

c. 펩티드 12는 서열 FPKFMQLHQKFY(SEQ ID NO. 4)를 포함하는 12개 아미노산 길이이다);

및

2. 화합물의 그룹인 칼콘에 속하는 적어도 하나의 칼콘 (여기서 칼콘은 칼콘 17, 칼콘 25, 또는 칼콘 30이다).

본 발명의 또 다른 목적은 살선충 활성을 나타내는 상승작용적 살선충 조성물을 제공하는 것이며, 여기서 펩티드의 농도는 1 mg/ml 미만이고, 칼콘의 농도는 10^-4-10^-5 M의 범위이다.

본 발명의 또 다른 목적은 선충구제제로서 사용하기 위해 칼콘을 용해시키고 칼콘의 작업 용액을 물과 같은 수성 용매에 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간에게 비독성인 상승작용적 살선충 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 광범위한 활성을 갖지 않고, 토양 미생물에 해롭지 않은 상승작용적 살선충 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 합성이 용이하고, 트랜스제닉 식물의 생성을 요구하지 않으며, 매우 경제적인 상승작용적 살선충 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명은 식물 기생충, 특히 선충을 사멸시키기 위한 농업 목적에 사용되는 선충구제제 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 살선충 펩티드 및 칼콘을 포함하는 선충구제제의 상승작용적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 주요 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 선충구제제의 조성물을 제공한다:

및

2. 화합물의 그룹인 칼콘 또는 칼코노이드에 속하는 적어도 하나의 칼콘 (여기서 칼콘은 칼콘 17 {(2E)-1-(2,4-디클로로페닐)-3-페닐-2-프로펜-1-온}, 칼콘 25 {(2E)-1-(4-에톡시페닐)-3-페닐-2-프로펜-1-온, 또는 칼콘 30 {(2E)-3-페닐-1-(2-티에닐)-2-프로펜-1-온}이다).

펩티드인 펩티드 2, 펩티드 3, 및 펩티드 12는 1 mg/ml만큼 낮은 농도에서 100% 살선충 활성을 개별적으로 나타낸다. 그러나, 펩티드 중 하나와 칼콘인 칼콘 17, 칼콘 25, 또는 칼콘 30의 조합은 상승작용적 방식으로 작용하고, 100% 살선충 활성을 위한 펩티드의 농도를 0.8 mg/ml로 감소시키며, 여기서 칼콘의 농도는 10^-4-10^-5 M 만큼 낮다. 활성에 필요한 펩티드의 양에서의 유의한 감소는 생산 비용을 크게 감소시켜, 고유한 조성물을 매우 경제적으로 만든다.

칼콘은 물과 같은 수성 용매에 쉽게 용해되지 않는 복합 유기 화합물이다. 칼콘을 용해시키기 위해 디메틸 설폭사이드 및 에탄올과 같은 유기 용매가 일반적으로 사용된다. 그러나, 이러한 용매는 인간과 동물에게 독성이며 환경적으로도 위험하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 농축된 칼콘 스톡을 연속 희석법에 의해 물에 용해시키는 방법을 제공하며, 여기서 칼콘 스톡은 DMSO에서 준비된 다음 에탄올에 연속 희석되고 이어서 선충구제제로서의 작업 용액을 제조하기 위해 물에 희석된다. 칼콘의 작업 용액은 10^-4-10^-5 M의 범위이고, 여기서 DMSO 및 에탄올의 최종 농도는 각각 0.01-0.1% 및 0.5-5%의 범위이며, 이는 환경적으로 안전하고 인간과 동물에게 비독성이다.

도면의 간단한 설명
도 1은 96-웰 플레이트 실험에서 선충에 대한 칼콘 17, 또는 칼콘 25와 조합된 펩티드 2의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 96-웰 플레이트 실험에서 선충에 대한 칼콘 30과 조합된 펩티드 2의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 96-웰 플레이트 실험에서 선충에 대한 칼콘 17, 또는 칼콘 25와 조합된 펩티드 3의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 96-웰 플레이트 실험에서 선충에 대한 칼콘 30과 조합된 펩티드 3의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5은 96-웰 플레이트 실험에서 선충에 대한 칼콘 17, 또는 칼콘 25와 조합된 펩티드 12의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6는 96-웰 플레이트 실험에서 선충에 대한 칼콘 30과 조합된 펩티드 12의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 96-웰 플레이트 실험에서 선충 알 부화에 대한 펩티드 2 단독 또는 칼콘과 조합된 펩티드 2를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 96-웰 플레이트 실험에서 선충 알 부화에 대한 펩티드 3 단독 또는 칼콘과 조합된 펩티드 3을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9은 96-웰 플레이트 실험에서 선충 알 부화에 대한 펩티드 12 단독 또는 칼콘과 조합된 펩티드 12를 그래프로 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 이제 하기에서 더욱 상세히 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 본원에 설명되는 구체예로 제한되는 것으로 해석되어선 안 된다. 오히려, 구체예는 본 발명의 개시가 충분하고, 당업자에게 본 발명의 범위를 완전히 전달하도록 제공된다.

칼콘 또는 칼코노이드는 방향족 케톤 및 에논을 포함하는 중심 코어를 갖는 화합물의 그룹이다. 벤질리덴아세토페논은 칼콘 계열의 부모 구성원이다. 칼콘 및 이들의 유도체는 항레트로바이러스, 항염증, 항기생충, 항말라리아, 항산화, 항진균, 항원충, 항박테리아, 항스테로이드, 심장보호, 항종양, 항암 등과 같은 광범위한 생물학적 활성을 갖는 분자이다. 여러 유형의 칼콘은 다양한 쌍떡잎 식물, 및 일부 단자엽 식물, 양치식물 및 겉씨식물에 자연적으로 존재하는 것으로 알려져 있다.

칼콘, (2E)-1,3-디페닐프로프-2-엔-1-온은 화학식 C₁₅H₁₂O를 갖고, 다른 칼콘은 일반적으로 하기 화학식 X의 구조를 갖는 이 부모 화합물의 유도체이다:

칼콘 구조는 3개-탄소 α, β-불포화 카르보닐 시스템에 의해 연결된 2개의 방향족 고리인 고리 A 및 고리 B를 포함한다. 적어도 30개의 자연적으로 발생하는 칼콘은 고리 A 또는 B에 부착된 여러 유형의 화학기를 갖는 것으로 알려져 있다.

표 1은 여러 30개 유형의 칼콘인 칼콘 1 내지 칼콘 30의 구조를 제공하며, 여기서 기본 구조는 화학식 X에 제공된 구조이다.

표 1

자연적으로 발생하는 칼콘의 명칭 및 구조

Attar 등은 칼콘이 살선충 활성을 갖는 것으로 알려져 있지만, 개별적인 칼콘의 효능은 상이한 농도에서 5%에서 100%까지의 살선충 활성의 범위에서 매우 다양하다는 것을 제시하였다. 또한, 칼콘의 효과는 비기생충 모델인 선충 카에노랍디티스 엘레간스에서만 시험되었다. 개별적인 칼콘의 활성은 10^-2 M보다 높은 농도에서 나타났다. 최소 억제 효과를 위해 더 높은 농도의 화합물을 사용하는 것은 독성, 토양 오염, 지하수로의 침출, 및 다른 관련 문제로 인해 매우 제한된다.

칼콘 그룹은 총괄적으로 하기 구조 화학식 1로 표시될 수 있다:

칼콘 17은 화학명 (2E)-1-(2,4-디클로로페닐)-3-페닐-2-프로펜-1-온 및 하기 화학식 2에 도시된 화학식을 갖는다:

칼콘 25은 화학명 (2E)-1-(4-에톡시페닐)-3-페닐-2-프로펜-1-온 및 하기 화학식 3에 도시된 화학식을 갖는다:

칼콘 30은 화학명 (2E)-3-페닐-1-(2-티에닐)-2-프로펜-1-온 및 하기 화학식 4에 도시된 화학식을 갖는다:

칼콘 및 칼콘-유사 구조는 많은 식물에 자연적으로 존재하므로 환경-친화적이며; 여러 생물학적 활성과의 연관성은 농업에서의 잠재적 사용을 크게 증가시킨다. 그러나, 칼콘의 주요 한계는 이들의 용해도이다. 칼콘은 물과 같은 수성 용매에 쉽게 용해되지 않으며 결과적으로 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 유기 용매에 용해되어야 한다. DMSO는 급성 경구 독성(LD50)이 7920 mg/kg[마우스]이고 급성 피부 독성(LD50)이 40000 mg/kg[래트]으로 인간과 동물에게 독성인 것으로 간주된다. 따라서, DMSO에 용해된 칼콘은 이와 접촉하는 사용자 및 동물에게 위험하므로 토양에 직접 적용하기에 적합하지 않다. 유사하게, 또 다른 용매인 에탄올은 급성 경구 독성(LD50)이 7060 mg/kg[래트]이며 이것 또한 사용자에게 안전하지 않다. 따라서, 환경적으로 안전한 용액에 칼콘을 사용하는 방법이 필요하다.

본 발명은 식물 기생충, 구체적으로, 선충을 사멸시키는 능력을 갖는 상승작용적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 살선충 펩티드 및 칼콘을 포함하는 선충구제제의 상승작용적 조성물에 관한 것이고, 여기서 펩티드는 CED-4 단백질 서열로부터 유래된다. 살선충 펩티드와 칼콘의 조합은 트랜스제닉 계통의 생성과 같은 선충 방제를 위한 다른 기존의 안전한 방법과 비교하여 독특하고 경제적이다. 펩티드는 개별적으로 살선충 활성을 나타내지만, 칼콘과의 조합은 효율을 증가시키고 상승작용적 효과를 가져 오며, 또한 활성에 필요한 펩티드의 양을 감소시켜 조성물의 생산 비용을 감소시킨다.

본 발명의 주요 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 선충구제제의 상승작용적 조성물을 제공한다:

a) 펩티드 2는 서열 DLLRPVVIAPQFSRQ(SEQ ID NO. 2)를 포함하는 15개 아미노산 길이의 펩티드이고,

b) 펩티드 3은 서열 RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(SEQ ID NO. 3)을 포함하는 19개 아미노산 길이이고,

c) 펩티드 12는 서열 FPKFMQLHQKFY(SEQ ID NO. 4)를 포함하는 12개 아미노산 길이이다);

및

2. 화합물의 그룹인 칼콘 또는 칼코노이드에 속하는 적어도 하나의 칼콘 (여기서 칼콘은 칼콘 17 {(2E)-1-(2,4-디클로로페닐)-3-페닐-2-프로펜-1-온}, 또는 칼콘 25 {(2E)-1-(4-에톡시페닐)-3-페닐-2-프로펜-1-온이다).

펩티드는 화학식 2-4의 적어도 하나의 칼콘과 조합될 때 0.8 mg/ml의 펩티드 농도에서 100% 살선충 활성을 나타낸다. 칼콘은 또한 펩티드 SEQ ID NO 2-4와 조합시 10^-4-10^-5 M만큼 낮은 농도에서 100% 살선충 활성을 나타내었다. 살선충 펩티드 SEQ ID No. 2-4와 화학식 2-4의 칼콘의 조합은 상승작용적 효과를 가져 오며 상기 조합은 펩티드 단독과 비교하여 더 낮은 농도로 작용한다.

칼콘은 물 또는 다른 수용액에 쉽게 용해되지 않아 사용성이 상당히 제한된다. 비-수성 용액에 칼콘을 용해시키면 이들은 환경-친화적이지 않게 된다. 일반적으로, 칼콘은 인간과 동물에게 매우 독성인 DMSO 및 에탄올과 같은 유기 용매에 용해된다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 최소의 DMSO 및 에탄올 농도를 갖는 환경적으로 안전한 용액에서 칼콘을 사용하는 방법을 제공한다. 칼콘의 작업 용액은 다음을 포함하는 단계로 물과 같은 수성 용매에서 제조된다:

1. 예를 들어, 1000 μl의 DMSO에 13.8 mg의 칼콘 17 또는 12.65 mg의 칼콘 25를 첨가함으로써 10^-1 M의 농도로 DMSO 중 칼콘의 스톡 용액을 제조하는 단계;

2. 예를 들어, 900 μl의 100% 에탄올에 단계 1로부터의 100 μl의 칼콘 스톡을 첨가함으로써 100% 에탄올에 칼콘 스톡을 희석하여 10^-2 M 농도의 칼콘 용액을 제조하는 단계;

3. 예를 들어, 900 μl의 수용액 중 50% 에탄올에 단계 2로부터의 100 μl의 칼콘 용액을 첨가함으로써 수용액 중 50% 에탄올에 단계 2로부터의 칼콘 스톡을 희석하여 10^-3 M 농도의 칼콘 용액을 획득하는 단계; 및

4. 예를 들어, 900 mL의 수용액 중 50% 에탄올에 단계 2로부터의 1 mL의 칼콘 용액을 첨가한 후 10^-5 M 이하와 같은 더 낮은 농도의 칼콘 용액을 얻기 위해 상기 용액을 증류수에서 추가로 희석함으로써 단계 3으로부터의 칼콘 용액을 보통의 증류수에서 희석하여 작업 용액으로서 10^-4 M 농도의 칼콘 수용액을 획득하는 단계;

여기서, 칼콘의 작업 용액 중 DMSO 및 에탄올의 최종 농도는 각각 0.01-0.1% 및 0.5-5%이고, 이는 용매의 치사 농도보다 현저히 낮다. 이 방법은 10^-4 M 미만의 농도로 수용액에 칼콘을 용해시키기 위한 희석 방법을 제공한다.

실시예 1

A) M. 인코그니타 증식

토마토 식물에 M. 인코그니타 유충을 접종시키고, 성장 챔버에서 유지시켰다. 적어도 2개월 후, M. 인코그니타 알을 실험을 위해 뿌리로부터 추출하였다. M. 인코그니타 알을 추출하기 위해 따른 절차는 하기에 설명된다.

뿌리 조직을 외과용 칼 및 시계 유리를 이용하여 손으로 잘게 자르거나, 이를 식품 가공기를 이용하여 잘게 잘랐다. 이후, 잘게 잘린 조직을 병에 넣고, 표백제의 10% 희석액으로 세척하였다. 멸균 조건하에서, 뿌리 용액을 이후 체(상단의 60 카운트 체, 하단의 500 카운트 체)를 통하여 부었다. 미정제 알 수집물을 500 카운트 체의 하단으로부터 15 mL 팔콘(Falcon) 튜브 내의 5 mL의 각각의 표백제 및 알 혼합물로 수집하였다. 이후, 5 mL의 70% 수크로스 용액을 각각의 팔콘 튜브에 넣었다. 이후, 1 mL 층의 이중 증류 멸균수를 각각의 팔콘 튜브 내의 수크로스 혼합물의 상부에 부드럽게 놓았다. 이후, 샘플을 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 수크로스 용액과 1 mL 물 층 사이에 현탁된 배아를 각각의 팔콘 튜브로부터 새로운 15 mL 팔콘 튜브로 전체 3 mL(용액의 3 mL의 상층)로 수집하였다. 10 mL의 5% 표백제 용액을 첨가하고, 알을 10분 동안 볼텍싱(vortexing)시켰다. 이후, 팔콘 튜브를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 상층액을 제거하고, 알을 10 mL의 멸균 이중 증류수에서 헹구고, 2000 rpm에서 5분 동안 재원심분리하였다. 이러한 과정을 2회 더 반복하였다. 마지막 세척 후, 5 mL의 상층액을 제거하는 한편, 나머지 5 mL의 물을 알과 혼합하고, 5 mL 페트리 접시에 놓았다. 이후, 알을 25-27℃의 인큐베이터에 넣었고, 유충 벌레(J2 단계)가 약 10일 후에 부화하였다. 벌레를 저장을 위해 25-27℃ 인큐베이터에 유지시켰다.

B) 시험 용액의 제조 및 선충의 배치

시험할 칼콘을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 넣고, 1 mL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 10^-1 M 용액을 제조하였다. 이 스톡 용액을 멸균 이중 증류수에서 추가 희석을 위해 사용하였다(10^-4 M 내지 10^-5 M). 예를 들어, DMSO 용액 중 10 μL의 10^-1 M 칼콘을 9990 μL의 멸균 이중 증류수에 첨가하여 선충에 대한 검정을 위한 10^-4 M 용액을 제조하였다. 100 μL의 물 중 희석액을 96 웰 플레이트의 30웰에 피펫팅하고, 하나의 벌레를 추출된 J2 M. 인코그니타 스톡으로부터 각각의 웰로 옮겼다. 음성 대조군의 경우, 상기 DMSO 농도가 선충을 사멸시키지 않았음을 확인하기 위해, 30마리의 벌레를 각각의 실험을 위해 100 μL의 멸균 이중 증류수 중 1% DMSO에 넣었다(과거의 연구는 C. 엘레간스 벌레가 이 농도의 DMSO에서 생존할 수 있음을 입증하였다(Attar et al., 2011)).

C) 선충 모니터링

생물학적검정은 벌레를 사멸시키는 펩티드 및 칼콘의 능력(사망률 %)을 시험하도록 설계된다. 각각의 시험을 각각의 웰(전체 30개의 웰) 내의 하나의 선충을 갖는 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 선충을 5일 동안 처리 용액에서 인큐베이션하였다. 선충의 생존력을 해부 현미경 하에서 프로브를 이용한 교란 후 움직임에 대해 각각 검사함으로써 시험하였다.

D) 알 부화 실험:

생물학적검정은 알 부화를 막는 펩티드 및 칼콘의 혼합물의 능력(부화되지 않은 알 %)을 시험하도록 설계된다. 각각의 시험을 웰 당 10개 알을 갖는 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 알을 16일 동안 각 처리에서 인큐베이션하였다. 부화된 대 부화되지 않은 알을 현미경 이미지에 의해 결정하였다.

실시예 2

펩티드 및 칼콘을 포함하는 살선충 조성물의 효능

전술한 바와 같이, 동일한 수의 선충을 96-웰 플레이트에서 5일 동안 다양한 처리 용액에서 인큐베이션하고, 5일째에 죽은 또는 생존한 선충의 수를 계수함으로써 상이한 조합의 선충구제제의 효능을 시험하였다. 유사하게, 선충 알의 부화에 대한 상이한 조합의 선충구제제 조성물의 효과도 계수되었다.

도 1-6에 도시된 바와 같이, 물 또는 1% DMSO에서의 J2 단계 유충 선충의 인큐베이션은 5일째에 10-15% 선충의 사멸을 야기하였고, 이러한 처리는 음성 대조군으로 제공되었다. 반면, 클로르피리포스 및 이미다클로프리드(1:1 비)를 포함하는 화학적 혼합물에서 유충 선충의 인큐베이션은 5일째에 약 50% 사멸을 발생시켰으며, 이는 양성 대조군으로서 제공되었다. 10^-4-10^-5 M 농도의 칼콘 17, 칼콘 25, 또는 칼콘 30 단독에 의한 선충 처리는 유충 선충의 70-85% 사멸을 발생시켰다.

유사하게, 도 7, 도 8 및 도 9에 도시된 바와 같이, 음성 대조군으로서 사용된 물에서의 알의 인큐베이션은 알의 70%를 부화시켰다. 10^-4-10^-5 M 농도의 칼콘 17 또는 칼콘 25에 의한 선충 알의 처리는 16일까지 알의 약 50%만을 부화시켰다.

도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 0.8 mg/ml 농도의 펩티드 2 단독과 유충 선충의 인큐베이션은 5일째에 약 60-80% 사멸을 발생시켰다. 그러나, 펩티드 2와 칼콘 17, 칼콘 25, 또는 칼콘 30의 조합은 5일째에 유충 선충의 거의 100% 사멸을 발생시켰으며, 여기서 펩티드의 농도는 0.8 mg/ml이고 칼콘의 농도는 10^-4-10^-5 M만큼 낮았다. 더욱이, 도 2에 도시된 바와 같이, 펩티드 2(0.8 mg/ml), 및 10^-4-10^-5 M 농도의 1:1 비의 칼콘 17 및 칼콘 30의 조합은 매우 효과적이었다.

유사하게, 도 3 및 4는 펩티드 3 단독이 칼콘과의 조합과 비교하여 유충 선충을 사멸시키는데 덜 효과적이라는 것을 나타낸다. 펩티드 3의 경우, 칼콘 25 또는 칼콘 30과의 조합이 칼콘 17과의 조합보다 효과적이다. 더욱이, 도 4에 도시된 바와 같이, 펩티드 3(0.8 mg/ml), 및 10^-4-10^-5 M 농도의 1:1 비의 칼콘 17 및 칼콘 30의 조합은 대단히 효과적이었다.

도 5 및 6은 0.8 mg/ml 농도의 펩티드 12 단독이 유충 선충을 사멸시키는데 매우 효과적이지만, 그럼에도 불구하고, 펩티드와 적어도 하나의 칼콘의 조합이 선충구제제 조성물의 효능을 유의하게 향상시킨다는 것을 도시한다.

도 7에 도시된 바와 같이, 0.8 mg/ml 농도의 펩티드 2에 의한 선충 알의 처리는 16일까지 알의 약 30%를 부화시킨 반면, 펩티드 2(0.8 mg/ml) 및 칼콘(10^-4-10^-5 M)의 조합은 16일까지 알의 10-25%를 부화시켰다.

도 8에 도시된 바와 같이, 0.8 mg/ml 농도의 펩티드 3에 의한 선충 알의 처리는 16일까지 알의 약 10%를 부화시킨 반면, 펩티드 3(0.8 mg/ml) 및 칼콘(10^-4-10^-5 M)의 조합은 16일까지 알의 10-20%를 부화시켰다.

도 9에 도시된 바와 같이, 0.8 mg/ml 농도의 펩티드 12에 의한 선충 알의 처리는 16일까지 알의 약 20%를 부화시킨 반면, 펩티드 12(0.8 mg/ml) 및 칼콘(10^-4-10^-5 M)의 조합은 16일까지 알의 10-15%를 부화시켰다.

이러한 결과는 CED-4 단백질로부터 유래된 펩티드인 펩티드 2 또는 펩티드 3, 또는 펩티드 12, 및 칼콘이 효율적인 살선충 활성을 가지며 선충을 사멸시키고 또한 이들의 알을 파괴하는 능력이 있음을 추가로 시사한다.

그러나, 이러한 펩티드와 칼콘, 특히, 칼콘 30의 조합은 선충 사멸에 대해 상당한 상승작용적 효과를 나타내었다.

이러한 결과는 0.8 mg/ml 농도의 살선충 펩티드인 펩티드 2 또는 펩티드 3, 또는 펩티드 12와 10^-4-10^-5 M만큼 낮은 농도의 칼콘인 칼콘 17, 칼콘 25, 또는 칼콘 30의 조합이 선충을 사멸시키는데 상승작용적 효과를 갖고 살선충 조성물로서 매우 효능이 있음을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> TELLURIS BIOTECH INDIA PRIVATE LIMITED <120> A SYNERGISTIC CHALCONE CONTAINING COMPOSITION OF A NEMATICIDE <130> P.1504.IB <150> 201741009366 <151> 2017-03-17 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 549 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 1 Met Leu Cys Glu Ile Glu Cys Arg Ala Leu Ser Thr Ala His Thr Arg 1 5 10 15 Leu Ile His Asp Phe Glu Pro Arg Asp Ala Leu Thr Tyr Leu Glu Gly 20 25 30 Lys Asn Ile Phe Thr Glu Asp His Ser Glu Leu Ile Ser Lys Met Ser 35 40 45 Thr Arg Leu Glu Arg Ile Ala Asn Phe Leu Arg Ile Tyr Arg Arg Gln 50 55 60 Ala Ser Glu Leu Gly Pro Leu Ile Asp Phe Phe Asn Tyr Asn Asn Gln 65 70 75 80 Ser His Leu Ala Asp Phe Leu Glu Asp Tyr Ile Asp Phe Ala Ile Asn 85 90 95 Glu Pro Asp Leu Leu Arg Pro Val Val Ile Ala Pro Gln Phe Ser Arg 100 105 110 Gln Met Leu Asp Arg Lys Leu Leu Leu Gly Asn Val Pro Lys Gln Met 115 120 125 Thr Cys Tyr Ile Arg Glu Tyr His Val Asp Arg Val Ile Lys Lys Leu 130 135 140 Asp Glu Met Cys Asp Leu Asp Ser Phe Phe Leu Phe Leu His Gly Arg 145 150 155 160 Ala Gly Ser Gly Lys Ser Val Ile Ala Ser Gln Ala Leu Ser Lys Ser 165 170 175 Asp Gln Leu Ile Gly Ile Asn Tyr Asp Ser Ile Val Trp Leu Lys Asp 180 185 190 Ser Gly Thr Ala Pro Lys Ser Thr Phe Asp Leu Phe Thr Asp Ile Leu 195 200 205 Leu Met Leu Lys Ser Glu Asp Asp Leu Leu Asn Phe Pro Ser Val Glu 210 215 220 His Val Thr Ser Val Val Leu Lys Arg Met Ile Cys Asn Ala Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Pro Asn Thr Leu Phe Val Phe Asp Asp Val Val Gln Glu Glu 245 250 255 Thr Ile Arg Trp Ala Gln Glu Leu Arg Leu Arg Cys Leu Val Thr Thr 260 265 270 Arg Asp Val Glu Ile Ser Asn Ala Ala Ser Gln Thr Cys Glu Phe Ile 275 280 285 Glu Val Thr Ser Leu Glu Ile Asp Glu Cys Tyr Asp Phe Leu Glu Ala 290 295 300 Tyr Gly Met Pro Met Pro Val Gly Glu Lys Glu Glu Asp Val Leu Asn 305 310 315 320 Lys Thr Ile Glu Leu Ser Ser Gly Asn Pro Ala Thr Leu Met Met Phe 325 330 335 Phe Lys Ser Cys Glu Pro Lys Thr Phe Glu Lys Met Ala Gln Leu Asn 340 345 350 Asn Lys Leu Glu Ser Arg Gly Leu Val Gly Val Glu Cys Ile Thr Pro 355 360 365 Tyr Ser Tyr Lys Ser Leu Ala Met Ala Leu Gln Arg Cys Val Glu Val 370 375 380 Leu Ser Asp Glu Asp Arg Ser Ala Leu Ala Phe Ala Val Val Met Pro 385 390 395 400 Pro Gly Val Asp Ile Pro Val Lys Leu Trp Ser Cys Val Ile Pro Val 405 410 415 Asp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Glu Gln Leu Asp Asp Glu Val Ala Asp 420 425 430 Arg Leu Lys Arg Leu Ser Lys Arg Gly Ala Leu Leu Ser Gly Lys Arg 435 440 445 Met Pro Val Leu Thr Phe Lys Ile Asp His Ile Ile His Met Phe Leu 450 455 460 Lys His Val Val Asp Ala Gln Thr Ile Ala Asn Gly Ile Ser Ile Leu 465 470 475 480 Glu Gln Arg Leu Leu Glu Ile Gly Asn Asn Asn Val Ser Val Pro Glu 485 490 495 Arg His Ile Pro Ser His Phe Gln Lys Phe Arg Arg Ser Ser Ala Ser 500 505 510 Glu Met Tyr Pro Lys Thr Thr Glu Glu Thr Val Ile Arg Pro Glu Asp 515 520 525 Phe Pro Lys Phe Met Gln Leu His Gln Lys Phe Tyr Asp Ser Leu Lys 530 535 540 Asn Phe Ala Cys Cys 545 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 2 Asp Leu Leu Arg Pro Val Val Ile Ala Pro Gln Phe Ser Arg Gln 1 5 10 15 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 3 Arg Gln Met Leu Asp Arg Lys Leu Leu Leu Gly Asn Val Pro Lys Gln 1 5 10 15 Met Thr Cys <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 4 Phe Pro Lys Phe Met Gln Leu His Gln Lys Phe Tyr 1 5 10

Claims

a) SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 4로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CED-4 단백질로부터 유래된 유효량의 적어도 하나의 펩티드;
및
b) 유효량의 하기 화학식 1의 적어도 하나의 화합물을 포함하는 기생충 선충 방제를 위한 조성물로서,
상기 조성물이 0.8 mg/ml의 펩티드 및 10^-5-10^-6 M의 화학식 1의 화합물의 농도에서 100%의 상승작용적 항-선충 효능을 갖는, 조성물:

상기 식에서,
고리 A는

, 또는

이다.
제1항에 있어서, 조성물이 15개의 아미노산 길이를 갖는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 16개의 아미노산 길이를 갖는 SEQ ID NO. 3의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 12개의 아미노산 길이를 갖는 SEQ ID NO. 4의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 적어도 하나의 증량제, 유화제 및/또는 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 적어도 하나의 농약적으로 활성인 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 농약적으로 활성인 화합물이 식물을 처리할 수 있는 물질, 살진균제, 살균제, 살충제, 진드기구충제, 선충구제제, 살연제, 약해완화제, 식물 성장 조절제, 식물 영양소 및 생물학적 방제제로부터 선택되는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 3의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 4의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 3의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 3의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 3의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 3의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 4의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 4의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 4의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 3의 화합물을 포함하는 조성물,

.
제1항에 있어서, 조성물이 SEQ ID NO. 4의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 하기 화학식 4의 화합물을 포함하는 조성물,

.