KR101715268B1

KR101715268B1 - 살선충활성물질 4-퀴놀론 알카로이드 물질 및 이를 이용한 선충 방제 방법

Info

Publication number: KR101715268B1
Application number: KR1020150044523A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 김헌; 장자영; 최경자; 최용호; 장경수
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 한국화학연구원
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2017-03-13
Also published as: KR20160116591A

Abstract

본 발명은 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)의 지상부로부터 분리한 살선충활성 물질 4-퀴놀론 알카로이드 물질 및 이를 이용한 뿌리혹선충병 방제방법에 관한 것으로, 본 발명의 두 개의 4-퀴놀론 알카로이드 물질들 중 하나는 신물질로서 5'-메톡시월쎄리온 A로 명명하였고, 다른 한 물질은 기지의 월쎄리온 A 물질이다. 두 물질은 토마토 뿌리혹선충의 2령 유충에 대해 50% 살선충 활성 농도가 각각 0.09 ㎍/ml과 0.27 ㎍/ml이고, 또한 1.25 ㎍/ml의 농도에서 선충 알부화를 각각 91.9%와 87.4% 수준으로 억제하였다. 이들의 살선충활성 효과는 아바멕틴(abamectin)과 유사하였고, 온실 시험에서 조추출물은 1,000 ㎍/ml 수준에서 뿌리혹 형성을 완벽하게 억제하였다. 이들 결과는 4-퀴놀론 알카로이드 물질을 활용할 경우 새로운 식물성 살선충제의 개발이 가능하다는 것을 제시한다.

Description

살선충활성물질 4-퀴놀론 알카로이드 물질 및 이를 이용한 선충 방제 방법 {4-Quinolone alkaloids with nematicidal activity and method for controlling nematode using the same}

본 발명은 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)로부터 분리한 살선충활성 물질 4-퀴놀론 알카로이드 물질, 이들 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법에 관한 것이다.

식물기생성 선충은 연작의 주요 원인중의 하나이며 작물에 따라 심각한 피해를 유발하는데, 식물기생성 선충에는 수 천종이 있다. 형태, 가해 양상 및 기주에 따라 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 시스트선충(Globodera spp.), 씨알선충(Anguina spp.), 줄기구근선충(Ditylenchus spp.), 아엽선충(Aphalenchoides spp.), 뿌리썩이선충(Pratylenchus spp.), 왜화선충(Tylenchorhychus spp.), 감귤선충(Rotylenchulus spp.) 등이 있다.

뿌리혹선충은 노지 및 시설 재배에 가장 큰 피해를 주는 해충 중 하나로서, 약 700여 종의 식물이 기주로 알려져 있다. 그 종류로는 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica) 및 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 등이 있으며, 주로 참외, 오이, 토마토, 딸기 고추 및 수박 등의 과채류와 인삼 등에 피해를 주는 가장 방제하기 어렵고 피해가 큰 해충이다. 뿌리혹선충의 방제는 메틸 브로마이드 등의 훈증제와 포스티아제이트(Fosthiazate) 등의 살선충제가 주로 이용된다.

그러나 이러한 화학적 방제는 인축에 대한 위험성과 잔류독성, 환경오염, 생태계 교란 등과 같은 다양한 문제점이 있다. 게다가, 유기인계, 카바메이트계 농약의 대안으로 사용되었던 메틸 브로마이드의 농약 폐지로 인해 보다 안전한 살선충제의 개발이 요구되어지고 있다. 또한, 최근에는 친환경적으로 재배되는 농산물을 요구하는 소비자들이 늘어나고 있는 실정이다. 따라서 인축이나 환경에 안전하면서 뿌리혹선충류 방제에 효과적인 대체 물질의 개발에 대한 연구가 다양하게 추진되고 있다.

환경 친화적인 식물기생성 선충 방제방법의 하나는 식물체 추출물을 이용하는 것이다. 식물은 2차 대사산물을 생성하여 오랜 시간동안 다른 생물체에 대한 공격에 저항해 왔다. 따라서, 이러한 식물체를 이용하여 뿌리혹선충을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 판단된다.

한국공개특허 제2013-0036985호에는 현호색 추출물로부터 분획된 현호색 분획물로부터 분리된 알칼로이드 화합물을 포함하는 살충 조성물이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2008-0074809호에는 천연 식물 추출물 및 이를 포함하는 해충 방제용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 살선충 활성물질 4-퀴놀론 알카로이드 물질 및 이를 이용한 선충 방제 방법에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 다양한 식물 추출물을 이용하여 살선충활성을 스크리닝을 하는 과정에 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 추출물이 강력한 살선충활성을 보인다는 사실을 발견하였다. 이에 따라, 이 식물추출물로부터 활성물질을 분리하고 동정한 결과, 두 개의 4-퀴놀론 알카로이드계 물질을 분리하였으며, 이들 중 한 물질은 신규한 물질이었으며, 두 물질에 대한 살선충활성은 처음으로 보고하는 바이다. 또한 이 두 물질의 살선충활성은 천연물질 중 가장 살선충 활성이 강한 것으로 알려진 아바멕틴(abamectin)과 거의 유사한 것으로 나타나 이들 물질을 이용할 경우 뿌리혹선충을 포함한 다양한 선충을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 판단된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트리움페타(Triumfetta) 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 월쎄리온 A(waltherione A)와 매우 비슷한 살충활성을 보이는 신규한 물질 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A)를 제공한다.

또한, 본 발명은 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 추출물, 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물 및 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 선충 방제 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 선충 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 뿌리혹선충에 대해 우수한 방제활성을 나타내므로 환경 친화적인 천연물 살선충제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 동물 및 인체의 선충을 방제하는 약품 개발에 직접적으로 또는 선도물질로서 이용될 수 있다.

도 1은 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)의 지상부로부터 획득한 메탄올 추출물과 상기 추출물에서 얻어진 세 개의 유기용매 분획층의 토마토 뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
도 2는 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)의 지상부 추출물로부터 분리한 두 개의 살선충활성 물질의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 3은 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)의 지상부로부터 분리한 두 개의 4-퀴놀론 알카로이드계 물질인 5'-메톡시월쎄리온 A와 월쎄리온 A의 토마토 뿌리혹선충의 알부화 억제활성을 나타낸 것이다.
도 4는 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 지상부의 메탄올 추출물의 온실에서 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제활성을 나타낸 것이다.
도 5는 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 지상부의 메탄올 추출물 처리시 토마토 식물 뿌리의 모습을 무처리구와 선충탄 2,000배 처리구와 함께 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 트리움페타(Triumfetta) 속 식물 추출물은 선충 방제 활성을 갖는 트리움페타 속 식물 추출물이면 제한 없이 사용가능하며, 바람직하게는 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 추출물은 트리움페타 그란디덴스 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 메탄올 분획물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는, 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)의 지상부로부터 획득한 메탄올 추출물과 이 추출물에서 얻어진 세 개의 유기용매 분획층 중에서 에틸아세테이트층이 가장 높은 살선충 활성을 나타내었으므로, 상기 추출물은 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 바람직한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 추출물에서, 상기 선충은 바람직하게는 식물기생성 선충이며, 더욱 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 시스트선충(Globodera spp.), 씨알선충(Anguina spp.), 줄기구근선충(Ditylenchus spp.), 아엽선충(Aphalenchoides spp.), 뿌리썩이선충(Pratylenchus spp.), 왜화선충(Tylenchorhychus spp.), 감귤선충(Rotylenchulus spp.) 등이며, 가장 바람직하게는 뿌리혹선충이다. 바람직한 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

(식 중, R은 수소임)

상기 조성물은 유효성분으로 상기 화학식 1의 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물을 포함하며, 상기 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물을 선충에 감염된 식물 또는 토양에 처리함으로써 선충을 방제할 수 있는 것이다.

본 발명의 월쎄리온 A(waltherione A)는 ESI-MS 분석 결과 m/z 값이 394.26으로 검출되었으며, MS와 NMR 분석결과 C₂₃H₂₃NO₅ 분자식을 갖는 것으로 확인되었다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 선충은 뿌리혹선충일 수 있으며, 바람직한 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물은 유효성분으로 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물 외에 당업계에 살선충 활성물질, 특히 뿌리혹선충 방제 물질로 알려져 있는 기타 물질을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 선충 방제용 조성물은 농약보조제로서 제제화에 일반적으로 사용되는 담체, 기타 보조제 등을 배합하여, 유제, 현탁제, 분제, 입제, 정제, 수화제, 수용제, 수액, 유동제, 과립 수화제, 에어로졸제, 페이스트제, 유탁제, 훈연제 등의 여러 형태로 제제할 수 있다. 이때, 제제화 시에 사용되는 담체로서는, 고체 담체와 액체 담체의 어느 것이나 그 사용목적에 따라 이용할 수 있다. 고체 담체로서는 예를 들면, 전분; 활성탄; 대두분, 소맥분, 목분, 어분, 분유 등의 동식물성 분말; 탈크, 카올린, 벤토나이트, 탄산칼슘, 제올라이트, 규조토, 화이트 카본, 클레이, 알루미나, 황산 암모늄, 요소 등의 무기물 분말을 들 수 있다. 액체 담체로서는 예를 들면 물; 이소프로필알콜, 에틸렌글리콜 등의 알콜; 시클로헥사논, 메틸에틸케톤 등의 케톤류; 디옥산, 테트라히드로퓨란 등의 에테르류; 케로신, 경유 등의 지방족 탄화수소류; 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 메틸나프탈렌, 솔벤트나프타 등의 방향족 탄화수소류; 클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; 디메틸아세트아미드 등의 산 아미드류; 지방산의 글리세린에스테르 등의 에스테르류; 아세토니트릴 등의 니트릴류; 디메틸술폭시드 등의 함황화합물류 등을 들 수 있다.

계면활성제로서는 예를 들면, 알킬벤젠술폰산금속염, 디나프틸메탄디술폰산 금속염, 알콜황산 에스테르염, 알킬아릴 술폰산염, 리그닌술폰산염, 폴리옥시에틸렌글리콜에테르, 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄모노알킬레이트 등을 들 수 있다.

그 밖의 보조제로서는 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 알긴산 나트륨, 구아검, 트라간트검, 폴리비닐알콜 등의 고착제 혹은 증점제, 금속 비누 등의 소포제, 지방산, 알킬인산염, 실리콘, 파라핀 등의 물성 향상제, 착색제 등을 사용할 수 있다.

이들 제제의 실제 사용 시에는, 그대로 사용하거나, 또는 물 등의 희석제로 소정 농도로 희석하여 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 여러 제제, 또는 그 희석물의 시용은, 통상 일반적으로 행해지고 있는 시용방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용(箱施用) 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면시용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이(毒餌), 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물을 제공한다.

(식 중, R은 -OCH₃ 임)

본 발명의 5'-메톡시월쎄리온 A (5'-methoxywaltherione A)는 신물질로서 월쎄리온 A (waltherione A)에 C-5'에 methoxy group이 붙어 있는 화합물임을 MS 분석과 NMR 분석을 통해 확인되었다. 5'-메톡시월쎄리온 A (5'-methoxywaltherione A)는 ESI-MS 분석결과 [M-H]^- 값으로 m/z 422.06이 검출되었으며, MS와 NMR 분석결과 C₂₄H₂₅NO₆ 분자식을 갖는 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 2의 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 유효성분으로 상기 화학식 2의 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물을 포함하며, 상기 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물을 선충에 감염된 식물 또는 토양에 처리함으로써 선충을 방제할 수 있는 것이다.

본 발명의 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물로부터 획득한 5'-메톡시월쎄리온 A와 기지의 물질인 월쎄리온 A가 뿌리혹선충 유충과 알 부화 억제활성을 가질 뿐만 아니라, 토마토 뿌리혹선충병에서도 농도 의존적으로 뿌리혹형성을 완벽하게 억제하는 것을 확인함으로써, 선충방제에 효과적인 점을 발견하였다. 두 물질은 모두 1.25 ㎍/mL의 농도에서 90% 이상의 알부화 억제율을 보여 아바멕틴(abamectin)과 유사한 알 부화 억제능을 나타내었다. 또한, 뿌리혹선충 2령 유충에 대하여, 처리농도 0.02-10 ㎍/mL에서 두 물질은 우수한 유충 치사활성을 보였다. 시료 72시간 후에는 실험에 사용된 물질 1과 2 그리고 아바멕틴(abamectin) 모두 더욱 치사활성이 증가하여 각각 0.08, 0.18, 0.11 ㎍/mL 수준의 EC₅₀ 값을 나타내었다.

또한, 본 발명은 상기 선충 방제용 물질을 작물 또는 토양에 처리하여 선충을 방제하는 방법을 제공한다. 본 발명에서는 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 추출물, 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물 및 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 선충 방제 방법을 제공한다.

상기 선충을 방제하는 방법으로는 본 발명의 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 추출물, 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물 및 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 작물이나 작물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물의 뿌리혹선충병 방제활성을 토양 관주 처리로 실험한 결과, 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물 500, 1000, 2000 ㎍/mL 농도의 시료는 효과적으로 뿌리혹 생성을 감소시켰다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 용매분획별 살선충 활성

트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens)의 지상부로부터 획득한 메탄올 추출물 11.26 g을 500 mL의 물과 동량의 에틸아세테이트로 용해한 다음 분획을 2회 실시하여 에틸아세테이트층을 얻은 후 200 mL의 부탄올을 물층에 가하여 2회 분배 추출하였다. 이렇게 하여 얻어진 3개의 분획층을 감압농축한 후 얻어진 추출물을 메탄올 추출물과 비교하여 토마토 2령 유충을 이용하여 살선충 활성을 조사하였다.

구체적으로, 토마토 뿌리혹선충에 감염된 토마토 식물의 뿌리를 수돗물로 씻어내 이물질을 제거하였다. 잘 씻은 뿌리를 2 cm 크기로 자른 후 믹서기에 넣고 뿌리가 잠길 정도로 0.5% (v/v)차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 넣은 후 1분 동안 분쇄하였다. 분쇄 후 0.02 ㎛ 체를 사용하여 알을 분리하였고, 분리된 알은 깔대기법(Baermann funnel)을 이용하여 유충을 분리하여 실험에 사용하였다.

토마토 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 2령 유충의 살선충 활성은 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법으로 조사하였다. 1차 스크리닝은 96-웰 플레이트에 토마토 뿌리혹선충 2령 유충을 50 ㎕ 당 20~30마리 밀도로 계수하여 각각 49.5 ㎕씩 접종하였다.

준비된 트리움페타 그란디덴스 메탄올 추출물과 부탄올 추출물은 메탄올에, 에틸아세테이트 추출물은 아세톤에, 그리고 물층은 물에 각각 용해한 후, 각각의 시료를 최종농도 1,000 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 125 ㎍/mL, 63 ㎍/mL, 32 ㎍/mL, 16 ㎍/mL 및 8 ㎍/mL이 되도록 선충 유충 현탁액에 처리하였다. 무처리 웰에는 0.5 ㎕의 메탄올 또는 아세톤을 처리하였다. 시료 처리 후 시료가 잘 섞이도록 96-웰 플레이트를 30초간 교반한 후 상대습도 100% 플라스틱 통에 넣은 후 랩을 씌워 밀봉한 후 배양기(25±2℃)에 보관하였다.

시료 처리 72시간 후 40배율 실체 현미경 하에서 관찰하였으며, 유충의 치사 유무는 웰 플레이트를 흔들어 몸 전체가 일자로 뻗은 상태로 운동성이 없는 유충을 죽은 유충으로, 그렇지 않은 유충은 살아있는 유충으로 판단하여 살선충 활성(%)을 조사하였다. 무처리 대조구로는 메탄올 1%를 사용하였고, 대조약제로는 아바멕틴(abamectin)을 치사 농도인 1 ㎍/mL를 사용하였다. 실험은 3회 반복으로 수행하였다.

그 결과, 도 1에서와 같이 에틸아세테이트층이 가장 높은 살선충 활성을 나타내었으며, 물층에는 전혀 활성이 없었다. 에틸아세테이트층, 메탄올층, 부탄올층의 EC₅₀값은 각각 8.35, 56.62, 120.18 ㎍/ml 이었으며, 활성이 가장 높은 에틸아세테이트층을 이용하여 살선충 물질의 분리를 수행하였다.

실시예 2. 살선충활성 물질 분리

가장 활성이 강한 것으로 나타난 에틸아세테이트 추출물(3.19 g)을 실리가켈 컬럼(3.5 x 60 cm, Kieselgel 60, 200 g, 70-230 mesh)에 가한 다음 클로로포름-메탄올 (95:5)로 용출하여 분획을 받은 다음 TLC 분석을 실시하여 비슷한 패턴을 보이는 분획들을 모아 최종적으로 11개의 분획(F1~F11)을 얻었다. 이들 11개 분획에 대하여 살선충활성을 조사한 결과, F4~F8이 활성이 있는 것으로 나타났고, 이들 분획들은 모두 Kieselgel 60GF254를 이용한 TLC 분석(전개 용매: 클로로포름-메탄올, 9:1)에서 Rf가 0.4인 물질을 포함하고 있었다. 활성을 보이는 F4~F8을 모두 합한 다음 시료(454.5 mg)를 Sephadex LH-20컬럼(70 g, 62 X 2.8 cm, 70-100 ㎛)에 가한다음 메틸렌클로라이드-n-헥산-메탄올(5:5:1)로 용출한 후 활성을 보이는 물질을 모아 농축하였다. 이 시료(49.3 mg)를 C18 reversed-phase 컬럼(Atlantis T3, 5 ㎛, OBD 19 x 250 mm, Waters, Co., Ireland)이 장착된 분취형 HPLC를 이용하여 분리를 실시하였다. 용출용매는 메탄올-0.05% TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 물(55:45)이였고, 유속 (flow rate)는 3.5 mL/min였다. 이 과정을 통하여 최종적으로 물질 1(8.5 mg)과 2(9.0 mg)를 순수하게 분리하였다.

실시예 3. 분리한 물질의 구조 결정

수득한 화합물 2종은 각각 HR-ESI-MS와 ¹H, ¹³C-NMR, 2-D NMR 등을 통해 구조를 동정하였다. 물질 1은 ESI-MS 분석결과 [M-H]^- 값으로 m/z 422.06이 검출되었으며, MS와 NMR 분석결과 C₂₄H₂₅NO₆ 분자식을 갖는 것으로 확인되었다.

물질 1과 2의 ¹H-¹³C-NMR 데이터는 아래 표 1에 정리하였다. 물질 1은 ¹H-NMR 스펙트럼에서 5.89와 7.66 ppm에서 5개의 방향족 수소 (aromatic hydrogen)에 기인하는 두 개의 signal이 관측되었으며, 2.46, 3.54, 3.78 및 3.95 ppm에서 4개의 methyl singlet이 관측되었다. 또한 두 개의 diastereotopic methylene이 2.03/2.43 그리고 2.01/2.33 ppm에서 관측되었으며, 두 개의 3차 C-H (methine hydrogen)이 4.69와 6.61 ppm에서 관측되었고, 한 개의 수산기 (hydroxyl group)이 5.12 ppm에서 관측되었다. 물질 1은 ¹³C-NMR, DEPT, HMQC 분석을 통해 14개의 aromatic carbon으로 기인하는 signal이 111.43과 153.06 사이에서 관측되었으며, 171.06 ppm에서 carbonyl carbon과 75.62와 80.11 ppm에서 두 개의 oxygenated methine carbon에 기인하는 signal이 관측되었다. 또한, 78.06 ppm에서 oxygenated quaternary carbon에 기인하는 signal이 관측되었다. 22.22와 34.06 ppm에서 두 개의 methylene carbon에 기인하는 signal이 관측되었으며, 55.42, 55.86, 60.46 ppm에서 세 개의 methoxy group이 관측되었다.

물질 2는 ESI-MS 분석 결과 [M+H]⁺ 값이 394.26으로 검출되었으며, MS와 NMR 분석결과 C₂₃H₂₃NO₅ 분자식을 갖는 것으로 확인되었다. 물질 1과 2는 매우 유사하였으나, 물질 1은 MS 분석과 NMR 분석을 통해 C-5'에 한 개의 methoxy group이 붙어있는 것으로 확인되었다. MS와 NMR 분석 결과 물질 2는 월쎄리온 A로 동정되었으며 물질 1은 신물질로서 물질 2에 C-5'에 methoxy group이 붙어 있는 것으로 확인되었으며 5'-메톡시월쎄리온 A로 명명하였다. 분리한 두 개의 살선충 물질의 구조는 도 2에 나타내었다.

5'-메톡시월쎄리온 A와 웰쎄리온 A의 ¹H-¹³C NMR 데이터

Position	5'-methoxywaltherione A		Waltherione A
Position	δ _C	δ _H(mult; J, Hz)	δ _C	δ _H(mult; J, Hz)
2	140.96, C		141.16, C
3	138.52, C		138.63, C
4	171.06, C		171.97, C
4a	118.50, C		118.83, C
5	141.33, C		141.54, C
6	132.35,C		132.24, C
7	133.17, CH	7.66, d (7.5)	133.06, CH
8	117.63, CH	7.38, d (7.0)	117.52, CH
8a	144.09, C		143.41, C
9	77.95, C		78.06, C
10	80.05, CH	4.69, d (7.5)	80.11, CH	4.70, d (7.5)
11	22.22, CH₂	a (2.03, m), b (2.43, m)	22.22, CH₂	a (2.08, m), b (2.41, m)
12	34.05, CH₂	a (2.01, m), b (2.33, m)	34.06, CH₂	a (2.01, m), b (2.35, m)
13	75.61, CH	6.61, br s	75.62, CH	6.67, d (6.0)
1'	135.53, C		134.21, C
2'	153.06, C		156.19, C
3'	111.43, CH	6.70, dd (9.0, 2.5)	110.89, CH	6.96, d (8.0)
4'	111.43, CH	6.88, d (8.5)	128.71, CH	7.21, t (15.0)
5'	150. 48, C		120.67, CH	6.73, t (15.0)
6'	119.37, CH	5.89, s (2.0)	131.64, CH	6.33, d (7.5)
2C-CH₃	14.67, CH₃	2.46, s	14.68, CH₃	2.46, s
3C-OMe	55.86, CH₃	3.95, s	55.51, CH₃	4.00, s
2'C-OMe	60.46, CH₃	3.78, s	60.29, CH₃	3.77, s
5'C-OMe	55.42, CH₃	3.54, s

δ _C : carbon의 chemical shift 값, δ _H: hydrogen의 chemical shift 값

s: singlet, d: doublet, dd: double doublet

J: coupling constant 값

실시예 4. 분리한 살선충물질의 뿌리혹선충 알 부화 억제활성

트리움페타 그란디덴스(T. grandidens) 지상부의 메탄올 추출물로부터 획득한 물질 1과 2는 메탄올에 용해하여 stock solution을 조제하였으며, 대조약제로서 아바멕틴(abamectin)은 아세톤에 용해하여 실험에 사용하였다. 세 가지 시료의 stock solution은 0.3% Tween 20이 들어있는 멸균수에 50배 희석하여 최종 농도 0.04-20 ㎍/mL 농도가 되도록 조제하였다.

뿌리혹선충에 대한 알 부화 억제활성은 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법으로 조사하였다. 150 개의 선충 알을 함유한 25 ㎕의 선충 알 현탁액을 96-웰 마이크로 플레이트에 옮겨 상기와 같이 조제한 물질 1과 2 그리고 아바멕틴 (abamectin)을 25 ㎕ 처리하여(1:1, v/v) 최종농도 0.02-10 ㎍/mL 되도록 처리하였다. 멸균수와 시료의 용해에 사용된 용매를 대조구로 사용하였으며, 실험은 5회 반복을 수행하였다. 시료 처리 3, 7, 14일 후 아래와 같은 식을 이용하여 알 부화 억제율을 조사하였다.

알 부화 억제율 (%) = [(C-T)/C]×100, C= 대조구의 알 부화율^*, T= 처리구의 알 부화율, ^*알 부화율(%) = 100 × 유충의 수/[알의 수 + 유충의 수]

그 결과, 도 3에서 나타낸 것처럼 트리움페타 그란디덴스(T. grandidens) 지상부의 메탄올 추출물로부터 획득한 5'-메톡시월쎄리온 A와 월쎄리온 A는 상당한 알 부화 억제활성을 나타내었다. 두 물질은 모두 1.25 ㎍/mL의 농도에서 90% 이상의 알부화 억제율을 보여 아바멕틴 (abamectin)과 유사한 알 부화 억제능을 나타내었다.

실시예 5. 분리한 살선충물질의 뿌리혹선충 유충 치사활성

트리움페타 그란디덴스(T. grandidens) 지상부의 메탄올 추출물로부터 획득한 물질 1과 2에 대해 뿌리혹선충 2령 유충에 대한 치사활성을 조사하였다. 앞에서 설명한 방법을 이용하여 뿌리혹 선충의 2령 유충을 얻었으며 이를 50 개 선충 유충/ 25 ㎕ 밀도로 조제하여 96-웰 마이크로 플레이트에 넣은 다음 상기와 같이 조제한 물질 1과 2, 대조약제로 아바멕틴(abamectin)을 25 ㎕ 처리하여(1:1, v/v) 최종농도 0.02-10 ㎍/mL 농도가 되도록 처리하였다. 멸균수와 시료의 용해에 사용된 용매를 대조구로 사용하였으며, 실험은 5회 반복을 수행하였다. 시료처리 후 96-웰 마이크로 플레이트는 27℃ 배양기에서 보관한 후 24, 48, 72시간 후 다음과 같은 식을 이용하여 치사율을 조사하였다. 50% 살선충 활성 농도(EC₅₀) 값은 마이크로 소프트 사의 Excel 2010 프로그램을 이용하여 산출하였다.

치사율(%)=[(처리구의 치사율-대조구의 치사율)/(100-대조구의 치사율)] x 100

그 결과, 트리움페타 그란디덴스(T. grandidens) 지상부 추출물로부터 획득한 물질 1과 2는 우수한 유충 치사활성을 보였다. 표 2에 물질 1과 2, 대조약제로서 아바멕틴(abamectin)의 EC₅₀ 값을 나타내었다. 시료 처리 48시간 후 5'-메톡시월쎄리온 A EC₅₀ 값은 0.09 ㎍/mL, 웰쎄리온 A는 0.27 ㎍/mL의 농도 수준이었으며 대조약제로 사용된 아바멕틴(abamectin)은 0.13 ㎍/mL 수준으로 5'-메톡시월쎄리온 A는 아바멕틴(abamectin) 보다 낮은 농도의 EC₅₀ 값을 가져 우수한 유충 치사활성을 보였다. 시료 72시간 후에는 실험에 사용된 물질 1과 2 그리고 아바멕틴(abamectin) 모두 더욱 치사활성이 증가하여 각각 0.08, 0.18, 0.11 ㎍/mL 수준의 EC₅₀ 값을 나타내었다. 이와 같은 결과로 살선충 물질 5'-메톡시월쎄리온 A는 방선균 유래 살선충 물질인 아바멕틴(abamectin) 보다 강력한 살선충 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물로부터 획득한 살선충 물질과 대조약제로서 아바멕틴(abamectin)의 뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 EC₅₀ 값

	EC₅₀ (㎍/mL)
	24 시간	48 시간	78 시간
5'-methoxywaltherione A	0.15	0.09	0.08
waltherione A	0.26	0.27	0.18
abamectin	0.96	0.13	0.11

실시예 6. 트리움페타 그란디덴스 메탄올 추출물의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제활성

트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물의 뿌리혹선충병 방제활성은 25℃ 유리온실에서 수행되었다. 직경 9 cm 포트에 400 g의 멸균한 사질토를 넣은 다음 온실에서 2주 동안 생육한 '서광'(몬산토코리아) 품종의 토마토를 이식하였다. 앞서 설명한 방법으로 뿌리혹선충에 감염된 토마토 뿌리로부터 알을 수거하여 각 포트당 5,000 마리의 알을 접종하였다. 그런 다음 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물을 메탄올에 용해한 후 0.025% (v/v) Tween 20 용액에 희석하여 최종농도 500, 1000, 2000 ㎍/mL 농도로 조제하였다. 대조농약으로 선충탄(30% fosthiazate)을 멸균수에 2,000배(150 ㎍/mL) 희석하여 사용하였으며, 음성대조구로 멸균수와 5% (v/v) 메탄올이 들어있는 0.025% (w/v) Tween 20 용액을 사용하였다. 각각의 시료는 포트당 20 mL씩 토양관주 처리하였으며, 실험은 5회 반복을 수행하였다. 선충 알 접종 6주 후 식물체의 뿌리를 수돗물로 깨끗이 씻은 후 Taylor and Sasser (1978, Biology, identification and control of root-knot neamtodes (Meloidogyne species), Cooperative Publication Department Plant Pathology, North Carolina State University and United State Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Raleigh, USA, 111)에 따라 뿌리혹 지수를 조사하였다. 뿌리혹 지수(GI: Galling Index)는 0-5단계(0 =0%, 1= 1-20%, 2= 21-40%, 3 = 41-60%, 4 = 61-80%, 5 = 81-100%)를 적용하여 조사하였다.

그 결과, 도 4에서와 같이 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물 500, 1,000, 2,000 ㎍/mL 농도의 시료는 효과적으로 뿌리혹 생성을 감소시켰다. 1,000과 2,000 g/mL 농도의 메탄올 추출물은 뿌리혹 생성을 완벽하게 저해하였으며 이것은 선충탄과 유사하였다. 대조적으로 무처리구는 극심한 뿌리혹 생성이 확인되었다(도 5). 또한, 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물 처리시 약해는 발생하지 않았다.

이와 같은 결과로서, 트리움페타 그란디덴스(Triumfetta grandidens) 메탄올 추출물은 뿌리혹선충병에 대한 강력한 살선충제로서 사용할 수 있을 것으로 판단하였다.

Claims

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하기 화학식 1의 월쎄리온 A(waltherione A) 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물.
[화학식 1]

(식 중, R은 수소임)
제6항에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
하기 화학식 2의 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물.
[화학식 2]

(식 중, R은 -OCH₃ 임)
하기 화학식 2의 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물.
[화학식 2]

(식 중, R은 -OCH₃ 임)
제10항에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
월쎄리온 A(waltherione A) 화합물 및 5'-메톡시월쎄리온 A(5'-methoxywaltherione A) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 선충 감염 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 선충 방제 방법.