KR102350697B1 - 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 - Google Patents

페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 섬유증의 원인이 되는 TGF-β의 신호 전달을 억제하여 콜라겐과 피브로넥틴의 활성화 및 발현을 억제함으로써 조직의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있고, 현재 시판 중인 폐 섬유증 치료제인 닌테다닙 또는 피르페니돈에 비하여 항섬유화 활성이 현저하게 우수하므로, 섬유증의 예방 또는 치료에 있어서 널리 활용될 것이다.

Description

페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물{FOOD COMPOSITION FOR PREVENTING OR ALLEVIATING FIBROSIS COMPRISING PHEOPHORBIDE COMPOUNDS AS AN EFFECTIVE INGREDIENT}
본 발명은 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
서구 사회의 사망 원인의 약 45%에 해당하는 섬유증 질환은 임상적으로 질병이 상당히 진행된 후에 진단이 가능하기 때문에, 예방적 치료의 한계가 있고 더불어 현재까지 진행성 및 기 생성된 섬유증을 직접 해결하는 효과적인 치료 수단도 없는 심각한 질환 분야이다.
섬유화 질환의 진행을 지배하는 원인 세포로는 비정상적으로 활성화된 섬유아세포인 근섬유아세포(myofibroblast)가 지목되고 있다. 근섬유아세포는 섬유성 1,3형 콜라겐 및 피브로넥틴으로 이루어진 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM)의 조직 내 축적 및 세포외기질을 분해하는 효소 유전자들의 비활성화를 유발하는 특징이 있다.
이러한 근섬유아세포의 분화와 활성화에는 손상된 상피, 내피, 골수 유래 섬유소 세포, 면역 세포 등에서 분비되는 TGF-β1(Transforming growth factor-beta 1), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-1(Interleukin-1), IL-6, IL-13, PDGF(Platelet-derived growth factor) 등의 성장 인자와 사이토카인 등이 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 섬유증을 악화시키는 상기 성장 인자와 사이토카인의 활성화 및 신호 전달을 차단하는 것이 섬유증을 치료하는 출발점이 될 수 있으며, 당업계에서는 섬유증 치료를 위해 TGF-β1, IL-13, CTGF(connective-tissue growth factor), PDGF, αvβ6 인테그린, 갈렉틴-3, LOXL2(Lysyl oxidase homolog 2), 트랜스글루타미네이즈-2, NOX4(NADPH oxidase 4) 또는 JNK(Jun N-terminal kinases) 억제제를 표적으로 하는 약물들이 개발 중이다.
현재, 특발성 폐섬유화 환자에게 투여되는 약물은 스테로이드 및 면역 억제제를 단독으로 또는 병용으로 사용하고 있다. 그러나, 전체 환자 중에 약 10 내지 30%의 환자에서 치료 효능을 나타내지만, 중간 생존율이 3년 미만으로 효과적이지는 못하며 많은 부작용으로 사용이 점차 줄어들고 있는 추세이다.
한편, 피르페니돈(Pirfenidone)은 TGF-β의 프로모터 반응을 억제하는 약물로 2011년 가이드라인에서 조건부 사용 금지가 권고된 약물이다. 하지만, 최근 조건부 사용가능 약물로 업데이트 되었으며, 동물연구에서 근섬유아세포의 확산을 감소시킨 것으로 나타났다. 그러나, 후속으로 진행된 임상시험에서는 뚜렷한 효과는 없었고 오심, 구토, 소화불량 등의 부작용이 나타나고 있음이 보고되었다.
또한, 티로신 키나아제 억제제인 닌테다닙(nintedanib)은 다양한 세포의 성장인자 수용체들을 억제하는 약물로서 세포 수준에서 섬유화를 촉진하는 사이토카인의 작용을 억제하고 TGF-β에 의한 콜라겐 합성을 감소시키며 섬유화 유도 동물 실험에서 폐섬유증을 완화시키는 것으로 알려져 있다(EP1530466B). 임상 실험을 통해 광범위한 환자군에서 폐 기능 감소 지연 효과를 나타내고 있으나, 폐섬유화를 치료할 수 있는 기능은 없는 것으로 알려져 있다.
이와 같이, 피르페니돈과 닌테다닙 약물은 폐 기능 감소의 지연에 초점이 맞춰져 있으며 섬유증의 진행 자체를 멈추게 하는 약물로서 기능을 하지 못한다는 한계를 가지고 있는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 조직의 섬유화를 억제하여 섬유증의 예방 또는 치료에 효과적인 성분을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 페오포르바이드 a가 TGF-β의 신호 전달을 억제함과 동시에 섬유화 질환의 핵심 단백질인 세포외기질 콜라겐과 피브로넥틴의 활성화를 효율적으로 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 조직의 섬유화를 억제하여 섬유증을 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 섬유증의 원인이 되는 TGF-β의 신호 전달을 억제하여 콜라겐과 피브로넥틴의 활성화 및 발현을 억제함으로써 조직의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있다. 뿐만 아니라, 현재 시판 중인 폐 섬유증 치료제인 닌테다닙 또는 피르페니돈에 비하여 항섬유화 활성이 현저하게 우수하므로, 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 것이다.
도 1은 황칠로부터 페오포르바이드 a를 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 세포 수준에서 페오포르바이드 a의 항섬유화 활성을 분석하기 위한 실험의 개략도이다.
도 3은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu와 LL-29에서 페오포르바이드 a의 세포 독성을 실험한 결과이다.
도 4는 TGF-β 및/또는 페오포르바이드 a 처리에 따른 Smad 단백질의 DNA 결합능의 차이를 확인하기 위한 루시퍼라아제 분석 방법으로 확인한 결과이다.
도 5는 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 페오포르바이드 a를 농도 별로 처리함에 따른 콜라겐 1A, 피브로넥틴, 알파 평활근 액틴 단백질의 발현량 차이를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 6은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 페오포르바이드 a를 농도 별로 처리함에 따른 콜라겐 1A의 발현량 차이를 면역세포화학 분석 방법을 이용하여 비교한 결과이다.
도 7 내지 도 10은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β와 페오포르바이드 a, 닌테다닙 또는 피르페니돈 처리에 따른 α-SMA 유전자(도 7), CTGF 유전자(도 8), 피브로넥틴 유전자(도 9) 및 NOX4 유전자(도 10)의 발현량 차이를 정량적 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 이용하여 비교한 결과이다.
도 11은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β와 페오포르바이드 a, 닌테다닙 또는 피르페니돈 처리에 따른 콜라겐 1A, 피브로넥틴 및 알파 평활근 액틴 단백질의 발현량 차이를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 12는 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β와 페오포르바이드 a, 닌테다닙 처리에 따른 콜라겐 1A 단백질의 발현량 차이를 면역세포화학 분석 방법을 이용하여 비교한 결과이다.
도 13은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β와 페오포르바이드 a, 닌테다닙 처리에 따른 Smad, 인산화된 Smad3, ERK 및 인산화된 ERK 단백질의 발현량의 차이를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명의 일 측면은, 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "페오포르바이드계 화합물"은 하기와 같은 화학식의 구조를 갖는다.
Figure 112021051794902-pat00001
상기 화학식에서, R1, R2 및 R3는 각각 H, C1~C4 직쇄 또는 측쇄 알킬, 카르복실, C1~C4의 알콕시카보닐, C1~C4의 알콕시카보닐 C1~C4 알킬, 아미노기, 아미노 C1~C4 알킬 및 옥소(=O)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
R4는 H, 히드록시, 옥소(=O), C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1~C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 아미노 및 아미노 C1~C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
본 발명에 있어서, 상기 페오포르바이드계 화합물은 페오포르바이드 a인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "페오포르바이드 a"는 C35H36N4O5의 분자식으로 표시되는 화합물이며, 하기와 같은 화학식의 구조를 갖는다.
Figure 112021051794902-pat00002
상기 페오포르바이드계 화합물, 구체적으로 페오포르바이드 a는 TGF-β 신호 전달을 억제하여 근섬유아세포의 분화와 활성화를 억제할 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 근섬유아세포의 주요 마커인 α-SMA의 발현을 억제하며, 섬유화의 특징인 세포외기질 단백질인 콜라겐 및 피브로넥틴의 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "TGF-β"는 손상된 조직의 복구를 시작하고 종결시키는 핵심적인 사이토카인을 의미하며, TGF-β가 계속적으로 생산되면 조직의 섬유화가 초래된다. 특히, 만성 간질환의 간조직 소견에서 TGF-β1 mRNA 발현은 콜라겐 I mRNA의 발현과 밀접하게 연관되어 있다. 또한, TGF-β1 단백질은 섬유화가 진행된 곳에서만 발현되고, 정상 간조직이나 비활동적인 곳에서는 발현되지 않는다. 따라서, 간섬유증 및 간경변에서 TGF-β가 중요한 역할을 담당하고 있다고 알려져 있다.
또한, 섬유증의 주요 원인세포인 근섬유아세포의 분화와 활성화에 TGF-β가 관여하는 것으로 알려져 있다. 섬유화 과정의 활성화에 있어서, 분자적 기전의 핵심은 TGF-β와 Smad 의존적인 신호 전달에 의한 근섬유아세포의 활성화이다. TGF-β1이 세포막에 존재하는 TGF-β1 수용체에 결합하면 TGF-β1 고유 기능의 신호를 전달하게 된다. 또한, 활성화된 TGF-β1 수용체는 Smad2 및 Smad3 단백질의 인산화(phosphorylation) 반응을 유도하고, 인산화된 Smad2/Smad3는 Smad4 단백질과 결합하여 복합체를 형성한다. Smad 복합체는 세포 핵 속으로 전위(translocation)되어 피브로넥틴 및 콜라겐과 같은 세포외기질을 구성하는 단백질의 전사를 일으키는 것으로 알려져있다.
따라서, 상기 페오포르바이드계 화합물, 특히, 페오포르바이드 a는 TGF-β의 신호 전달을 억제하여, Smad 단백질의 인산화를 억제함으로써 세포외기질을 구성하는 피브로넥틴 및 콜라겐의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "섬유증"은 장기 또는 조직에서 과량의 섬유성 결합 조직이 형성되는 것을 의미한다. 이는 장기 또는 조직에서 정상적 구성요소로서의 섬유성 조직과는 구별될 수 있다. 섬유증은 섬유아세포에 의한 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외기질이 과량 축적되어 장기 조직의 경직화에 따른 인체 조직 기능의 손실을 지속적으로 유발하는 치명적인 질병으로 이해될 수 있다.
상기 섬유증은 예를 들어, 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 관절 섬유증, 신경 섬유증, 췌장 섬유증, 신장 섬유증, 근 섬유증 및 복막 섬유증으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 명세서 사용된 용어 "간섬유증(liver fibrosis)"은 간의 만성 손상으로 섬유 조직이 증식하는 증상을 말하며, 만성 간 질환, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, D형 간염 바이러스 감염, 주혈흡충증, 알코올성 간 질환 또는 비-알코올성 지방간염, 대사성 질환, 단백질 결핍증, 관상 동맥 질환, 자가 면역 간염, 낭포성 섬유증, 알파-1 항트립신 결핍증, 일차성 담즙성 간경화증, 약물 반응 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로 인한 것을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
간섬유화는 간경변증의 전구병변으로 만성 간질환을 일으키는 심한 간 손상의 결과로 여러 가지 사이토카인과 성장인자의 작용에 의해 시작된다. 일반적으로 간섬유증은 가역적이고 얇은 피브릴(thin fibril)로 구성되며 결절 형성이 없고 간손상 원인이 한시적인 경우 세포사멸(apoptosis) 과정과 MMP(matrix metalloproteinases)에 의해서 증가된 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이 분해되어 정상 회복이 가능하다. 그러나 간섬유증 과정이 반복적으로 지속되면 두꺼운 피브릴(thick fibril)을 형성하고 결절이 있는 간경변으로 진행하게 된다. 또한 다양한 염증 유발요인으로 인해 간세포가 손상되어 콜라겐을 포함한 비정상적인 세포외기질 단백질이 축적되는 간섬유증의 과정을 통하여 간경변증이 유발되며 간경변증의 발현 조절을 위해서는 세포외기질의 축적을 조절하는 것이 중요하다. 간세포가 손상되는 경우의 염증반응은 휴지기의 간성상세포를 활성화시켜 세포외 기질과 다양한 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)을 분비하며 그 중 TGF-β1은 강력한 성장억제제의 역할을 한다. TGF-β1은 25 kD의 물질로서 잠재하는 TGF-β1 결합 단백질 (latent TGF-β1 binding protein)과 결합하여 비활성의 잠재성(inactive latent) 형태로 분비되고 1,4형 교원질, 라미닌 및 디코린(decorin) 등의 세포외기질과 결합한 상태로 존재하여 여러 가지 자극에 의해 활성화된다. TGF-β1은 콜라게나아제(collagenase) 생산을 감소하거나 콜라게나아제 억제물질 생산을 증가하여 콜라겐 발현을 조절하며 대식세포에서 TNF-α, IL-1 및 PDGF 등의 생산을 증가시키며 섬유화 과정에 중요한 역할을 한다. 현재 TGF-β1은 섬유화가 진행된 곳에서만 발현되고 정상 간조직이나 비활동적인 곳에서는 발현되지 않아 간섬유화에서 TGF-β1이 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 비알콜성 지방간은 음주와 관계없이 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등의 원인에 의해 발병될 수 있으며, 진행 경과에 따라 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간(steatosis)과 간세포의 염증반응(hepatocellular inflammation)을 나타내는 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 진행 섬유화증(advanced fibrosis) 및 간경변(liver cirrhosis)까지 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다. 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 현대 사회의 고지방 및 고열량 식이 섭취에 따른 성인병의 증가로 선진국 기준 성인 인구의 20-30%가 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)을 나타내며 그 중 2-3%가 비알코올성 지방간염(NASH) 환자로 이행된다고 보고되고 있을 뿐 아니라, 특히, 조직학적으로 섬유화와 염증을 동반한 지방간염 소견을 보여 간경변, 간부전 및 간암으로 발전할 위험이 매우 높아지게 된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폐섬유증"은, 폐에서의 과도한 섬유성 연결 조직의 형성 또는 발달(섬유증)로 인해, 흉터가 생긴(섬유성) 조직의 발달을 의미한다. 구체적으로, 폐 섬유증은 폐포 및 폐의 간질성 조직의 팽윤 및 흉터를 유발하는 만성 질환이다. 이와 같은 흉터 조직이 건강한 조직을 대체하여 염증을 유발하며, 만성 염증은 섬유증의 전조로 파악될 수 있다. 이와 같은 폐 조직의 손상으로 인하여 폐가 뻣뻣하게 될 수 있고, 개체가 자가호흡이 어려워지게 될 수 있다.
구체적으로, 상기 폐섬유증은 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury), 비특이성 간질성 폐렴(Nonspecific Interstitial Pneumonia), 급성간질성 폐렴(Acute Interstitial Pneumonia), 특발성 기질화 폐렴(Cryptogenic Organizing Pneumonia), 호흡계기관지염 관련성 간질성 폐질환(Respiratory Bronchiolitisassociated Interstitial Lung), 박리성 간질성 폐렴(Desquamative Interstitial Pneumonia), 임파구성 간질성 폐렴(Lymphoid Interstitial Pneumonia), 간질성 폐섬유증 및 미만성 폐섬유증, 폐부종, 낭포성 섬유증 및 대사성 질환으로 인한 폐섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부 섬유증"은 피부의 과도한 상흔이며, 병리학적 상처 치유 반응의 결과이다. 광범위한 섬유성 피부 질환이 있다: 강피증, 신성섬유화성 피부증, 혼합성 결합조직 질환, 경화성 점액수종, 경화성 수종, 및 호산구성 근막염. 화학 물질이나 물리적 작용제(기계적 외상, 화상 상처)에 대한 노출은 또한 섬유성 피부 질환의 잠재적인 원인이다. 피부 섬유증은 면역, 자가 면역 및 염증 기전에 의해 주도될 수 있다. 섬유 아세포의 콜라겐 생성 및 분해의 균형은 피부 섬유증의 병태 생리 과정에서 중요한 역할을 한다. 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 및 인터루킨-4(IL-4)와 같은 특정의 시토카인은 상처 치유 및 섬유화를 촉진한다. 정상 피부의 섬유아세포는 정지되어 있다. 이들은 결합조직 단백질의 양을 제어하고 낮은 증식활성을 갖는다. 피부 손상 후, 이러한 세포들은 활성화되고, 즉 이들은 α-평활근 액틴(α-SMA)을 발현하고 다량의 결합조직 단백질을 합성한다. 활성화된 세포들은 흔히 근육섬유 아세포라고 불리운다. 이때, "피부 섬유증"은 또한 "피부경화증 (scleroderma)"을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "심장 섬유증(cardiac fibrosis)"은 심장 세포 사이에 기질 단백질이 과도하게 침착되어 심장이 딱딱하게 굳는 현상으로 심근경색 환자의 심장에서 주로 나타나며 심장의 기능이 감소하는 주원인 현상을 말하며, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 심부전, 심근경색 및 대사성 질환으로 인한 심장 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 또한, 심장의 섬유화는 심부전 및 심근경색의 주요 원인이므로, 용어 "심장 섬유증"은 심장 섬유화로 유발되는 심부전 및/또는 심근경색을 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제형화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제형은 사용 방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 침제, 정제, 주사제, 캅셀제 및 환제 등으로 제조할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물의 제형은 국소 또는 경피 투여용 제형인 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라서 방부제, 완충제등과 무균 혼합될 수 있다. 본 발명에 따른 연고, 페이스트, 크림 및 젤 제형은 추가적으로 부형제인 동물성 및 식물성 지방, 기름, 왁스, 파라핀, 전분, 토라가칸토, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트등과 규산, 활석, 산화 아연, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 페오포르바이드 a를 유효량으로 포함할 때 바람직한 섬유증의 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 본원에서, 용어 "유효량"은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 섬유증을 예방, 개선 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물에 페오포르바이드계 화합물, 일 실시예로 페오포브바이드 a가 0.01 내지 99.9% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 화합물은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 예를 들어, 페오포르바이드 a를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.001 ug 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 ug 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 페오포르바이드 a의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 페오포르바이드 a를 섬유증의 예방, 치료 또는 개선을 위한 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물
본 발명의 다른 측면은, 페오포르바이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 페오포르바이드계 화합물은 페오포르바이드 a인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "식품"은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서의 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품, 음료 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 용어이다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 황칠 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다.
섬유증 예방 및 치료 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 페오포르바이드계 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 섬유증을 가지고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 이때, 페오포르바이드계 화합물은 상술한 바와 같으며, 바람직하게 상기 페오포르바이드계 화합물은 페오포르바이드 a일 수 있다. 또한, 상기 화합물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 섬유증의 종류는 상술한 바와 같다.
페오포르바이드계 화합물의 섬유증 치료 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 페오포르바이드계 화합물의 섬유증 치료 용도를 제공한다.
이때, 페오포르바이드계 화합물은 상술한 바와 같으며, 바람직하게 상기 페오포르바이계 화합물은 페오포르바이드 a일 수 있다. 또한, 섬유증의 종류는 상술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 황칠 추출물의 제조
황칠(Dendropanax Morbiferus)의 잎, 줄기, 뿌리 등을 세척하고 그라인더를 이용하여 분쇄한 다음 약 8 g의 분쇄물에 20 w/v% 농도가 되도록 에탄올 또는 메탄올을 첨가하였다. 이를 4시간 이상 동안 침지 교반한 후에 여과하여 1차 액상 성분을 분리하였다. 분리된 고형분을 다시 에탄올 또는 메탄올에 4시간 이상 동안 침지 교반한 후에 여과하여 2차 액상 성분을 수득하였다. 상기 수득한 1차 액상 성분과 2차 액상 성분을 혼합하고, 상기 혼합물을 감압 하에서 농축시킨 다음, 잔사를 동결 건조하여 황칠 추출물을 수득하였다.
제조예 2. 황칠 추출물로부터 페오포르바이드 a의 분리
제조예 1에서 수득한 황칠 추출물을 석유 에테르, 헥산, 클로로포름, 다이클로로메테인, 에틸아세테이트 순서로 분획하여 분획물을 수득하였다. 활성이 높은 클로로포름 분획물을 실리카겔 컬럼상에서 석유에테르, 에틸에테르, 메탄올 및 물의 용출조건을 이용하여 총 6개의 소분획물(F-1 내지 F-6)을 수득하였다. 이 중에서, F-2 분획물을 실리카겔 컬럼상에서 석유에테르, 에틸에테르 및 메탄올의 용출조건을 활용하여 총 10개의 소분획물(F-1a 내지 F-10a)을 수득하였다.
이 중에서, F-4a 소분획물을 실리카겔 컬럼상에서 다이클로로메테인:메탄올=95:05(v/v)의 용출조건을 이용하여 총 3개의 소분획물(F-1b 내지 F-3b)을 수득하였다. 이 중에서, F-3b 소분획물에서 하기의 표 1에 기재된 바와 같은, NMR 분석을 통하여 페오포르바이드 a 성분을 확인하였다(도 1).
Position 1H Chemical shift
A 9.42
β 9.56
δ 8.60
2a 8.00
2b 6.25
10 6.27
8 4.50
7 4.05
10b 3.88
4a 3.70
5a 3.65
1a 3.33
3a 3.20
7a,7b 2.30-2.50
8a 1.80
4b 1.65
실험예 1. 페오포르바이드 a의 세포 독성 실험
제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a의 세포에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여, 인간 페유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포와 LL-29 세포를 사용하였다. CCD8-Lu 세포와 LL-29 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 2x103개의 세포를 접종하고, 37℃의 습윤한 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하면서 안정화하였다. 배양된 세포에 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a의 농도를 달리하여 처리하고 72시간 후에 WST-1 시약을 처리하였다. 1시간 후에, microplate reader(EZ Read 400, biochrom, UK)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 세포의 생존율을 측정하여 독성 여부를 평가하였다.
실험 결과인 세포 생존율은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도를 비율로 표시하여 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 페오포르바이드 a는 2.5 μM의 농도까지는 세포 독성이 거의 없었으며, 5μM의 농도에서 약 25%, 그리고 10μM의 농도에서 약 75%의 세포 독성이 있는 것을 확인하였다.
실험예 2. 페오포르바이드 a의 TGF-β 신호 전달 경로 억제 효과 확인
Smad 유전자가 결합할 수 있는 염기서열(5'-GGTGTCTAGACATAGTCTAGACA-3' 서열번호 1)이 8번 반복된 유전자를 리포터 유전자인 루시퍼라아제를 인코딩하는 유전자에 결합시킨 벡터를 제조하였다. 이를 RSV 프로모터 유전자와 베타-갈락토시다아제를 인코딩하는 유전자를 결합시킨 벡터와 함께 Balb/c3T3 세포에 트랜스펙션하였다. 그리고 나서 6시간 후, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 TGF-β를 5 ng/㎖의 농도로 처리하며, 실험군에는 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a를 0.06 μM, 0.12 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM 농도 별로 각각 5 ng/㎖의 TGF-β와 함께 처리하였다.
그리고 나서, 상기 세포를 20시간 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양을 한 후, 루시퍼라아제 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Balb/c3T3 세포에서 TGF-β에 의해 Smad 단백질의 활성이 증가하지만, TGF-β에 의해 증가된 Smad 단백질의 활성은 페오포르바이드 a에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a에 의해 TGF-β 신호 전달을 통하여 활성화되는 Smad의 인산화가 억제되는 것을 알 수 있었다.
실험예 3. 페오포르바이드 a 화합물의 항섬유화 활성 분석
실험예 3.1. 웨스턴 분석법을 이용한 항섬유화 활성 분석
페오포르바이드 a의 항섬유화 활성을 분석하기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2x105개의 세포를 6 웰 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍 조건을 진행하였다.
24시간 후에, 5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에, 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a를 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 2). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 처리하고, 6시간 후에 페오포르바이드 a를 0.06 μM, 0.12 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 2.5 μM, 5 μM의 농도 별로 각각 처리하였다.
18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(Deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용해 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000 xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 bicinchoninic acid assay(BCA 분석) 단백질 정량 키트를 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동 한 후, 웨스톤 블롯팅을 수행하였다. 1차 항체로는 항-콜라겐 1A 또는 항-피브로넥틴, 항-알파 평활근 액틴 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 항-mouse IgG HRP 또는 항-rabbit IgG HRP를 사용하였다. 보정을 위하여 항-β-액틴 항체를 이용하여 단백질 발현의 차이를 보정하였다.
실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A, 피브로넥틴 및 평활근액틴의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 콜라겐 1A, 피브로넥틴 및 평활근액틴 단백질은 페오포르바이드 a를 처리하였을 때 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a에 의해 섬유화 특징 단백질의 발현을 억제함으로써 섬유화 진행이 억제될 수 있는 가능성을 확인하였다.
실험예 3.2. 세포면역화학염색 분석법을 이용한 항섬유화 활성 분석
제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a의 항섬유화 활성을 분석하기 위하여 면역세포화학 염색 방법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2x104개의 세포를 24 웰 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍 조건을 진행하였다.
24시간 후에, 5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에, 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a를 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 2). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 처리하고, 6시간 후에 페오포르바이드 a를 0.15 μM, 0.3 μM, 0.6 μM, 1.2 μM, 2.5 μM, 5 μM의 농도 별로 처리하였다.
각 샘플들에 대한 면역조직 분석은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 PBS 완충용액으로 2회 세척을 한 후에 4% 포름알데하이드를 첨가하여 1시간 동안 고정시키고, 1차 항체로 항-콜라겐 1A를, 2차 항체로는 Alexa Fluor 488을 사용하였다. 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 염색을 하고, 형광 현미경을 사용하여 형광의 세기 차이에 의한 분석을 수행하였다.
실험 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 CCD8-Lu 세포에서는 콜라겐 1A의 발현이 낮았으며, 5 ng/㎖의 TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A의 발현이 상당히 증가함을 형광의 세기에 의해 확인하였다. 또한, 5 ng/㎖의 TGF-β를 처리하고 6시간 후에 페오포르바이드 a를 처리하였을 때는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 발현의 증가가 대부분 억제되고, 특히 페오포르바이드 a가 2.5 μM 이상의 농도인 경우에 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 발현의 증가의 억제 효과가 가장 뛰어난 것을 확인하였다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a에 의해 섬유화의 진행이 억제되는 것을 알 수 있었다.
실험예 4. 페오포르바이드 a와 폐섬유증 치료제의 항섬유화 활성 비교
실험예 4.1. 정량적 실시간 중합연쇄반응을 이용한 항섬유화 활성 비교
제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a와 기존에 폐섬유증의 치료제로 승인을 받은 닌테다닙과 피르페니돈과의 항섬유화 활성을 비교 분석하기 위하여, 정량적 실시간 중합연쇄반응법을 이용한 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2x105개의 세포를 6웰 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍 조건을 진행하였다.
24시간 후에, 5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에, 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a 또는 폐섬유증 치료제를 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 처리하고, 6시간 후에 페오포르바이드 a를 각각 2.5 μM 또는 5 μM 농도 별로, 1 μM 농도의 닌테다닙, 및 1 mM 농도의 피르페니돈 화합물을 처리하였다.
18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)액을 직접 첨가한 후, 10분 동안 상온에서 방치하였다. 그리고 나서, 0.1 ㎖의 클로로포름을 첨가하여 15초 동안 교반한 다음, 약 12,000 xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하고, 동일 부피만큼의 아이소프로필알콜을 첨가한 후에 12,000 xg로 10분 동안 원심분리하였다. 그리고 나서, 액체를 제거하고 75% 에탄올로 1회 세척을 한 후에 상온에서 건조하였다. 건조 후, RNAase-free 정제 증류수를 약 50 ㎕를 첨가하고, 분광 광도계를 이용하여 수득된 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다.
수득된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해, 정제된 총 RNA 2 ㎍에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분 동안 진행한 후, 10X 역전사반응 완충 용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 첨가하여, cDNA 합성 반응을 42℃에서 60분 동안 수행하였다.
cDNA 합성 반응이 끝난 후에 72℃에서 5분 동안 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일 가닥의 RNA를 제거하여 최종 cDNA를 수득하였다. 근섬유아세포의 특징 유전자인 알파 평활 근액틴 유전자와 섬유화 특징 유전자인 CCN2(또는 CTGF) 유전자, 섬유화 특징 유전자인 피브로넥틴 및 활성 산소 양의 주요 조절자로 알려진 NOX4(NADPH oxidase 4) 유전자의 발현 변화 여부를 정량적 실시간 중합연쇄반응을 통해 관찰하였다. GAPDH 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다. 정량적 실시간 중합연쇄반응에 사용된 유전자들의 염기 서열은 하기의 표 2에 기재된 바와 같다.
프라이머 서열 서열번호
alpha-SMA-S 5'-GCCCAGCCAAGCACTGTCAGGA-3' 서열번호 2
alpha-SMA-AS 5'-TCCCACCATCACCCCCTGATGTC-3' 서열번호 3
CTGF-S 5'-GGCTTACCGACTGGAAGAC-3' 서열번호 4
CTGF-AS 5'-AGGAGGCGTTGTCATTGG-3' 서열번호 5
Fibronectin-S 5'-GTGGCTGAAGACACAAGGAA-3' 서열번호 6
Fibronectin-AS 5'-CCTGCCATTGTAGGTGAAT-3' 서열번호 7
NOX4-S 5'-CACCTCTGCCTGTTCATCTG-3' 서열번호 8
NOX4-AS 5'-GGCTCTGCTTAGACACAATCC-3' 서열번호 9
GAPDH-S 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3' 서열번호 10
GAPDH-AS 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3' 서열번호 11
실험 결과, 도 7 내지 도 10에 나타난 바와 같이, 인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β를 처리하였을 때 α-SMA, CTGF 및 NOX4 유전자의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 유도되는 α-SMA, CTGF, 피브로넥틴 및 NOX4 유전자의 발현은 2.5 μM과 5 μM 농도의 페오포르바이드 a를 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 확인하였다. 반면에, 1 μM의 닌테다닙과 1 mM의 피르페니돈 화합물의 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 α-SMA, CTGF 및 NOX4 유전자의 발현을 약하게 억제하거나 거의 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a는 기존의 폐섬유증 치료제로 알려져 있는 닌테다닙과 피르페니돈 화합물과 비교하여, 동일한 조건에서 현저하게 우수한 항섬유화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4.2. 섬유화 관련 단백질 발현을 통한 항섬유화 활성 비교
페오포르바이드 a와 기존에 폐섬유증의 치료제로 승인을 받은 닌테다닙과 피르페니돈과의 항섬유화 활성을 비교 분석하기 위하여, 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2x105개의 세포를 6웰 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍 조건을 진행하였다.
24시간 후에, 5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 그리고 나서, 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a 또는 폐섬유증 치료제를 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 처리하고, 6시간 후에 페오포르바이드 a를 각각 2.5 μM 또는 5 μM 농도 별로, 1 μM 농도의 닌테다닙, 또는 1 mM 농도의 피르페니돈 화합물을 각각 처리하였다.
18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(Deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용해 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000 xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 bicinchoninic acid assay(BCA 분석) 단백질 정량 키트를 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동(SDS-PAGE) 한 후, 웨스톤 블롯팅(Western Bloting)을 수행하였다. 1차 항체로는 항-α-SMA, 항-콜라겐 1A 및 항-피프로넥틴을 사용하였고, 2차 항체로는 항-mouse IgG HRP 또는 항-rabbit IgG HRP를 사용하였다. 보정을 위하여 항-β 액틴 항체를 이용하여 단백질 발현의 차이를 보정하였다.
실험 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu에 TGF-β를 처리하였을 때 α-SMA, 콜라겐 1A 및 피브로넥틴의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 α-SMA, 콜라겐 1A 및 피브로넥틴은 2.5 μM과 5 μM 농도의 페오포르바이드 a를 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 확인하였다. 반면에, 1 μM의 닌테다닙과 1 mM의 피르페니돈 화합물의 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 α-SMA, 콜라겐 1A 및 피브로넥틴 단백질의 발현을 약하게 억제하거나 거의 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a는 기존의 폐섬유증 치료제로 알려져 있는 닌테다닙과 피르페니돈 화합물과 비교하여, 동일한 조건에서 현저하게 우수한 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 4.3. 세포면역화학염색 분석법을 이용한 항섬유화 활성 분석
페오포르바이드 a와 기존에 폐섬유증의 치료제로 승인을 받은 닌테다닙과 피르페니돈과의 항섬유화 활성을 비교 분석하기 위하여, 면역세포화학 염색 방법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2x104개의 세포를 24 웰 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 반응시켰다.
24시간 후에, 5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 페오포르바이드 a를 각각 2.5 μM 또는 5 μM 농도 별로, 1 μM 농도의 닌테다닙, 또는 1 mM 농도의 피르페니돈 화합물을 각각 처리하였다.
각 샘플들에 대한 면역조직 분석은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 PBS 완충용액으로 2회 세척을 한 후에 4% 포름알데하이드를 첨가하여 1시간 동안 고정시키고, 1차 항체로 항-콜라겐 1A를, 2차 항체로는 Alexa Fluor 488을 사용하였다. 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 염색을 하고, 형광 현미경을 사용하여 형광의 세기 차이에 의한 분석을 수행하였다.
실험 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 CCD8-Lu 세포에서는 콜라겐 1A의 발현이 낮았으며, 5 ng/㎖의 TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A의 발현이 상당히 증가함을 형광의 세기에 의해 확인하였다. 또한, 5 ng/㎖의 TGF-β를 처리하고 6시간 후에 페오포르바이드 a를 처리하였을 때는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 발현의 증가는 2.5 μM과 5 μM 농도의 페오포르바이드 a를 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 확인하였다. 반면에 1 μM의 닌테다닙 화합물을 처리했을 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 단백질의 발현을 약하게 억제하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a는 기존의 폐섬유증 치료제로 알려져 있는 닌테다닙과 비교하여, 동일한 조건에서 현저하게 우수한 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 5. 섬유화와 관련된 인산화된 단백질의 발현 조절 확인
페오포르바이드 a가 TGF-β 신호 전달 경로 중 인산화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2x105개의 세포를 6웰 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍 조건을 진행하였다.
24시간 후에, 5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 그리고 나서, 제조예 2에서 수득한 페오포르바이드 a 또는 폐섬유증 치료제를 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 처리하고, 6시간 후에 5 μM 농도의 페오포르바이드 a와, 1 μM 농도의 닌테다닙 화합물을 각각 처리하였다.
1시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(Deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용해 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000 xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 bicinchoninic acid assay(BCA 분석) 단백질 정량 키트를 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동(SDS-PAGE) 한 후, 웨스톤 블롯팅(Western Bloting)을 수행하였다. 1차 항체로는 항-pSmad3 항체, 항-Smad3 항체, 항-pERK 항체 및 항-ERK 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 항-mouse IgG HRP 항체 또는 항-rabbit IgG HRP 항체를 사용하였다.
실험 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 에 TGF-β를 처리하였을 때 인산화된 Smad3와 인산화된 ERK 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 인산화된 Smad3와 인산화된 ERK는 5 μM 농도의 페오포르바이드 a를 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 확인하였다. 반면에, 1 μM의 닌테다닙 화합물의 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 인산화된 Smad3와 인산화된 ERK 단백질의 발현을 거의 억제하지 못함을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 페오포르바이드 a는 TGF-β에 의해 유도되는 인산화된 Smad3와 인산화된 ERK 단백질의 발현을 억제함으로써 항섬유화 효능을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 폐 섬유증 모델 마우스에서 페오포르바이드 a의 항섬유화 효과 확인
본 실험은 C57BL/6NCrlOri 마우스(㈜오리엔트 바이오)에 블레오마이신(bleomycin, BLM)(NIPPON KAYAKU, KIT code No. NA)을 처리하여 폐 섬유증을 유도한 폐 섬유증 모델을 이용하여, 페오포르바이드 a의 항섬유화 효과를 평가한 것이다. 실험군은 아래 표 3과 같이 구성하였다.
그룹 성별 동물수 ITI
볼륨
(μl)		 BLM
용량 (mg/kg)		 PO
볼륨
(ml/kg)		 효능물질
용량
(mg/kg)		 닌테다닙
용량 (mg/kg)
베히클 컨트롤
(Vehicle control)		 숫컷 5 50 - 10 - -
음성 대조군
(Fibrosis control)		 숫컷 5 50 1.8 10 - -
T1 숫컷 5 50 1.8 10 1.25 mpk -
T2 숫컷 5 50 1.8 10 5 mpk -
T3 숫컷 5 50 1.8 10 20 mpk -
T4 숫컷 5 50 1.8 10 80 mpk -
양성 대조군(닌테다닙) 숫컷 5 50 1.8 10 60 mpk 60
마우스는 체중을 측정하여 총 7군으로 분리한 후, 베히클 컨트롤(Vehicle control)군은 멸균 생리식염수를, 베히클 컨트롤군을 제외한 나머지군은 BLM을 Day 1에 기도내 투여하여 폐 섬유화를 유도하였다. 그리고 1일부터 21일까지 베히클 컨트롤군과 음성 대조군(Fibrosis control)은 효능물질을 제외한 DMSO(sigma D2650-5X)만을 투여하였다.
또한, T1군 내지 T4군에는 효능물질(페오포르바이드 a)을, 양성 대조군은 닌테다닙을 각각 1일 1회 반복 경구 투여하였다. 단, 1일에는 BLM을 기도내 투여하기 1시간 전에, 효능물질 또는 부형제를 경구 투여하였다.
투여 후, 매일 1일 1회 사망 및 빈사 상태를 관찰하고, 1일 2회 외관 및 행동 변화 등의 일반증상을 관찰하였다. 동물이 비정상이라고 판단될 경우 관찰 범위 및 횟수를 증가시켰으며, 심각한 고통이나 사망에 가까운 독성이 발현되는 경우, 안락사시켰다. 체중은 투여 기간동안 총 7회(1, 2, 4, 8, 11, 15, 18일) 측정하였고, 부검 당일에 1회 측정하였다.
부검은 22일에 이소푸란(isoflurane) 흡입을 이용하여 안락사 시킨 후 실시하였다. 먼저 후대정맥과 복대정맥을 절단하여 방혈치사 시킨 후, 융강과 복강의 외관상 비정상 유무를 관찰한 후, 폐를 적출하였다. 적출된 폐는 중량을 측정하고, 병리조직학적 검사를 위해 일부(좌측폐)를 10% 중성 완충포르말린액으로 고정하였다. 고정된 폐는 조직표본을 만들어 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 후 병리조직학적 검사를 실시하였다. 적출된 폐의 장기중량비는 다음의 계산식에 대입하여 산출하였다.
<수학식 1>
장기중량비 = 전체 폐 중량(g)/전체 체중(g)
실험결과는 평균값과 표준편차로 나타내었고, 실험결과 분석은 Pristima System 또는 Statistical Analysis System(SAS/STAT)을 이용하여 통계적으로 분석하였다.
Pristima System을 이용하여 통계분석을 할 경우, 군간 비교는 다중비교분석을 실시하였다. 실험 데이터는 Bartlett's Test를 이용하여 등분산 검정을 실시한 후, 등분산된 데이터는 일원배치분산분석(ANOVA)으로 검정하고, 군간 차이는 Dunnett's Test로 분석하였다. 등분산되지 않은 데이터는 Kruskal-Wallis Test로 분석하였고, 투여군과 대조군 간의 차이는 Dunn's Rank Sum Test로 분석하였다. 또 다른 방법으로, 두 군간의 등분산 검정을 위해 F-test를 실시하였다.
SAS/STAT를 이용하여 통계분석을 할 경우, 두 군간 등분산 검정은 F-test를 이용하여 실시하였다. 등분산된 데이터는 Student's t-test를 실시하여 군간의 차이를 검증하였고, 등분산되지 않은 데이터는 Wilcoxon Rank Sum Test를 실시하였다. 실험결과의 통계학적인 분석 방법을 표 4로 정리하였다.
Parameters Tested Methods of Statistical Analysis
Preliminary Test Not significant Significant
Body Weight Bartlett’s Test
F-test		 ANOVA Test,
Dunnett’s Test
Student’s t-test		 Kruskal-Wallis Test,
Dunn’s Rank Sum Test
Wilcoxon Rank Sum Test
Body Weight Gain
Organ weight
그 결과, 폐 섬유증 모델에서 음성 대조군에 비해 페오포르바이드 a를 투여한 군에서 항섬유화 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 닌테다닙을 투여한 양성 대조군에 비해서도 페오포르바이드 a를 투여한 군에서 유의적인 항섬유 효과가 있음을 확인하였다.
<110> Paean Biotechnology Inc. <120> FOOD COMPOSITION FOR PREVENTING OR ALLEVIATING FIBROSIS COMPRISING PHEOPHORBIDE COMPOUNDS AS AN EFFECTIVE INGREDIENT <130> SPD21-045PBT <150> KR 2019-164277 <151> 2019-12-11 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotides binding Smad gene <400> 1 ggtgtctaga catagtctag aca 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SMA-S <400> 2 gcccagccaa gcactgtcag ga 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SMA-AS <400> 3 tcccaccatc accccctgat gtc 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF-S <400> 4 ggcttaccga ctggaagac 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF-AS <400> 5 aggaggcgtt gtcattgg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-S <400> 6 gtggctgaag acacaaggaa 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-AS <400> 7 cctgccattg taggtgaat 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOX4-S <400> 8 cacctctgcc tgttcatctg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOX4-AS <400> 9 ggctctgctt agacacaatc c 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-S <400> 10 gtctcctctg acttcaacag cg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-AS <400> 11 accaccctgt tgctgtagcc aa 22

Claims (5)

  1. 하기 [화학식 2]로 표시되는 페오포르바이드 a를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    [화학식 2]
    Figure 112021113143336-pat00016
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 페오포르바이드 a는 TGF-β에 의해 유도되는 Smad 및 ERK의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐 섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 페오포르바이드 a는 TGF-β에 의해 유도되는 알파-평활근 액틴, 피브로넥틴 또는 콜라겐의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐 섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 삭제
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