KR20120072895A

KR20120072895A - 섬유증의 예방 또는 치료를 위한 Ｉｄ1의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20120072895A
Application number: KR1020100134822A
Authority: KR
Inventors: 이증훈; 김창덕; 손경철; 제영진
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2012-07-04

Abstract

본 발명은 섬유증의 예방 또는 치료를 위한 Id1의 신규한 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 콜라겐의 발현을 억제하여 섬유증을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내는 약학적 조성물, 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제하는 방법 및 섬유증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Id1 단백질은 지나친 콜라겐 합성에 따른 증상을 완화시키거나 TGF-β1/Smad 2,3에 의해 유도되는 콜라겐의 발현을 감소시키는 효과가 우수하므로 콜라겐의 과발현으로 인해 유발되는 섬유증을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

섬유증의 예방 또는 치료를 위한 Ｉｄ1의 신규한 용도{NOVEL USE OF Id1 FOR PREVENTING OR TREATING FIBROSIS}

본 발명은 콜라겐의 발현을 억제하여 섬유증을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내는 약학적 조성물, 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제하는 방법 및 섬유증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

섬유증(fibrosis)은 섬유아세포에 의한 세포외 기질의 비정상적 생성, 축적 및 침착이 일어나는 질환으로, 다양한 조직의 구조 및 기능을 변화시키는 손상(injury) 또는 염증에 따른 콜라겐 매트릭스의 비정상적인 축적을 말한다. 섬유증의 발병 위치에 무관하게, 섬유증의 대부분의 병인학은 정상 조직을 대체하는 콜라겐 매트릭스의 과도한 축적을 포함한다. 특히 신장, 간, 폐, 심장, 뼈 또는 골수, 그리고 피부에서 유발된 섬유증은 장기의 기능부전을 유도하고 최악의 경우 사망에 이르게도 한다. 상기 섬유아세포는 정상적 상태에서는 세포외 기질의 전구체를 생성하여 섬유 조직을 형성하는 기능을 한다. 결합 조직의 세포사이 물질인 세포외 기질은 피브로 넥틴, 라미닌, 콘드로넥틴, 콜라겐과 같은 단백질 형태로 존재한다.

한편, 섬유증의 발전은 조직에서의 TGF-β(Transforming growth factor-β)의 과도한 발현 및 과도한 생성과 연관되어 있으며, 피부에서의 섬유증은 조직의 생장과 기능, 움직임에 심각한 문제를 일으키는 비후성 반흔(hypertrophic scar)이나 켈로이드의 형성을 유발하기도 한다. 실제로, 비후성 반흔이 나타난 섬유아세포나 켈로이드 섬유아세포 등에선 TGF-β와 그 수용체의 발현이 유난히 증가되어 있다.

TGF-β(Transforming growth factor-β)는 세포의 생장과 분화, 사멸, 이동, 부착, 혈관형성 및 상처치료 등 많은 생물학적 반응을 조절하는 다양한 기능을 가진 사이토카인이다. 피부의 섬유아세포에서 TGF-β는 세포의 생장과 이동을 자극하며, 또한 피부에서 가장 풍부한 제1형 콜라겐을 비롯하여 많은 세포외기질 성분들의 발현과 침착을 유도한다. 더 나아가 TGF-β 신호전달이 증가될 경우, 세포외기질의 과도한 축적으로부터 비롯된 복잡한 조직질환인 섬유증이 발병할 수 있다.

피부의 섬유아세포에서 TGF-β는 주로 Smad 단백질들의 활성화를 매개로 하여 제1형 콜라겐의 발현을 유도한다. TGF-β는 하나의 I형 수용체와 하나의 II형 수용체로 구성된 수용체복합체에 결합하며, 결합 후 R-Smad (receptor-activated Smad)인 Smad2와 3가 TGF-β I형 수용체 kinase에 의해 직접적으로 인산화 되고 그 후 활성화된 R-Smad는 Co-Smad (common mediator)인 Smad4 와 이형복합체를 형성하어 핵 안으로 이동한다. 이어서 이 복합체는 COL1A2 유전자 프로모터 상의 CAGACA에 결합하여 그 발현을 자극한다. I-Smad(inhibitory Smad)인 Smad7은 이 신호전달과정에서 E3 리가아제나 여러 세포내 조절단백질들과 음성되먹임 고리를 이룸으로써 콜라겐 발현에 부정적으로 작용한다. 또한 TGF-β는 MAP kinase 신호전달경로와 같은 Smad와 독립적인 과정을 통해 신호를 전달하기도 한다.

이러한 TGF-β는 여러 질환의 병인에 관여 하는 것으로 알려져 있다. TGF-β의 감소는 죽상동맥경화증(altherosclerosis)을 유발하고, 반대로 TGF-β의 증가는 여러 종류의 섬유증(fibrosis)의 원인이다.

섬유증의 병인에서 TGF-β의 원인-결과의 관계는 잘 확립되었으나, TGFβ가 어떠한 과정을 거쳐 섬유증을 유발하는지 그 기전에 대하여는 거의 보고된 바가 없다. 또한, 섬유증은 공통적으로 산화적 스트레스와 연관이 있으나, 그 기전도 역시 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 섬유증의 발생에 대한 분자적 기전, 섬유증 치료제의 새로운 타겟 발굴 및 신규한 섬유증 치료제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, TGF-β(transforming growth factor β)와 Id1 단백질 간의 상호작용을 확인함으로써 콜라겐 합성과정에서의 Id1 단백질의 작용을 규명하였으며, Id1 단백질이 TGF-β1/Smad2, 3에 의해 유도되는 콜라겐 발현을 감소시킨다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 각종 섬유증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있도록, Id1 단백질 또는 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬유증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Id1(Inhibitor of DNA binding 1) 단백질 또는 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Id1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Id1-v2일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유증은 TGF-β1에 의해 유도되는 콜라겐의 과발현으로 인해 유발되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유증은 병리학적 상태 또는 질환에 의한 섬유증, 외상(trauma), 감염, 수술, 화상, 방사능 손상에 의해 발생되는 섬유증 및 화학요법치료제에 의한 섬유증 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유증은 비후성 반흔(hypertrophic scar), 켈로이드, 국소성 경피증, 전신 경화증, 호산구증가-근통증 증후군 및 피부의 경피성 이식편대숙주질환 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Id1 단백질은 지나친 콜라겐 합성에 의한 증상을 완화시키는 활성 또는 콜라겐 발현을 감소 또는 억제시키는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Id1 단백질은 Smad2 또는 Smad3의 발현 및 활성을 저해함으로써 콜라겐 발현을 감소시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 섬유아세포에 Id1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

나아가 본 발명은 (a) Id1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정결과, Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양이 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가하는 경우, 상기 후보물질을 섬유증의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 Id1 단백질은 지나친 콜라겐 합성에 의한 증상을 완화시키거나 TGF-β1/Smad 2,3에 의해 유도되는 콜라겐의 발현을 감소시키는 효과가 우수하므로 콜라겐의 과발현으로 인해 유발되는 섬유증을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서, foreskin에서 얻어낸 섬유아세포에 TGF-β1(5 ng/ml)을 처리하였을 때, (A) 시간에 따른 제1형 콜라겐의 발현 정도의 변화를 웨스턴 블롯(western blot)과 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이고, (B) 시간에 따른 Id1-v1 및 Id1-v2의 발현 정도의 변화를 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서, 비후성 반흔 환자의 조직과 정상피부조직을 이용하여 Id1, TGF-β1, Smad3 및 p-Smad3의 발현 정도를 면역염색법으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서, 켈로이드 환자의 조직과 정상피부조직을 이용하여 Id1, TGF-β1, Smad3 및 p-Smad3의 발현 정도를 면역염색법으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서, NHDF에 아무런 자극을 주지 않은 군(왼쪽), GFP가 붙어있는 재조합 벡터를 NHDF에 도입시킨 실험군(가운데), Id1-v2 단백질이 도입된 재조합 벡터를 NHDF에 도입시킨 실험군(오른쪽)으로 나누어 각각 TGF-β1(5 ng/ml)을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 1일부터 7일까지의 콜라겐 젤 수축 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서, (A) NHDF에 GFP가 표지된 Id1-v2 아데노바이러스를 과발현시킨 후 TGF-β1(5 ng/ml)을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 Id1-v2의 발현 정도와 위치를 확인한 결과이며, (B) NHDF에 GFP가 표지된 Id1-v2 아데노바이러스를 과발현시킨 후 TGF-β1(5 ng/ml)을 처리한 뒤 각각 세포를 모아 제1형 콜라겐-α1, 제1형 콜라겐-α2의 단백질 발현 정도와 mRNA 발현 정도를 웨스턴 블롯과 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서, NHDF에 GFP가 표지된 Id1-v2 아데노바이러스와 GFP(대조군)를 과발현시킨 후 TGF-β1(10 ng/ml)을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 TGF-β1의 신호전달경로에 작용하는 Smad2/p-Smad2와 Smad3/p-Smad3의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과이다.

본 발명자들은 섬유증의 발생에 대한 분자적 기전, 섬유증 치료제의 새로운 타깃 발굴 및 신규한 섬유증 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, TGF-β(transforming growth factor β)와 Id1 단백질 간의 상호작용을 확인함으로써 콜라겐 합성과정에서의 Id1 단백질의 작용을 규명하였으며, Id1 단백질이 TGF-β1/Smad2, 3에 의해 유도되는 콜라겐 발현을 감소시킨다는 사실을 확인하였다.

Id(Inhibitor of DNA binding) 단백질은 베이직 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix: bHLH) 단백질의 일종으로서 Id1 ~ Id4의 4개의 멤버로 구성되어있다. 이들은 모두 공통된 HLH-이합체화 도메인을 가지고 있으나 DNA 결합 도메인은 결핍되어 있다. 때문에 Id 단백질들은 주로 다른 많은 bHLH 단백질들과 이형복합체를 형성하여 이들의 DNA 결합능력과 전사능력을 떨어뜨림으로써 세포분화과정에 음성 조절자로서 작용하게 된다. 또한 이들은 세포주기의 다양한 단계에 작용함으로써 세포증식이 일어나도록 하는 데에 중요한 역할을 수행한다. 한편, Id 단백질은 caveolin-1이나 estrogen receptor β1 등 bHLH 단백질이 아닌 다른 단백질들과 결합을 이루어 작용하기도 한다.

이러한 Id 단백질들이 다양한 조직에서의 TGF-β/Smad 신호전달과정에 강하게 연관되어있다는 여러 증거들이 있다. 상피세포 등에서, TGF-β에 의한 초기반응단계 동안에 Id1 유전자의 발현이 일시적으로 유도될 수 있지만, TGF-β의 자극이 지속되면 Id1은 Smad3와 스트레스반응 단백질인 ATF3에 의해 그 발현이 억제된다. TGF-β에 의한 Id 발현의 억제는 상피-중간엽 세포이행 (EMT)을 유도할 수 있다. 또한 TGF-β가 저해됨으로써 Id1의 발현이 유도되면 인간배아줄기세포에서 유래된 상피세포는 확장, 유지된다. 이와 반대로 Id 단백질들은 TGF-β1의 다양한 활성을 억제하기도 한다. 전립선 상피세포에서의 Id1과 흑색종 세포에서의 Id2는 모두 TGF-β1에 의해 유도되는 성장억제작용을 조절하며, 마찬가지로 Id1과 Id2는 소장상피세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포자살을 억제시킬 수 있다. 또한 폐의 근 섬유아세포에서는 BMP-7에 의해 Id2 와 Id3의 발현이 유도됐을 때 TGF-β에 의한 활성이 저해된다는 보고도 나와 있다.

특히, 많은 조직에서 Id 단백질들이 TGF-β에 의한 생물학적 반응에 영향을 줄 수 있다는 가능성을 제시한 여러 보고들이 있었지만, 피부에서의 콜라겐 발현에 대한 Id 단백질의 활성이나 영향에 대해서는 지금까지 알려진 바가 없다.

이에 본 발명에서는 in vivo와 in vitro 상에서 TGF-β와 Id1 간의 상호작용을 확인함으로써 콜라겐 합성과정에서의 Id1 단백질의 작용을 최초로 규명하였으며, 인간피부섬유아세포(NHDF)에서 Id1이 TGF-β1/Smad 2,3에 의해 유도되는 콜라겐 발현을 감소시켜 콜라겐의 과발현, 침착 및 수축에 의해 발생하는 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 인간 피부 섬유아세포를 대상으로 TGF-β를 처리하였을 때 제1형 콜라겐의 발현 정도를 웨스턴 블럿 및 RT-PCR로 확인한 결과, TGF-β의 처리시간에 의존적으로 제1형 콜라겐 단백질과 mRNA의 발현이 유도되는 것으로 나타났고(도 1A 참조), 같은 조건에서 TGF-β가 Id1, 특히 Id1-v2의 mRNA 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(도 1B 참조). 이러한 결과를 통해 TGF-β에 의한 콜라겐 발현과 Id1 단백질의 발현이 서로 연관되어 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 비후성 반흔과 켈로이드 피부조직에서 Id1의 발현양상을 알아보기 위해 면역염색을 수행한 결과, 정상조직에 비해 두 질환의 조직에서 Id1이 눈에 띠게 감소된 것으로 나타났으며(도 2 및 도 3 참조), 콜라겐에 대한 Id1의 억제효과를 확인하기 위해 in vitro 상에서 지나친 콜라겐 합성에 의한 증상 완화를 관찰한 결과, TGF-β1은 젤의 수축을 촉진시켰으나, Id1-v2는 NHDF에 의한 정상적인 콜라겐 젤 수축을 현저하게 완화시키는 것으로 나타났으며, 특히, TGF-β와 Id1-v2를 함께 발현시킨 경우에는 TGF-β에 의한 젤 수축효과가 Id1-v2에 의해 강하게 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 이러한 결과는 세포 내에서 Id1 단백질의 발현이 증가함에 따라 섬유아세포에서 유발되는 지나친 콜라겐 합성에 의한 증상을 효과적으로 완화시킨다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서 콜라겐의 발현에 대한 Id1 단백질의 효과를 알아보기 위해 GFP가 표지된 Id1-v2 단백질의 세포내 위치를 확인한 결과 TGF-β의 유무와 관계없이 콜라겐의 발현이 저해되는 시점에 NHDF의 세포질에 위치하고 있는 것으로 나타났으며(도 5A 참조), 섬유아세포에서 TGF-β1의 유무조건 하에 Id1 단백질을 과발현시킨 후, 콜라겐의 단백질과 mRNA의 레벨을 웨스턴 블롯과 RT-PCR로 확인한 결과, 콜라겐 단백질과 mRNA의 양은 TGF-β가 있는 조건, 없는 조건에서 모두 대조군에 비해 크게 감소하는 것으로 나타났다(도 5B 참조). 이러한 결과는 Id1 단백질이 핵이 아닌 세포질에 존재하면서 콜라겐에 대한 조절자로 작용하며 Id1 단백질이 콜라겐 발현과정을 특정 단계를 조절한다는 사실을 보여준다.

나아가, 본 발명의 또 다른 실시예에서 TGF-β1에 의해 진행되는 콜라겐 유전자 발현과정에서 중요한 인자인 Smad2와 Smad3의 작용에 Id1 단백질이 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위해 아데노바이러스를 이용하여 Id1-v2를 과발현시키고 그로부터 야기된 단백질 발현양상을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, TGF-β는 Smad2와 Smad3의 발현과 인산화를 모두 유도하였으나, Id1-v2는 TGF-β에 의해 진행되는 이들의 발현뿐 아니라 활성까지도 모두 저해하는 것으로 나타났다(도 6 참조). 이러한 결과는 TGF-β 매개 콜라겐 발현 과정에서 Id1-v2가 Smad2와 Smad3의 발현이나 활성화게 중요한 조절자로 작용할 수 있으며, 이것이 콜라겐 발현을 억제하는 주된 과정이 될 수 있음을 보여준다.

그러므로 본 발명에 따르면 Id1 단백질은 콜라겐을 수축시키는 활성 또는 콜라겐 발현을 감소 또는 억제시키는 활성을 갖으며, 구체적으로 Id1 단백질은 Smad2 또는 Smad3 활성을 저해함으로써 콜라겐 발현을 감소 또는 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 Id1 단백질 또는 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 Id1 단백질은 천연으로부터 분리하거나 DNA 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 천연형 또는 재조합 Id1 단백질 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 또한, Id1 단백질은 포유류 동물 또는 인간 유래의 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 Id1 단백질은 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 Id1-v2일 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 Id1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 Id1과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, “실질적으로 동질의 활성”이란 상기에서 기재한 Id1의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 Id1의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 Id1의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드의 기능적 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질　등이 이에 포함될 수 있다.

본 발명에 사용된 Id1 단백질은 공지된 서열로부터 유전공학적 방법으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에는 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 바람직하게는 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진다.

상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 또는 플라스미드 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 감염(infection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등이 포함된다. 본 발명의 일실시예에서는 아데노바이러스를 사용하였다.

본 발명의 일실시예에서 사용한 아데노바이러스는 비-레트로바이러스 벡터 중 하나로서(Rosenfeld, M.A., et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe, H.A. et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992), 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다.

또한, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는다(Miller, A.D., Nature, 1992, 357:455-460). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).

또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다.

상기 Id1을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 섬유증을 치료하기 위한 유효량으로 표적 세포 내로 직접 주사할 수 있다.

플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

본 발명에 따른 상기 Id1 단백질은 세포 내에서의 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제시키는 작용을 통해 섬유증을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 “섬유증”은 섬유아세포에 의한 세포외 기질의 비정상적 생성, 축적 또는 침착이 일어나는 질환을 말하며, 섬유아세포 축적 및 섬유 조직에 의한 정상 조직의 대체에 따른 과도한 콜라겐 축적을 특징으로 한다. 섬유증은 신체의 다양한 부위에 위치해 있을 수 있는데 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 관절 섬유증, 신경 섬유증, 근 섬유증 및 복막 섬유증 등과 같은 병리학적 상태 또는 질환에 의한 섬유증; 외상(trauma), 감염, 수술, 화상, 방사능 손상에 의해 발생되는 섬유증; 및 화학요법치료제(예컨대, 블레오마이신, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 메토트록세이트, 무스틴 또는 프로카르바진)에 의한 섬유증을 포함한다.

신장의 경우, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 이식 거부, HIV 신장병증, IgA 신장병증, 국소성 사구체경화증 및 루퍼스 신장병증에서 섬유증이 관찰되며; 간의 경우, 간경변증, 정맥-폐색 질환, C형 간염바이러스 감염, 알코올 유도성 간 섬유증 및 자가면역 간 섬유증에서 섬유증이 관찰되며; 폐의 경우, 특발성 섬유증, 간질성 폐질환, 폐염증, 자가면역 섬유증 및 블레오마이신 유도 섬유증 등에서 섬유증이 관찰되고; 피부의 경우, 전신성 경화증, 켈로이드, 상처 및 호산구증가-근통증 증후군에서 섬유증이 관찰되며; 중추 신경계의 경우, 안내 섬유증에서 섬유증이 관찰되고; 심혈관계의 경우, 혈관 재협착에서 섬유증이 관찰되고; 코의 경우, 비용종증에서 섬유증이 관찰되며; 뼈 또는 골수에서도 섬유증이 관찰되며; 내분비 기관에서도 섬유증이 관찰되며; 그리고 위장관계, 안질환에서도 섬유증이 관찰된다.

바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 섬유증은 비후성 반흔(hypertrophic scar), 켈로이드, 국소성 경피증, 전신 경화증, 호산구증가-근통증 증후군 및 피부의 경피성 이식편대숙주질환 중 어느 하나이며, 보다 바람직하게는 비후성 반흔 또는 켈로이드이다.

상기 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 “치료”란 용어는“치료하는”이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 섬유증의 “치료”또는 “치료요법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 섬유증의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 섬유증의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 섬유증을 경감시킴.

(4) 섬유증의 재발을 예방함, 및

(5) 섬유증의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 Id1 단백질을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 섬유증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 Id1 단백질의 약학적으로 유효한 양은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효량을 달리할 수 있으나, 바람직한 투여량은 0.01 ~ 100 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 투여량은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물은 섬유증의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

나아가, 본 발명에서 규명한 바와 같이 Id-1은 지나친 콜라겐 합성에 따른 증상을 완화시키는 활성 또는 콜라겐 발현을 감소 또는 억제시키는 활성을 가지기 때문에, TGF-β1에 의해 유도되는 콜라겐 과발현으로 인해 유발되는 섬유증의 예방 및 치료에 효과적인 물질을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 (a) Id1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정결과, Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양이 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가하는 경우, 상기 후보물질을 섬유증의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 Id1이 섬유증에 관여되어 있다는 발견을 기초로 한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 첫 번째 단계에 따르면, 분석하고자 하는 후보물질을 Id1에 접촉시킨다. 이용되는 Id1는 세포 내 또는 세포 외에 존재하는 것이다. 세포 외 Id1, 즉 정제된 재조합 Id1는 당업계에 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 통하여 얻을 수 있다. 또한, 세포 외 Id1로서, Id1의 고유의 활성을 가지는 Id1의 펩타이드도 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 스크리닝 되는 후보물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다.

이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch (USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.

최종적으로, Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양을 측정하는데, 만일 Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양이 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가하는 경우, 상기 후보물질을은 섬유증의 치료제로서 선택될 수 있다.

상기에서, Id1 단백질 활성의 증가는 Id1 단백질이 결합할 수 있는 능력이 증가됨을 의미한다. 그리고, Id1 단백질의 세포 내 양 증가라 함은 Id1 유전자의 발현이 증가되거나 또는 Id1 단백질의 분해가 억제되어 Id1 단백질의 농도가 증가되는 것을 말한다. 상기 Id1 유전자 발현은 Id1 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다.

Id1 단백질의 활성 및 세포 내 양을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassa y), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)이 포함된다.

또한, 본 발명의 Id1을 표적으로 한 스크리닝 방법은 예를 들어, 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있으나 이제 한정되는 것은 아니며 공지의 스크리닝 방법은 모두 사용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다.

본 발명은 섬유증 발생에 대한 분자적 기전을 명확하게 보여주며, 섬유증 치료제의 새로운 분자 타깃을 제공한다. 또한, 본 발명에서 제공되는 섬유증 예방 또는 치료용 조성물은 매우 효율적으로 섬유증의 발병을 억제 또는 섬유증을 치료 할 수 있는 특징이 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

TGF -β가 콜라겐 단백질의 생성에 미치는 영향

본 발명자들은 TGF-β가 제1형 콜라겐 단백질의 생성에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 정상 인간피부섬유아세포(NHDF)에서 TGF-β의 처리시간에 따라 제1형 콜라겐 단백질과 mRNA의 발현을 확인하였다.

먼저, foreskin에서 얻어낸 섬유아세포에 TGF-β1(5 ng/ml)를 처리한 후, 시간별(0, 1, 6, 24시간)로 샘플을 얻어 각각 웨스턴 블롯(western blot)과 RT-PCR을 사용하여 콜라겐 발현을 확인하였는데, 구체적으로, 먼저 TGF-β1을 처리한 후 시간별 섬유아세포로부터 총 RNA를 추출하였는데 이는 Easy blue RNA isolation kit (Intron, Daejeon, Korea)을 이용하여 분리하였고, 2μg의 총 RNA를 M-MLV 역전사효소(ELPIS Biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 역전사 시켰으며, PCR 조건은 하기와 같은 프라이머들을 사용하여, 95℃ 5min분간 반응, 95℃ 30sec초 반응, 58℃ 30sec초 반응 및 72℃ 1min의 반응을 20회 반복수행하였고 최종적으로 72℃ 7min동안 연장반응 시켰다.

프라이머 서열

제1형 콜라겐-α1 F-primer(서열번호 3)

5‘- AGGGGGAAAAACTGCTTTGT-3’

제1형 콜라겐-α1 R-primer(서열번호 4)

5‘- GGAGGGAATCACTGGTGCTA-3’

제1형 콜라겐-α2 F-primer(서열번호 5)

5‘- CCGTTGGACCTCCTGGTAAT-3’

제1형 콜라겐-α2 R-primer(서열번호 6)

5‘- CCCTTGTTACCGCTCTCTCC-3’

또한, 상기 웨스턴블럿은 먼저 배양된 세포를 protease inhibitor(20 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml pepstatin A, 10 μg/ml chymostatin, 2 μg/ml aprotinin, and 1mM PMSF)를 포함한 RIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA, and 0.1% NP-40)에서 용해하였다. 강하게 pipetting 한 후 13,000 rpm으로 15분간 원심분리 하였고, total protein을 Bradford protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 측정하였다. 샘플을 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 transfer한 후 상응하는 항체와 함께 4^oC에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후 상온에서 peroxidase가 접합된 이차항체에 1시간 반응시키고 chemiluminescence (Intron)로 확인하였다. 이 실험에서 일차항체로는 GFP, Collagen TypeΙ-α1, α2, actin, Id1, TGF-β(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA), Smad2, phospho-smad2, smad3, phospho-smad3(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)가 사용되었다.

또한, TGF-β1(5 ng/ml)를 처리한 후, 시간별(0, 1, 6, 24시간)로 샘플을 얻어 RT-PCR을 사용하여 Id1-v1, Id1-v2의 RNA 레벨을 확인하였는데, PCR을 위해 사용한 프러이머들은 하기 기재된 바와 같으며, PCR 조건은 상기 PCR 조건에서 20회 대신 30회 반복 사이클을 수행한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 진행하였다.

프라이머 서열

Id1-v1 F-primer : 5'-CGTAGATCTATGAAAGTCGCCAGTGG-3'(서열번호 7)

Id1-v1 R-primer : 5'-TATCTCGAGTCAGCGACACAAGATGC-3'(서열번호 8)

Id1-v2 F-primer : 5'-CGTAGATCTATGAAAGTCGCCAGTGG-3'(서열번호 9)

Id1-v2 R-primer : 5'-TATCTCGAGCTAGTGGTCGGATCTGG-3'(서열번호 10)

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, TGF-β의 처리시간에 따라 제1형 콜라겐 단백질과 mRNA의 발현이 유도되는 것으로 나타났다(도 1A 참조). 또한, 같은 조건에서 TGF-β가 Id1, 특히 Id1-v2의 mRNA 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(도 1B 참조).

상기와 같은 in vitro 실험에서 TGF-β로 인해 콜라겐 발현이 증가된 반면 Id1의 발현은 억제된다는 것을 확인하였으며, 동일한 TGF-β 자극에 따른 두 mRNA의 레벨 변화가 서로 상반되게 나타난 상기 결과를 통해 TGF-β에 의한 콜라겐 발현과 Id1 단백질의 발현이 서로 연관되어 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

비후성 반흔과 켈로이드 피부에서 Id1 의 발현 양상

본 발명자들은 TGF-β와 콜라겐이 지나치게 발현되어 있는 질환들에서 Id1 단백질의 양이 감소되어 있을 것이라 예상하고, 비후성 반흔과 켈로이드에서 Id1의 발현양상을 알아보기 위해 비후성 반흔, 켈로이드 환자의 조직과 정상피부조직을 이용해 면역염색을 통하여 각각 Id1, TGF-β, Smad3, p-Smad3의 발현 정도를 확인하였는데, 즉, 정상 또는 환자 피부의 파라핀절편을 de-waxing 및 re-hydrating 하였고, phosphate-buffered saline으로 3회 세척한 후 37^oC에서 5분간 proteinase K(DAKO ready to use kit)를 처리하였다. 이어서 DAKO LSAV 2 System peroxidase kit을 이용하였다. 0.1% Tween20이 포함된 phosphate-buffered saline으로 절편을 세척하고 상온에서 10분간 H2O2를 처리하였다. 0.1% Tween 20과 1% bovine serum albumin이 포함된 phosphate-buffered saline으로 상온에서 30분간 blocking한 후 0.1% Tween20이 포함된 phosphate-buffered saline으로 3회 세척하였고, 뒤이어 anti-Id1, TGF-β, Smad3, p-Smad3 항체 (1:100 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 그런뒤 TBS-T로 3회 세척하였고 2차 antibody 로 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응시킨뒤 3번 세척하고 DAB 1방울과 DAB buffer 1ml을 섞어서 슬라이드위에 5분간 반응시켰으며 DW로 세척하였다. 다음으로 heamatoxilin으로 30초간 반응시킨뒤 다시 DW로 세척하였다. 마지막으로 모든 조직슬라이트를 탈수 시킨뒤 mounting solution cover slide에 1방울 떨어뜨려 슬라이드로 덮고 마른뒤 현미경으로 관찰하였다.

세척과 색 검출 후 절편을 hematoxylin으로 염색하고 표본화하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 많은 경우 정상조직과 비교했을 때 비후성 반흔과 켈로이드 질환의 조직에서 Id1은 눈에 띄게 감소된 것으로 나타났으며, 일부 환자의 조직에서는 그 발현 양상이 대조군과 비슷하게 나왔으나 이는 질환의 진행단계의 차이에 기인한 현상이 것으로 사료되었다.

상기와 같은 결과를 통해 TGF-β와 Id1 단백질은 실제 생체 내 조직에서도 서로 밀접하게 연관되어 있다는 사실을 알 수 있었고, 특히 비후성반흔 및 켈로이드 환자 조직에서 Id1의 발현이 감소된다는 사실을 통해 Id1이 상기 질환의 발명기작과 관련성이 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

Id1 이 콜라겐의 발현에 미치는 영향

<3-1> 콜라겐 수축에 미치는 영향

본 발명자들은 콜라겐에 대한 Id1의 억제효과를 확인하기 위해 in vitro에서 wound-contraction 모델을 이용하여 콜라겐 수축을 관찰하였다. 즉, 정상 인간피부섬유아세포(NHDF)에서 GFP가 붙어있는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 Id1-v2 단백질을 과발현시킨 후, TGF-β1의 유무에 다른 생리적 효과를 in vitro wound-contraction 모델을 이용하여 확인하였다.

구체적으로, Id1-v2 단백질이 도입된 재조합 벡터를 NHDF에 도입시킨 실험군, GFP가 붙어있는 재조합 벡터를 NHDF에 도입시킨 실험군, NHDF에 아무런 자극을 가하지 않은 대조군을 대상으로 각각 TGF-β1(5 ng/ml)을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 1일부터 7일까지의 젤 수축(gel contraction) 정도를 확인하였으며, 각각의 날짜별 젤 수축의 사이즈를 재어 그래프로 나타내었으며, 특히 도 4에서 왼쪽과 가운데 것은 대조군으로 왼쪽 군은 GFP 발현벡터를 도입시키지 않은 군을 나타낸 것이고, 가운데 군은 바이러스 대조군으로 GFP만 발현되는 벡터를 도입시킨 군이며, 오른쪽 군은 GFP-Id1-v2 재조합 벡터를 발현를 발현시킨 실험군을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 7일이 지난 후 아무 자극을 주지 않은 격자(대조군)에서의 NHDF 세포는 콜라겐 젤을 원래크기의 50% 가까이 수축시키는 것으로 나타났다. 이 기간 동안 TGF-β1은 젤의 수축을 촉진시켰으나 Id1-v2는 NHDF에 의한 정상적인 콜라겐 젤 수축을 현저하게 완화시키는 것으로 나타났으며, 특히 TGF-β와 Id1-v2를 함께 발현시킨 실험군에서 TGF-β에 의한 젤 수축효과가 Id1-v2에 의해 강하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과는 섬유아세포에서 유발되는 콜라겐 수축이 세포내에서 발현되는 Id1-v2의 증가로 인해 완화된다는 사실을 알 수 있었다.

<3-2> 콜라겐 발현에 미치는 영향

본 발명자들은 상기 <3-1>의 결과에 기초하여, Id1-v2 단백질과 콜라겐의 발현 간의 관계를 확인하였다. NHDF에 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 GFP가 표지된 Id1-v2 아데노바이러스 벡터를 도입하여 Id1-v2를 과발현시킨 후 TGF-β1(5 ng/ml)을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 Id1-v2의 발현정도와 위치를 확인하였다. 또한, 상기와 동일한 조건으로 처리한 뒤 각각 세포를 모아 웨스턴 블롯과 RT-PCR을 사용하여 제1형 콜라겐-α1, 제1형 콜라겐-α2의 단백질 발현 정도와 mRNA 발현 정도를 확인하였다. 이 실험 방법은 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

또한, GFP가 표지된 Id1-v2 단백질의 세포내에서의 위치를 확인한 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 일반적인 Id 단백질들의 위치와 다르게 GFP-Id1-v2는 TGF-β의 유무와 관계없이 콜라겐의 발현이 저해되는 그 시점에 NHDF의 세포질에 위치하고 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 Id1-v2는 핵이 아닌 세포질에 존재하면서 콜라겐에 대한 조절자로 작용한다는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 5B에 나타낸 바와 같이, Id1-v2 단백질이 발현된 경우 콜라겐 단백질과 mRNA의 양은 TGF-β가 있는 조건, 없는 조건에서 모두 대조군에 비해 눈에 띄게 감소하는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 Id1 단백질은 콜라겐 발현을 전사단계에서부터 억제한다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 이와 같은 사실을 통해 본 발명의 Id1 단백질은 지난친 콜라겐 합성에 따른 증상의 완화효과 및 콜라겐의 과발현으로 유발되는 섬유증을 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

Id1 단백질이 TGF -β1 매개 신호전달경로에 미치는 영향

TGF-β1에 의해 진행되는 콜라겐 유전자 발현과정에서 Smad2와 Smad3가 가장 중요한 인자 중 하나이기 때문에 본 발명자들은 Smad2와 Smad3 단백질, 그리고 인산화된 Smad2 및 Smad3의 레벨을 측정함으로써 Id1-v2가 이들 단백질에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

NHDF에 GFP가 표지된 Id1-v2 아데노바이러스와 대조군인 GFP를 과발현시킨 후, TGF-β1(10 ng/ml)을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 TGF-β1의 신호전달경로(pathway)에 작용하는 Smad2/p-Smad2와 Smad3/p-Smad3의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였으며, 이는 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 다만, 항체로서 1차 항체를 smad2, phospho-smad2, smad3, phospho-smad3, GFP, Actin 항체를 사용하였고, 2차 항체로 rabbit 및 goat 항체를 사용한 것 이외에는 동일하게 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 재조합 아데노바이러스를 이용하여 Id1-v2를 과발현시키고 그로부터 야기된 단백질의 발현양상을 western blot을 통해 확인한 결과, TGF-β는 Smad2와 Smad3의 발현과 인산화를 모두 유도하였으나 Id1-v2는 TGF-β에 의해 진행되는 이들의 발현뿐만 아니라 활성까지도 모두 저해하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 TGF-β 매개 콜라겐 발현 과정에서 Id1-v2가 Smad2와 Smad3의 발현이나 활성화에 중요한 조절자로서 작용할 수 있으며 이것이 콜라겐 발현을 억제하는 주된 과정이 될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungnam National University <120> Novel use of Id1 for preventing or treating fibrosis <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Id1-v2 amino acid sequence <400> 1 Met Lys Val Ala Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Pro Ser 1 5 10 15 Cys Ala Leu Lys Ala Gly Lys Thr Ala Ser Gly Ala Gly Glu Val Val 20 25 30 Arg Cys Leu Ser Glu Gln Ser Val Ala Ile Ser Arg Cys Ala Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Glu Gln Gln Val Asn Val 50 55 60 Leu Leu Tyr Asp Met Asn Gly Cys Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Val 65 70 75 80 Pro Thr Leu Pro Gln Asn Arg Lys Val Ser Lys Val Glu Ile Leu Gln 85 90 95 His Val Ile Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Gln Leu Glu Leu Asn Ser Glu 100 105 110 Ser Glu Val Gly Thr Pro Gly Gly Arg Gly Leu Pro Val Arg Ala Pro 115 120 125 Leu Ser Thr Leu Asn Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ala Glu Val Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Asp His 145 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id1-v2 DNA sequence <400> 2 atgaaagtcg ccagtggcag caccgccacc gccgccgcgg gccccagctg cgcgctgaag 60 gccggcaaga cagcgagcgg tgcgggcgag gtggtgcgct gtctgtctga gcagagcgtg 120 gccatctcgc gctgcgccgg gggcgccggg gcgcgcctgc ctgccctgct ggacgagcag 180 caggtaaacg tgctgctcta cgacatgaac ggctgttact cacgcctcaa ggagctggtg 240 cccaccctgc cccagaaccg caaggtgagc aaggtggaga ttctccagca cgtcatcgac 300 tacatcaggg accttcagtt ggagctgaac tcggaatccg aagttggaac ccccgggggc 360 cgagggctgc cggtccgggc tccgctcagc accctcaacg gcgagatcag cgccctgacg 420 gccgaggtga gatccagatc cgaccactag 450 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type I collagen a1 F-primer <400> 3 agggggaaaa actgctttgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type 1 collagen a1 R-primer <400> 4 ggagggaatc actggtgcta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type 1 collagen a2-F primer <400> 5 ccgttggacc tcctggtaat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type 1 collagen a2 R-primer <400> 6 cccttgttac cgctctctcc 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id1-v1 F-primer <400> 7 cgtagatcta tgaaagtcgc cagtgg 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id1-v1 R-primer <400> 8 tatctcgagt cagcgacaca agatgc 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id1-v2 F-primer <400> 9 cgtagatcta tgaaagtcgc cagtgg 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id1-v2 R-primer <400> 10 tatctcgagc tagtggtcgg atctgg 26

Claims

Id1(Inhibitor of DNA binding 1) 단백질 또는 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Id1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Id1-v2인 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Id1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 섬유증은 TGF-β1에 의해 유도되는 콜라겐의 과발현으로 인해 유발되는 것임을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 섬유증은 병리학적 상태 또는 질환에 의한 섬유증, 외상(trauma), 감염, 수술, 화상, 방사능 손상에 의해 발생되는 섬유증 및 화학요법치료제에 의한 섬유증 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 섬유증은 비후성 반흔(hypertrophic scar), 켈로이드, 국소성 경피증, 전신 경화증, 호산구증가-근통증 증후군 및 피부의 경피성 이식편대숙주질환 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Id1 단백질은 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 Id1 단백질은 Smad2 또는 Smad3의 발현 및 활성을 저해함으로써 콜라겐 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
섬유아세포에 Id1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현을 감소 또는 억제하는 방법.
(a) Id1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 측정결과, Id1 단백질의 양, Id1 단백질의 활성 또는 Id1 유전자의 발현양이 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가하는 경우, 상기 후보물질을 섬유증의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.