KR102345006B1 - 섬모 손상 질환의 진단을 위한 ick 및 klc3의 용도 - Google Patents

섬모 손상 질환의 진단을 위한 ick 및 klc3의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 섬모 손상 질환의 진단을 위한 ICK 및 KLC3의 용도, 및 KLC3 억제제를 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제에 관한 것으로, 동물모델의 신장에서 녹아웃(knock out)을 통한 ICK 결함으로 섬모가 손상되고 낭포가 형성되고, KLC3 단백질이 증가하는 것을 확인하여 ICK 결함 및 KLC3 증가가 섬모 손상의 지표라는 것을 입증함으로써, ICK 및 KLC3를 섬모 손상 질환의 진단을 위한 바이오 마커로 제안한다.
또한, 본 발명은 신장 상피세포에서 ICK 결함으로 형성되는 낭포가 KLC3 단백질을 억제로 개선되는 것을 확인함으로써, KLC3 단백질의 활성 억제제 또는 KLC3 mRNA의 발현 억제제를 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제로 제공한다.

Description

섬모 손상 질환의 진단을 위한 ICK 및 KLC3의 용도{Use of ICK and KLC3 for the diagnosis of ciliary injury disease}
본 발명은 섬모 손상 질환의 진단을 위한 ICK 및 KLC3의 용도, 및 KLC3 억제제를 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제에 관한 것이다.
섬모 (cilia)는 세포 표면에 돌출된 세포의 소기관으로, 모든 진행세포에 있는 일차섬모(primary cilia)는 운동성이 없으며, 외부에서 오는 다양한 감각(시각, 후각, 청각, 운동 감각, 삼투압 등)을 감지하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 세포 내 중요한 신호전달과정이 일차섬모를 매개로 일어남이 알려지면서 세포 신호전달 체계를 통합하는 "신호전달의 허브"로서 일차섬모의 중요성이 부각되고 있다.
신장에서 일차섬모는 집합세관의 사이세포(intercalated cell)를 제외한 세뇨관을 구성하는 모든 상피세포, 사구체 및 사구체 주머니 세포의 내강 쪽 세포표면에서 발견된다. 상기 일차섬모는 유체의 흐름 및 화학적 인자에 대해 반응을 하고, 신장의 구조와 기능의 유지에 필수적인 화학, 기계감각적 세포 내 기관으로서 역할을 한다. 이러한 일차 섬모가 손상되는 섬모 손상 질환은 바뎃-비들 증후군(Bardet-Biedl Syndrom;BBS), 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 다낭신(Polycystic Kidney Disease, PKD), 신장 낭종(renal cysts), 불임(infertility), 호흡기 질환(respiratory disorder), 내장역위증(situs inversus), 비만 및 고혈압(hypertension) 등이 알려져 있다.
특히, 다낭신(Polycystic Kidney Disease, PKD)은 신장에 체액으로 가득 찬 낭포가 형성되어 신기능을 저해시키는 유전질환이다. 다낭신 발병에 관여하는 대표적인 원인 유전자로는 PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1)과 PKD2(Polycystic Kidney Disease 2)가 알려져 있는데 이 두 유전자는 각 각 Polycystin-1 (PC1)과 Polycystin-2(PC2) 단백질을 암호화한다. PC1과 PC2 단백질은 함께 복합체를 이루어 신장 상피세포에 존재하는 섬모에 위치하여 칼슘채널로써 역할을 수행한다. 하지만 아직까지 다낭신 동물모델에서 관찰되는 섬모 결함 메커니즘에 관여하는 유전자들이 명확히 밝혀져 있지 않다.
본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 섬모 손상 질환을 진단하여 예후를 예측할 수 있는 새로운 바이오마커로서 ICK 및 KLC3와 섬모 손상 질환의 관련성을 확인하고, KLC3 억제제가 섬모 손상 질환의 증상인 낭포 형성을 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 섬모 손상 질환의 진단을 위한 ICK 및 KLC3의 용도, 및 KLC3 억제제를 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제에 관한 것으로, 동물모델의 신장에서 녹아웃(knock out)을 통한 ICK 결함으로 섬모가 손상되고 낭포가 형성되고, KLC3 단백질이 증가하는 것을 확인하여 ICK 결함 및 KLC3 증가가 섬모 손상의 지표라는 것을 입증함으로써, ICK 및 KLC3를 섬모 손상 질환의 진단을 위한 바이오 마커로 제안하는 것이다.
또한, 본 발명은 신장 상피세포에서 ICK 결함으로 형성되는 낭포가 KLC3 단백질을 억제로 개선되는 것을 확인함으로써, KLC3 단백질의 활성 억제제 또는 KLC3 mRNA의 발현 억제제를 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제로 제공하는 것이다.
본 발명은 ICK 단백질, ICK 단백질을 코딩하는 유전자, KLC3 단백질, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 섬모 손상 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 섬모 손상 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICK 단백질, ICK 단백질을 코딩하는 유전자, KLC3 단백질, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제1단계; 및 상기 단백질의 발현 수준을 정상 조직에서 분리된 생물학적 시료와 비교하는 제2단계;를 포함하는 섬모 손상 질환의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 KLC3 단백질의 활성 억제제, 또는 KLC3 mRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 ICK 단백질 또는 ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 결핍된 질환 대상체를 선별하는 제1단계; 상기 선별된 질환 대상체에서 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제2단계; 및 시험물질을 처리한 후 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 시험물질을 처리하지 않은 질환 대상체에 비해 감소하면 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제로 판단하는 제3단계;를 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 동물모델의 신장에서 녹아웃(knock out)을 통한 ICK 결함으로 섬모가 손상되고 낭포가 형성되고, KLC3 단백질이 증가하는 것을 확인하여 ICK 결함 및 KLC3 증가가 섬모 손상의 지표라는 것을 입증함으로써, ICK 및 KLC3를 섬모 손상 질환의 진단을 위한 바이오 마커로 제공될 수 있다.
또한, 신장 상피세포에서 ICK 결함으로 형성되는 낭포가 KLC3 단백질을 억제로 개선되는 것을 확인함으로써, KLC3 단백질의 활성 억제제 또는 KLC3 mRNA의 발현 억제제를 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제로 제공될 수 있다.
도 1은 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델에서 시간에 따른 신장의 낭포 형성을 확인한 사진이다.
도 2는 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델에서 낭포 형성 세포(cyst lining cell)의 증식을 확인한 형광 염색 사진이다.
도 3은 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델에서 신장의 무게를 비교한 그래프이다.
도 4는 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델의 생존율을 비교한 그래프이다.
도 5는 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델의 신장 샘플에서 일차 섬모의 변화를 비교한 형광 염색 사진 및 그래프이다.
도 6은 ICK와 KLC3 단백질의 관련성을 확인한 공 면역침전 분석(Co-immunoprecipitation)의 결과 사진이다.
도 7은 in vitro에서 KLC3 단백질이 일차 섬모의 기저체(basal body)에 위치한 것을 확인한 형광 염색 사진이다.
도 8은 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델의 신장 샘플에서 KLC3 단백질이 낭포 형성 세포(cyst lining cell)에 특이적으로 발현되는 것을 확인한 형광 염색 사진이다.
도 9는 in vitro 낭포 형성과정(cystogenesis)에서 정상 및 ICK 녹아웃(knock out)에서 KLC3 단ㅂ의 변화를 확인한 형광 염색 사진이다.
도 10은 KLC3의 발현조절을 위한 변형된 KLC3 유전자의 구조를 도식화한 그림이다.
도 11은 신장 상피세포인 mlMCD-3 세포에서 KLC3의 발현 조절에 따른 일차 섬모의 변화를 확인한 형광 염색 사진이다.
도 12는 신장 상피세포인 mlMCD-3 세포에서 KLC3의 발현 조절에 따른 일차 섬모의 변화를 비교한 그래프이다.
도 13은 신장 상피세포인 mlMCD-3 세포의 3D 세포 배양에서 KLC3의 발현 변화에 따른 낭포 형성 여부를 비교한 사진 및 그래프이다.
도 14는 신장 상피세포인 mlMCD-3 세포의 3D 세포 배양에서 ICK 및 KLC3 녹아웃(knock out)에 따른 낭포의 변화를 비교한 사진 및 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 ICK 단백질, ICK 단백질을 코딩하는 유전자, KLC3 단백질, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
상기 섬모 손상 질환은 ICK 단백질이 발현되지 않아 발병되는 신장 질환일 수 있으며, 상기 신장 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 또는 수신증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 섬모 손상 질환의 진단용 키트를 제공한다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물이고, 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 ‘유전자의 발현 수준’은 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있으며, 상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있으며, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 또는 DNA 칩에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 ‘단백질의 발현 수준’은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
또한, 단백질의 수준은 면역분석법 또는 면역염색법에 의해 측정될 수 있다. 상기 방법은 시료에서 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 마이크로칩 또는 자동화된 마이크로어레이 시스템의 형태로 실시될 수 있다.
상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다.
상기 단백질 수준은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total highresolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다. MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다.
또한, 본 발명은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 섬모 손상 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICK 단백질, ICK 단백질을 코딩하는 유전자, KLC3 단백질, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준, KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제1단계; 및 상기 단백질의 발현 수준을 정상 조직에서 분리된 생물학적 시료와 비교하는 제2단계;를 포함하는 섬모 손상 질환의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 KLC3 단백질의 활성 억제제, 또는 KLC3 mRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여된다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 대상체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
또한, 본 발명은 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 ICK 단백질 또는 ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 결핍된 질환 대상체를 선별하는 제1단계; 상기 선별된 질환 대상체에서 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제2단계; 및 시험물질을 처리한 후 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 시험물질을 처리하지 않은 질환 대상체에 비해 감소하면 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제로 판단하는 제3단계;를 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 조직 분석(Histological Analysis)
동물 모델로부터 수집한 신장 샘플을 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 삽입하여 5 μm 두께로 절단하였다. 에탄올을 단계적으로 주입하여 재수화를 한 후, 헤마톡실린, 에오신 및 Masson’s Trichrome 염색법으로 염색하였다.
2. 면역 형광 현미경
동물 모델로부터 수집한 신장 샘플을 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 삽입하여 5 μm 두께로 파라핀 절편을 제조하였다. 파라핀 절편을 4℃에서 1차 항체와 밤새 배양하였다. 세포의 경우 유리 커버슬립에서 배양한 후 -20℃에서 메탄올로 10분간 고정하고, 4℃에서 1차 항체와 밤새 배양하였다. 1X PBS로 세 번 세척한 후, 형광이 있는 2차 항체와 DAPI 항체의 희석액으로 두 시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 Vectashield (Vector Lab.)에 올린 후 confocal microscope (Carl Zeiss)으로 관찰하였다.
3. 세포 배양
신장 상피세포인 mlMCD-3 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM F-12 배지에서 배양하였다. 섬모형성을 유도하기 위해서 2D culture의 경우에는 3일, 3D culture의 경우에는 5일동안 FBS가 제거된 조건의 배지에서 배양하였다. HEK293T 세포는 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 섬모형성을 유도하기 위해서 FBS가 제거된 배지에서 1일 동안 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2가 포함된 37℃의 습한 환경에서 배양하였다.
4. 트랜스펙션 (Transfection)
siRNA의 경우에 Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen)를 이용하여 제조자의 메뉴얼에 따라 대조군, Ick siRNA 또는 Klc3 siRNA (small interfering RNA; Santa Cruz Biotechonology, Bioneer)를 세포에 트랜스펙션시켰다.
Vector의 경우에는 FuGENE (Promega)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 HA-EV/Ick, Flag-EV/Klc3, EGFP-EV/Klc3/Klc3 ΔTPR를 세포에 각각 트랜스펙션시켰다.
5. 3차원 세포배양
신장 상피세포인 mlMCD-3 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM F-12 배지에 현탁한 후에 matrigel (Corning)과 1:1로 혼합하였다. 섬모 형성을 유도하기 위하여 5일동안 FBS가 제거된 조건의 배지에서 배양하였다. 상 대비 사진은 Olympus 1X70 현미경으로 촬영하였다.
6. 공 면역침전 분석 (Co-immunoprecipitation)
용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50~150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1% NP-40, supplemented with a protease and phosphatase inhibitor mixture (Roche))를 이용하여 4℃에서 5분동안 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 원심 분리기에 넣고 4℃에서 15분동안 20,000 g로 풀다운 시켜 상층액을 얻었다. 얻은 용액을 이용하여 Flag M2 항체를 이용하여 상온에 놓인 회전자에서 2시간동안 배양시킨 후에, Dynabeads™ Protein G (Invitrogen, 10004D)를 이용하여 상온에 놓인 회전자에서 2시간동안 배양시켰다. 배양시킨 용액을 워시 버퍼 ((50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50~150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1% NP-40)를 이용하여 세 번 세척한 후에, SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
블롯들은 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 배양되었고, 이후 상온에서 2시간 동안 2차 항체와 함께 배양하였다. 면역활성 복합체는 ECL 제제 (Atto)로 시각화하였다.
7. 통계분석
통계분석은 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad sofrware)으로 수행하였다. 모든 그래프는 평균±표준편차로 표기하였으며, 비대응 one-tailed t-test (unpaired one-tailed t-test)로 진행되었다. P-value가 0.05 이하인 데이터에 대하여 유의미하다고 판단하였다.
실시예 1. 섬모 손상 질환에서 바이오 마커로서 ICK 변화의 평가
본 발명에 따른 ICK 단백질 및 ICK 단백질을 코딩하는 유전자가 섬모 손상 질환을 진단하는 바이오 마커임을 확인하기 위해, 마우스 모델에서 ICK를 녹아웃(knock out)하고, 섬모 손상 질환인 다낭신이 발병되는지 여부를 평가하였다.
도 1 및 2에 나타난 바와 같이, 정상 대조군에 비해 ICK 녹아웃(knock out) 마우스의 신장에서는 시간이 지남에 따라 낭포 형성이 증가하고 낭포 형성 세포(cyst lining cell)의 수가 증가되어 있음을 확인하였다.
또한, 상기 마우스 모델에서 신장의 무게 및 생존율을 측정한 결과, 도 3 및 4에 나타난 바와 같이 ICK 녹아웃(knock out) 마우스의 경우 신장의 무게가 증가되어 있고, 20주 내지 30주 사이에 ICK 녹아웃(knock out) 마우스가 치사되는 것으로 나타났다. 상기 마우스 모델의 신장 샘플에서 일차 섬모를 염색한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 정상 대조군에 비해 ICK 녹아웃(knock out) 마우스의 신장에서는 섬모의 수가 1/3 수준으로 감소되어 있음을 확인하였다.
상기 결과들을 참고하면, 녹아웃(knock out)으로 ICK 상실을 통해 마우스 모델에서 낭포 형성이 증가하고 낭포 형성 세포(cyst lining cell)의 수가 증가되며, 섬모의 수가 감소되는 섬모 손상 질환의 특징이 나타났으며, 이러한 결과는 ICK 단백질 또는 ICK 단백질을 코딩하는 유전자가 섬모 손상 질환의 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 2. 섬모 손상 질환에서 바이오 마커로서 KLC3 변화의 평가
본 발명에 따른 KLC3 단백질 및 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자가 섬모 손상 질환을 진단하는 바이오 마커임을 확인하기 위해, ICK 단백질과 KLC3 단백질의 연관성을 확인하고, 마우스 모델에서 KLC3 단백질의 수준 및 위치를 확인하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 공 면역침전 분석(Co-immunoprecipitation)에서 ICK 단백질과 KLC3 단백질은 함께 침전되는 것으로 나타났으며, ICK 단백질은 KLC3 단백질을 매개로 작용함을 확인하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, in virto에서 KLC3 단백질이 이차 섬모의 기저체에 위치한 ICK 단백질을 둘러 싸고 있는 것을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 정상 대조군과 ICK 녹아웃(knock out) 마우스 모델의 신장 샘플에서 KLC3 단백질이 낭포 형성 세포(cyst lining cell)에 특이적으로 발현되어 있음을 확인하였고, 도 9에 나타난 바와 같이, in vitro 낭포 형성과정(cystogenesis)에서 ICK 녹아웃(knock out)인 경우 KLC3 단백질의 발현 수준이 증가되어 있음을 확인하였다.
상기 결과들을 참고하면, KLC3 단백질은 섬모 손상 질환의 진단용 바이오 마커인 ICK 단백질과 관련이 있으며, KLC3 단백질이 낭포 형성 세포(cyst lining cell)에 특이적으로 발현되어 있으며, 낭포 형성과정(cystogenesis)에서 ICK이 상실되는 경우, KLC3 단백질의 수준이 증가하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 KLC3 단백질 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자가 섬모 손상 질환의 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 3. 일차 섬모 조절에서의 KLC3 역할 검증
본 발명에 따른 KLC3 단백질 및 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자가 섬모 손상 질환을 진단하는 바이오 마커임을 확인하기 위해, 신장 상피세포인 mIMCD-3 세포에서 KLC3 단백질의 발현 수준을 조절하였을 때의 일차 섬모의 변화를 평가하였다.
도 11 및 12에 나타난 바와 같이, KLC3 단백질의 발현 수준이 증가된 경우, 야생형 대조군에 비해 일차 섬모의 수가 증가하였고, 섬모의 길이가 길어지는 것으로 나타났다. 또한, TPR(tetratricopeptide repeat) 도메인이 제거된 KLC3이 트랜스펙션된 경우, 섬모의 기저체 거리가 멀어지는 것으로 나타났다.
상기 결과는 KLC3 단백질이 일차 섬모의 수를 증가 및 신장시키는 요소라는 것을 입증하며, KLC3 단백질의 비정상적인 증가는 섬모 손상 질환을 나타내는 바이오 마커가 될 수 있음을 입증한다.
실시예 4. KLC3 억제를 통한 낭포 형성의 억제 효과 확인
본 발명에 따라 KLC3 발현 수준을 억제하면 섬모 손상 질환이 개선되는 지 확인하기 위해, 3D 세포 배양된 신장 상피세포인 mlMCD-3 세포에서 KLC3 단백질의 증가 또는 억제가 미치는 영향을 평가하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, KLC3 발현이 증가된 mlMCD-3 세포에서는 낭포가 형성되는 것으로 나타났다. 또한, 도 14에 나타난 바와 같이, ICK 녹아웃(knock out)된 mlMCD-3 세포에서는 낭포가 형성되었으나, ICK 녹아웃(knock out)된 mlMCD-3 세포에 KLC3 발현 억제제(KLC3 mRNA에 결합하는 siRNA)를 처리한 결과 낭포 형성이 억제되는 것으로 나타났다.
상기 결과는 KLC3의 발현을 증가하면 섬모 손상 질환인 다낭신의 특징인 낭포 형성이 증가하며, ICK 상실로 나타나는 낭포 형성은 KLC3를 억제하여 개선할 수 있다는 입증한다. 이러한 결과는 ICK 및 KLC3가 섬모 손상 질환인 다낭신을 진단하기 위한 바이오 마커임을 입증할 뿐만 아니라, KLC3 단백질의 활성 억제제, 또는 KLC3 mRNA의 발현 억제제가 섬모 손상 질환인 다낭신을 예방 또는 치료하기 위한 치료제로 제공될 수 있음을 입증한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (18)

  1. KLC3 단백질, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 진단용 바이오 마커 조성물로서,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 진단용 바이오 마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 섬모 손상 질환의 진단용 키트로서,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물이고;상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 진단용 키트.
  6. 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 섬모 손상 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. KLC3 단백질, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 바이오마커 조성물로서,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 바이오마커 조성물.
  8. 삭제
  9. KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 키트로서,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 예후예측용 키트.
  10. 삭제
  11. 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제1단계; 및상기 단백질의 발현 수준을 정상 조직에서 분리된 생물학적 시료와 비교하는 제2단계;를 포함하는 섬모 손상 질환의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법으로서,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  12. 삭제
  13. KLC3 mRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고,
    상기 KLC3 mRNA의 발현 억제제는 KLC3 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 섬모 손상 질환은 ICK 단백질이 발현되지 않아 발병되는 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 ICK 단백질의 발현 수준, ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 ICK 단백질 또는 ICK 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 결핍된 질환 대상체를 선별하는 제1단계;
    상기 선별된 질환 대상체에서 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제2단계; 및
    시험물질을 처리한 후 KLC3 단백질의 발현 수준, 또는 KLC3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 시험물질을 처리하지 않은 질환 대상체에 비해 감소하면 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제로 판단하는 제3단계;를 포함하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법으로써,
    상기 섬모 손상 질환은 다낭신, 사구체 낭종, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 및 수신증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬모 손상 질환의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  18. 삭제
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